WO2024004647A1 - 従属栄養性微細藻類及びその用途、並びに従属栄養性微細藻類中のγ－アミノ酪酸を増加させる方法 - Google Patents

従属栄養性微細藻類及びその用途、並びに従属栄養性微細藻類中のγ－アミノ酪酸を増加させる方法 Download PDF

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medium
heterotrophic microalgae
microalgae
culture
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清志 多田
大地 高田
英祐 日高
順子 伊藤
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株式会社AlgaleX
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    • C12N1/12—Unicellular algae; Culture media therefor

Definitions

  • the present invention relates to heterotrophic microalgae, uses thereof, and methods for increasing ⁇ -aminobutyric acid in heterotrophic microalgae.
  • GABA Gamma-aminobutyric acid
  • ⁇ -Aminobutyric acid is widely distributed in nature and is biosynthesized from glutamic acid in vivo. In the mammalian brain, ⁇ -aminobutyric acid acts as an inhibitory neurotransmitter, improving brain function, relaxing, stress-reducing, and lowering blood pressure, and also has the ability to improve sleep quality. It has been reported that
  • Patent Document 1 listed below discloses microalgae belonging to the family Pavlovaceae (strain OPMS30543 and strain OPMS30543X) containing ⁇ -aminobutyric acid.
  • Patent Document 2 listed below discloses an algae belonging to the class Ideyucogonaceae that contains ⁇ -aminobutyric acid.
  • Patent Document 3 listed below discloses Idyukogome cells containing ⁇ -aminobutyric acid.
  • heterotrophic microalgae Some microalgae exhibit heterotrophic properties (heterotrophic microalgae).
  • heterotrophic microalgae refers to microalgae that can be cultured and proliferated without light irradiation by providing an organic carbon source, rather than through photosynthetic culture, which requires light irradiation. It is an algae with special properties.
  • the main purpose of the present invention is to provide heterotrophic microalgae with a high content of ⁇ -aminobutyric acid. Further, the main object of the present invention is to provide a method for increasing the content of ⁇ -aminobutyric acid in heterotrophic microalgae.
  • heterotrophic microalgae take up ⁇ -aminobutyric acid contained in the culture medium and accumulate it within the algal bodies.
  • the present inventors established a technique for increasing ⁇ -aminobutyric acid in heterotrophic microalgae and a technique for obtaining heterotrophic microalgae containing a large amount of ⁇ -aminobutyric acid.
  • the present inventors also discovered a method for recovering ⁇ -aminobutyric acid contained in a culture medium using heterotrophic microalgae.
  • the present invention has been completed as a result of these findings.
  • the present invention provides heterotrophic microalgae having a content of ⁇ -aminobutyric acid of 100 mg or more per 100 g of dry algal bodies.
  • the heterotrophic microalgae may be microalgae belonging to Thraustochytriales.
  • the heterotrophic microalgae may be microalgae belonging to the genus Aurantiochytrium.
  • the present invention also provides foods, medicines, or feeds containing the heterotrophic microalgae.
  • the present invention also provides a method for increasing the content of ⁇ -aminobutyric acid in heterotrophic microalgae, which comprises culturing the heterotrophic microalgae in a medium containing ⁇ -aminobutyric acid.
  • the present invention also provides a method for recovering ⁇ -aminobutyric acid from a medium, which includes the steps of culturing heterotrophic microalgae in a medium containing ⁇ -aminobutyric acid, and collecting the heterotrophic microalgae.
  • the present invention comprises the steps of preparing a medium using a composition containing ⁇ -aminobutyric acid, culturing heterotrophic microalgae in the medium, and collecting the heterotrophic microalgae.
  • the present invention also provides a method for producing food, medicine, or feed comprising using heterotrophic microalgae cultured in a medium containing ⁇ -aminobutyric acid.
  • the present invention provides heterotrophic microalgae with a high content of ⁇ -aminobutyric acid.
  • the present invention also provides a method for increasing the content of ⁇ -aminobutyric acid in heterotrophic microalgae. Note that the effects of the present invention are not limited to the effects described herein, and may be any of the effects described within this specification.
  • the content of ⁇ -aminobutyric acid is 100 mg or more per 100 g of dry algae.
  • the content of the ⁇ -aminobutyric acid per 100 g of dry algae is, for example, 120 mg or more, 140 mg or more, 160 mg or more, 180 mg or more, 200 mg or more, 220 mg or more, 240 mg or more, 260 mg or more, 280 mm or more, 300 mg or more, 350 mg or more, It may be 400 mg or more, 450 mg or more, 500 mg or more, or 550 mg or more.
  • the heterotrophic microalgae according to the present embodiment can be obtained by culturing the heterotrophic microalgae in a medium containing ⁇ -aminobutyric acid, and can be obtained by culturing the heterotrophic microalgae in a medium not containing at least ⁇ -aminobutyric acid.
  • the content of ⁇ -aminobutyric acid in the algae is higher than that of heterotrophic microalgae. That is, the heterotrophic microalgae according to the present embodiment is a heterotrophic microalgae containing a high content of ⁇ -aminobutyric acid.
  • the medium that does not contain preferably is a medium that does not contain ⁇ -aminobutyric acid and/or L-glutamic acid, and preferably contains ⁇ -aminobutyric acid and/or L-glutamic acid of 1 mg/L or less. desirable.
  • the content of ⁇ -aminobutyric acid in the algae of the heterotrophic microalgae according to the present embodiment is, for example, 1.1 times or more, 1.3 times or more the content of ⁇ -aminobutyric acid in the algae of the control. 1.5 times or more, 1.8 times or more, 2.0 times or more, 2.3 times or more, 2.5 times or more, 2.8 times or more, 3.0 times or more, 3.5 times or more , 4.0 times or more, 4.5 times or more, 5.0 times or more, 5.5 times or more, or 6.0 times or more.
  • heterotrophic microalgae examples include microalgae belonging to Thraustochytriales or Labyrinthulales, and one or more types from these groups can be used.
  • microalgae belonging to the above-mentioned thraustochytrium examples include Aurantiochytrium, Schizochytrium, Thraustochytrium, Parietichytrium, or Ulkenia. Microalgae belonging to this group can be mentioned, and one type or two or more types from these groups can be used.
  • microalgae belonging to the genus Labyrinthula examples include microalgae belonging to the genus Labyrinthula.
  • microalgae belonging to the genus Aurantiochytrium examples include microalgae belonging to Aurantiochytrium limacinum or Aurantiochytrium mangrovei.
  • strains of Aurantiochytrium rimassinum include SR-21 strain, 4W-1b strain, NIES3737 strain, ATCC MYA-1381 strain, mh0186 strain, and F29-b strain.
  • strains of Aurantiochytrium mangrove bay include 18W-13a strain, RCC893 strain, MP2 strain, BL10 strain, and FB3 strain, and one or more types from these groups can be used.
  • the SR-21 strain was submitted to the National Institute of Biotechnology and Biotechnology, Agency of Industrial Science and Technology (currently the National Institute of Industrial Science and Technology, National Institute of Technology and Product Evaluation, Biotechnology Center, Patent Organism Depositary (NITE-IPOD)) under the name "Marine Bacteria SR21 Strain”. It was deposited on March 6, 1994, with the accession number FERM BP-5034, and it was deposited with the Fermentation Research Institute, Inc. on March 17, 1995, with the accession number IFO. 32693 (paragraph [0035] of Patent Document 4 (Japanese Unexamined Patent Publication No.
  • Non-Patent Document 1 https://www.atcc.org
  • Non-Patent Document 2 https://www.ncbi.nlm.nih.gov
  • MYA-1381 strain the date of registration is listed as June 28, 2011.
  • strain SR-21 was originally classified into the genus Schizochytrium, but is now classified into the genus Auranthiochytrium (see Non-Patent Document 3: Mycoscience (2007) 48:199-211, etc.).
  • ⁇ NITE-IPOD International Patent Organism Depositary (IPOD), Biological Resource Center, National Institute of Technology and Evaluation (NITE), #120, 2-5-8 Kazusakamatari, Kisarazu-shi, Chiba 2920818, Japan.
  • ⁇ ATCC American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard,Manassas, VA 20110-2209,USA.
  • the heterotrophic microalgae according to this embodiment has a high content of ⁇ -aminobutyric acid, for example, by ingesting, administering, or applying the heterotrophic microalgae, it has an effect on improving brain function, a relaxing effect, and reducing stress. It is expected to have effects such as blood pressure lowering effect, collagen production promoting effect, epidermal cell proliferation effect, and hyaluronic acid synthesis promoting effect. Therefore, the heterotrophic microalgae according to the present embodiment is preferably used in various compositions (e.g., foods, medicines, external skin preparations, feeds, etc.), such as products that are orally ingested by animals (including humans). is more preferable, and more preferably food, medicine, or feed. That is, the heterotrophic microalgae according to the present embodiment is preferably a heterotrophic microalgae for food, medicine, or feed.
  • various compositions e.g., foods, medicines, external skin preparations, feeds, etc
  • the above heterotrophic microalgae containing high ⁇ -aminobutyric acid can be obtained by the method for producing heterotrophic microalgae according to one embodiment of the present invention.
  • the method for producing heterotrophic microalgae is a method for producing heterotrophic microalgae in which the content of ⁇ -aminobutyric acid is 100 mg or more per 100 g of dry algae. This is a method for producing heterotrophic microalgae containing high butyric acid content.
  • the method for producing heterotrophic microalgae includes a step of culturing heterotrophic microalgae in a medium containing ⁇ -aminobutyric acid (hereinafter also referred to as "cultivation step").
  • a step of culturing heterotrophic microalgae in a medium containing ⁇ -aminobutyric acid hereinafter also referred to as "cultivation step”.
  • the culture step it is also possible to convert L-glutamic acid in the medium to ⁇ -aminobutyric acid by the heterotrophic microalgae, and to accumulate ⁇ -aminobutyric acid within the microalgae. Furthermore, when performing the culture step, it is also possible to accumulate ⁇ -aminobutyric acid and/or to convert glutamic acid to ⁇ -aminobutyric acid and to accumulate the converted ⁇ -aminobutyric acid.
  • heterotrophic microalgae having a higher content of ⁇ -aminobutyric acid than heterotrophic microalgae cultured in a medium containing no ⁇ -aminobutyric acid and/or glutamic acid can be cultured.
  • glutamic acid is preferably L-glutamic acid.
  • the method for producing ⁇ -aminobutyric acid-rich heterotrophic microalgae may include a step of preparing a medium containing ⁇ -aminobutyric acid (hereinafter also referred to as "medium preparation step").
  • the medium used in the above culture step may be prepared in the medium preparation step.
  • the medium may be a medium containing ⁇ -aminobutyric acid and/or glutamic acid, and a medium containing at least ⁇ -aminobutyric acid is more preferable because it is easier to obtain heterotrophic microalgae with a high content of ⁇ -aminobutyric acid. .
  • the content of ⁇ -aminobutyric acid in the medium used in the above culture step is, for example, 10 mg/L or more, 20 mg/L or more, 30 mg/L or more, 40 mg/L or more, 50 mg/L or more, 60 mg/L or more, 70 mg/L or more. /L or more, 80mg/L or more, 90mg/L or more, or 100mg/L or more.
  • the content of glutamic acid in the medium used in the above culture step is, for example, 10 mg/L or more, 20 mg/L or more, 30 mg/L or more, 40 mg/L or more, 50 mg/L or more, 60 mg/L or more, 70 mg/L or more.
  • the content of ⁇ -aminobutyric acid and glutamic acid in the medium used in the culture step may be the sum of the above-mentioned ⁇ -aminobutyric acid content and glutamic acid content in an appropriate combination.
  • the medium containing ⁇ -aminobutyric acid and/or glutamic acid is, for example, a composition containing ⁇ -aminobutyric acid and/or glutamic acid, or a composition containing ⁇ -aminobutyric acid and/or glutamic acid alone, and a heterotrophic microorganism. It can be prepared using ingredients necessary for culturing algae. Therefore, the medium preparation step may be a step of preparing a medium containing ⁇ -aminobutyric acid using a composition containing ⁇ -aminobutyric acid or ⁇ -aminobutyric acid.
  • the content of ⁇ -aminobutyric acid in the medium can be adjusted within the numerical range described above.
  • a medium containing glutamic acid can be prepared using, for example, a composition containing glutamic acid or glutamic acid alone, and components necessary for culturing heterotrophic microalgae. Therefore, the medium preparation step may be a step of preparing a medium containing glutamic acid using a composition containing glutamic acid or glutamic acid.
  • a medium containing both ⁇ -aminobutyric acid and glutamic acid may be prepared.
  • compositions containing ⁇ -aminobutyric acid can be used, for example, in fermentation residues and fermentation residues such as shochu lees, awamori distillation lees, and pickles, as well as waste liquids and waste foods in food manufacturing processes using foods containing ⁇ -aminobutyric acid. Any substance containing ⁇ -aminobutyric acid as a type of water-soluble amino acid may be used.
  • Compositions containing glutamic acid contain glutamic acid as a type of water-soluble amino acid, for example, in food manufacturing processes when producing glutamic acid or polyglutamic acid, or waste liquids and waste foods in food manufacturing processes using foods containing glutamic acid. It suffices as long as it exists.
  • glutamic acid is contained in kelp; vegetables such as tomatoes; fermented foods such as cheese; and fermentation residues such as the above-mentioned shochu distillation lees and awamori distillation lees.
  • a composition containing ⁇ -aminobutyric acid and/or a composition containing glutamic acid can be used as a material for a medium used for culturing heterotrophic microalgae. It is preferable to use at least a composition containing ⁇ -aminobutyric acid as a material for the medium because it is easy to obtain heterotrophic microalgae containing a high content of ⁇ -aminobutyric acid.
  • the present inventors have developed a composition containing ⁇ -aminobutyric acid and/or glutamic acid used when preparing a culture medium, using residues generated after fermentation in sake production (hereinafter also referred to as "sake production residue") such as awamori distillation lees. ).
  • Awamori distillation lees are generated during the awamori manufacturing process, and some of it is used as moromi vinegar, livestock feed, or crop fertilizer, but if it cannot be completely removed, it is treated as industrial waste.
  • new ways of utilizing alcoholic beverage manufacturing residues such as awamori distilled lees are currently being sought.
  • the present inventors have investigated the use of sake manufacturing residues such as awamori distillation lees as a material for a culture medium. As a result, the present inventors found that ⁇ -aminobutyric acid was included in the component derived from the liquid of liquor production residue such as Awamori distillation lees, and that the component derived from the liquid of liquor production residue such as Awamori distillation lees was It was found that it is suitable for the culture process.
