WO2024090927A1 - 신규 항-cdcp1 항체 및 이의 용도 - Google Patents

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WO2024090927A1
WO2024090927A1 PCT/KR2023/016475 KR2023016475W WO2024090927A1 WO 2024090927 A1 WO2024090927 A1 WO 2024090927A1 KR 2023016475 W KR2023016475 W KR 2023016475W WO 2024090927 A1 WO2024090927 A1 WO 2024090927A1
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seq
nucleic acid
acid sequence
amino acids
cancer
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PCT/KR2023/016475
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English (en)
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박상규
엄윤정
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주식회사 노벨티노빌리티
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer

Definitions

  • the present invention relates to novel anti-CDCP-1 antibodies or antibody fragments thereof.
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer comprising the anti-CDCP1 antibody or antibody fragment thereof, a composition for detecting CDCP1, and an antibody drug conjugate comprising the anti-CDCP-1 antibody or antibody fragment thereof. .
  • CDCP1 (CUB-domain containing protein 1), also known as CD318, SIMA135, TRASK, and gp140, is a type 1 transmembrane protein that is upregulated in malignancies of the breast, lung, colorectal, ovary, kidney, liver, pancreas, and hematopoietic system. It is a glycoprotein.
  • human CDCP1 consists of a total length of about 836 amino acids and has three CUB domains (complement C1r/C1s, Uegf, and Bmp1 domains). Increased levels of CDCP1 are known to be associated with cancer progression and significantly lower survival rates.
  • CDCP1 located primarily on the cell surface, is located at the nexus of key oncogenic and metastatic signaling cascades, including the SRC/PKC ⁇ , PI3K/AKT, WNT, and RAS/ERK axes, the oxidative pentose phosphate pathway, and fatty acid oxidation, contributing to cancer cell survival and growth. , makes important functional contributions to metastasis and treatment resistance.
  • An object of the present invention is to provide an anti-CDCP1 antibody or antigen-binding fragment thereof.
  • Another object of the present invention is to provide a nucleic acid encoding the anti-CDCP1 antibody or antigen-binding fragment thereof, a vector containing the same, and cells transformed with such vector.
  • Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer comprising the anti-CDCP1 antibody or antigen-binding fragment thereof.
  • Another object of the present invention is to provide a composition for detecting CDCP1 comprising the anti-CDCP1 antibody or antigen-binding fragment thereof.
  • Another object of the present invention is to provide a cancer diagnosis kit containing the composition for detecting CDCP1.
  • Another object of the present invention is to provide an antibody drug conjugate comprising an anti-CDCP1 antibody or an antigen-binding fragment thereof.
  • CDR-H1 heavy chain complementarity-determining region 1
  • Heavy chain complementarity-determining region 2 comprising amino acids expressed from a nucleic acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 12, and SEQ ID NO: 22
  • Heavy chain complementarity-determining region 3 comprising amino acids expressed from a nucleic acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 13, and SEQ ID NO: 23
  • Light chain complementarity-determining region 1 comprising amino acids expressed from a nucleic acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 16, and SEQ ID NO: 26
  • a light chain complementarity-determining region 2 comprising amino acids expressed from a nucleic acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 17, and SEQ ID NO: 27
  • a light chain complementarity-determining region 3 comprising amino acids expressed from a nucleic acid sequence
  • the “CDCP-1 (CUB-domain containing protein 1)” includes all of those also known as CD318, SIMA135, TRASK, and gp140.
  • the CDCP-1 may be derived from a mammal, and the mammal may be a human, monkey, mouse, cow, or horse.
  • anti-CDCP1 antibody refers to an antibody that specifically binds to CDCP1.
  • anti-CDCP1 antibodies can specifically bind to a specific domain of CDCP1, thereby inhibiting or neutralizing the activity or activation of CDCP1.
  • the “antibody” refers to a substance produced by stimulation of an antigen within the immune system, and may be produced in vivo, recombinantly produced, or artificially synthesized, and the type is not particularly limited.
  • antibodies include animal antibodies, chimeric antibodies, humanized antibodies, and human antibodies. Additionally, in the present invention, antibodies may include all antigen-binding fragments of antibodies that possess antigen-binding ability.
  • the antibody may be selected from all subtypes of immunoglobulins (e.g., IgA, IgD, IgE, IgG (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), IgM, etc.).
  • the antibody in the form of IgG may be in the form of an IgG1, IgG2, IgG3, or IgG4 subtype, such as an IgG1 or IgG2 subtype. It also includes monoclonal antibodies, bispecific antibodies, minibodies, domain antibodies, antibody mimetics (or synthetic antibodies), chimeric antibodies, humanized antibodies, human antibodies, antibody fusions (or antibody conjugates), and fragments thereof, It is not limited to this.
  • the “antigen-binding fragment” refers to a portion of an antibody or a polypeptide containing the antibody that has a specific binding ability to an antigen.
  • the antigen-binding fragment may be a portion of an antibody containing an amino acid residue that interacts with an antigen (e.g., an epitope) to provide the antibody with specificity and/or affinity for the antigen, or a polypeptide containing the same.
  • the antigen-binding fragment may be selected from the group consisting of antibody fragments containing one or more of the complementarity-determining regions, such as scFv, (scFv)2, scFv-Fc, Fab, Fab', and F(ab') 2 . , but is not limited to this.
  • These biologically active fragments may be produced by recombinant DNA techniques or, for example, by enzymatic or chemical cleavage of intact antibodies. Immunologically functional immunoglobulin fragments are not limited thereto.
  • CDR complementarity-determining regions
  • the antibody or antigen-binding fragment thereof includes a heavy chain complementarity-determining region 1 comprising amino acids expressed from the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 1; Heavy chain complementarity-determining region 2 comprising amino acids expressed from the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 2; Heavy chain complementarity-determining region 3 comprising amino acids expressed from the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 3; Light chain complementarity-determining region 1 comprising amino acids expressed from the nucleic acid sequence of SEQ ID NO:6; Light chain complementarity-determining region 2 comprising amino acids expressed from the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 7; and a light chain complementarity-determining region 3 comprising amino acids expressed from the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 8; It may be an anti-CDCP1 antibody or an antigen-binding fragment thereof, including.
  • the antibody or antigen-binding fragment thereof includes a heavy chain variable region comprising amino acids expressed from the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 5; and a light chain variable region comprising amino acids expressed from the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 10; It may be an anti-CDCP1 antibody or an antigen-binding fragment thereof, including.
  • the antibody or antigen-binding fragment thereof includes a heavy chain complementarity-determining region 1 comprising amino acids expressed from the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 11; Heavy chain complementarity-determining region 2 comprising amino acids expressed from the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 12; Heavy chain complementarity-determining region 3 comprising amino acids expressed from the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 13; Light chain complementarity-determining region 1 comprising amino acids expressed from the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 16; Light chain complementarity-determining region 2 comprising amino acids expressed from the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 17; and a light chain complementarity-determining region 3 comprising amino acids expressed from the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 18; It may be an anti-CDCP1 antibody or an antigen-binding fragment thereof, including.
  • the antibody or antigen-binding fragment thereof includes a heavy chain variable region comprising amino acids expressed from the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 15; and a light chain variable region comprising amino acids expressed from the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 20; It may be an anti-CDCP1 antibody or an antigen-binding fragment thereof, including.
  • the antibody or antigen-binding fragment thereof includes a heavy chain complementarity-determining region 1 comprising amino acids expressed from the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 21; Heavy chain complementarity-determining region 2 comprising amino acids expressed from the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 22; Heavy chain complementarity-determining region 3 comprising amino acids expressed from the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 23; Light chain complementarity-determining region 1 comprising amino acids expressed from the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 26; Light chain complementarity-determining region 2 comprising amino acids expressed from the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 27; and a light chain complementarity-determining region 3 comprising amino acids expressed from the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 28; It may be an anti-CDCP1 antibody or an antigen-binding fragment thereof, including.
  • the antibody or antigen-binding fragment thereof includes a heavy chain variable region comprising amino acids expressed from the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 25; and a light chain variable region comprising amino acids expressed from the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 30; It may be an anti-CDCP1 antibody or an antigen-binding fragment thereof, including.
  • “heavy chain” includes full-length heavy chains and fragments thereof having variable region sequences sufficient to provide binding specificity for an antigen or epitope.
  • the full-length heavy chain contains the variable region domain VH and the three constant region domains CH1, CH2, and CH3.
  • the VH domain is located at the amino terminus of the heavy chain polypeptide
  • the CH domain is located at the carboxy terminus
  • CH3 is located closest to the carboxy terminus.
  • Heavy chains include isotypes of IgG (including the IgG1, IgG2, IgG3, and IgG4 subtypes), IgA (including the IgA1 and IgA2 subtypes), IgM, and IgE.
  • light chain includes full-length light chains and fragments thereof having variable region sequences sufficient to provide binding specificity for an antigen or epitope.
  • the full-length light chain includes the variable region domain VL, and the constant region domain CL.
  • the light chain variable region domain is located at the amino terminus of the light chain polypeptide.
  • Types of light chains include kappa and lambda chains.
  • the complementarity determining regions of the heavy and light chain variable regions of the anti-CDCP1 antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention may include an amino acid sequence having substantial sequence identity with the amino acid sequence expressed from the above nucleic acid sequence.
  • the "substantial sequence identity” is 70% when the sequence of the present invention and any other sequence are aligned to the maximum extent possible and the aligned sequence is analyzed using an algorithm commonly used in the art. refers to a sequence showing sequence homology, more preferably 80% homology or 90% homology. Alignment methods for sequence comparison are known in the art and, in one embodiment, have about 90%, 95%, or 99% identity to the heavy chain variable region disclosed. has about 90%, 95%, or 99% identity with the light chain variable region disclosed in other examples. For example, in the case of a variant showing 90%, 95%, or 99% identity to the sequence of an antibody or antigen-binding fragment disclosed in the present invention, any mutation may occur in the framework of the variable region rather than the CDR.
  • the anti-CDCP1 antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention may specifically bind to the CUB1 domain of CDCP1.
  • the anti-CDCP1 antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention recognizes the CUB1 domain and binds to CDCP1 with high affinity.
  • affinity or affinity refers to the strength of interaction between an antibody or antigen-binding fragment thereof and an antigen, and refers to the CDR sequence of the antibody or antigen-binding fragment, and/or the physicochemical properties of the antibody or antigen-binding fragment. It can be determined by properties (hydrophilicity/hydrophobicity, electrostatic properties, etc.), characteristics of the antigen such as size, shape, and/or charge of the antigen. Methods for determining such affinity are known in the art, and can usually be expressed as a dissociation constant (KD), but are not limited thereto.
