CN115043900A - 一种拟肽化合物及其制备2019-nCoV主蛋白酶抑制剂的用途 - Google Patents

一种拟肽化合物及其制备2019-nCoV主蛋白酶抑制剂的用途 Download PDF

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Abstract

本发明属于药物研发技术领域，涉及一种新的拟肽化合物、其药学上可接受的盐、其立体异构体或同位素标记物，并进一步公开其用于制备2019‑nCoV主蛋白酶抑制剂的用途。本发明所述拟肽化合物及其衍生物、药学上可接受的盐、立体异构体、互变异构体或同位素标记物，在已知2019‑nCoV主蛋白酶抑制剂PF‑07321332结构基础上，通过引入卤素或脂肪族取代基进而获得新结构化合物，相较于已应用的抑制剂PF‑07321332，本发明所述化合物对2019新型冠状病毒主蛋白酶的抑制活性及药代性质等均得到较好的改善，在治疗2019新型冠状病毒感染导致的新型冠状病毒肺炎(COVID‑19)具有良好的应用前景。

Description

一种拟肽化合物及其制备2019-nCoV主蛋白酶抑制剂的用途
技术领域
本发明属于药物研发技术领域，涉及一种新的拟肽化合物、其药学上可接受的盐、其立体异构体或同位素标记物，并进一步公开其用于制备 2019-nCoV主蛋白酶抑制剂的用途。
背景技术
2019新型冠状病毒(2019-nCoV，亦称为SARS-CoV-2)是一种单链、 正义RNA病毒，属于肉瘤病毒亚属的β冠状病毒。它是一种人畜共患病毒， 同时在人际间也可以传播。2019新型冠状病毒主要通过呼吸道飞沫传播和 接触传播，人感染了冠状病毒后，往往会导致新型冠状病毒肺炎(COVID- 19)，常见症状有呼吸道症状、发热、咳嗽、气促和呼吸困难等，部分感染 患者会进展为重症，引起严重急性呼吸综合征、肾衰竭，甚至导致死亡。鉴 于此，如何遏制病毒的传播，更好地治疗新型冠状病毒肺炎，成为全人类迫 在眉睫的共同议题。
据报道，2019新型冠状病毒的变异较快，目前至少有6种变异毒株被报道，而2021年11月报道的奥密克戎(Omicron)已取代德尔塔(Delta) 成为主要的流行变异株。相对而言，奥密克戎变异株具有更强的免疫逃逸能力(https://www.nature.com/articles/s41392-021-00852-5)和传播能力 (Schmidt,F.et al.Nature https://doi.org/10.1038/s41586-021-04005-0(2021))。这主要是因为，奥密克戎在其刺突蛋白上发生了32中突变(SARS-CoV-2 variants of concern and variants under investigation inEngland，Technical briefing 29)，从而使得疫苗和中和抗体的保护效力降低甚至失效。
研究显示，2019新型冠状病毒的主蛋白酶(也称3C-like protease)是相对保守的蛋白酶，它负责催化病毒的多聚蛋白(pp1a和pp1ab)水解，并产生多个功能性的非结构蛋白，组成复制-转录复合物，以完成后续遗传物质的复制和结构蛋白的合成。因此，通过抑制2019新型冠状病毒主蛋白酶的功能，可干扰病毒的复制过程，达到抗病毒的效果；且由于人体中没有类似结构功能的蛋白酶(Jin,Z.et al.,2020；Rathnayake,A.D.et al.,2020)，故是一个理想的抗病毒作用靶点。有鉴于此，本领域期待开发新的可抑制2019-nCoV主蛋白酶的新型高效药物，为2019新型冠状病毒的防治提供新的思路。
发明内容
为此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种新的拟肽化合物、其药学上可接受的盐、其立体异构体或同位素标记物，并将其应用于2019 新型冠状病毒感染所致的新型冠状病毒肺炎的治疗领域；
本发明所要解决的第二个技术问题在于提供上述拟肽化合物用于制备 2019新型冠状病毒的主蛋白酶抑制剂的用途。
为解决上述技术问题，本发明所述的一种拟肽化合物及其衍生物、药学上可接受的盐、立体异构体、互变异构体或同位素标记物，所述化合物具有如下式(Ⅰ)所示的结构：
Figure BDA0003575365220000021
其中，
所述R1和R2彼此独立地选自氢、卤素、C1-4烷基、芳基或4-6元杂环，上述基团未取代或可选择的被0-5个F原子取代；所述R1和R2彼此独立或者可选择的彼此之间键合形成被0-5个F原子取代的3-6元环系结构；
所述R3和R4彼此独立地选自氢、卤素、C1-4烷基、COR5、芳基或4-6 元杂环，上述基团未取代或可选择的被0-5个F原子取代；且所述R3和R4不同时为氢。
本发明所述的拟肽化合物可以为以前药的形式给药式I化合物。按照本领域技术人员的理解，本身可具有很少或不具有药理活性的式I化合物的某些衍生物当给药体内或身体上时会(例如)通过水解断裂，特别是酯酶或肽酶促进的水解断裂，转化为具有所需活性的式I化合物，这样的衍生物称为“前药”。本领域技术人员通过对式(I)化合物中存在的适当官能团进行修饰 (H.Bundgaard，Design of Prodrugs，Elsevier,1985)从而得到相应的前药。
本发明所述的拟肽化合物可含有不对称或手性中心，因此以不同立体异构形式存在。除非另外规定，否则本发明的化合物的所有立体异构形式以及其混合物，包括外消旋混合物皆为本发明的一部分。
本发明所述的拟肽化合物的所有药学上可接受的同位素标记的式(I) 化合物，其中一个或多个原子被具有相同原子数，但原子质量或质量数不同于在自然界中通常发现的原子质量或质量数的原子替代。被诸如氘的较重同位素取代可提供由较大代谢稳定性产生的某些治疗优势，例如体内半衰期增加或剂量需求降低，因此可能在某些情况下为优选。
本申请所使用的术语“烷基”意指式-CnH(2n+1)直链或支链单价烃基，非限制性实例包括甲基、乙基、丙基、丁基、2-甲基-丙基、1，1-二甲基乙基、戊基及己基。
本申请所使用的术语“环烷基”意指含有至少三个碳原子的式-CnH(2n-1)的环单价烃基，非限制性实例包括环丙基、环丁基、环戊基及环己基。
本申请所使用的术语“烷氧基”意指通过氧原子连接的烷基取代基，非限制性实例包括甲氧基、乙氧基、丙氧基及丁氧基。
本申请所使用的术语“烷氧基羰基氧基”意指通过羰基(-CO-)连接的烷氧基，非限制性实例包括甲氧基羰基、乙氧基羰基及丙氧基羰基。
本申请所使用的术语“烷基羰基氧基”意指通过羰基氧基(-C(＝O)O-) 连接的烷基，代表性实例包括甲基羰基氧基、乙基羰基氧基及叔丁基羰基氧基。
本申请所使用的术语“烷氧基羰基氧基-烷氧基”意指通过烷氧基连接的烷氧基羰基氧基，本申请所使用的术语卤素是指F、Cl、Br、I。
本申请所使用的术语“杂环”是指具有4至7个碳原子的脂杂环和芳杂环类化合物，其中脂杂环的环亚甲基(-CH2-)中的一或多个已被选自-O-、-S- 或-N-的基团替代，其中-N-的化合价要求由H满足或由作为连接点满足；芳杂环指符合休克尔规则(Hückel's rule)的、含有1-2个选自O、S、N原子的5元或6元杂环体系。