  • the above-mentioned culture medium preparation process will be explained using as an example a case where a culture medium containing components derived from a liquid in sake manufacturing residue such as awamori distillation lees is prepared.
  • Alcohol in this specification is not particularly limited, but preferably is alcohol produced by fermenting raw materials using Aspergillus oryzae and yeast.
  • sake manufacturing residues include slurry-like or solid lees generated during the sake manufacturing process.
  • the alcohol production residue include sake lees, awamori distillation lees, and shochu distillation lees, and one or more selected from these can be used. Among these, awamori distillation lees and/or shochu distillation lees, which are distillation lees, are preferred.
  • the raw materials for sake are not particularly limited, and include raw materials commonly used in the production of sake, awamori, shochu, etc.
  • grains, potatoes, etc. include, for example, rice. , barley, wheat, buckwheat, soybean, corn, etc.; potatoes such as sweet potato; sugarcane; chestnuts, etc., and one or more selected from these can be used.
  • “Awamori distillation lees” is the distillation residue produced in the awamori manufacturing process
  • “shochu distillation lees” is the distillation residue produced in the shochu production process.
  • “sake lees” is brewing residue produced during the sake manufacturing process.
  • the state of the sake lees is not particularly limited, but awamori distilled lees or shochu distilled lees can be in the form of a slurry, and sake lees can be in the form of a solid.
  • Liquor manufacturing residue, such as awamori distilled sake lees includes a liquid containing amino acids and organic acids such as citric acid, minerals and vitamins, and a solid containing protein, dietary fiber, and the like.
  • the medium containing components derived from the liquid in liquor manufacturing residue such as awamori distilled lees only needs to contain at least a component derived from the liquid in liquor manufacturing residue such as awamori distilled lees. It may or may not contain components derived from solids in the residue.
  • a medium containing components derived from liquid in sake manufacturing residue such as awamori distillation lees can be prepared in the medium preparation process described above.
  • sake production residues such as awamori distillation lees may or may not be subjected to solid-liquid separation, for example.
  • the culture medium preparation step may be a step that includes solid-liquid separation of liquor manufacturing residue such as awamori distillation lees.
  • the medium preparation step may be a step of preparing a medium containing components derived from a liquid obtained by solid-liquid separation of sake manufacturing residue such as awamori distillation lees.
  • the above-mentioned solid-liquid separation may be performed by known means such as centrifugation, sedimentation, filtration, compression, and commercially available solid-liquid separators.
  • the liquid obtained by solid-liquid separation may be used as is. That is, in the culture medium preparation step, the culture medium may be prepared using the liquid obtained by solid-liquid separation itself.
  • a culture medium may be prepared by mixing the liquid with additives described below.
  • a medium may be prepared using a liquid obtained by solid-liquid separation that has been subjected to at least one treatment.
  • a liquid obtained by solid-liquid separation may be subjected to a drying process to prepare a dried product, and then the dried product may be mixed with an additive described later and water to prepare a medium.
  • the liquor manufacturing residue such as awamori distillation lees that is separated into solid and liquid may be used after being subjected to at least one treatment, for example.
  • the at least one treatment may be selected from, for example, refrigeration, freezing, heating, concentration, sterilization, and drying.
  • the culture medium preparation step may be a step that does not include solid-liquid separation of liquor manufacturing residues such as awamori distillation lees.
  • the culture medium preparation step is a step of preparing a medium containing components derived from the liquid in the liquor production residue such as the awamori distillation lees by using the liquor production residue such as the awamori distillation lees without solid-liquid separation. It may be.
  • Sake production residues such as awamori distillation lees that are used without solid-liquid separation are, for example, alcohol production residues such as awamori distillation lees (distillation residue) produced in the distillation of aged mash that are subjected to at least one treatment other than solid-liquid separation. It may be something that has been applied.
  • the at least one treatment may be selected from, for example, refrigeration, freezing, heating, concentration, sterilization, and drying.
  • a dry product may be prepared by drying sake manufacturing residue such as awamori distillation lees, and then a culture medium may be prepared by mixing the dry product with water and additives to be described later.
  • the medium prepared in the medium preparation step may contain additives in addition to components derived from the liquid in the liquor manufacturing residue such as awamori distillation lees. That is, the medium preparation step may be a step of preparing a medium containing a component derived from a liquid in sake manufacturing residue such as awamori distillation lees, and an additive.
  • additives examples include sugars, mineral components (including natural seawater and artificial seawater), organic acids, inorganic acids, organic bases, inorganic bases, vitamins, amino acids, peptides, and proteins.
  • types of additives contained in the medium may be appropriately selected by those skilled in the art depending on the type of heterotrophic microalgae to be cultured.
  • saccharides include at least one saccharide selected from glucose, galactose, fructose, maltose, sucrose, lactose, oligosaccharides, and sugar alcohols (glycerol, etc.).
  • the amount of saccharides in the medium may be adjusted as appropriate by those skilled in the art depending on the type of heterotrophic microalgae to be cultured.
  • the above mineral components include, for example, sulfates such as potassium sulfate, magnesium sulfate, iron sulfate, ammonium sulfate, copper sulfate, nickel sulfate, and zinc sulfate; phosphates such as potassium phosphate; carbonates such as calcium carbonate; Chlorides such as cobalt, manganese chloride, sodium chloride, and calcium chloride; alkali metal oxides; molybdates such as sodium molybdate; selenites such as sodium selenite; potassium bromide and potassium iodide. At least one mineral component selected from halides; natural sea salt; artificial sea salt such as Red Sea Salt; The amount of mineral components in the medium may be appropriately adjusted by those skilled in the art depending on the type of heterotrophic microalgae to be cultured.
  • sulfates such as potassium sulfate, magnesium sulfate, iron sulfate, ammonium sulfate
  • the pH of the medium containing components derived from the liquid in the liquor manufacturing residue such as awamori distillation lees may be adjusted as necessary.
  • an acid or a base may be added to adjust the pH before and/or after adding the above-mentioned additives.
  • the pH may be adjusted as appropriate by those skilled in the art depending on the type of heterotrophic microalgae to be cultured.
  • the culture medium preparation step the culture medium containing components derived from the liquid in sake production residues such as awamori distillation lees is preferably sterilized. That is, the medium preparation step is preferably a step of preparing and sterilizing a medium containing components derived from a liquid in sake manufacturing residue such as awamori distillation lees. Such sterilization may be performed by known means such as autoclave sterilization, filter sterilization, boiling sterilization, and radiation sterilization.
  • the sterilization process may also serve as a process to solubilize the solid portion derived from liquor manufacturing residues such as awamori distillation lees contained in the medium.
  • the medium containing components derived from the liquid in liquor manufacturing residue such as awamori distillation lees may be a liquid medium or a solid medium.
  • a liquid medium is more suitable than a solid medium.
  • the culture medium containing components derived from the liquid in liquor production residue such as awamori distillation lees is the culture medium used in the method for producing heterotrophic microalgae with a high content of ⁇ -aminobutyric acid according to the present embodiment.
  • Any medium containing ⁇ -aminobutyric acid may be used.
  • the medium preparation process is mainly exemplified as a process of preparing a medium containing ⁇ -aminobutyric acid using awamori distillation lees, the medium preparation process is not limited to this.
  • a medium may be prepared using a composition containing ⁇ -aminobutyric acid other than ⁇ -aminobutyric acid, or using ⁇ -aminobutyric acid.
  • the culture conditions such as the culture temperature, culture period, and culture method in the culture step may be any conditions that allow the cultivation of heterotrophic microalgae.
  • the temperature is 5 to 40°C, preferably 10 to 35°C, more preferably 20 to 28°C, even more preferably 25°C ⁇ 1°C, usually for 1 to 10 days, preferably 3 to 7 days, e.g.
  • Culture is carried out for 4 to 5 days, and can be carried out by aeration agitation culture, shaking culture, or static culture.
  • culture may be started after adjusting each concentration of ⁇ -aminobutyric acid and/or glutamic acid in the medium, but each of these concentrations may be adjusted to a predetermined concentration during the culture process after the start of culture.
  • a composition containing ⁇ -aminobutyric acid and/or glutamic acid may be added to the medium to adjust their concentrations in the medium.
  • the glutamic acid concentration in the medium is adjusted to a predetermined concentration while feeding a composition containing glutamic acid.
  • Na in terms of Na is not particularly limited, but is, for example, 0.001 to 50 g/L/hr.
  • the culturing step includes the above seed culturing step and before culturing the seed algae in a preculture medium containing ⁇ -aminobutyric acid (for example, a component derived from liquid in sake manufacturing residue such as awamori distillation lees).
  • the medium for seed culture may be, for example, a medium known as a medium for culturing heterotrophic microalgae, or a medium containing components derived from liquid in sake manufacturing residue such as awamori distillation lees. good.
  • the medium for seed culture is preferably a medium known as a medium for culturing heterotrophic microalgae.
  • the component composition of the seed culture medium may be different from that used for pre-culture or main culture. It may be the same as the culture medium or may be different.
  • the component composition of the medium for pre-culture may be the same as or different from that of the medium for main culture.
  • Heterotrophic microalgae may be cultured in a culture device having suitable cell culture means.
  • Cell culture means means means having a function for culturing cells, and is, for example, a culture tank.
  • the culture tank may be one selected from a stirring device, a vibration device, a temperature control device, a pH control device, a turbidity measurement device, a light control device, a gas concentration measurement device such as O 2 or CO 2 , and a pressure measurement device. It may have multiple devices.
  • the culture tank may be the same tank as the concentration/separation tank, or may be a separate tank from the concentration/separation tank. When the culture tank is a tank separate from the concentration/separation tank, the culture tank and the concentration/separation tank may be connected by appropriate means (for example, a flow path).
  • the method for producing ⁇ -aminobutyric acid-rich heterotrophic microalgae according to the present embodiment may further include a step of collecting the heterotrophic microalgae (hereinafter also referred to as "recovery step").
  • the collection step is a step of collecting the heterotrophic microalgae cultured by the culture step described above.
  • the heterotrophic microalgae may be collected separately from the medium, or may be collected together with the medium. That is, the heterotrophic microalgae collected in the collection step may be the heterotrophic microalgae separated from the medium, or may be a mixture of the heterotrophic microalgae and the medium.
  • the recovery step may include a step of separating the cultured heterotrophic microalgae from the medium (hereinafter also referred to as "separation step"). In the separation step, the culture medium and the heterotrophic microalgae may be separated by known means such as centrifugation or filtration.
  • the method for producing ⁇ -aminobutyric acid-rich heterotrophic microalgae according to the present embodiment may further include a step of drying the heterotrophic microalgae (hereinafter also referred to as "drying step").
  • drying step the cultured heterotrophic microalgae is dried, and the heterotrophic microalgae becomes dried algal bodies.
  • the drying step may be performed, for example, after the recovery step.
  • the heterotrophic microalgae to be dried may be, for example, heterotrophic microalgae separated from the medium, or may be a mixture of heterotrophic microalgae and the medium.
  • the heterotrophic microalgae to be dried is preferably heterotrophic microalgae separated from the culture medium. That is, in a preferred embodiment, the recovery step is a step including the separation step, and the drying step is a step of drying the heterotrophic microalgae separated from the culture medium.
  • the above drying may be performed by known means.
  • the drying may be performed by at least one selected from heat drying, low temperature drying, ventilation drying, reduced pressure drying, freeze drying, spray drying, natural drying, commercially available drying equipment, and the like.
  • the method for producing heterotrophic microalgae with a high content of ⁇ -aminobutyric acid includes, in addition to the steps described above, a step of pulverizing heterotrophic microalgae (hereinafter also referred to as "pulverization step"). It's okay to be there.
  • the pulverization step may be performed, for example, after the recovery step and before the drying step, or after the drying step.
  • the grinding step is preferably performed after the drying step. Since the heterotrophic microalgae (dried algal bodies) after the drying process have a reduced water content, they can be easily pulverized and can also be pulverized to a small particle size.
  • the pulverization may be performed by known pulverization means.
  • heterotrophic microalgae containing a high content of ⁇ -aminobutyric acid can be obtained, and the production method may be used to obtain such microalgae.
  • Patent Document 5 Japanese Patent No. 7218023.
  • the present inventors have developed a process of culturing heterotrophic microalgae in a medium containing components derived from the liquid of awamori distillation lees, and It has been found that the odor and taste of heterotrophic microalgae can be improved by performing the step of drying the heterotrophic microalgae.
  • the method for producing heterotrophic microalgae with a high content of ⁇ -aminobutyric acid is, for example, a method for producing heterotrophic microalgae containing a high content of ⁇ -aminobutyric acid in a medium containing components derived from a liquid of liquor manufacturing residue such as awamori distillation lees.
  • the method may include the steps of culturing trophic microalgae and drying the cultured heterotrophic microalgae.
  • the manufacturing method may further include the above-mentioned pulverization step.
  • the crushing step By performing the crushing step, the particle size of the dried algae obtained can be reduced. Thereby, it is possible to improve the mouthfeel of an article containing dried algal bodies, and to improve the dispersibility when dry algal bodies are blended with other raw materials.
  • Patent Document 5 Japanese Patent No. 7218023
  • the production method described in Japanese Patent Application No. 2022-6913 Patent Document 5: Japanese Patent No. 7218023
  • the present invention can also provide compositions (for example, foods, medicines, feeds, or external preparations for skin) containing heterotrophic microalgae with a high content of ⁇ -aminobutyric acid.
  • the heterotrophic microalgae with high ⁇ -aminobutyric acid content is heterotrophic microalgae in which the content of ⁇ -aminobutyric acid is 100 mg or more per 100 g of dry algae. Details of the heterotrophic microalgae can be found in 1. above. and 2. The same explanation applies to this embodiment as well.
  • food refers to food in an edible state that can be used directly for human consumption. Food given to non-human animals, such as feed (including fodder), does not fall under “food” as described herein.
  • Foods include, for example, general foods, foods for specified uses, and foods with health claims (foods for specified health uses, foods with nutritional function claims, and foods with functional claims).
  • General foods include so-called health foods, such as functional foods, nutritional supplements, health supplements, and supplements.
  • Types of foods include, for example, processed meat products, processed seafood products, processed milk products, processed vegetable products, processed fruit products, oil and fat foods, luxury foods, seasonings, confectionery, frozen foods, retort foods, canned foods, and bottled foods. Examples include, but are not limited to, stuffed foods and instant foods.
  • Feed is food given to animals other than humans.
  • Feed includes, for example, pet food, livestock feed, poultry feed, and fish feed.
  • animals to which feed is given include livestock (cows, pigs, chickens, horses, sheep, goats, etc.), fish, shellfish, and pets (dogs, cats, hamsters, rabbits, parakeets, tropical fish, reptiles, amphibians, insects, etc.), but are not limited to these.
