WO2024017270A1 - 一种螺环化合物及其制备方法与应用 - Google Patents

一种螺环化合物及其制备方法与应用 Download PDF

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WO2024017270A1
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methyl
mmol
indoline
oxospiro
pyrrolidine
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PCT/CN2023/108016
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English (en)
French (fr)
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赖英杰
熊金锋
肖瑛
段振芳
王斌
李中乐
刘汉斌
乐晓亮
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深圳信立泰药业股份有限公司
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/02—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing at least one abnormal peptide link
    • C07K5/0202—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing at least one abnormal peptide link containing the structure -NH-X-X-C(=0)-, X being an optionally substituted carbon atom or a heteroatom, e.g. beta-amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the invention belongs to the technical field of chemical drugs and relates to a spirocyclic compound, or its isomer, or its racemate, or its pharmaceutically acceptable salt, as well as its preparation method and application.
  • a 3C-like protease inhibitor As a 3C-like protease inhibitor, and methods of using it to treat a variety of specific diseases or conditions.
  • Coronaviruses are a family of enveloped positive-strand RNA pathogenic viruses that cause acute and chronic diseases, including central nervous system disease, the common cold, lower respiratory tract infections, and diarrhea. After the coronavirus enters the host cell, it is broken down to release the nucleocapsid and viral genome. Host cell ribosomes translate the open reading frames (ORFs) 1a and ORF1b of the viral genome into polyproteins pp1a and pp1b, respectively, encoding 16 nonstructural proteins (nsps), while the remaining ORFs encode structural proteins and accessory proteins.
  • ORFs open reading frames
  • 3C-like cysteine protease (3CLpro) and papain-like cysteine protease (PLpro) catalyze the cleavage of PP to generate nsp2-16, which then forms the replication-transcription complex (RTC). Loss of these protease activities causes the viral life cycle to cease.
  • 3C-like protease also known as the main protease (Mpro), its full name consists of 306 amino acids, can further cleave the new coronavirus polyprotein, thereby producing helicase, RNA-dependent RNA polymerase and other related replication elements, which play a role in virus proliferation and plays an important role in assembly.
  • the natural 3CLpro monomer consists of three domains, and the two monomers interact to form a pocket structure containing the substrate binding site. The active center is located in the gap between domains I and II, and the catalytic sites are Cys at position 145 and His at position 41.
  • the target of Paxlovid is 3C-like protease (3CLpro).
  • PF-07321332 is 3C-like protease (3CLpro). By inhibiting viral 3CLpro, it inhibits RNA replication and the production of related non-structural proteins, thereby inhibiting virus replication.
  • 3CLpro 3C-like protease
  • PF-07321332 has received FDA emergency drug marketing approval for the treatment of new coronavirus infection.
  • other prescription drugs such as anti-lipid drugs, statins, anticoagulants and antidepressants, will increase the toxic and side effects of these drugs, and may even lead to serious adverse reactions such as death. occur.
  • certain compounds can inhibit 3CLpro activity, they have not yet been approved as coronavirus treatments.
  • this application provides a compound represented by general formula (I), or its isomer, or its racemate, or its pharmaceutically acceptable salt, as well as its preparation method and application.
  • a 3C-like protease inhibitor and methods of using it to treat a variety of specific diseases or conditions.
  • the present application provides a compound represented by general formula (I), or its isomer, its racemate, or its pharmaceutically acceptable salt.
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition, which contains a therapeutically effective amount of the compound described in any one of the above or a pharmaceutically acceptable salt thereof and a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the present invention also provides the use of a therapeutically effective amount of the above-described compound or a pharmaceutically acceptable salt thereof in the preparation of a medicament for treating a disease condition, wherein the disease is a 3C-like protease inhibitor-related disease, Specifically, the condition is selected from conditions such as COVID-19.
  • the present invention is implemented through the following technical solutions:
  • R 1 , R 2 , R 3 , R 4 , R 5 , R 6 , R 7 , R 8 , R 9 , R 10 , R 11 , R 12 , R 13 , R 14 , R 15 , R 16 , R 17 , R 18 , R 19 , R 20 , R 21 , R 22 , R 23 and R 24 are independently selected from hydrogen and deuterium, and at least one of them is deuterium.
  • a compound represented by general formula (Ia), or an isomer thereof, a racemate thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof is provided, including:
  • R 1 , R 2 , R 3 , R 4 , R 5 , R 6 , R 7 , R 8 , R 9 , R 10 , R 11 , R 12 , R 13 , R 14 , R 15 , R 16 , R 17 , R 18 , R 19 , R 20 , and R 21 are independently selected from hydrogen and deuterium, and at least one of them is deuterium.
  • the R 1 is selected from deuterium.
  • the R 2 , R 3 and R 4 are all selected from deuterium.
  • the R 5 is selected from deuterium.
  • the R 6 , R 7 , R 8 , R 9 , R 10 and R 11 are all selected from deuterium.
  • the R 5 , R 6 , R 7 , R 8 , R 9 , R 10 and R 11 are all selected from deuterium.
  • the R 12 is selected from deuterium.
  • the R 13 and R 14 are selected from deuterium.
  • the R 15 and R 16 are selected from deuterium.
  • one of the R 17 , R 18 , R 19 and R 20 is deuterium or all are selected from deuterium.
  • R 18 is selected from deuterium.
  • the R 21 is selected from deuterium.
  • the R 22 , R 23 and R 24 are all selected from deuterium.
  • the compound, or its isomer, or its racemate, or its pharmaceutically acceptable salt is selected from:
  • the pharmaceutically acceptable salt refers to the compound, or its isomer, or its racemate, or its pharmaceutically acceptable salt and a pharmaceutically acceptable acid. or base preparation.
  • At least one hydrogen atom of the compound, or its isomer, or its racemate, or its pharmaceutically acceptable salt, is replaced by an isotope deuterium.
  • the present invention further provides a pharmaceutical composition, which is characterized in that it contains a therapeutically effective amount of the compound, or an isomer thereof, or a racemate thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, and a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the present invention further provides the pharmaceutical use of the compound, or its isomer, or its racemate, or its pharmaceutically acceptable salt, specifically, its use in the preparation of medicaments for the treatment of diseases. It is a disease related to 3C-like protease inhibitors, specifically selected from diseases such as COVID-19.
  • pharmaceutically acceptable salt refers to a salt of a compound of the present invention prepared from a compound having specific substituents found in the present invention and a pharmaceutically acceptable acid or base.
  • the compounds provided by the invention also exist in prodrug forms.
  • Prodrugs of the compounds described herein readily undergo chemical changes under physiological conditions to transform into the compounds of the present invention.
  • prodrugs can be converted to compounds of the invention by chemical or biochemical methods in the in vivo environment.
  • Certain compounds of the present invention may exist in unsolvated or solvated forms, including hydrated forms.
  • solvated and unsolvated forms are equivalent to each other and are included within the scope of the present invention.
  • the compounds of the present invention may exist in specific geometric or stereoisomeric forms.
  • the present invention contemplates all such compounds, including cis and trans isomers, (-)- and (+)-enantiomers, (R)- and (S)-enantiomers, diastereoisomers isomer, the (D)-isomer, the (L)-isomer, the atropisomer, and racemic and other mixtures thereof, such as enantiomeric or diastereomerically enriched mixtures, all of which are within the scope of the present invention.
  • Additional asymmetric carbon atoms may be present in substituents such as alkyl groups. All such isomers, as well as mixtures thereof, are included within the scope of the present invention.
  • Optically active (R)- and (S)-isomers can be prepared by chiral synthesis or chiral reagents or other conventional techniques. If one enantiomer of a compound of the invention is desired, it can be prepared by asymmetric synthesis or derivatization with chiral auxiliaries, in which the resulting diastereomeric mixture is separated and the auxiliary group is cleaved to provide pure desired enantiomer.
  • a diastereomeric salt is formed with a suitable optically active acid or base, and then the salt is formed by conventional methods known in the art. Diastereomeric resolution is performed and the pure enantiomers are recovered. Furthermore, the separation of enantiomers and diastereomers is usually accomplished by the use of chromatography using chiral stationary phases, optionally combined with chemical derivatization methods (e.g., generation of amino groups from amines). formate).
  • pharmaceutically acceptable carrier refers to any preparation carrier or medium that can deliver an effective amount of the active substance of the present invention, does not interfere with the biological activity of the active substance, and has no toxic side effects on the host or patient.
  • Representative carriers include water, oil , vegetables and minerals, cream base, lotion base, ointment base, etc. These matrices include suspending agents, viscosifiers, transdermal penetration enhancers, etc. Their preparations are well known to those skilled in the field of cosmetics or topical medicine. For additional information on vectors, please refer to Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Ed., Lippincott, Williams & Wilkins (2005), the contents of which are incorporated herein by reference.
  • excipient generally refers to a carrier, diluent and/or medium required for formulating an effective pharmaceutical composition.
  • the term "effective amount” or “therapeutically effective amount” with respect to a drug or pharmacologically active agent refers to a non-toxic amount of the drug or agent sufficient to achieve the desired effect.
  • the "effective amount” of an active substance in the composition refers to the amount required to achieve the desired effect when combined with another active substance in the composition.
  • the determination of the effective amount varies from person to person, depends on the age and general condition of the recipient, and also depends on the specific active substance. The appropriate effective amount in individual cases can be determined by those skilled in the art based on routine experiments.
  • active ingredient refers to a chemical entity that is effective in treating a target disorder, disease or condition.
  • the compounds of the present invention can be prepared by a variety of synthetic methods well known to those skilled in the art, including the specific embodiments listed below, embodiments formed by combining them with other chemical synthesis methods, and methods well known to those skilled in the art. Equivalent alternatives and preferred embodiments include, but are not limited to, embodiments of the present invention.
  • the inhibitory activity IC 50 of the coronavirus Mpro protease of the compound of the present invention is in the range of ⁇ 0.1 ⁇ M, preferably ⁇ 0.01 ⁇ M.
  • CYP3A4 is the most important CYP450 enzyme in the liver and is also abundantly distributed in the intestine. Most of the drugs on the market are metabolized by CYP3A4. Inhibiting CYP3A4 will cause the risk of serious DDI.
  • the present invention is expected to solve this problem existing in the existing technology.
  • the compound of the present invention can be prepared through the following synthetic route:
  • R 1 , R 2 , R 3 , R 4 , R 5 , R 6 , R 7 , R 8 , R 9 , R 10 , R 11 , R 12 , R 13 , R 14 , R 15 , R 16 , R 17 , R 18 , R 19 , R 20 , R 21 , R 22 , R 23 and R 24 are as defined in the specification.
  • Methyl-d3-4,6,7-trifluoro-1H-indole-2-carboxylate-3-d is hydrolyzed to obtain 4,6,7-trifluoro-1H-indole-2-carboxylic acid- 3-d.
  • Step A Synthesis of (3R,5'S)-1'-(methyl-L-alkyl)-2-oxospiro[indoline-3,3'-pyrrolidine]-5'-carboxamide hydrochloride
  • Step B (3R,5'S)-1'-(N-methyl-N-(4,6,7-trifluoro-1H-indole-2-carbonyl-3-d)-L-leuco)- 2-Oxospiro[indoline-3,3'-pyrrolidine]-5'-carboxamide
  • Step C N-((S)-1-((3R,5'S)-5'-cyano-2-oxospiro[indoline-3,3'-pyrrolidin]-1'-yl)- 4-Methyl-1-oxopent-2-yl)-4,6,7-trifluoro-N-methyl-1H-indole-2-carboxamide-3-d
  • Step A Synthesis of (S)-2,3,4,9-tetrahydro-1H-pyrido[3,4-b]indole-3-carboxylic acid methyl ester hydrochloride
  • Step B Synthesis of 2-(tert-butyl)3-methyl(S)-1,3,4,9-tetrahydro-2H-pyrido[3,4-b]indole-2,3-dicarboxylic acid ester
  • Step C Synthesis of 1'-(tert-butyl)5'-(3R,5'S)-2-oxo-1'4-spiro[indoline-3,3'-pyrrolidine]-1',5' -Dicarboxylic acid ester
  • Step D Synthesis of 1'-(tert-butyl)-5'-(3R,5'S)-5-bromo-2-oxo-1'4-spiro[indoline-3,3'-pyrrolidine]- 1',5'-dicarboxylic acid methyl ester
  • Step E Synthesis of (3R,5'S)-5-bromo-5'-carbamoyl-2-oxospiro[indoline-3,3'-pyrrolidine]-1'-carboxylic acid tert-butyl ester
  • Step F Synthesis of (3R,5'S)-5-bromo-2-oxospiro[indoline-3,3'-pyrrole]-5'-carboxamide hydrochloride
  • Step G Synthesis of N-methyl-((S)-1-((3R,5'S)-5-bromo-5'-carbamoyl-2-oxospiro[indoline-3,3'-pyrrole Alk]-1'-yl)-4-methyl-1-oxopentan-2-yl)carbamic acid tert-butyl ester
  • N-(tert-butoxycarbonyl)-N-methyl-L-leucine 1.0 g, 4.07 mmol
  • (3R,5'S)-5-bromo-2-oxospiro[indole] were mixed at room temperature.
  • Phenoline-3,3'-pyrrole]-5'-carboxamide hydrochloride (1.55 g, 4.07 mmol) was added to dichloromethane (20 ml) and DMF (20 ml), and N-methylmorpholine ( 1.64 g, 16.28 mmol) and HATU (1.85 g, 4.88 mmol), reacted at room temperature for 4 h.
  • Step H Synthesis of N-methyl-((S)-1-((3R,5'S)-5'-carbamoyl-2-oxospiro[indoline-3,3'-pyrrolidine]-1 '-yl-5-d)-4-methyl-1-oxopentan-2-yl)carbamic acid tert-butyl ester
  • N-methyl-((S)-1-((3R,5'S)-5-bromo-5'-carbamoyl-2-oxospiro[indoline-3,3'-pyrrole [Alk]-1'-yl)-4-methyl-1-oxopentan-2-yl)carbamic acid tert-butyl ester 1. g, 2.61 mmol was added to D 2 O (14 mL) and CD 3 To OD (14 ml), add Na 2 CO 3 (0.83 g, 7.83 mmol), D 3 PO 2 (720 g ha, 5.22 mmol), 10% Pd/C (280 mg), and then react at 50°C overnight .
  • Step I Synthesis of (3R,5'S)-1'-(methyl-L-leucine)-2-oxospiro[indoline-3,3'-pyrrolidine]-5-d-5'- Carboxamide
  • N-methyl-((S)-1-((3R,5'S)-5'-carbamoyl-2-oxospiro[indoline-3,3'-pyrrolidine]-1 '-Basic-5-d)-4-methyl-1-oxopentan-2-yl)carbamic acid tert-butyl ester (1.00 g, 2.17 mmol) was dissolved in dichloromethane (10 ml) and added A solution of 4MHCl in dioxane (10 ml, 40 mmol) was stirred at room temperature for 4 h.
  • Step J Synthesis of (3R,5′S)-1′-(N-methyl-N-(4,6,7-trifluoro-1H-indole-2-carbonyl)-L-leucine)- 2-Oxospiro[indoline-3,3'-pyrrolidine]-5-d-5'-carboxamide
  • Step K Synthesis of N-((S)-1-((3R,5'S)-5'-cyano-2-oxospiro[indoline-3,3'-pyrrolidine]-1'-yl- 5-d)-4-Methyl-1-oxopentan-2-yl)-4,6,7-trifluoro-N-methyl-1H-indole-2-carboxylic acid amide
  • Step B Synthesis of L-tryptophan- ⁇ , ⁇ -d2 methyl ester hydrochloride
  • Step C Synthesis of (S)-2,3,4,9-tetrahydro-1H-pyrido[3,4-b]indole-3-carboxylic acid-4,4-d2 methyl ester hydrochloride
  • Step D Synthesis of 2-(tert-butyl)3-methyl(S)-1,3,4,9-tetrahydro-2H-pyrido[3,4-b]indole-2,3-dicarboxylic Acid-4,4-d2
  • Step E Synthesis of 1'-(tert-butyl)5'-(3R,5'S)-2-oxo-1'4-spiro[indoline-3,3'-pyrrolidine]-1',5' -Dicarboxylic acid-4',4'-d2 methyl ester
  • Step F Synthesis of (3R,5'S)-5'-carbamoyl-2-oxospiro[indoline-3,3'-pyrrolidine]-1'-carboxylic acid-4',4'-d2tert Butyl ester
  • Step G Synthesis of (3R,5'S)-2-oxospiro[indoline-3,3'-pyrrole]-4',4'-d2-5'-carboxylic acid amide hydrochloride
  • Step H Synthesis of ((S)-1-((3R,5'S)-5'-carbamoyl-2-oxospiro[indoline-3,3'-pyrrolidine]-1'-yl-4 ',4'-d2)-4-methyl-1-oxopentan-2-yl)(methyl)carbamic acid tert-butyl ester
  • N-Boc-N-methyl L-leucine (1.23 g, 5.00 mmol) and (3R,5'S)-2-oxosspiro[indoline-3,3'-pyrrolidine] were mixed at room temperature.
  • -5'-Carboxylic acid amide hydrochloride (1.34 g, 4.97 mmol) was added to dichloromethane (40 ml) and DMF (10 ml), N-methylmorpholine (1.77 g, 17.50 mmol) and HATU (2.09 g, 5.5 mmol), reacted at room temperature for 4 hours.
  • Step I Synthesis of (3R,5'S)-1'-(methyl-L-leucyl)-2-oxospiro[indoline-3,3'-pyrrolidine]-4',4'-d2 -5'-carboxylic acid amide hydrochloride
  • Step G Synthesis of N-((S)-1-((3R,5'S)-5'-cyano-2-oxospiro[indoline-3,3'-pyrrolidine]-1'-yl- 4',4'-d2)-4-methyl-1-oxopentan-2-yl)-4,6,7-trifluoro-N-methyl-1H-indole-2-carboxylic acid amide
  • Step K Synthesis of N-((S)-1-((3R,5'S)-5'-cyano-2-oxospiro[indoline-3,3'-pyrrolidine]-1'-yl- 4',4'-d2)-4-methyl-1-oxopentan-2-yl)-4,6,7-trifluoro-N-methyl-1H-indole-2-carboxylic acid amide
  • Step A Synthesis of 1'-tert-butyl 5'-methyl-2-oxospiro[indoline-3,3'-pyrrolidine]-1',5'-dicarboxylic acid-2',2' -d2
  • Step B Synthesis of tert-butyl (3R,5'S)-5'-carbamoyl-2-oxospiro[indoline-3,3'-pyrrolidine]-1'-carboxylate-2',2 '-d2
  • Step D Synthesis of tert-butyl-1-(3R,5'S)-5'-carbamoyl-2-oxospiro[indoline-3,3'-pyrrolidine]-1'-yl-2', 2'-d2)-4-methyl-1-oxopentyl (2-yl)methyl ester
  • N-tert-butoxycarbonyl-N-methylleucine (841 mg, 1.05 mmol) was added to dichloromethane/DMF (20 ml) at room temperature, then morpholine (1.39 g) was slowly added at 0°C. , 13.7 mmol), HATU (1.44g, 3.77 mmol) was added, followed by stirring at room temperature for 5 minutes; then 2-oxospiro[indoline-3,3'-pyrrolidine]-2' was added at 0 degrees, 2'-d2-5'-carboxamide (800 mg, 3.43 mmol), stirred at room temperature for 12 hours.
  • Step E Synthesis of 3R,5'S-1'-methyl-L-leucine-2-oxospiro[indoline-3,3'-pyrrolidine]-2',2'-d2-5'- formamide
  • Step F 4,6,7-trifluoroindole-2-carbonyl-L-leucine-2-oxosspiro[indoline-3,3'-pyrrolidine]-2',2'-d2 -5'-carboxamide
  • Step G N-1-(3R,5'S)-5'-cyano-2-oxosspiro[indoline-3,3'-pyrrolidine]-1'-yl-2',2'-d2 )-4-Methyl-1-oxopentyl-2-yl)-4,6,7-trifluoro-N-methyl-1H-indole-2-carboxamide
  • Step A Synthesis of (S)-2-amino-3-(6-bromo-1H-indol-3-yl)propionic acid methyl ester hydrochloride
  • Step B Synthesis of (S)-7-bromo-2,3,4,9-tetrahydro-1H-pyridine[3,4-b]indole-3-carboxymethyl ester
  • Step C Synthesis of 2-tert-butyl-3-methyl-(S)-7-bromo-1,3,4,9-tetrahydro-2H-pyrido[3,4-b]indole-2, 3-dicarboxylic acid ester
  • Step D Synthesis of 1'-(tert-butyl)-5'-methyl-(3R,5'S)-6-bromo-2-oxospiro[indoline-3,3'-pyrrolidine]-1' ,5'-dicarboxylate
  • Step E Synthesis of (3R,5'S)-6-bromo-5'-carbamoyl-2-oxospiro[indoline-3,3'-pyrrolidine]-1'-carboxylic acid tert-butyl ester
  • Step F Synthesis of (3R,5'S)-6-bromo-2-oxospiro[indoline-3,3'-pyrrole]-5'-carboxamide hydrochloride
  • Step G Synthesis of tert-butyl ((S)-1-((3R,5'S)-6-bromo-5'-carbamoyl-2-oxospiro[indoline-3,3'-pyrrolidine] -1'-yl)-4-methyl-1-oxopent-2-yl)(methyl)carbamate
  • N-tert-butoxycarbonyl-N-methyl-L-leucine (1.22 g, 4.96 mmol, 1.2 equiv)
  • 2-(7-azobenzotriazole)-N,N ,N',N'-Tetramethylurea hexafluorophosphate (2.17 g, 5.7 mmol, 1.38 equiv) was dissolved in dichloromethane (16 ml) and N,N-dimethylformamide (8 ml)
  • N-methylmorpholine (1.82 ml, 16.53 mmol) was added.
  • Step H Synthesis of (3R,5'S)-6-bromo-1'-(methyl-L-leucyl)-2-oxospiro[indoline-3,3'-pyrrolidine]-5'- Formamide hydrochloride
  • tert-butyl tert-butyl ((S)-1-((3R,5'S)-6-bromo-5'-carbamoyl-2-oxospiro[indoline-3,3'- Pyrrolidin]-1'-yl)-4-methyl-1-oxopent-2-yl)(methyl)carbamate (2.26 g, 4.22 mmol) was dissolved in dichloromethane (25 mL) , add 4M hydrogen chloride in dioxane solution (8 ml, 32.0 mmol), and stir at room temperature for 2 h.
  • Step I Synthesis of (3R,5'S)-6-bromo-1'-(N-methyl-N-(4,6,7-trifluoro-1H-indole-2-carbonyl)-L-leucyl )-2-oxospiro[indoline-3,3'-pyrrolidine]-5'-carboxamide
  • Step J Synthesis of (3R,5'S)-1'-(N-methyl-N-(4,6,7-trifluoro-1H-indole-2-carbonyl)-L-leucyl)-2- Oxyspiro[indoline-3,3'-pyrrolidine]-6-d-5'-carboxamide
  • Step K Synthesis of N-((S)-1-((3R,5'S)-5'-cyano-2-oxospiro[indoline-3,3'-pyrrolidine]-1'-yl- 6-d)-4-Methyl-1-oxopent-2-yl)-4,6,7-trifluoro-N-methyl-1H-indole-2-carboxamide
  • Step A Synthesis of N-methyl-((S)-1-((3R,5'S)-5'-carbamoyl-2-oxospiro[indole-3,3'-pyrrolidine]-1' -yl)-4-(methyl-d3)-1-oxopentyl-2-yl-4,5,5,5-d4)carbamate hydrochloride
  • Step B Synthesis of N-methyl-1-(3R,5'S)-5'-formamido-2-oxospiro[indoline-3,3'-pyrrolidin]-1'-yl)-4 -(Methyl-d3)-1-oxopent-2-yl-4,5,5,5-d4)-4,6,7-trifluoro-1H-indole-2-carboxamide
  • Step C Synthesis of N-((S)-1-((3R,5'S)-5'-cyano-2-oxospiro[indole-3,3'-pyrrolidin]-1'-yl)- 4-(Methyl-d3)-1-oxopentyl-2-yl-4,5,5,5-d4)-4,6,7-trifluoro-N-methyl-1H-indole- 2-carboxamide
  • N-methyl-1-(3R,5'S)-5'-formamido-2-oxospiro[indoline-3,3'-pyrrolidin]-1'-yl)-4 -(Methyl-d3)-1-oxopentyl-2-yl-4,5,5,5-d4)-4,6,7-trifluoro-1H-indole-2-carboxamide (0.112 g, 0.2 mmol) was dissolved in DCM (10 mL), and Burgess reagent (0.142 g, 0.59 mmol) was added. After the addition was completed, the reaction was stirred at room temperature for 5 h.
  • Step A Synthesis of N-deuterated methyl-Boc-L-leucine-d7
  • Step B Synthesis of N-(methyl-d3)-1-(3R,5'S)-5'-formamido-2-oxospiro[indoline-3,3'-pyrrolidine]-1'- base)-4-(methyl-d3)-1-oxopentyl-2-yl-4,5,5,5-d4)-4,6,7-trifluoro-1H-indole-2- formamide
  • N-deuteromethyl-Boc-L-leucine-d7 750 mg, 2.94 mmol
  • N-methylmorpholine 743 mg, 7.34 mmol
  • 2-(7-azobenzene Triazole)-N,N,N',N'-tetramethylurea hexafluorophosphate (1.12 g, 2.94 mmol) was mixed in dichloromethane (30 ml) and reacted at room temperature for half an hour.