  • KD dissociation constant
  • the anti-CDCP1 antibody according to the present invention has specificity for human CDCP1 and has excellent internalization function and affinity (FIGS. 6 to 9). Therefore, the anti-CDCP1 antibody according to the present invention can be used for the prevention and/or treatment of cancer.
  • the chimeric anti-CDCP1 antibody according to the present invention has specificity for human CDCP1 and has excellent internalization function and affinity (FIGS. 12 to 14). Therefore, the chimeric anti-CDCP1 antibody according to the present invention can be effectively used for the prevention and treatment of cancer occurring in humans.
  • Another aspect of the invention relates to nucleic acids encoding anti-CDCP1 antibodies or antigen-binding fragments thereof.
  • the polynucleotide may be prepared by a known chemical synthesis method, and may be a single- or double-stranded nucleotide polymer encoding the anti-CDCP1 antibody or antigen-binding fragment and may include DNA, RNA, or a variant thereof.
  • Another aspect of the present invention relates to a recombinant vector containing the above nucleic acid.
  • the "recombinant vector” is an expression vector capable of expressing a target protein in a suitable host cell, and refers to a genetic construct containing essential regulatory elements operably linked to express the gene insert. Operable linkages with recombinant vectors can be prepared using genetic recombination techniques well known in the art, and site-specific DNA cutting and linking can be done using enzymes generally known in the art.
  • the vector may be an expression vector, may include a selectable marker for selecting host cells, and, if it is a replicable expression vector, may include an origin of replication.
  • Another aspect of the invention relates to cells transformed with the above recombinant vector.
  • the “transformed cell” refers to a cell into which a target polynucleotide or recombinant vector has been introduced into a host cell. Transformation may be the introduction of foreign DNA into a cell by the above 'introduction' method, and can be performed by selecting an appropriate standard technique depending on the host cell, as is known in the art. Additionally, the type of the transformed cell is not limited.
  • Another aspect of the present invention relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer comprising an anti-CDCP1 antibody or antigen-binding fragment thereof.
  • prevention refers to any action by which the composition of the present invention delays the development of cancer.
  • treatment means any action that allows the composition of the present invention to improve or benefit the symptoms of cancer.
  • the “cancer” refers to bone cancer, lung cancer, head cancer, cervical cancer, thyroid cancer, parathyroid cancer, non-small cell lung cancer, stomach cancer, liver cancer, pancreatic cancer, skin cancer, skin or intraocular melanoma, rectal cancer, anal cancer, and colon cancer.
  • uterine cancer breast cancer, ovarian cancer, fallopian tube carcinoma, endometrial carcinoma, cervical carcinoma, vaginal carcinoma, vulvar carcinoma, Hodgkin's disease, esophageal cancer, small intestine cancer, endocrine cancer, adrenal cancer, soft tissue sarcoma, urethral cancer, penile cancer, prostate It may be, but is not limited to, cancer, bladder cancer, renal or ureteral cancer, renal cell carcinoma, renal pelvic carcinoma, central nervous system tumor, central nervous system lymphoma, spinal cord tumor, glioblastoma, brainstem glioma, and pituitary adenoma.
  • composition of the present invention can be applied in a pharmaceutically effective amount
  • pharmaceutically effective amount means an amount sufficient to treat a disease with a reasonable benefit/risk ratio applicable to medical treatment, and the effective dose level Factors including the patient's gender, age, disease type, severity, drug activity, sensitivity to the drug, administration time, administration route and excretion rate, treatment period, concurrently used drugs, and other factors well known in the medical field. It can be decided accordingly.
  • Another aspect of the present invention relates to a method for preventing or treating cancer, comprising administering the pharmaceutical composition to a subject.
  • Subject of the present invention includes animals or humans with cancer whose symptoms can be improved by administration of the pharmaceutical composition according to the present invention.
  • Cancer is the same as described above.
  • cancer By administering the therapeutic composition according to the present invention to an individual, cancer can be effectively prevented and treated.
  • administering means introducing a predetermined substance into a human or animal by any appropriate method, and the route of administration of the therapeutic composition according to the present invention is oral via any general route as long as it can reach the target tissue. Alternatively, it may be administered parenterally. Additionally, the therapeutic composition according to the present invention can be administered by any device that can move the active ingredient to target cells.
  • the preferred dosage of the pharmaceutical composition according to the present invention varies depending on the patient's condition and weight, degree of disease, drug form, administration route and period, but can be appropriately selected by a person skilled in the art.
  • Another aspect of the present invention relates to the use of the pharmaceutical composition for preventing or treating cancer.
  • Cancer is the same as described above.
  • Another aspect of the present invention relates to a composition for detecting CDCP1, comprising the anti-CDCP1 antibody or antigen-binding fragment thereof.
  • Antibodies included in the detection composition may be labeled with a detectable labeling substance.
  • a detectable labeling substance for example, radioisotopes or radionuclides (e.g. 3 H, 14 C, 15 N, 35 S, 90 Y, 99 Tc, 111 In, 125 I, 131 I), fluorescent substances (e.g.
  • FITC FITC
  • rhodamine lanthanide fluorophore
  • enzymes e.g., horseradish peroxidase, ⁇ -galactosidase, luciferase, alkaline phosphatase
  • chemiluminescent groups e.g., chemiluminescent groups, biotinyl groups, or secondary reporters.
  • Recognized polypeptide epitopes e.g., leucine zipper pair sequences, binding sites for antibodies, metal binding domains, epitope tags
  • kits containing the above detection composition.
  • the kit can be used together with agents capable of detecting CDCP1 of the present invention, such as anti-CDCP1 antibodies and antigen-binding fragments thereof, as well as various labeling substances, buffer solutions, etc., and all kits known in the art. It may include a configuration of, but is not limited to this.
  • the presence or likelihood of cancer can be diagnosed by reacting the antibody of the present invention with a biological sample. Specifically, diagnosis can be made by contacting an anti-CDCP1 antibody or a functional fragment thereof with a biological sample to determine whether an antigen-antibody complex is formed.
  • the “biological sample” includes, but is not limited to, tissue, cells, blood, serum, plasma, tissue autopsy samples (brain, skin, lymph nodes, spinal cord), etc.
  • Another aspect of the present invention relates to an antibody drug conjugate comprising the anti-CDCP1 antibody or antigen-binding fragment thereof, wherein the antibody or antigen-binding fragment is conjugated with one or more drugs.
  • antibody-drug conjugate refers to a form in which a drug and an antibody are chemically linked without reducing the biological activities of the antibody and drug.
  • the antibody-drug conjugate may be composed of “antibody-linker-drug”.
  • the “antibody” of the present invention is as described above.
  • the “linker” refers to a chemical moiety containing an atomic chain that covalently binds a drug to an antibody.
  • the linker can be manufactured in a form linked to a drug, and has a reactive group at the end of the linker that can be linked to an antibody.
  • the form of the linker is not limited as long as it can react and crosslink the heavy and/or light chains of the antibody.
  • the “drug” may refer to any substance that has specific biological activity in cells, and includes compounds, DNA, RNA, peptides, etc.
  • drugs include all substances that can cause cell death, cell proliferation, immune activation, immunosuppression, activation of specific signaling, or inhibition of specific signaling, and in particular, cytotoxic drugs or May be immunosuppressant. More specifically, the drug may be an anticancer agent or an antitumor agent, but is not limited thereto.
  • the anti-CDCP1 antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention specifically binds to CDCP1 and has strong affinity. Accordingly, the anti-CDCP1 antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention can prevent or treat cancer mediated by CDCP1, and can also be used for cancer diagnosis by detecting CDCP1.
  • Figure 1 shows the results of confirming the binding ability of the monoclonal antibodies prepared in the present invention to CDCP1 (A; 2B5, B; 4H4, C; 2F9).
  • Figure 2 shows the results of confirming the binding ability of the 2B5 antibody of the present invention to human CDCP1 in MDA-MB-468 cells.
  • Figure 3 shows the results of confirming the binding ability of the 4H4 antibody of the present invention to human CDCP1 in MDA-MB-468 cells.
  • Figure 4 shows the results of confirming the binding ability of the 2F9 antibody of the present invention to human CDCP1 in MDA-MB-468 cells.
  • Figure 5 shows the results confirming the internalization of the antigen-antibody complex of the monoclonal antibody of the present invention (A; 2B5, B; 4H4, C; 2F9).
  • Figure 6 shows the results confirming the cross-reactivity of the 2B5 and 4H4 antibodies of the present invention (A; 2B5, B; 4H4).
  • Figure 7 shows the results confirming the binding ability of the m2B5 and m4H4 antibodies of the present invention (A; m2B5, B; m4H4).
  • Figure 8 shows the results of confirming the internalization function of the m2B5 and m4H4 antibodies of the present invention (A; m2B5, B; m4H4).
  • Figure 9 shows the results of confirming the affinity of the m2B5 and m4H4 antibodies of the present invention (A; m2B5, B; m4H4).
  • Figure 10 shows the results of confirming the binding site for CDCP1 of the m2B5 antibody of the present invention.
  • Figure 11 shows the results of confirming the binding site for CDCP1 of the m4H4 antibody of the present invention.
  • Figure 12 shows vectors for expressing the light and heavy chains of the 2B5, 4H4, and 2F9 chimeric antibodies of the present invention (A; 2B5, B; 4H4, C; 2F9).
  • Figure 13 shows the results confirming the binding ability of chi2B5, chi4H4, and chi2F9 antibodies of the present invention to CDCP1 (A; chi2B5, B; chi4H4, C; chi2F9).
  • Figure 14 shows the results of confirming the affinity for CDCP1 of the chi2B5, chi4H4, and chi2F9 antibodies of the present invention (A; chi2B5, B; chi4H4, C; chi2F9).
  • Figure 15 shows the results confirming the internalization of the chi2B5, chi4H4, and chi2F9 antibodies of the present invention (A; chi2B5, B; chi4H4, C; chi2F9).
  • enzyme immunosorbent assay was performed to confirm antibody production. Specifically, blood was collected from the eyeball of an immunized mouse, placed in a 1.5 ml microcentrifuge tube (e-tube), centrifuged at 21,055 x g for 15 minutes at 4°C, and the fractionated serum was stored at -20°C. did. An indirect enzyme-linked immunosorbent assay was performed using the antigen protein used in the mouse immune response to confirm the presence or absence of antibodies.
  • mice in which antibody production was confirmed were sacrificed, splenocytes were isolated, and fused with mouse B lymphoblast cells (F0 cells, ATCC CRL-1646).
  • DMEM medium supplemented with 10% fetal bovine serum and 1% penicillin/streptomycin antibiotics was used for culturing mouse F0 cells.
  • F0 cells were washed three times in serum-free DMEM medium solution supplemented with 1% penicillin/streptomycin antibiotics, and the number of cells was confirmed to be 6.0 ⁇ 10 7 at the last wash.