  • composition containing heterotrophic microalgae containing high ⁇ -aminobutyric acid content may be in the form of, for example, liquid, solid, semisolid, paste, granule, or powder. , capsule shape, etc., but are not particularly limited.
  • composition for example, food, medicine, feed, skin external preparation, oral composition, etc.
  • heterotrophic microalgae containing high ⁇ -aminobutyric acid has a high content of ⁇ -aminobutyric acid. It is expected that by ingesting, administering, or applying it to foods, medicines, or feeds, effects such as improving brain function, relaxing effects, reducing stress, and lowering blood pressure can be obtained.
  • the heterotrophic microalgae high in ⁇ -aminobutyric acid used in this embodiment can be included in a composition that has a brain function improving effect, a relaxing effect, a stress reducing effect, and a blood pressure lowering effect. It can be used for the prevention, amelioration, or treatment of symptoms or diseases that can be prevented, ameliorated, or treated by.
  • the present embodiment describes the method used in or for the production of various compositions or various drugs such as compositions for improving brain function, compositions for relaxing, compositions for stress reduction, and compositions for lowering blood pressure. It is also possible to provide heterotrophic microalgae containing a high content of ⁇ -aminobutyric acid or uses thereof.
  • the present embodiment provides a method for preventing and improving symptoms or diseases that can be prevented, ameliorated, or treated by ⁇ -aminobutyric acid, using the heterotrophic microalgae containing high ⁇ -aminobutyric acid or a composition containing the same. Or a method of treatment can be provided. Further, this embodiment provides the above heterotrophic microalgae containing high ⁇ -aminobutyric acid or a composition containing the same for preventing, improving or treating symptoms or diseases that can be prevented, improved or treated by ⁇ -aminobutyric acid. You can also provide things.
  • the composition according to the present embodiment includes foods, supplements, etc. that are based on the concept of prevention, improvement, or treatment of the above-mentioned symptoms or diseases, symptoms or diseases related thereto, and are labeled accordingly as necessary. compositions for ingestion are preferred.
  • prevention refers to preventing or delaying the onset of a symptom or disease in a subject, or reducing the risk of onset of a symptom or disease in a subject.
  • improvement refers to improvement or maintenance of a disease, symptom, or condition in a subject; prevention or delay of deterioration; reversal, prevention, or delay of progression.
  • non-therapeutic purpose is a concept that does not include medical treatment, that is, treatment of the human body through treatment. Examples include health promotion, beauty practices, etc.
  • the present invention also provides a method for producing a composition (eg, food, medicine, feed, skin external preparation, etc.) containing heterotrophic microalgae with a high content of ⁇ -aminobutyric acid.
  • a composition eg, food, medicine, feed, skin external preparation, etc.
  • the production method according to an embodiment of the present invention uses heterotrophic microalgae (heterotrophic microalgae containing high ⁇ -aminobutyric acid) cultured in a medium containing ⁇ -aminobutyric acid. including.
  • the heterotrophic microalgae cultured in the medium containing ⁇ -aminobutyric acid are preferably heterotrophic microalgae produced by the method for producing ⁇ -aminobutyric acid-rich heterotrophic microalgae according to an embodiment of the present invention. It is a trophic microalgae. That is, the method for producing the composition (for example, food, medicine, feed, skin external preparation, etc.) according to the present embodiment preferably uses the ⁇ -aminobutyric acid-rich heterotrophic microorganism according to the embodiment of the present invention. The method may include the steps described in the method for producing algae. Details of the process are described in 2. above. As explained in .
  • ⁇ -aminobutyric acid-rich heterotrophic microalgae-containing composition for example, food, medicine, feed, etc.
  • the present invention also provides a method for increasing the content of ⁇ -aminobutyric acid in heterotrophic microalgae (hereinafter also referred to as "method for increasing ⁇ -aminobutyric acid content").
  • a method for increasing ⁇ -aminobutyric acid content according to an embodiment of the present invention includes the step of culturing heterotrophic microalgae in a medium containing ⁇ -aminobutyric acid.
  • the process is as described in 2. above. This is the same culture process as explained in .
  • the method for increasing ⁇ -aminobutyric acid content according to the present embodiment may include at least one step selected from a culture medium preparation step, a collection step, and a drying step, in addition to the culturing step. Details of these steps can be found in 2. above. The same explanation applies to this embodiment as well.
  • increasing the content of ⁇ -aminobutyric acid refers to increasing the content of ⁇ -aminobutyric acid in the heterotrophic microalgae through the above culture step.
  • the increase is, for example, 1.1 times or more, 1.3 times or more, 1.5 times or more, 1.8 times or more, 2.0 times or more, 2.3 times or more, 2.5 times or more, 2.8 times or more, 3.0 times or more, 3.5 times or more, 4.0 times or more, 4.5 times or more, 5. It may be increased by 0 times or more, 5.5 times or more, or 6.0 times or more.
  • the present invention also provides a method for recovering ⁇ -aminobutyric acid from a culture medium.
  • a method for recovering ⁇ -aminobutyric acid from a medium according to an embodiment of the present invention includes the steps of culturing heterotrophic microalgae in a medium containing ⁇ -aminobutyric acid, and collecting the heterotrophic microalgae. and, including. These steps are respectively described in 2. above. This is the same as the culture step and recovery step explained in . Furthermore, the method for recovering ⁇ -aminobutyric acid from a culture medium according to the present embodiment may include a culture medium preparation process and/or a drying process in addition to the culture process and recovery process. Details of these steps can be found in 2. above. The same description applies to this embodiment as well.
  • the present invention also provides a method for recovering ⁇ -aminobutyric acid from a composition.
  • a method for recovering ⁇ -aminobutyric acid from a composition according to an embodiment of the present invention includes the steps of preparing a medium using a composition containing ⁇ -aminobutyric acid, and culturing heterotrophic microalgae in the medium. and collecting the heterotrophic microalgae. These steps are respectively described in 2. above. This is the same as the culture medium preparation step, culture step, and collection step described in . Furthermore, the method for recovering ⁇ -aminobutyric acid from the composition according to the present embodiment may include a drying process in addition to the medium preparation process, culture process, and recovery process. For details of the drying process, see 2. above. The same explanation applies to this embodiment as well.
  • composition used in the culture medium preparation step of this embodiment may be, for example, awamori distillation lees, but is not particularly limited as long as it does not impair the effects of the present invention.
  • the present invention can employ the following configurations or technical features as appropriate.
  • - [1] Heterotrophic microalgae having a content of ⁇ -aminobutyric acid of 100 mg or more per 100 g of dry algae.
  • -[2] The heterotrophic microalgae according to [1] above, wherein the heterotrophic microalgae is a microalgae belonging to Thraustochytriales.
  • -[3] The heterotrophic microalgae according to [1] or [2] above, wherein the heterotrophic microalgae is a microalgae belonging to the genus Aurantiochytrium.
  • the heterotrophic microalgae is preferably the heterotrophic microalgae described in [2] or [3] above.
  • the produced heterotrophic microalgae is preferably a heterotrophic microalgae containing a high content of ⁇ -aminobutyric acid.
  • the medium is a medium containing ⁇ -aminobutyric acid, which is obtained by preparing and sterilizing a medium containing components derived from liquid in sake manufacturing residue.
  • ⁇ [9] For increasing the content of ⁇ -aminobutyric acid in heterotrophic microalgae, or for recovering ⁇ -aminobutyric acid from a culture medium, or for producing food, medicine, or feed. , the manufacturing method according to any one of [5] to [8] above.
  • the medium is (i) a medium obtained by adjusting and sterilizing a ⁇ -aminobutyric acid-containing composition, or (ii) a component derived from liquor production residue or a liquid in liquor production residue.
  • the method may include a step of adjusting and sterilizing a medium containing liquor production residue or a component derived from a liquid in the liquor production residue.
  • ⁇ [11] ⁇ -aminobutyric acid-rich heterotrophic microalgae obtained by the production method according to any one of [5] to [10] above, using ⁇ -aminobutyric acid-rich heterotrophic microalgae A method for producing a composition containing microalgae. - [12] Heterotrophic microalgae high in ⁇ -aminobutyric acid content obtained by the production method according to any one of [5] to [10] above, or use thereof.
  • a method for increasing the content of ⁇ -aminobutyric acid in heterotrophic microalgae which includes the step of culturing the heterotrophic microalgae in a medium containing ⁇ -aminobutyric acid.
  • a method for recovering ⁇ -aminobutyric acid from a medium comprising the steps of culturing heterotrophic microalgae in a medium containing ⁇ -aminobutyric acid, and collecting the heterotrophic microalgae.
  • a method of recovering ⁇ -aminobutyric acid from a composition comprising: ⁇ [16] ⁇ - obtained by using heterotrophic microalgae cultured in a medium containing ⁇ -aminobutyric acid, or by the production method described in any one of [5] to [10] above.
  • a composition for example, food, medicine, feed, etc.
  • a method for producing the composition which comprises using heterotrophic microalgae containing high aminobutyric acid content.
  • the cultured heterotrophic microalgae is preferably a heterotrophic microalgae containing a high content of ⁇ -aminobutyric acid.
  • the medium is a medium obtained by adjusting and sterilizing a medium containing liquor manufacturing residue or a component derived from a liquid in the liquor manufacturing residue.
  • the method may include a step of adjusting and sterilizing a medium containing liquor production residue or a component derived from a liquid in the liquor production residue.
  • the heterotrophic microalgae is used for one or more types selected from inhibitory neurotransmission, brain function improvement, relaxation, stress reduction, blood pressure reduction, and sleep quality improvement, The heterotrophic microalgae according to any one of [1] to [4] above, or the method according to any one of [5] to [18] above.
  • the composition is used for one or more selected from inhibitory neurotransmission, improvement of brain function, relaxation, stress reduction, reduction of blood pressure, reduction of anxiety, and improvement of sleep quality. The composition according to [4] above, or the method according to any one of [5] to [18] above.
  • the cognitive dysfunction include one or more selected from mild cognitive dysfunction, Alzheimer's disease, cognitive dysfunction due to aging (eg, decline in memory, spatial cognition, etc.), and the like.
  • Example 1 Production of dried algal bodies in Example 1 Heterotrophic microalgae were cultured according to the following procedure to obtain dried algal bodies.
  • Example 1 The measurement results are shown in Table 1 below.
  • Example 1-1 the culture medium and dried algal bodies obtained in each test were written as "Example 1-1" and "Example 1-2".
  • Example 2 Heterotrophic microalgae were cultured according to the following procedure to obtain dried algae.
  • the content of ⁇ -aminobutyric acid per 100g of dry algae was 278mg, so approximately 84.5% of the decrease in ⁇ -aminobutyric acid in the medium was caused by dry algae. It is considered that the amount was taken into the body and accumulated (278/329 ⁇ 100 ⁇ 84.5 [%]).
  • the stopper was a breathable silicone rubber open-cell sponge plug.
  • the culture medium used for flask culture is a medium containing 25% shochu distilled lees
  • the medium is a medium containing 50 mL of shochu distilled lees supernatant medium, 150 mL of water, 4 g of glucose, and 3.34 g of red sea salt.
  • "%" of 25% shochu lees containing medium is "volume of shochu distilled lees supernatant medium (mL)/[total volume of shochu distilled lees supernatant medium (mL) and water volume (mL)"] (mL)] x 100 (%).
  • the total amount is also the volume (mL) of the medium.
  • the ratio of the volume (mL) of the shochu distillation lees supernatant medium to the volume (mL) of water was adjusted to prepare 50%, 75%, and 100% shochu distillation lees containing media.
  • the concentrations of glucose and red sea salt in the medium containing shochu distilled lees are the same as in the case of ⁇ 25%'', ⁇ glucose 4 g, red sea salt 3.34 g/volume'' even when the concentration of the shochu distilled lees supernatant medium is changed.
  • the volume was adjusted to 200 mL.
  • the 100% shochu distillation lees-containing medium has a volume of water (mL) of 0 mL and a volume of the shochu distillation lees supernatant medium (mL) of 200 mL per 200 mL of the total amount.
  • Flask culture GTY medium containing seed algae was seeded in a medium containing shochu distillation lees, and cultured under aerobic conditions for 36 hours. The culture conditions at this time were 25°C and shaking at 110 strokes/min.
  • Example 3-1 is a test example using a 25% shochu lees culture medium, and test examples in which the shochu lees supernatant medium content in the shochu lees culture medium was changed to 50%, 75%, and 100%, respectively. These were named Example 3-2, Example 3-3, and Example 3-4.
  • Example 3 Collection and drying The collection and drying in Example 3 were carried out in Example 3-1, Example 3-2, and Example 3- according to the procedure of "(1) e)" of Test Example 1 above after flask culture. 3. Dried algal bodies of Examples 3-4 were obtained. The content of ⁇ -aminobutyric acid was measured in accordance with "(3) Measurement of the content of ⁇ -aminobutyric acid" in Test Example 1 above. The measurement results in Example 3 are shown in Table 3 below. DCW is an abbreviation for dry algae weight.
  • the actual measured value/theoretical value of GABA within the algae is [actual measured value of GABA within the algae at the end of culture [mg/100g]/theoretical value of GABA within the algae assuming that all the reduced amount of GABA in the medium is collected in the algal body [ mg/100g]].
  • the "medium” in “in the medium” in Table 3 refers to the "medium containing potato shochu distillation lees.”
  • GABA in the culture medium could be incorporated into the algal bodies of heterotrophic microalgae even when using not only awamori distilled lees but also shochu distilled lees. From this, it is possible to use not only sake manufacturing residues (sake manufacturing lees, etc.) such as awamori distillation lees, shochu distillation lees, and sake lees, but also ⁇ -aminobutyric acid-containing compositions or ⁇ -aminobutyric acid-containing medium. It was confirmed that heterotrophic microalgae with high aminobutyric acid content could be obtained.
  • ⁇ -aminobutyric acid could be contained in the algal bodies of heterotrophic microalgae. From this, it is considered that by adjusting the culture conditions such as the concentration of ⁇ -aminobutyric acid and/or glutamic acid in the medium, the upper limit of the amount accumulated within the algae can be adjusted as appropriate.
  • ⁇ -aminobutyric acid could be contained within the algal bodies of heterotrophic microalgae to at least about 2, 3 or 5% by weight.
  • a lees-containing medium was obtained.
  • An aqueous solution of Na glutamate (sterilized by filtration) was added to the medium after the start of the culture during the culture under the conditions shown in Table 4.
  • a glutamate Na aqueous solution (glutamate Na concentration 200 g/L) was added so that the glutamate Na concentration in the medium was 0.6 g/L/hr.