  • Step C Synthesis of N-(methyl-d3)-((S)--1-(3R,5'S)-5'-carbamoyl-2-oxospiro[indoline-3,3'-pyrrole Alk]-1'-yl)-4-(methyl-d3)-1-oxopentyl-2-yl-4,5,5,5-d4)carbamate hydrochloride
  • Step D Synthesis of N-1-(3R,5'S)-5'-formamido-2-oxospiro[indoline-3,3'-pyrrolidin]-1'-yl)-4-(methyl Base-d3)-1-oxopentyl-2-yl-4,5,5,5-d4)-4,6,7-trifluoro-N-(methyl-d3)-1H-indole- 2-carboxamide
  • Step E Synthesis of N-((S)-1-((3R,5'S)-5'-cyano-2-oxospiro[indoline-3,3'-pyrrolidin]-1'-yl) -4-(methyl-d3)-1-oxopent-2-yl-4,5,5,5-d4)-4,6,7-trifluoro-N-(methyl-d3)-1H -indole-2-carboxamide
  • N-(methyl-d3)-1-(3R,5'S)-5'-formamido-2-oxospiro[indoline-3,3'-pyrrolidine]-1'- base)-4-(methyl-d3)-1-oxopentyl-2-yl-4,5,5,5-d4)-4,6,7-trifluoro-1H-indole-2- Formamide 180 mg, 318 ⁇ mol was dissolved in dichloromethane (15 mL) and Burgess' reagent (379 mg, 1.59 mmol) was slowly added. The reaction was stirred for 2 hours.
  • Step A Synthesis of (3R,5'S)-2-oxospiro[indoline-3,3'-pyrrolidine]-2',2'-d2-5'-carboxamide hydrochloride
  • tert-butyl(3R,5'S)-5'-carbamoyl-2-oxospiro[indoline-3,3'-pyrrolidine]-1'-carboxylate-2',2' -d2 (1.0 g, 3.00 mmol) was dissolved in hydrochloric acid/ethyl acetate (2M, 20 ml) and reacted at room temperature for 2 hours.
  • Step B tert-Butyl (S)-1-(3R,5'S)-5'-carbamoyl-2-oxospiro[indoline-3,3'-pyrrolidine]-1'-yl-2 ',2'-d2)-4-(methyl-d3)-1-oxopentyl-2-yl-4,5,5,5-d4)(methyl-d4)carbamate
  • N-tert-butoxycarbonyl-N-methyl-L-leucine-isopropyl-D7 750 mg, 2.94 mmol
  • N-methylmorpholine 742 mg, 7.34 mmol
  • 2 -(7-Azobenzotriazole)-N,N,N',N'-tetramethylurea hexafluorophosphate (1.12 g, 2.94 mmol) was mixed in dichloromethane (30 ml).
  • Step C Synthesis of N-(methyl-d3)-((S)--1-(3R,5'S)-5'-carbamoyl-2-oxospiro[indoline-3,3'-pyrrole Alk]-1'-yl-2',2'-d2)-4-(methyl-d3)-1-oxopentyl-2-yl-4,5,5,5-d4)carbamic acid Ester hydrochloride
  • tert-butyl (S)-1-(3R,5'S)-5'-carbamoyl-2-oxospiro[indoline-3,3'-pyrrolidine]-1'-yl-2 ',2'-d2)-4-(methyl-d3)-1-oxopentyl-2-yl-4,5,5,5-d4)(methyl-d4)carbamate (580 mg, 1.23 mmol) was dissolved in hydrochloric acid/ethyl acetate (2M, 20 ml) and reacted at room temperature for 2 hours.
  • Step D Synthesis of N-(S)1-(3R,5'S)-5'-formamido-2-oxospiro[indoline-3,3'-pyrrolidine]-1'-yl-2' ,2'-d2)-4-(methyl-d3)-1-oxopentyl-2-yl-4,5,5,5-d4)-4,6,7-trifluoro-N-( Methyl-d3)-1H-indole-2-carboxamide
  • Step E Synthesis of N-(S)-1-(3R,5'S)-5'-cyano-2-oxospiro[indoline-3,3'-pyrrolidine]-1'-yl-2' ,2'-d2)-4-(methyl-d3)-1-oxopentyl-2-yl-4,5,5,5-d4)-4,6,7-trifluoro-N-( Methyl-d3)-1H-indole-2-carboxamide
  • N-(S)1-(3R,5'S)-5'-formamido-2-oxospiro[indoline-3,3'-pyrrolidine]-1'-yl-2' ,2'-d2)-4-(methyl-d3)-1-oxopentyl-2-yl-4,5,5,5-d4)-4,6,7-trifluoro-N-( Methyl-d3)-1H-indole-2-carboxamide (380 mg, 669 ⁇ mol) was dissolved in dichloromethane (20 mL), and Burgess' reagent (798 mg, 3.35 mmol) was slowly added. The reaction was stirred for 2 hours.
  • Step A Synthesis of tert-butyl ((S)-1-(3R,5'S)-5'-carbamoyl-2-oxospiro[indoline-3,3'-pyrrolidin]-1'-yl -2',2'-d2)-4-methyl-1-oxopentyl-2-yl)(methyl-d3)carbamate
  • N-tert-butoxycarbonyl-N-methyl-D3-leucine (841 mg, 3.43 mmol) to dichloromethane/DMF (20 ml, 4V:1V) at room temperature, then incubate at 0°C Slowly add morpholine (1.4 g, 13.7 mmol), HATU (1.44 g, 3.77 mmol), then stir at room temperature for 5 minutes; then add (3R,5'S)-2-oxospiro[indoline] at 0°C. -3,3'-pyrrolidine]-2',2'-d2-5'-carboxamide (800 mg, 3.43 mmol), stirred at room temperature for 12 hours.
  • Step B Synthesis of (3R,5'S)-1'-(methyl-d3)-L-leucyl-2-oxospiro[indoline-3,3'-pyrrolidine]-2',2' -d2-5'-carboxamide
  • Step C Synthesis of (3R,5'S)-1'-(N-(methyl-d3)-N-(4,6,7-trifluoro-1H-indole-2-carbonyl)-L-leucyl )-2-oxospiro[indoline-3,3'-pyrrolidine]-2',2'-d2-5'-carboxamide
  • Step D N-((S)-1-(3R,5'S)-5'-cyano-2-oxospiro[indoline-3,3'-pyrrolidine]-1'-yl-2' ,2'-d2)-4-methyl-1-oxopentyl-2-yl)-4,6,7-trifluoro-N-(methyl-d3)-1H-indole-2-methyl Amide
  • Step A (3R,5')-1'-(N-methyl-N-(4,6,7-trifluoro-1H-indole-2-carbonyl-3-d)-L-leucyl )-2-oxospiro[indoline-3,3'-pyrrolidine]-5-d-5'-carboxamide
  • Step B Synthesis of N-((S)-1-((3R,5S)-5'-cyano-2-oxospiro[indoline-3,3'-pyrrolidine]-1'-yl- 5-d)-4-methyl-1-oxopentyl-2-yl)-4,6,7-trifluoro-N-methyl-1H-indole-2-carboxamide-3-d
  • Step A Synthesis of 4,6,7-trifluoro-3,5-diiodo-1H-indole-2-carboxylic acid
  • Step B Synthesis of 4,6,7-trifluoro-1H-indole-2-carboxylic acid-3,5-d2 acid
  • Step C Synthesis of (3R,5'S)-1'-(N-methyl-N-(4,6,7-trifluoro-1H-indole-2-carbonyl-3,5-d2)-L-leucine Aminoacyl)-2-oxospiro[indoline-3,3'-pyrrolidine]-5-d-5'-carboxamide
  • Step D Synthesis of N-((S)-1-((3R,5'S)-5'-cyano-2-oxospiro[indoline-3,3'-pyrrolidine]-1'-yl- 5-d)-4-Methyl-1-oxopent-2-yl)-4,6,7-trifluoro-N-methyl-1H-indole-2-carboxamide-3,5- d2
  • Step A (3R,5'S)-1'-(N-methyl-N-(4,6,7-trifluoro-1H-indole-2-carbonyl-3,5-d2)-L-leucine Acyl)-2-oxospiro[indoline-3,3'-pyrrolidine]-5'-carboxamide
  • Step B Synthesis of N-((S)-1-((3R,5'S)-5'-cyano-2-oxospiro[indoline-3,3'-pyrrolidin]-1'-yl )-4-methyl-1-oxopentane-2-yl)-4,6,7-trifluoro-N-methyl-1H-indole-2-carboxamide-3,5-d2
  • sodium hydride (209 mg, 5.22 mmol, 60%) was suspended in 15 ml of tetrahydrofuran, replaced with nitrogen three times, then cooled to 0°C, and then N-Boc-L-leucine-d10 (420 mg, A solution of 1.74 mmol) dissolved in tetrahydrofuran (5 ml) was slowly injected into the tetrahydrofuran solution in which sodium hydride was suspended. After the addition was completed, stir at 25°C for 1 hour. Finally, methyl iodide (1.24 g, 8.70 mmol) was added at 0°C. Inject into the mixture and stir the reaction for another 15 hours after rising to 25°C.
  • Step C tert-Butyl(1-((3R,5'S)-5'-carbamoyl-2-oxospiro[indoline-3,3'-pyrrolidin]-1'-yl)-4- (Methyl-d3)-1-oxopentyl-2-yl-2,3,3,4,5,5,5-d7)(methyl)carbamate
  • N-Methyl-Boc-L-leucine-d10 (420 mg, 1.64 mmol), N-methylmorpholine (416 mg, 4.11 mmol) and 2-(7-azobenzene) were mixed at room temperature.
  • Triazole)-N,N,N',N'-tetramethylurea hexafluorophosphate (623 mg, 1.64 mmol) was mixed in dichloromethane (20 ml) and reacted at room temperature for half an hour.
  • Step D Synthesis of N-(methyl-d3)-((S)--1-(3R,5'S)-5'-carbamoyl-2-oxospiro[indoline-3,3'-pyrrole Alk]-1'-yl)-1-oxopentyl-2-yl-2,3,3,4,5,5,5,5-d7)carbamate hydrochloride
  • Step E Synthesis of (3R,5'S)-1'-(N-methyl-N-(4,6,7-trifluoro-1H-indole-2-carbonyl)leucyl-d10)-2-2 -Oxspiro[indoline-3,3'-pyrrolidine]-5'-carboxamide
  • N-(methyl-d3)-((S)--1-(3R,5'S)-5'-carbamoyl-2-oxospiro[indoline-3,3'-pyrrolidine] -1'-yl)-1-oxopentyl-2-yl-2,3,3,4,5,5,5,5-d7)carbamate hydrochloride 330 mg, 868 ⁇ mol ) dissolved in N,N-dimethylformamide (4 ml) was added to the above mixture and reacted for another 1.5 hours at room temperature of 25 degrees Celsius. After the reaction was completed, saturated ammonium chloride (60 ml) was added, and the mixture was extracted with dichloromethane (20 ml ⁇ 3).
  • Step F Synthesis of N-(1-(3R,5'S)-5'-cyano-2-oxospiro[indoline-3,3'-pyrrolidin]-1'-yl)-4-(methane Base-d3)-1-oxopentapoly-2-yl-2,3,3,4,5,5,5-d7)-4,6,7-trifluoro-N-methyl-1H-indole Indole-2-carboxamide
  • Step A Synthesis of (3R,5'S)-1'-(N-methyl-N-(4,6,7-trifluoro-1H-indole-2-carbonyl-3,5-d 2 )-L- Leucyl)-2-oxyspiro[indoline-3,3'-pyrrolidine]-2',2'-d 2 -5'-carboxamide
  • Step B Synthesis of N-((S)-1-((3R,5'S)-5'-cyano-2-oxospiro[indoline-3,3'pyrrolidine]-1'-yl-2 ',2'-d 2 )-4-methyl-1-oxopentan-2-yl)-4,6,7-trifluoro-N-methyl-1H-indole-2-carboxamide- 3,5-d 2
  • Step A Synthesis of tert-butyl ((S)-1-((3R,5'S)-5'-carbamoyl-2-oxospiro[indoline-3,3'pyrrolidine]-1'-yl -2',2'-d2)-4-methyl-1-oxopentyl-2-yl)(methyl)carbamate
  • Doline-3,3'-pyrrolidine]-2',2'-d2-5'-carboxamide (800 mg, 3.43 mmol), stirred at room temperature for 12 hours.
  • Step B Synthesis of tert-butyl ((S)-1-((3R,5'S)-5-bromo-5'-carbamoyl-2-oxospiro[indoline-3,3'pyrrolidine]- 1'-yl-2',2'-d2)-4-methyl-1-oxopentyl-2-yl)(methyl)carbamate
  • Step C Synthesis of tert-butyl ((S)-1-((3R,5'S)-5'-carbamoyl-2-oxospiro[indoline-3,3'pyrrolidine]-1'-yl -2',2',5-d3)-4-methyl-1-oxopentyl-2-yl)(methyl)carbamate
  • reaction solution is cooled to room temperature, filtered, 20 ml of water is added to the filtrate, extracted with dichloromethane (100 ml x 3), the organic phases are combined, washed with water (50 ml), saturated brine (100 ml), and anhydrous. Dry over sodium sulfate, filter and concentrate.
  • Step D Synthesis of (3R,5'S)-1'-(methyl-L-leucyl)-2-oxospiro[indoline-3,3'pyrrolidine]-2',2',5- d3-5'-carboxamide
  • Step E (3R,5'S)-1'-(N-methyl-N-(4,6,7-trifluoro-1H-indole-2-carbonyl)-L-leucyl-2-oxspiro Cycl[Indoline-3,3'pyrrolidine]-2',2',5-d3-5'-carboxamide
  • Step F N-((S)-1-((3R,5'S)-5'-cyano-2-oxospiro[indoline-3,3'pyrrolidine]-1'-yl-2' ,2',5-d3)-4-methyl-1-oxopentyl-2-yl)-4,6,7-trifluoro-N-methyl-1H-indole-2-carboxamide
  • reaction solution was quenched with aqueous sodium bicarbonate solution (20 ml), extracted with ethyl acetate (30 ml x 3), the combined organic phases were washed with saturated aqueous sodium chloride solution, dried over anhydrous sodium sulfate, filtered, and spun to dryness.
  • Step B Synthesis of (3R,5'S)-5-bromo-1'-((methyl-d3)-L-leucyl)-2-oxospiro[indoline-3,3'pyrrolidine]- 5'-carboxamide
  • Step C Synthesis of (3R,5'S)-5-5-bromo-1'-(N-(methyl-d3)-N-(4,6,7-trifluoro-1H-indole-2-carbonyl) -L-Leucyl)--2-oxospiro[indoline-3,3'pyrrolidine]-5'-carboxamide
  • reaction solution was quenched with water, extracted with dichloromethane (20 ml x 3), the combined organic phases were washed with saturated sodium chloride aqueous solution, dried over anhydrous sodium sulfate, filtered and spun to dryness.
  • Step D Synthesis of (3R,5'S)-1'-(N-(methyl-d3)-N-(4,6,7-trifluoro-1H-indole-2-carbonyl)-L-leucyl )-2-oxospiro[indoline-3,3'pyrrolidine]-5-d-5'-carboxamide
  • Step E Synthesis of N-((S)-1-((3R,5'S)-5'-cyano-2-oxospiro[indoline-3,3'pyrrolidine]-1'-yl-5 -d)-4-Methyl-1-oxopentyl-2-yl)-4,6,7-trifluoro-N-(methyl-d3)-1H-indole-2-carboxamide
  • reaction solution was quenched with aqueous sodium bicarbonate solution, extracted with dichloromethane (20 ml x 3), the organic phases were combined, washed with saturated aqueous sodium chloride solution, dried over anhydrous sodium sulfate, filtered, and spun to dryness.
  • Step B Synthesis of (S)-2,3,4,9-tetrahydro-1H-pyrido[3,4-b]indole-3-carboxylic acid-5,6,7,8-d4 acid
  • Step C Synthesis of (S)-2,3,4,9-tetrahydro-1H-pyrido[3,4-b]indole-3-carboxylic acid methyl ester-5,6,7,8-d4
  • Step D Synthesis of 2-(tert-butyl)-3-methyl-(S)-1,3,4,9-tetrahydro-2H-pyrido[3,4-b]indole-2,3- Dicarboxylic acid-5,6,7,8-d4
  • Step E Synthesis of 1'-(tert-butyl)-5'-methyl-(3R,5'S)-2-oxospiro[indoline-3,3'-pyrrolidine]-1',5'- Dicarboxylic acid-4,5,6,7-d4
  • N-bromosuccinimide 90 mg, 0.5 mmol
  • take samples and monitor every hour Add N-bromosuccinimide to a maximum of 0.95 equivalent.
  • the reaction liquid was added to a saturated aqueous sodium bicarbonate solution, and extracted three times with dichloromethane (50 ml). The organic phases were combined, dried over anhydrous sodium sulfate, and spun to dryness.
  • Step F Synthesis of (3R,5'S)-1'-(tert-butoxycarbonyl)-2-oxospiro[indoline-3,3'-pyrrolidine]-5'-carboxylic acid-4,5,6 ,7-d4 acid
  • Step G Synthesis of tert-butyl (3R,5'S)-5'-carbamoyl-2-oxospiro[indoline-3,3'-pyrrolidine]-1'-carboxylic acid-4,5,6 ,7-d4
  • Step H Synthesis of (3R,5'S)-2-oxospiro[indoline-3,3'-pyrrolidine]-4,5,6,7-d4-5'-carboxamide hydrochloride
  • Step 1 Synthesis of tert-butyl ((S)-1-((3R,5'S)-5'-carbamoyl-2-oxospiro[indoline-3,3'-pyrrolidine]-1'- Base-4,5,6,7-d4)-4-methyl-1-oxopentyl-2-yl)(methyl-d3)carbamate
  • reaction solution was poured into 5 ml of saturated aqueous ammonium chloride solution, and extracted three times with ethyl acetate (20 ml). The organic phases were combined, dried over anhydrous sodium sulfate, and spun to dryness.
  • Step J Synthesis of (3R,5'S)-1'-((methyl-d3)-L-leucyl)-2-oxospiro[indoline-3,3'-pyrrolidine]-4,5 ,6,7-d4-5'-carboxamide hydrochloride
  • Step K Synthesis of (3R,5'S)-1'-(N-methyl-d3)-d3)-N-(4,6,7-trifluoro-1H-indole-2-carbonyl)-L-leucine Aminoacyl)-2-oxospiro[indoline-3,3'-pyrrolidine]-4,5,6,7d4-5'-carboxamide
  • Step L Synthesis of N-((S)-1-((3R,5'S)-5'-cyano-2-oxospiro[indoline-3,3'-pyrrolidine]-1'-yl- 4,5,6,7-d4)-4-methyl-1-oxopentyl-2- (methyl)-4,6,7-trifluoro-N-(methyl-d3)-1H-indole-2-carboxamide
  • Step A Synthesis of (3R,5'S)-6-bromo-1'-(N-methyl-N-(4,6,7-trifluoro-1H-indole-2-carbonyl-3,5-d2) -L-Leucyl)-2-oxospiro[indoline-3,3'-pyrrolidine]-5'-carboxamide
  • Step B Synthesis of (3R,5'S)-1'-(N-methyl-N-(4,6,7-trifluoro-1H-indole-2-carbonyl-3,5-d2)-L-leucine Aminoacyl)-2-oxospiro[indoline-3,3'-pyrrolidine]-6-d-5'-carboxamide
  • Step C Synthesis of N-((S)-1-((3R,5'S)-5'-cyano-2-oxospiro[indoline-3,3'-pyrrolidine]-1'-yl- 6-d)-4-Methyl-1-oxopentan-2-yl)-4,6,7-trifluoro-N-methyl-1H-indole-2-carboxylic acid amide-3,5 -d2
  • PF-07321332 was selected as the positive control compound.
  • Test results The range of IC 50 is as follows: A ⁇ 0.1 ⁇ M.
  • HMM human liver microsomes
  • test sample was prepared into a 50mM stock solution using DMSO.
  • the stock solution was gradient diluted with 50% acetonitrile water to 5.00, 1.67, 0.556, 0.185, 0.0617, 0.0206 and 0.00686mM.
  • Midazolam stock solutions were diluted to 5 ⁇ M in 0.1 M potassium phosphate buffer.
  • Ketoconazole stock solutions were diluted with 50% acetonitrile water to 30.0, 10.0, 3.33, 1.11, 0.370, 0.123, and 0.0412 ⁇ M.
  • Human liver microsomes 20mg/mL were diluted to 0.2mg/mL with 0.1M potassium phosphate buffer.
  • NADPH powder is prepared at 8mM in 0.1M potassium phosphate buffer.
  • stop solution 50 ng/mL propranolol, internal standard
  • 100 ⁇ L of stop solution 50 ng/mL propranolol, internal standard
  • Centrifuge 4000rpm for 10 minutes to precipitate proteins.
  • IC 50 values are calculated via a three- or four-parameter inverse logarithmic equation. When fitting When the obtained IC 50 is greater than the highest dosage concentration (50 ⁇ M) or the IC 50 cannot be obtained by fitting, the IC 50 value is marked as ">50 ⁇ M".
  • x Concentration of test article or positive control inhibitor.
  • y Enzyme activity at the corresponding concentration.
  • IC 50 half inhibitory concentration.
  • Test results: A ⁇ 3 ⁇ M, B 3-50 ⁇ M, C>50 ⁇ M.
  • the IC 50 of compound 7 for CYP3A4-M increased by more than 80% compared with non-deuterium compounds. It is expected that compound 7 can reduce the risk of enzyme CYP3A4 enzyme inhibition.
  • Vero cells were seeded into a 96-well cell culture plate at a density of 1 ⁇ 10 4 cells per well and cultured in a 5% CO 2 , 37°C incubator. After waiting for the cells to completely adhere, change to the medium containing 2% FBS 2 hours before infection and add the corresponding compound to the specified concentration (the starting concentration of the test compound is 10 ⁇ M, 4-fold dilution), and add the p-gp inhibitor CP at the same time -100356 (final concentration 2 ⁇ M), and then inoculate the new coronavirus Omicron BA.2 strain at MOI 0.05. After 72 hours of infection, the cell supernatant was collected to extract RNA, and the virus copy number was detected by qPCR.
  • SD rats female, 180-250g, purchased from Viton Lever.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • CMC-Na CMC-Na
  • TPGS physiological saline
  • heparin acetonitrile
  • formic acid formic acid
  • propranolol internal standard
  • liver S9 component 100 times with 0.1M potassium phosphate, add 30 ⁇ L of the liver S9 dilution into a 96-well plate, add 15 ⁇ L of midazolam (15 ⁇ M) probe substrate, and preheat at 37°C. After heating for 10 minutes, add 15 ⁇ L NADPH (8mM) to start the reaction. After incubating at 37°C for 35 minutes, add 150 ⁇ L ACN (including internal standard) to terminate the reaction. Centrifuge at 4000 rpm for 5 minutes. Take out 100 ⁇ L of the supernatant and add 100 ⁇ L of methanol:water (1:1). Diluted for sample analysis.