本申请所使用的芳基指由不含有杂原子的简单芳香环(如苯环、萘环等)衍生出的官能团或取代基。
具体的，所述拟肽化合物及其衍生物、药学上可接受的盐、立体异构体、互变异构体或同位素标记物，所述R5选自C1-3烷基或环烷基；优选的，所述R5选自C1-3烷基或C1-3环烷基。
具体的，所述拟肽化合物及其衍生物、药学上可接受的盐、立体异构体、互变异构体或同位素标记物，所述4-6元杂环为含有选自氮、氧、硫中的1-2个杂原子的杂环。
优选的，所述拟肽化合物及其衍生物、药学上可接受的盐、立体异构体、互变异构体或同位素标记物：
所述R1和R2彼此独立地选自氢、氟或者被0-3个氟原子取代的C1-4烷基，所述R1和R2彼此独立或者可选择的彼此之间键合形成3-6元环系结构；
所述R3和R4独立地选自氢、卤素、C1-3烷基或者COR5，其中，所述 R5选自C1-3烷基或C1-3环烷基。
优选的，所述拟肽化合物及其衍生物、药学上可接受的盐、立体异构体、互变异构体或同位素标记物：
所述R1、R2彼此独立地选自氟或者被0-3个氟原子取代的C1-4烷基；
所述R3、R4彼此独立地选自氢、氟或者C1-3烷基。
优选的，所述拟肽化合物及其衍生物、药学上可接受的盐、立体异构体、互变异构体或同位素标记物，所述化合物选自如下化合物(1)-(31)：
Figure BDA0003575365220000051
Figure BDA0003575365220000061
优选的，所述拟肽化合物及其衍生物、药学上可接受的盐、立体异构体、互变异构体或同位素标记物，所述化合物选自化合物(1)、(2)、(3)、 (4)、(5)、(6)、(7)、(8)、(11)、(12)、(13)、(14)、(22)、(23)、(24)、 (25)、(26)、(28)、(29)、(30)、(31)；
优选的，所述化合物选自化合物(1)、(2)、(3)、(5)、(7)、(12)、(13)、 (14)、(22)、(23)、(24)、(25)、(28)、(29)、(30)、(31)；
更优选的，所述化合物选自化合物(1)、(3)、(12)、(13)、(14)、(22)、 (23)、(24)、(25)、(31)；
最优选的，所述化合物选自化合物(31)。
本发明还公开了一种制备所述拟肽化合物及其衍生物、药学上可接受的盐、立体异构体、互变异构体或同位素标记物的方法，包括向式(Ⅰ) 所示的化合物分子中的并环上引入选定结构的脂肪族、杂环或芳香性取代基的步骤。
本发明还公开了所述拟肽化合物及其衍生物、药学上可接受的盐、立体异构体、互变异构体或同位素标记物用于制备2019-nCoV主蛋白酶抑制剂的用途。
本发明还公开了所述拟肽化合物及其衍生物、药学上可接受的盐、立体异构体、互变异构体或同位素标记物用于制备治疗2019新型冠状病毒感染导致新型冠状病毒肺炎药物的用途。
具体的，所述拟肽化合物及其衍生物、药学上可接受的盐、立体异构体、互变异构体或同位素标记物，可以单独给药或与药代动力学增强剂、其他抗2019新型冠状病毒药物联合使用。
本发明所述拟肽化合物及其衍生物、药学上可接受的盐、立体异构体、互变异构体或同位素标记物，在已知2019-nCoV主蛋白酶抑制剂 PF-07321332结构基础上，通过引入卤素或脂肪族取代基进而获得新结构化合物，相较于已应用的抑制剂PF-07321332，本发明所述化合物对2019新型冠状病毒主蛋白酶的抑制活性及药代性质等均得到较好的改善；尤其是基于引入氟原子进行取代所得化合物，其抑制效果大幅提高，且在动物体内的暴露量更大，吸收性和药代动力学性质更优，在治疗2019新型冠状病毒感染导致的新型冠状病毒肺炎(COVID-19)具有良好的应用前景。
本发明所述拟肽化合物及其衍生物、药学上可接受的盐、立体异构体、互变异构体或同位素标记物，对2019新型冠状病毒主蛋白酶具有良好的抑制作用，能够通过抑制2019新型冠状病毒主蛋白酶来抑制病毒的复制，可以用于制备治疗治疗2019新型冠状病毒感染所致新型冠状病毒肺炎中的药物，所述抑制剂可单独给药或与药代动力学增强剂、其他抗2019新型冠状病毒药物联合使用，为新型冠状病毒肺炎的治疗提供了新的药物选择。
具体实施方式
本发明如下实施例方案中，所使用的通用缩写包括：CDCl3为氘代氯仿；CO2Et为羧酸乙酯；DCM为二氯甲烷；DIPEA为N,N-二异丙基乙胺； DMF为二甲基甲酰胺；DMSO为二甲基亚砜；EtOAc/EA为乙酸乙酯；H 或h或hr为小时；Na2SO4为硫酸钠；NADH为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(被还原形式)；NAD+为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(被氧化形式)PEP为磷酸烯醇丙酮酸；RT或rt为室温；TFA为三氟乙酸；THF为四氢呋喃；PE为石油醚；DMAP为4-二甲氨基吡啶；TMSCN为三甲基氰硅烷；HATU为2-(7- 偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯；DIBAL为二异丁基氢化铝；DAST为二乙胺基三氟化硫。
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本申请作进一步说明。
实施例1
本实施例用于制备化合物(31)，其名称为(2S)-N-((S)-1-氰基-2-((S)-2- 氧代吡咯烷-3-基)乙基)-3-((S)-3，3-二甲基-2-(2，2，2-三氟乙酰胺基)丁酰基)-5-氟-6，6-二甲基-3-氮杂双环[3.1.0]己烷-2-甲酰胺，结构式如下所示：
Figure BDA0003575365220000081
本实施例所述化合物(31)的合成路线如下所示，具体包括如下步骤：
Figure BDA0003575365220000091
步骤1：((S)-1-氨基-1-氧代-3-((S)-2-氧代吡咯烷-3-基)丙烷-2-基)氨基甲酸 叔丁酯
在室温下，把(S)-2-(叔丁氧基羰基)氨基)-3-((S)-2-氧代吡咯烷-3-基)丙酸甲酯(0.50g，1.74mmol)溶解在氨水(10.0mL)中，反应液在室温下搅拌 3.0小时；过滤反应液，滤饼烘干即得白色固体目标化合物(0.35g，74.1％)；产物检测数据为：MS(ESI,pos.ion)m/z:272.1[M+H]+；
步骤2：((S)-1-氰基-2-((S)-2-氧代吡咯烷-3-基)乙基)氨基甲酸叔丁酯
在室温下，把((S)-1-氨基-1-氧代-3-((S)-2-氧代吡咯烷-3-基)丙烷-2-基) 氨基甲酸叔丁酯(0.350g，1.29mmol)溶解在二氯甲烷(4.0mL)中，再加入三氟乙酸酐(0.8mL)，反应液在室温下搅拌5.0小时；再往反应液中加入饱和氯化钠淬灭，乙酸乙酯(100mL×2)萃取，合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩，所得残留物经硅胶柱层析(PE：EA＝1：1)纯化，得到白色固体目标化合物(0.13g，39.8％)；产物检测数据为：MS(ESI,pos. ion)m/z:254.1[M+H]+；
