WO2023281331A1 - Aditivo para animales que contiene saponinas, compuestos fenólicos y p-cimenol, y procedimiento para su obtención - Google Patents
Aditivo para animales que contiene saponinas, compuestos fenólicos y p-cimenol, y procedimiento para su obtención Download PDFInfo
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Definitions
- the present invention relates to the field of animal nutrition.
- it refers to an additive for animals that includes saponins, phenolic compounds and p-cimenol, and its process for obtaining it.
- the air quality in farms is a very important factor, whose control depends on animal welfare, productivity and economic performance.
- Ammonia is one of the smallest gases produced on farms. It comes from the decomposition by microorganisms of protein compounds contained in urine and feces [1]—[3] and, due to its high volatility and rapid evaporation, rapidly worsens air quality.
- Ammonia in addition to being a predisposing factor for respiratory diseases, produces a increased susceptibility of animals to infection. This gas, therefore, increases the probability in animals of suffering respiratory diseases, such as pneumonia, and also other non-respiratory ones, such as neonatal mortality, cannibalism, and skin and eye injuries [3].
- the objective of the invention refers to defining the composition of the additive for animals that contains saponins, phenolic compounds and p-cimenol; as well as define the procedure for obtaining it.
- Fig. 1 Recommended maximum levels of ammonia and carbon dioxide in poultry and swine farms
- Fig 2 Generic structure of spirostanes, obtained by hydrolysis of saponins (aglycone part of spirostanol-type saponins). They contain 6 rings (A-F) and 4 methylations located at carbons 10, 13, 20 and 25. The union with monosaccharides through the glycosidic bond forms saponins.
- Fig 3. Generic structure of furostanes, obtained by hydrolysis of saponins (aglycone part of furostanol-type saponins), which contain 5 rings (A-E). (b) Structure of the Glc radicals.
- Fig. 4 Chemical reaction of decomposition of urea to ammonia and carbon dioxide by the urease enzyme carried out by ammonia-producing microorganisms.
- Fig. 5 Chemical structure of resveratrol, with two phenolic rings.
- Fig. 6 Basic structure of yuccaols (A-E) with three phenolic rings and multiple reactive radicals.
- Fig. 8 Flow chart to obtain a saponin concentrate from the Yucca schidigera stem extract.
- Fig. 9 Flowchart to obtain a concentrate of phenolic compounds from the Yucca schidigera stem extract.
- Fig. 10 Flow diagram to obtain a p-cimenol concentrate from the extract of Thymus vulgaris leaves.
- Fig. 11 Distribution of the composting pits, where the areas of pits 1, 5 and 10 where the environmental ammonia measurements were made are marked in red.
- Fig. 12 Results of the application of the composition of the invention in composting pits after one month of its administration. The reduction percentages in each grave or "pit" are shown.
- Fig. 13 Evolution of environmental ammonia concentrations (NEE) in ppm in a pig farm where measurements are made during 6 days at 7:00 a.m., 12:00 p.m. and 5:00 p.m.
- the present invention refers to the composition of an additive for animals that comprises saponins, phenolic compounds and p-cimenol in powder format and liquid.
- said animals refer to livestock production animals including, but not limited to, ruminants, swine, and poultry.
- saponins are present at a minimum of 2.25% by weight of the composition of the present invention.
- Said saponins are preferably contained in a concentrated Yucca schidigera stem extract, more preferably between 6 and 13% by weight.
- the saponins in cassava are steroid glycosides or triterpenoids that can be of the spirostanol (fig. 2) and fürostanol (fig. 3) type.
- Saponins are attributed several positive effects on the reduction of environmental ammonia concentration, among which we highlight: its reducing effect of ammonia and odors in animal feces, based on its (limited) antimicrobial activity against producing microorganisms of ammonia; the inhibition of gastrointestinal ureases (fig. 4); its direct union with ammonia; and the stimulation of microorganisms that produce organic acids [5] that react with ammonia, forming salts that are less toxic than the original compound and that neutralize the alkaline waste from animals, thus reducing the volatility of ammonia [6] .
- Phenolic compounds obtained from Yucca schidisera obtained from Yucca schidisera
- phenolic compounds are present at least 3.5% by weight of the composition of the present invention.
- these phenolic compounds are preferably resveratrol (fig. 5) or yuccaols (fig. 6) or a combination thereof [8].
- resveratrol and yuccaols are preferably contained in Yucca schidigera stem extract, more preferably by weight of 9.4%. This percentage takes into account the sum of these two major phenolic compounds.
- phenolic compounds also have the ability to reduce environmental ammonia [9] p-cimenol obtained from Thymus vulsaris
- p-cymenol is present at a minimum of 1.6% by weight of the composition of the present invention.
- Said compound is preferably contained in a concentrated extract of Thymus vulgaris, more preferably in a percentage by weight between 15 and 17%.