Abstract

本申请属于化学药物技术领域，涉及一种通式(I)所示的螺环化合物，或其异构体、或其消旋体、或其可药用的盐，作为一种3C样蛋白酶抑制剂以及使用其治疗多种特定疾病或病状的方法。

Description

一种螺环化合物及其制备方法与应用 技术领域
本发明属于化学药物技术领域，涉及一种螺环化合物，或其异构体、或其消旋体、或其可药用的盐，及其制备方法与应用。作为一种3C样蛋白酶抑制剂，以及使用其治疗多种特定疾病或病状的方法。
背景技术
冠状病毒(CoV)是一种包膜正链RNA致病病毒家族，可导致急性和慢性疾病，包括中枢神经系统疾病、普通感冒、下呼吸道感染和腹泻。冠状病毒进入宿主细胞后会被分解释放出核衣壳和病毒基因组。宿主细胞核糖体将病毒基因组的开放阅读框架(ORF)1a和ORF1b分别翻译成多聚蛋白pp1a和pp1b，用于编码16个非结构蛋白(nsps)，而其余的ORF编码结构蛋白和附属蛋白。3C样半胱氨酸蛋白酶(3CLpro)和木瓜样半胱氨酸蛋白酶(PLpro)催化PP裂解生成nsp2-16，进而形成复制-转录复合体(RTC)。这些蛋白酶活性缺失会导致病毒生命周期停止。
3C样蛋白酶(3CLpro)又称主要蛋白酶(Mpro)，全称由306个氨基酸组成，可进一步切割新冠多聚蛋白，从而产生解旋酶、RNA依赖的RNA聚合酶等相关复制元件，在病毒增殖和组装中具有重要作用。天然的3CLpro单体由三个结构域组成，两个单体相互作用形成包含底物结合位点的口袋结构。活性中心位于结构域I和II之间的缝隙中，催化位点为145位的Cys和41位的His。Paxlovid的作用靶点是3C样蛋白酶(3CLpro)，通过抑制病毒3CLpro，抑制RNA复制及相关非结构蛋白的生成，从而抑制病毒的复制。
目前，辉瑞制药PF-07321332的作用靶点是3C样蛋白酶(3CLpro)，通过抑制病毒3CLpro，抑制RNA复制及相关非结构蛋白的生成，从而抑制病毒的复制。PF-07321332已获得FDA紧急用药上市批准，用于新冠病毒感染的治疗。但是，PF-07321332治疗新冠肺炎时，如遇到其他处方药物，如抗血脂药物他汀类药物、抗凝血剂以及抗抑郁药，会增加这些药物毒副作用，甚至可能导致死亡等严重不良反应的发生。研究中尽管有报道称某些化合物可以抑制3CLpro活性，但它们尚未被批准作为冠状病毒疗法。
综上所述，本领域迫切需要更加安全、有效、便捷的抗新冠药物。
发明内容
鉴于现有技术存在的问题，本申请提供一种通式(I)所示的化合物，或其异构体、或其消旋体、或其可药用的盐，及其制备方法与应用。作为一种3C样蛋白酶抑制剂，以及使用其治疗多种特定疾病或病状的方法。
第一方面，本申请提供一种通式(I)所示的化合物，或其或其异构体、或其消旋体、或其可药用的盐。
进一步地，提供了一种通式(Ia)所示的化合物，或其或其异构体、或其消旋体、或其可药用的盐。
第二方面，本发明还提供一种药物组合物，其包含治疗有效量的上述任一项所述的化合物或其药物可接受的盐和药物可接受的载体。
第三方面，本发明还提供一种治疗有效量的上述所述的化合物或其药物可接受的盐在制备用于治疗病况的药物中的用途，所述疾病是3C样蛋白酶抑制剂相关疾病，具体地，所述病况选自新冠肺炎等病症。
具体地，本发明通过以下技术方案来实现：
一种通式(I)所示的化合物，或其异构体、或其消旋体、或其可药用的盐，包括：
R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11、R12、R13、R14、R15、R16、R17、R18、R19、R20、R21、R22、R23、R24独立的选自氢、氘，且至少其中一个为氘。
作为本发明的一种优选技术方案，提供了一种通式(Ia)所示的化合物，或其异构体、或其消旋体、或其可药用的盐，包括：
R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11、R12、R13、R14、R15、R16、R17、R18、R19、R20、R21独立的选自氢、氘，且至少其中一个为氘。
作为本发明的一种优选技术方案，所述的R1选自氘。
作为本发明的一种优选技术方案，所述的R2、R3、R4都选自氘。
作为本发明的一种优选技术方案，所述的R5选自氘。
作为本发明的一种优选技术方案，所述的R6、R7、R8、R9、R10、R11都选自氘。
作为本发明的一种优选技术方案，所述的R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11都选自氘。
作为本发明的一种优选技术方案，所述的R12选自氘。
作为本发明的一种优选技术方案，所述的R13、R14都选自氘。
作为本发明的一种优选技术方案，所述的R15、R16都选自氘。
作为本发明的一种优选技术方案，所述的R17、R18、R19、R20之一为氘或都选自氘，优选R18选自氘。
作为本发明的一种优选技术方案，所述的R21选自氘。
作为本发明的一种优选技术方案，所述的R22、R23、R24都选自氘。
作为本发明的一种优选技术方案，所述的化合物，或其异构体、或其消旋体、或其可药用的盐，选自：



作为本发明的一种优选技术方案，所述药学上可接受的盐是指所述化合物，或其异构体、或其消旋体、或其可药用的盐与药学上可接受的酸或碱制备。
作为本发明的一种优选技术方案，所述化合物，或其异构体、或其消旋体、或其可药用的盐的一个以上的氢原子上被同位素氘取代。
本发明进一步提供了一种药物组合物，其特征在于，包含治疗有效量的所述化合物，或其异构体、或其消旋体、或其可药用的盐和药物可接受的载体。
本发明进一步提供了所述化合物，或其异构体、或其消旋体、或其可药用的盐的医药用途，具体地，在制备用于治疗疾病的药物中的用途，所述疾病为3C样蛋白酶抑制剂相关疾病，具体选自新冠肺炎等病症。
为清楚起见，本文定义了在化合物的描述中所使用的通用术语。
除非另有说明，本文所用的下列术语和短语旨在具有下列含义。一个特定的术语或短语在没有特别定义的情况下不应该被认为是不确定的或不清楚的，而应该按照普通的含义去理解。当本文中出现商品名时，意在指代其对应的商品或其活性成分。这里所采用的术语“药学上可接受的”，是针对那些化合物、材料、组合物和/或剂型而言，它们在可靠的医学判断的范围之内，适用于与人类和动物的组织接触使用，而没有过多的毒性、刺激性、过敏性反应或其它问题或并发症，与合理的利益/风险比相称。
术语“药学上可接受的盐”是指本发明化合物的盐，由本发明发现的具有特定取代基的化合物与药学上可接受的酸或碱制备。
除了盐的形式，本发明所提供的化合物还存在前药形式。本文所描述的化合物的前药容易地在生理条件下发生化学变化从而转化成本发明的化合物。此外，前体药物可以在体内环境中通过化学或生化方法被转换到本发明的化合物。
本发明的某些化合物可以以非溶剂化形式或者溶剂化形式存在，包括水合物形式。一般而言，溶剂化形式与非溶剂化的形式相当，都包含在本发明的范围之内。
本发明的化合物可以存在特定的几何或立体异构体形式。本发明设想所有的这类化合物，包括顺式和反式异构体、(-)-和(+)-对映体、(R)-和(S)-对映体、非对映异构体、(D)-异构体、(L)-异构体，阻转异构体，及其外消旋混合物和其他混合物，所述混合物例如对映异构体或非对映体富集的混合物，所有这些混合物都属于本发明的范围之内。烷基等取代基中可存在另外的不对称碳原子。所有这些异构体以及它们的混合物，均包括在本发明的范围之内。
可以通过的手性合成或手性试剂或者其他常规技术制备光学活性的(R)-和(S)-异构体，以及D和L异构体，阻转异构体等。如果想得到本发明某化合物的一种对映体，可以通过不对称合成或者具有手性助剂的衍生作用来制备，其中将所得非对映体混合物分离，并且辅助基团裂开以提供纯的所需对映异构体。或者，当分子中含有碱性官能团(如氨基)或酸性官能团(如羧基)时，与适当的光学活性的酸或碱形成非对映异构体的盐，然后通过本领域所公知的常规方法进行非对映异构体拆分，然后回收得到纯的对映体。此外，对映异构体和非对映异构体的分离通常是通过使用色谱法完成的，所述色谱法采用手性固定相，并任选地与化学衍生法相结合(例如由胺生成氨基甲酸盐)。
术语“药学上可接受的载体”是指能够递送本发明有效量活性物质、不干扰活性物质的生物活性并且对宿主或者患者无毒副作用的任何制剂载体或介质，代表性的载体包括水、油、蔬菜和矿物质、膏基、洗剂基质、软膏基质等。这些基质包括悬浮剂、增粘剂、透皮促进剂等。它们的制剂为化妆品领域或局部药物领域的技术人员所周知。关于载体的其他信息，可以参考Remington:The Science and Practice of Pharmacy,21st Ed.,Lippincott,Williams&Wilkins(2005)，该文献的内容通过引用的方式并入本文。
术语“赋形剂”通常是指配制有效的药物组合物所需要载体、稀释剂和/或介质。
针对药物或药理学活性剂而言，术语“有效量”或“治疗有效量”是指无毒的但能达到预期效果的药物或药剂的足够用量。对于本发明中的口服剂型，组合物中一种活性物质的“有效量”是指与该组合物中另一种活性物质联用时为了达到预期效果所需要的用量。有效量的确定因人而异，取决于受体的年龄和一般情况，也取决于具体的活性物质，个案中合适的有效量可以由本领域技术人员根据常规试验确定。
术语“活性成分”、“治疗剂”，“活性物质”或“活性剂”是指一种化学实体，它可以有效地治疗目标紊乱、疾病或病症。
“任选”或“任选地”指的是随后描述的事件或状况可能但不是必需出现的，并且该描述包括其中所述事件或状况发生的情况以及所述事件或状况不发生的情况。
本发明的化合物可以通过本领域技术人员所熟知的多种合成方法来制备，包括下面列举的具体实施方式、其与其他化学合成方法的结合所形成的实施方式以及本领域技术上人员所熟知的等同替换方式，优选的实施方式包括但不限于本发明的实施例。
本发明的化合物的冠状病毒Mpro蛋白酶的抑制活性IC50的范围<0.1μM，优选<0.01μM。
另外，CYP3A4为肝脏最主要CYP450酶，在肠道中也有丰富分布，已上市药物多数通过CYP3A4代谢，对CYP3A4有抑制会引起较严重DDI风险，本发明预期解决现有技术存在的该问题。
本发明化合物可以通过以下合成路线制备得到：

其中，R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11、R12、R13、R14、R15、R16、R17、R18、R19、R20、R21、R22、R23、R24如说明书定义。
具体实施方式
下面结合实施例对本申请作进一步详细的描述，但本申请的实施方式不限于此。
氘代中间体1的合成
步骤A：合成4,6,7-三氟-1H-吲哚-2-羧酸-3-d
室温下，向4,6,7-三氟-1H-吲哚-2-羧酸(1.00克，4.64毫摩尔)中加入CD3OD(30毫升)，1-溴-3-甲基-2-丁烯(0.1克，0.67毫摩尔)，升温至50摄氏度反应5d。
反应结束，浓缩，加入20毫升的正己烷，室温下搅拌29min，抽滤，滤饼用20毫升的正己烷洗涤，得到1.05克灰白色固体甲基-d3-4,6,7-三氟-1H-吲哚-2-羧酸酯-3-d(收率96.5％)。
甲基-d3-4,6,7-三氟-1H-吲哚-2-羧酸酯-3-d经水解得到4,6,7-三氟-1H-吲哚-2-羧酸-3-d。
氘代中间体2的合成
室温下，将3-(6-溴-1H-吲哚-3-基)-2-(叔丁氧羰基)氨基丙酸甲酯(5.0克，12.58毫摩尔)溶于CD3OD(20毫升)与重水(20毫升)中，加入D3PO2(1.73克，25.17毫摩尔)，碳酸钠(5.33克，50.32毫摩尔)，Pd/C(0.5克)，然后50摄氏度反应3h
反应结束，浓缩至干，用DCM(50毫升X3)，有机相浓缩，得到3.2克白色固体产物叔丁氧羰基)-1-色氨酸甲酯-6-d(收率80％)。LC-MS:[M-H]+＝318。
室温下，将3.2克白色固体产物叔丁氧羰基)-1-色氨酸甲酯-6-d(3.0克，9.4毫摩尔)溶于DCM(30毫升)，加入4M盐酸二氧六环(10毫升)，室温下搅拌8h。
反应结束，浓缩至干，，得到2.39克白色固体产物L-色氨酸甲酯-6-d(收率100％)。LC-MS:[M-H]-＝218。
根据前述类似的方法合成得到以下几个D代中间体：
市售中间体或者通过现有技术已知的方法制备得到：
实施例1化合物1的制备
合成N-((S)-1-((3R,5'S)-5'-氰基-2-氧螺环[吲哚啉-3,3'-吡咯烷]-1'-基)-4-甲基-1-氧戊-2-基)-4,6,7-三氟-N-甲基-1H-吲哚-2-甲酰胺-3-d
合成路线如下：
步骤A：合成(3R,5'S)-1'-(甲基-L-烷基)-2-氧螺环[吲哚啉-3,3'-吡咯烷]-5'-甲酰胺盐酸盐
室温下，叔丁基((S)-1-((3R,5'S)-5'-氨甲酰基-2-氧螺环[吲哚-3,3'-吡咯烷]-1'-基)-4-甲基-1-氧戊-2-基)(甲基)氨基甲酸酯(1.0克，2.178毫摩尔)溶于DCM(10毫升)，加入盐酸二氧六环(4M，10毫升)中，室温反应4小时。反应结束，浓缩至干，得到类白色固体产物940毫克(3R,5'S)-1'-(甲基-L-烷基)-2-氧螺环[吲哚啉-3,3'-吡咯烷]-5'-甲酰胺盐酸盐，不做进一步的处理，直接用于下一步反应。LC-MS:[M-H]-＝357。
步骤B：(3R,5'S)-1'-(N-甲基-N-(4,6,7-三氟-1H-吲哚-2-羰基-3-d)-L-亮基)-2-氧螺环[吲哚啉-3,3'-吡咯烷]-5'-甲酰胺
室温下，将4,6,7-三氟-1H-吲哚-2-羧酸-3-d(160毫克，0.711毫摩尔)，溶于DMF(5毫升)中，0℃下搅拌，加入HATU(314.8毫克,0.828毫摩尔),DIPEA(445.7毫克，3.45毫摩尔)，然后0℃下搅拌10min，加入(3R,5'S)-1'-(甲基-L-烷基)-2-氧螺环[吲哚啉-3,3'-吡咯烷]-5'-甲酰胺盐酸盐(300毫克，0.69毫摩尔)的DMF溶液(5毫升)，加完后转移至室温反应1h。反应结束，加入水(20ml)，用二氯甲烷(20毫升×4)萃取。合并有机相，减压浓缩，残余物通过反向柱纯化得到150毫克白色产物(3R,5'S)-1'-(N-甲基-N-(4,6,7-三氟-1H-吲哚-2-羰基-3-d)-L-亮基)-2-氧螺环[吲哚啉-3,3'-吡咯烷]-5'-甲酰胺(收率39％)。LC-MS:[M-H]-＝555
步骤C:N-((S)-1-((3R,5'S)-5'-氰基-2-氧螺环[吲哚啉-3,3'-吡咯烷]-1'-基)-4-甲基-1-氧戊-2-基)-4,6,7-三氟-N-甲基-1H-吲哚-2-甲酰胺-3-d
室温下，将(3R,5'S)-1'-(N-甲基-N-(4,6,7-三氟-1H-吲哚-2-羰基-3-d)-L-亮基)-2-氧螺环[吲哚啉-3,3'-吡咯烷]-5'-甲酰胺(150毫克，0.269毫摩尔)溶于DCM(30毫升)中，加入伯吉斯试剂(321mg,1.34mmol),室温反应5小时。反应结束，加入水(20ml)，用二氯甲烷(20毫升×4)萃取。合并有机相，减压浓缩，残余物通过反向柱纯化得到110毫克白色产物N-((S)-1-((3R,5S)-5'-氰基-2-氧螺环[吲哚啉-3,3'-吡咯烷]-1'-基)-4-甲基-1-氧戊-2-基)-4,6,7-三氟-N-甲基-1H-吲哚-2-甲酰胺-3-d(收率76％)。LC-MS:[M-H]-＝537。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.53(s,1H),10.69(s,1H),7.16-7.11(m,1H),7.08(d,J＝7.5Hz,2H),6.85(dd,J＝13.2,7.5Hz,2H),5.34(dd,J＝9.5,5.4Hz,1H),5.18(t,J＝7.7Hz,1H),3.86(d,J＝3.1Hz,2H),3.20(s,3H),2.72-2.62(m,1H),2.48-2.31(m,1H),1.84-1.74(m,1H),1.68(dt,J＝13.8,6.7Hz,1H),1.57(s,1H),0.96(d,J＝6.5Hz,3H),0.92(d,J＝6.4Hz,3H).
实施例2化合物2的制备
合成N-((S)-1-((3R,5'S)-5'-氰基-2-氧螺环[吲哚啉-3,3'-吡咯烷]-1'-基)-4-甲基-1-氧戊-2-基)-4,6,7-三氟-N-(甲基-d3)-1H-吲哚-2-甲酰胺
步骤A：合成化合物2-2
将化合物(叔丁氧羰基)-L-亮氨酸(10克，43.3毫摩尔)溶于100毫升干燥四氢呋喃中，然后0度下加入氢化钠(6.9克，173.2毫摩尔)，反应在氮气保护下，0度下搅拌30分钟，滴加氘代碘甲烷(13.5毫升，216.5毫摩尔)，室温下反应过夜。向混合物中加入50毫升水，用1N盐酸调节pH＝4，然后用乙酸乙酯(50毫升x 3)萃取,合并的有机相用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤、旋干。所得残余物用硅胶柱纯化(洗脱剂：石油醚烷/乙酸乙酯＝2/1)，得到9克黄色油状物化合物2-2(收率：84.1％)。[M-H]-＝247.
步骤B：合成化合物2-3
将化合物2-1(2克，8.06毫摩尔)与化合物2-2(2.2克，8.87毫摩尔)溶于二氯甲烷(10毫升)和N,N-二甲基甲酰胺(10毫升)中，在冰水浴条件下加入N-甲基吗啉(1.74克，17.2毫摩尔)和HATU(3.61克，9.5毫摩尔)，室温反应2小时。将反应液倒入到50毫升饱和氯化铵水溶液中，用乙酸乙酯(30毫升)萃取3次。合并有机相，用无水硫酸钠干燥，旋干。所得残余物用硅胶柱纯化(洗脱剂：二氯甲烷/甲醇＝97/3)，得到2.9克黄色固体化合物2-3(收率：77％)。M+H]+＝462.
步骤C：合成化合物2-4
将化合物2-3(2.9克，6.27毫摩尔)溶于二氯甲烷(15毫升)中，滴入4N盐酸1,4二氧六环溶液(10毫升)，室温搅拌1小时。将反应液旋干。得到2.2克黄色固体化合物5(收率：96％)。[M+H]+＝362.
步骤D：合成化合物2-6
将化合物2-4(500毫克，1.38毫摩尔)化合物2-5(298毫克，1.38毫摩尔)溶于二氯甲烷(4毫升)和N,N-二甲基甲酰胺(4毫升)中，在冰水浴条件下加入N,N-二异丙基乙胺(804毫克，6.23毫摩尔)和HATU(632毫克，1.66毫摩尔)。室温反应4小时。将反应液倒入到50毫升饱和氯化铵水溶液中，用乙酸乙酯(30毫升)萃取3次。合并有机相，用无水硫酸钠干燥，旋干。所得残余物用硅胶柱纯化(洗脱剂：二氯甲烷/甲醇＝95/5)，得到270毫克棕黄色固体合成化合物2-6(收率：35％)。[M+H]+＝559.
步骤E：合成化合物2
将化合物2-6(270毫克，0.48毫摩尔)溶于二氯甲烷(4毫升)中，冰水浴下加入三乙胺(392毫克，3.87毫摩尔),滴入三氟乙酸酐(406毫克，1.93毫摩尔)，0度搅拌2小时。反应液用20毫升二氯甲烷稀释，依次用饱和碳酸氢钠水溶液、饱和氯化铵水溶液洗涤。有机相用无水硫酸钠干燥，旋干。所得残余物用硅胶板纯化(展开剂：石油醚/乙酸乙酯＝1/1)，得到30毫克白固体化合物2(收率：11％)。LCMS:Rt＝2.558min,[M+H]+＝539.1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.53(s,1H),10.68(s,1H),7.19-7.06(m,3H),6.94-6.77(m,3H),5.40-5.31(m,1H),5.24-5.17(m,1H),3.89(s,2H),2.72-2.65(m,1H),2.52-2.47(m,1H),1.85-1.54(m,3H),1.01-0.93(m,6H).
实施例3-6化合物3-6的制备
参照前述制备方法制备得到：
实施例7化合物7的制备
合成N-((S)-1-((3R,5'S)-5'-氰基-2-氧代螺[吲哚啉-3,3’-吡咯烷]-1'-基-5-d)-4-甲基-1-氧代戊烷-2-基)-4,6,7-三氟-N-甲基-1H-吲哚-2-羧酸酰胺
步骤A：合成(S)-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-羧酸甲酯盐酸盐
室温下，L-色氨酸甲酯盐酸盐(100克，392.6毫摩尔)溶于甲醇(1000毫升)中，加入多聚甲醛(46.0克，510.6毫摩尔)，加热至回流反应过夜。反应结束，浓缩至干，得到类白色固体产物(S)-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-羧甲酯盐酸盐，不做进一步的处理，直接用于下一步反应。LC-MS:[M+H]+＝231。
步骤B：合成2-(叔丁基)3-甲基(S)-1,3,4,9-四氢-2H-吡啶并[3,4-b]吲哚-2,3-二羧酸酯
室温下，将上一步(S)-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3羧甲酯盐酸盐溶于二氯甲烷(1000毫升)中，加入三乙胺(83.4g，824.2毫摩尔)和Boc2O(128.38克，588.9毫摩尔)，室温反应过夜。
反应结束，降温至0-10℃，加入水200ml，加入1M盐酸(520毫升),分液，有机相加入0.5M盐酸(150毫升)萃取，再用饱和盐水(250毫升)洗涤，减压浓缩至干，加入EA(100毫升)、正己烷(1000毫升)析晶，过滤，得到105.0克淡黄色产物2-(叔丁基)3-甲基(S)-6-1,3,4,9-四氢-2H-吡啶并[3,4-b]吲哚-2,3-二羧酸酯(两步收率80％)。LC-MS:[M+H]+＝ 231
步骤C:合成1'-(叔丁基)5'-(3R,5'S)-2-氧代-1'4-螺[吲哚啉-3,3’-吡咯烷]-1',5'-二羧酸酯
室温下，将2-(叔丁基)3-甲基-(S)-6-1,3,4,9-四氢-2H-吡啶并[3,4-b]吲哚-2,3-二羧酸酯(50克，151.3毫摩尔)溶于四氢呋喃(500毫升)中，降温0-5℃，加入乙酸(64.0克)，降温至-20℃以下，缓慢滴加NBS(28.3克，159.0毫摩尔)、THF(240毫升)、水(28.3毫升)溶液，加完反应1.5h。
反应结束，加入饱和碳酸钾溶液(500毫升)淬灭反应，加入乙酸乙酯(500毫升)，分液，水相加入EA(250毫升)萃取，合并有机相，有机相用水(250毫升)萃取，再用饱和盐水(250毫升)萃取。浓缩至干，得到黄色油状物产物1'-(叔丁基)-5'-(3R,5'S)-5-溴-2-氧代-1'4-螺[吲哚啉-3,3’-吡咯烷]-1',5'-二羧酸甲酯，直接用于下一步反应，不做进一步的纯化。LC-MS:[M+H]+＝348
步骤D:合成1'-(叔丁基)-5'-(3R,5'S)-5-溴-2-氧代-1'4-螺[吲哚啉-3,3’-吡咯烷]-1',5'-二羧酸甲酯
室温下，将上一步1'-(叔丁基)5'-(3R,5'S)-2-氧代-1'4-螺[吲哚啉-3,3’-吡咯烷]-1',5'-二羧酸甲酯溶于乙腈(500毫升)中，加入NBS(26.93克，151.3毫摩尔)，室温反应1.5h。
反应结束，加入20毫升饱和硫代硫酸钠水溶液淬灭反应，浓缩，加入水(500毫升)，二氯甲烷萃取(500毫升×3)，合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，加入正己烷(400毫升)和甲基叔丁基醚(200毫升)，室温搅拌3h。抽滤，得到38.5克褐色粉末产物1'-(叔丁基)-5'-(3R,5'S)-5-溴-2-氧代-1'4-螺[吲哚啉-3,3’-吡咯烷]-1',5'-二羧酸甲酯(收率60％)。LC-MS:[M-H]+＝423。
步骤E:合成(3R,5'S)-5-溴-5'-氨基甲酰基-2-氧代螺[吲哚啉-3,3’-吡咯烷]-1'-羧酸叔丁酯
室温下，将1'-(叔丁基)-5'-(3R,5'S)-5-溴-2-氧代-1'4-螺[吲哚啉-3,3’-吡咯烷]-1',5'-二羧酸甲酯(9.00克，21.22毫摩尔)溶于7M氨甲醇溶液(120毫升，840毫摩尔)中，50℃搅拌1天。反应结束，浓缩，加入二氯甲烷(20毫升)和甲基叔丁基醚(80毫升)，室温搅拌3h，抽滤，得到5.50克橙褐色固体产物(3R,5'S)-5-溴-5'-氨基甲酰基-2-氧代螺[吲哚啉-3,3’-吡咯烷]-1'-羧酸叔丁酯(收率63.3％)。LC-MS:[M-H]+＝408。
步骤F：合成(3R,5'S)-5-溴-2-氧代螺[吲哚啉-3,3'-吡咯]-5'-羧酰胺盐酸盐