  • the mouse was sacrificed, the spleen of the sacrificed mouse was removed, the tissue was disrupted using a syringe in a serum-free DMEM medium solution supplemented with 1% penicillin/streptomycin antibiotics, and the undisrupted tissue was discarded using a cell strainer. By removing, a spleen cell suspension was obtained.
  • the spleen cell suspension was centrifuged to aggregate only the spleen cells, diluted in red blood cell lysing solution (Sigma, USA), and washed three times with serum-free DMEM medium solution supplemented with 1% penicillin/streptomycin antibiotics. During the final washing operation, the spleen cell suspension was centrifuged to aggregate the spleen cells. The number of cells was confirmed to be 3.0x108 , and the splenocytes and F0 cells were slowly mixed with a serum-free DMEM medium solution containing 1% penicillin/streptomycin antibiotics and centrifuged at 410 xg for 3 minutes.
  • the cells were added to DMEM medium containing 20% fetal bovine serum and 1% penicillin/streptomycin antibiotics to prepare a suspension.
  • Feeder (medium used to culture F0 cells) was dispensed into each well of a 96-well plate, and 100 ⁇ l of the final suspension was added and cultured at 37°C and 5% CO 2 .
  • HAT medium supplemented with 10% fetal calf serum and 1% penicillin/streptomycin antibiotics, and confluent cells were selectively cultured.
  • the HAT medium was changed a total of 3 times at 1-day intervals, and on the 4th day, it was replaced with HA medium containing 10% fetal bovine serum and 1% penicillin/streptomycin antibiotics, cultured, and colonies observed.
  • the supernatant of the fused cell culture prepared in steps 1-3 above was collected and enzyme-linked immunosorbent assay was performed to confirm the production of antibodies specific to the CDCP1 antigen prepared above. Only cells that produced antibodies specific to the CDCP1 antigen were isolated and transferred to a 24-well plate and cultured.
  • the 96-well plate was diluted and cultured to enter 0.5 antibody-producing fused cells per well, the culture medium was recovered, and 20 ng of CDCP1 protein used as an antigen was coated on the 96-well plate per well, followed by enzyme-linked immunosorbent assay.
  • CDCP1 protein used as an antigen was coated on the 96-well plate per well, followed by enzyme-linked immunosorbent assay.
  • fused cells producing monoclonal antibodies were selected. Selected confluent cells were collected from cell culture, and enzyme-linked immunosorbent assay and ultra-fast flow cytometric automated analysis were performed.
  • the individual type of antibody produced in the culture medium from the monoclonal antibody producing cells finally selected in steps 1-4 above was confirmed using the Monoclonal Isotyping Kit (HRP/ABTS) (Thermo). As a result, it was confirmed that the produced antibody had a kappa light chain of the IgG1 type.
  • RNA was extracted from the monoclonal antibody-producing fusion cells isolated in Example 1 using the RNeasy Plus Micro Kit (QIAGEN, 74034), and a complementary DNA library was obtained using SMARTScribe Reverse Transcriptase (TaKaRa, 639536). Afterwards, the sequences encoding the variable region and complementarity determining region (CDR) of the heavy chain and light chain of the monoclonal antibody were confirmed in Genscript.
  • CDR complementarity determining region
  • nucleic acid sequences encoding the variable regions and complementarity-determining regions of the heavy and light chains of the 4H4 antibody are shown in Table 2 below.
  • nucleic acid sequences encoding the variable regions and complementarity-determining regions of the heavy and light chains of the 2F9 antibody are shown in Table 3 below.
  • the 2B5 and 4H4 antibody producing fused cells (5x10 6 cells/mice) selected in Example 1 were diluted in physiological saline solution containing no calcium and magnesium and intraperitoneally injected into 10-week-old Balb/c mice. Mice were inoculated with Pristane (Sigma, USA) 1 week before inoculation with the fusion cell line. After 14 days, mice were sacrificed, intraperitoneal ascites was recovered, and centrifuged at 842 xg for 15 minutes. The supernatant was bound to Protein A/G plus agarose beads (Santacruz), and only the antibody was separated and purified. The purity of the purified antibody and antigen-specific antibody were confirmed by SDS-PAGE and enzyme-linked immunosorbent assay.
  • Enzyme-linked immunosorbent assay was performed to confirm the cross-reactivity of m2B5 and m4H4 monoclonal antibodies to CDCP1.
  • the proteins used as antigens, Rhesus CDCP1 (Sino Biologics), Human CDCP1 (R&D systems), and Mouse CDCP1 (Sino Biological), were each coated at 20 ng per well on a 96-well plate, followed by blocking buffer (3% BSA and 0.1% Tween). 100 ⁇ l/well of physiological saline containing 20) was dispensed and incubated at room temperature for 30 minutes.
  • Example 3-1 the antibody derived from mouse ascites prepared in Example 3-1 was diluted with blocking buffer (physiological saline solution containing 3% BSA and 0.1% Tween 20) and bound to a concentration of 0.001 to 50 ng/ml.
  • blocking buffer physiological saline solution containing 3% BSA and 0.1% Tween 20
  • HRP-conjugated anti-mouse IgG was diluted 1:2000 using blocking buffer and dispensed at 50 ⁇ l/well.
  • TMB and 1 N HSO 4 were added, respectively, and the absorbance in the 450 nm wavelength range was analyzed using SPECTROstar Nano (BMG LABTECH, Germany).
  • m2B5 is reactive to human and Rhesus CDCP1 in the concentration range, 0.001 to 20 ng/ml ( Figure 6A), and m4H4 is 0.01 to 50 ng/ml. It was confirmed that it was reactive to Human and Rhesus CDCP1 in the ml concentration range ( Figure 6B), but was not reactive to Mouse CDCP1. This suggests that the monoclonal antibody of the present invention exhibits specific reactivity against humans and rhesus monkeys.
  • MDA-MB-468 cells were incubated in blocking buffer (physiological saline solution containing 5% BSA) for 30 minutes and then incubated with different concentrations of 2B5 or 4H4 monoclonal antibody (10, 50, 100, 250, 500 ng/ml). ) was diluted and reacted for 1 hour. After washing twice with washing buffer (physiological saline solution containing 1% BSA), the response to CDCP1 at each concentration was confirmed using Alexa Flour 488 goat anti-mouse IgG (Invitrogen).
  • MDA-MB-468 cells a breast cancer cell line.
  • MDA-MB-468 cells were cultured for 10 minutes in a solution containing 1% BSA, cycloheximide at a concentration of 75 ⁇ g/mL, and Human Fc Block (BD Pharmingen), and then incubated in a solution of Example 3-3 above.
  • Each monoclonal antibody of m2B5 or m4H4 was diluted to the minimum effective concentration established in the binding ability confirmation experiment and reacted for 1 hour.
  • the cells were washed twice with washing buffer (physiological saline solution containing 1% BSA) and incubated for 2 hours in an incubator at 37 °C and 5% CO 2 to induce internalization of the antibody.
  • the negative control was incubated at 4 °C in air. It was cultured for 2 hours under these conditions.
  • the expression of CDCP1 remaining on the cell surface was confirmed using Alexa Flour 488 goat anti-mouse IgG (Invitrogen).
  • the m2B5 monoclonal antibody forms an antibody-antigen complex and is an antibody that can be internalized by about 35% (Figure 8A), and the m4H4 monoclonal antibody forms an antibody-antigen complex. It was confirmed that the antibody was capable of internalizing 29% (Figure 8B).
  • SPR Surface Plasmon Resonance
  • the m2B5 monoclonal antibody showed strong affinity for CDCP1 with a K D value of about 2.6 It was confirmed that the K D value was approximately 4.2
  • Human CDCP1 gene (NP_073753) and its deletion mutant ( ⁇ CUB1-flag; signal sequence of CDCP1 [M1 ⁇ A30] and R368 to E836, ⁇ CUB1- ⁇ CUB2-flag; signal sequence of CDCP1 A FLAG sequence was attached to the C-terminus ([M1 ⁇ A30] and G545 to E836) and transfected into COS7 cells that do not express human CDCP1. Afterwards, the transfected cells were pulverized using RIPA buffer and Western blot was performed.
  • the amino acid sequence for the human Fc portion was grafted onto the variable domain of the anti-CDCP1 antibody obtained in Example 1 and cloned into the pCHO1.0 vector (Thermo).
  • the light chain variable region was fused in frame to the human kappa constant region.
  • the heavy chain variable region for 2F9 was fused in frame to the human IgG1 constant region with point mutations (L234A, L235, P329G), and the heavy chain variable region for 2B5 and 4H4 was fused in frame to the IgG4 constant region.
  • signal peptide sequences for secretion of full-length IgG1 or IgG4 antibodies into the medium were added to each of the two genes and verified once again through sequence analysis after synthesis.
  • restriction enzymes AvrII, BstZ17l, EcoRV, or PacI recognition sites were added to be used in the cloning process.
  • glycerol stock was prepared for each clone, and an endotoxin-free plasmid was used for expression testing in CHO cells.
  • the DNA plasmid obtained in Example 4-1 was transfected into CHO-S cells (Invitrogen, 10743-029). 1 week before transfection, CHO-S cells were grown in CD FortiCHO culture medium, and 1 day before transfection, cells were aliquoted. Nucleic acid-lipofectamine complex was prepared for the transfection sample and transfected at 37°C, 8% Cultured in a CO 2 incubator. After culturing for about 10 days, the culture medium was recovered and bound to a Mab Select SuRe-coated Protein A column (Cytiba), then eluted with 20 mM citric acid, 5% sorbitol (pH 3.5) buffer, and 100 mM Tris. It was neutralized with buffer (pH 9.0). After dialysis with phosphate buffer, it was stored at -70°C.
  • chimeric antibodies against 2B5, 4H4, and 2F9 prepared as above were referred to as chi2B5, chi4H4, and chi2F9, respectively.
  • PANC1 cells a pancreatic cancer cell line
  • RIPA buffer 100 ug of whole cell lysate was mixed with 1 ug of each antibody or 100 ul of cell culture medium and cultured overnight at 4°C using a rotator.
  • Puracruz Protein A/G plus beads
  • MDA-MB-468 cells a breast cancer cell line.
  • MDA-MB-468 cells were cultured in blocking buffer (physiological saline containing 5% BSA) for 30 minutes, then chi2B5, chi4H4, or chi2F9 culture medium was diluted 1/10 and incubated for 1 hour. Afterwards, after washing twice with washing buffer (physiological saline solution containing 1% BSA), the binding ability to CDCP1 was confirmed using Goat anti-human IgG (Gamma chain specific), FITC (Invitrogen).
  • the chi2B5 antibody forms an antibody-antigen complex and can be internalized by about 63% (Figure 15A), and the chi4H4 antibody forms an antibody-antigen complex and can be internalized by about 28% (Figure 15A).