- p-Cymenol (fig. 7) is a compound whose functions as a bactericide, fungicide and preservative are known [10] and it is present in many botanical varieties, including Thymus vulgaris. In vitro assays and field tests indicate that p-Cymenol is effective against ammonia-producing bacteria present in the digestive tract and in feces. Its mechanism of action is as follows:
- the present invention refers to a process for obtaining the additive, which contains saponins, phenolic compounds and p-cimenol, which comprises the steps of:
- stage (a) comprises the following substages (fig. 8):
- step (b) comprises the following sub-steps (fig. 9):
- step (c) comprises the following sub-steps (fig. 10):
- Example 1 Obtaining saponins from the stem of Yucca schidigera
- the Yucca schidigera stem was dried at a temperature of 37°C for 12 hours. Next, the dry Yucca schidigera stem was pressed at room temperature. The material obtained contained saponins at 1.2% of its weight.
- the ethanolic phases obtained by exposure to 80°C for 4 hours were allowed to dry completely.
- the material was extracted with 100 ml of ethylene acetate in continuous passes for 30 minutes until a viscous brown residue was obtained, which was separated into the aqueous phase and organic phase by extracting with 100 ml of 1-butanol.
- the aqueous phase was discarded and the organic phase was concentrated by steam evaporation until obtaining a brown powder that corresponds to the saponin concentrate from the stem of Y. schidigera.
- This material had a concentration of active principles of between 6% and 13% by weight.
- the Yucca schidigera stem was dried at a temperature of 37°C for 12 hours. Next, the dry Yucca schidigera stem was pressed at room temperature. The material obtained contained the phenolic compounds at 0.5% by weight.
- the crushed leaves of Thymus vulgaris were placed in a container with enough water to achieve the suspension of the sample, with a proportion of 1 kg of dry T. vulgaris in 3 liters of water.
- p-cimenol which is one of the most acidic compounds in the oil
- an acid-base extraction was carried out. First, the oils obtained together with distilled water were placed in the separatory funnel. Next, 50 ml of 1N potassium hydroxide were added, causing p-cimenol, as it is one of the most acidic compounds present in the oil, to migrate to the aqueous phase.
- aqueous phase was isolated from the remainder, it was transferred to a new separatory funnel for acidification with 15 ml of 2N hydrochloric acid and 100 ml of ether were added. In this way, the ethereal phases were obtained, which contained a higher p-cimenol concentration.
- Example 4 Obtaining the composition of the invention in solid format (powder) Once all the active principles were purified (saponins, phenolic compounds and p-cimenol), after quantitative analysis to verify all concentrations, the preparation of the final product was carried out.
- Example 6.1 In a first trial to reduce the concentration of environmental ammonia in composting pits on a commercial farm in Mesa de los Santos (Colombia) with 840,000 broilers, a Toxi RAE Pro digital Sensor measurement system was used to determine this gas.
- the composition of the invention in solid format (powder) was added to the poultry feed continuously at a dose of 125 g of invention per ton of feed.
- the measurements were made in the different areas (anterior, middle and posterior) of 3 of the 10 compost pits, more specifically in pits 1, 5 and 10 (fig. 11), whose content came from the poultry farm.
- the first measurement was made before the administration of the composition of the invention to the animals.
- the second measurement was made one month after the start of the administration of the composition of the invention.
- the first measurements gave higher ambient ammonia concentrations than the second. More specifically, the second measurements showed an average reduction in ammonia concentration close to 67% in the anterior part, 57% in the middle part, and 66% in the posterior part of the analyzed pits (fig. 12).
- composition of the invention was capable of reducing the ammonia concentration by approximately 60% and had a prolonged effect over time, up to one month after starting the administration of the product.
- Example 6.2 In a second trial to reduce the concentration of environmental ammonia and improve welfare in a broiler farm located in Cerro Azul (Panama), ammonia concentrations were measured in a control batch without the product and in a batch that received the product. powdered for 36 days. The productive results and the prevalence of ascites, a clinical sign related to high concentrations of environmental ammonia, were also evaluated. This relationship is due to the fact that when ammonia levels increase, animals suffer respiratory problems and this reduces gas exchange, causing oxygen levels in the body to decrease. As a consequence, heart rate and blood pressure increase, and this leads to a transfer of fluid from the arteries to the abdominal cavity (ascites).
- Control broilers receiving no supplement to control ammonia levels on the farm (200 birds).
- composition of the invention was included at a rate of 0.5 kg of composition of the invention per ton of feed continuously for 36 days (200 birds).
- the environmental ammonia levels were 80 ppm in the control batch and 25 ppm in the treatment batch, which represents a reduction of 68.8%.
- this farm could reduce environmental ammonia levels by 68.7%, which would allow it to produce 450 more tons of meat and save 377.6 tons of feed.
- Example 6.3 In a third study in pigs, the concentration of environmental ammonia was evaluated in a control batch and a treatment batch in an experimental farm in Almazán (Soria) to determine if the composition of the invention in liquid format could reduce the environmental ammonia load in 50 days.
- Control pigs that do not receive any supplement to control ammonia levels on the farm.
- Treatment the composition of the invention was included at a rate of 0.5 liters of invention per ton of feed continuously for 50 days.
- control batch After 50 days of testing, the control batch showed environmental ammonia levels of 100 ppm, while in the treatment batch it was 25 ppm, which implies a 75% reduction.
- Weight gain was higher in the treatment flock, 750 g/day/pig compared to 575 g/day/pig in the control flock.
- the conversion rate also improved in the treatment batch, more specifically, 18%, since it was 2.90 in the treatment batch and 3.54 in the control batch.