室温下，将(3R,5'S)-5-溴-5'-氨基甲酰基-2-氧代螺[吲哚啉-3,3’-吡咯烷]-1'-羧酸叔丁酯(1.2克，2.93毫摩尔)溶于二氯甲烷(25毫升)中，加入4M HCl的二氧六环溶液(8毫升，32.0毫摩尔)，室温搅拌2h。反应结束，浓缩至干，得1.07克褐色固体(3R,5'S)-5-溴-2-氧代螺[吲哚啉-3,3'-吡咯]-5'-羧酰胺盐酸盐(收率100％)。LC-MS:[M-H]+＝343。
步骤G：合成N-甲基-((S)-1-((3R,5'S)-5-溴-5'-氨甲酰-2-氧代螺[吲哚啉-3,3'-吡咯烷]-1'-基)-4-甲基-1-氧代戊烷-2-基)氨基甲酸叔丁酯
室温下，将N-(叔丁氧羰基)-N-甲基-L-亮氨酸(1.0克,4.07毫摩尔)和(3R,5'S)-5-溴-2-氧代螺[吲哚啉-3,3'-吡咯]-5'-羧酰胺盐酸盐(1.55克，4.07毫摩尔)加入二氯甲烷(20毫升)和DMF(20毫升)中，加入N-甲基吗啉(1.64克，16.28毫摩尔)和HATU(1.85克，4.88毫摩尔)，室温反应4h。
反应结束，加入水(40毫升)淬灭反应，二氯甲烷萃取(40毫升×3)，合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，所得残余物用硅胶柱层析纯化(洗脱剂：DCM/甲醇＝20:1)，得到1.30克淡黄色固体N-甲基-((S)-1-((3R,5'S)-5-溴-5'-氨甲酰-2-氧代螺[吲哚啉-3,3'-吡咯烷]-1'-基)-4-甲基-1-氧代戊烷-2-基)氨基甲酸叔丁酯(收率60％)。LC-MS:[M+H]+＝535。
步骤H：合成N-甲基-((S)-1-((3R,5'S)-5'-氨甲酰-2-氧代螺[吲哚啉-3,3’-吡咯烷]-1’-基-5-d)-4-甲基-1-氧代戊烷-2-基)氨基甲酸叔丁酯
室温下，将N-甲基-((S)-1-((3R,5'S)-5-溴-5'-氨甲酰-2-氧代螺[吲哚啉-3,3'-吡咯烷]-1'-基)-4-甲基-1-氧代戊烷-2-基)氨基甲酸叔丁酯(1.4克,2.61毫摩尔)加入到D2O(14毫升)和CD3OD(14毫升)中，加入Na2CO3(0.83克，7.83毫摩尔),D3PO2(720克豪，5.22毫摩尔),10％Pd/C(280毫克)，然后50℃反应过夜。
反应结束，过滤，浓缩，加入水20毫升，用DCM萃取(200毫升×3),有机相无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，得到1.0克白色固体N-甲基-((S)-1-((3R,5'S)-5'-氨甲酰-2-氧代螺[吲哚啉-3,3’-吡咯烷]-1’-基-5-d)-4-甲基-1-氧代戊烷-2-基)氨基甲酸叔丁酯(收率60％)。LC-MS:[M+H]+＝458。
步骤I：合成(3R,5'S)-1'-(甲基-L-亮氨酸)-2-氧代螺[吲哚啉-3,3'-吡咯烷]-5-d-5'-羧酰胺
室温下，将N-甲基-((S)-1-((3R,5'S)-5'-氨甲酰-2-氧代螺[吲哚啉-3,3’-吡咯烷]-1’-基-5-d)-4-甲基-1-氧代戊烷-2-基)氨基甲酸叔丁酯(1.00克，2.17毫摩尔)溶于二氯甲烷(10毫升)中，加入4MHCl的二氧六环溶液(10毫升，40毫摩尔)，室温搅拌4h。反应结束，浓缩至干，得1.72克白色固体(3R,5'S)-1'-(甲基-L-亮氨酸)-2-氧代螺[吲哚啉-3,3'-吡咯烷]-5-d-5'-羧酰胺(收率100％)。LC-MS:[M+H]+＝358。
步骤J：合成(3R,5′S)-1′-(N-甲基-N-(4,6,7-三氟-1H-吲哚-2-羰基)-L-亮氨酸)-2-氧代螺[吲哚啉-3,3'-吡咯烷]-5-d-5'-甲酰胺
室温下，将4,6,7-三氟1H-吲哚-2-羧酸(201.79毫克，0.938毫摩尔)加入到DMF(10毫升)中，冰浴下加入HATU(387毫克，1.10毫摩尔)和DIPEA(0.693毫升，3.9毫摩尔)，搅拌10分钟后，加入(3R,5'S)-1'-(甲基-L-亮氨酸)-2-氧代螺[吲哚啉-3,3'-吡咯烷]-5-d-5'-羧酰胺(310毫克，0.784毫摩尔)。
反应结束，加入饱和碳酸氢钠溶液(10毫升)淬灭反应，二氯甲烷萃取(10毫升×3)，合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，所得残余物用硅胶柱层析纯化(洗脱剂：DCM/甲醇＝20:1)，得到0.31毫克淡黄色固体(3R,5′S)-1′-(N-甲基-N-(4,6,7-三氟-1H-吲哚-2-羰基)-L-亮氨酸)-2-氧代螺烷[吲哚啉-3,3'-吡咯烷]-5-d-5'-甲酰胺(收率71％)。LC-MS:[M+H]+＝555。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.46(s,1H),10.68(s,1H),7.54(s,1H),7.13-7.05(m,3H),6.92(s,1H),6.84(d,J＝8.0Hz,1H),6.54(s,1H),5.34(t,J＝4Hz,8Hz,1H),4.64-4.59(m,1H),3.90-3.77(m,2H),3.15(s,3H),2.34-2.16(m,2H),1.70-1.66(m,2H),1.68-1.51(m,1H),0.96(d,J＝8.0Hz,3H),0.92(d,J＝4Hz,3H)。
步骤K:合成N-((S)-1-((3R,5'S)-5'-氰基-2-氧代螺[吲哚啉-3,3’-吡咯烷]-1'-基-5-d)-4-甲基-1-氧代戊烷-2-基)-4,6,7-三氟-N-甲基-1H-吲哚-2-羧酸酰胺
室温下将(3R,5′S)-1′-(N-甲基-N-(4,6,7-三氟-1H-吲哚-2-羰基)-L-亮氨酸)-2-氧代螺[吲哚啉-3,3'-吡咯烷]-5-d-5'-甲酰胺(0.31g,0.55毫摩尔)溶于二氯甲烷(15mL)中，加入Burgess试剂(0.796克，3.34毫摩尔)，室温搅拌6h。
加入饱和碳酸氢钠淬灭反应(15毫升)，二氯甲烷萃取(50毫升×3)，合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，所得残余物用硅胶柱层析纯化(洗脱剂：洗脱剂：DCM/甲醇＝20:1)，得到0.25克浅黄色固体产物N-((S)-1-((3R,5'S)-5'-氰基-2-氧代螺[吲哚啉-3,3’-吡咯烷]-1'-基-5-d)-4-甲基-1-氧代戊烷-2-基)-4,6,7-三氟-N-甲基-1H-吲哚-2-羧酸酰胺(收率84％)。LC-MS:[M-H]-＝537。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.53(s,1H),10.68(s,1H),7.16-7.08(m,3H),6.88-6.80(m,2H),5.35-5.31(m,1H),5.20-5.16(m,1H),3.89-3.84(m,2H),3.20(s,3H),2.70-2.64(m,1H),2.53-2.51(m,1H),1.82-1.74(m,1H),1.72-1.66(m,1H),1.58-1.55(m,1H),0.96(d,J＝8.0Hz,3H),0.92(d,J＝6.4Hz,3H)。
实施例8化合物8的制备
参照前述制备方法制备得到：LC-MS:[M-H]-＝546
实施例9化合物9的制备
合成N-((S)-1-((3R,5'S)-5'-氰基-2-氧代螺[吲哚啉-3,3’-吡咯烷]-1'-基-4',4'-d2)-4-甲基-1-氧代戊烷-2-基)-4,6,7-三氟-N-甲基-1H-吲哚-2-羧酸酰胺
步骤A：合成L-色氨酸-β,β-d2
室温下，向L-色氨酸(5.00克，24.48毫摩尔)中加入重水(100毫升)，加入10％Pd/C(500毫克)，氢气置换，升温至110摄氏度反应6h。反应结束，过滤，滤液浓缩，得到5.05克无色油状液体L-色氨酸-β,β-d2(收率100％)。LC-MS:[M+H]+＝207。
步骤B：合成L-色氨酸-β,β-d2甲酯盐酸盐
室温下，将L-色氨酸-β,β-d2(5.05克，24.5毫摩尔)溶于甲醇(50毫升)中，加入二氯亚砜(45.83克，49毫摩尔)，升温至回流反应18h，反应结束，浓缩至干，得到4.8克白色固体产物L-色氨酸-β,β-d2甲酯盐酸盐(收率89％)。LC-MS:[M+H]+＝221。
步骤C：合成(S)-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-羧酸-4,4-d2甲酯盐酸盐
室温下，将L-色氨酸-β,β-d2甲酯盐酸盐(4.8克，21.8毫摩尔)溶于甲醇(100毫升)中，加入37％甲醇水溶液(1.86克，22.88毫摩尔)，加热至回流反应1.5h。反应结束，浓缩至干，加入叔丁基甲基醚(100毫升)，搅拌15min，过滤，得到产物4.5克白色固体产物(S)-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-羧-4,4-d2甲酯盐酸盐(收率89.6％)。LC-MS:[M+H]+＝233。
步骤D：合成2-(叔丁基)3-甲基(S)-1,3,4,9-四氢-2H-吡啶并[3,4-b]吲哚-2,3-二羧酸-4,4-d2
室温下，将(S)-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3羧-4,4-d2甲酯盐酸盐(4.5克，19.3毫摩尔)溶于二氯甲烷(60毫升)中，加入三乙胺(3.39克，33.49毫摩尔)和Boc酸酐(4.39克，20.09毫摩尔)，室温反应3h。反应结束，加入饱和碳酸氢钠淬灭(50毫升)，二氯甲烷萃取(50毫升×3),合并有机相，无水硫酸钠干燥，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩得到5.01克无色油状液体产物2-(叔丁基)3-甲基(S)-1,3,4,9-四氢-2H-吡啶并[3,4-b]吲哚-2,3-二羧酸-4,4-d2(收率90％)。LC-MS:[M+H]+＝333
步骤E:合成1'-(叔丁基)5'-(3R,5'S)-2-氧代-1'4-螺[吲哚啉-3,3’-吡咯烷]-1',5'-二羧酸-4',4'-d2甲酯
室温下，将2-(叔丁基)3-甲基(S)-1,3,4,9-四氢-2H-吡啶并[3,4-b]吲哚-2,3-二羧酸-4,4-d2溶于四氢呋喃(15毫升)，乙酸(15毫升)，水(15毫升)中，冷却至-15℃，加入NBS(2.68克，15.05毫摩尔)，缓慢升到5℃继续反应。反应结束，加入饱和亚硫酸钠(10毫升)和饱和碳酸氢钠(10毫升)淬灭反应，二氯甲烷萃取(30毫升×3)，无水硫酸钠干燥，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，得到4克白色固体产物1'-(叔丁基)5'-(3R,5'S)-2-氧代-1'4-螺[吲哚啉-3,3’-吡咯烷]-1',5'-二羧酸-4',4'-d2甲酯(收率76％)。LC-MS:[M+H]+＝350
步骤F:合成(3R,5'S)-5'-氨基甲酰基-2-氧代螺[吲哚啉-3,3’-吡咯烷]-1'-羧酸-4',4'-d2叔丁酯
室温下，将1'-(叔丁基)5'-(3R,5'S)-2-氧代-1'4-螺[吲哚啉-3,3’-吡咯烷]-1',5'-二羧酸-4',4'-d2甲酯(4.00克，11.45毫摩尔)溶于甲醇(30毫升)中，加入7M氨甲醇溶液(60毫升，420毫摩尔)，室温搅拌3天。反应结束，浓缩，经C18柱纯化(0-50％MeCN/H2O)得到1.8克白色固体产物(3R,5'S)-5'-氨基甲酰基-2-氧代螺[吲哚啉-3,3’-吡咯烷]-1'-羧酸-4',4'-d2叔丁酯(收率44.7％)。LC-MS:[M+H]+＝335。
步骤G：合成(3R,5'S)-2-氧代螺[吲哚啉-3,3'-吡咯]-4',4'-d2-5'-羧酸酰胺盐酸盐
室温下，将(3R,5'S)-5'-氨基甲酰基-2-氧代螺[吲哚啉-3,3’-吡咯烷]-1'-羧酸-4',4'-d2叔丁酯(1.8克，5.39毫摩尔)溶于二氯甲烷(25毫升)中，加入4M HCl的二氧六环溶液(11毫升，44毫摩尔)，室温搅拌4h。反应结束，浓缩至干，得1.46克白色固体(3S,5'S)-2-氧代螺[吲哚啉-3,3'-吡咯]-4',4'-d2-5'-羧酸酰胺盐酸盐(收率100％)。LC-MS:[M+H]+＝234。
步骤H：合成((S)-1-((3R,5'S)-5'-氨基甲酰基-2-氧代螺[吲哚啉-3,3’-吡咯烷]-1'-基-4',4'-d2)-4-甲基-1-氧代戊烷-2-基)(甲基)氨基甲酸叔丁酯
室温下，将N-Boc-N-甲基L-亮氨酸(1.23克，5.00毫摩尔)和(3R,5'S)-2-氧代螺[吲哚啉-3,3’-吡咯烷]-5'-羧酸酰胺盐酸盐(1.34克，4.97毫摩尔)加入二氯甲烷(40毫升)和DMF(10毫升)中，加入N-甲基吗啉(1.77克，17.50毫摩尔)和HATU(2.09克，5.5毫摩尔)，室温反应4h。
反应结束，加入饱和碳酸氢钠溶液(50毫升)淬灭反应，二氯甲烷萃取(50毫升×3)，合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，所得残余物用硅胶柱层析纯化(洗脱剂：乙酸乙酯)，得到2.00克黄色油状液体((S)-1-((3R,5'S)-5'-氨基甲酰基-2-氧代螺[吲哚啉-3,3’-吡咯烷]-1'-基-4',4'-d2)-4-甲基-1-氧代戊烷-2-基)(甲基)氨基甲酸叔丁酯(收率87.2％)。LC-MS:[M+H]+＝461。
步骤I：合成(3R,5'S)-1'-(甲基-L-亮氨酰基)-2-氧代螺[吲哚啉-3,3’-吡咯烷]-4',4'-d2-5'-羧酸酰胺盐酸盐
室温下，将((S)-1-((3R,5'S)-5'-氨基甲酰基-2-氧代螺[吲哚啉-3,3’-吡咯烷]-1'-基-4',4'-d2)-4-甲基-1-氧代戊烷-2-基)(甲基)氨基甲酸叔丁酯(2.00克，4.3毫摩尔)溶于二氯甲烷(10毫升)中，加入4MHCl的二氧六环溶液(10毫升，40毫摩尔)，室温搅拌4h。反应结束，浓缩至干，得1.72克白色固体(3R,5'S)-1'-(甲基-L-亮氨酰基)-2-氧代螺[吲哚啉-3,3’-吡咯烷]-4',4'-d2-5'-羧酸酰胺盐酸盐(收率100％)。LC-MS:[M+H]+＝361。
步骤G：合成N-((S)-1-((3R,5'S)-5'-氰基-2-氧代螺[吲哚啉-3,3’-吡咯烷]-1'-基-4',4'-d2)-4-甲基-1-氧代戊烷-2-基)-4,6,7-三氟-N-甲基-1H-吲哚-2-羧酸酰胺
室温下，将4,6,7-三氟1H-吲哚-2-羧酸(848毫克)和(3R,5'S)-1'-(甲基-L-亮氨酰基)-2-氧代螺[吲哚啉-3,3’-吡咯烷]-4',4'-d2-5'-羧酸酰胺盐酸盐(1.71克，4.30毫摩尔)加入二氯甲烷(40毫升)和DMF(10毫升)中，加入N-甲基吗啉(1.52克，14.98毫摩尔)和HATU(1.80克，4.7毫摩尔)，室温反应4h。反应结束，加入饱和碳酸氢钠溶液(50毫升)淬灭反应，二氯甲烷萃取(50毫升×3)，合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，所得残余物用硅胶柱层析纯化(洗脱剂：乙酸乙酯/甲醇＝20:1)，得到1.80克黄色油状液体N-((S)-1-((3R,5'S)-5'-氰基-2-氧代螺[吲哚啉-3,3’-吡咯烷]-1'-基-4',4'-d2)-4-甲基-1-氧代戊烷-2-基)-4,6,7-三氟-N-甲基-1H-吲哚-2-羧酸酰胺(收率80.1％)。LC-MS:[M+H]+＝558。
步骤K:合成N-((S)-1-((3R,5'S)-5'-氰基-2-氧代螺[吲哚啉-3,3’-吡咯烷]-1'-基-4',4'-d2)-4-甲基-1-氧代戊烷-2-基)-4,6,7-三氟-N-甲基-1H-吲哚-2-羧酸酰胺
室温下将N-((S)-1-((3R,5'S)-5'-氰基-2-氧代螺[吲哚啉-3,3’-吡咯烷]-1'-基-4',4'-d2)-4-甲基-1-氧代戊烷-2-基)-4,6,7-三 氟-N-甲基-1H-吲哚-2-羧酸酰胺(1.8g)溶于二氯甲烷(15mL)中，加入Burgess试剂(2.38克，9.97毫摩尔)，室温搅拌4h。加入饱和碳酸氢钠淬灭反应(15毫升)，二氯甲烷萃取(50毫升×3)，合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，所得残余物用硅胶柱层析纯化(洗脱剂：乙酸乙酯)，得到1.05克浅黄色固体产物N-((S)-1-((3R,5'S)-5'-氰基-2-氧代螺[吲哚啉-3,3’-吡咯烷]-1'-基-4',4'-d2)-4-甲基-1-氧代戊烷-2-基)-4,6,7-三氟-N-甲基-1H-吲哚-2-羧酸酰胺。LC-MS:[M+H]+＝540。
实施例10化合物10的制备
N-1-(3R，5'S)-5'-氰基-2-氧代螺[吲哚啉-3，3'-吡咯烷]-1'-基-2'，2'-d2)-4-甲基-1-氧代戊聚-2-基)-4，6，7-三氟-N-甲基-1H-吲哚-2-甲酰胺
步骤A：合成1'-叔丁基5'-甲基-2-氧代螺[吲哚啉-3，3'-吡咯烷]-1'，5'-二羧酸-2'，2'-d2
室温下把2-叔丁基3-甲基-1，3，4，9-四氢吡啶[3，4-b]吲哚-2，3-二羧酸-1，1-d2(23.0克，69.2毫摩尔)溶解于四氢呋喃(400毫升)，再加入40毫升水，在零度下加入醋酸(29.1克，484毫摩尔)，接着NBS(12.9克，72.6毫摩尔)溶解于四氢呋喃/水8：1(100毫升)在-30度下缓慢的滴加到反应夜中，-30度搅拌2小时。
反应完毕，加20％的碳酸钾水溶液(1000毫升)中和反应夜，直到PH等于7～8，接着乙酸乙酯萃取(1000毫升×3)，合并有机相，依次用水(1000毫升)、饱和食盐水(1000毫升)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，得到21克粗品1'-叔丁基5'-甲基-2-氧代螺[吲哚啉-3，3'-吡咯烷]-1'，5'-二羧酸-2'，2'-d2。LC-MS:[M-H]+＝347。
步骤B：合成叔丁基(3R，5'S)-5'-氨基甲酰基-2-氧代螺[吲哚啉-3，3'-吡咯烷]-1'-羧酸酯-2'，2'-d2
室温下把1'-叔丁基5'-甲基-2-氧代螺[吲哚啉-3，3'-吡咯烷]-1'，5'-二羧酸-2'，2'-d2(16.0克，46毫摩尔)加入到7摩尔600毫升的氨甲醇中，接着50度搅拌48小时。反应完毕，直接旋干反应液得到粗品过反向柱(乙腈：水5：95到40：50)得到纯品8克叔丁基(3R，5'S)-5'-氨基甲酰基-2-氧代螺[吲哚啉-3，3'-吡咯烷]-1'-羧酸酯-2'，2'-d2(收率：50％)。LC-MS:[M-H]+＝332.
步骤C：合成2-氧代螺[吲哚啉-3，3'-吡咯烷]-2'，2'-d2-5'-甲酰胺
室温下把叔丁基(3R，5'S)-5'-氨基甲酰基-2-氧代螺[吲哚啉-3，3'-吡咯烷]-1'-羧酸酯-2'，2'-d2(2.40克，7.2毫摩尔)加入到盐酸二氧六环(4摩尔，20毫升)中,室温下反应2小时。反应完毕，直接旋干得到1.6克粗品2-氧代螺[吲哚啉-3，3'-吡咯烷]-2'，2'-d2-5'-甲酰胺用于下一步。LC-MS:[M-H]+＝232。
步骤D：合成叔丁基-1-(3R，5'S)-5'-氨基甲酰基-2-氧代螺[吲哚啉-3，3'-吡咯烷]-1'-基-2'，2'-d2)-4-甲基-1-氧代戊聚-2-基)甲酯
室温下把N-叔丁氧羰基-N-甲基亮氨酸(841毫克，1.05毫摩尔)加入到二氯甲烷/DMF中(20毫升),接着在0度下缓慢加入吗啡啉(1.39克，13.7毫摩尔)，HATU(1.44g,3.77毫摩尔)加入，接着室温搅拌5分钟；接着0度下加入2-氧代螺[吲哚啉-3，3'-吡咯烷]-2'，2'-d2-5'-甲酰胺(800毫克，3.43毫摩尔)，室温下搅拌12小时。反应完毕，加水(100毫升)淬灭，二氯甲烷萃取(100毫升×3)，合并有机相，依次用水(200毫升)、饱和食盐水(100毫升)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩。所得残余物过反向柱(乙腈：水5：9到50：50)得到1.2克白色固体叔丁基-1-(3R，5'S)-5'-氨基甲酰基-2-氧代螺[吲哚啉-3，3'-吡咯烷]-1'-基-2'，2'-d2)-4-甲基-1-氧代戊聚-2-基)甲酯.(收率：75.9％)。LC-MS:[M-H]+＝459
步骤E：合成3R，5'S-1'-甲基-L-亮氨酸-2-氧代螺[吲哚啉-3，3'-吡咯烷]-2'，2'-d2-5'-甲酰胺
把叔丁基-1-(3R，5'S)-5'-氨基甲酰基-2-氧代螺[吲哚啉-3，3'-吡咯烷]-1'-基-2'，2'-d2)-4-甲基-1-氧代戊聚-2-基)甲酯(600毫克，1.3毫摩尔)加入到盐酸二氧六环(4摩尔，20毫升)中,室温下反应2小时。反应完毕，直接旋干得到460毫克粗品3R，5'S-1'-甲基-L-亮氨酸-2-氧代螺[吲哚啉-3，3'-吡咯烷]-2'，2'-d2-5'-甲酰胺直接用于下一步。LC-MS:[M-H]+＝359。
步骤F：4，6，7-三氟吲哚-2-羰基-L-亮氨酸-2-氧代螺[吲哚啉-3，3'-吡咯烷]-2'，2'-d2-5'-甲酰胺
室温下把4，6，7-三氟吲哚-2-羧酸(275毫克，1.28毫摩尔)加入到二氯甲烷/DMF中(20毫升),接着在0度下缓慢加入吗啡啉(516毫克，1.28毫摩尔)，HATU(534毫克,1.41毫摩尔)加入，接着室温搅拌5分钟；接着0度下加入3R，5'S-1'-甲基-L-亮氨酸-2-氧代螺[吲哚啉-3，3'-吡咯烷]-2'，2'-d2-5'-甲酰胺(460毫克，1.28毫摩尔)，室温下搅拌12小时。
反应完毕，加水(100毫升)淬灭，二氯甲烷萃取(100毫升×3)，合并有机相，依次用水(200毫升)、饱和食盐水(100 毫升)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩。所得残余物过反向柱(乙腈：水5：9到50：50)得到700毫克白色固体4，6，7-三氟吲哚-2-羰基-L-亮氨酸-2-氧代螺[吲哚啉-3，3'-吡咯烷]-2'，2'-d2-5'-甲酰胺(收率：98％)。LC-MS:[M-H]+＝556.
步骤G：N-1-(3R，5'S)-5'-氰基-2-氧代螺[吲哚啉-3，3'-吡咯烷]-1'-基-2'，2'-d2)-4-甲基-1-氧代戊聚-2-基)-4，6，7-三氟-N-甲基-1H-吲哚-2-甲酰胺
室温下把4，6，7-三氟吲哚-2-羰基-L-亮氨酸-2-氧代螺[吲哚啉-3，3'-吡咯烷]-2'，2'-d2-5'-甲酰胺(700毫克，1.26毫摩尔)加入到二氯甲烷(100毫升),接着在0度下加入伯吉斯试剂(1.20克，5.04毫摩尔)，接着室温搅拌16小时。
反应完毕，加水(100毫升)淬灭，二氯甲烷萃取(100毫升×3)，合并有机相，依次用水(200毫升)、饱和食盐水(100毫升)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩。所得残余物过反向柱(乙腈：水5：9到50：50)得到536毫克白色固体N-1-(3R，5'S)-5'-氰基-2-氧代螺[吲哚啉-3，3'-吡咯烷]-1'-基-2'，2'-d2)-4-甲基-1-氧代戊聚-2-基)-4，6，7-三氟-N-甲基-1H-吲哚-2-甲酰胺.(收率：79％)。LC-MS:[M-H]+＝538.
1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.53(s,1H),10.67(s,1H),7.17-7.03(m,3H),6.93-6.78(m,3H),5.32(dd,J＝9.3,5.5Hz,1H),5.17(dd,J＝8.8,6.7Hz,1H),3.18(s,3H),2.70-2.61(m,1H),2.52(d,J＝2.0Hz,1H),1.81-1.73(m,1H),1.72-1.61(m,1H),1.60-1.54(m,1H),0.93(dd,J＝15.1,6.5Hz,7H).