  • the "medium” in “medium” in Table 4 refers to "medium containing awamori distillation lees.”
  • L-glutamic acid in the culture medium is taken into the algal bodies of microalgae belonging to the Thraustochytrium family, particularly microalgae of the genus Aurantiochytrium, and is used for proliferation. It was thought that if more L-glutamic acid was taken into the algae than is used for growth, it would be converted to ⁇ -aminobutyric acid and accumulated within the algae.
  • heterotrophic microalgae can produce ⁇ -aminobutyric acid from L-glutamic acid in their bodies and accumulate the produced ⁇ -aminobutyric acid in their bodies.
  • heterotrophic microalgae containing a high content of ⁇ -aminobutyric acid can also be obtained by supplying L-glutamic acid in addition to ⁇ -aminobutyric acid to the culture medium.
  • Auranthiochytrium strains (Auranthiochytrium M15d1 strain, Auranthiochytrium S28P strain) were grown in Awamori distillation lees-containing medium containing 50% Awamori distillation lees supernatant medium according to ⁇ Test Example 3>. (medium containing 50% awamori distiller's lees) and cultured in flasks. These two strains were collected and stored in Japan by the present inventors.
  • the Awamori distiller's lees supernatant medium is a ⁇ -aminobutyric acid-containing composition (for culture medium) obtained according to the preparation of the Awamori distiller's lees supernatant medium of ⁇ Test Example 1>.
  • the 50% awamori distiller's lees-containing medium used in Test Example 5 can be obtained by adjusting the concentration of the awamori distiller's lees supernatant medium according to ⁇ Test Example 3>.
  • the "medium” in Table 5 refers to a medium containing 50% awamori distiller's lees.
  • the content of ⁇ -aminobutyric acid was measured in the same manner as in ⁇ Test Example 1>.
  • strains of the genus Auranthiochytrium other than strain SR21 collect GABA in the culture medium during cultivation and accumulate it in the algal bodies. It has been shown that microalgae belonging to the genus Aurantiochytrium, which is a heterotrophic microalgae, can have a high content of ⁇ -aminobutyric acid regardless of the algae strain, and that ⁇ -aminobutyric acid can be recovered from the culture medium.

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Abstract

本発明は、γ－アミノ酪酸の含有量が多い従属栄養性微細藻類、及び、従属栄養性微細藻類中のγ－アミノ酪酸の含有量を増加させる方法を提供することを目的とする。　本発明は、γ－アミノ酪酸の含有量が、乾燥藻体１００ｇ当たり１００ｍｇ以上である、従属栄養性微細藻類を提供する。本発明は、当該従属栄養性微細藻類を含有する、食品、医薬品、又は飼料も提供する。本発明は、γ－アミノ酪酸を含む培地中で従属栄養性微細藻類を培養する工程を含む、従属栄養性微細藻類中のγ－アミノ酪酸の含有量を増加させる方法も提供する。

Description

従属栄養性微細藻類及びその用途、並びに従属栄養性微細藻類中のγ－アミノ酪酸を増加させる方法
　本発明は、従属栄養性微細藻類及びその用途、並びに従属栄養性微細藻類中のγ－アミノ酪酸を増加させる方法に関する。
　γ－アミノ酪酸（gamma-aminobutyric acid：ＧＡＢＡ）は、タンパク質を構成しない、水溶性のアミノ酸の一種である。γ－アミノ酪酸は、自然界に広く分布しており、生体内においてはグルタミン酸から生合成される。哺乳動物の脳内において、γ－アミノ酪酸は、抑制型神経伝達物質として働き、脳機能改善作用、リラックス作用、ストレス軽減作用、及び血圧低下作用を示し、また、睡眠の質を改善する機能を有することが報告されている。
　現在までに、γ－アミノ酪酸を含有する微細藻類に関していくつか報告されている。例えば、下記特許文献１には、γ－アミノ酪酸を含有するパブロバ科の微細藻類（ＯＰＭＳ３０５４３株及びＯＰＭＳ３０５４３Ｘ株）が開示されている。下記特許文献２には、γ－アミノ酪酸を含有するイデユコゴメ綱に属する藻類が開示されている。下記特許文献３には、γ－アミノ酪酸を含有するイデユコゴメ細胞が開示されている。
　微細藻類の中には従属栄養性を示すもの（従属栄養性微細藻類）がある。ここで、「従属栄養性微細藻類」とは、光照射が必須となる光合成によって増殖させる光合成培養によらず、有機の炭素源を与えることで光照射をすることなしに培養、増殖が可能な性質を持つ藻類である。これまで、従属栄養性を示し且つγ－アミノ酪酸を多く含有する微細藻類については報告されていない。
特開２０２１－１３３１３号公報 特開２０２０－７２６９８号公報 特表２０１４－５２４２４８号公報 特開平１０－０７２５９０号公報 特許７２１８０２３号公報
　本発明は、γ－アミノ酪酸の含有量が多い従属栄養性微細藻類を提供することを主目的とする。また、本発明は、従属栄養性微細藻類中のγ－アミノ酪酸の含有量を増加させる方法を提供することを主目的とする。
　本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、従属栄養性微細藻類が培地に含まれるγ－アミノ酪酸を取り込み、藻体内に蓄積するという知見を得た。その結果、本発明者らは、従属栄養性微細藻類中のγ－アミノ酪酸を増加させる技術、及び、γ－アミノ酪酸を多く含有する従属栄養性微細藻類を得る技術を確立した。また、本発明者らは、培地に含まれるγ－アミノ酪酸を従属栄養性微細藻類によって回収する方法も見出した。本発明は、これらの結果、完成されたものである。
　すなわち、本発明は、γ－アミノ酪酸の含有量が、乾燥藻体１００ｇ当たり１００ｍｇ以上である、従属栄養性微細藻類を提供する。
　前記従属栄養性微細藻類は、ヤブレツボカビ類（Thraustochytriales）に属する微細藻類であってよい。
　前記従属栄養性微細藻類は、オーランチオキトリウム属（Aurantiochytrium）に属する微細藻類であってよい。
　本発明は、前記従属栄養性微細藻類を含有する、食品、医薬品、又は飼料も提供する。
　本発明は、γ－アミノ酪酸を含む培地中で従属栄養性微細藻類を培養する工程を含む、従属栄養性微細藻類中のγ－アミノ酪酸の含有量を増加させる方法も提供する。
　本発明は、γ－アミノ酪酸を含む培地中で従属栄養性微細藻類を培養する工程と、前記従属栄養性微細藻類を回収する工程と、を含む、培地からγ－アミノ酪酸を回収する方法も提供する。
　本発明は、γ－アミノ酪酸を含む組成物を用いて培地を調製する工程と、前記培地中で従属栄養性微細藻類を培養する工程と、前記従属栄養性微細藻類を回収する工程と、を含む、組成物からγ－アミノ酪酸を回収する方法も提供する。
　本発明は、γ－アミノ酪酸を含む培地中で培養された従属栄養性微細藻類を用いることを含む、食品、医薬品、又は飼料の製造方法も提供する。
　本発明により、γ－アミノ酪酸の含有量が多い従属栄養性微細藻類が提供される。また、本発明により、従属栄養性微細藻類中のγ－アミノ酪酸の含有量を増加させる方法が提供される。なお、本発明の効果は、ここに記載された効果に限定されず、本明細書内に記載されたいずれかの効果であってもよい。
　以下、本発明を実施するための好適な形態について説明する。以下に説明する実施形態は、本発明の代表的な実施形態を示したものであり、本発明の範囲がこれらの実施形態のみに限定されることはない。
１．γ－アミノ酪酸高含有従属栄養性微細藻類
　本発明の一実施形態に係る従属栄養性微細藻類において、γ－アミノ酪酸の含有量は、乾燥藻体１００ｇ当たり１００ｍｇ以上である。当該γ－アミノ酪酸の含有量は、乾燥藻体１００ｇ当たり、例えば１２０ｍｇ以上、１４０ｍｇ以上、１６０ｍｇ以上、１８０ｍｇ以上、２００ｍｇ以上、２２０ｍｇ以上、２４０ｍｇ以上、２６０ｍｇ以上、２８０ｍｍｇ以上、３００ｍｇ以上、３５０ｍｇ以上、４００ｍｇ以上、４５０ｍｇ以上、５００ｍｇ以上、又は５５０ｍｇ以上であってよい。
　本実施形態に係る従属栄養性微細藻類は、γ－アミノ酪酸を含む培地中で従属栄養性微細藻類を培養することにより得られ、γ－アミノ酪酸を少なくとも含まない培地中で培養することにより得られた従属栄養性微細藻類に比べて、藻体中のγ－アミノ酪酸の含有量が多い。すなわち、本実施形態に係る従属栄養性微細藻類は、γ－アミノ酪酸高含有従属栄養性微細藻類である。なお、前記含まない培地とは、γ－アミノ酪酸及び／又はＬ－グルタミン酸を含まない培地であることが望ましく、γ－アミノ酪酸及び／又はＬ－グルタミン酸が１ｍｇ／Ｌ以下の培地であることが望ましい。
　本明細書において、「γ－アミノ酪酸の含有量が多い」及び「γ－アミノ酪酸高含有」とは、γ－アミノ酪酸を含まない培地中で培養することにより得られた従属栄養性微細藻類（コントロール）の藻体中のγ－アミノ酪酸の含有量に比べて、藻体中のγ－アミノ酪酸の含有量が多いことをいう。サンプルとコントロールとを対比する場合、培地中のγ－アミノ酪酸及び／又はＬ－グルタミン酸濃度以外は同じ培養条件にて培養を行い、サンプルの「γ－アミノ酪酸の含有量が多い」及び「γ－アミノ酪酸高含有」を判断してもよい。本実施形態に係る従属栄養性微細藻類の藻体中のγ－アミノ酪酸の含有量は、例えば、上記コントロールの藻体中のγ－アミノ酪酸の含有量の１．１倍以上、１．３倍以上、１．５倍以上、１．８倍以上、２．０倍以上、２．３倍以上、２．５倍以上、２．８倍以上、３．０倍以上、３．５倍以上、４．０倍以上、４．５倍以上、５．０倍以上、５．５倍以上、又は６．０倍以上であってよい。
　上記従属栄養性微細藻類としては、例えば、ヤブレツボカビ類（Thraustochytriales）又はラビリンチュラ類（Labyrinthulales）に属する微細藻類が挙げられ、これらの群から1種又は２種以上を用いることができる。
　上記ヤブレツボカビ類に属する微細藻類としては、例えば、オーランチオキトリウム属（Aurantiochytrium）、シゾキトリウム属（Schizochytrium）、スラウストキトリウム属（Thraustochytrium）、パリエティキトリウム属（Parietichytrium）、又はウルケニア属（Ulkenia）に属する微細藻類が挙げられ、これらの群から1種又は２種以上を用いることができる。
　上記ラビリンチュラ類に属する微細藻類としては、例えば、ラビリンチュラ属（Labyrinthula）に属する微細藻類が挙げられる。
　上記オーランチオキトリウム属に属する微細藻類としては、例えば、オーランチオキトリウム　リマシナム（Aurantiochytrium limacinum）又はオーランチオキトリウム　マングローベイ（Aurantiochytrium mangrovei）に属する微細藻類が挙げられる。オーランチオキトリウム　リマシナムの株としては、例えば、ＳＲ－２１株、４Ｗ－１ｂ株、ＮＩＥＳ３７３７株、ＡＴＣＣ　ＭＹＡ－１３８１株、ｍｈ０１８６株、及びＦ２９－ｂ株が挙げられる。オーランチオキトリウム　マングローベイの株としては、例えば、１８Ｗ－１３ａ株、ＲＣＣ８９３株、ＭＰ２株、ＢＬ１０株、及びＦＢ３株が挙げられ、これらの群から1種又は２種以上を用いることができる。
　ＳＲ－２１株は、工業技術院生命工学工業技術研究所（現在は、独立行政法人製品評価技術基盤機構　バイオテクノロジーセンター　特許生物寄託センター（ＮＩＴＥ-ＩＰＯＤ）に、「海生菌ＳＲ２１菌株」の名称で平成７年（１９９４年）３月６日付けで寄託され、受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ－５０３４を取得し、また、財団法人発酵研究所に平成７年３月１７日付けで寄託され、受入番号ＩＦＯ　３２６９３を取得している（特許文献４（特開平１０－０７２５９０号公報）の段落〔００３５〕）。また、ＳＲ－２１株は、ＡＴＣＣからも、ＡＴＣＣ　ＭＹＡ－１３８１株(Strain designation SR21 [IFO 32693])として入手可能であり（非特許文献１：https://www.atcc.org）；非特許文献２：https://www.ncbi.nlm.nih.gov）、非特許文献２にはこのＭＹＡ－１３８１株に関し、登録日：２０１１年６月２８日と記載されている。また、ＳＲ－２１株は、当初シゾキトリウム属に分類されていたが、現在はオーランチオキトリウム属に分類されている（非特許文献３：Mycoscience (2007) 48:199-211.等参照）。
　・NITE-IPOD:International Patent Organism Depositary (IPOD),  Biological Resource Center, National Institute of Technology and Evaluation(NITE), #120, 2-5-8 Kazusakamatari, Kisarazu-shi, Chiba 2920818, Japan.
　・ATCC:American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard,Manassas, VA 20110-2209,USA.