- Example 6.4 In a fourth trial to evaluate the concentration of environmental ammonia in a farm with 396 pre-fattening pigs in Colombia, the levels of this gas were evaluated daily for 6 days, three times a day (morning, noon and afternoon). The composition of the invention was added to drinking water continuously for 5 days at a rate of 0.125 ml of composition of the invention per liter of drinking water. The trial consisted of a single batch. Ammonia measurements were made the day before starting the administration of the composition of the invention and the following 5 days, always at 7:00, 12:00 and 17:00.
- the concentration of ammonia in the environment was progressively reduced as the days passed, obtaining a reduction at the end of the test of 80% at 7:00 a.m., 90% at 12:00 p.m., and 86% at 5:00 p.m.: 00 h, compared to the first measurement (fig. 13).
- composition of the invention managed to reduce the concentration of environmental ammonia in pig farms by 85%. This concentration went from being 40 ppm, which has negative effects on production, human health and animal welfare, to 6 ppm, a concentration that does not pose a risk to humans or animals.
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Abstract
La presente invención se refiere a un aditivo para animales que comprende saponinas, compuestos fenólicos y p-cimenol, y a su proceso de obtención.
Description
DESCRIPCIÓN
ADITIVO PARA ANIMALES QUE CONTIENE SAPONINAS, COMPUESTOS FENÓLICOS Y P-CIMENOL, Y PROCEDIMIENTO PARA SU OBTENCIÓN
Campo de invención
La presente invención se refiere al campo de la alimentación en animales. En particular, se refiere a un aditivo para animales que comprende saponinas, compuestos fenólicos y p-cimenol, y a su proceso de obtención.
Antecedentes de la invención
La calidad del aire en las granjas es un factor muy importante , de cuyo control dependen el bienestar animal, la productividad y el rendimiento económico.
La producción ganadera intensiva, ampliamente extendida, implica la cría de animales en elevadas densidades, a menudo en espacios donde la ventilación puede ser deficiente. Estos factores dan lugar a un deficiente intercambio de gases con el exterior y causan la aparición de problemas derivados de una mala calidad del aire, relacionada con elevadas concentraciones de algunos gases, particularmente de amoníaco, aunque también puede acumularse el dióxido de carbono [1] (fig. 1).
El amoníaco es uno de los gases más pequdiciales que se producen en las granjas. Procede de la descomposición por parte de microrganismos de los compuestos proteicos contenidos en la orina y las heces [1]— [3] y, por su alta volatilidad y rápida evaporación, empeora rápidamente la calidad del aire.
Su efecto irritante produce lesiones en el tracto respiratorio de los animales, desde parálisis y pérdida de los cilios de la superficie de la mucosa traqueal hasta necrosis del epitelio. Los animales afectados no pueden eliminar de su mucosa respiratoria partículas de polvo, microorganismos u otros agentes dañinos, por lo que es más fácil que lleguen a los pulmones o sacos aéreos (en el caso de las aves), dando lugar a problemas respiratorios graves.
El amoníaco, además de ser un factor predisponente de enfermedades respiratorias produce un
una mayor susceptibilidad de los animales a padecer infecciones. Este gas, por lo tanto, aumenta la probabilidad en los animales de sufrir enfermedades respiratorias, como la neumonía, y también otras no respiratorias, como mortalidad neonatal, canibalismo y lesiones dérmicas y oculares [3]
Existe, por lo tanto, la necesidad de controlar y reducir las emisiones de amoníaco en las granjas para poder obtener unos buenos rendimientos productivos y mantener el bienestar animal.
En este sentido, los presentes inventores han desarrollado un aditivo para animales a base de saponinas, compuestos fenólicos (también llamados pronutrientes [4]) y p-cimenol procedentes de extractos vegetales. Este aditivo disminuye las concentraciones ambientales de amoníaco en las granjas.
Descripción resumida de la invención
El objetivo de la invención se refiere a definir la composición del aditivo para animales que contiene saponinas, compuestos fenólicos y p-cimenol; así como definir el procedimiento para su obtención.
Breve descripción de las figuras
Fig. 1. Niveles máximos recomendados de amoníaco y dióxido de carbono en granjas de aves y cerdos
Fig 2. Estructura genérica de los espirostanos, obtenidos por hidrólisis de las saponinas (parte aglicona de las saponinas del tipo espirostanol). Contienen 6 anillos (A-F) y 4 metilaciones situadas en los carbonos 10, 13, 20 y 25. La unión con monosacáridos mediante el enlace glicosídico forma las saponinas.
Fig 3. (a) Estructura genérica de los furostanos, obtenidos por hidrólisis de las saponinas (parte aglicona de las saponinas del tipo furostanol), que contienen 5 anillos (A-E). (b) Estructura de los radicales Glc.
Fig. 4. Reacción química de descomposición de la urea a amoníaco y dióxido de carbono por la enzima ureasa que se lleva a cabo por microorganismos productores de amoníaco.
Fig. 5. Estructura química del resveratrol, con dos anillos fenólicos.
Fig. 6. Estructura básica de los yuccaoles (A-E) con tres anillos fenólicos y múltiples radicales reactivos.
Fig. 7. Estructura química del p-cimenol.
Fig. 8. Diagrama de flujo para obtener un concentrado de saponinas del extracto del tallo de Yucca schidigera.