  • Figure 15B it was confirmed that the chi2F9 antibody formed an antibody-antigen complex and was internalized by approximately 32% (Figure 15C).

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Abstract

본 발명은 신규한 항 CDCP-1 항체 또는 이의 항체 단편에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 항-CDCP1 항체 또는 이의 항체 단편을 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물, CDCP1 검출용 조성물 및 상기 항 CDCP-1 항체 또는 이의 항체 단편을 포함하는 항체 약물 접합체에 관한 것이다.

Description

신규 항-CDCP1 항체 및 이의 용도
본 발명은 신규한 항 CDCP-1 항체 또는 이의 항체 단편에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 항-CDCP1 항체 또는 이의 항체 단편을 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물, CDCP1 검출용 조성물 및 상기 항 CDCP-1 항체 또는 이의 항체 단편을 포함하는 항체 약물 접합체에 관한 것이다.
CDCP1(CUB-domain containing protein 1)은 CD318, SIMA135, TRASK 및 gp140이라고도 알려져 있는 것으로, 유방, 폐, 결장직장, 난소, 신장, 간, 췌장 및 조혈계의 악성 종양에서 상향 조절되는 1형 막관통 당단백질이다. 구체적으로, 인간 CDCP1은, 전장 약 836 아미노산으로 이루어지고, 3개의 CUB 도메인(complement C1r/C1s, Uegf, Bmp1 도메인)으로 갖는다. 증가된 수준의 CDCP1은 암의 진행과 현저히 낮은 생존율과 관련이 있는 것으로 알려져 있다. 주로 세포 표면에 위치한 CDCP1은 SRC/PKCδ, PI3K/AKT, WNT, 및 RAS/ERK 축, 산화 오탄당 인산 경로 및 지방산 산화를 포함하는 주요 종양 발생 및 전이 신호 캐스케이드의 연결부에 위치하여 암 세포 생존 및 성장, 전이 및 치료 저항성에 중요한 기능적 기여를 한다.
이에, 다양한 암의 탐지 및 치료를 위해 CDCP1에 특이적이면서 부작용이 없고 유효한 치료제의 개발이 요구되고 있는 실정이다.
본 발명의 목적은 항-CDCP1 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 항-CDCP1항체 또는 이의 항원 결합 단편을 암호화하는 핵산, 이를 포함하는 벡터 및 이와 같은 벡터로 형질 전환된 세포를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 항-CDCP1 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 항-CDCP1 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 CDCP1 검출용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 CDCP1검출용 조성물을 포함하는 암 진단용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 항-CDCP1 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 항체 약물 접합체를 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위한 본 발명의 일 측면은 서열번호 1, 서열번호 11 및 서열번호 21로 이루어진 군에서 선택되는 핵산 서열로부터 발현된 아미노산을 포함하는 중쇄 상보성-결정 영역 1 (CDR-H1); 서열번호 2, 서열번호 12 및 서열번호 22로 이루어진 군에서 선택되는 핵산 서열로부터 발현된 아미노산을 포함하는 중쇄 상보성-결정 영역 2 (CDR-H2); 서열번호 3, 서열번호 13 및 서열번호 23으로 이루어진 군에서 선택되는 핵산 서열로부터 발현된 아미노산을 포함하는 중쇄 상보성-결정 영역 3 (CDR-H3); 서열번호 6, 서열번호 16 및 서열번호 26으로 이루어진 군에서 선택되는 핵산 서열로부터 발현된 아미노산을 포함하는 경쇄 상보성-결정 영역 1 (CDR-L1); 서열번호 7, 서열번호 17 및 서열번호 27로 이루어진 군에서 선택되는 핵산 서열로부터 발현된 아미노산을 포함하는 경쇄 상보성-결정 영역 2 (CDR-L2); 및 서열번호 8, 서열번호 18 및 서열번호 28로 이루어진 군에서 선택되는 핵산 서열로부터 발현된 아미노산을 포함하는 경쇄 상보성-결정 영역 3 (CDR-L3); 을 포함하는, 항-CDCP1 항체 또는 이의 항원 결합 단편인 것일 수 있다.
본 발명에서, 상기 "CDCP-1(CUB-domain containing protein 1)"은 CD318, SIMA135, TRASK 및 gp140 라고도 알려져 있는 것을 모두 포함한다. 상기 CDCP-1은 포유 동물로부터 유래된 것일 수 있으며, 상기 포유동물은 인간, 원숭이, 마우스, 소 또는 말일 수 있다.
본 발명에서, 상기 "항-CDCP1 항체"는 상기 CDCP1에 특이적으로 결합하는 항체를 의미한다. 구체적으로, 항-CDCP1 항체는 CDCP1의 특정 도메인에 특이적으로 결합하여, 이에 따라 CDCP1의 활성 또는 활성화를 억제 또는 중화시킬 수 있다.
본 발명에서, 상기 "항체"는 면역계 내에서 항원의 자극에 의하여 만들어지는 물질을 의미하는 것으로서, 생체 내에서 생성된 것, 재조합적으로 생성된 것, 또는 인공적으로 합성된 것일 수 있으며, 그 종류는 특별히 제한되지 않는다. 본 발명에서 항체는 동물 항체, 키메릭 항체, 인간화 항체, 및 인간 항체를 모두 포함한다. 또한 본 발명에서 항체란 항원 결합능을 보유한 항체의 항원 결합 단편을 모두 포함할 수 있다. 　
구체적으로, 상기 항체는 모든 서브타입의 면역글로불린(예컨대, IgA, IgD, IgE, IgG (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), IgM, 등)에서 선택된 것일 수 있다. 상기 IgG 형태의 항체는 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 서브타입, 예컨대 IgG1 또는 IgG2 서브타입 형태일 수 있다. 또한, 모노클로날 항체, 이중특이적 항체, 미니바디, 도메인 항체, 항체 모방체(또는 합성 항체), 키메라 항체, 인간화 항체, 인간 항체, 항체 융합체(또는 항체 접합체) 및 이의 단편을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, 상기 "항원 결합 단편"은 항원에 대한 특이적 결합능을 갖는 항체의 일부 또는 이를 포함하는 폴리펩타이드를 의미한다. 예컨대, 항원결합단편은 항원(예컨대, 에피토프)과 상호작용하여, 항체에 항원에 대한 특이성 및/또는 친화성을 부여하는 아미노산 잔기를 포함하는 항체의 일부 또는 이를 포함하는 폴리펩타이드일 수 있다. 상기 항원 결합 단편은 상기 상보성 결정 영역을 하나 이상 포함하는 항체 단편, 예컨대, scFv, (scFv)2, scFv-Fc, Fab, Fab' 및 F(ab')2로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이러한 생물학적 활성 단편은 재조합 DNA 기술에 의해 생산되거나, 또는 예를 들면 온전한 항체를 효소적 또는 화학적 절단하여 생산될 수 있다. 면역학적으로 기능적인 면역글로불린 단편에는 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 "상보성　결정 영역 (Complementarity-determining regions, CDR)"라 함은, 항체의 가변 영역 중에서 항원과의 결합 특이성을 부여하는 부위를 의미한다.
구체적으로, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은, 서열번호 1의 핵산 서열로부터 발현된 아미노산을 포함하는 중쇄 상보성-결정 영역 1; 서열번호 2의 핵산 서열로부터 발현된 아미노산을 포함하는 중쇄 상보성-결정 영역 2; 서열번호 3의 핵산 서열로부터 발현된 아미노산을 포함하는 중쇄 상보성-결정 영역 3; 서열번호 6의 핵산 서열로부터 발현된 아미노산을 포함하는 경쇄 상보성-결정 영역 1; 서열번호 7의 핵산 서열로부터 발현된 아미노산을 포함하는 경쇄 상보성-결정 영역 2; 및 서열번호 8의 핵산 서열로부터 발현된 아미노산을 포함하는 경쇄 상보성-결정 영역 3; 을 포함하는, 항-CDCP1 항체 또는 이의 항원 결합 단편인 것일 수 있다.
더욱 구체적으로, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 5의 핵산 서열로부터 발현된 아미노산을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열번호 10의 핵산 서열로부터 발현된 아미노산을 포함하는 경쇄 가변 영역; 을 포함하는, 항-CDCP1 항체 또는 이의 항원 결합 단편인 것일 수 있다.
또한 구체적으로, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은, 서열번호 11의 핵산 서열로부터 발현된 아미노산을 포함하는 중쇄 상보성-결정 영역 1; 서열번호 12의 핵산 서열로부터 발현된 아미노산을 포함하는 중쇄 상보성-결정 영역 2; 서열번호 13의 핵산 서열로부터 발현된 아미노산을 포함하는 중쇄 상보성-결정 영역 3; 서열번호 16의 핵산 서열로부터 발현된 아미노산을 포함하는 경쇄 상보성-결정 영역 1; 서열번호 17의 핵산 서열로부터 발현된 아미노산을 포함하는 경쇄 상보성-결정 영역 2; 및 서열번호 18의 핵산 서열로부터 발현된 아미노산을 포함하는 경쇄 상보성-결정 영역 3; 을 포함하는, 항-CDCP1 항체 또는 이의 항원 결합 단편인 것일 수 있다.
더욱 구체적으로, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 15의 핵산 서열로부터 발현된 아미노산을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열번호 20의 핵산 서열로부터 발현된 아미노산을 포함하는 경쇄 가변 영역; 을 포함하는, 항-CDCP1 항체 또는 이의 항원 결합 단편인 것일 수 있다.
또한 구체적으로, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은, 서열번호 21의 핵산 서열로부터 발현된 아미노산을 포함하는 중쇄 상보성-결정 영역 1; 서열번호 22의 핵산 서열로부터 발현된 아미노산을 포함하는 중쇄 상보성-결정 영역 2; 서열번호 23의 핵산 서열로부터 발현된 아미노산을 포함하는 중쇄 상보성-결정 영역 3; 서열번호 26의 핵산 서열로부터 발현된 아미노산을 포함하는 경쇄 상보성-결정 영역 1; 서열번호 27의 핵산 서열로부터 발현된 아미노산을 포함하는 경쇄 상보성-결정 영역 2; 및 서열번호 28의 핵산 서열로부터 발현된 아미노산을 포함하는 경쇄 상보성-결정 영역 3; 을 포함하는, 항-CDCP1 항체 또는 이의 항원 결합 단편인 것일 수 있다. 더욱 구체적으로, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 25의 핵산 서열로부터 발현된 아미노산을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열번호 30의 핵산 서열로부터 발현된 아미노산을 포함하는 경쇄 가변 영역; 을 포함하는, 항-CDCP1 항체 또는 이의 항원 결합 단편인 것일 수 있다.