　本実施形態に係る従属栄養性微細藻類はγ－アミノ酪酸の含有量が多いため、例えば、当該従属栄養性微細藻類を摂取、投与又は塗布することにより、脳機能改善作用、リラックス作用、ストレス軽減作用、及び血圧低下作用、コラーゲン生成促進作用、表皮細胞増殖作用、ヒアルロン酸合成促進作用などが得られることが期待される。したがって、本実施形態に係る従属栄養性微細藻類の用途は、各種組成物（例えば、食品、医薬品、皮膚外用剤、飼料等）が好ましく、例えば、動物（人を含む）が経口で摂取する物品がより好ましく、より好ましくは、食品、医薬品又は飼料である。すなわち、本実施形態に係る従属栄養性微細藻類は、好ましくは、食品用、医薬品用、又は飼料用の従属栄養性微細藻類である。
２．γ－アミノ酪酸高含有従属栄養性微細藻類の製造方法
　上記γ－アミノ酪酸高含有従属栄養性微細藻類は、本発明の一実施形態に係る従属栄養性微細藻類の製造方法によって得られうる。当該従属栄養性微細藻類の製造方法は、具体的には、γ－アミノ酪酸の含有量が乾燥藻体１００ｇ当たり１００ｍｇ以上である従属栄養性微細藻類を製造する方法であり、すなわち、γ－アミノ酪酸高含有従属栄養性微細藻類の製造方法である。
　本実施形態に係る従属栄養性微細藻類の製造方法は、γ－アミノ酪酸を含む培地中で従属栄養性微細藻類を培養する工程（以下「培養工程」ともいう。）を含む。当該培養工程を行うことにより、培地中のγ－アミノ酪酸を従属栄養性微細藻類に取り込ませ、蓄積させることができる。これにより、従属栄養性微細藻類中のγ－アミノ酪酸の含有量を増加させることができる。さらに、当該培養工程を行うことにより、従属栄養性微細藻類によって、培地中のＬ－グルタミン酸をγ－アミノ酪酸に変換させ、γ－アミノ酪酸を当該微細藻類内に蓄積させることも可能である。また、当該培養工程を行うときに、γ－アミノ酪酸を蓄積させること、及び／又は、グルタミン酸からγ－アミノ酪酸への変換及び変換されたγ－アミノ酪酸を蓄積させることも可能である。したがって、上記培養工程により、γ－アミノ酪酸及び／又はグルタミン酸を含まない培地中で培養した従属栄養性微細藻類に比べてγ－アミノ酪酸の含有量が多い従属栄養性微細藻類が培養されうる。なお、グルタミン酸は、Ｌ－グルタミン酸が好ましい。
２－１．従属栄養性微細藻類の培養
２－１－１．培地
　本実施形態に係るγ－アミノ酪酸高含有従属栄養性微細藻類の製造方法は、γ－アミノ酪酸を含む培地を調製する工程（以下「培地調製工程」ともいう。）を含んでいてよい。上記培養工程において用いられる培地は、当該培地調製工程において調製されうる。当該培地は、γ－アミノ酪酸及び／又はグルタミン酸を含む培地でもよく、γ－アミノ酪酸を少なくとも含む培地であることが、γ－アミノ酪酸高含有の従属栄養性微細藻類を得やすいので、より好ましい。
　上記培養工程において用いられる培地中のγ－アミノ酪酸の含有量は、例えば１０ｍｇ／Ｌ以上、２０ｍｇ／Ｌ以上、３０ｍｇ／Ｌ以上、４０ｍｇ／Ｌ以上、５０ｍｇ／Ｌ以上、６０ｍｇ／Ｌ以上、７０ｍｇ／Ｌ以上、８０ｍｇ／Ｌ以上、９０ｍｇ／Ｌ以上、又は１００ｍｇ／Ｌ以上であってよい。
　また、上記培養工程において用いられる培地中のグルタミン酸の含有量は、例えば１０ｍｇ／Ｌ以上、２０ｍｇ／Ｌ以上、３０ｍｇ／Ｌ以上、４０ｍｇ／Ｌ以上、５０ｍｇ／Ｌ以上、６０ｍｇ／Ｌ以上、７０ｍｇ／Ｌ以上、８０ｍｇ／Ｌ以上、９０ｍｇ／Ｌ以上、又は１００ｍｇ／Ｌ以上であってよい。
　また、上記培養工程において用いられる培地中のγ－アミノ酪酸及びグルタミン酸の含有量は、上述したγ－アミノ酪酸含有量及びグルタミン酸含有量を適宜組み合わせた合計値であってよい。
　上記培地調製工程において、γ－アミノ酪酸及び／又はグルタミン酸を含む培地は、例えば、γ－アミノ酪酸及び／又はグルタミン酸を含む組成物又はγ－アミノ酪酸単体及び／又はグルタミン酸単体と、従属栄養性微細藻類の培養に必要な成分と、を用いて調製されうる。したがって、上記培地調製工程は、γ－アミノ酪酸を含む組成物又はγ－アミノ酪酸を用いてγ－アミノ酪酸を含む培地を調製する工程であってよい。γ－アミノ酪酸を含む組成物又はγ－アミノ酪酸単体の配合量を調整することにより、培地中のγ－アミノ酪酸の含有量を上記で述べた数値範囲に調整できる。また、グルタミン酸を含む培地は、例えば、グルタミン酸を含む組成物又はグルタミン酸単体と、従属栄養性微細藻類の培養に必要な成分と、を用いて調製されうる。したがって、上記培地調製工程は、グルタミン酸を含む組成物又はグルタミン酸を用いてグルタミン酸を含む培地を調製する工程であってよい。また、γ－アミノ酪酸及びグルタミン酸の両方を含む培地を調製してもよい。
　γ－アミノ酪酸を含む組成物は、例えば、焼酎粕、泡盛蒸留粕及び漬物などの発酵残渣及び発酵残液、並びに、γ－アミノ酪酸を含む食品を用いた食品製造過程での廃液及び廃棄食品など、水溶性のアミノ酸の一種としてγ－アミノ酪酸が存在しているものであればよい。グルタミン酸を含む組成物は、例えば、グルタミン酸やポリグルタミン酸を製造する際の食品製造過程、又は、グルタミン酸を含む食品を用いた食品製造過程での廃液及び廃棄食品など、水溶性のアミノ酸の一種としてグルタミン酸が存在しているものであればよい。なお、グルタミン酸は昆布；トマト等の野菜類；チーズ等の発酵食品や上述した焼酎蒸留粕、泡盛蒸留粕等の発酵残渣等に含まれる。γ－アミノ酪酸を含む組成物及び／又はグルタミン酸を含む組成物といったこれらは従属栄養性微細藻類の培養に用いる培地の材料として利用可能である。培地の材料として、γ－アミノ酪酸を含む組成物を少なくとも用いることが、γ－アミノ酪酸高含有従属栄養性微細藻類を得やすいので、好ましい。
　本発明者らは、培地を調製する際に用いるγ－アミノ酪酸及び／又はグルタミン酸を含む組成物として、泡盛蒸留粕等といった酒製造において発酵後に発生する残渣（以下、「酒製造残渣」ともいう）に着目した。泡盛蒸留粕は、泡盛の製造工程で発生し、その一部はもろみ酢、家畜の飼料、又は農作物の肥料として利用されているが、それでも捌ききれない場合は産業廃棄物として処理されている。泡盛蒸留粕等の酒製造残渣の廃棄量を低減させるため、泡盛蒸留粕等の酒製造残渣の新たな活用法が模索されているという現状がある。本発明者らは、泡盛蒸留粕等の酒製造残渣を培地の材料として活用することを検討した。その結果、本発明者らは、泡盛蒸留粕等の酒製造残渣の液体に由来する成分にγ－アミノ酪酸が含まれており、泡盛蒸留粕等の酒製造残渣の液体に由来する成分が上記培養工程に適していることを見出した。以下、上記培地調製工程について、泡盛蒸留粕等の酒製造残渣中の液体に由来する成分を含む培地を調製する場合を一例に挙げて説明する。
　本明細書における「酒」とは、特に限定されないが、原料から、麹菌及び酵母を用いて、発酵させて製造される酒が好ましい。酒製造残渣として、当該酒の製造工程において生じるスラリー状又は固形状の粕などが挙げられる。当該酒製造残渣として、日本酒粕、泡盛蒸留粕、焼酎蒸留粕などが挙げられ、これらから選択される１種又は２種以上を用いることができる。このうち、蒸留粕である、泡盛蒸留粕及び／又は焼酎蒸留粕が好ましい。酒の原料は、特に限定されず、日本酒、泡盛、焼酎等の製造で一般的に使用されている原料（例えば、穀類及び芋類等）が挙げられ、より具体的な例として、例えば、米、大麦、小麦、蕎麦、大豆、トウモロコシ等の穀類；サツマ芋等の芋類；サトウキビ；栗等が挙げられ、これらから選択される１種又は２種以上を用いることができる。
　「泡盛蒸留粕」とは、泡盛の製造工程において生じる蒸留残渣であり、焼酎蒸留粕」とは、焼酎の製造工程において生じる蒸留残渣である。また、「日本酒粕」とは、日本酒の製造工程において生じる醸造残渣である。酒粕の状態は特に限定されないが、泡盛蒸留粕又は焼酎蒸留粕は、スラリー状等を挙げることができ、日本酒粕は、固形状等を挙げることができる。泡盛蒸留酒粕等の酒製造残渣は、アミノ酸及びクエン酸などの有機酸並びにミネラル及びビタミンなどを含有する液体と、タンパク質及び食物繊維などを含有する固体と、を含む。
　泡盛蒸留粕等の酒製造残渣中の液体に由来する成分を含む培地は、泡盛蒸留粕等の酒製造残渣中の液体に由来する成分を少なくとも含んでいればよく、泡盛蒸留粕等の酒製造残渣中の固体に由来する成分を含んでいてもよく、含んでいなくてもよい。
　泡盛蒸留粕等の酒製造残渣中の液体に由来する成分を含む培地は、上記培地調製工程において調製されうる。培地調製工程において、泡盛蒸留粕等の酒製造残渣は、例えば、固液分離されてもよく、されなくてもよい。
　まず、一例として、培地調製工程は、泡盛蒸留粕等の酒製造残渣を固液分離することを含む工程であってよい。具体的には、培地調製工程は、泡盛蒸留粕等の酒製造残渣を固液分離して得られた液体に由来する成分を含む培地を調製する工程であってよい。
　上記固液分離は、例えば、遠心分離、沈降分離、ろ過分離、圧搾、及び市販の固液分離機などの既知の手段によって行われてよい。
　固液分離して得られた液体は、例えば、そのまま用いられてよい。すなわち、培地調製工程において、固液分離して得られた液体そのものを用いて培地を調製してよい。例えば、当該液体と後述する添加物とを混合して、培地を調製してもよい。または、固液分離して得られた液体に少なくとも１つの処理が施されたものを用いて培地を調製してもよい。例えば、固液分離して得られた液体に乾燥処理を施して乾燥物を作製し、その後、当該乾燥物と後述する添加物と水とを混合して培地を調製してもよい。
　固液分離される泡盛蒸留粕等の酒製造残渣は、例えば、少なくとも１つの処理が施された後に用いられてもよい。当該少なくとも１つの処理は、例えば、冷蔵、冷凍、加熱、濃縮、滅菌、及び乾燥から選択されてよい。
　次に、他の一例として、培地調製工程は、泡盛蒸留粕等の酒製造残渣を固液分離することを含まない工程であってもよい。具体的には、培地調製工程は、泡盛蒸留粕等の酒製造残渣を固液分離せずに用いて当該泡盛蒸留粕等の酒製造残渣中の液体に由来する成分を含む培地を調製する工程であってもよい。
　固液分離せずに用いられる泡盛蒸留粕等の酒製造残渣は、例えば、熟成もろみの蒸留において生じた泡盛蒸留粕（蒸留残渣）等の酒製造残渣に固液分離以外の少なくとも１つの処理が施されたものであってもよい。当該少なくとも１つの処理は、例えば、冷蔵、冷凍、加熱、濃縮、滅菌、及び乾燥から選択されてよい。例えば、泡盛蒸留粕等の酒製造残渣に乾燥処理を施して乾燥物を作製し、その後、当該乾燥物と後述する添加物と水とを混合して培地を調製してもよい。
　培地調製工程において調製される培地は、泡盛蒸留粕等の酒製造残渣中の液体に由来する成分以外に、添加物を含んでいてよい。すなわち、培地調製工程は、泡盛蒸留粕等の酒製造残渣中の液体に由来する成分と、添加物と、を含む培地を調製する工程であってよい。
　上記添加物としては、例えば、糖類、ミネラル成分（天然海水及び人工海水を含む）、有機酸、無機酸、有機塩基、無機塩基、ビタミン、アミノ酸、ペプチド、及びタンパク質が挙げられる。培地に含まれる添加物の種類は、培養される従属栄養性微細藻類の種類に応じて当業者によって適宜選択されてよい。
　上記糖類としては、例えば、グルコース、ガラクトース、フルクトース、マルトース、シュクロース、ラクトース、オリゴ糖、及び糖アルコール（グリセロールなど）から選択される少なくとも１つの糖類が挙げられる。培地中の糖類の量は、培養される従属栄養性微細藻類の種類に応じて当業者によって適宜調整されてよい。
　上記ミネラル成分としては、例えば、硫酸カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸鉄、硫酸アンモニウム、硫酸銅、硫酸ニッケル、及び硫酸亜鉛などの硫酸塩；リン酸カリウムなどのリン酸塩；炭酸カルシウムなどの炭酸塩；塩化コバルト、塩化マンガン、塩化ナトリウム、及び塩化カルシウムなどの塩化物；アルカリ金属酸化物；モリブデン酸ナトリウムなどのモリブデン酸塩；亜セレン酸ナトリウムなどの亜セレン酸塩；臭化カリウム及びヨウ化カリウムなどのハロゲン化物；天然海水塩；レッドシーソルト（Ｒｅｄ　Ｓｅａ　Ｓａｌｔ）などの人工海水塩；から選択される少なくとも１つのミネラル成分が挙げられる。培地中のミネラル成分の量は、培養される従属栄養性微細藻類の種類に応じて当業者によって適宜調整されてよい。
　培地調製工程において、泡盛蒸留粕等の酒製造残渣中の液体に由来する成分を含む培地のｐＨは、必要に応じて調整されてよい。例えば、培地調製工程において、上記添加物を添加する前及び／又は後において、酸又は塩基を添加してｐＨを調整してもよい。当該ｐＨは、培養される従属栄養性微細藻類の種類に応じて当業者によって適宜調整されてよい。
　培地調製工程において、泡盛蒸留粕等の酒製造残渣中の液体に由来する成分を含む培地は、好ましくは滅菌される。すなわち、培地調製工程は、好ましくは、泡盛蒸留粕等の酒製造残渣中の液体に由来する成分を含む培地を調製及び滅菌する工程である。当該滅菌は、オートクレーブ滅菌、濾過滅菌、煮沸滅菌、及び放射線滅菌などの既知の手段によって行われてよい。