实施例11-12化合物11-12的制备
参照前述制备方法制备得到：
实施例13化合物13的制备
合成N-((S)-1-((3R,5'S)-5'-氰基-2-氧螺环[吲哚啉-3,3’-吡咯烷]-1'-基-6-d)-4-甲基-1-氧戊-2-基)-4,6,7-三氟-N-甲基-1H-吲哚-2-甲酰胺
步骤A：合成(S)-2-氨基-3-(6-溴-1H-吲哚-3-基)丙酸甲酯盐酸盐
室温下，L-6-溴色氨酸(5克，17.8毫摩尔)溶于甲醇(50毫升)中。在冰浴中搅拌10分钟后逐滴加入二氯亚砜(1.89毫升，26.65毫摩尔)，转至室温搅拌15分钟，然后加热至回流反应3小时。反应结束，浓缩至干，得到淡粉色固体产物(S)-2-氨基-3-(6-溴-1H-吲哚-3-基)丙酸甲酯盐酸盐(5.94克，17.8毫摩尔)，不做进一步的处理，直接用于下一步反应。LC-MS:[M+H]+＝297。
步骤B：合成(S)-7-溴-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶[3,4-b]吲哚-3-羧甲酯
室温下，将上一步合成的(S)-2-氨基-3-(6-溴-1H-吲哚-3-基)丙酸甲酯盐酸盐(5.94克，17.8毫摩尔)溶于甲醇(60毫升)中，加入多聚甲醛(2.08g，38.45毫摩尔)，室温搅拌10分钟后加热至回流温度，反应过夜。反应结束，浓缩至干，得到褐色固体产物(S)-7-溴-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶[3,4-b]吲哚-3-羧甲酯(6.71克，17.8毫摩尔)，不做进一步的处理，直接用于下一步反应。LC-MS:[M+H]+＝309。
步骤C:合成2-叔丁基-3-甲基-(S)-7-溴-1,3,4,9-四氢-2H-吡啶并[3,4-b]吲哚-2，3-二羧酸酯
室温下，将上一步合成的(S)-7-溴-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶[3,4-b]吲哚-3-羧甲酯(6.71克，17.8毫摩尔)溶于四氢 呋喃(70毫升)中，加入三乙胺(5.2毫升，37.38毫摩尔)和Boc2O(5.8毫升，24.74毫摩尔)，室温反应过夜。反应结束，降温至0-10℃，加入水50毫升，用1N盐酸溶液调反应液pH至5左右，二氯甲烷(75毫升×3)萃取，合并有机相并加入1N盐酸(75毫升)萃取，再用饱和盐水(100毫升)洗涤，所得有机相经无水硫酸钠干燥后减压浓缩至干，得到7.41克淡黄色产物2-叔丁基-3-甲基-(S)-7-溴-1,3,4,9-四氢-2H-吡啶并[3,4-b]吲哚-2，3-二羧酸酯，不做进一步的处理，直接用于下一步反应。。LC-MS:[M+H]+＝409。
步骤D:合成1'-(叔丁基)-5'-甲基-(3R,5'S)-6-溴-2-氧螺环[吲哚啉-3,3’-吡咯烷]-1',5'-二羧酸酯
室温下，将2-叔丁基-3-甲基-(S)-7-溴-1,3,4,9-四氢-2H-吡啶并[3,4-b]吲哚-2，3-二羧酸酯(7.41克)溶于四氢呋喃(75毫升)中，降温至0-5℃，加入乙酸(7.5克，124.6毫摩尔)，降温至-25℃，缓慢滴加NBS(3.32克，18.7毫摩尔)、THF(27毫升)、水(3.3毫升)溶液，加完反应2小时。反应结束，加入饱和碳酸钾溶液(80毫升)淬灭反应，加入乙酸乙酯(100毫升)，分液，水相加入乙酸乙酯(150毫升)萃取，合并有机相，有机相用水(150毫升)萃取，再用饱和盐水(150毫升)萃取。浓缩至干，1'-(叔丁基)-5'-甲基-(3R,5'S)-6-溴-2-氧螺环[吲哚啉-3,3’-吡咯烷]-1',5'-二羧酸酯粗产物(7.74克)，经过反相柱提纯得到4.56克纯品(收率：60％)。LC-MS:[M+H]+＝425。
步骤E:合成(3R,5'S)-6-溴-5'-氨甲酰基-2-氧螺环[吲哚啉-3,3’-吡咯烷]-1'-羧酸叔丁酯
室温下，1'-(叔丁基)-5'-甲基-(3R,5'S)-6-溴-2-氧螺环[吲哚啉-3,3’-吡咯烷]-1',5'-二羧酸酯(3.75克，8.84毫摩尔)溶于7M氨甲醇溶液(120毫升，840毫摩尔)中，50℃搅拌24h。反应结束，浓缩，加入二氯甲烷(20毫升)和甲基叔丁基醚(80毫升)，室温搅拌3小时，抽滤，得到3.03克橙褐色固体产物(3R,5'S)-6-溴-5'-氨甲酰基-2-氧螺环[吲哚啉-3,3’-吡咯烷]-1'-羧酸叔丁酯(收率85％)。LC-MS:[M-H]-＝408。
步骤F：合成(3R,5'S)-6-溴-2-氧螺环[吲哚啉-3,3'-吡咯]-5'-甲酰胺盐酸盐
室温下，将(3R,5'S)-6-溴-5'-氨甲酰基-2-氧螺环[吲哚啉-3,3’-吡咯烷]-1'-羧酸叔丁酯(2.53克，6.2毫摩尔)溶于二氯甲烷(25毫升)中，加入4M氯化氢的二氧六环溶液(8毫升，32.0毫摩尔)，室温搅拌2h。反应结束，浓缩至干，得2.37克褐色固体(3R,5'S)-6-溴-2-氧螺环[吲哚啉-3,3'-吡咯]-5'-甲酰胺盐酸盐(收率100％)。LC-MS:[M-H]-＝308。
步骤G：合成叔丁基((S)-1-((3R，5'S)-6-溴-5'-氨甲酰-2-氧螺环[吲哚啉-3,3'-吡咯烷]-1'-基)-4-甲基-1-氧戊-2-基)(甲基)氨基甲酸酯
室温下，将N-叔丁氧羰基-N-甲基-L-亮氨酸(1.22克，4.96毫摩尔，1.2当量)，2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(2.17克，5.7毫摩尔，1.38当量)溶于二氯甲烷(16毫升)和N,N-二甲基甲酰胺(8毫升)的溶液中，后加入N-甲基吗啡啉(1.82毫升，16.53毫摩尔)。搅拌20分钟后加入(3R,5'S)-6-溴-2-氧螺环[吲哚啉-3,3'-吡咯]-5'-甲酰胺盐酸盐(1.58克，4.13毫摩尔)，并于室温条件下继续反应4小时。
反应结束，于冰浴中加入饱和碳酸氢钠溶液(30毫升)淬灭反应，加入乙酸乙酯(50毫升)分液，有机相加入乙酸乙酯(100毫升)萃取，合并有机相，有机相1N盐酸溶液(70毫升)萃取，再用饱和盐水(70毫升)萃取。有机相经无水硫酸钠干燥、浓缩至干，所得残余物用硅胶柱层析纯化(洗脱剂：乙酸乙酯)，得2.26克白色固体叔丁基((S)-1-((3R，5'S)-6-溴-5'-氨甲酰-2-氧螺环[吲哚啉-3,3'-吡咯烷]-1'-基)-4-甲基-1-氧戊-2-基)(甲基)氨基甲酸酯(收率100％)。LC-MS:[M-H]-＝535。
步骤H：合成(3R,5'S)-6-溴-1'-(甲基-L-亮氨酰基)-2-氧螺环[吲哚啉-3,3’-吡咯烷]-5'-甲酰胺盐酸盐
室温下，将叔丁基叔丁基((S)-1-((3R，5'S)-6-溴-5'-氨甲酰-2-氧螺环[吲哚啉-3,3'-吡咯烷]-1'-基)-4-甲基-1-氧戊-2-基)(甲基)氨基甲酸酯(2.26克，4.22毫摩尔)溶于二氯甲烷(25毫升)中，加入4M氯化氢的二氧六环溶液(8毫升，32.0毫摩尔)，室温搅拌2h。反应结束，浓缩至干，得2.254克褐色固体(3R,5'S)-6-溴-1'-(甲基-L-亮氨酰基)-2-氧螺环[吲哚啉-3,3’-吡咯烷]-5'-甲酰胺盐酸盐(收率100％)。LC-MS:[M-H]-＝435。
步骤I：合成(3R,5'S)-6-溴-1'-(N-甲基-N-(4,6,7-三氟-1H-吲哚-2-羰基)-L-亮氨酰基)-2-氧螺环[吲哚啉-3,3’-吡咯烷]-5'-甲酰胺
室温下，将4,6,7-三氟1H-吲哚-2-羧酸(215毫克，1.5毫摩尔)，2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(570毫克，1.5毫摩尔)溶于二氯甲烷(30毫升)和N,N-二甲基甲酰胺(10毫升)的溶液中，后加入N-甲基吗啉(0.333毫升，3毫摩尔)。搅拌20分钟后加入(3R,5'S)-6-溴-1'-(甲基-L-亮氨酰基)-2-氧螺环[吲哚啉-3,3’-吡咯烷]-5'-甲酰胺盐酸盐(0.478克，1毫摩尔)，室温反应4h。反应结束，加入饱和碳酸氢钠溶液(50毫升)淬灭反应，二氯甲烷萃取(75毫升×3)，合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，所得残余物用硅胶柱层析纯化(洗脱剂：乙酸乙酯)，得到0.441克白色固体(3R,5'S)-6-溴-1'-(N-甲基-N-(4,6,7-三氟-1H-吲哚-2-羰基)-L-亮氨酰基)-2-氧螺环[吲哚啉-3,3’-吡咯烷]-5'-甲酰胺(收率70％)。LC-MS:[M-H]-＝632。
步骤J：合成(3R,5'S)-1'-(N-甲基-N-(4,6,7-三氟-1H-吲哚-2-羰基)-L-亮氨酰基)-2-氧螺环[吲哚啉-3,3’-吡咯烷]-6-d-5'-甲酰胺
室温下，将(3R,5'S)-6-溴-1'-(N-甲基-N-(4,6,7-三氟-1H-吲哚-2-羰基)-L-亮氨酰基)-2-氧螺环[吲哚啉-3,3’-吡咯烷]-5'-甲酰胺(348毫克，0.55毫摩尔)，[1,1'-双(二苯基膦)二茂铁]二氯化钯二氯甲烷络合物(90毫克，0.11毫摩尔)溶于四氢呋喃(36毫升)和重水(7.2毫升)的混合溶液中，随后加入四甲基乙二胺(25微升，0.165毫摩尔)。搅拌20分钟后，分批量加入硼氘化钠(115毫克，2.75毫摩尔)，室温搅拌6小时。
反应结束，在冰浴中加入冷水(50毫升)淬灭反应，二氯甲烷萃取(50毫升×3)，合并有机相，加入pH＝1的稀盐酸溶液(50毫升)萃取，饱和食盐水(75毫升)萃取，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，得318毫克黑色固体(3R,5'S)-1'-(N-甲基-N-(4,6,7-三氟-1H-吲哚-2-羰基)-L-亮氨酰基)-2-氧螺环[吲哚啉-3,3’-吡咯烷]-6-d-5'-甲酰胺，不做进一步的处理， 直接用于下一步反应。LC-MS:[M-H]-＝555。
步骤K:合成N-((S)-1-((3R,5'S)-5'-氰基-2-氧螺环[吲哚啉-3,3’-吡咯烷]-1'-基-6-d)-4-甲基-1-氧戊-2-基)-4,6,7-三氟-N-甲基-1H-吲哚-2-甲酰胺
室温下，将(3R,5'S)-1'-(N-甲基-N-(4,6,7-三氟-1H-吲哚-2-羰基)-L-亮氨酰基)-2-氧螺环[吲哚啉-3,3’-吡咯烷]-6-d-5'-甲酰胺(318毫克，0.578毫摩尔)溶于二氯甲烷(10毫升)中，加入伯吉斯试剂(683毫克，2.86毫摩尔)，室温搅拌4小时。反应结束，加入饱和碳酸氢钠溶液(15毫升)淬灭反应，二氯甲烷(50毫升×3)萃取，合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，所得残余物用硅胶柱层析纯化(洗脱剂：乙酸乙酯)，得到200毫克浅黄色固体产物，经制备纯化白色固体40毫克N-((S)-1-((3R,5'S)-5'-氰基-2-氧螺环[吲哚啉-3,3’-吡咯烷]-1'-基-6-d)-4-甲基-1-氧戊-2-基)-4,6,7-三氟-N-甲基-1H-吲哚-2-甲酰胺。LC-MS:[M-H]-＝537。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.53(s,1H),10.67(s,1H),7.10(dd,J＝16.3,6.1Hz,2H),6.88-6.78(m,3H),5.33(t,J＝7.4Hz,1H),5.18(t,J＝7.7Hz,1H),3.93-3.79(m,2H),3.18(d,J＝5.4Hz,3H),2.66(dd,J＝13.4,8.8Hz,1H),2.48(d,J＝6.5Hz,1H),1.72(dt,J＝33.7,7.1Hz,2H),1.61-1.53(m,1H),0.94(dd,J＝15.2,6.5Hz,6H).19F NMR(376MHz,DMSO-d6)δ-122.82(d,J＝19.7Hz),-143.69(d,J＝20.6Hz),-161.79(t,J＝20.1Hz).
实施例14-17化合物14-17的制备
参照前述制备方法制备得到：
实施例18化合物18的制备
合成N-((S)-1-((3R，5'S)-5'-氰基-2-氧螺环[吲哚-3,3'-吡咯烷]-1'-基)-4-(甲基-d3)-1-氧代戊基-2-基-4,5,5,5-d4)-4,6,7-三氟-N-甲基-1H-吲哚-2-甲酰胺
步骤A：合成N-甲基-((S)-1-((3R,5'S)-5'-氨甲酰-2-氧螺环[吲哚-3,3'-吡咯烷]-1'-基)-4-(甲基-d3)-1-氧代戊基-2-基-4,5,5,5-d4)氨基甲酸酯盐酸盐
向反应瓶中加入N-甲基-叔丁基-((S-1-((3R，5'S)-5'-氨甲酰-2-氧螺环[吲哚-3,3'-吡咯烷]-1'-基)-4-(甲基-d3)-1-氧代戊基-2-基-4,5,5,5-d4)氨基甲酸酯(260mg，0.56mmol),用DCM(3mL)溶解，室温下加入HCl/dioxane溶液(5mL)， 搅拌反应3h。反应完成后，旋干溶剂，得到产品N-甲基-((S)-1-((3R,5'S)-5'-氨甲酰-2-氧螺环[吲哚-3,3'-吡咯烷]-1'-基)-4-(甲基-d3)-1-氧代戊基-2-基-4,5,5,5-d4)氨基甲酸酯盐酸盐(收率：100％)，直接用于下一步反应。LC-MS:[M-H]-＝364.3。
步骤B：合成N-甲基-1-(3R，5'S)-5'-甲酰氨基-2-氧螺环[吲哚啉-3，3'-吡咯烷]-1'-基)-4-(甲基-d3)-1-氧代戊基-2-基-4，5，5，5-d4)-4，6，7-三氟-1H-吲哚-2-甲酰胺
室温下，将4,6,7-三氟吲哚甲酸(0.144g,0.67mmol)溶于DMF(5mL)中，加入DIPEA(0.36g,2.79mmol)和HATU(0.32g,0.84mmol)，室温搅拌30min，再加入至上一步所的产物N-甲基-((S)-1-((3R,5'S)-5'-氨甲酰-2-氧螺环[吲哚-3,3'-吡咯烷]-1'-基)-4-(甲基-d3)-1-氧代戊基-2-基-4,5,5,5-d4)氨基甲酸酯盐酸盐中，搅拌反应3h。
反应结束后，向反应瓶中加入DCM(50mL)稀释，再用水洗涤2次(50mL*4)，有机相用无水硫酸钠干燥后过滤旋干，得到粗产物，经反向柱纯化得到112毫克淡黄色固体N-甲基-1-(3R，5'S)-5'-甲酰氨基-2-氧螺环[吲哚啉-3，3'-吡咯烷]-1'-基)-4-(甲基-d3)-1-氧代戊基-2-基-4，5，5，5-d4)-4，6，7-三氟-1H-吲哚-2-甲酰胺(收率：35.7％)。LC-MS:[M-H]-＝561.3
步骤C:合成N-((S)-1-((3R，5'S)-5'-氰基-2-氧螺环[吲哚-3,3'-吡咯烷]-1'-基)-4-(甲基-d3)-1-氧代戊基-2-基-4,5,5,5-d4)-4,6,7-三氟-N-甲基-1H-吲哚-2-甲酰胺
室温下，将N-甲基-1-(3R，5'S)-5'-甲酰氨基-2-氧螺环[吲哚啉-3，3'-吡咯烷]-1'-基)-4-(甲基-d3)-1-氧代戊基-2-基-4，5，5，5-d4)-4，6，7-三氟-1H-吲哚-2-甲酰胺(0.112g,0.2mmol)溶解于DCM(10mL)中，加入伯吉斯试剂(0.142g,0.59mmol)，加毕，室温下搅拌反应5h。反应完全后，旋干溶剂，过反向柱纯化，得到27mg白色固体产物N-((S)-1-((3R，5'S)-5'-氰基-2-氧螺环[吲哚-3,3'-吡咯烷]-1'-基)-4-(甲基-d3)-1-氧代戊基-2-基-4,5,5,5-d4)-4,6,7-三氟-N-甲基-1H-吲哚-2-甲酰胺(收率：24.7％)。LC-MS:[M-H]-＝543.2。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ9.47(s,1H),8.65(s,1H),7.05(td,J＝9.3,8.8,4.8Hz,1H),6.93-6.81(m,2H),6.80-6.63(m,3H),5.41(dd,J＝9.5,5.9Hz,1H),5.02(t,J＝8.6Hz,1H),4.43(d,J＝10.4Hz,1H),3.96(d,J＝10.5Hz,1H),3.47(s,3H),2.86(dd,J＝13.2,8.8Hz,1H),2.52(dd,J＝13.2,8.3Hz,1H),2.03(s,1H),1.93(dd,J＝14.2,9.5Hz,1H).
实施例19化合物19的制备
步骤A：合成N-氘代甲基-Boc-L-亮氨酸-d7
室温下，氢化钠(1.68克，41.96毫摩尔，60％)悬浮在30毫升四氢呋喃中，氮气置换三次，然后降温到0℃，随后将Boc-L-亮氨酸-d7(2.0克，8.39毫摩尔)溶于四氢呋喃(10毫升)的溶液缓慢注射到悬浮有氢化钠的四氢呋喃溶液中，加毕，25℃搅拌1小时，最后将氘代碘甲烷(6.08克，41.96毫摩尔)在0℃下注射至混合液中，该反应升至25℃后再搅拌15小时。
反应结束，用甲叔醚20毫升萃取，留下的水相用1M的盐酸水溶液调节pH到2.0，然后用乙酸乙酯(20毫升×6)萃取。合并有机相，再用饱和盐水(60毫升)洗涤，干燥，过滤减压浓缩至干，不做进一步的处理，得到1.5克N-氘代甲基-Boc-L-亮氨酸-d7。LC-MS:[M+H]+＝256。
步骤B：合成N-(甲基-d3)-1-(3R，5'S)-5'-甲酰氨基-2-氧螺环[吲哚啉-3，3'-吡咯烷]-1'-基)-4-(甲基-d3)-1-氧代戊基-2-基-4，5，5，5-d4)-4，6，7-三氟-1H-吲哚-2-甲酰胺
室温下，将N-氘代甲基-Boc-L-亮氨酸-d7(750mg，2.94毫摩尔)，N-甲基吗啡啉(743mg，7.34毫摩尔)和2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(1.12克，2.94毫摩尔)混合在二氯甲烷(30毫升)中，室温反应半个小时后，将2-氧螺环[吲哚啉-3，3'-吡咯烷]-5'-甲酰胺盐酸盐(655mg，2.45毫摩尔)溶于N,N-二甲基甲酰胺(6毫升)的溶液加入到以上混合液中，室温25摄氏度下再反应1.5小时。
反应结束，加入饱和氯化铵(60ml)，用二氯甲烷(20毫升×3)萃取。合并有机相，再用饱和盐水(60毫升)洗涤，干燥，过滤减压浓缩至干得到残余。残余物通过正相柱(正己烷/乙酸乙酯＝1：5)纯化得到550毫克白色产物叔丁基(S)-1-(3R，5'S)-5'-氨基甲酰基-2-氧螺环[吲哚啉-3，3'-吡咯烷]-1'-基)-4-(甲基-d3)-1-氧代戊基-2-基-4，5，5，5-d4)(甲基-d3)氨基甲酸酯(收率48％)。LC-MS:[M-H]-＝467
步骤C:合成N-(甲基-d3)-((S)--1-(3R，5'S)-5'-氨甲酰-2-氧螺环[吲哚啉-3，3'-吡咯烷]-1'-基)-4-(甲基-d3)-1-氧代戊基-2-基-4，5，5，5-d4)氨基甲酸酯盐酸盐
室温下，叔丁基(S)-1-(3R，5'S)-5'-氨基甲酰基-2-氧螺环[吲哚啉-3，3'-吡咯烷]-1'-基)-4-(甲基-d3)-1-氧代戊基-2-基-4，5，5，5-d4)(甲基-d3)氨基甲酸酯(550毫克，1.17毫摩尔)溶于盐酸/乙酸乙酯(2M，20毫升)中，室温反应2小时。反应结束，浓缩至干，得到类白色固体产物460毫克N-(甲基-d3)-((S)-1-(3R，5'S)-5'-氨甲酰-2-氧螺环[吲哚啉-3，3'-吡咯烷]-1'-基)-4-(甲基-d3)-1-氧代戊基-2-基-4，5，5，5-d4)氨基甲酸酯盐酸盐，不做进一步的处理，直接用于下一步反应。LC-MS:[M+H]+＝369。
步骤D:合成N-1-(3R，5'S)-5'-甲酰氨基-2-氧代螺[吲哚啉-3，3'-吡咯烷]-1'-基)-4-(甲基-d3)-1-氧代戊基-2-基-4，5，5，5-d4)-4，6，7-三氟-N-(甲基-d3)-1H-吲哚-2-甲酰胺
室温下，将4，6，7-三氟吲哚-2-羧酸(150mg，697微摩尔)，N-甲基吗啡啉(176mg，1.74毫摩尔)和2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(265克，697微摩尔)混合在二氯甲烷(20毫升)中，室温反应半个小时后，将N-(甲基-d3)-((S)--1-(3R，5'S)-5'-氨甲酰-2-氧代螺[吲哚啉-3，3'-吡咯烷]-1'-基)-4-(甲基-d3)-1-氧代戊基-2-基-4，5，5，5-d4)氨基甲酸酯盐酸盐(235mg，581微摩尔)溶于N,N-二甲基甲酰胺(4毫升)的溶液加入到以上混合液中，室温25摄氏度下反应1.5小时。
反应结束，加入饱和氯化铵(60ml)，用二氯甲烷(20毫升×3)萃取。合并有机相，再用饱和盐水(60毫升)洗涤，干燥，过滤减压浓缩至干得到残余。残余物通过正相柱(正己烷/乙酸乙酯＝1：5)纯化得到180毫克白色产物N-(甲基-d3)-1-(3R，5'S)-5'-甲酰氨基-2-氧螺环[吲哚啉-3，3'-吡咯烷]-1'-基)-4-(甲基-d3)-1-氧代戊基-2-基-4，5，5，5-d4)-4，6，7-三氟-1H-吲哚-2-甲酰胺(收率55％)。LC-MS:[M-H]-＝564。
步骤E:合成N-((S)-1-((3R，5'S)-5'-氰基-2-氧螺环[吲哚啉-3,3'-吡咯烷]-1'-基)-4-(甲基-d3)-1-氧戊烯-2-基-4,5,5,5-d4)-4,6,7-三氟-N-(甲基-d3)-1H-吲哚-2-甲酰胺
室温下，将N-(甲基-d3)-1-(3R，5'S)-5'-甲酰氨基-2-氧螺环[吲哚啉-3，3'-吡咯烷]-1'-基)-4-(甲基-d3)-1-氧代戊基-2-基-4，5，5，5-d4)-4，6，7-三氟-1H-吲哚-2-甲酰胺(180毫克，318微摩尔)溶于二氯甲烷(15毫升)中，随后缓慢加入伯吉斯试剂(379毫克，1.59毫摩尔)。该反应搅拌2小时。反应结束，加入饱和氯化铵(60ml)，用二氯甲烷(20毫升×3)萃取。合并有机相，再用饱和盐水(60毫升)洗涤，干燥，过滤减压浓缩至干得到残余。残余物通过反相柱(水/乙腈＝3：7)纯化得到117毫克白色产物N-((S)-1-((3R，5'S)-5'-氰基-2-氧螺环[吲哚啉-3,3'-吡咯烷]-1'-基)-4-(甲基-d3)-1-氧戊烯-2-基-4,5,5,5-d4)-4,6,7-三氟-N-(甲基-d3)-1H-吲哚-2-甲酰胺(收率67％)。LC-MS:[M+H]+＝548。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.54(s,1H),10.69(s,1H),7.16-7.03(m,3H),6.83(d,J＝12.6Hz,3H),5.32(s,1H),5.17(d,J＝9.6Hz,1H),3.86(s,2H),2.65(d,J＝10.7Hz,1H),1.84-1.53(m,3H).