步骤3：(S)-2-氨基-3-((S)-2-氧代吡咯烷-3-基)丙腈
在室温下，把((S)-1-氰基-2-((S)-2-氧代吡咯烷-3-基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(0.13g，0.51mmol)溶解在二氯甲烷(1.0mL)中，再加入三氟乙酸(2.0mL)，反应液在室温下搅拌1.5小时，减压浓缩反应液得到淡黄色固体目标化合物 (70mg，89.7％)；产物检测数据为：MS(ESI,pos.ion)m/z:154.0[M+H]+；
步骤4：(3R，7aS)-3-苯基四氢-3H，5H-吡咯并[1，2-c]噁唑-5-酮
在室温下，(S)-5-(羟甲基)吡咯烷-2-酮(25.0g，217.2mmol)溶解在甲苯(130.0mL)溶液中，再加入苯甲醛(27.6g，260.6mmol)和对甲苯磺酸 (1.9g，10.9mmol)，加热至回流搅拌过夜；冷却反应液，往反应液中加入水(200mL)，乙酸乙酯(400mL×2)萃取，合并有机相，饱和食盐水(200mL) 洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩，所得混合物经硅胶柱层析(PE： EA＝4：1)，得黄色油状目标化合物(19.4g，44.0％)；产物检测数据为： MS(ESI,pos.ion)m/z:204.0[M+H]+；
步骤5：(3R，7aS)-6-氟-3-苯基四氢-3H，5H-吡咯并[1，2-c]噁唑-5-酮
在室温下，向反应瓶中加入二异丙氨(7.5g，73.8mmol)和THF(150.0mL)，在氮气保护下，降温至-30℃，再滴加正丁基锂(32.5mL，81.2mmol)，保持-20℃搅拌反应20分钟，再降至-50℃，加入(3R，7aS)-3-苯基四氢-3H，5H- 吡咯并[1，2-c]噁唑-5-酮(10.0g，49.2mmol)，低温反应30分钟，取N-氟代双苯磺酰胺(31.0g，98.4mmol)溶解在80mL THF中，在低温下滴加到反应体系中，保持低温反应20分钟，自然升温到室温；再往反应液中加入饱和氯化胺(200mL)淬灭，乙酸乙酯(300mL×3)萃取，合并有机相，饱和食盐水(100mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩，所得混合物经硅胶柱层析(PE：EA＝3：1)，得黄色油状目标化合物(5.2g，47.8％)；产物检测数据为：MS(ESI,pos.ion)m/z:222.0[M+H]+；
步骤6：(3R，7aS)-6-氟-3-苯基-6-(苯基硒基)四氢-3H，5H-吡咯并[1，2-c]噁唑- 5-酮
在室温下，往反应瓶中加入二异丙氨(0.79g，7.79mmol)和THF(20mL)，在氮气保护下，降温至-30℃，再滴加正丁基锂(3.4mL，8.57mmol)，保持-30℃搅拌反应30分钟，再降至-70℃，加入(3R，7aS)-6-氟-3-苯基四氢-3H， 5H-吡咯并[1，2-c]噁唑-5-酮(1.15g，5.19mmol)，低温下反应0.5小时，取苯基次溴硒酸(1.35g，5.7mmol)溶解在2mL THF中，在低温下滴加到反应体系中，保持低温反应30分钟，自然升温到室温。再往反应液中加入饱和氯化胺(40mL)淬灭，乙酸乙酯(50mL×3)萃取，合并有机相，饱和食盐水(100mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩，得黄色油状粗产品 (1.25g)；
步骤7：(3R，7aS)-6-氟-3-苯基-1，7a-二氢-3H，5H-吡咯并[1，2-c]噁唑-5-酮
往反应瓶中加入(3R，7aS)-6-氟-3-苯基-6-(苯基硒基)四氢-3H，5H-吡咯并[1，2-c]噁唑-5-酮(1.25g)和二氯甲烷(10.0mL)，在冰浴下，加入30％的双氧水(2.0mL)和吡啶(1.0mL)，然后自然升温至室温，点板反应完全，往反应液中加水(50mL)，二氯甲烷(50mL×3)萃取，无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩，所得残留物经硅胶柱层析(PE：EA＝1：1)纯化，得无色油状目标化合物(0.23g，20.0％)；产物检测数据为：MS(ESI,pos.ion)m/z: 220.0[M+H]+；
步骤8：(3R,6bS)-5a-氟-6，6-二甲基-3-苯基四氢-3H-环丙基[3，4]吡咯并[1，2- c]噁唑-5(1H)-酮
向反应瓶中加入异丙基三苯基溴化膦(1.3g，3.42mmol)和THF(20mL)，在冰浴条件下，滴加KHMDS(4.5mL，4.56mmol)，保持零度搅拌反应1.5 分钟，加入(3R，7aS)-6-氟-3-苯基-1，7a-二氢-3H，5H-吡咯并[1，2-c]噁唑 -5-酮(0.50g，2.28mmol)，低温下反应2.0小时，自然升温到室温。再往反应液中加入饱和氯化钠淬灭，乙酸乙酯(80mL×3)萃取，合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩，所得残留物经硅胶柱层析(PE：EA＝3： 1)纯化，得无色油状目标化合物(0.14g，23.5％)；产物检测数据为：MS (ESI,pos.ion)m/z:262.1[M+H]+；
步骤9：((2S)-3-苄基-5-氟-6，6-二甲基-3-氮杂双环[3.1.0]己烷-2-基)甲醇
在冰浴条件下，于(3R，6bS)-5a-氟-6，6-二甲基-3-苯基四氢-3H-环丙基[3，4]吡咯并[1，2-c]噁唑-5(1H)-酮(400.0mg，1.53mmol)的四氢呋喃(10.0mL) 溶液中加入四氢铝锂(582.3mg，1.53mmol)，反应液在室温下搅拌3.0小时；加水(50mL)淬灭，过滤，滤液用乙酸乙酯(200mL)萃取两次，无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩，所得残留物经硅胶柱层析(DCM：MeOH＝50： 1)纯化，得无色油状目标化合物(165.0mg，43.3％)；产物检测数据为： MS(ESI,pos.ion)m/z:250.1[M+H]+；
步骤10：((2S)-5-氟-6，6-二甲基-3-氮杂双环[3.1.0]己-2-基)甲醇在室温下，于((2S)-3-苄基-5-氟-6，6-二甲基-3-氮杂双环[3.1.0]己-2-基) 甲醇(300mg，1.2mmol)的甲醇(5.0mL)溶液中加入钯碳(10％，30mg)，用氢气置换空气两次，然后再氢气氛围下室温搅拌过夜；反应完毕，过滤，滤液减压浓缩即得无色油状目标化合物(145.0mg，收率76.0％)；产物检测数据为：MS(ESI,pos.ion)m/z:160.1[M+H]+；
步骤11：(4S)-1-氟-4-(羟甲基)-6，6-二甲基-3-氮杂双环[3.1.0]己烷-3-甲酸叔 丁酯