　例えば、泡盛蒸留粕等の酒製造残渣の固体部分が培地中に残存している場合、高温下で当該培地を滅菌することにより、培地中の固体部分の一部又は全部が可溶化することがある。このように、滅菌する処理が、培地に含まれる泡盛蒸留粕等の酒製造残渣由来の固体部分を可溶化させる処理を兼ねていてもよい。
　泡盛蒸留粕等の酒製造残渣中の液体に由来する成分を含む培地は、液体培地でもよく固体培地でもよい。従属栄養性微細藻類を大量培養する場合には、固体培地よりも液体培地の方が適している。
　以上、泡盛蒸留粕等の酒製造残渣中の液体に由来する成分を含む培地を例示したが、本実施形態に係るγ－アミノ酪酸高含有従属栄養性微細藻類の製造方法において用いられる培地はこれに限定されず、γ－アミノ酪酸を含む培地であればよい。また、培地調製工程として泡盛蒸留粕を用いてγ－アミノ酪酸を含む培地を調製する工程を主に例示したが、培地調製工程はこれに限定されず、例えば、泡盛蒸留粕等の酒製造残渣以外のγ－アミノ酪酸を含む組成物、又はγ－アミノ酪酸を用いて、培地を調製してもよい。
２－１－２．培養条件
　培養工程における培養温度、培養期間、及び培養法などの培養条件は、従属栄養性微細藻類を培養可能な条件であればよい。例えば、温度は５～４０℃、好ましくは１０～３５℃、より好ましくは２０～２８℃、さらにより好ましくは２５℃±１℃にて、通常１～１０日間、好ましくは３～７日間、例えば４～５日間培養を行い、通気攪拌培養、振とう培養、又は静置培養で行うことができる。また、培地中のγ－アミノ酪酸及び／又はグルタミン酸の各濃度を調整してから培養を開始してもよいが、培養開始後の培養工程中でこれらの各濃度を所定濃度になるように調整してもよく、例えば、培養工程において、培養開始後に、γ－アミノ酪酸及び／又はグルタミン酸を含む組成物を培地に流加して、培地中のこれらの濃度を調整してもよい。好ましくは、培養工程において、培養開始後に、グルタミン酸を含む組成物を流加しながら、培地中のグルタミン酸濃度が所定濃度になるように調整することであり、このときの培地中のグルタミン酸濃度（グルタミン酸Ｎａ換算）は、特に限定されないが、例えば、０．００１～５０ｇ／Ｌ／ｈｒである。
　従属栄養性微細藻類を大量培養する場合、培養工程は、好ましくは、種培養と本培養とに分けて、又は、種培養と前培養と本培養とに分けて行われる。具体的には、培養工程は、種培養用の培地中で従属栄養性微細藻類を培養して種藻を得る種培養工程と、γ－アミノ酪酸を含む（例えば泡盛蒸留粕等の酒製造残渣中の液体に由来する成分を含む）本培養用の培地中で当該種藻を培養する本培養工程と、を含むことが好ましい。または、培養工程は、上記種培養工程と、γ－アミノ酪酸（例えば泡盛蒸留粕等の酒製造残渣中の液体に由来する成分）を含む前培養用の培地中で当該種藻を培養する前培養工程と、γ－アミノ酪酸（例えば泡盛蒸留粕等の酒製造残渣中の液体に由来する成分）を含む本培養用の培地中に前培養培地を加えて培養する本培養工程と、を含むことが好ましい。
　種培養用の培地は、例えば、従属栄養性微細藻類を培養する培地として既知の培地であってもよく、泡盛蒸留粕等の酒製造残渣中の液体に由来する成分を含む培地であってもよい。効率的に大量培養するためには、種培養用の培地は、従属栄養性微細藻類を培養する培地として既知の培地であることが好ましい。種培養用の培地としてγ－アミノ酪酸（例えば泡盛蒸留粕等の酒製造残渣中の液体に由来する成分）を含む培地を用いる場合、種培養用の培地の成分組成は、前培養用又は本培養用の培地と同一でもよく、異なってもよい。前培養用の培地の成分組成は、本培養用の培地と同一でもよく、異なってもよい。
　従属栄養性微細藻類は、適当な細胞培養手段を有する培養装置で培養されてよい。「細胞培養手段」とは、細胞を培養するための機能を有する手段を意味し、例えば、培養槽である。当該培養槽は、攪拌装置、振動装置、温度制御装置、ｐＨ調節装置、濁度測定装置、光制御装置、Ｏ２、ＣＯ２などの気体濃度測定装置、及び圧力測定装置から選択される１又は複数の装置を有してもよい。当該培養槽は濃縮・分離槽と同一の槽であってもよく、濃縮・分離槽とは別の槽であってもよい。培養槽が濃縮・分離槽と別の槽である場合、適切な手段（例えば流路）により、培養槽と濃縮・分離槽とが連結されていてもよい。
２－２．従属栄養性微細藻類の回収
　本実施形態に係るγ－アミノ酪酸高含有従属栄養性微細藻類の製造方法は、さらに、従属栄養性微細藻類を回収する工程（以下「回収工程」ともいう。）を含んでいてよい。当該回収工程は、具体的には、上記で説明した培養工程によって培養された従属栄養性微細藻類を回収する工程である。
　回収工程において、従属栄養性微細藻類は、培地から分離して回収されてもよく、培地と共に回収されてもよい。すなわち、回収工程おいて回収される従属栄養性微細藻類は、培地から分離された従属栄養性微細藻類であってもよく、従属栄養性微細藻類と培地との混合物であってもよい。培地から分離された従属栄養性微細藻類を回収する場合、回収工程は、培養された従属栄養性微細藻類を培地から分離する工程（以下「分離工程」ともいう。）を含んでいてよい。分離工程において、培地と従属栄養性微細藻類との分離は、例えば、遠心分離又は濾過などの既知の手段によって行われてよい。
２－３．従属栄養性微細藻類の乾燥
　本実施形態に係るγ－アミノ酪酸高含有従属栄養性微細藻類の製造方法は、さらに、従属栄養性微細藻類を乾燥する工程（以下「乾燥工程」ともいう。）を含んでいてよい。乾燥工程において、培養された従属栄養性微細藻類が乾燥され、当該従属栄養性微細藻類は乾燥藻体となる。当該乾燥工程は、例えば、上記回収工程よりも後に行われてよい。
　乾燥される従属栄養性微細藻類は、例えば、培地から分離された従属栄養性微細藻類であってもよく、従属栄養性微細藻類と培地との混合物であってもよい。乾燥を効率的に行うためには、乾燥される従属栄養性微細藻類は、培地から分離された従属栄養性微細藻類であることが好ましい。すなわち、好ましい実施態様において、上記回収工程は上記分離工程を含む工程であり、且つ、上記乾燥工程は培地から分離された従属栄養性微細藻類を乾燥する工程である。
　上記乾燥は、既知の手段によって行われてよい。例えば、当該乾燥は、加熱乾燥、低温乾燥、通風乾燥、減圧乾燥、凍結乾燥、噴霧乾燥、自然乾燥、及び市販の乾燥装置などから選択される少なくとも１つによって行われてよい。
２－４．従属栄養性微細藻類の粉砕
　本実施形態に係るγ－アミノ酪酸高含有従属栄養性微細藻類の製造方法は、上記で説明した工程以外に、従属栄養性微細藻類を粉砕する工程（以下「粉砕工程」ともいう。）を含んでいてよい。粉砕工程は、例えば、上記回収工程の後且つ上記乾燥工程の前、又は、上記乾燥工程の後に行われてよい。粉砕工程は、好ましくは、上記乾燥工程の後に行われる。乾燥工程後の従属栄養性微細藻類（乾燥藻体）は、水分量が低下しているため、粉砕が容易であり、また、小さい粒度となるように粉砕することもできる。当該粉砕は、既知の粉砕手段によって行われてよい。
　本実施形態に係る製造方法によって、γ－アミノ酪酸高含有従属栄養性微細藻類を得ることができ、このような微細藻類を得るための製造方法であってもよい。
　ところで、本発明者らは先に、特願２０２２－６９１３（特許文献５：特許７２１８０２３号公報）において、従属栄養性微細藻類自体のにおい及び味を改善する技術を提案した。特願２０２２－６９１３に開示されているように、本発明者らは、泡盛蒸留粕の液体に由来する成分を含む培地中で従属栄養性微細藻類を培養する工程と、当該培養された従属栄養性微細藻類を乾燥する工程と、を行うことにより、従属栄養性微細藻類のにおい及び味を改善できることを見出した。
　本実施形態において製造される従属栄養性微細藻類のにおい及び味を改善したい場合、例えば、特願２０２２－６９１３において開示された技術の適用が検討されてもよい。当該技術を適用する場合、本実施形態に係るγ－アミノ酪酸高含有従属栄養性微細藻類の製造方法は、例えば、泡盛蒸留粕等の酒製造残渣の液体に由来する成分を含む培地中で従属栄養性微細藻類を培養する工程と、当該培養された従属栄養性微細藻類を乾燥する工程と、を含んでいてよい。また、当該製造方法は、上記粉砕工程をさらに含んでいてもよい。粉砕工程を行なうことで、得られる乾燥藻体の粒度を低減できる。これにより、乾燥藻体を含む物品の口当たりを向上させたり、乾燥藻体を他の原料に配合した場合の分散性を向上させたりすることが可能である。なお、本実施形態に係るγ－アミノ酪酸高含有従属栄養性微細藻類を製造する際に、特願２０２２－６９１３（特許文献５：特許７２１８０２３号公報）に記載の製造方法を適用してもよい。
３．γ－アミノ酪酸高含有従属栄養性微細藻類を含有する食品、医薬品、又は飼料等
　本発明は、γ－アミノ酪酸高含有従属栄養性微細藻類を含有する組成物（例えば食品、医薬品、飼料、又は皮膚外用剤など）も提供することができる。γ－アミノ酪酸高含有従属栄養性微細藻類は、具体的には、γ－アミノ酪酸の含有量が乾燥藻体１００ｇ当たり１００ｍｇ以上である従属栄養性微細藻類である。当該従属栄養性微細藻類の詳細は、上記１．及び２．で説明したとおりであり、当該説明が本実施形態にも当てはまる。
　本明細書において「食品」とは、人が食べるために直接使用できる、食用可能な状態のものをいう。飼料（餌料を含む）などの人以外の動物に与えられる食物は、本明細書に記載されている「食品」に該当しない。
　食品には、例えば、一般食品、特定用途食品、及び保健機能食品（特定保健用食品、栄養機能食品、及び機能性表示食品）が含まれる。一般食品には、いわゆる健康食品と呼ばれるものが含まれ、例えば、機能性食品、栄養補助食品、健康補助食品、及びサプリメントなどが含まれる。
　食品の種類としては、例えば、肉加工品、水産加工品、乳加工品、野菜加工品、果実加工品、油脂食品、嗜好食品、調味料、菓子類、冷凍食品、レトルト食品、缶詰食品、びん詰め食品、及びインスタント食品などが挙げられるが、これらに限定されない。
　飼料は、人以外の動物に与えられる餌である。飼料には、例えば、ペットフード、家畜飼料、家禽飼料、及び養魚飼料が含まれる。飼料が与えられる動物としては、例えば、家畜類（牛、豚、鶏、馬、ヒツジ、ヤギなど）、魚類、貝類、及びペット（イヌ、ネコ、ハムスター、ウサギ、インコ、熱帯魚、爬虫類、両生類、昆虫など）などが挙げられるが、これらに限定されない。
　γ－アミノ酪酸高含有従属栄養性微細藻類含有の組成物（例えば食品、医薬品、及び飼料等）の形態としては、例えば、液体状、固体状、半固体状、ペースト状、顆粒状、粉末状、及びカプセル状などが挙げられるが、特に限定されない。
　本実施形態に係るγ－アミノ酪酸高含有従属栄養性微細藻類含有の組成物（例えば食品、医薬品、飼料、皮膚外用剤、経口組成物等）はγ－アミノ酪酸の含有量が多いため、当該食品、医薬品、又は飼料等の摂取、投与又は塗布など使用により、脳機能改善作用、リラックス作用、ストレス軽減作用、及び血圧低下作用などが得られることが期待される。
　よって、本実施形態に用いるγ－アミノ酪酸高含有従属栄養性微細藻類は、脳機能改善作用、リラックス作用、ストレス軽減作用、及び血圧低下作用の組成物に含有させることができ、γ－アミノ酪酸によって予防、改善又は治療が可能な症状又は疾患の予防、改善又は治療に用いることができる。
　また、本実施形態は、脳機能改善用組成物、リラックス用組成物、ストレス軽減用組成物、及び血圧低下用組成物などの各種組成物又は各種薬剤の製造における又は製造のために用いる、前記γ－アミノ酪酸高含有従属栄養性微細藻類又はその使用を提供することもできる。
　また、本実施形態は、前記γ－アミノ酪酸高含有従属栄養性微細藻類又はこれを含む組成物を用いる、γ－アミノ酪酸によって予防、改善又は治療が可能な症状又は疾患の予防方法、改善方法又は治療方法を提供することができる。
　また、本実施形態は、γ－アミノ酪酸によって予防、改善又は治療が可能な症状又は疾患の予防用、改善用又は治療用の前記γ－アミノ酪酸高含有従属栄養性微細藻類又はこれを含む組成物を提供することもできる。
　また、本実施形態に係る組成物には、上述した症状又は疾患、これらに関連する症状又は疾患などに関する予防、改善又は治療等をコンセプトとし、必要に応じてその旨を表示した食品、サプリメントなどを包含してもよく、摂取用の組成物が好適である。
　本実施形態において、「予防」とは、適用対象における症状若しくは疾患の発症の防止若しくは発症の遅延、又は適用対象における症状若しくは疾患の発症の危険性を低下させること等をいう。本技術において、「改善」とは、適用対象における疾患、症状又は状態の好転又は維持；悪化の防止又は遅延；進行の逆転、防止又は遅延をいう。また、「非治療目的」とは、医療行為、すなわち、治療による人体への処置行為を含まない概念である。例えば、健康増進、美容行為等が挙げられる。
４．上記γ－アミノ酪酸高含有従属栄養性微細藻類含有組成物（例えば、食品、医薬品、飼料、又は皮膚外用剤等）の製造方法