实施例20-31化合物20-31的制备
参照前述制备方法制备得到：

实施例32
合成N-(S)-1-(3R，5'S)-5'-氰基-2-氧代螺[吲哚啉-3，3'-吡咯烷]-1'-基-2'，2'-d2)-4-(甲基-d3)-1-氧代戊基-2-基-4，5，5，5-d4)-4，6，7-三氟-N-(甲基-d3)-1H-吲哚-2-甲酰胺
合成路线
步骤A：合成(3R，5'S)-2-氧螺环[吲哚啉-3，3'-吡咯烷]-2'，2'-d2-5'-甲酰胺盐酸盐
室温下，叔丁基(3R，5'S)-5'-氨基甲酰基-2-氧螺环[吲哚啉-3，3'-吡咯烷]-1'-羧酸酯-2'，2'-d2(1.0克，3.00毫摩尔)溶于盐酸/乙酸乙酯(2M，20毫升)中，室温反应2小时。
反应结束，浓缩至干，得到类白色固体产物800毫克(3R，5'S)-2-氧螺环[吲哚啉-3，3'-吡咯烷]-2'，2'-d2-5'-甲酰胺盐酸盐，不做进一步的处理，直接用于下一步反应。LC-MS:[M+H]+＝234。
步骤B：叔丁基(S)-1-(3R，5'S)-5'-氨基甲酰基-2-氧螺环[吲哚啉-3，3'-吡咯烷]-1'-基-2'，2'-d2)-4-(甲基-d3)-1-氧代戊基-2-基-4，5，5，5-d4)(甲基-d4)氨基甲酸酯
室温下，将N-叔丁氧羰基-N-甲基-L-亮氨酸-异丙基-D7(750mg，2.94毫摩尔)，N-甲基吗啡啉(742mg，7.34毫摩尔)和2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(1.12克，2.94毫摩尔)混合在二氯甲烷(30毫升)中，室温反应半个小时后，将(3R，5'S)-2-氧螺环[吲哚啉-3，3'-吡咯烷]-2'，2'-d2-5'-甲酰胺盐酸盐(660mg，2.45毫摩尔)溶于N,N-二甲基甲酰胺(6毫升)的溶液加入到以上混合液中，室温25摄氏度下再反应1.5小时。
反应结束，加入饱和氯化铵(60ml)，用二氯甲烷(20毫升×3)萃取。合并有机相，再用饱和盐水(60毫升)洗涤，干燥，过滤减压浓缩至干得到残余。残余物通过正相柱(正己烷/乙酸乙酯＝1：5)纯化得到580毫克白色产物叔丁基(S)-1-(3R，5'S)-5'-氨基甲酰基-2-氧螺环[吲哚啉-3，3'-吡咯烷]-1'-基-2'，2'-d2)-4-(甲基-d3)-1-氧代戊基-2-基-4，5，5，5-d4)(甲基-d4)氨基甲酸酯(收率50％)。LC-MS:[M-H]-＝469
步骤C:合成N-(甲基-d3)-((S)--1-(3R，5'S)-5'-氨甲酰-2-氧螺环[吲哚啉-3，3'-吡咯烷]-1'-基-2'，2'-d2)-4-(甲基-d3)-1-氧代戊基-2-基-4，5，5，5-d4)氨基甲酸酯盐酸盐
室温下，叔丁基(S)-1-(3R，5'S)-5'-氨基甲酰基-2-氧螺环[吲哚啉-3，3'-吡咯烷]-1'-基-2'，2'-d2)-4-(甲基-d3)-1-氧代戊基-2-基-4，5，5，5-d4)(甲基-d4)氨基甲酸酯(580毫克，1.23毫摩尔)溶于盐酸/乙酸乙酯(2M，20毫升)中，室温反应2小时。
反应结束，浓缩至干，得到类白色固体产物440毫克N-(甲基-d3)-((S)--1-(3R，5'S)-5'-氨甲酰-2-氧螺环[吲哚啉-3，3'-吡咯烷]-1'-基-2'，2'-d2)-4-(甲基-d3)-1-氧代戊基-2-基-4，5，5，5-d4)氨基甲酸酯盐酸盐，不做进一步的处理，直接用于下一步反应。LC-MS:[M-H]-＝369。
步骤D:合成N-(S)1-(3R，5'S)-5'-甲酰氨基-2-氧螺环[吲哚啉-3，3'-吡咯烷]-1'-基-2'，2'-d2)-4-(甲基-d3)-1-氧代戊基-2-基-4，5，5，5-d4)-4，6，7-三氟-N-(甲基-d3)-1H-吲哚-2-甲酰胺
室温下，将4，6，7-三氟吲哚-2-羧酸(300mg，1.39毫摩尔)，N-甲基吗啡啉(423mg，4.18毫摩尔)和2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(530克，1.39毫摩尔)混合在二氯甲烷(30毫升)中，室温反应半个小时后，将叔丁基(S)-1-(3R，5'S)-5'-氨基甲酰基-2-氧螺环[吲哚啉-3，3'-吡咯烷]-1'-基-2'，2'-d2)-4-(甲基-d3)-1-氧代戊基-2-基-4，5，5，5-d4)(甲基-d4)氨基甲酸酯(420mg，1.03毫摩尔)溶于N,N-二甲基甲酰胺(6毫升)的溶液加入到以上混合液中，室温25摄氏度下再反应1.5小时。
反应结束，加入饱和氯化铵(60ml)，用二氯甲烷(20毫升×3)萃取。合并有机相，再用饱和盐水(60毫升)洗涤，干燥，过滤减压浓缩至干得到残余。残余物通过正相柱(正己烷/乙酸乙酯＝1：5)纯化得到380毫克白色产物N-(S)1-(3R，5'S)-5'-甲酰氨基-2-氧螺环[吲哚啉-3，3'-吡咯烷]-1'-基-2'，2'-d2)-4-(甲基-d3)-1-氧代戊基-2-基-4，5，5，5-d4)-4，6，7-三氟-N-(甲基-d3)-1H-吲哚-2-甲酰胺(收率49％)。LC-MS:[M-H]-＝566。
步骤E:合成N-(S)-1-(3R，5'S)-5'-氰基-2-氧代螺[吲哚啉-3，3'-吡咯烷]-1'-基-2'，2'-d2)-4-(甲基-d3)-1-氧代戊基-2-基-4，5，5，5-d4)-4，6，7-三氟-N-(甲基-d3)-1H-吲哚-2-甲酰胺
室温下，将N-(S)1-(3R，5'S)-5'-甲酰氨基-2-氧螺环[吲哚啉-3，3'-吡咯烷]-1'-基-2'，2'-d2)-4-(甲基-d3)-1-氧代戊基-2-基-4，5，5，5-d4)-4，6，7-三氟-N-(甲基-d3)-1H-吲哚-2-甲酰胺(380毫克，669微摩尔)溶于二氯甲烷(20毫升)中，随后缓慢加入伯吉斯试剂(798毫克，3.35毫摩尔)。该反应搅拌2小时。
反应结束，加入饱和氯化铵(60ml)，用二氯甲烷(20毫升×3)萃取。合并有机相，再用饱和盐水(60毫升)洗涤，干燥，过滤减压浓缩至干得到残余。残余物通过反相柱(水/乙腈＝3：7)纯化得到226毫克白色产物N-(S)-1-(3R，5'S)-5'-氰基-2-氧螺环[吲哚啉-3，3'-吡咯烷]-1'-基-2'，2'-d2)-4-(甲基-d3)-1-氧代戊基-2-基-4，5，5，5-d4)-4，6，7-三氟-N-(甲基-d3)-1H-吲哚-2-甲酰胺(收率62％)。LC-MS:[M-H]-＝548。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.52(s,1H),10.67(s,1H),7.09(t,J＝10.1Hz,3H),6.83(dd,J＝12.3,5.0Hz,3H),5.34(d,J＝17.9Hz,1H),5.17(t,J＝7.9Hz,1H),2.65(d,J＝14.2Hz,2H),1.76(t,J＝11.8Hz,1H),1.70-1.61(m,1H)。
实施例33
合成N-((S)-1-(3R，5'S)-5'-氰基-2-氧螺环[吲哚啉-3，3'-吡咯烷]-1'-基-2'，2'-d2)-4-甲基-1-氧代戊基-2-基)-4，6，7-三氟-N-甲基-d3)-1H-吲哚-2-甲酰胺
步骤A：合成叔丁基((S)-1-(3R，5'S)-5'-氨基甲酰基-2-氧螺环[吲哚啉-3，3'-吡咯烷]-1'-基-2'，2'-d2)-4-甲基-1-氧代戊基-2-基)(甲基-d3)氨基甲酸酯
室温下把N-叔丁氧羰基-N-甲基-D3-亮氨酸(841毫克，3.43毫摩尔)加入到二氯甲烷/DMF中(20毫升，4V：1V),接着在0度下缓慢加入吗啡啉(1.4克，13.7毫摩尔)，HATU(1.44g,3.77毫摩尔)加入，接着室温搅拌5分钟；接着0℃下加入(3R,5'S)-2-氧螺环[吲哚啉-3，3'-吡咯烷]-2'，2'-d2-5'-甲酰胺(800毫克，3.43毫摩尔)，室温下搅拌12小时。
反应完毕，加水(100毫升)淬灭，二氯甲烷萃取(100毫升×3)，合并有机相，依次用水(200毫升)、饱和食盐水(100毫升)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩。所得残余物过反向柱(乙腈：水5：9到50：50)得到1.3克白色固体叔丁基((S)-1-(3R，5'S)-5'-氨基甲酰基-2-氧螺环[吲哚啉-3，3'-吡咯烷]-1'-基-2'，2'-d2)-4-甲基-1-氧代戊基-2-基)(甲基-d3)氨基甲酸酯(收率：77.9％)。LC-MS:[M-H]-＝462
步骤B：合成(3R，5'S)-1'-(甲基-d3)-L-亮氨酰基-2-氧螺环[吲哚啉-3，3'-吡咯烷]-2'，2'-d2-5'-甲酰胺
把叔叔丁基((S)-1-(3R，5'S)-5'-氨基甲酰基-2-氧螺环[吲哚啉-3，3'-吡咯烷]-1'-基-2'，2'-d2)-4-甲基-1-氧代戊基-2-基)(甲基-d3)氨基甲酸酯(650毫克，1.4毫摩尔)加入到盐酸二氧六环(4摩尔，20毫升)中,室温下反应2小时。
反应完毕，直接旋干得到500毫克粗品(3R，5'S)-1'-(甲基-d3)-L-亮氨酰基-2-氧螺环[吲哚啉-3，3'-吡咯烷]-2'，2'-d2-5'-甲酰胺，直接用于下一步。LC-MS:[M-H]-＝362。
步骤C：合成(3R，5'S)-1'-(N-(甲基-d3)-N-(4,6,7-三氟-1H-吲哚-2-羰基)-L-亮氨酰基)-2-氧螺环[吲哚啉-3,3'-吡咯烷]-2'，2'-d2-5'-甲酰胺
室温下把4，6，7-三氟吲哚-2-羧酸(417毫克，1.94毫摩尔)加入到二氯甲烷/DMF中(20毫升),接着在0度下缓慢加入吗啡啉(784毫克，7.74毫摩尔)，HATU(738毫克,1.94毫摩尔)加入，接着室温搅拌5分钟；接着0度下加入(3R，5'S)-1'-(甲基-d3)-L-亮氨酰基-2-氧螺环[吲哚啉-3，3'-吡咯烷]-2'，2'-d2-5'-甲酰胺(470毫克，1.29毫摩尔)，室温下搅拌12小时。反应完毕，加水(100毫升)淬灭，二氯甲烷萃取(100毫升×3)，合并有机相，依次用水(200毫升)、饱和食盐水(100毫升)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩。所得残余物过反向柱(乙腈：水5：9到50：50)得到600毫克白色固体(3R，5'S)-1'-(N-(甲基-d3)-N-(4,6,7-三氟-1H-吲哚-2-羰基)-L-亮氨酰基)-2-氧螺环[吲哚啉-3,3'-吡咯烷]-2'，2'-d2-5'-甲酰胺(收率：82.8％)。LC-MS:[M-H]-＝559.
步骤D：N-((S)-1-(3R，5'S)-5'-氰基-2-氧螺环[吲哚啉-3，3'-吡咯烷]-1'-基-2'，2'-d2)-4-甲基-1-氧代戊基-2-基)-4，6，7-三氟-N-(甲基-d3)-1H-吲哚-2-甲酰胺
室温下把(3R，5'S)-1'-(N-(甲基-d3)-N-(4,6,7-三氟-1H-吲哚-2-羰基)-L-亮氨酰基)-2-氧螺环[吲哚啉-3,3'-吡咯烷]-2'，2'-d2-5'-甲酰胺(600毫克，1.07毫摩尔)加入到二氯甲烷(100毫升),接着在0度下加入伯吉斯试剂(1.02克，4.28毫摩尔)，接着室温搅拌16小时。反应完毕，加水(100毫升)淬灭，二氯甲烷萃取(100毫升×3)，合并有机相，依次用水(200毫升)、饱和食盐水(100毫升)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩。所得残余物过反向柱(乙腈：水5：9到50：50)得到380毫克白色固体N-((S)-1-(3R，5'S)-5'-氰基-2-氧螺环[吲哚啉-3，3'-吡咯烷]-1'-基-2'，2'-d2)-4-甲基-1-氧代戊基-2-基)-4，6，7-三氟-N-(甲基-d3)-1H-吲哚-2-甲酰胺.(收率：65.5％)。LC-MS:[M-H]-＝541.
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.53(s,1H),10.68(s,1H),7.18-7.05(m,3H),6.84(dt,J＝11.7,5.7Hz,3H),5.33(dd,J＝9.3,5.5Hz,1H),5.18(dd,J＝8.7,6.7Hz,1H),2.73-2.64(m,1H),2.48(s,1H),1.78(ddd,J＝14.2,9.5,5.1Hz,1H),1.68(dt,J＝13.9,6.6Hz,1H),1.58(d,J＝8.0Hz,1H),0.94(dd,J＝15.3,6.5Hz,6H).
实施例34
合成N-((S)-1-((3R,5S)-5'-氰基-2-氧螺环[吲哚啉-3,3'-吡咯烷]-1'-基-5-d)-4-甲基-1-氧代戊基-2-基)-4,6,7-三氟-N-甲基-1H-吲哚-2-甲酰胺-3-d
步骤A：(3R,5')-1'-(N-甲基-N-(4,6,7-三氟-1H-吲哚-2-羰基-3-d)-L-亮氨酰基)-2-氧螺环[吲哚啉-3,3'-吡咯烷]-5-d-5'-甲酰胺
室温下，将4,6,7-三氟-1H-吲哚-2-羧酸-3-d(160毫克，0.711毫摩尔)，溶于DMF(5毫升)中，0℃下搅拌，加入HATU(314.8毫克,0.828毫摩尔),DIPEA(445.7毫克，3.45毫摩尔)，然后0℃下搅拌10min，加入(3R,5'S)-1'-(甲基-L-亮氨酰基)-2-氧螺环[吲哚啉-3,3'-吡咯烷]-5-d-5'-甲酰胺盐酸盐(300毫克，0.69毫摩尔)的DMF溶液(5毫升)，加完后转移至室温反应1h。
反应结束，加入水(20ml)，用二氯甲烷(20毫升×4)萃取。合并有机相，减压浓缩，残余物通过反向柱纯化得到220毫克白色产物(3R,5')-1'-(N-甲基-N-(4,6,7-三氟-1H-吲哚-2-羰基-3-d)-L-亮氨酰基)-2-氧螺环[吲哚啉-3,3'-吡咯烷]-5-d-5'-甲酰胺(收率57.3％)。LC-MS:[M-H]-＝556
步骤B:合成N-((S)-1-((3R,5S)-5'-氰基-2-氧螺环[吲哚啉-3,3'-吡咯烷]-1'-基-5-d)-4-甲基-1-氧代戊基-2-基)-4,6,7-三氟-N-甲基-1H-吲哚-2-甲酰胺-3-d
室温下，将(3R,5')-1'-(N-甲基-N-(4,6,7-三氟-1H-吲哚-2-羰基-3-d)-L-亮氨酰基)-2-氧螺环[吲哚啉-3,3'-吡咯烷]-5-d-5'-甲酰胺(220毫克，0.394毫摩尔)溶于DCM(30毫升)中，室温反应5小时。
反应结束，加入水(20ml)，用二氯甲烷(20毫升×4)萃取。合并有机相，减压浓缩，残余物通过反向柱纯化得到160毫克白色产物N-((S)-1-((3R,5S)-5'-氰基-2-氧螺环[吲哚啉-3,3'-吡咯烷]-1'-基-5-d)-4-甲基-1-氧代戊基-2-基)-4,6,7-三氟-N-甲基-1H-吲哚-2-甲酰胺-3-d(收率75.3％)。LC-MS:[M-H]-＝538。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.54(s,1H),10.69(s,1H),7.16-7.08(m,3H),6.83(d,J＝8.0Hz,1H),5.33(dd,J＝9.6,5.5Hz,1H),5.18(t,J＝7.6Hz,1H),3.87(t,J＝7.2Hz,2H),3.20(s,3H),2.70-2.64(m,1H),2.47-2.32(m,1H),1.82-1.74(m,1H),1.71-1.68(m,1H),1.62-1.50(m,1H),0.94(dd,J＝15.2,6.5Hz,6H).
实施例35
合成N-((S)-1-((3R,5'S)-5'-氰基-2-氧螺环[吲哚啉-3,3'-吡咯烷]-1'-基-5-d)-4-甲基-1-氧代戊基-2-基)-4,6,7-三氟-N-甲基-1H-吲哚-2-羧酰胺-3,5-d2
合成路线:
步骤A：合成4,6,7-三氟-3,5-二碘-1H-吲哚-2-羧酸
将4,6,7-三氟吲哚甲酸(0.50克，2.32毫摩尔)溶于乙醇(15毫升)中，加入碘(0.59克，2.32毫摩尔)、高碘酸钠(0.25克，1.16毫摩尔)、硫酸(0.25毫升，4.65毫摩尔)，升温至70摄氏度下反应11小时。
反应完毕，冷却至室温，将反应液滴入30毫升饱和硫代硫酸钠溶液中，析出褐色粘稠物，抽滤，滤饼硅胶柱层析(DCM/MT＝20/1 TO 10/1)得到0.25克4,6,7-三氟-3,5-二碘-1H-吲哚-2-羧酸(收率：22.9％)。LC-MS:[M-H]-＝465。
步骤B：合成4,6,7-三氟-1H-吲哚-2-羧酸-3,5-d2酸
将4,6,7-三氟-3,5-二碘-1H-吲哚-2-羧酸(0.10克，0.214毫摩尔)溶于THF(10毫升)和重水(2毫升)中，减压蒸干。加入THF(10毫升)和重水(2毫升)，随后依次加入PdCl2(dppf)(31毫克，0.0428毫摩尔)，四甲基乙二胺(10毫克，0.086毫摩尔)，搅拌10min后，分批加入硼氘化钠(54毫克，1.29毫摩尔)，室温反应1小时。
反应完毕，将反应液中加入20ml水，EA(20毫升)萃取，弃掉有机相，用2M盐酸调节pH到2-3，EA(3*20毫升)萃取，无水硫酸钠干燥，减压蒸干溶剂，硅胶柱层析(DCM/MeOH＝20/1 to 10/1)，得到46毫克灰色固体4,6,7-三氟-1H-吲哚-2-羧酸-3,5-d2酸(收率：99％)。LC-MS:[M-H]-＝216。
步骤C：合成(3R,5'S)-1'-(N-甲基-N-(4,6,7-三氟-1H-吲哚-2-羰基-3,5-d2)-L-亮氨酰基)-2-氧螺环[吲哚啉-3,3'-吡咯烷]-5-d-5'-甲酰胺
室温下，4,6,7-三氟-1H-吲哚-2-羧酸-3,5-d2-酸(66毫克，0.303毫摩尔)溶于DMF(5毫升)中，加入(3R,5'S)-1'-(甲基-L-亮氨酰基)-2-氧螺环[吲哚啉-3,3'-吡咯烷]-5-d-5'-甲酰胺盐酸盐(100毫克，0.252毫摩尔)、HATU(144毫克，0.379毫摩尔)、DIPEA(0.132毫升，0.758毫摩尔)，氮气保护，室温下反应3小时。
反应完毕，10毫升饱和碳酸氢钠溶液淬灭乙酸乙酯(20毫升×3)萃取，合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，所得残余物反相C18柱分离(水→乙腈)得到32毫克淡黄色固体(3R,5'S)-1'-(N-甲基-N-(4,6,7-三氟-1H-吲哚-2-羰基-3,5-d2)-L-亮氨酰基)-2-氧螺环[吲哚啉-3,3'-吡咯烷]-5-d-5'-甲酰胺(收率：22.7％)。LC-MS:[M-H]-＝557。
步骤D：合成N-((S)-1-((3R,5'S)-5'-氰基-2-氧螺环[吲哚啉-3,3'-吡咯烷]-1'-基-5-d)-4-甲基-1-氧代戊基-2-基)-4,6,7-三氟-N-甲基-1H-吲哚-2-羧酰胺-3,5-d2
室温下，(3R,5'S)-1'-(N-甲基-N-(4,6,7-三氟-1H-吲哚-2-羰基-3,5-d2)-L-亮氨酰基)-2-氧螺环[吲哚啉-3,3'-吡咯烷]-5-d-5'-甲酰胺(32毫克，0.057毫摩尔)溶于DCM(3毫升)中，加入伯吉斯试剂(40毫克，0.171毫摩尔)室温反应3 小时。
反应完毕，加入5毫升水，DCM(2*20毫升)萃取，合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸干溶剂，硅胶柱层析(PE/EA＝4/1to 1/1)得到19毫克白色固体N-((S)-1-((3R,5'S)-5'-氰基-2-氧螺环[吲哚啉-3,3'-吡咯烷]-1'-基-5-d)-4-甲基-1-氧代戊基-2-基)-4,6,7-三氟-N-甲基-1H-吲哚-2-羧酰胺-3,5-d2(收率：48％)。LC-MS:[M-H]-＝539。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.53(s,1H),10.69(s,1H),7.13-7.00(m,2H),6.83(d,J＝8.0Hz,1H),5.32(dd,J＝9.4,5.4Hz,1H),5.17(t,J＝7.7Hz,1H),3.95-3.76(m,2H),3.19(s,3H),2.75-2.60(m,1H),1.86-1.48(m,3H),0.93(dd,J＝15.1,6.5Hz,6H)。
实施例36
合成N-((S)-1-((3R,5'S)-5'-氰基-2-氧螺环[吲哚啉-3,3'-吡咯烷]-1'-基)-4-甲基-1-氧代戊基-2-基)-4,6,7-三氟-N-甲基-1H-吲哚-2-羧酰胺-3,5-d2
合成路线:
步骤A：(3R,5'S)-1'-(N-甲基-N-(4,6,7-三氟-1H-吲哚-2-羰基-3,5-d2)-L-亮氨酰基)-2-氧螺环[吲哚啉-3，3'-吡咯烷]-5'-甲酰胺
室温下，4,6,7-三氟-1H-吲哚-2-羧酸-3,5-d2-酸(132毫克，0.608毫摩尔)溶于DMF(5毫升)中，加入(3R,5'S)-1'-(甲基-L-亮氨酰基)-2-氧螺环[吲哚啉-3,3'-吡咯烷]-5-d-5'-甲酰胺盐酸盐(200毫克，0.506毫摩尔)、HATU(289毫克，0.76毫摩尔)、DIPEA(0.265毫升，1.52毫摩尔)，氮气保护，室温下反应5小时。
反应完毕，20毫升饱和碳酸氢钠溶液淬灭乙酸乙酯(50毫升×3)萃取，合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，所得残余物硅胶柱层析(PE/EA＝4/1 TO 1/1)得到60毫克(3R,5'S)-1'-(N-甲基-N-(4,6,7-三氟-1H-吲哚-2-羰基-3,5-d2)-L-亮氨酰基)-2-氧螺环[吲哚啉-3，3'-吡咯烷]-5'-甲酰胺(收率：21％)。LC-MS:[M-H]-＝556。
步骤B：合成N-((S)-1-((3R,5'S)-5'-氰基-2-氧代螺[二氢吲哚-3,3'-吡咯烷]-1'-基)-4-甲基-1-氧代戊烷-2-yl)-4,6,7-三氟-N-甲基-1H-吲哚-2-羧酰胺-3,5-d2
室温下，(3R,5'S)-1'-(N-甲基-N-(4,6,7-三氟-1H-吲哚-2-羰基-3,5-d2)-L-亮氨酰基)-2-氧螺环[吲哚啉-3，3'-吡咯烷]-5'-甲酰胺(60毫克，0.108毫摩尔)溶于DCM(6毫升)中，加入伯吉斯试剂(76毫克，0.321毫摩尔)室温反应3小时。
反应完毕，加入5毫升水，DCM(2*20毫升)萃取，合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸干溶剂，硅胶柱层析(PE/EA＝4/1 to 1/1)得到19毫克白色固体N-((S)-1-((3R,5'S)-5'-氰基-2-氧螺环[吲哚啉-3,3'-吡咯烷]-1'-基)-4-甲基-1-氧代戊基-2-基)-4,6,7-三氟-N-甲基-1H-吲哚-2-羧酰胺-3,5-d2(收率：33％)。LC-MS:[M-H]-＝538。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.53(s,1H),10.69(s,1H),7.08(d,J＝7.5Hz,2H),6.84(dd,J＝12.2,7.6Hz,2H),5.40-5.25(m,1H),5.17(t,J＝7.7Hz,1H),3.85(s,2H),3.19(s,3H),2.70-2.62(m,1H),1.87-1.49(m,3H),0.93(dd,J＝15.1,6.5Hz,6H)。
实施例37
合成N-(1-((3R,5'S)-5'-5'-氰基-氧螺环[吲哚啉-3，3'-吡咯烷]-1'-基)-4-(甲基-d3)-1-氧代戊基-2-基-2,3,3,4,5,5,5-d7)-4,6,7-三氟-N-甲基-1H-吲哚-2-甲酰胺
合成路线：
步骤A：合成N-Boc-L-亮氨酸-d10
室温下，L-亮氨酸-d10(250毫克，1.77毫摩尔)和碳酸氢钠(743毫克，8.85毫摩尔)溶于四氢呋喃(10毫升)和水(3毫升)中，缓慢向其中加入二碳酸二叔丁酯(580毫克，2.66毫摩尔)，加毕，25℃搅拌16小时。
反应结束，加入20毫升水，用甲叔醚15毫升萃取，留下的水相用1M的盐酸水溶液调节pH到2.0，然后用乙酸乙酯(10毫升×4)萃取。合并有机相，再用饱和盐水(30毫升)洗涤，干燥，过滤减压浓缩至干，不做进一步的处理，得到420毫克N-Boc-L-亮氨酸-d10。LC-MS:[M-H]-＝240。
步骤B：合成N-甲基-Boc-L-亮氨酸-d10
室温下，氢化钠(209毫克，5.22毫摩尔，60％)悬浮在15毫升四氢呋喃中，氮气置换三次，然后降温到0℃，随后将N-Boc-L-亮氨酸-d10(420毫克，1.74毫摩尔)溶于四氢呋喃(5毫升)的溶液缓慢注射到悬浮有氢化钠的四氢呋喃溶液中，加毕，25℃搅拌1小时，最后将碘甲烷(1.24克，8.70毫摩尔)在0℃下注射至混合液中，该反应升至25℃后再搅拌15小时。反应结束，加入20毫升水用甲叔醚20毫升萃取，留下的水相用1M的盐酸水溶液调节pH到2.0，然后用乙酸乙酯(5毫升×6)萃取。合并有机相，再用饱和盐水(20毫升)洗涤，干燥，过滤减压浓缩至干，不做进一步的处理，得到420毫克N-甲基-Boc-L-亮氨酸-d10。LC-MS:[M-H]-＝254。
步骤C：叔丁基(1-((3R,5'S)-5'-氨基甲酰基-2-氧螺环[吲哚啉-3，3'-吡咯烷]-1'-基)-4-(甲基-d3)-1-氧代戊基-2-基-2,3,3,4,5,5,5-d7)(甲基)氨基甲酸酯
室温下，将N-甲基-Boc-L-亮氨酸-d10(420毫克，1.64毫摩尔)，N-甲基吗啡啉(416毫克，4.11毫摩尔)和2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(623毫克，1.64毫摩尔)混合在二氯甲烷(20毫升)中，室温反应半个小时后，将(3R,5'S)-1'-(甲基-L-烷基)-2-氧螺环[吲哚啉-3,3'-吡咯烷]-5'-甲酰胺盐酸盐(367毫克，1.37毫摩尔)溶于N,N-二甲基甲酰胺(4毫升)的溶液加入到以上混合液中，室温25℃下再反应1.5小时。
反应结束，加入饱和氯化铵(40毫升)，用二氯甲烷(15毫升×3)萃取。合并有机相，再用饱和盐水(40毫升)洗涤，干燥，过滤减压浓缩至干得到残余。残余物通过正相柱(正己烷/乙酸乙酯＝1：5)纯化得到420毫克白色产物叔丁基(1-((3R,5'S)-5'-氨基甲酰基-2-氧螺环[吲哚啉-3，3'-吡咯烷]-1'-基)-4-(甲基-d3)-1-氧代戊基-2-基-2,3,3,4,5,5,5-d7)(甲基)氨基甲酸酯(收率65％)。LC-MS:[M-H]-＝467
步骤D:合成N-(甲基-d3)-((S)--1-(3R，5'S)-5'-氨甲酰-2-氧螺环[吲哚啉-3，3'-吡咯烷]-1'-基)-1-氧代戊基-2-基-2，3，3，4，5，5，5，5-d7)氨基甲酸酯盐酸盐
室温下，叔丁基(1-((3R,5'S)-5'-氨基甲酰基-2-氧螺环[吲哚啉-3，3'-吡咯烷]-1'-基)-4-(甲基-d3)-1-氧代戊基-2-基-2,3,3,4,5,5,5-d7)(甲基)氨基甲酸酯(420毫克，896微摩尔)溶于盐酸/乙酸乙酯(1M，20毫升)中，室温反应2小时。反应结束，浓缩至干，得到类白色固体产物330毫克N-(甲基-d3)-((S)--1-(3R，5'S)-5'-氨甲酰-2-氧螺环[吲哚啉-3，3'-吡咯烷]-1'-基)-1-氧代戊基-2-基-2，3，3，4，5，5，5，5-d7)氨基甲酸酯盐酸盐，不做进一步的处理，直接用于下一步反应。LC-MS:[M-H]-＝367。
步骤E:合成(3R,5'S)-1'-(N-甲基-N-(4,6,7-三氟-1H-吲哚-2-羰基)亮氨酰基-d10)-2-2-氧螺环[吲哚啉-3，3'-吡咯烷]-5'-甲酰胺
室温下，将4，6，7-三氟吲哚-2-羧酸(280毫克，1.30毫摩尔)，N-甲基吗啡啉(263毫克，2.60毫摩尔)和2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(500毫克，1.30毫摩尔)混合在二氯甲烷(20毫升)中，室温反应半个小时后，将N-(甲基-d3)-((S)--1-(3R，5'S)-5'-氨甲酰-2-氧螺环[吲哚啉-3，3'-吡咯烷]-1'-基)-1-氧代戊基-2-基-2，3，3，4，5，5，5，5-d7)氨基甲酸酯盐酸盐(330毫克，868微摩尔)溶于N,N-二甲基甲酰胺(4毫升)的溶液加入到以上混合液中，室温25摄氏度下再反应1.5小时。反应结束，加入饱和氯化铵(60毫升)，用二氯甲烷(20毫升×3)萃取。合并有机相，再用饱和盐水(60毫升)洗涤，干燥，过滤减压浓缩至干得到残余。残余物通过正相柱(正己烷/乙酸乙酯＝1：5)纯化得到330毫克白色产物(3R,5'S)-1'-(N-甲基-N-(4,6,7-三氟-1H-吲哚-2-羰基)亮氨酰基-d10)-2-2-氧螺环[吲哚啉-3，3'-吡咯烷]-5'-甲酰胺(收率67％)。LC-MS:[M-H]-＝564。
步骤F:合成N-(1-(3R，5'S)-5'-氰基-2-氧代螺[吲哚啉-3，3'-吡咯烷]-1'-基)-4-(甲基-d3)-1-氧代戊聚-2-基-2，3，3，4，5，5，5-d7)-4，6，7-三氟-N-甲基-1H-吲哚-2-甲酰胺
室温下，将(3R,5'S)-1'-(N-甲基-N-(4,6,7-三氟-1H-吲哚-2-羰基)亮氨酰基-d10)-2-2-氧螺环[吲哚啉-3，3'-吡咯烷]-5'-甲酰胺(330毫克，583微摩尔)溶于二氯甲烷(15毫升)中，随后缓慢加入伯吉斯试剂(695毫克，2.92毫摩尔)。该反应搅拌2小时。反应结束，加入饱和氯化铵(60毫升)，用二氯甲烷(20毫升×3)萃取。合并有机相，再用饱和盐水(60毫升)洗涤，干燥，过滤减压浓缩至干得到残余。残余物通过反相柱(水/乙腈＝3：7)纯化得到199.1毫克白色产物N-(1-((3R,5'S)-5'-5'-氰基-氧螺环[吲哚啉-3，3'-吡咯烷]-1'-基)-4-(甲基-d3)-1-氧代戊基-2-基-2,3,3,4,5,5,5-d7)-4,6,7-三氟-N-甲基-1H-吲哚-2-甲酰胺(收率62％)。LC-MS:[M-H]-＝546。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.53(s,1H),10.68(s,1H),7.15-7.04(m,3H),6.84(dt,J＝13.5,6.7Hz,3H),5.22-5.14(m,1H),3.86(s,2H),3.19(s,3H),2.66(dd,J＝13.4,8.9Hz,1H),2.50-2.46(m,1H).