在室温下，于((2S)-5-氟-6，6-二甲基-3-氮杂双环[3.1.0]己-2-基)甲醇(100.0mg，0.63mmol)的THF(2.0mL)溶液中加入Boc2O(205.6mg， 0.94mmol)，反应液室温搅拌反应1.0小时；加水(60mL)，用乙酸乙酯(100mL) 萃取，无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩，所得残留物经硅胶柱层析(PE： EA＝1：2)纯化，得无色油状目标化合物(128.0mg，78.4％)；产物检测数据为：MS(ESI,pos.ion)m/z:260.1[M+H]+；
步骤12：(2S)-3-(叔丁氧基羰基)-5-氟-6，6-二甲基-3-氮杂双环[3.1.0]己烷-2- 甲酸
在室温下，于(4S)-1-氟-4-(羟甲基)-6，6-二甲基-3-氮杂双环[3.1.0]己烷 -3-甲酸叔丁酯(100.0mg，0.39mmol)的丙酮(1.0mL)溶液中加入琼斯试剂(2M，0.5mL)，反应液室温搅拌反应2.0小时，加100mL水、100mL乙酸乙酯萃取3次，合并有机相，用无水硫酸钠干燥，有机相减压浓缩，经硅胶柱层析(PE：EA＝1：2)纯化，得无色油状目标化合物(80.0mg，收率 75.1％)；产物检测数据为：MS(ESI,pos.ion)m/z:274.0[M+H]+；
步骤13：(4S)-4-(((S)-1-氰基-2-((S)-2-氧代吡咯烷-3-基)乙基)氨基甲酰基)- 1-氟-6，6-二甲基-3-氮杂双环[3.1.0]己烷-3-甲酸叔丁酯
在室温下，于(2S)-3-(叔丁氧基羰基)-5-氟-6，6-二甲基-3-氮杂双环[3.1.0] 己烷-2-甲酸(140.0mg，0.51mmol)的DMF(3.0mL)溶液中加入(S)-2-氨基-3-((S)-2-氧代吡咯烷-3-基)丙腈(86.3mg，0.56mmol)和HATU(251.0mg， 0.66mmol)，室温搅拌反应1.0小时；反应完毕，加100mL水、120mL乙酸乙酯萃取2次，合并有机相，用无水硫酸钠干燥，有机相减压浓缩，经硅胶柱层析(PE：EA＝1：1)纯化，得白色固体目标化合物(165.0mg，收率79.1％)；产物检测数据为：MS(ESI,pos.ion)m/z:409.2[M+H]+；
步骤14：(2S)-N-((S)-1-氰基-2-((S)-2-氧代吡咯烷-3-基)乙基)-5-氟-6，6-二 甲基-3-氮杂双环[3.1.0]己烷-2-甲酰胺
在室温下，于(4S)-4-(((S)-1-氰基-2-((S)-2-氧代吡咯烷-3-基)乙基)氨基甲酰基)-1-氟-6，6-二甲基-3-氮杂双环[3.1.0]己烷-3-甲酸叔丁酯(140.0mg， 0.34mmol)的DCM(1.0mL)溶液中加入三氟乙酸(1.0mL)，室温搅拌反应3.0小时；反应完毕，减压浓缩，得白色固体目标化合物(100.0mg，收率 95.4％)；产物检测数据为：MS(ESI,pos.ion)m/z:309.1[M+H]+；
步骤15：((2S)-1-((4S)-4-(((S)-1-氰基-2-((S)-2-氧代吡咯烷-3-基)乙基)氨 基甲酰基)-1-氟-6，6-二甲基-3-氮杂双环[3.1.0]己-3-基)-3，3-二甲基-1-氧代丁烷-2- 基)氨基甲酸叔丁酯
在室温下，于(2S)-N-((S)-1-氰基-2-((S)-2-氧代吡咯烷-3-基)乙基)-5-氟-6，6-二甲基-3-氮杂双环[3.1.0]己烷-2-甲酰胺(200.0mg，0.65mmol)的DMF (3.0mL)溶液中加入(S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3，3-二甲基丁酸(165.0mg， 0.71mmol)和HATU(370.5mg，0.98mmol)，室温搅拌反应1.0小时；反应完毕，加100mL水、100mL乙酸乙酯萃取2次，合并有机相，用无水硫酸钠干燥，有机相减压浓缩，经硅胶柱层析(PE：EA＝1：1)纯化，得白色固体目标化合物(210.0mg，收率62.0％)；产物检测数据为：MS(ESI,pos.ion) m/z:522.3[M+H]+；
步骤16：(2S)-3-((S)-2-氨基-3，3-二甲基丁酰基)-N-((S)-1-氰基-2-((S)-2-氧 代吡咯烷-3-基)乙基)-5-氟-6，6-二甲基-3-氮杂双环[3.1.0]己烷-2-甲酰胺
室温下，于((2S)-1-((4S)-4-(((S)-1-氰基-2-((S)-2-氧代吡咯烷-3-基)乙基)氨基甲酰基)-1-氟-6，6-二甲基-3-氮杂双环[3.1.0]己-3-基)-3，3-二甲基-1-氧代丁烷-2-基)氨基甲酸叔丁酯(200.0mg，0.38mmol)的DCM(1.0mL)溶液中加入三氟乙酸(1.0mL)，室温搅拌反应2.0小时；反应完毕，减压浓缩，得黄色固体目标化合物(150.0mg，收率93.7％)；产物检测数据为：MS(ESI, pos.ion)m/z:422.1[M+H]+；
步骤17：(2S)-N-((S)-1-氰基-2-((S)-2-氧代吡咯烷-3-基)乙基)-3-((S)-3，3- 二甲基-2-(2，2，2-三氟乙酰胺基)丁酰基)-5-氟-6，6-二甲基-3-氮杂双环[3.1.0]己烷-2- 甲酰胺
在室温下，于(2S)-3-((S)-2-氨基-3，3-二甲基丁酰基)-N-((S)-1-氰基 -2-((S)-2-氧代吡咯烷-3-基)乙基)-5-氟-6，6-二甲基-3-氮杂双环[3.1.0]己烷-2- 甲酰胺(70.0mg，0.17mmol)的DCM(2.0mL)溶液中加入三氟乙酸酐(69.8mg， 0.33mmol)和三乙胺(51.5mg，0.51mmol)，反应液室温搅拌反应2.0小时，加60mL水、60mL乙酸乙酯萃取3次，合并有机相，用无水硫酸钠干燥，有机相减压浓缩，经硅胶柱层析(PE：EA＝1：3)纯化，得白色固体目标化合物(45.0mg，收率51.2％)；产物检测数据为：MS(ESI,pos.ion)m/z:518.2[M +H]+；1H NMR(500MHz,CD3OD):δ4.48-4.51(m,1H),4.32-4.28(m,1H), 4.24(s,1H),3.69-3.27(m,2H),3.20-3.15(m,2H),2.20-2.13(m,3H),2.10-1.95 (m,3H),0.92(s,9H),0.87(s,6H)。可见，本实施例制备化合物结构正确。
实施例2
本实施例用于制备化合物(9)，其名称为1-乙酰基-N-((S)-1-氰基 -2-((S)-2-氧代吡咯烷-3-基)乙基)-3-((S)-3,3-二甲基-2-(2,2,2-三氟乙酰胺)丁酰基)-6,6-二甲基-3-氮杂双环[3.1.0]己烷-2-甲酰胺，结构式如下所示：
Figure BDA0003575365220000151
本实施例所述化合物(9)的合成路线如下所示，具体包括如下步骤：
Figure BDA0003575365220000152