Fig. 9. Diagrama de flujo para obtener un concentrado de compuestos fenólicos del extracto del tallo de Yucca schidigera.
Fig. 10. Diagrama de flujo para obtener un concentrado de p-cimenol del extracto de hojas de Thymus vulgaris.
Fig. 11. Distribución de las fosas de compostaje, donde se marcan en rojo las áreas de las fosas (“pits”) 1, 5 y 10 donde se realizaron las mediciones de amoniaco ambiental.
Fig. 12. Resultados de la aplicación de la composición de la invención en fosas de compostaje tras un mes de su administración. Se muestran los porcentajes de reducción en cada fosa o “pit”.
Fig. 13. Evolución de las concentraciones de amoníaco (NEE) ambiental en ppm en una granja de cerdos donde se realizan mediciones durante 6 días a las 7:00 h, 12:00 h y 17:00 h.
Descripción detallada de la invención
En un primer aspecto, la presente invención se refiere a la composición de un aditivo para animales que comprende saponinas, compuestos fenólicos y p-cimenol en formato polvo y
líquido. Preferiblemente, dichos animales se refieren a animales de producción ganadera que incluyen, sin limitarse a los mismos, rumiantes, ganado porcino y aves.
Saponinas obtenidas de Yucca schidigera
En una realización preferida, las saponinas están presentes en un mínimo del 2,25% en peso de la composición de la presente invención. Dichas saponinas están contenidas, preferiblemente, en un extracto concentrado de tallo de Yucca schidigera, más preferiblemente entre el 6 y el 13% en peso.
Las saponinas en la yuca son glucósidos de esteroides o triterpenoides que pueden ser del tipo espirostanol (fig. 2) y fürostanol (fig. 3).
A las saponinas se les atribuyen varios efectos positivos sobre la reducción de la concentración de amoníaco ambiental, entre los que destacamos: su efecto reductor del amoníaco y de olores en las heces de los animales, basado en su actividad antimicrobiana (limitada) frente microorganismos productores de amoníaco; la inhibición de las ureasas gastrointestinales (fig. 4); su unión directa con el amoníaco; y la estimulación de microorganismos productores de ácidos orgánicos [5] que reaccionan con el amoníaco formando sales menos tóxicas que el compuesto original y que neutralizan los deshechos de naturaleza alcalina procedentes de los animales, disminuyendo, así, la volatilidad del amoníaco [6] .
En definitiva, la suplementación del alimento con saponinas produce un efecto positivo sobre la tasa de crecimiento, eficiencia alimenticia y salud y bienestar de los animales [7] .
Compuestos fenólicos obtenidos de Yucca schidisera
En aún otra realización preferida, los compuestos fenólicos, están presentes como mínimo el 3,5% en peso de la composición de la presente invención.
En una realización aplicable a todas las realizaciones de la presente invención en las que se mencionan los compuestos fenólicos, estos compuestos fenólicos son preferiblemente resveratrol (fig. 5) o yuccaoles (fig. 6) o una combinación de los mismos [8] En total, el resveratrol y los yuccaoles están contenidos, preferiblemente, en extracto de tallo Yucca schidigera, más preferiblemente en un peso del 9,4%. Este porcentaje tiene en cuenta la suma de estos dos compuestos fenólicos mayoritarios.
Estos compuestos fenólicos también tienen capacidad de reducir el amoníaco ambiental [9] p-cimenol obtenido de Thymus vulsaris
En otra realización preferida, el p-cimenol está presente en un mínimo del 1,6% en peso de la composición de la presente invención. Dicho compuesto está contenido, preferiblemente, en un extracto concentrado de Thymus vulgaris, más preferiblemente en un porcentaje en peso entre el 15 y 17%.
El p-cimenol (fig. 7) es un compuesto cuyas funciones como bactericida, fungicida y conservante son conocidas [10] y está presente en muchas variedades botánicas, entre ellas Thymus vulgaris.
Los ensayos in vitro y las pruebas de campo indican que el p-cimenol es efectivo contra bacterias productoras de amoníaco presentes en el aparato digestivo y en las heces. Su mecanismo de acción es el siguiente:
El contacto con el p-cimenol provoca, en las bacterias productoras de amoníaco, la liberación inmediata del contenido celular al medio, causada por la perforación de la membrana bacteriana que lleva a la destrucción de la célula por choque osmótico [10] Esto se debe a la interacción del p-cimenol con los lípidos que componen la membrana citoplasmática [11].
En un segundo aspecto, la presente invención se refiere a un procedimiento para la obtención del aditivo, que contiene saponinas, compuestos fenólicos y p-cimenol, que comprende las etapas de:
(a) obtener un concentrado de saponinas del extracto del tallo de Yucca schidigera;
(b) obtener un concentrado de compuestos fenólicos del extracto del tallo de Yucca schidigera;
(c) obtener un concentrado de p-cimenol del extracto de las hojas de Thymus vulgaris;
(d) mezclar los concentrados de las etapas (a), (b) y (c) hasta la homogeneidad;
(e) añadir el excipiente correspondiente según la presentación del aditivo sea en polvo o líquido.