实施例38
合成N-((S)-1-((3R,5'S)-5'-氰基-2-氧螺环[吲哚啉-3,3'吡咯烷]-1'-基-2',2'-d2)-4-甲基-1-氧代戊烷-2-基)-4,6,7-三氟-N-甲基-1H-吲哚-2-甲酰胺-3,5-d2
合成路线：
步骤A：合成(3R,5'S)-1'-(N-甲基-N-(4,6,7-三氟-1H-吲哚-2-羰基-3,5-d2)-L-亮氨酰基)-2-氧螺环[吲哚啉-3,3'-吡咯烷]-2',2'-d2-5'-甲酰胺
室温下，将(3R,5'S)-2-氧螺环[吲哚啉-3，3'-吡咯烷]-2'，2'-d2-5'-甲酰胺(200毫克，0.5毫摩尔)，4,6,7-三氟-1H-吲哚-2-羧基-3,5-d2酸(164毫克，0.76毫摩尔)溶于无水DMF(5毫升)中，加入DIPEA(0.31毫升，1.76毫摩尔)，HATU(288毫克，0.76毫摩尔)，室温搅拌5h。
反应结束，加入饱和碳酸氢钠(15毫升)淬灭反应，乙酸乙酯萃取(20毫升×3)，合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩至干，所得残余物用硅胶柱层析纯化(洗脱剂：石油醚:乙酸乙酯＝10:90)，得到82毫克白色固体产物(3R,5'S)-1'-(N-甲基-N-(4,6,7-三氟-1H-吲哚-2-羰基-3,5-d2)-L-亮氨酰基)-2-氧螺环[吲哚啉-3,3'-吡咯烷]-2',2'-d2-5'-甲酰胺(收率29.0％)。LC-MS:[M-H]-＝558.2。
步骤B：合成N-((S)-1-((3R,5'S)-5'-氰基-2-氧代螺[吲哚啉-3,3'吡咯烷]-1'-基-2',2'-d2)-4-甲基-1-氧代戊烷-2-基)-4,6,7-三氟-N-甲基-1H-吲哚-2-甲酰胺-3,5-d2
室温下，将(3R,5'S)-1'-(N-甲基-N-(4,6,7-三氟-1H-吲哚-2-羰基-3,5-d2)-L-亮氨酰基)-2-氧螺环[吲哚啉-3,3'-吡咯烷]-2',2'-d2-5'-甲酰胺(84毫克，0.15毫摩尔)溶于无水二氯甲烷(8毫升)中，加入伯吉斯试剂(180毫克，0.75毫摩尔)，室温下搅拌3小时。
反应结束，加入饱和碳酸氢钠(20毫升)淬灭反应，二氯甲烷萃取(10毫升×3)，合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩至干，所得残余物用硅胶柱层析纯化(洗脱剂：石油醚:乙酸乙酯＝1:1)，得到59毫克白色固体产物N-((S)-1-((3R,5'S)-5'-氰基-2-氧螺环[吲哚啉-3,3'吡咯烷]-1'-基-2',2'-d2)-4-甲基-1-氧代戊烷-2-基)-4,6,7-三氟-N-甲基-1H-吲哚-2-甲酰胺-3,5-d2(收率73.0％)。LC-MS:[M+Na]+＝564.2。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.52(s,1H),10.67(s,1H),7.13-7.04(m,2H),6.88-6.78(m,2H),5.39-5.27(m,1H),5.22-5.11(m,1H),3.19(s,3H),2.69-2.62(m,1H),2.54-2.52(m,1H),1.82-1.74(m,1H),1.72-1.63(m,1H),1.61-1.52(m,1H),0.95(d,J＝6.6Hz,3H),0.92(d,J＝6.4Hz,3H).
实施例39
合成N-((S)-1-((3R,5'S)-5'--氰基-2-氧螺环[吲哚啉-3,3'吡咯烷]-1'-基-2',2'-d2)-4-甲基-1-氧代戊基-2-基)-4,6,7-三氟-N-甲基-1H-吲哚-2-甲酰胺
步骤A：合成叔丁基((S)-1-((3R,5'S)-5'-氨基甲酰基-2-氧螺环[吲哚啉-3,3'吡咯烷]-1'-基-2'，2'-d2)-4-甲基-1-氧代戊基-2-基)(甲基)氨基甲酸酯
室温下把N-叔丁氧羰基-N-甲基-亮氨酸(841毫克，3.43毫摩尔)加入到二氯甲烷/DMF中(20毫升，V:V＝4:1),接着在0度下缓慢加入吗啡啉(1.4克，13.7毫摩尔)，HATU(1.44g,3.77毫摩尔)加入，接着室温搅拌5分钟；接着0度下加入(3R,5'S)-2-氧螺环[吲哚啉-3，3'-吡咯烷]-2'，2'-d2-5'-甲酰胺(800毫克，3.43毫摩尔)，室温下搅拌12小时。
反应完毕，加水(100毫升)淬灭，二氯甲烷萃取(100毫升×3)，合并有机相，依次用水(200毫升)、饱和食盐水(100毫升)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩。所得残余物过反向柱(乙腈：水5：9到50：50)得到1.3克白色固体叔丁基((S)-1-((3R,5'S)-5'-氨基甲酰基-2-氧螺环[吲哚啉-3,3'吡咯烷]-1'-基-2'，2'-d2)-4-甲基-1-氧代戊基-2-基)(甲基)氨基甲酸酯(收率：77.9％)。LC-MS:[M-H]-＝459
步骤B：合成叔丁基((S)-1-((3R,5'S)-5-溴-5'-氨基甲酰基-2-氧螺环[吲哚啉-3,3'吡咯烷]-1'-基-2'，2'-d2)-4-甲基-1-氧代戊基-2-基)(甲基)氨基甲酸酯
室温下把叔丁基((S)-1-((3R,5'S)-5'-氨基甲酰基-2-氧螺环[吲哚啉-3,3'吡咯烷]-1'-基-2'，2'-d2)-4-甲基-1-氧代戊基-2-基)(甲基)氨基甲酸酯(550毫克，1.19毫摩尔)加入到二氯甲烷(20毫升),接着零度下加入NBS(320毫克，1.8毫摩尔)，室温下搅拌20个小时。
反应完毕，反应液加50毫升水淬灭，二氯甲烷萃取(100毫升×3)，合并有机相，依次用水(50毫升)、饱和食盐水(100毫升)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩。所得残余物过反向柱(乙腈：水5：9到50：50)得到400毫克白色固体叔丁基((S)-1-((3R,5'S)-5-溴-5'-氨基甲酰基-2-氧螺环[吲哚啉-3,3'吡咯烷]-1'-基-2'，2'-d2)-4-甲基-1-氧代戊基-2-基)(甲基)氨基甲酸酯(收率：30％)。LC-MS:[M-H]-＝537
步骤C：合成叔丁基((S)-1-((3R,5'S)-5'-氨基甲酰基-2-氧螺环[吲哚啉-3,3'吡咯烷]-1'-基-2'，2',5-d3)-4-甲基-1-氧代戊基-2-基)(甲基)氨基甲酸酯
室温下把叔丁基((S)-1-((3R,5'S)-5-溴-5'-氨基甲酰基-2-氧螺环[吲哚啉-3,3'吡咯烷]-1'-基-2'，2'-d2)-4-甲基-1-氧代戊基-2-基)(甲基)氨基甲酸酯(360毫克，0.667毫摩尔)加入到氘代甲醇/氘水中(20毫升),接着依次加入湿钯碳(250毫克)、碳酸钠(283毫克,2.67毫摩尔)、氘代次磷酸(184毫克，2.67毫摩尔)接着50度搅拌12小时。
反应完毕，反应液冷却到室温，过滤，滤液加20毫升水，二氯甲烷萃取(100毫升×3)，合并有机相，依次用水(50毫升)、饱和食盐水(100毫升)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩。所得残余物过反向柱(乙腈：水5：9到50：50)得到110毫克白色固体叔丁基((S)-1-((3R,5'S)-5'-氨基甲酰基-2-氧螺环[吲哚啉-3,3'吡咯烷]-1'-基-2'，2',5-d3)-4-甲基-1-氧代戊基-2-基)(甲基)氨基甲酸酯(收率：30％)。LC-MS:[M-H]-＝460
步骤D：合成(3R,5'S)-1'-(甲基-L-亮氨酰基)-2-氧螺环[吲哚啉-3,3'吡咯烷]-2',2',5-d3-5'-甲酰胺
把叔丁基((S)-1-((3R,5'S)-5'-氨基甲酰基-2-氧螺环[吲哚啉-3,3'吡咯烷]-1'-基-2'，2',5-d3)-4-甲基-1-氧代戊基-2-基) (甲基)氨基甲酸酯(110毫克，0.238毫摩尔)加入到盐酸二氧六环(4摩尔，20毫升)中,室温下反应2小时。
反应完毕，直接旋干得到86毫克粗品(3R,5'S)-1'-(甲基-L-亮氨酰基)-2-氧螺环[吲哚啉-3,3'吡咯烷]-2',2',5-d3-5'-甲酰胺盐酸盐直接用于下一步。LC-MS:[M-H]-＝360。
步骤E：(3R,5'S)-1'-(N-甲基-N-(4，6，7-三氟-1H-吲哚-2-羰基)-L-亮氨酰基-2-氧螺环[吲哚啉-3,3'吡咯烷]-2',2',5-d3-5'-甲酰胺
室温下把4，6，7-三氟吲哚-2-羧酸(77毫克，0.357毫摩尔)加入到二氯甲烷/DMF中(10毫升V:V＝4:1),接着在0度下缓慢加入吗啡啉(96毫克，0.948毫摩尔)，HATU(136毫克,0.357毫摩尔)加入，接着室温搅拌5分钟；接着0度下加入(3R,5'S)-1'-(甲基-L-亮氨酰基)-2-氧螺环[吲哚啉-3,3'吡咯烷]-2',2',5-d3-5'-甲酰胺盐酸盐(86毫克，0.237毫摩尔)，室温下搅拌12小时。
反应完毕，加水(50毫升)淬灭，二氯甲烷萃取(50毫升×3)，合并有机相，依次用水(100毫升)、饱和食盐水(100毫升)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩。所得残余物过反向柱(乙腈：水5：9到50：50)得到80毫克白色固体(3R,5'S)-1'-(N-甲基-N-(4，6，7-三氟-1H-吲哚-2-羰基)-L-亮氨酰基-2-氧螺环[吲哚啉-3,3'吡咯烷]-2',2',5-d3-5'-甲酰胺(收率：60％)。LC-MS:[M-H]-＝557.
步骤F：N-((S)-1-((3R,5'S)-5'-氰基-2-氧螺环[吲哚啉-3,3'吡咯烷]-1'-基-2',2',5-d3)-4-甲基-1-氧代戊基-2-基)-4,6,7-三氟-N-甲基-1H-吲哚-2-甲酰胺
室温下把(3R,5'S)-1'-(N-甲基-N-(4，6，7-三氟-1H-吲哚-2-羰基)-L-亮氨酰基-2-氧螺环[吲哚啉-3,3'吡咯烷]-2',2',5-d3-5'-甲酰胺(80毫克，0.143毫摩尔)加入到二氯甲烷(30毫升),接着在0度下加入伯吉斯试剂(136毫克，0.572毫摩尔)，接着室温搅拌16小时。
反应完毕，加水(50毫升)淬灭，二氯甲烷萃取(50毫升×3)，合并有机相，依次用水(50毫升)、饱和食盐水(50毫升)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩。所得残余物过反向柱(乙腈：水5：9到50：50)得到60毫克白色固体N-((S)-1-((3R,5'S)-5'-氰基-2-氧螺环[吲哚啉-3,3'吡咯烷]-1'-基-2',2',5-d3)-4-甲基-1-氧代戊基-2-基)-4,6,7-三氟-N-甲基-1H-吲哚-2-甲酰胺(收率：78％)。LC-MS:[M-H]-＝539.1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.54(s,1H),10.68(s,1H),7.18-7.06(m,3H),6.90-6.78(m,2H),5.33(dd,J＝9.4,5.6Hz,1H),5.18(dd,J＝8.8,6.8Hz,1H),3.19(s,3H),2.72-2.61(m,1H),2.48(m,1H),1.84-1.73(m,1H),1.68(dt,J＝13.8,6.6Hz,1H),1.61-1.48(m,1H),0.94(dd,J＝15.2,6.4Hz,6H).
实施例40
合成N-((S)-1-((3R,5'S)-5'-氰基-2-氧螺环[吲哚啉-3,3'吡咯烷]-1'-基-5-d)-4-甲基-1-氧代戊基-2-基)-4,6,7-三氟-N-(甲基-d3)-1H-吲哚-2-甲酰胺
步骤A合成叔丁基((S)-1-((3R,5'S)-5-溴-5'-氨甲酰-2-氧螺环[吲哚啉-3,3'吡咯烷]-1'-基)-4-甲基-1-氧代戊基-2-基)(甲基-d3)氨基甲酸酯
将(3R，5'S)-5-溴-2-氧螺环[吲哚啉-3,3'吡咯烷]-5'-甲酰胺盐酸盐(0.76克，2.19毫摩尔)溶于四氢呋喃/N,N-二甲基甲酰胺(20毫升/2毫升)中，加入N-(叔丁氧羰基)-N-(甲基-d3)-L-亮氨酸(0.57克，2.31毫摩尔)、并置换氮气降温至0℃，降温后加入N-甲基吗啉(0.72毫升，6.57毫摩尔)和50％T3P(1.54克，2.14毫摩尔)。反应在氮气保护下，常温搅拌2小时。
将反应液用碳酸氢钠水溶液(20毫升)淬灭，用乙酸乙酯(30毫升x 3)萃取，合并有机相用饱和氯化钠水溶液洗涤，经无水硫酸钠干燥,过滤,旋干，所得残余物用硅胶柱层析纯化(洗脱剂：二氯甲烷/甲醇＝95.5％/4.5％)，得到0.62克白色固体叔丁基((S)-1-((3R,5'S)-5-溴-5'-氨甲酰-2-氧螺环[吲哚啉-3,3'吡咯烷]-1'-基)-4-甲基-1-氧代戊基-2-基)(甲基-d3)氨基甲酸酯(收率：52.4％)LCMS:[M-H]-＝538.
步骤B：合成(3R，5'S)-5-溴-1'-((甲基-d3)-L-亮氨酰基)-2-氧螺环[吲哚啉-3,3'吡咯烷]-5'-甲酰胺
将叔丁基((S)-1-((3R,5'S)-5-溴-5'-氨甲酰-2-氧螺环[吲哚啉-3,3'吡咯烷]-1'-基)-4-甲基-1-氧代戊基-2-基)(甲基-d3)氨基甲酸酯(0.62克，1.15毫摩尔)溶于二氯甲烷(5毫升)，加入4M氯化氢二氧六环(5毫升)，常温下反应1小时，将反应液旋干，得到0.67克乳白色固体(3R，5'S)-5-溴-1'-((甲基-d3)-L-亮氨酰基)-2-氧螺环[吲哚啉-3,3'吡咯烷]-5'-甲酰胺(收率：100％)。LCMS:[M-H]-＝438.
步骤C：合成(3R,5'S)-5-5-溴-1'-(N-(甲基-d3)-N-(4,6,7-三氟-1H-吲哚-2-羰基)-L-亮氨酰基)--2-氧螺环[吲哚啉-3,3'吡咯烷]-5'-甲酰胺
将(3R，5'S)-5-溴-1'-((甲基-d3)-L-亮氨酰基)-2-氧螺环[吲哚啉-3,3'吡咯烷]-5'-甲酰胺(0.67克，1.52毫摩尔)溶于二氯甲烷/N,N-二甲基甲酰胺(5毫升/5毫升)中，将反应降温至0℃，加入4,6,7-三氟-1H-吲哚-2-羧酸(0.38克，1.75毫摩尔)、2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(0.81克，2.38毫摩尔)和N,N-二异丙基乙胺(0.78克，6.08毫摩尔)，反应在氮气保护下，0℃搅拌反应1.5小时。
将反应液用水淬灭，用二氯甲烷(20毫升x 3)萃取，合并有机相用饱和氯化钠水溶液洗涤，经无水硫酸钠干燥,过滤，旋干。所得残余物用硅胶柱层析纯化(洗脱剂：二氯甲烷/甲醇＝95.3％/4.7％)，得到0.57克米白色固体(3R,5'S)-5-5-溴-1'-(N-(甲基-d3)-N-(4,6,7-三氟-1H-吲哚-2-羰基)-L-亮氨酰基)--2-氧螺环[吲哚啉-3,3'吡咯烷]-5'-甲酰胺(收率：58.8％)。LCMS:[M-H]-＝637.
步骤D：合成(3R,5'S)-1'-(N-(甲基-d3)-N-(4,6,7-三氟-1H-吲哚-2-羰基)-L-亮氨酰基)-2-氧螺环[吲哚啉-3,3'吡咯烷]-5-d-5'-甲酰胺
将(3R,5'S)-5-5-溴-1'-(N-(甲基-d3)-N-(4,6,7-三氟-1H-吲哚-2-羰基)-L-亮氨酰基)--2-氧螺环[吲哚啉-3,3'吡咯烷]-5'-甲酰胺(0.57克，0.89毫摩尔)溶于甲醇(10毫升)中，置换氮气三次，加入钯碳(0.06克，10％质量分数)，反应在氘气保护下，常温搅拌反应5小时。
将反应液用硅藻土过滤，旋干。所得残余物用硅胶柱层析纯化(洗脱剂：二氯甲烷/甲醇＝95.5％/4.5％)，得到0.44克白色固体(3R,5'S)-1'-(N-(甲基-d3)-N-(4,6,7-三氟-1H-吲哚-2-羰基)-L-亮氨酰基)-2-氧螺环[吲哚啉-3,3'吡咯烷]-5-d-5'-甲酰胺(收率：88.3％)。LCMS:[M-H]-＝558.
步骤E：合成N-((S)-1-((3R,5'S)-5'-氰基-2-氧螺环[吲哚啉-3,3'吡咯烷]-1'-基-5-d)-4-甲基-1-氧代戊烷基-2-基)-4,6,7-三氟-N-(甲基-d3)-1H-吲哚-2-甲酰胺
将(3R,5'S)-1'-(N-(甲基-d3)-N-(4,6,7-三氟-1H-吲哚-2-羰基)-L-亮氨酰基)-2-氧螺环[吲哚啉-3,3'吡咯烷]-5-d-5'-甲酰胺(0.44克，0.79毫摩尔)溶于二氯甲烷(5毫升)中，降温至0升后加入三乙胺(0.44毫升，3.15毫摩尔)和三氟乙酸酐(0.9毫升，6.29毫摩尔)，在氮气保护下，0摩搅拌反应0.5小时。
将反应液用碳酸氢钠水溶液淬灭，用二氯甲烷(20毫升x 3)萃取，合并有机相，用饱和氯化钠水溶液洗涤，经无水硫酸钠干燥,过滤,旋干。所得残余物用硅胶柱层析纯化(洗脱剂：二氯甲烷/甲醇＝96.3％/3.7％)，得到0.1克白色固体N-((S)-1-((3R,5'S)-5'-氰基-2-氧螺环[吲哚啉-3,3'吡咯烷]-1'-基-5-d)-4-甲基-1-氧代戊烷基-2-基)-4,6,7-三氟-N-(甲基-d3)-1H-吲哚-2-甲酰胺(收率：23.3％)。LCMS:[M-H]-＝540.1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.54(t,J＝6.3Hz,1H),10.68(s,1H),7.07(s,3H),6.80(s,2H),5.33(s,1H),5.16(s,1H),3.87(s,2H),2.66(s,1H),2.27(s,1H),1.79(s,1H),1.70(s,1H),1.55(s,1H),0.96(s,6H).
实施例41
合成：N-((S)-1-((3R,5'S)-5'-氰基-2-氧螺环[吲哚-3,3'-吡咯烷]-1'-基-4,5,6,7-d4)-4-甲基-1-氧代戊基-2-基)-4,6,7-三氟-N-(甲基-d3)-1H-吲哚-2-甲酰胺
步骤A：合成L-色氨酸-2,4,5,6,7-d5氘代盐酸盐
将L-色氨酸(10克，48.96毫摩尔)加入到50毫升D2O中，加入DCl(100克，20％wt.，97.9毫摩尔)。加热至110度反应过夜。将反应液用冰水浴降温，有白色固体析出，过滤，旋干。得8.9克淡黄色固体化合物L-色氨酸-2,4,5,6,7-d5氘代盐酸盐(73.6％收率)。LCMS:[M+H]+＝210.
步骤B：合成(S)-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-羧酸-5,6,7,8-d4酸
将L-色氨酸-2,4,5,6,7-d5氘代盐酸盐(8.9克，36.2毫摩尔)加入到15毫升甲醇中，加入37％甲醛水溶液(3.48克，42.16毫摩尔)，室温反应过夜。将反应液过滤。得9.5克淡黄色固体化合物(S)-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-羧酸-5,6,7,8-d4酸(收率：100％)。LCMS:[M+H]+＝221.
步骤C：合成(S)-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-羧酸甲酯-5,6,7,8-d4
将(S)-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-羧酸-5,6,7,8-d4酸(9.5克，43.18毫摩尔)加入到100毫升氯化氢甲醇溶液(4M)中，室温反应过夜。将反应液低温旋干，得10.2克棕色固体(S)-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-羧酸甲酯-5,6,7,8-d4(收率：100％)。LCMS:[M+H]+＝235.
步骤D：合成2-(叔丁基)-3-甲基-(S)-1,3,4,9-四氢-2H-吡啶并[3,4-b]吲哚-2,3-二羧酸-5,6,7,8-d4
将(S)-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-羧酸甲酯-5,6,7,8-d4(10.2克，43.59毫摩尔)加入到50毫升二氯甲烷中，冰水浴下加入N,N-二异丙基乙胺(23毫升，17.07毫摩尔)至碱性，加入二碳酸二叔丁酯(13毫升，57.4毫摩尔)，室温下反应5小时,将反应液倒入到40毫升饱和氯化铵水溶液中，用二氯甲烷(30毫升)萃取3次。合并有机相，用无水硫酸钠干燥，过滤，旋干。所得物用Flash硅胶柱纯化(0-35％乙酸乙酯/石油醚)，得5.1克白色固体2-(叔丁基)-3-甲基-(S)-1,3,4,9-四氢-2H-吡啶并[3,4-b]吲哚-2,3-二羧酸-5,6,7,8-d4(收率：4步31％收率)。LCMS:[M+H]+＝335.