步骤1：N-(叔丁基)-3-甲基丁-2-烯-1-胺
在冰浴下，把叔丁胺(10.0g，136.0mmol)溶解在THF(100mL)溶液中，再依次加入1-溴-3-甲基丁-2-烯(10.2g，68.4mmol)和三乙胺(13.7g, 136.0mmol)，室温下搅拌5小时；往反应液中加入水(150mL)，乙酸乙酯(300mL×2)萃取，合并有机相，饱和食盐水(100mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩，所得混合物经硅胶柱层析(PE：EA＝1：2)，得白色固体目标化合物(1.5g，15.4％)；产物检测数据为：MS(ESI,pos.ion)m/z: 142.0[M+H]+；
步骤2：N-(叔丁基)-N-(3-甲基丁基-2-烯-1-基)-3-氧代丁酰胺
在室温下，把N-(叔丁基)-3-甲基丁-2-烯-1-胺(1.0g，7.0mmol)溶解在甲苯(10.0mL)溶液中，再依次加入3-氧代丁酸叔丁酯(1.6g，10.5mmol) 和DMAP(0.17g，1.4mmol)，加热回流过夜；再冷却反应液，往反应液中加入水(200mL)、乙酸乙酯(100mL×3)萃取，合并有机相，饱和食盐水 (200mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩，所得混合物经硅胶柱层析(PE：EA＝5：1)，得白色固体目标化合物(0.60g，38.0％)；产物检测数据为：MS(ESI,pos.ion)m/z:226.0[M+H]+；
步骤3：2-溴-N-(叔丁基)-N-(3-甲基丁基-2-烯-1-基)-3-氧代丁酰胺
在室温条件下，于N-(叔丁基)-N-(3-甲基丁基-2-烯-1-基)-3-氧代丁酰胺(0.60g，2.60mmol)的乙酸乙酯(10.0mL)溶液中加NBS(0.62g，3.5mmol)，室温搅拌3.0小时，缓慢加水淬灭，用乙酸乙酯(100mL×3)萃取，合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩，所得残留物经硅胶柱层析(PE:EA ＝5:1)纯化，得白色固体目标化合物(0.31g，39.2％)；产物检测数据为： MS(ESI,pos.ion)m/z:304.0[M+H]+；
步骤4：3-乙酰基-4-(2-溴丙烷-2-基)-1-(叔丁基)吡咯烷-2-酮
在-78℃条件下，于2-溴-N-(叔丁基)-N-(3-甲基丁基-2-烯-1-基)-3-氧代丁酰胺(0.30g，0.99mmol)的四氢呋喃(5.0mL)溶液中，在氧气环境下，加入三氟甲烷磺酸镱(1.2g，1.97mmol)和三乙基硼溶液(1.97mL，1.0M)，在-78℃条件下搅拌2小时；然后缓慢升至室温，往反应液中加水(100mL) 淬灭，乙酸乙酯(200mL×2)萃取，无水硫酸钠干燥，过滤、减压浓缩，所得残留物经硅胶柱层析(PE：EA＝3：1)纯化，得无色油状目标化合物(0.15g，50.0％)；产物检测数据为：MS(ESI,pos.ion)m/z:304.0[M+H]+；
步骤5：1-乙酰基-3-(叔丁基)-6，6-二甲基-3-氮杂双环[3.1.0]己-2-酮
在冰浴下，于3-乙酰基-4-(2-溴丙烷-2-基)-1-(叔丁基)吡咯烷-2-酮(0.10g，0.33mmol)的四氢呋喃(3.0mL)溶液中加入氢化钠(40.0mg，0.99mmol)，反应液在室温下搅拌0.5小时；往反应液中加水(30mL)淬灭，乙酸乙酯 (100mL)萃取，无水硫酸钠干燥，过滤、减压浓缩，所得残留物经硅胶柱层析(PE：EA＝5：1)纯化，得无色油状目标化合物(60.0mg，81.5％)；产物检测数据为：MS(ESI,pos.ion)m/z:224.1[M+H]+；
步骤6：1-乙酰基-3-(叔丁基)-6，6-二甲基-3-氮杂双环[3.1.0]己烷-2-腈
在室温下，于1-乙酰基-3-(叔丁基)-6，6-二甲基-3-氮杂双环[3.1.0]己-2- 酮(100mg，0.45mmol)的四氢呋喃(5.0mL)溶液中加入氢氯二茂锆(228.5mg， 0.90mmol)，反应液在室温下搅拌2小时；然后在加入TMSCN(89.1mg， 0.90mmol)，再在室温下搅拌5.0小时，加水(30mL)、乙酸乙酯(100mL×2) 萃取，合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤、减压浓缩，所得残留物经硅胶柱层析(PE：EA＝1：1)纯化，得无色油状目标化合物(45.0mg，56.1％)；产物检测数据为：MS(ESI,pos.ion)m/z:235.1[M+H]+；
步骤7：1-乙酰基-6，6-二甲基-3-氮杂双环[3.1.0]己烷-2-腈
在室温条件下，向1-乙酰基-3-(叔丁基)-6，6-二甲基-3-氮杂双环[3.1.0] 己烷-2-腈(70.0mg，0.30mmol)的DCM(1.0mL)溶液中加入三氟乙酸 (2.0mL)，在氮气保护下，室温搅拌5.0小时，减压浓缩反应液得到粗产品 (45.0mg，84.0％)，未经进一步纯化直接用于下一步反应；产物检测数据为：MS(ESI,pos.ion)m/z:179.0[M+H]+；
步骤8：1-乙酰基-6，6-二甲基-3-氮杂双环[3.1.0]己烷-2-甲酸甲酯
在冰浴条件下，于1-乙酰基-6，6-二甲基-3-氮杂双环[3.1.0]己烷-2-腈(110.0mg，0.62mmol)的甲醇(5.0mL)溶液中加入浓盐酸(2.0mL)，反应液加热回流搅拌5.0小时；冷却反应液，加水(50mL)，用5％NaOH调节pH至中性，乙酸乙酯(100mL×2)萃取，无水硫酸钠干燥，过滤、减压浓缩，所得残留物经硅胶柱层析(DCM：MeOH＝10：1)纯化，得无色油状目标化合物(57.0mg，43.5％)；产物检测数据为：MS(ESI,pos.ion)m/z: 212.0[M+H]+；
步骤9：1-乙酰基-3-((S)-2-(叔丁氧基羰基)氨基)-3，3-二甲基丁酰基)-6，6-二 甲基-3-氮杂双环[3.1.0]己烷-2-甲酸甲酯
在室温下，于1-乙酰基-6，6-二甲基-3-氮杂双环[3.1.0]己烷-2-甲酸甲酯(70.0mg，0.33mmol)的DMF(2.0mL)溶液中加入(S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3，3-二甲基丁酸(84.2mg，0.36mmol)和HATU(250.8mg，0.66mmol)，室温搅拌反应2.0小时；反应完毕，加30mL水、100mL乙酸乙酯萃取2 次，合并有机相，用无水硫酸钠干燥，有机相减压浓缩，经硅胶柱层析(PE： EA＝2：1)纯化，得白色固体目标化合物(110.0mg，收率78.6％)；产物检测数据为：MS(ESI,pos.ion)m/z:425.2[M+H]+；
步骤10：1-乙酰基-3-((S)-2-氨基-3，3-二甲基丁酰基)-6，6-二甲基-3-氮杂双环 [3.1.0]己烷-2-甲酸甲酯