Preferiblemente, la etapa (a) comprende las siguientes subetapas (fig. 8):
(al) Secar el tallo de Yucca schidigera en una estufa convencional a temperatura de 37°C;
(a2) Prensar y molturar el tallo hasta obtener un polvo homogéneo;
(a3) Extraer el polvo obtenido en (a2) con etanol 95% tres veces;
(a4) Dejar secar completamente las fases etanólicas obtenidas en (a3) mediante la exposición a una temperatura de 80°C durante 4 horas;
(a5) Hacer pases continuos con acetato de etileno en reflujo durante 30 minutos hasta obtener un residuo marrón viscoso;
(a6) Separar el residuo marrón obtenido en (a5) en fase acuosa y fase 1-butanol;
(a7) Concentrar la fase orgánica obtenida en (a6) mediante la evaporación con vapor hasta obtener un polvo marrón.
De este modo se obtiene el concentrado de saponinas.
Preferiblemente, la etapa (b) comprende las siguientes subetapas (fig. 9):
(bl) Secar el tallo de Yucca schidigera en una estufa convencional a temperatura de 37°C;
(b2) Prensar y molturar el tallo seco hasta obtener un polvo homogéneo;
(b3) Extraer el polvo obtenido en (b2) con una solución etanol/agua 1:1 v/v en una relación 1:5 p/v en peso del polvo y solvente;
(b4) Dejar secar completamente las fases etanólicas obtenidas en (b3) mediante la exposición a 80° C durante 4 horas;
(b5) Extraer mediante pasos continuos con una solución de metanol 100%;
(b6) Separar el residuo marrón obtenido en (b5) en fase acuosa y fase 1-butanol;
(b6) Concentrar la fase acuosa obtenida en (b6) mediante evaporación con vapor hasta obtener un polvo marrón.
De este modo se obtiene el concentrado de compuestos fenólicos.
Preferiblemente, la etapa (c) comprende las siguientes subetapas (fig. 10):
(el) prensar en frío las hojas de Thymus vulgaris ;
(c2) suspender en agua el polvo obtenido en (el);
(c3) destilar el aceite del extracto de las hojas;
(c4) extraer el aceite de la fase acuosa;
(c5) extraer con una base el contenido fenólico del aceite y solubilizarlo en agua;
(c6) extraer el p-cimenol con éter;
(c7) evaporar el éter.
Mediante esta etapa (c) se obtiene el concentrado de p-cimenol.
La presente invención se ilustra adicionalmente mediante la referencia de los siguientes ejemplos, sin que los mismos representen una limitación del alcance de la presente invención.
Ejemplos
Ejemplo 1 Obtención de saponinas a partir del tallo de Yucca schidigera
Para la obtención de un concentrado de saponinas se realizó el secado del tallo de Yucca schidigera a temperatura de 37°C durante 12 horas. Seguidamente, se realizó un prensado a temperatura ambiente del tallo de Yucca schidigera seco. El material obtenido contenía saponinas en un 1,2% de su peso.
Para obtener una mayor concentración de principio activo (saponinas), se realizó una extracción de 1 kg de tallo de Y. schidigera (seco y molido) con 3 litros de etanol 95% con el fin de separar la fase etanólica (con saponinas) de la no etanólica, que fue descartada. Se repitió el proceso tres veces para obtener un producto de mayor pureza.
Se dejaron secar completamente las fases etanólicas obtenidas mediante la exposición a 80°C durante 4 horas. Seguidamente, se realizó la extracción del material con 100 mi de acetato de etileno en pases continuos durante 30 minutos hasta obtener un residuo marrón viscoso, que fue separado en fase acuosa y fase orgánica mediante la extracción con 100 mi de 1-butanol.
Se descartó la fase acuosa y se concentró la fase orgánica mediante evaporación con vapor hasta la obtención de un polvo marrón que corresponde el concentrado de saponinas procedentes del tallo de Y. schidigera. Este material presentaba una concentración de principios activos de entre el 6% y el 13% en peso.
Se llevó a cabo una estandarización del extracto concentrado para comprobar la pureza y riqueza de este.
Ejemplo 2 Obtención de compuestos fenólicos a partir del tallo de Yucca schidisera
Para la obtención de un concentrado de los compuestos fenólicos se realizó el secado del tallo de Yucca schidigera a temperatura de 37°C durante 12 horas. Seguidamente, se realizó un prensado a temperatura ambiente del tallo de Yucca schidigera seco. El material obtenido contenía los compuestos fenólicos en un 0,5% en peso.
Para obtener una mayor concentración de los principios activos, se realizó una extracción de 1 kg de tallo de Yucca schidigera (seco y molido) con 5 kg de solución etanol-agua. La fase etanólica obtenida se dejó secar completamente mediante la exposición a una temperatura de 80°C durante 4 horas en un evaporador a baja presión. La presión inferior a 1 atm permite facilitar el proceso de evaporación.
Se realizó una extracción con 100 mi de metanol 100% a temperatura ambiente, que se repitió dos veces, de manera que queda un residuo marrón, que se separó en fase acuosa y fase 1-butanol mediante la adición de 50 mi de 1-butanol. Finalmente, se descartó la fase orgánica y se concentró la fase acuosa mediante la evaporación con vapor hasta obtener un polvo marrón que correspondía
con el concentrado de compuestos fenólicos procedentes del tallo de Y. schidigera. Este material contenía una concentración de principios activos del 9,4%, teniendo en cuenta la suma de todos los compuestos fenólicos, que incluye resveratrol y yuccaoles, mayoritariamente.