　本発明は、γ－アミノ酪酸高含有従属栄養性微細藻類を含有する組成物（例えば、食品、医薬品、飼料、皮膚外用剤など）の製造方法も提供する。本発明の一実施形態に係る製造方法は、具体的には、γ－アミノ酪酸を含む培地中で培養された従属栄養性微細藻類（γ－アミノ酪酸高含有従属栄養性微細藻類）を用いることを含む。
　上記γ－アミノ酪酸を含む培地中で培養された従属栄養性微細藻類は、好ましくは、本発明の一実施形態に係るγ－アミノ酪酸高含有従属栄養性微細藻類の製造方法によって製造された従属栄養性微細藻類である。すなわち、本実施形態に係る組成物（例えば、食品、医薬品、又は飼料、皮膚外用剤等）の製造方法は、好ましくは、本発明の一実施形態に係るγ－アミノ酪酸高含有従属栄養性微細藻類の製造方法において説明した工程を含んでいてよい。当該工程の詳細は、上記２．で説明したとおりである。
　本実施形態に係る組成物の製造方法は、γ－アミノ酪酸高含有従属栄養性微細藻類と、組成物として許容される１以上の成分と、を用いることを含む。本実施形態に係る食品の製造方法は、γ－アミノ酪酸高含有従属栄養性微細藻類と、食品として許容される１以上の成分と、を用いることを含む。本実施形態に係る医薬品の製造方法は、γ－アミノ酪酸高含有従属栄養性微細藻類と、医薬品として許容される１以上の成分と、を用いることを含む。本実施形態に係る飼料の製造方法は、γ－アミノ酪酸高含有従属栄養性微細藻類と、飼料として許容される１以上の成分と、を用いることを含む。
　本実施形態に係る製造方法によって製造されるγ－アミノ酪酸高含有従属栄養性微細藻類含有組成物（例えば、食品、医薬品、及び飼料等）の詳細は、上記３．で説明したとおりであり、当該説明が本実施形態にも当てはまる。
５．従属栄養性微細藻類中のγ－アミノ酪酸の含有量を増加させる方法
　上記で述べたとおり、γ－アミノ酪酸を含む培地中で従属栄養性微細藻類を培養することにより、従属栄養性微細藻類中のγ－アミノ酪酸の含有量を増加させることができる。上記培養により、培地中のγ－アミノ酪酸を従属栄養性微細藻類に取り込ませ、蓄積させることができるからである。したがって、本発明は、従属栄養性微細藻類中のγ－アミノ酪酸の含有量を増加させる方法（以下「γ－アミノ酪酸含有量増加方法」ともいう。）も提供する。
　本発明の一実施形態に係るγ－アミノ酪酸含有量増加方法は、γ－アミノ酪酸を含む培地中で従属栄養性微細藻類を培養する工程を含む。当該工程は、上記２．で説明した培養工程と同じである。また、本実施形態に係るγ－アミノ酪酸含有量増加方法は、培養工程以外に、培地調製工程、回収工程、及び乾燥工程から選択される少なくとも１つの工程を含んでいてよい。これらの工程の詳細は、上記２．で説明したとおりであり、当該説明が本実施形態にも当てはまる。
　本明細書において、「γ－アミノ酪酸の含有量を増加させる」とは、従属栄養性微細藻類中のγ－アミノ酪酸の含有量を上記培養工程により増加させることをいう。当該増加は、上記培養工程前における従属栄養性微細藻類中のγ－アミノ酪酸の含有量を、例えば１．１倍以上、１．３倍以上、１．５倍以上、１．８倍以上、２．０倍以上、２．３倍以上、２．５倍以上、２．８倍以上、３．０倍以上、３．５倍以上、４．０倍以上、４．５倍以上、５．０倍以上、５．５倍以上、又は６．０倍以上に増加させることであってよい。
６．培地からγ－アミノ酪酸を回収する方法
　上記で述べたとおり、γ－アミノ酪酸を含む培地中で従属栄養性微細藻類を培養することにより、培地中のγ－アミノ酪酸を従属栄養性微細藻類に取り込ませ、蓄積させることができる。培地中のγ－アミノ酪酸を取り込んだ従属栄養性微細藻類を回収することにより、結果として、γ－アミノ酪酸を培地から回収することができる。したがって、本発明は、培地からγ－アミノ酪酸を回収する方法も提供する。
　本発明の一実施形態に係る培地からγ－アミノ酪酸を回収する方法は、γ－アミノ酪酸を含む培地中で従属栄養性微細藻類を培養する工程と、当該従属栄養性微細藻類を回収する工程と、を含む。これらの工程は、それぞれ、上記２．で説明した培養工程及び回収工程と同じである。また、本実施形態に係る培地からγ－アミノ酪酸を回収する方法は、培養工程及び回収工程以外に、培地調製工程及び／又は乾燥工程を含んでいてよい。これらの工程の詳細は、上記２．で説明したとおりであり、当該説明が本実施形態にも当てはまる。
７．組成物からγ－アミノ酪酸を回収する方法
　上記で述べたとおり、γ－アミノ酪酸を含む組成物を用いて調製された培地中で従属栄養性微細藻類を培養することにより、培地中のγ－アミノ酪酸を従属栄養性微細藻類に取り込ませ、蓄積させることができる。培地中のγ－アミノ酪酸を取り込んだ従属栄養性微細藻類を回収することにより、結果として、上記組成物に含まれていたγ－アミノ酪酸を培地から回収することができる。したがって、本発明は、組成物からγ－アミノ酪酸を回収する方法も提供する。
　本発明の一実施形態に係る組成物からγ－アミノ酪酸を回収する方法は、γ－アミノ酪酸を含む組成物を用いて培地を調製する工程と、当該培地中で従属栄養性微細藻類を培養する工程と、当該従属栄養性微細藻類を回収する工程と、を含む。これらの工程は、それぞれ、上記２．で説明した培地調製工程、培養工程、及び回収工程と同じである。また、本実施形態に係る組成物からγ－アミノ酪酸を回収する方法は、培地調製工程、培養工程、及び回収工程以外に、乾燥工程を含んでいてよい。乾燥工程の詳細は、上記２．で説明したとおりであり、当該説明が本実施形態にも当てはまる。
　本実施形態の培地調製工程において用いられる組成物は、例えば泡盛蒸留粕であってよいが、本発明の効果を損なわない限り特に限定されない。
　８．本発明は、以下の構成又は技術的特徴を適宜採用することができる。
・〔１〕　γ－アミノ酪酸の含有量が、乾燥藻体１００ｇ当たり１００ｍｇ以上である、従属栄養性微細藻類。
・〔２〕　前記従属栄養性微細藻類が、ヤブレツボカビ類（Thraustochytriales）に属する微細藻類である、前記〔１〕に記載の従属栄養性微細藻類。
・〔３〕　前記従属栄養性微細藻類が、オーランチオキトリウム属（Aurantiochytrium）に属する微細藻類である、前記〔１〕又は〔２〕に記載の従属栄養性微細藻類。
・〔４〕　前記〔１〕～〔３〕のいずれか１つに記載の従属栄養性微細藻類を含有する、組成物。好ましくは、食品、医薬品、又は飼料である。
・〔５〕　γ－アミノ酪酸を含む培地中で従属栄養性微細藻類を培養する工程を含む、従属栄養性微細藻類の製造方法、又は、従属栄養性微細藻類含有組成物の製造方法。当該従属栄養性微細藻類は、前記〔２〕又は〔３〕に記載の従属栄養性微細藻類であることが好適である。当製造された従属栄養性微細藻類は、γ－アミノ酪酸高含有従属栄養性微細藻類であることが好適である。当該培地は、酒製造残渣中の液体に由来する成分を含む培地を調製及び滅菌したγ－アミノ酪酸を含む培地である。
・〔６〕　前記培養工程後に、前記従属栄養性微細藻類を回収する工程を含む、前記〔５〕記載の製造方法。
・〔７〕　前記培養工程中又は当該工程前に、γ－アミノ酪酸を含む組成物を用いて培地を調製する工程を含む、前記〔５〕又は〔６〕に記載の製造方法。
・〔８〕　γ－アミノ酪酸を含む組成物を用いて培地を調製する工程と、
　前記培地中で従属栄養性微細藻類を培養する工程と、
　前記従属栄養性微細藻類を回収する工程と、を含む、従属栄養性微細藻類の製造方法、又は、従属栄養性微細藻類含有組成物の製造方法。
・〔９〕　従属栄養性微細藻類中のγ－アミノ酪酸の含有量を増加させるための、又は、培地からγ－アミノ酪酸を回収するための、又は、食品、医薬品若しくは飼料を製造するための、前記〔５〕～〔８〕のいずれか１つに記載の製造方法。
・〔１０〕　前記培地が、（i）γ－アミノ酪酸含有組成物を調整及び滅菌して得られた培地である、又は、（ii）酒製造残渣又は酒製造残渣中の液体に由来する成分を含む培地を調整及び滅菌して得られた培地である、前記〔１〕～〔９〕に記載のいずれか１つの製造方法。培養工程中又は当該工程前に、酒製造残渣又は酒製造残渣中の液体に由来する成分を含む培地を調整及び滅菌する工程を含んでもよい。
・〔１１〕　前記〔５〕～〔１０〕のいずれか１つに記載の製造方法により得られた、γ－アミノ酪酸高含有従属栄養性微細藻類を用いる、γ－アミノ酪酸高含有従属栄養性微細藻類を含む組成物の製造方法。
・〔１２〕　前記〔５〕～〔１０〕のいずれか１つに記載の製造方法により得られた、γ－アミノ酪酸高含有従属栄養性微細藻類又はこの使用。
・〔１３〕　γ－アミノ酪酸を含む培地中で従属栄養性微細藻類を培養する工程を含む、従属栄養性微細藻類中のγ－アミノ酪酸の含有量を増加させる方法。
・〔１４〕　γ－アミノ酪酸を含む培地中で従属栄養性微細藻類を培養する工程と、　前記従属栄養性微細藻類を回収する工程と、を含む、培地からγ－アミノ酪酸を回収する方法。
・〔１５〕　γ－アミノ酪酸を含む組成物を用いて培地を調製する工程と、　前記培地中で従属栄養性微細藻類を培養する工程と、　前記従属栄養性微細藻類を回収する工程と、を含む、組成物からγ－アミノ酪酸を回収する方法。
・〔１６〕　γ－アミノ酪酸を含む培地中で培養された従属栄養性微細藻類を用いること、又は、前記〔５〕～〔１０〕のいずれか１つに記載の製造方法により得られるγ－アミノ酪酸高含有従属栄養性微細藻類を用いることを含む、組成物（例えば、食品、医薬品、又は飼料など）又は当該組成物の製造方法。当該培養された従属栄養性微細藻類は、γ－アミノ酪酸高含有従属栄養性微細藻類であることが、好ましい。
・〔１７〕　前記培地が、酒製造残渣又は酒製造残渣中の液体に由来する成分を含む培地を調整及び滅菌して得られた培地である、前記〔１３〕～〔１６〕に記載のいずれか１つの方法。培養工程中又は当該工程前に、酒製造残渣又は酒製造残渣中の液体に由来する成分を含む培地を調整及び滅菌する工程を含んでもよい。
・〔１８〕　前記従属栄養性微細藻類が、前記〔２〕又は〔３〕に記載の従属栄養性微細藻類である、前記〔１３〕～〔１７〕に記載のいずれか１つの方法。
・〔１９〕　前記従属栄養性微細藻類が、抑制型神経伝達、脳機能改善、リラックス、ストレス軽減、血圧低下、睡眠の質改善から選択される１種又は２種以上に用いられるものである、前記〔１〕～〔４〕のいずれか１つに記載の従属栄養性微細藻類、又は、前記〔５〕～〔１８〕に記載のいずれか１つの方法。
・〔２０〕　前記組成物が、抑制型神経伝達、脳機能改善、リラックス、ストレス軽減、血圧低下、不安感の低減、睡眠の質改善から選択される１種又は２種以上に用いられるものである、前記〔４〕に記載の組成物、又は、前記〔５〕～〔１８〕に記載のいずれか１つの方法。
・〔２１〕　前記脳機能改善が、過食症、うつ病、認知機能障害などから選択される１種又は２種以上の疾患又は症状の予防・改善である、前記〔１９〕に記載の組成物、又は、前記〔２０〕に記載の方法。前記認知機能障害として、例えば軽度認知機能障害、アルツハイマー病、老化による認知機能障害（例えば、記憶力、空間認知力等の低下等）等；などから選択される１種又は２種以上が挙げられる。
　以下で実施例を参照して本発明をより詳しく説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
＜試験例１＞
（１）実施例１の乾燥藻体の製造
　以下の手順に従って従属栄養性微細藻類を培養し、乾燥藻体を得た。
ａ）泡盛蒸留粕上清培地の調製
　泡盛製造工場から入手した泡盛蒸留粕（蒸留残渣）を６０００×ｇで１０分間遠心分離した。得られた液体（上清）をｐＨ６に調整し、泡盛蒸留粕上清培地を得た。
ｂ）ＧＴＹ培地の調製
　蒸留水１Ｌに対して、グルコース２０ｇ、酵母エキス５ｇ、トリプトン１０ｇ、及びレッドシーソルト（Ｒｅｄ　Ｓｅａ　Ｓａｌｔ）１６．７ｇを添加した。これにより、ＧＴＹ培地を得た。
ｃ）種培養
　ＮＩＴＥ（独立行政法人製品評価技術基盤機構）から分譲されたオーランチオキトリウム　リマシナムＳＲ－２１株（ＦＥＲＭ　ＢＰ－５０３４）を、ＧＴＹ培地で３日間振とう培養し、種藻を得た。
ｄ）本培養
　９０Ｌジャーファメンターに、泡盛蒸留粕上清培地３０Ｌ、水道水３０Ｌ、グルコース１．２ｋｇ、レッドシーソルト１ｋｇを入れ、１２１℃で２０分間蒸気滅菌した。これにより、泡盛蒸留粕中の液体に由来する成分を含む培地（以下「泡盛蒸留粕含有培地」ともいう。）を得た。当該泡盛蒸留粕含有培地に、種藻を含むＧＴＹ培地を播種し、好気条件下で２４時間撹拌培養した。
ｅ）回収及び乾燥
　本培養後の培地を６０００×ｇで１０分間遠心分離し、培養されたオーランチオキトリウム　リマシナム（藻体）を培地から分離した。分離された固形分（藻体）を回収し、ドラムドライヤーを用いて１５０℃で１分間乾燥して、実施例１の乾燥藻体を得た。
（２）比較例１の乾燥藻体の製造
　上記（１）ｃ）と同一の条件でオーランチオキトリウム　リマシナムを培養し、比較例１の藻体を得た。その後、上記（１）e）の手順に従い、比較例１の乾燥藻体を得た。
（３）γ－アミノ酪酸の含有量の測定