在常温下，于1-乙酰基-3-((S)-2-(叔丁氧基羰基)氨基)-3，3-二甲基丁酰基)-6，6-二甲基-3-氮杂双环[3.1.0]己烷-2-甲酸甲酯(50.0mg，0.12mmol) 的DCM(1.0mL)溶液中加入三氟乙酸(1.0mL)，反应液室温搅拌反应2.0 小时；减压浓缩反应液，得淡黄色固体目标化合物(40.0mg，收率100.0％)；产物检测数据为：MS(ESI,pos.ion)m/z:325.2[M+H]+；
步骤11：1-乙酰基-3-((S)-3，3-二甲基-2-(2，2，2-三氟乙酰胺基)丁酰基)-6，6- 二甲基-3-氮杂双环[3.1.0]己烷-2-甲酸甲酯
在室温下，于1-乙酰基-3-((S)-2-氨基-3，3-二甲基丁酰基)-6，6-二甲基 -3-氮杂双环[3.1.0]己烷-2-甲酸甲酯(50.0mg，0.15mmol)的DCM(1.0mL) 溶液中加入三氟乙酸酐(64.8mg，0.30mmol)，反应液室温搅拌反应1.0小时，加40mL水、200mL乙酸乙酯萃取3次，合并有机相，用无水硫酸钠干燥，有机相减压浓缩，经硅胶柱层析(PE：EA＝3：1)纯化，得白色固体目标化合物(37.0mg，收率58.7％)；产物检测数据为：MS(ESI,pos.ion) m/z:421.1[M+H]+；
步骤12：1-乙酰基-3-((S)-3，3-二甲基-2-(2，2，2-三氟乙酰胺基)丁酰基)-6，6- 二甲基-3-氮杂双环[3.1.0]己烷-2-甲酸甲酯
在室温下，于1-乙酰基-3-((S)-3，3-二甲基-2-(2，2，2-三氟乙酰胺基) 丁酰基)-6，6-二甲基-3-氮杂双环[3.1.0]己烷-2-甲酸甲酯(50.0mg，0.12mmol) 的甲醇(2.0mL)和水溶液(2.0mL)中加入氢氧化锂(47.6mg，1.2mmol)，反应液室温搅拌反应5.0小时，加40mL水，用5％HCl调pH至中性，用 100mL乙酸乙酯萃取2次，合并有机相，用无水硫酸钠干燥，有机相减压浓缩，经硅胶柱层析(PE：EA＝1：2)纯化，得白色固体目标化合物(36.0mg，收率74.1％)；产物检测数据为：MS(ESI,pos.ion)m/z:407.1[M+H]+；
步骤13：1-乙酰基-N-((1S)-1-氰基-2-(2-氧代吡咯烷-3-基)乙基)-3-((S)-3，3- 二甲基-2-(2，2，2-三氟乙酰胺基)丁酰基)-6，6-二甲基-3-氮杂双环[3.1.0]己烷-2-甲酰 胺
在室温下，于1-乙酰基-3-((S)-3，3-二甲基-2-(2，2，2-三氟乙酰胺基) 丁酰基)-6，6-二甲基-3-氮杂双环[3.1.0]己烷-2-甲酸甲酯(50.0mg，0.12mmol) 的DMF(2.0mL)溶液中加入(2S)-2-氨基-3-(2-氧代吡咯烷-3-基)丙腈(20.7mg， 0.12mmol)和HATU(93.4mg，0.25mmol)，室温搅拌反应1.0小时；反应完毕，加60mL水、100mL乙酸乙酯萃取2次，合并有机相，用无水硫酸钠干燥，有机相减压浓缩，经硅胶柱层析(PE：EA＝1：2)纯化，得白色固体目标化合物(27.0mg，收率40.5％)；产物检测数据为：MS(ESI,pos.ion) m/z:542.2[M+H]+；1HNMR(500MHz,DMSO-d6):δ9.20(s,1H),9.01(s,1H), 7.1(s,1H)4.99-4.90(m,1H),4.42(s,1H),4.20(s,1H),3.93-3.90(m,1H), 3.70-3.64(m,1H),3.18-3.02(m,2H),2.41-2.36(m,1H),2.17-2.08(m,2H), 1.79-1.68(m,3H),1.58-1.51(m,1H),1.25-1.23(m,1H),0.92(s,10H),0.87(s, 6H)。可见，本实施例制备化合物结构正确。
实施例3
本实施例用于制备化合物(12)，其名称为N-((S)-1-氰基-2-((S)-2-氧代吡咯烷-3-基)乙基)-1-(1,1-二氟乙基)-3-((S)-3,3-二甲基-2-(2,2,2-三氟乙酰胺) 丁酰基)-6,6-二甲基-3-氮杂双环[3.1.0]己烷-2-甲酰胺，结构式如下所示：
Figure BDA0003575365220000201
本实施例所述化合物(12)的具体制备方法包括如下步骤：
步骤1：3-(叔丁基)-1-(1，1-二氟乙基)-6，6-二甲基-3-氮杂双环[3.1.0]己-2-酮
在冰浴条件下，1-乙酰基-3-(叔丁基)-6，6-二甲基-3-氮杂双环[3.1.0]己 -2-酮(0.5g，2.2mmol)溶解在DAST(5.0mL)溶液中，再加入催化量的乙醇，封管加热回流过夜；冷却反应液，往反应液中加入水(50mL)、乙酸乙酯(100mL×2)萃取，合并有机相，饱和食盐水(100mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩，所得混合物经硅胶柱层析(PE：EA＝5：1)，得白色固体目标化合物(0.26g，48.9％)；产物检测数据为：MS(ESI,pos.ion) m/z:246.1[M+H]+；
步骤2：3-(叔丁基)-1-(1，1-二氟乙基)-6，6-二甲基-3-氮杂双环[3.1.0]己-2-醇
在室温下，把3-(叔丁基)-1-(1，1-二氟乙基)-6，6-二甲基-3-氮杂双环 [3.1.0]己-2-酮(100.0mg，0.45mmol)溶解在THF(2.0mL溶液中，再加入 DIBAL(2M，3.0mL)，室温搅拌3.0小时；往反应液中加入水(100mL)、乙酸乙酯(100mL×2)萃取，合并有机相，饱和食盐水(100mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤、减压浓缩，所得混合物经硅胶柱层析(PE：EA＝1：1)纯化，得白色固体目标化合物(75.0mg，67.2％)；产物检测数据为：MS(ESI,pos.ion)m/z:248.1[M+H]+；
步骤3：3-(叔丁基)-1-(1，1-二氟乙基)-2-甲氧基-6，6-二甲基-3-氮杂双环 [3.1.0]己烷
在室温条件下，于3-(叔丁基)-1-(1，1-二氟乙基)-6，6-二甲基-3-氮杂双环[3.1.0]己-2-醇(30mg，0.13mmol)的甲苯(2.0mL)溶液中加对甲苯磺酸 (5mg)和甲醇(40mg，0.26mmol)，反应液加热70℃反应5小时，冷却反应液，缓慢加水淬灭，用乙酸乙酯(50mL×3)萃取，合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤、减压浓缩，所得残留物经硅胶柱层析(PE：EA＝1：1) 纯化，得白色固体目标化合物(20mg，64.0％)；产物检测数据为：MS(ESI,pos.ion)m/z:262.1[M+H]+；
步骤4：3-(叔丁基)-1-(1，1-二氟乙基)-6，6-二甲基-3-氮杂双环[3.1.0]己烷-2- 腈