Se llevó a cabo la estandarización del extracto concentrado para comprobar la pureza y riqueza de este.
Ejemplo 3 Obtención de p-cimenol a partir de las hojas de Thymus vulgaris
Para obtener el extracto concentrado de p-cimenol, primero se realizó el prensado en frío de hojas de tomillo ( Thymus vulgaris) previamente secadas y molidas hasta convertirse en un polvo homogéneo. La concentración de p-cimenol en las hojas de tomillo secas era del 0,4%.
Para obtener una mayor concentración de principio activo, las hojas trituradas de Thymus vulgaris se introdujeron en un contenedor con agua suficiente para lograr la suspensión de la muestra, con una proporción de 1 kg de T. vulgaris seco en 3 litros de agua.
Se buscó la menor manipulación de la muestra con el objetivo de no degradar los aceites, que son la fuente principal del compuesto a purificar. Por ello se usó una destilación con arrastre de vapor para extraer el aceite de T. vulgaris. Debido a que se trata de un aceite altamente volátil e insoluble en agua, se esperó a que el producto presente dos fases. Posteriormente, se realizó una extracción para separar el aceite puro con un embudo de separación. Se separó el aceite en un recipiente tapado y protegido de la luz para evitar la descomposición lumínica.
Con la parte acuosa, se realizó una nueva extracción con éter para lograr, así, separar finalmente los excedentes de aceite que quedaban solubilizados en esta fase. De la fase etérea se extrajeron las trazas de agua remanente con sulfato de sodio como desecante. Para reducir la cantidad de componentes a separar mediante cromatografía, se realizó una extracción ácido-base.
Para la obtención del p-cimenol, que es uno de los compuestos de mayor acidez en el aceite, se realizó una extracción ácido-base. En primer lugar, se colocó en el embudo de separación los aceites obtenidos junto con agua destilada. A continuación, se añadieron 50 mi de hidróxido de potasio 1N, haciendo que el p-cimenol, por ser uno de los compuestos más ácidos presentes en el aceite, migrara a la fase acuosa.
Una vez aislada la fase acuosa del resto, se llevó a un nuevo embudo de separación para su acidificación con 15 mi de ácido clorhídrico 2N y se agregaron 100 mi de éter. De esta manera se obtuvieron las fases etéreas, que contenían una mayor concentración p-cimenol.
Se juntaron todas las fases etéreas y se filtraron con sulfato de sodio anhidro como desecante para eliminar las trazas de agua. Posteriormente, se llevó el compuesto a calentar en un baño maría para evaporar el éter y obtener, así, los fenoles aislados. Este aceite fue absorbido con una bentonita, lo que permite tener el producto en polvo fino con entre un 15% y un 17% en peso de p-cimenol.
Se llevó a cabo una estandarización del extracto concentrado para comprobar la pureza y riqueza de este.
Ejemplo 4. Obtención de la composición de la invención en formato sólido (polvo)
Una vez todos los principios activos fueron purificados (saponinas, compuestos fenólicos y p- cimenol), previo análisis cuantitativo para comprobar todas las concentraciones, se llevó a cabo la preparación del producto final.
Esta preparación tuvo lugar por mezcla simple de los extractos concentrados para obtener el producto en forma de sólido y la posterior adición de un excipiente en polvo.
Para la preparación de la composición de la invención en polvo, se añadieron 37,5 kg de extracto concentrado en saponinas y 37,5 kg de extracto concentrado en compuestos fenólicos procedentes del tallo de Yucca schidigera, 10 kg de extracto concentrado de p-cimenol procedente de Thymus vulgaris. Se mezclaron durante 6 minutos, momento en el que se pudo asegurar la homogeneidad del producto. A continuación, se molturó el producto para garantizar una granulometría apropiada para el uso en instalaciones industriales, los usuarios finales del producto y se añadieron 15 kg de excipiente en polvo. El producto obtenido por la incorporación de ingredientes naturales de plantas queda listo para ser consumido con una composición mínima garantizada de 2,25% en peso de saponinas, 3,5% en peso de compuestos fenólicos y 1,6% en peso de p-cimenol.
Una vez todos los principios activos fueron purificados (saponinas, compuestos fenólicos y p- cimenol), previo análisis cuantitativo para comprobar todas las concentraciones, se llevó a cabo la preparación del producto final.
Esta preparación tuvo lugar por mezcla simple de los extractos concentrados para obtener el producto en forma de sólido y la posterior adición de un excipiente en líquido.
Para la preparación de la composición de la invención en líquido, se añadieron 37,5 kg de extracto concentrado en saponinas y 37,5 kg de extracto concentrado en compuestos fenólicos procedentes del tallo de Yucca schidigera, 10 kg de extracto concentrado de p-cimenol procedente de Thymus vulgaris. Se mezclaron durante 6 minutos, momento en el que se pudo asegurar la homogeneidad del producto. Luego, se molturó el producto para garantizar una granulometría apropiada para el uso en instalaciones industriales, los usuarios finales del producto y se añadieron 15 L de excipiente en líquido. El producto obtenido por la incorporación de ingredientes naturales de plantas queda listo para ser consumido con una composición mínima garantizada de e 2,25% en peso de saponinas, 3,5% en peso de compuestos fenólicos y 1,6% en peso de p-cimenol.