본 발명에서, "중쇄"는 항원 또는 에피토프에 대한 결합 특이성을 제공하기에 충분한 가변영역 서열을 갖는 전장 중쇄 및 이의 단편을 포함한다. 전장 중쇄는 가변영역 도메인 VH 및 3개의 불변영역 도메인 CH1, CH2 및 CH3을 포함한다. VH 도메인은 중쇄 폴리펩타이드의 아미노 말단에 존재하고, CH 도메인은 카복시 말단에 존재하며, CH3가 카복시-말단에 가장 가깝게 위치한다. 중쇄는 IgG (IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4 서브타입 포함), IgA (IgA1 및 IgA2 서브타입 포함), IgM 및 IgE의 아이소타입을 포함한다.
본 발명에서, "경쇄"는 항원 또는 에피토프에 대한 결합 특이성을 제공하기에 충분한 가변영역 서열을 갖는 전장의 경쇄 및 이의 단편을 포함한다. 전장 경쇄는 가변영역 도메인 VL, 및 불변영역 도메인 CL을 포함한다. 경쇄의 가변영역 도메인은 경쇄 폴리펩타이드의 아미노 말단에 존재한다. 경쇄의 종류에는 카파 및 람다 사슬이 포함된다.
본 발명의 항-CDCP1 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 중쇄 및 경쇄 가변영역의 상보성 결정 영역은 상기의 핵산 서열로부터 발현된 아미노산 서열과 실질적인 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.
상기 "실질적인 서열 동일성"은, 상기한 본 발명의 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에，70%의 서열 상동성, 보다 바람직하게는 80%의 상동성 또는 90%의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다. 서열비교를 위한 얼라인먼트 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 일 실시예에서 개시된 중쇄 가변 영역과 약 90 %, 95 %, 또는 99 % 동일성을 가진다. 다른 실시예에서 개시된 경쇄 가변 영역과 약 90 %, 95 %, 또는 99 % 동일성을 가진다. 예를 들면 본 발명에 개시된 항체 또는 항원 결합 단편의 서열과 90 %, 95 %, 또는 99 % 동일성을 나타내는 변이체의 경우, 임의의 변이는 CDR 보다는 가변영역의 골격에서 발생될 수 있다.
또한 구체적으로, 상기 본 발명의 항-CDCP1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 CDCP1의 CUB1 도메인에 특이적으로 결합하는 것일 수 있다.
본 발명 일 실시예에서는 본 발명의 항-CDCP1 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 상기 CUB1 도메인을 인식하여 CDCP1에 대해 높은 친화도로 결합하는 것을 확인하였다.
본 발명에서 "친화성 또는 친화도(affinity)"는 항체 또는 이의 항원 결합단편과 항원 사이의 상호작용의 강도이며, 항체 또는 항원결합 단편의 CDR 서열, 및/또는 항체 또는 항원결합 단편의 물리화학적 특성(친수성/소수성, 정전기적 특성 등), 항원의 크기, 모양, 및/또는 전하와 같은 항원의 특징 등에 의해 결정될 수 있다. 이러한 친화도를 결정하는 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 통상적으로 해리 상수(dissociation constant, KD)로 나타낼 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에서는 본 발명에 따른 항-CDCP1 항체가 인간 CDCP1에 대한 특이성을 가지며, 내재화 기능과 친화력이 우수함을 확인하였다(도 6 내지 도 9). 따라서, 본 발명에 따른 항-CDCP1 항체는 암의 예방 및/또는 치료를 위하여 사용될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 키메라 항-CDCP1 항체는 인간 CDCP1에 대한 특이성을 가지며, 내재화 기능과 친화력이 우수함을 확인하였다(도 12 내지 도 14). 따라서, 본 발명에 따른 키메라 항-CDCP1 항체는 인간에서 발생하는 암의 예방 및 치료를 위하여 효과적으로 사용될 수 있다.
본 발명의 다른 측면은 항-CDCP1 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 암호화하는 핵산에 관한 것이다.
상기 폴리뉴클레오티드는 공지된 화학적 합성법에 의해서 제조될 수 있으며, 상기 항-CDCP1 항체 또는 항원 결합 단편을 암호화하는 단일 또는 이중가닥의 뉴클레오타이드 폴리머로서 DNA, RNA 또는 이의 변형체를 모두 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 상기 핵산을 포함하는 재조합 벡터에 관한 것이다.
상기 "재조합 벡터"는 적당한 숙주세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있는 발현 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동 가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 말한다. 재조합 벡터와의 작동 가능한 연결은 당해 기술 분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 이용할 수 있다.
구체적으로, 상기 벡터는 발현벡터일 수 있으며, 숙주 세포를 선택하기 위한 선택성 마커를 포함하고, 복제 가능한 발현벡터인 경우 복제 기원을 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 예는 상기 재조합 벡터로 형질전환된 세포에 관한 것이다.
상기 "형질전환된 세포"는 숙주세포에 목적으로 하는 폴리뉴클레오티드 또는 재조합 벡터를 도입한 세포를 의미한다. 형질전환은 상기 '도입' 방법에 의해 외래 DNA를 세포 내로 유입시킨 것일 수 있고, 당 분야에서 공지된 바와 같이 숙주세포에 따라 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 또한, 상기 형질전환된 세포의 종류는 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 일 측면은 항-CDCP1 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서, "예방"은 본 발명의 조성물이 암의 발생을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서, "치료"는 본 발명의 조성물이 암의 증상이 호전되도록 하거나 이롭게 되도록 하는 모든 행위를 의미한다.
구체적으로, 상기 "암"은 골암, 폐암, 두부암, 경부 암, 갑상선암, 부갑상선암, 비소세포성폐암, 위암, 간암, 췌장암, 피부암, 피부 또는 안구내 흑색종, 직장암, 항문부근암, 결장암, 자궁암, 유방암, 난소암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병, 식도암, 소장암, 내분비선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 방광암, 신장암 또는 수뇨관 암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, 중추신경계 종양, 중추신경계 림프종, 척수 종양, 교모세포종, 뇌간 신경교종, 뇌하수체 선종일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 적용될 수 있으며, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 성별, 연령, 질병의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 상기 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 암의 예방 또는 치료방법에 관한 것이다.
본 발명의 "개체"는 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 증상이 호전될 수 있는 암을 가진 동물 또는 인간을 포함한다. '암'은 전술한 바와 같다.
본 발명에 따른 치료용 조성물을 개체에게 투여함으로써, 암을 효과적으로 예방 및 치료할 수 있다.
본 발명의 "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 인간 또는 동물에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며, 본 발명에 따른 치료용 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 경구 또는 비경구 투여될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 치료용 조성물은 유효성분이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 상기 약학적 조성물의 암의 예방 또는 치료 용도에 관한 것이다. '암'은 전술한 바와 같다.
본 발명의 또 다른 측면은, 상기 항-CDCP1 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는, CDCP1 검출용 조성물에 관한 것이다. 상기 검출용 조성물에 포함되는 항체는 검출 가능한 표지 물질로 표지될 수 있다. 예를 들어, 방사성동위원소 또는 방사성핵종(예를 들면, 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I), 형광 물질(예를 들면, FITC, 로다민, 란탄족 형광체), 효소(예를 들면, 호스래디쉬 퍼옥시다제, β-갈락토시다제, 루시퍼라제, 알칼리성 포스파타제), 화학발광기, 바이오티닐기, 또는 2차 리포터에 의해 인식되는 폴리펩타이드 에피토프(예를 들면, 류신 지퍼 쌍 서열, 항체에 대한 결합 부위, 금속 결합 도메인, 에피토프 태그)가 포함되나 이로 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 측면은 상기 검출용 조성물을 포함하는 암 진단용 키트에 관한 것이다. 상기 키트는 본 발명의 CDCP1을 검출할 수 있는 제제, 예를 들어 본 발명의 항 CDCP1 항체 및 이의 항원 결합 단편 뿐 아니라, 각종 표지물질, 완충액 등이 함께 사용될 수 있으며, 당업계에 공지된 모든 키트의 구성을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 항체를 생물학적 시료와 반응시켜 암의 발병 여부 또는 발병 가능성을 진단할 수 있다. 구체적으로, 항-CDCP1 항체 또는 이의 기능적 단편과 생물학적 시료를 접촉시켜 항원-항체 복합체의 형성 여부를 확인함으로써 진단할 수 있다.
상기 "생물학적 시료"는 조직, 세포, 혈액, 혈청, 혈장, 조직 부검 시료(뇌, 피부, 림프절, 척수) 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 측면은 상기 항-CDCP1 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하고, 상기 항체 또는 항원 결합 단편에는 하나 이상의 약물이 접합된, 항체 약물 접합체에 관한 것이다.
본 발명에서, "항체 약물 접합체(antibody-drug conjugate, ADC)"는 항체와 약물의 생물학적 활성을 저하시키지 않으면서 약물과 항체를 화학적으로 연결한 형태를 지칭한다. 상기 항체-약물 접합체는 "항체-링커-약물"로 구성될 수 있다.
상기 본 발명의 "항체"는 전술한 바와 같다.
상기 "링커"는 항체에 약물을 공유 결합시키는 원자쇄를 포함하는 화학적 부분을 말한다. 링커는 약물과 연결된 형태로 제조될 수 있으며, 링커 말단에는 항체와 연결시킬 수 있는 반응기를 갖는다. 링커는 항체의 중쇄 및/또는 경쇄와 반응하여 가교할 수 있다면 그 형태는 제한되지 않는다.
상기 "약물" 은 세포에 특정 생물학적 활성을 가지는 임의의 물질을 의미할 수 있으며, 이는 화합물, DNA, RNA, 펩타이드 등을 모두 포함한다.
구체적으로, 약물은 세포에 세포 사멸, 세포 증식, 면역 활성, 면역 억제를 포함하여 특정 신호전달의 활성화, 또는 특정 신호전달의 억제 등을 일으킬 수 있는 물질을 모두 포함하며, 특히, 세포독성 약물 또는 면역 억제제일 수 있다. 더욱 구체적으로, 상기 약물은 항암제, 항종양제일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 항-CDCP1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 CDCP1에 특이적으로 결합하며, 강한 친화도를 갖는다. 이에 따라, 본 발명의 항-CDCP1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 CDCP1에 의해 매개되는 암을 예방 또는 치료할 수 있으며, CDCP1을 검출함으로써 암 진단 용도로도 활용될 수 있다.
본 발명의 효과는 상기한 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 상세한 설명 또는 청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
도 1 은 본 발명에서 제조된 단일 클론 항체의 CDCP1에 대한 결합능을 확인한 결과를 나타낸 것이다(A; 2B5, B; 4H4, C; 2F9).