在室温条件下，于3-(叔丁基)-1-(1，1-二氟乙基)-2-甲氧基-6，6-二甲基 -3-氮杂双环[3.1.0]己烷(0.15g，0.57mmol)的四氢呋喃(3.0mL)溶液中，加入TMSCN(0.19g，2.87mmol)，反应液加热回流搅拌4小时；冷却反应液，往反应液中加水(50mL)淬灭，乙酸乙酯(100mL)萃取，无水硫酸钠干燥，过滤、减压浓缩，所得残留物经硅胶柱层析(PE：EA＝1：1)纯化，得无色油状目标化合物(0.11g，75.3％)；产物检测数据为：MS(ESI,pos. ion)m/z:257.1[M+H]+；
步骤5：1-(1，1-二氟乙基)-6，6-二甲基-3-氮杂双环[3.1.0]己烷-2-腈
在室温条件下，3-(叔丁基)-1-(1，1-二氟乙基)-6，6-二甲基-3-氮杂双环[3.1.0]己烷-2-腈(100.0mg，0.39mmol)溶解在三氟乙酸(2.0mL)溶液中，在氮气保护下，室温搅拌5.0小时；减压浓缩反应液得到粗产品直接用于下一步反应(61.0mg，78.2％)；产物检测数据为：MS(ESI,pos.ion)m/z:200.0[M +H]+；
步骤6：1-(1，1-二氟乙基)-6，6-二甲基-3-氮杂双环[3.1.0]己烷-2-甲酸甲酯
在冰浴条件下，于1-(1，1-二氟乙基)-6，6-二甲基-3-氮杂双环[3.1.0] 己烷-2-腈(110.0mg，0.55mmol)的甲醇(3.0mL)溶液中加入浓盐酸(0.4mL)，反应液加热回流搅拌3.0小时；冷却反应液，加水(50mL)，用5％的NaOH 溶液调节pH至中性，乙酸乙酯(200mL)萃取，无水硫酸钠干燥，过滤、减压浓缩，所得残留物经硅胶柱层析(DCM：MeOH＝30：1)纯化，得无色油状目标化合物(49.0mg，38.2％)；产物检测数据为：MS(ESI,pos.ion) m/z:234.1[M+H]+；
步骤7：3-((S)-2-(叔丁氧基羰基)氨基)-3，3-二甲基丁酰基)-1-(1，1-二氟乙 基)-6，6-二甲基-3-氮杂双环[3.1.0]己烷-2-甲酸甲酯
在室温下，于1-(1，1-二氟乙基)-6，6-二甲基-3-氮杂双环[3.1.0]己烷-2- 甲酸甲酯(100mg，0.43mmol)的DMF(3.0mL)溶液中加入(S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3，3-二甲基丁酸(99.1mg，0.43mmol)和HATU(326.8mg， 0.86mmol)，室温搅拌反应1.0小时；反应完毕，加50mL水，乙酸乙酯萃取(60mL×3)，合并有机相，用无水硫酸钠干燥，有机相减压浓缩，经硅胶柱层析(PE：EA＝1：1)纯化，得白色固体目标化合物(140.0mg，收率 73.0％)；产物检测数据为：MS(ESI,pos.ion)m/z:447.2[M+H]+；
步骤8：3-((S)-2-氨基-3，3-二甲基丁酰基)-1-(1，1-二氟乙基)-6，6-二甲基-3- 氮杂双环[3.1.0]己烷-2-甲酸甲酯
室温下，于3-(2-(叔丁氧基羰基)氨基)-3，3-二甲基丁酰基)-1-(1，1-二氟乙基)-6，6-二甲基-3-氮杂双环[3.1.0]己烷-2-甲酸甲酯(100.0mg，0.22mmol) 的DCM(1.0mL)溶液中加入三氟乙酸(1.0mL)，反应液室温搅拌反应2.0 小时；减压浓缩反应液，得淡黄色固体目标化合物(76.0mg，收率99.8％)；产物检测数据为：MS(ESI,pos.ion)m/z:347.2[M+H]+；
步骤9：1-(1，1-二氟乙基)-3-((S)-3，3-二甲基-2-(2，2，2-三氟乙酰胺基)丁酰 基)-6，6-二甲基-3-氮杂双环[3.1.0]己烷-2-甲酸甲酯
在室温下，于3-((S)-2-氨基-3，3-二甲基丁酰基)-1-(1，1-二氟乙基)-6， 6-二甲基-3-氮杂双环[3.1.0]己烷-2-甲酸甲酯(75.0mg，0.22mmol)的DCM (3.0mL)溶液中加入三氟乙酸酐(136.5mg，0.66mmol)和三乙胺(66.6mg， 0.66mmol)，反应液室温搅拌反应2.0小时，加100mL水、200mL乙酸乙酯萃取2次，合并有机相，用无水硫酸钠干燥，有机相减压浓缩，经硅胶柱层析(PE：EA＝1：1)纯化，得白色固体目标化合物(64.0mg，收率65.8％)；产物检测数据为：MS(ESI,pos.ion)m/z:443.1[M+H]+；
步骤10：1-(1，1-二氟乙基)-3-((S)-3，3-二甲基-2-(2，2，2-三氟乙酰胺基)丁酰 基)-6，6-二甲基-3-氮杂双环[3.1.0]己烷-2-甲酸甲酯
在室温下，于1-(1，1-二氟乙基)-3-((S)-3，3-二甲基-2-(2，2，2-三氟乙酰胺基)丁酰基)-6，6-二甲基-3-氮杂双环[3.1.0]己烷-2-甲酸甲酯(50.0mg， 0.11mmol)的甲醇(1.0mL)和水溶液(1.0mL)中加入氢氧化锂(47.5mg， 1.1mmol)，反应液室温搅拌反应2.0小时，加40mL水，并用5％HCl调pH 至中性，用50mL乙酸乙酯萃取3次，合并有机相，用无水硫酸钠干燥，有机相减压浓缩，经硅胶柱层析(PE：EA＝1：3)纯化，得白色固体目标化合物(41.0mg，收率87.0％)；产物检测数据为：MS(ESI,pos.ion)m/z: 429.1[M+H]+；
步骤11：N-((S)-1-氰基-2-((S)-2-氧代吡咯烷-3-基)乙基)-1-(1,1-二氟乙基)- 3-((S)-3,3-二甲基-2-(2,2,2-三氟乙酰胺)丁酰基)-6,6-二甲基-3-氮杂双环[3.1.0]己 烷-2-甲酰胺
在室温下，于(1S，5R)-1-(1，1-二氟乙基)-3-(3，3-二甲基-2-(2，2，2- 三氟乙酰胺基)丁酰基)-6，6-二甲基-3-氮杂双环[3.1.0]己烷-2-甲酸(50.0mg， 0.12mmol)的DMF(3.0mL)溶液中加入(S)-2-氨基-3-((S)-2-氧代吡咯烷-3- 基)丙腈(21.9mg，0.13mmol)和HATU(66.1mg，0.17mmol)，室温搅拌反应3.0小时；反应完毕，加50mL水、100mL乙酸乙酯萃取2次，合并有机相，用无水硫酸钠干燥，有机相减压浓缩，经硅胶柱层析(PE：EA＝1： 2)纯化，得白色固体目标化合物(34.5mg，收率51.2％)。产物检测数据为：MS(ESI,pos.ion)m/z:564.2[M+H]+；1H NMR(500MHz,CDCl3):δ9.95(s, 1H),9.43(s,1H),8.12(s,1H)4.90-4.89(m,1H),4.54-4.52(m,1H),4.33-4.23(m, 1H),4.07-3.95(m,1H),3.80-3.76(m,1H),3.38-3.24(m,2H),2.46-2.30(m,2H), 2.20-2.18(m,1H),1.89-1.80(m,3H),1.55-1.51(m,1H),1.35-1.30(m,2H), 0.96(s,9H),0.90(s,6H)。可见，本实施制备产物结构正确。
实验例
1、体外酶学活性实验：