Para demostrar la eficacia del producto o composición de la invención sobre los niveles de amoniaco ambiental en granja y en fosas de compostaje se han realizado varios ensayos en aves y cerdos donde se comprueba el efecto de distintas dosis del producto descrito en esta invención sobre los niveles de amoníaco ambiental.
Ejemplo 6.1. En un primer ensayo para reducir la concentración de amoníaco ambiental en fosas de compostaje en una granja comercial en Mesa de los Santos (Colombia) con 840.000 pollos de engorde se utilizó un sistema de medición Sensor digital Toxi RAE Pro para la determinación de este gas.
La composición de la invención en formato sólido (polvo) se adicionó al alimento de las aves de forma continua a una dosis de 125 g de invención por tonelada de pienso. Las mediciones se realizaron en las distintas áreas (anterior, media y posterior) de 3 de las 10 fosas de compostaje, más específicamente en las fosas 1, 5 y 10 (fig. 11), cuyo contenido procedía de la granja de aves. La primera medición se realizó antes de la administración de la composición de la invención a los animales. La segunda medición se realizó un mes después del inicio de la administración de la composición de la invención.
Las primeras mediciones dieron concentraciones de amoníaco ambiental más altas que las segundas. Más específicamente, las segundas mediciones mostraron una reducción promedio de la concentración de amoníaco cercana al 67% en la parte anterior, 57% en la parte media y 66% en la parte posterior de las fosas analizadas (fig. 12).
En definitiva, la composición de la invención fue capaz de reducir la concentración de amoníaco en aproximadamente un 60% y tuvo un efecto prolongado en el tiempo, hasta un mes después de iniciar la administración del producto.
Ejemplo 6.2. En un segundo ensayo para reducir la concentración de amoníaco ambiental y mejorar el bienestar en una granja de pollos de engorde situada en Cerro Azul (Panamá) se midieron las concentraciones de amoníaco en un lote control sin el producto y en un lote que recibió el producto en polvo durante 36 días. También se evaluaron los resultados productivos y la prevalencia de ascitis, signo clínico relacionado con elevadas concentraciones de amoníaco ambiental. Esta relación se debe a que cuando aumentan los niveles de amoníaco, los animales sufren problemas respiratorios y esto reduce el intercambio gaseoso, haciendo que disminuyan los niveles de oxígeno en el organismo. Como consecuencia, aumenta la frecuencia cardíaca y la presión arterial, y eso conlleva un trasvaso de líquido procedente de las arterias hacia la cavidad abdominal (ascitis).
Lotes:
• Control: pollos de engorde que no reciben ningún suplemento para controlar los niveles de amoníaco en la granja (200 aves).
• Tratamiento: la composición de la invención se incluyó a razón de 0,5 kg de composición de la invención por tonelada de alimento de manera continua durante 36 días (200 aves).
36 días después del inicio de la administración del producto, los niveles de amoníaco ambiental fueron de 80 ppm en el lote control y 25 ppm en el lote tratamiento, lo que representa una reducción del 68,8%.
En general, los resultados productivos fueron mejores en el lote tratamiento, que obtuvo un peso final de 2,36 kg contra los 1,85 kg del lote control; un índice de conversión de 1,69 contra un 1,85 del lote control y una reducción de la mortalidad por ascitis, que fue de 2,1% contra un 3,6% en el lote control.
En base a estos resultados se puede estimar que, por cada millón de pollos de engorde criados durante 36 días suplementados con la composición de la invención, esta granja podría reducir los niveles de amoníaco ambiental en un 68,7%, lo que le permitiría producir 450 toneladas más de carne y ahorrar 377,6 toneladas de pienso.
Ejemplo 6.3. En un tercer estudio en cerdos se evaluó la concentración de amoníaco ambiental en un lote control y un lote tratamiento en una granja experimental de Almazán (Soria) para
determinar si la composición de la invención en formato líquido podía reducir la carga de amoníaco ambiental en 50 días.
Lotes:
• Control: cerdos que no reciben ningún suplemento para controlar los niveles de amoníaco en la granja.
• Tratamiento: la composición de la invención se incluyó a razón de 0,5 litros de invención por tonelada de alimento de manera continua durante 50 días.
Tras 50 días de ensayo, el lote control mostró unos niveles de amoníaco ambiental de 100 ppm, mientras que en el lote tratamiento obtuvo fueron de 25 ppm, lo que implica una reducción del 75%.
La ganancia de peso fue superior en el lote tratamiento, de 750 g/día/cerdo comparado con 575 g/día/cerdo en el lote control. El índice de conversión también mejoró en el lote tratamiento, más concretamente, un 18%, ya que fue de 2,90 en el lote tratamiento y de 3,54 en el lote control.
Ejemplo 6.4. En un cuarto ensayo para evaluar la concentración de amoníaco ambiental en una granja con 396 cerdos de pre-engorde en Colombia, se evaluaron los niveles de este gas diariamente durante 6 días, tres veces al día (mañana, mediodía y tarde). La composición de la invención se añadió al agua de bebida de forma continua durante 5 días a razón de 0,125 mi de composición de la invención por litro de agua de bebida. El ensayo consistió en un único lote. Las mediciones de amoníaco se realizaron el día previo a empezar la administración de la composición de la invención y los siguientes 5 días, siempre a las 7:00, 12:00 y 17:00 horas.