도 2는 본 발명 2B5 항체의 인간 CDCP1에 대한 결합능을 MDA-MB-468 세포에서 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명 4H4 항체의 인간 CDCP1에 대한 결합능을 MDA-MB-468 세포에서 확인한 결과를 나타낸 것이다
도 4는 본 발명 2F9 항체의 인간 CDCP1에 대한 결합능을 MDA-MB-468 세포에서 확인한 결과를 나타낸 것이다
도5는 본 발명 단일 클론 항체의 항원-항체 복합체 내재화를 확인한 결과를 나타낸 것이다(A; 2B5, B; 4H4, C; 2F9).
도 6는 본 발명 2B5 및 4H4 항체의 교차반응성을 확인한 결과를 나타낸 것이다(A; 2B5, B; 4H4).
도 7은 본 발명 m2B5 및 m4H4 항체의 결합능을 확인한 결과를 나타낸 것이다(A; m2B5, B; m4H4).
도 8은 본 발명 m2B5 및 m4H4 항체의 내재화 기능을 확인한 결과를 나타낸 것이다(A; m2B5, B; m4H4).
도 9는 본 발명 m2B5 및 m4H4 항체의 친화력을 확인한 결과를 나타낸 것이다(A; m2B5, B; m4H4).
도 10은 본 발명 m2B5 항체의 CDCP1에 대한 결합 부위를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 본 발명 m4H4 항체의 CDCP1에 대한 결합 부위를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 본 발명 2B5, 4H4 및 2F9 키메라 항체의 경쇄 및 중쇄 발현용 벡터를 나타낸 것이다(A; 2B5, B; 4H4, C; 2F9).
도 13은 본 발명 chi2B5, chi4H4 및 chi2F9 항체의 CDCP1에 대한 결합능을 확인한 결과를 나타낸 것이다(A; chi2B5, B; chi4H4, C; chi2F9).
도 14는 본 발명 chi2B5, chi4H4 및 chi2F9 항체의 CDCP1에 대한 친화력을 확인한 결과를 나타낸 것이다(A; chi2B5, B; chi4H4, C; chi2F9).
도 15는 본 발명 chi2B5, chi4H4 및 chi2F9 항체의 내재화를 확인한 결과를 나타낸 것이다(A; chi2B5, B; chi4H4, C; chi2F9).
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 항-CDCP1 항체 제조
1-1. 면역화된 마우스 제작
1-2. 항체 생성 세포의 확인 및 선별
상기 1-1의 마지막 면역일로부터 3일 후, 효소 면역 측정법을 실시하여 항체 생성을 확인하였다. 구체적으로, 면역화 된 마우스의 안구에서 혈액을 채취하여 1.5 ml 미세원심분리 튜브(e-tube)에 담은 후, 4 ℃에서 21,055 x g에서 15 분 동안 원심 분리하여 분획된 혈청을 -20° C에 보관하였다. 마우스 면역반응에 사용한 항원 단백질을 사용하여 비간접적 효소면역 측정법을 수행하여 항체 생성유무를 확인하였다.
1-3. 하이브리도마의 제조
항체 생성이 확인된 마우스를 희생하여 비장세포를 분리하고, 마우스 B림프모구 세포(F0 cell, ATCC CRL-1646)와 융합하였다. 10 % 소태아 혈청 및 1 % 페니실린/스트렙토마이신 항생제를 첨가한 DMEM 배지를 마우스 F0 세포의 배양에 사용하였다.
세포 융합과정을 진행하기 전에 F0 세포를 1 % 페니실린/스트렙토마이신 항생제를 첨가한 무혈청 DMEM 배지 용액에 3회 세척하여 마지막 세척 작업시 6.0ⅹ107 개의 세포수를 확인하였다.
마우스를 희생시키고, 희생된 마우스의 비장을 적출하여 1 % 페니실린/스트렙토마이신 항생제가 첨가된 무혈청 DMEM 배지 용액에서 주사기를 사용하여 조직을 파쇄 후, 셀 스트레이너(cell strainer)로 파쇄되지 않은 조직을 제거하여 비장세포 현탁액을 얻었다.
비장세포 현탁액을 원심분리하여 비장세포만 응집시킨 뒤, 적혈구 용해용액(Sigma, USA)에 희석시키고, 1 % 페니실린/스트렙토마이신 항생제가 첨가된 무혈청 DMEM 배지 용액으로 3 회 세척하고 마지막 세척 작업시 3.0ⅹ108 개의 세포수를 확인하고, 1 % 페니실린/스트렙토마이신 항생제가 첨가된 무혈청 DMEM배지 용액으로 비장세포 및 F0 세포를 천천히 섞어준 뒤 410 x g에서 3 분 동안 원심 분리하였다.
그 다음, 50 %(M/V) 폴리에틸렌글리콜(PEG, Sigma, USA) 1 ml을 적하하며 1 분 동안 균질하게 혼합한 후, 이와 같이 제조된 융합 혼합용액을 1 % 페니실린/스트렙토마이신 항생제가 첨가된 무혈청 DMEM 배지 용액으로 희석하여 182 x g에서 5 분 동안 원심분리하였다.
그 후, 세포를 20 % 소태아혈청 및 1 % 페니실린/스트렙토마이신 항생제가 포함된 DMEM 배지에 첨가하여 현탁액을 제조하였다. 96 웰 플레이트의 각 웰에 먹이배지(Feeder, F0 세포를 배양하던 배지)가 분주된 상태에 최종 현탁액을 100 μl 씩 첨가하여 37 ℃, 5 % CO2에서 배양하였다.
1 일 후 10 % 소태아혈청 및 1 % 페니실린/스트렙토마이신 항생제를 첨가한 HAT배지로 교체하고융합세포를 선별적으로 배양하였다. HAT 배지는 1 일 간격으로 총 3 회 교체하였으며, 4 일차에 10 % 소태아혈청 및 1 % 페니실린/스트렙토마이신 항생제가 포함된 HA 배지로 교체하여 배양하고 콜로니(colony)를 관찰하였다.
1-4. 항체 생성 융합세포의 선택 및 분리
상기 1-3에서 제조한 융합된 세포 배양액의 상층액을 수집하고 효소면역 측정법을 실시하여, 상기 제조된 CDCP1 항원에 특이적인 항체 생성을 확인하였다. CDCP1 항원에 특이적인 항체가 생성된 세포만을 분리하여 24-웰 플레이트로 옮겨 배양하였다.
이후 96-웰 플레이트에 웰당 0.5 개의 항체 생성 융합세포가 들어가도록 희석하여 배양한 후 배양액을 회수하고, 96-웰 플레이트에 항원으로 사용한 CDCP1 단백질을 웰당 20 ng을 코팅한 후, 효소면역 측정법을 실시하여 단일 클론 항체를 생산하는 융합세포를 선택하였다. 선택된 융합세포를 세포 배양액에서 수집하고, 효소면역 측정법 및 초고속 유세포 자동 분석을 수행하였다.
그 결과, 최종적으로 2B5, 4H4, 2F9, 3개의 단일 클론 항체를 생산하는 융합세포가 선택되었다. 도 1 내지 4에 나타난 바와 같이, 2B5, 4H4 및 2F9 단일 클론 항체는 CDCP1에 대해 결합능이 있는 것을 확인하였으며, 도 5에 나타난 바와 같이, 항체의 내재화가 일어남을 확인하였다.
1-5. 단일 클론 항체 생성 융합세포의 개별형(Isotype) 확인
Monoclonal Isotyping Kit (HRP/ABTS) (Thermo)를 사용하여 상기 1-4에서 최종적으로 선별된 단일클론 항체 생성 세포에서 배양액에 대해 생성되는 항체의 개별형을 확인하였다. 그 결과, 제작된 항체는 IgG1 유형에 카파(kappa) 경쇄를 가지는 것을 확인하였다.
실시예 2. 항-CDCP1 항체 IgG 가변 영역의 염기 서열 분석
실시예 1에서 분리한 단일 클론 항체 생성 융합 세포로부터 RNeasy Plus Micro Kit(QIAGEN, 74034)를 사용하여 총(total) RNA를 추출하였고, SMARTScribe Reverse Transcriptase(TaKaRa, 639536)로 상보성 DNA 라이브러리를 얻었다. 이후, Genscript에서 단일 클론 항체 중쇄(Heavy chain) 및 경쇄(Light chain)의 가변 영역(Variable region) 및 상보성 결정 영역(complementarity determining region, CDR)을 암호화한 서열을 확인하였다.
2B5 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 및 상보성 결정 영역을 암호화하는 핵산 서열은 하기 표 1에 나타난 바와 같다.
Figure PCTKR2023016475-appb-img-000001
4H4 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 및 상보성 결정 영역을 암호화하는 핵산 서열은 하기 표 2에 나타난 바와 같다.
Figure PCTKR2023016475-appb-img-000002
2F9 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 및 상보성 결정 영역을 암호화하는 핵산 서열은 하기 표 3에 나타난 바와 같다.
Figure PCTKR2023016475-appb-img-000003
3. 마우스 유래 항체 제조
3-1. 마우스 복수 유래 항체 제조
과량의 항체를 얻기 위해 상기 실시예 1에서 선택한 2B5 및 4H4 항체 생성 융합세포(5x106cells/mice)를 칼슘 및 마그네슘이 함유되지 않은 생리식염수에 희석하여 10주령 Balb/c 마우스에 복강 주입하였다. 마우스는 융합세포주 접종 1주일전 Pristane(Sigma, USA)을 접종하였다. 14 일 후 마우스를 희생시켜 복강 내 복수를 회수하고 842 x g에서 15 분 동안 원심분리하였다. 상층액은 Protein A/G plus agarose beads(Santacruz)에 결합시킨 후 항체만을 분리 정제하였고, SDS-PAGE 및 효소면역측정법으로 정제된 항체의 순도 및 항원에 특이적인 항체임을 확인하였다.
3-2. m2B5 및 m4H4 단일 클론 항체의 교차반응성 확인
m2B5 및 m4H4 단일 클론 항체의 CDCP1에 대한 교차반응을 확인하기 위해 효소면역측정법을 수행하였다. 항원으로 사용한 단백질인 Rhesus CDCP1(Sino Biologics), Human CDCP1(R&D systems) 및 Mouse CDCP1(Sino Biological) 단백질을 96-웰 플레이트에 웰당 20 ng씩 각각 코팅 후, Blocking buffer(3 % BSA 및 0.1 % Tween 20이 함유된 생리식염수)를 100 μl/well 분주하여 상온에서 30 분간 배양하였다.
이후, 상기 실시예 3-1에서 제조된 마우스 복수 유래 항체를 Blocking buffer(3 % BSA 및 0.1 % Tween 20이 함유된 생리식염수)로 희석하여 0.001 내지 50 ng/ml 농도로 결합시켰다. 그 다음, 0.1 % Tween 20이 함유된 생리식염수로 웰을 세척 후 HRP-conjugated anti-mouse IgG(Thermo)는 Blocking buffer를 사용하여 1:2000로 희석하여 50 μl/well 분주하였다. 0.1 % Tween 20이 함유된 생리식염수로 웰을 세척 후 TMB, 1 N HSO4 각각 넣어준 뒤 SPECTROstar Nano(BMG LABTECH, Germany)를 사용하여 450 nm파장대의 흡광도를 분석하였다.