　実施例１の培養（本培養）０時間の培地、実施例１の乾燥藻体、比較例１の培養０時間の培地、及び比較例１の乾燥藻体のそれぞれについて、γ－アミノ酪酸の含有量を測定した。当該測定は、ニンヒドリン試液によるポストカラム誘導体化法によるアミノ酸自動分析計を用いて実施された。
　測定結果を下記表１に示す。なお、実施例１の試験については２回実施したため、表１において、それぞれの試験で得られた培地及び乾燥藻体を「実施例１－１」、「実施例１－２」と表記した。
　上記表１の結果から、泡盛蒸留粕含有培地を用いることにより、ＧＴＹ培地に比べて藻体中のγ－アミノ酸含有量を増加できることが分かる。これにより、本発明によって藻体中のγ－アミノ酪酸の含有量を増加できることが確認された。また、本発明によってγ－アミノ酪酸高含有藻体が得られることが確認された。
＜試験例２＞
（１）実施例２の乾燥藻体の製造
　以下の手順に従って従属栄養性微細藻類を培養し、乾燥藻体を得た。
　上記試験例１の（１）ａ）～ｃ）の手順に従い、培地の調製と種培養を行った。その後、下記のｄ）前培養及びe）本培養を行った。
ｄ）前培養
　９０Ｌジャーファメンターに、泡盛蒸留粕上清培地１５Ｌ、水道水４５Ｌ、グルコース１．２ｋｇ、レッドシーソルト１ｋｇを入れ、１２１℃で２０分間蒸気滅菌した。これにより、泡盛蒸留粕含有培地を得た。当該泡盛蒸留粕含有培地に、種藻を含むＧＴＹ培地を播種し、好気条件下で２４時間撹拌培養した。
ｅ）本培養
　６００Ｌジャーファメンターに、泡盛蒸留粕上清培地１５０Ｌ、水道水１５０Ｌ、グルコース１２ｋｇ、レッドシーソルト５ｋｇを入れ、１２１℃で２０分間蒸気滅菌した。これにより、泡盛蒸留粕含有培地を得た。当該泡盛蒸留粕含有培地に、前培養培地６０Ｌを移し、好気条件下で３４時間撹拌培養した。
　本培養後、上記試験例１の（１）ｅ）の手順に従い、実施例２の乾燥藻体を得た。
（２）γ－アミノ酪酸の含有量の測定
　上記試験例１の（３）に記載された方法により、本培養開始時の培地、本培養終了時の培地、及び実施例２の乾燥藻体のそれぞれについて、γ－アミノ酪酸の含有量を測定した。
　測定結果を下記表２に示す。
　上記表２の結果から、培地１Ｌ当たりのγ－アミノ酪酸の含有量は、本培養工程を経て７９ｍｇ減少したことが分かる（１０６－２７＝７９［ｍｇ／Ｌ］）。当該減少分のγ－アミノ酪酸が全て藻体内に取り込まれたと仮定すると、得られた乾燥藻体の量が培地１Ｌ当たり２４ｇであったことから、乾燥藻体１００ｇ当たりのγ－アミノ酪酸の含有量は計算上では約３２９ｍｇでありうる（７９／２４×１００≒３２９［ｍｇ／１００ｇ（乾燥藻体）］）。しかしながら、実際の測定結果によれば、乾燥藻体１００ｇ当たりのγ－アミノ酪酸の含有量は２７８ｍｇであったことから、培地中のγ－アミノ酪酸減少分の約８４．５％が乾燥藻体中に取り込まれ、蓄積されたと考えられる（２７８／３２９×１００≒８４．５［％］）。
　これにより、γ－アミノ酪酸を含む培地中で従属栄養性微細藻類を培養すると、培地中のγ－アミノ酪酸が従属栄養性微細藻類内に取り込まれることで、藻類中のγ－アミノ酪酸の含有量を増加できることが確認できた。
＜試験例３＞
（１）実施例３の乾燥藻体の製造
　以下の手順に従って従属栄養性微細藻類を培養し、乾燥藻体を得た。
ａ）焼酎蒸留粕上清培地の調製
　「泡盛蒸留粕（残渣）」を、焼酎製造工場から入手した「芋（サツマイモ）焼酎蒸留粕（残渣）」に代えた以外は、上記試験例１の「（１）ａ）泡盛蒸留粕上清培地の調製」に従って、焼酎蒸留粕上清培地（芋焼酎蒸留粕上清培地）を得た。
ｂ）ＧＴＹ培地の調製及びｃ）種培養
　試験例３における「ｂ）ＧＴＹ培地の調製」「ｃ）種培養」は、上記試験例１の「（１）ｂ）」「（１）ｃ）」に従って、行った。藻株は、オーランチオキトリウム　リマシナムＳＲ－２１株（ＦＥＲＭ　ＢＰ－５０３４）を用いた。
　２００ｍＬの培養培地を入れて栓をした５００ｍＬ容三角フラスコを、オートクレーブにて１２１℃で２０分間で滅菌した。これにより、焼酎蒸留粕中の液体に由来する成分を含む培地（以下、「焼酎蒸留粕含有培地」ともいう。）を得た。栓は、通気性のあるシリコンゴム連続気泡スポンジプラグを用いた。また、フラスコ培養に用いる培養培地が、２５％焼酎蒸留粕含有培地である場合には、当該培地は、焼酎蒸留粕上清培地５０ｍＬ、水１５０ｍＬ、グルコース４ｇ、レッドシーソルト３．３４ｇを含む培地である。２５％焼酎粕含有培地の「％」は、「焼酎蒸留粕上清培地の体積量（ｍＬ）／〔焼酎蒸留粕上清培地の体積量（ｍＬ）及び水の体積量（ｍＬ）の合計量（ｍＬ）〕」×１００（％）にて、求めることができる。当該合計量は、培地の体積量（ｍＬ）でもある。
　また、焼酎蒸留粕上清培地の体積量（ｍＬ）及び水の体積量（ｍＬ）の割合を調製して、５０％、７５％、１００％の焼酎蒸留粕含有培地を調製した。焼酎蒸留粕含有培地中のグルコース、レッドシーソルトの濃度は、焼酎蒸留粕上清培地の濃度を変化させた場合でも、「２５％」のときと同じ「グルコース４ｇ、レッドシーソルト３．３４ｇ／体積量２００ｍＬ」になるように調製した。なお、１００％の焼酎蒸留粕含有培地は、前記合計量２００ｍＬ当たり、水の体積量（ｍＬ）０ｍＬ及び焼酎蒸留粕上清培地の体積量（ｍＬ）２００ｍＬである。
ｄ）フラスコ培養
　焼酎蒸留粕含有培地に、種藻を含むＧＴＹ培地を播種し、好気条件下で３６時間培養した。このときの培養条件は、２５℃で、１１０ストローク／分の振とうであった。
　２５％焼酎粕培養培地を用いた試験例を実施例３－１とし、焼酎粕培養培地中の焼酎粕上清培地含有率を５０％、７５％、１００％に代えた試験例を、それぞれ、実施例３－２、実施例３－３、実施例３－４とした。
　ｅ）回収及び乾燥
　実施例３における回収及び乾燥は、フラスコ培養後、上記試験例１の「（１）ｅ）」の手順に従って、実施例３－１、実施例３－２、実施例３－３、実施例３－４の各乾燥藻体を得た。
　また、γアミノ酪酸の含有量の測定は、上記試験例１の「（３）γ－アミノ酪酸の含有量の測定」に従って、行った。
　実施例３における各測定結果を下記表３に示す。ＤＣＷは、乾燥藻体重量の略である。藻体内ＧＡＢＡ実測値／理論値は、〔培養終了時の藻体内ＧＡＢＡ　実測値　［ｍｇ／１００ｇ］／培地中のＧＡＢＡ減少分が全て藻体に回収されたと仮定した時の藻体内ＧＡＢＡ　理論値　［ｍｇ／１００ｇ］〕から求めた値である。表３中の「培地中」の「培地」とは、「芋焼酎蒸留粕含有培地」のことである。
 
　上記表３の結果から、泡盛蒸留粕だけでなく、焼酎蒸留粕を用いた場合でも、培地中のＧＡＢＡを、従属栄養性微細藻類の藻体内に取り込むことができた。このことから、泡盛蒸留粕、焼酎蒸留粕及び日本酒粕等の酒製造残渣（酒製造粕等）だけではなく、γ－アミノ酪酸を含む組成物又はγ－アミノ酪酸含有培地を用いて、γ－アミノ酪酸高含有従属栄養性微細藻類を得ることができることが確認された。
　焼酎蒸留粕濃度５０％以上の培養培地を用いた場合には、培地中のγ－アミノ酪酸を全量藻体内に蓄積した以上のγ－アミノ酪酸が、従属栄養性微細藻類の藻体内に蓄積されていることが確認され、培養開始時の培養培地中には焼酎蒸留粕上清培地由来のＬ―グルタミン酸が含まれていた。このことから、藻体内でγ－アミノ酪酸がＬ－グルタミン酸から生産され、生産されたγ－アミノ酪酸はこの藻体内に蓄積されることが確認できた。
　焼酎蒸留粕濃度５０％の培養培地を用いた場合には、得られたＤＣＷが高く、培養培地中のＬ－グルタミン酸が増殖に主に使われたと考えられる。このため、焼酎蒸留粕濃度５０％の培養培地を用いた場合には、藻体内でのＬ－グルタミン酸由来のγ－アミノ酪酸の生産量が低いのであろうと考えられる。一方で、焼酎蒸留粕７５％の培養培地を用いた場合には、ＤＣＷが低く、藻体内でのＬ－グルタミン酸由来のγ－アミノ酪酸の生産量が高いと考えられる。
　また、従属栄養性微細藻類の藻体内に、γ－アミノ酪酸を、約１質量％含有させることができることが確認された。このことから、培地中のγ－アミノ酪酸及び／又はグルタミン酸濃度等の培養条件を調整することで、藻体内の蓄積量の上限を適宜調整することができると考える。例えば、従属栄養性微細藻類の藻体内に、γ－アミノ酪酸を、少なくとも約２，３もしくは５質量％まで含有させることができるであろう。
＜試験例４＞
（１）実施例４の乾燥藻体の製造
　以下の手順に従って従属栄養性微細藻類を培養し、乾燥藻体を得た。
　上記試験例１の（１）ａ）～ｃ）の手順に従い、泡盛蒸留粕上清培地の調製、ＧＴＹ培地の調製、種培養を行った。その後、上記試験例２の「（１）ｄ）本培養」の９０Ｌジャー培養を、好気条件下で行った。藻株は、オーランチオキトリウム　リマシナムＳＲ－２１株（ＦＥＲＭ　ＢＰ－５０３４）を用いた。
　なお、９０Ｌジャー培養に用いた泡盛蒸留粕含有培地は、泡盛蒸留粕培養培地中の泡盛粕上清培地の濃度（含有率）が５０％になるように調製し、滅菌後、５０％泡盛蒸留粕含有培地を得た。培養開始後の培地に、培養中に、グルタミン酸Ｎａ水溶液（濾過滅菌済み）を、表４に示すような条件にて流加させた。グルタミン酸Ｎａ水溶液（グルタミン酸Ｎａ濃度２００ｇ／Ｌ）を、培地中のグルタミン酸Ｎａ濃度が０．６ｇ／Ｌ／ｈｒとなるように流加した。表４中の「培地中」の「培地」とは、「泡盛蒸留蒸留粕含有培地」のことである。
 
　流加したグルタミン酸量が多いがＤＣＷが低く、Ｌ－グルタミン酸がうまく増殖につかえていないことが確認できた。一方で、培養培地中のＧＡＢＡを、全量藻体内に蓄積した以上のＧＡＢＡが藻体内に蓄積されていることが確認できた。
　培養培地中のＬ－グルタミン酸は、ヤブレツボカビ類に属する微細藻類、特にはオーランチオキトリウム属微細藻類の藻体内に取り込まれ、増殖に使われている。増殖に使われる以上のＬ－グルタミン酸が、藻体内に取り込まれた場合には、藻体内でγ－アミノ酪酸に変換され蓄積されると考えた。
　このことから、従属栄養性微細藻類は、その体内でＬ－グルタミン酸からγ－アミノ酪酸を生産し、生産されたγ－アミノ酪酸を体内に蓄積できることが確認された。このように、培養培地中にγ－アミノ酪酸の他にＬ－グルタミン酸を供給することによっても、γ－アミノ酪酸高含有従属栄養性微細藻類を得ることができることが確認された。
　＜試験例５＞
　オーランチオキトリウム属２株（オーランチオキトリウム属Ｍ１５ｄ１株、オーランチオキトリウム属　Ｓ２８Ｐ株）を、＜試験例３＞に従って、それぞれ、泡盛蒸留粕上清培地を５０％含む泡盛蒸留粕含有培地（５０％泡盛蒸留粕含有培地）に播種し、フラスコ培養を行った。これら２株は、本発明者らによって日本国内で採取され、保管されていたものである。泡盛蒸留粕上清培地は、＜試験例１＞の泡盛蒸留粕上清培地の調製に従って得られたγ－アミノ酪酸含有組成物（培地用）である。
　試験例５で用いられる、５０％泡盛蒸留粕含有培地は、＜試験例３＞に従って、泡盛蒸留粕上清培地の濃度を調整し、得ることができる。
　表５における「培地」とは、５０％泡盛蒸留粕含有培地のことである。γ－アミノ酪酸の含有量の測定は、＜試験例１＞と同様にして行った。
 
　この試験結果から、ＳＲ２１株以外のオーランチオキトリウム属２株とも、培養培地中のＧＡＢＡを培養時に回収して藻体内に蓄積することが示された。従属栄養性微細藻類であるオーランチオキトリウム属に属する微細藻類は、藻株に関係なくγ－アミノ酪酸を高含有化できること、及びγ－アミノ酪酸を培地から回収できることが示された。従属栄養性微細藻類であるオーランチオキトリウム属に属する微細藻類を培養する際にγ－アミノ酪酸を含む培地を用いることも微細藻類中のγ－アミノ酪酸含有量の増加に有益であることが示された。

Claims (8)

  1. 　γ－アミノ酪酸の含有量が、乾燥藻体１００ｇ当たり１００ｍｇ以上である、従属栄養性微細藻類。
  2. 　前記従属栄養性微細藻類が、ヤブレツボカビ類（Thraustochytriales）に属する微細藻類である、請求項１に記載の従属栄養性微細藻類。
  3. 　前記従属栄養性微細藻類が、オーランチオキトリウム属（Aurantiochytrium）に属する微細藻類である、請求項１又は２に記載の従属栄養性微細藻類。
  4. 　請求項１又は２に記載の従属栄養性微細藻類を含有する、食品、医薬品、又は飼料。
  5. 　γ－アミノ酪酸を含む培地中で従属栄養性微細藻類を培養する工程を含む、従属栄養性微細藻類中のγ－アミノ酪酸の含有量を増加させる方法。
  6. 　γ－アミノ酪酸を含む培地中で従属栄養性微細藻類を培養する工程と、
    　前記従属栄養性微細藻類を回収する工程と、を含む、培地からγ－アミノ酪酸を回収する方法。
  7. 　γ－アミノ酪酸を含む組成物を用いて培地を調製する工程と、
    　前記培地中で従属栄養性微細藻類を培養する工程と、
    　前記従属栄養性微細藻類を回収する工程と、を含む、組成物からγ－アミノ酪酸を回収する方法。
  8. 　γ－アミノ酪酸を含む培地中で培養された従属栄養性微細藻類を用いることを含む、食品、医薬品、又は飼料の製造方法。
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