步骤E：合成1'-(叔丁基)-5'-甲基-(3R,5'S)-2-氧螺环[吲哚啉-3,3'-吡咯烷]-1'，5'-二羧酸-4,5,6,7-d4
将2-(叔丁基)-3-甲基-(S)-1,3,4,9-四氢-2H-吡啶并[3,4-b]吲哚-2,3-二羧酸-5,6,7,8-d4(3.34克，10.0毫摩尔)加入到20毫升四氢呋喃和4毫升水中，冰水浴降温，加入冰醋酸(4毫升，70.0毫摩尔)，再加入NBS(1.42克，8.0毫摩尔)，冰水浴反应2小时。取样监控，若原料有剩余，则补加N-溴代丁二酰亚胺(90毫克，0.5毫摩尔)并每隔1小时取样监控，N-溴代丁二酰亚胺最多补加至0.95当量。将反应液加入到饱和碳酸氢钠水溶液中，用二氯甲烷(50毫升)萃取3次。合并有机相，用无水硫酸钠干燥，旋干。所得物用Flash硅胶柱纯化(0-30％乙酸乙酯/石油醚)，得1.7克白色固体1'-(叔丁基)-5'-甲基-(3R,5'S)-2-恶螺环[吲哚啉-3,3'-吡咯烷]-1'，5'-二羧酸-4,5,6,7-d4(收率:49％)。LCMS:[M+H]+＝351.
步骤F：合成(3R,5'S)-1'-(叔丁氧羰基)-2-氧螺环[吲哚啉-3,3'-吡咯烷]-5'-羧酸-4,5,6,7-d4酸
将1'-(叔丁基)-5'-甲基-(3R,5'S)-2-恶螺环[吲哚啉-3,3'-吡咯烷]-1'，5'-二羧酸-4,5,6,7-d4(2.3克，6.6毫摩尔)加入到23毫升甲醇和4.5毫升水中，加入氢氧化锂一水合物(236毫克，1.3毫摩尔)，室温反应4小时。
将反应液减压浓缩，加入20毫升水溶解并用1N盐酸调节pH至4-5，用二氯甲烷(20毫升)萃取三次，合并有机相，用无水硫酸钠干燥，旋干。得到2.2g白色固体1'-(叔丁基)-5'-甲基-(3R,5'S)-2-恶螺环[吲哚啉-3,3'-吡咯烷]-1'，5'-二羧酸-4,5,6,7-d4(收率:99％)，直接用于下一步反应。LCMS:[M-H]-＝335.
步骤G：合成叔丁基(3R,5'S)-5'-氨甲酰-2-氧螺环[吲哚啉-3,3'-吡咯烷]-1'-羧酸-4,5,6,7-d4
将1'-(叔丁基)-5'-甲基-(3R,5'S)-2-恶螺环[吲哚啉-3,3'-吡咯烷]-1'，5'-二羧酸-4,5,6,7-d4(2.1克，6.2毫摩尔)和N,N-二异丙基乙胺(3.2克，25.0毫摩尔)加入到20毫升二氯甲烷中，加入氯化铵(668毫克,12.5毫摩尔)，冰水浴降温，再加入2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(3.6克，9.4毫摩尔)，升到室温反应3小时。
将反应液倒入到20毫升饱和氯化铵水溶液中，用二氯甲烷(20毫升)萃取3次。合并有机相，用无水硫酸钠干燥，旋干。所得物用Flash硅胶柱纯化(0-4％甲醇/二氯甲烷)，得1克白色固体叔丁基(3R,5'S)-5'-氨甲酰-2-氧螺环[吲哚啉-3,3'-吡咯烷]-1'-羧酸-4,5,6,7-d4(收率:43％)。LCMS:[M+H]+＝336.
步骤H：合成(3R,5'S)-2-氧螺环[吲哚啉-3,3'-吡咯烷]-4,5,6,7-d4-5'-甲酰胺盐酸盐
将叔丁基(3R,5'S)-5'-氨甲酰-2-氧螺环[吲哚啉-3,3'-吡咯烷]-1'-羧酸-4,5,6,7-d4(400毫克，1.19毫摩尔)加入到4毫升乙腈中，冰水浴降温，加入乙酸乙酯盐酸气(0.9毫升，4M，3.0毫摩尔)，升至室温反应2小时。
将反应液直接减压浓缩，得到280毫克白色固体(3R,5'S)-2-氧螺环[吲哚啉-3,3'-吡咯烷]-4,5,6,7-d4-5'-甲酰胺盐酸盐(收率：100％)，直接用于下一步反应。LCMS:[M+H]+＝236.
步骤I：合成叔丁基((S)-1-((3R，5'S)-5'-氨甲酰-2-氧螺环[吲哚啉-3,3'-吡咯烷]-1'-基-4,5,6,7-d4)-4-甲基-1-氧代戊基-2-基)(甲基-d3)氨基甲酸酯
将(3R,5'S)-2-氧螺环[吲哚啉-3,3'-吡咯烷]-4,5,6,7-d4-5'-甲酰胺盐酸盐(280毫克，0.75毫摩尔)加入到3毫升无水二氯甲烷和0.7毫升N,N-二甲基甲酰胺中，冰水浴降温，加入N-甲基吗啉(304毫克，3.0毫摩尔)，N-(叔丁氧羰基)-N-(甲基-d3)-L-亮氨酸(168毫克，0.68毫摩尔)，2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(343毫克，0.9毫摩尔)，升至室温反应3小时。将反应液倒入到5毫升饱和氯化铵水溶液中，用乙酸乙酯(20毫升)萃取3次。合并有机相，用无水硫酸钠干燥，旋干。所得物用Flash硅胶柱纯化(0-4％甲醇/二氯甲烷)，得200毫克白色固体叔丁基((S)-1-((3R，5'S)-5'-氨甲酰-2-氧螺环[吲哚啉-3,3'-吡咯烷]-1'-基-4,5,6,7-d4)-4-甲基-1-氧代戊基-2-基)(甲基-d3)氨基甲酸酯(收率:57％)。LCMS:[M+H]+＝466.
步骤J：合成(3R,5'S)-1'-((甲基-d3)-L-亮氨酰基)-2-氧螺环[吲哚啉-3,3'-吡咯烷]-4,5,6,7-d4-5'-甲酰胺盐酸盐
将叔丁基((S)-1-((3R，5'S)-5'-氨甲酰-2-氧螺环[吲哚啉-3,3'-吡咯烷]-1'-基-4,5,6,7-d4)-4-甲基-1-氧代戊基-2-基)(甲基-d3)氨基甲酸酯(200毫克，0.45毫摩尔)和加入到2毫升乙腈中，冰水浴条件下加入乙酸乙酯盐酸气(0.3毫升，4M,1.31毫摩尔)，反应2小时。将反应液减压浓缩。得到200毫克合物淡黄色固体合成(3R,5'S)-1'-((甲基-d3)-L-亮氨酰基)-2-氧螺环[吲哚啉-3,3'-吡咯烷]-4,5,6,7-d4-5'-甲酰胺盐酸盐(收率：100％)，直接用于下一步反应。LCMS:[M+H]+＝366.
步骤K：合成(3R,5'S)-1'-(N-甲基-d3)-d3)-N-(4,6,7-三氟-1H-吲哚-2-羰基)-L-亮氨酰基)-2-氧螺环[吲哚啉-3,3'-吡咯烷]-4,5,6,7d4-5'-甲酰胺
将4,6,7-三氟-1H-吲哚-2-羧酸(321毫克，0.5毫摩尔)和1-氯-N，N，2-三甲基丙-1-烯-1-胺(236毫克，1.3毫摩尔)加入到6毫升无水二氯甲烷中，后室温搅拌2h，将该溶液在0-10℃下滴入到(3R,5'S)-1'-((甲基-d3)-L-亮氨酰基)-2-氧螺环[吲哚啉-3,3'-吡咯烷]-4,5,6,7-d4-5'-甲酰胺盐酸盐(200毫克，0.5毫摩尔)和三乙胺(0.4毫升，3.0毫摩尔)的10毫升DMF的溶液中。升至室温反应16小时。
将反应液倒入到10毫升饱和氯化铵水溶液中，用DCM(20毫升)萃取3次。合并有机相，用无水硫酸钠干燥，过滤，旋干。所得物用制备板纯化(甲醇/二氯甲烷＝10/1)，得120毫克白色固体化合物(3R,5'S)-1'-(N-甲基-d3)-d3)-N-(4,6,7-三氟-1H-吲哚-2-羰基)-L-亮氨酰基)-2-氧螺环[吲哚啉-3,3'-吡咯烷]-4,5,6,7d4-5'-甲酰胺(收率:43％)。LCMS:[M-H]-＝561.
步骤L：合成N-((S)-1-((3R,5'S)-5'-氰基-2-氧螺环[吲哚啉-3,3'-吡咯烷]-1'-基-4,5,6,7-d4)-4-甲基-1-氧代戊基-2- 基)-4,6,7-三氟-N-(甲基-d3)-1H-吲哚-2-甲酰胺
将(3R,5'S)-1'-(N-甲基-d3)-d3)-N-(4,6,7-三氟-1H-吲哚-2-羰基)-L-亮氨酰基)-2-氧螺环[吲哚啉-3,3'-吡咯烷]-4,5,6,7d4-5'-甲酰胺(120毫克，0.21毫摩尔)加入到4.5毫升二氯甲烷中，加入三乙胺(172毫克，1.71毫摩尔)，冰水浴下滴入三氟乙酸酐(179毫克，0.85毫摩尔)，升至室温反应5小时。
将反应液加入到5毫升饱和碳酸氢钠水溶液中，用二氯甲烷(20毫升)萃取3次。合并有机相，用无水硫酸钠干燥，旋干。所得物用反相制备色谱纯化，得55毫克白色固体N-((S)-1-((3R,5'S)-5'-氰基-2-氧螺环[吲哚啉-3,3'-吡咯烷]-1'-基-4,5,6,7-d4)-4-甲基-1-氧代戊基-2-基)-4,6,7-三氟-N-(甲基-d3)-1H-吲哚-2-甲酰胺(收率:45％)。LCMS:[M-H]-＝543.1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.50(s,1H),10.65(s,1H),7.15-7.05(m,1H),6.81(s,1H),5.34-5.27(m,1H),5.16(t,J＝7.7Hz,1H),3.84(s,2H),2.69-2.59(m,1H),2.46-2.43(m,1H),1.80-1.71(m,1H),1.70-1.61(m,1H),1.60-1.48(m,1H),0.92(dd,J＝15.5,6.4Hz,6H).
实施例42
合成N-((S)-1-((3R,5'S)-5'-氰基-2-氧螺环[吲哚啉-3,3’-吡咯烷]-1'-基-6-d)-4-甲基-1-氧代戊基-2-基)-4,6,7-三氟-N-甲基-1H-吲哚-2-羧酸酰胺-3,5-d2
步骤A：合成(3R,5'S)-6-溴-1'-(N-甲基-N-(4,6,7-三氟-1H-吲哚-2-羰基-3,5-d2)-L-亮氨酰基)-2-氧螺环[吲哚啉-3,3’-吡咯烷]-5'-甲酰胺
室温下，将4,6,7-三氟-3,5-d2-1H-吲哚-2-羧酸(300毫克，1.38毫摩尔)，2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(525毫克，1.38毫摩尔)溶于二氯甲烷(27毫升)和N,N-二甲基甲酰胺(9毫升)的溶液中，加入N-甲基吗啉(0.307毫升，2.76毫摩尔)。搅拌20分钟后加入(3R,5'S)-6-溴-1'-(甲基-L-亮氨酰基)-2-氧螺环[吲哚啉-3,3’-吡咯烷]-5'-甲酰胺(0.474克，0.92毫摩尔)，室温反应4小时。
反应结束，加入饱和碳酸氢钠溶液(50毫升)，用二氯甲烷萃取(75毫升×3)，合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，所得残余物用硅胶柱层析纯化(洗脱剂：乙酸乙酯)，得到0.474克白色固体(3R,5'S)-6-溴-1'-(N-甲基-N-(4,6,7-三氟-1H-吲哚-2-羰基-3,5-d2)-L-亮氨酰基)-2-氧螺环[吲哚啉-3,3’-吡咯烷]-5'-甲酰胺(收率83％)。LC-MS:[M+H]+＝636。
步骤B：合成(3R,5'S)-1'-(N-甲基-N-(4,6,7-三氟-1H-吲哚-2-羰基-3,5-d2)-L-亮氨酰基)-2-氧代螺[吲哚啉-3,3’-吡咯烷]-6-d-5'-甲酰胺
室温下，将(3R,5'S)-6-溴-1'-(N-甲基-N-(4,6,7-三氟-1H-吲哚-2-羰基-3,5-d2)-L-亮氨酰基)-2-氧螺环[吲哚啉-3,3’-吡咯烷]-5'-甲酰胺(474毫克，0.746毫摩尔)，[1,1'-双(二苯基膦)二茂铁]二氯化钯二氯甲烷络合物(122毫克，0.15毫摩尔)溶于四氢呋喃(35毫升)和重水(7毫升)的混合溶液中，随后加入四甲基乙二胺(35微升，0.22毫摩尔)。搅拌20分钟后，分批量加入硼氘化钠(156毫克，3.75毫摩尔)，室温搅拌6小时。
反应结束，在冰浴中加入冷水(50毫升)淬灭反应，二氯甲烷萃取(50毫升×3)，合并有机相，用1N盐酸溶液(50毫升)萃取，饱和食盐水(75毫升)萃取，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，得350毫克黑色固体(3R,5'S)-1'-(N-甲基-N-(4,6,7-三氟-1H-吲哚-2-羰基-3,5-d2)-L-亮氨酰基)-2-氧代螺[吲哚啉-3,3’-吡咯烷]-6-d-5'-甲酰胺，不做进一步的处理，直接用于下一步反应。LC-MS:[M-H]-＝557。
步骤C:合成N-((S)-1-((3R,5'S)-5'-氰基-2-氧代螺[吲哚啉-3,3’-吡咯烷]-1'-基-6-d)-4-甲基-1-氧代戊烷-2-基)-4,6,7-三氟-N-甲基-1H-吲哚-2-羧酸酰胺-3,5-d2
室温下，将(3R,5'S)-1'-(N-甲基-N-(4,6,7-三氟-1H-吲哚-2-羰基-3,5-d2)-L-亮氨酰基)-2-氧代螺[吲哚啉-3,3’-吡咯烷]-6-d-5'-甲酰胺(350毫克，0.627毫摩尔)溶于二氯甲烷(10毫升)中，加入伯吉斯试剂(746毫克，3.13毫摩尔)，室温搅拌4小时。
反应结束，加入饱和碳酸氢钠溶液(15毫升)淬灭反应，二氯甲烷(50毫升×3)萃取，合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，所得残余物用硅胶柱层析纯化(洗脱剂：乙酸乙酯)，得到200毫克浅黄色固体产物，经制备纯化得到70毫克白色固体N-((S)-1-((3R,5'S)-5'-氰基-2-氧螺环[吲哚啉-3,3’-吡咯烷]-1'-基-6-d)-4-甲基-1-氧代戊基-2-基)-4,6,7-三氟-N-甲基-1H-吲哚-2-羧酸酰胺-3,5-d2。LC-MS:[M-H]-＝539。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.50(s,1H),10.66(s,1H),7.05(d,J＝7.5Hz,1H),6.88-6.77(m,2H),5.31(t,J＝7.3Hz,1H),5.15(t,J＝7.8Hz,1H),3.85(d,J＝10.8Hz,2H),3.17(s,3H),2.64(dd,J＝13.3,8.9Hz,1H),1.80-1.63(m,2H),1.54(s,1H),0.91(dd,J＝15.3,6.5Hz,6H).
实施例43相关活性测试
采用体外酶学试验，检测化合物对新型冠状病毒(SARS-CoV-2)3CLpro蛋白酶的抑制活性。选用PF-07321332作为阳性对照化合物。
1.化合物用DMSO进行1:3系列稀释10个浓度点，每个浓度双复孔，加入实验板中。阴性对照孔含有酶和底物但不含化合物，作为无抑制作用对照。阳性对照孔含有底物、酶和高浓度的PF-07321332，作为100％抑制作用对照。
2.将Mpro蛋白酶加入含化合物的实验板中，室温和化合物共培养30分钟。
3.然后加入反应底物在30℃恒温培养箱共孵育60分钟。
4.用多功能酶标仪读板检测荧光读数。
5.采用GraphPad Prism软件分析计算化合物对3CLpro蛋白酶的半数抑制浓度(IC50)值。
试验结果：IC50的范围如下所示：A<0.1μM.
表1受试化合物3CLpro蛋白酶抑制结果
实施例44 CYP酶抑制实验
1实验体系
混合人肝微粒体(HLM)购自瑞德肝脏疾病研究(上海)有限公司，使用前储存于-80℃冰箱。
2实验溶液的配制
底物储备液的配制
阳性对照抑制剂储备液的配制
供试品、底物和阳性对照抑制剂工作液的配制
供试品用DMSO配制成50mM的储备液。储备液用50％乙腈水梯度稀释为5.00、1.67、0.556、0.185、0.0617、0.0206和0.00686mM。
咪达唑仑储备液分别用0.1M磷酸钾缓冲液稀释到5μM。酮康唑储备液分别用50％乙腈水稀释到30.0、10.0、3.33、1.11、0.370、0.123和0.0412μM。
人肝微粒体混合溶液和辅助因子溶液的配制
人肝微粒体20mg/mL用0.1M磷酸钾缓冲液稀释至0.2mg/mL。NADPH粉末用0.1M磷酸钾缓冲液配制为8mM。
3实验步骤
将微粒体从-80℃冰箱中取出，冰上解冻。将15μL底物工作液预先加入96孔板中。取2μL梯度稀释的供试品或阳性对照工作液加入含有98μL的0.2mg/mL的人肝微粒体混合溶液相应孔中，在无抑制剂孔中加入2μL溶剂于人肝微粒体混合溶液中。底物溶液和含有供试品或阳性对照的人肝微粒体混合溶液预先在37℃条件下预热10分钟后，各孔加入15μL 8mM的NADPH溶液启动反应。在37℃条件下，3A4(咪达唑仑为底物)反应10分钟。
到达反应时间后，加入150μL终止液(50ng/mL普萘洛尔，内标)终止反应。4000rpm离心10分钟，沉淀蛋白。取100μL上清液加入到100μL超纯水中，摇板10分钟混合均匀，进行LC-MS/MS分析。
4数据分析
将含不同浓度供试品时底物代谢产物生成量与溶剂对照样品的底物代谢产物生成量的百分比作为各同工酶的剩余活性百分比。应用XL fit对数据进行非线性回归分析。通过三参数或四参数反曲对数方程来计算IC50值。当拟合 得到的IC50大于最高给药浓度(50μM)或无法拟合得到IC50时，则IC50值标记为“>50μM”。
三参数方程：
四参数方程：
max：最大酶活性。min：最小酶活性。
x：供试品或阳性对照抑制剂的浓度。y：对应浓度下的酶活性。
Hillslope：斜率。
IC50：半抑制浓度。
当最小酶活性在±10％内时使用四参数方程，否则使用三参数方程。
试验结果：A<3μM，B＝3-50μM，C>50μM.
表2受试化合物CYP酶抑制结果
其中，化合物7对CYP3A4-M的IC50相对于非氘化合物提高了80％以上，预期化合物7可以降低酶CYP3A4酶抑制风险。
然而，同样是氘代化合物，化合物19对CYP3A4-M的IC50相对于非氘化合物反而下降了50％以上。同时，其他氘代化合物，也未见化合物7这样的改进效果。
实施例45化合物抗新冠病毒Omicron BA.2株体外药效试验
抗病毒活性测试实验方法：
将Vero细胞以1x104个细胞每孔的密度接种到96孔细胞培养板中并于5％CO2、37℃培养箱中培养。等待细胞完全贴壁后，感染前2小时更换成含2％FBS的培养基并加入相应化合物至指定的浓度(受试化合物起始浓度10μM，4倍稀释)，同时加入p-gp抑制剂CP-100356(终浓度2μM),随后以MOI 0.05接种新冠病毒Omicron BA.2株，待感染72h之后，收集细胞上清提取RNA，通过qPCR检测病毒拷贝数。
使用GraphPad Prism软件对样品的抑制率进行非线性拟合分析，计算化合物的半数有效浓度(EC50)值。
结果显示，受试化合物7对新冠病毒Omicron BA.2株具有良好的抑制活性，优于非氘化合物。
表3受试化合物体外抗Omicron BA.2株活性和细胞毒性
实施例46大鼠体内DDI对比
1.实验材料
SD大鼠：雌性，180-250g，购于维通利华。
试剂：DMSO(二甲亚砜)，CMC-Na，TPGS，生理盐水，肝素，乙腈，甲酸，普萘洛尔(内标)均为市售可得。
仪器：赛默飞LC-MS(U300UPLC，TSQ QUANTUMN ULTRA三重四级杆质谱)。
2.实验方法：
1)将15只大鼠随机分为3组，每组5只，分别灌胃给予空白溶媒、50mg/kg非氘化合物、50mg/kg化合物7，连续给药5天，第5天给药后24h所有组别大鼠安乐死，解剖取肝，用生理盐水清洗后-80℃冻存。
2)冰浴中剪取每个大鼠肝组织样品约200mg，转移至2mL EP管中，将肝组织剪成碎块后，加入3倍量的空白匀浆液(0.25M蔗糖，0.01M Trish-HCL、1mM EDTA,PH7.4)，在EP管中制成匀浆，4℃，9000g离心30分钟，定量吸取200uL上清液转移到新的EP管中，-80℃保存，上清液即为肝S9组分。
3)将制备好的肝S9组分用0.1M磷酸钾稀释100倍后，取30μL肝S9稀释液加入到96孔板中，加入15μL咪达唑仑(15μM)探针底物，37℃预热10min后，加入15μL NADPH(8mM)启动反应，37℃孵育35min后加入将150μL ACN(含内标)终止反应，以4000rpm离心5min，取出上清液100μL加100μL甲醇：水(1:1)稀释，用于样品分析。
4)检测各组所有大鼠肝S9体系中1-羟基咪达唑仑代谢物生成量，通过对比受试物给药组探针底物代谢物生成量与空白溶媒组比例判断各受试物对CYP3A4酶的影响。评价标准：如受试物组活性与空白溶媒组活性比例<1提示受试物可能对CYP3A4有抑制；如受试物组活性与空白溶媒组活性比例>2，提示受试物对CYP3A4具有诱导作用， 标准参考FDA 2012版《药物相互作用指导原则》。
3.实验结果：
试验结果如下表所示：
表4.非氘化合物与化合物7连续给药后对CYP3A4酶活性影响
结果显示等剂量给药后非氘化合物对CYP3A4有明显酶诱导作用，而化合物7对CYP3A4的酶活性无明显影响。对CYP3A4有诱导作用会导致与3A4底物联合用药时加快其药物代谢，降低其体内暴露量，增加代谢物的生成，进而影响其药效和安全性。
注，实施例44、45和46的非氘化合物结构式如下：
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (17)

  1. 一种式(I)所示的螺环化合物，或其异构体、或其消旋体、或其可药用的盐，其特征在于：
    R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11、R12、R13、R14、R15、R16、R17、R18、R19、R20、R21、R22、R23、R24独立的选自氢、氘，且至少其中一个为氘。
  2. 根据权利要求1所述的一种式(I)所示的化合物，或其异构体、或其消旋体、或其可药用的盐，其特征在于：所述的R1选自氘。
  3. 根据权利要求1或2所述的一种式(I)所示的化合物，或其异构体、或其消旋体、或其可药用的盐，其特征在于：所述的R2、R3、R4都选自氘。
  4. 根据权利要求1-3任一项所述的一种式(I)所示的化合物，或其异构体、或其消旋体、或其可药用的盐，其特征在于：所述的R5选自氘。
  5. 根据权利要求1-4任一项所述的一种式(I)所示的化合物，或其异构体、或其消旋体、或其可药用的盐，其特征在于：所述的R6、R7、R8、R9、R10、R11都选自氘。
  6. 根据权利要求1-5任一项所述的一种式(I)所示的化合物，或其异构体、或其消旋体、或其可药用的盐，其特征在于：所述的R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11都选自氘。
  7. 根据权利要求1-6任一项所述的一种式(I)所示的化合物，或其异构体、或其消旋体、或其可药用的盐，其特征在于：所述的R12选自氘。
  8. 根据权利要求1-7任一项所述的一种式(I)所示的化合物，或其异构体、或其消旋体、或其可药用的盐，其特征在于：所述的R13、R14都选自氘。
  9. 根据权利要求1-8任一项所述的一种式(I)所示的化合物，或其异构体、或其消旋体、或其可药用的盐，其特征在于：所述的R15、R16都选自氘。
  10. 根据权利要求1-9任一项所述的一种式(I)所示的化合物，或其异构体、或其消旋体、或其可药用的盐，其特征在于：所述的R17、R18、R19、R20之一为氘或都选自氘。
  11. 根据权利要求1-10任一项所述的一种式(I)所示的化合物，或其异构体、或其消旋体、或其可药用的盐，其特征在于：所述的R21选自氘。
  12. 根据权利要求1-11任一项所述的一种式(I)所示的化合物，或其异构体、或其消旋体、或其可药用的盐，其特征在于：所述的R22、R23、R24都选自氘。
  13. 根据权利要求1-12任一项所述的一种式(I)所示的化合物，或其异构体、或其消旋体、或其可药用的盐，其特征在于，选自：



  14. 根据权利要求1-13任一权利要求所述化合物，或其异构体、或其消旋体、或其可药用的盐，其特征在于，所述药学上可接受的盐是指化合物，或其异构体、或其消旋体、或其可药用的盐与药学上可接受的酸或碱制备。
  15. 一种药物组合物，其特征在于，包含治疗有效量的权利要求1-13任一项所述化合物，或其异构体、或其消旋体、或其可药用的盐和药物可接受的载体。
  16. 权利要求1-13任一项所述化合物，或其异构体、或其消旋体、或其可药用的盐的医药用途，具体地，在制备用于治疗疾病的药物中的用途，所述疾病为3C样蛋白酶抑制剂剂相关疾病。
  17. 根据权利要求16述的用途，其特征在于，所述用途具体优选自冠状病毒的治疗。
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