그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이, m2B5는 농도 범위에서 인간(Human) 및 리서스(Rhesus) CDCP1에 반응성을 가지며, 0.001 내지 20 ng/ml (도 6A), 및 m4H4는 0.01 내지 50 ng/ml 농도 범위에서 인간(Human) 및 리서스(Rhesus) CDCP1에 반응성을 가지고(도 6B), Mouse CDCP1에 대해서는 반응성이 없음을 확인하였다. 이는, 본 발명의 단일 클론 항체는 인간 및 리서스 원숭이에 대해 특이적인 반응성을 나타냄을 시사한다.
3-3. m2B5 및 m4H4 단일 클론 항체의 결합능 확인
m2B5 및 m4H4 단일 클론 항체의 결합능을 확인하고자 유방암 세포주인 MDA-MB-468 세포를 사용하여 초고속 유세포 자동 분석을 수행하였다. MDA-MB-468세포를 blocking buffer(5 % BSA가 함유된 생리식염수)에 30 분 동안 배양한 후 2B5 또는 4H4의 단일 클론 항체 농도를 달리하여(10, 50, 100, 250, 500 ng/ml) 희석시켜 1 시간 동안 반응시켰다. 이후 Washing buffer(1% BSA 가 함유된 생리식염수)로 2 회 세척 후 Alexa Flour 488 goat anti-mouse IgG(Invitrogen)을 이용하여 CDCP1에 대한 농도별 반응을 확인하였다.
그 결과, 도 7에 나타난 바와 같이, MDA-MB-468에 존재한 CDCP1에 대해 제작한 항체가 고농도일수록 반응성이 증가하며, 최대 반응성을 확인하기 위한 최소 유효농도는 m2B5 단일 클론 항체의 경우 50 ng/ml이며(도 7A), m4H4 단일 클론 항체의 경우 100 ng/ml 임을 확인하였다(도 7B).
3-4. m2B5 및 m4H4 단일 클론 항체의 내재화 확인
m2B5 및 m4H4 단일 클론 항체의 내재화를 확인하고자 유방암 세포주인 MDA-MB-468 세포를 사용하여 초고속 유세포 자동 분석을 수행하였다. MDA-MB-468세포를 1 % BSA, 75 μg/mL농도의 사이클로헥사마이드(cycloheximide), Human Fc Block(BD Pharmingen쪠)가 섞인 용액에 10 분 동안 배양한 후, 상기 실시예 3-3의 결합능 확인실험에서 확립한 최소 유효농도로 m2B5 또는 m4H4 각각의 단일 클론 항체를 희석시켜 1 시간 동안 반응시켰다. 이후, Washing buffer(1% BSA 가 함유된 생리식염수)로 2 회 세척 후 항체의 내재화 반응을 유도하기 위해 37 °C, 5 % CO2 인큐베이터에서 2 시간 동안 배양하였으며, 음성 대조군은 4 ℃, 대기 조건에서 2 시간 동안 배양하였다. Alexa Flour 488 goat anti-mouse IgG (Invitrogen)을 이용하여 세포 표면에 남아있는 CDCP1의 발현을 확인하였다.
그 결과, 도 8에 나타난 바와 같이, MDA-MB-468 세포에서 m2B5 단일 클론 항체는 항체-항원 복합체를 이루어 약 35% 내재화 가능한 항체이며(도 8A), m4H4 단일 클론 항체는 항체-항원 복합체를 이루어 29% 내재화 가능한 항체임을 확인하였다(도 8B).
3-5. m2B5 및 m4H4 단일 클론 항체의 친화력 확인
m2B5 및 m4H4 단일 클론 항체의 친화력을 확인하기 위하여 SPR(Surface Plasmon Resonance) 분석을 수행하였다. SR7500DC(Reichert, USA)를 사용하여, 항체 제작을 위해 사용된 CDCP1 단백질을 PEG chip(Reichert, USA)에 고정시킨 후, 서로 다른 농도의 m2B5 또는 m4H4 각각의 단일 클론 항체를 1 분당 30 ul씩 흘렸을 때의 CDCP1에 대한 친화도인 KD 값을 Scrubber2 프로그램을 이용하여 분석하였다. KD 값은 Kd를 Ka로 나눈 값으로, 수치가 낮을수록 해당 타겟에 대한 결합능이 크다는 것을 의미한다.
그 결과, 도 9에 나타난 바와 같이, m2B5 단일 클론 항체는 CDCP1에 대한 KD값이 약 2.6 X 10-11 M으로 강한 친화도를 나타내었으며(도 9A), m4H4 단일 클론 항체 역시 CDCP1 항원에 대한 KD값이 약 4.2 X 10-11 M으로 강한 친화도를 나타냄을 확인하였다(도 9B).
3-6. m2B5 및 m4H4 단일 클론 항체의 도메인 맵핑
인간 CDCP1 유전자 (NP_073753) 및 그의 결실 변이체(△CUB1-flag; CDCP1의 신호 서열(signal sequence)[M1~A30]와 R368부터 E836, △CUB1-△CUB2-flag; CDCP1의 신호 서열(signal sequence)[M1~A30]와 G545부터 E836)에 C-말단(terminal)쪽 FLAG서열을 부착시켜 인간 CDCP1이 발현되지 않는 COS7 세포에 형질 감염시켰다. 이후, 형질 감염된 세포를 RIPA 버퍼를 사용하여 세포를 분쇄한 후 웨스턴 블롯(Western blot)을 실시하였다.
그 결과, 도 10 및 도 11에 나타난 바와 같이, m2B5 항체(도 10) 및 m4H4 항체(도 11) 모두 CUB1 도메인(domain) (C221-S350)이 결실된 CDCP1을 인식하지 못하였으며, CDCP1에 대한 결합 부위는 CUB1 도메인인 것을 확인하였다.
4. 키메라 항체 제조
4-1. 키메라 항체의 경쇄 및 중쇄 발현용 세트 제작
상기 실시예 1에서 얻은 항-CDCP1 항체의 가변 도메인에 인간 Fc 부분에 대한 아미노산 서열을 그래프팅하고, pCHO1.0 벡터(Thermo)내에 클로닝하였다. 경쇄 가변 영역은 인간 카파 불변 영역에 대한 프레임 내 융합시켰다. 2F9에 대한 중쇄 가변 영역은 인간 IgG1 불변 영역에 점 돌연변이(point mutation, L234A, L235, P329G)을 준 프레임 내에 융합하였고, 2B5 및 4H4에 대한 중쇄 가변 영역은 IgG4 불변 영역에 대한 프레임 내에 융합하였다. 또한, 전장 IgG1 또는 IgG4 항체의 배지내 분비를 위한 신호(signal) 펩타이드 서열을 두 유전자에 각각 추가하여 합성 후 서열 분석을 통해 다시 한번 검증하였다. 아울러 hybrid promoter 와 poly A 사이에 항체 단백질을 삽입하기 위해 제한효소 AvrII, BstZ17l, EcoRV 또는 PacI 인식부위를 첨가하여 클로닝 과정에 사용되도록 하였다.
상기와 같은 과정을 통해, 도 12에 나타난 바와 같이, "EF2/CMV 프로모터-[AvrII]-2B5/4H4/2F9 경쇄 또는 중쇄 서열-[BstZ17l]-poly A-CMV/EF1 프로모터-[EcoRV]-2B5/4H4/2F9 중쇄 또는 경쇄-[PacI]]-poly A"를 제작하였다.
이후, 각 클론에 대해 글리세롤 스톡을 제조하고 엔도톡신이 없는 플라스미드(Plasmid)를 CHO 세포내에서 발현 시험에 사용하였다.
4-2. CHO 세포에 형질 감염 후 항체의 생산 및 분리 정제
상기 실시예 4-1에서 얻어진 DNA 플라스미드를 CHO-S 세포(Invitrogen, 10743-029)에 형질 감염시켰다. 형질감염 1 주일 전 CHO-S 세포를 CD FortiCHO 배양배지에 성장시키고 형질감염 1 일 전 세포를 분주한 후, 형질감염 시료에 대해 핵산-리포펙타민 복합체를 준비하여 형질감염 시키고 37 ℃, 8 % CO2 인큐베이터에서 배양하였다. 약 10 일간 배양 후, 배양액을 회수하여 Mab Select쪠 SuRe쪠 Protein A column(Cytiba)에 결합시킨 후 20 mM 시트르산(Citric acid), 5 % 솔비톨(sorbitol) (pH 3.5) 버퍼로 용출하고 100 mM Tris buffer(pH 9.0) 로 중화하였다. Phosphate buffer로 dialysis 한 후 -70 ℃에 보관하였다.
상기와 같이 제조한 2B5, 4H4 및 2F9에 대한 키메라 항체를 각각 chi2B5, chi4H4 및 chi2F9라 하였다.
4-3. chi2B5, chi4H4 및 chi2F9 항체의 친화력 확인
췌장암 세포주인 PANC1 세포를 RIPA 버퍼로 분쇄하여 얻은 whole cell lysate을 100 ug씩 사용하여 제작한 각각의 항체 1 ug 또는 세포 배양액 100 ul를 혼합하여 4 ℃ 조건에서 로테이터(Rotator)를 사용하여 밤새 배양하였다. Protein A/G plus beads (Santacruz)를 사용하여 chi2B5, chi4H4 또는 chi2F9 세포배양액과 결합하는 단백질을 침전시킨 샘플을 항-CDCP1(Cell signaling)로 immunoblotting하여 관찰하였다. 이때 각각의 항체의 Isotype control 인 Normal mouse IgG(Santacruz) 또는 Normal human IgG(Thermo)은 음성 대조군으로 사용하였다.
그 결과, 도 13에 나타난 바와 같이, 상기 chi2B5(도 13A), chi4H4(도 13B) 및 chi2F9(도 13C) 항체 모두 PANC1 세포의 CDCP1에 결합능이 있음을 확인할 수 있다.
또한, 유방암 세포주인 MDA-MB-468 세포를 사용하여 초고속 유세포 자동 분석을 수행하였다. MDA-MB-468세포를 Blocking buffer(5 % BSA가 함유된 생리식염수)에 30 분 동안 배양한 후 chi2B5, chi4H4 또는 chi2F9 배양액을 1/10로 희석하여 1 시간 반응시켰다. 이후, Washing buffer(1 % BSA 가 함유된 생리식염수)로 2 회 세척 후 Goat anti-human IgG(Gamma chain specific), FITC(Invitrogen)을 이용하여 CDCP1에 대한 결합능을 확인하였다.