La concentración de amoníaco en el ambiente se redujo progresivamente a medida que transcurrieron los días, obteniendo una reducción al final del ensayo del 80% a las 7:00 h, del 90% a las 12:00 h y del 86% a las 17:00 h, comparado con la primera medición (fig. 13).
En definitiva, la composición de la invención consiguió reducir un 85% la concentración de amoníaco ambiental en granjas de cerdos. Esta concentración pasó de ser de 40 ppm, que tiene efectos negativos sobre la producción, la salud humana y el bienestar animal, a 6 ppm, concentración que no supone un riesgo para humanos ni animales.
Referencias
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Claims
1.- Aditivo para animales que comprende saponinas, compuestos fenólicos y p-cimenol.
2.- Aditivo para animales, según la reivindicación 1, en el que los compuestos fenólicos son resveratrol o yuccaoles o una combinación de los mismos.
3.- Aditivo para animales, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que las saponinas están presentes en como mínimo el 2,25% en peso de dicho aditivo.
4.- Aditivo para animales, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que los compuestos fenólicos están presentes en como mínimo el 3,5% en peso de dicho aditivo.
5.- Aditivo para animales, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el p- cimenol está presente en como mínimo el 1,6% en peso de dicho aditivo.
6.- Aditivo para animales, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que las saponinas están contenidas en el extracto concentrado de tallo de Yucca schidigera.
7.- Aditivo para animales, según la reivindicación 6, en el que las saponinas están presentes en el extracto concentrado de tallo de Yucca schidigera en un porcentaje en peso entre el 6 y el 13%.
8.- Aditivo para animales, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que los compuestos fenólicos están contenidos en el extracto concentrado de tallo de Yucca schidigera.
9 - Aditivo para animales, según la reivindicación 8, en el que los compuestos fenólicos están presentes en el extracto concentrado de tallo de Yucca schidigera en un porcentaje en peso de como mínimo el 9,4%.
10.- Aditivo para animales, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que p- cimenol está contenido en el extracto concentrado de Thymus vulgaris.
11.- Aditivo para animales, según la reivindicación 10, en el que el p-cimenol está presente en el extracto concentrado de hojas de Thymus vulgaris en un porcentaje en peso entre el 15 y el 17%.
12.- Procedimiento para la obtención de un aditivo para animales que comprende saponinas, compuestos fenólicos y p-cimenol, que comprende las etapas de:
(a) obtener un extracto concentrado de saponinas del tallo de Yucca schidigera ;
(b) obtener un extracto concentrado de compuestos fenólicos del tallo de Yucca schidigera ;
(c) obtener un extracto concentrado de p-cimenol de las hojas de Thymus vulgaris ;
(d) mezclar los extractos concentrados de las etapas (a), (b) y (c) hasta la homogeneidad;
(e) añadir el excipiente correspondiente según la presentación del aditivo sea en polvo o líquido.
13.- Procedimiento, según la reivindicación 12, en el que la etapa (a) comprende las siguientes subetapas:
(al) Secar el tallo de Yucca schidigera en una estufa convencional a temperatura de 37°C;
(a2) Prensar y molturar el tallo hasta obtener un polvo homogéneo;
(a3) Extraer el polvo obtenido en (a2) con etanol 95% tres veces;
(a4) Dejar secar completamente las fases etanólicas obtenidas en (a3) mediante la exposición a una temperatura de 80°C durante 4 horas;
(a5) Hacer pases continuos con acetato de etileno en reflujo durante 30 minutos hasta obtener un residuo marrón viscoso;
(a6) Separar el residuo marrón obtenido en (a5) en fase acuosa y fase 1-butanol;
(a7) Concentrar la fase orgánica obtenida en (a6) mediante la evaporación con vapor hasta obtener un polvo marrón.
14.- Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 13, en el que la etapa (b) comprende las siguientes subetapas:
(bl) Secar el tallo de Yucca schidigera en una estufa convencional a temperatura de 37°C;
(b2) Prensar y molturar el tallo seco hasta obtener un polvo homogéneo;
(b3) Extraer el polvo obtenido en (b2) con una solución etanol/agua 1:1 v/v en una relación 1:5 p/v en peso del polvo y solvente;
(b4) Dejar secar completamente las fases etanólicas obtenidas en (b3) mediante la exposición a 80° C durante 4 horas;
(b5) Extraer mediante pasos continuos con una solución de metanol 100%;
(b6) Separar el residuo marrón obtenido en (b5) en fase acuosa y fase 1-butanol;
(b6) Concentrar la fase acuosa obtenida en (b6) mediante evaporación con vapor hasta obtener un polvo marrón.
15.- Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14, en el que la etapa (c) comprende las siguientes subetapas:
(el) prensar en frío las hojas de Thymus vulgaris
(c2) suspender en agua el polvo obtenido en (el);
(c3) destilar el aceite del extracto de las hojas;
(c4) extraer el aceite de la fase acuosa;
(c5) extraer con una base el contenido fenólico del aceite y solubilizarlo en agua;
(c6) extraer el p-cimenol con éter;
(c7) evaporar el éter.
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