本方法参考并使用碧云天公司的产品新型冠状病毒(2019-nCoV) Mpro/3CLpro抑制剂筛选试剂盒(货号：PS0312M)进行抑制剂活性筛选。该产品采用荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer，FRET) 的原理进行。
实验方法：取黑底96孔板，每孔按照试剂盒反应体系说明书所需依次加入重组主蛋白酶(3C-like protease)酶溶液或、受试物或溶剂，37℃孵育 15min，随后加入底物，37℃孵育1h。其中，每个受试物设置8个浓度，每个浓度设置2个复孔，同时设置阳性对照组、阴性对照组(OSU)、仅加底物的空白对照组(NSU)。各试剂具体加样信息详见下表1。
表1抑制率测定试验试剂添加量
Figure BDA0003575365220000241
试剂盒相关信息：(名称：新型冠状病毒Mpro/3CLpro抑制剂筛选试剂盒；试剂来源：碧云天；规格：100T；保存条件：-20℃。)
酶标仪分别于加入底物后1min内及1h后以EX/EM＝325/393nm波长检测信号，并按照如下公式计算抑制率，使用graphpad prism拟合曲线计算半数抑制浓度(IC50)。
抑制率％＝1-[(OSUFI值-给药组FI值)/(OSUFI值-NSUFI值)]×100％。
按照如上所述方法步骤，分别测试本发明实施例1-3所述化合物和对照化合物(PF-07321332)的生物数据，其中，对照化合物PF-07321332为参照WO2021/250648中公布的方法合成得到，其结构式如下：
Figure BDA0003575365220000251
上述生物数据试验结果见下表2所示。
表2体外酶学活性数据
化合物编号 IC<sub>50</sub>(nM)
实施例1化合物 12.7
实施例2化合物 24.5
实施例3化合物 20.3
对照化合物PF-07321332 26.2
由上述试验结果可知，本发明实施例1合成化合物对于己酮糖激酶具有明显的良好的抑制效果，而实施例2-3中所述化合物与对照化合物 PF-07321332具有近似的技术效果，抑制效果均较好。
2、静脉注射或口服定量本发明化合物后的药代动力学评价
本实验例分别对上述实施例1-3中化合物和对照化合物在SD大鼠、犬或猴子体内的药代动力学研究进行了评估。
本发明实施例1-3中化合物以5％DMSO+5％Kolliphor HS15+90％Saline 的生理盐水溶液进行给药。
对于静脉注射(iv)给药，动物给予1mg/kg的剂量，分别在时间点为 0.083、0.25、0.5、1.0、2.0、5.0、7.0和24小时进行取血(0.3mL)，并在3000或4000rpm条件下离心10分钟。
对于口服(po)给药，动物给予5mg/kg的剂量，并分别在时间点为 0.25、0.5、1.0、2.0、5.0、7.0和24小时进行取血(0.3mL)，并在3000或 4000rpm条件下离心10分钟。
收集血浆溶液，并于-20℃或-70℃下保存直到进行上述的LC/MS/MS 分析，结果见下表3。
表3部分化合物在SD大鼠体内的药代动力学数据
Figure BDA0003575365220000261
由表3数据可知，本发明合成化合物在动物体内的暴露量更大，吸收性良好，其药代动力学性质良好，相对于对照化合物，其性能更优。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (10)

1.一种拟肽化合物及其衍生物、药学上可接受的盐、立体异构体、互变异构体或同位素标记物，其特征在于，所述化合物具有如下式(Ⅰ)所示的结构：
Figure FDA0003575365210000011
其中，
所述R1和R2彼此独立地选自氢、卤素、C1-4烷基、芳基或4-6元杂环，上述基团未取代或可选择的被0-5个F原子取代；所述R1和R2彼此独立或者可选择的彼此之间键合形成被0-5个F原子取代的3-6元环系结构；
所述R3和R4彼此独立地选自氢、卤素、C1-4烷基、COR5、芳基或4-6元杂环，上述基团未取代或可选择的被0-5个F原子取代；且所述R3和R4不同时为氢。
2.根据权利要求1所述拟肽化合物及其衍生物、药学上可接受的盐、立体异构体、互变异构体或同位素标记物，其特征在于，所述R5选自C1-3烷基或环烷基；优选的，所述R5选自C1-3烷基或C1-3环烷基。
3.根据权利要求1或2所述拟肽化合物及其衍生物、药学上可接受的盐、立体异构体、互变异构体或同位素标记物，其特征在于，所述4-6元杂环为含有选自氮、氧、硫中的1-2个杂原子的杂环。
4.根据权利要求1-3任一项所述拟肽化合物及其衍生物、药学上可接受的盐、立体异构体、互变异构体或同位素标记物，其特征在于：
所述R1和R2彼此独立地选自氢、氟或者被0-3个氟原子取代的C1-4烷基，所述R1和R2彼此独立或者可选择的彼此之间键合形成3-6元环系结构；
所述R3和R4独立地选自氢、卤素、C1-3烷基或者COR5，其中，所述R5选自C1-3烷基或C1-3环烷基。
5.根据权利要求1-4任一项所述拟肽化合物及其衍生物、药学上可接受的盐、立体异构体、互变异构体或同位素标记物，其特征在于：
所述R1、R2彼此独立地选自氟或者被0-3个氟原子取代的C1-4烷基；
所述R3、R4彼此独立地选自氢、氟或者C1-3烷基。
6.根据权利要求1-5任一项所述拟肽化合物及其衍生物、药学上可接受的盐、立体异构体、互变异构体或同位素标记物，其特征在于，所述化合物选自如下化合物(1)-(31)：
Figure FDA0003575365210000021
Figure FDA0003575365210000031
7.根据权利要求6所述拟肽化合物及其衍生物、药学上可接受的盐、立体异构体、互变异构体或同位素标记物，其特征在于，所述化合物选自化合物(1)、(2)、(3)、(4)、(5)、(6)、(7)、(8)、(11)、(12)、(13)、(14)、(22)、(23)、(24)、(25)、(26)、(28)、(29)、(30)、(31)；
优选的，所述化合物选自化合物(1)、(2)、(3)、(5)、(7)、(12)、(13)、(14)、(22)、(23)、(24)、(25)、(28)、(29)、(30)、(31)；
更优选的，所述化合物选自化合物(1)、(3)、(12)、(13)、(14)、(22)、(23)、(24)、(25)、(31)；
最优选的，所述化合物选自化合物(31)。
8.一种制备权利要求1-7任一项所述拟肽化合物及其衍生物、药学上可接受的盐、立体异构体、互变异构体或同位素标记物的方法，其特征在于，包括向式(Ⅰ)所示的化合物分子中的并环上引入选定结构的脂肪族、杂环或芳香性取代基的步骤。
9.权利要求1-7任一项所述拟肽化合物及其衍生物、药学上可接受的盐、立体异构体、互变异构体或同位素标记物用于制备2019-nCoV主蛋白酶抑制剂的用途。
10.权利要求1-7任一项所述拟肽化合物及其衍生物、药学上可接受的盐、立体异构体、互变异构体或同位素标记物用于制备治疗2019新型冠状病毒感染导致新型冠状病毒肺炎药物的用途。
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