그 결과, 도 14에 나타난 바와 같이, 상기 chi2B5(도 14A), chi4H4(도 14B) 및 chi2F9(도 14C) 항체 모두 CDCP1에 대해 제작한 항체의 결합능이 있음을 확인되었다.
4-4. chi2B5, chi4H4 및 chi2F9 항체의 내재화 확인
chi2B5, chi4H4 및 chi2F9 항체의 내재화를 확인하고자 췌장암 세포주인 PANC1 세포를 사용하여 초고속 유세포 자동 분석을 수행하였다. PANC1 세포를 1% BSA, 75 ug/mL 농도의 사이클로헥사마이드, Human Fc Block(BD Pharmingen쪠)가 섞인 용액에 10 분 동안 배양한 후, chi2B5, chi4H4 또는 chi2F9 각각의 배양액을 1/10로 희석하여 1 시간 동안 반응시켰다.
Washing buffer(1 % BSA 가 함유된 생리식염수)로 2 회 세척 후 항체의 내재화 반응을 유도하기위해 37 ℃, 5 % CO2 인큐베이터에서 2 시간 배양하였으며, 음성 대조군은 4 ℃ 대기 조건에서 2 시간 동안 배양하였다. Goat anti-human IgG(Gamma chain specific), FITC(Invitrogen)을 이용하여 세포 표면에 남아있는 CDCP1의 발현을 확인하였다.
그 결과, 도 15 나타난 바와 같이, PANC1 세포에서 chi2B5 항체는 항체-항원 복합체를 이루어 약 63% 내재화가 가능하며(도 15A), chi4H4 항체는 항체-항원 복합체를 이루어 약 28% 내재화가 가능하고(도 15B), chi2F9 항체는 항체-항원 복합체를 이루어 약 32 % 내재화가 가능함을 확인하였다(도 15C).
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.
본 발명의 범위는 후술하는 청구범위에 의하여 나타내어지며, 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (18)

  1. 항-CDCP1 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서,
    서열번호 1, 서열번호 11 및 서열번호 21로 이루어진 군에서 선택되는 핵산 서열로부터 발현된 아미노산을 포함하는 중쇄 상보성-결정 영역 1 (CDR-H1);
    서열번호 2, 서열번호 12 및 서열번호 22로 이루어진 군에서 선택되는 핵산 서열로부터 발현된 아미노산을 포함하는 중쇄 상보성-결정 영역 2 (CDR-H2);
    서열번호 3, 서열번호 13 및 서열번호 23으로 이루어진 군에서 선택되는 핵산 서열로부터 발현된 아미노산을 포함하는 중쇄 상보성-결정 영역 3 (CDR-H3);
    서열번호 6, 서열번호 16 및 서열번호 26으로 이루어진 군에서 선택되는 핵산 서열로부터 발현된 아미노산을 포함하는 경쇄 상보성-결정 영역 1 (CDR-L1);
    서열번호 7, 서열번호 17 및 서열번호 27로 이루어진 군에서 선택되는 핵산 서열로부터 발현된 아미노산을 포함하는 경쇄 상보성-결정 영역 2 (CDR-L2); 및
    서열번호 8, 서열번호 18 및 서열번호 28로 이루어진 군에서 선택되는 핵산 서열로부터 발현된 아미노산을 포함하는 경쇄 상보성-결정 영역 3 (CDR-L3); 을 포함하는, 항-CDCP1 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은,
    서열번호 1의 핵산 서열로부터 발현된 아미노산을 포함하는 중쇄 상보성-결정 영역 1;
    서열번호 2의 핵산 서열로부터 발현된 아미노산을 포함하는 중쇄 상보성-결정 영역 2;
    서열번호 3의 핵산 서열로부터 발현된 아미노산을 포함하는 중쇄 상보성-결정 영역 3;
    서열번호 6의 핵산 서열로부터 발현된 아미노산을 포함하는 경쇄 상보성-결정 영역 1;
    서열번호 7의 핵산 서열로부터 발현된 아미노산을 포함하는 경쇄 상보성-결정 영역 2; 및
    서열번호 8의 핵산 서열로부터 발현된 아미노산을 포함하는 경쇄 상보성-결정 영역 3; 을 포함하는, 항-CDCP1 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 5의 핵산 서열로부터 발현된 아미노산을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
    서열번호 10의 핵산 서열로부터 발현된 아미노산을 포함하는 경쇄 가변 영역; 을 포함하는, 항-CDCP1 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은,
    서열번호 11의 핵산 서열로부터 발현된 아미노산을 포함하는 중쇄 상보성-결정 영역 1;
    서열번호 12의 핵산 서열로부터 발현된 아미노산을 포함하는 중쇄 상보성-결정 영역 2;
    서열번호 13의 핵산 서열로부터 발현된 아미노산을 포함하는 중쇄 상보성-결정 영역 3;
    서열번호 16의 핵산 서열로부터 발현된 아미노산을 포함하는 경쇄 상보성-결정 영역 1;
    서열번호 17의 핵산 서열로부터 발현된 아미노산을 포함하는 경쇄 상보성-결정 영역 2; 및
    서열번호 18의 핵산 서열로부터 발현된 아미노산을 포함하는 경쇄 상보성-결정 영역 3; 을 포함하는, 항-CDCP1 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 15의 핵산 서열로부터 발현된 아미노산을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
    서열번호 20의 핵산 서열로부터 발현된 아미노산을 포함하는 경쇄 가변 영역; 을 포함하는, 항-CDCP1 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은,
    서열번호 21의 핵산 서열로부터 발현된 아미노산을 포함하는 중쇄 상보성-결정 영역 1;
    서열번호 22의 핵산 서열로부터 발현된 아미노산을 포함하는 중쇄 상보성-결정 영역 2;
    서열번호 23의 핵산 서열로부터 발현된 아미노산을 포함하는 중쇄 상보성-결정 영역 3;
    서열번호 26의 핵산 서열로부터 발현된 아미노산을 포함하는 경쇄 상보성-결정 영역 1;
    서열번호 27의 핵산 서열로부터 발현된 아미노산을 포함하는 경쇄 상보성-결정 영역 2; 및
    서열번호 28의 핵산 서열로부터 발현된 아미노산을 포함하는 경쇄 상보성-결정 영역 3; 을 포함하는, 항-CDCP1 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  7. 제4항에 있어서,
    상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 25의 핵산 서열로부터 발현된 아미노산을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
    서열번호 30의 핵산 서열로부터 발현된 아미노산을 포함하는 경쇄 가변 영역; 을 포함하는, 항-CDCP1 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항체는 CDCP1의 CUB1 도메인에 특이적으로 결합하는 것인, 항-CDCP1 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  9. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 항-CDCP1 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 암호화하는 핵산.
  10. 제9항의 핵산을 포함하는 벡터.
  11. 제10항의 벡터로 형질 전환된 세포.
  12. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 항-CDCP1 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는, 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 암은 골암, 폐암, 두부암, 경부암, 갑상선암, 부갑상선암, 비소세포성폐암, 위암, 간암, 췌장암, 피부암, 피부 또는 안구내 흑색종, 직장암, 항문부근암, 결장암, 자궁암, 유방암, 난소암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병, 식도암, 소장암, 내분비선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 방광암, 신장암, 수뇨관암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, 중추신경계 종양, 중추신경계 림프종, 척수 종양, 교모세포종, 뇌간 신경교종 및 뇌하수체 선종으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인, 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  14. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 항-CDCP1 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는, CDCP1 검출용 조성물.
  15. 제14항의 조성물을 포함하는, 암 진단용 키트.
  16. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 항-CDCP1 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하고,
    상기 항체 또는 항원 결합 단편에는 하나 이상의 약물이 접합된, 항체 약물 접합체.
  17. 하기의 항-CDCP1 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 암 예방 또는 치료 방법:
    서열번호 1, 서열번호 11 및 서열번호 21로 이루어진 군에서 선택되는 핵산 서열로부터 발현된 아미노산을 포함하는 중쇄 상보성-결정 영역 1 (CDR-H1);
    서열번호 2, 서열번호 12 및 서열번호 22로 이루어진 군에서 선택되는 핵산 서열로부터 발현된 아미노산을 포함하는 중쇄 상보성-결정 영역 2 (CDR-H2);
    서열번호 3, 서열번호 13 및 서열번호 23으로 이루어진 군에서 선택되는 핵산 서열로부터 발현된 아미노산을 포함하는 중쇄 상보성-결정 영역 3 (CDR-H3);
    서열번호 6, 서열번호 16 및 서열번호 26으로 이루어진 군에서 선택되는 핵산 서열로부터 발현된 아미노산을 포함하는 경쇄 상보성-결정 영역 1 (CDR-L1);
    서열번호 7, 서열번호 17 및 서열번호 27로 이루어진 군에서 선택되는 핵산 서열로부터 발현된 아미노산을 포함하는 경쇄 상보성-결정 영역 2 (CDR-L2); 및
    서열번호 8, 서열번호 18 및 서열번호 28로 이루어진 군에서 선택되는 핵산 서열로부터 발현된 아미노산을 포함하는 경쇄 상보성-결정 영역 3 (CDR-L3); 을 포함하는, 항-CDCP1 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  18. 하기 항-CDCP1 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 약학적 조성물의 암의 예방 또는 치료 용도:
    서열번호 1, 서열번호 11 및 서열번호 21로 이루어진 군에서 선택되는 핵산 서열로부터 발현된 아미노산을 포함하는 중쇄 상보성-결정 영역 1 (CDR-H1);
    서열번호 2, 서열번호 12 및 서열번호 22로 이루어진 군에서 선택되는 핵산 서열로부터 발현된 아미노산을 포함하는 중쇄 상보성-결정 영역 2 (CDR-H2);
    서열번호 3, 서열번호 13 및 서열번호 23으로 이루어진 군에서 선택되는 핵산 서열로부터 발현된 아미노산을 포함하는 중쇄 상보성-결정 영역 3 (CDR-H3);
    서열번호 6, 서열번호 16 및 서열번호 26으로 이루어진 군에서 선택되는 핵산 서열로부터 발현된 아미노산을 포함하는 경쇄 상보성-결정 영역 1 (CDR-L1);
    서열번호 7, 서열번호 17 및 서열번호 27로 이루어진 군에서 선택되는 핵산 서열로부터 발현된 아미노산을 포함하는 경쇄 상보성-결정 영역 2 (CDR-L2); 및
    서열번호 8, 서열번호 18 및 서열번호 28로 이루어진 군에서 선택되는 핵산 서열로부터 발현된 아미노산을 포함하는 경쇄 상보성-결정 영역 3 (CDR-L3); 을 포함하는, 항-CDCP1 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
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