WO2023239145A1 - 리보플라빈 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 미생물 및 이를 이용한 리보플라빈을 생산하는 방법 - Google Patents

리보플라빈 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 미생물 및 이를 이용한 리보플라빈을 생산하는 방법 Download PDF

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최윤정
안찬홍
김예은
이지혜
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12N1/00—Microorganisms; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P25/00—Preparation of compounds containing alloxazine or isoalloxazine nucleus, e.g. riboflavin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/15—Corynebacterium

Definitions

  • This application is a microorganism deposited with deposit number KCCM12835P; Method for producing riboflavin using the above microorganism; A composition for producing riboflavin containing the microorganism or its culture; and the use of the microorganism or its culture for producing riboflavin.
  • Riboflavin is a type of water-soluble vitamin and is vitamin B2.
  • Riboflavin derivatives include the flacoenzymes FAD and FMN, which are generally required for redox reactions in all organic cell bodies. For this reason, all plants and animals and many microorganisms synthesize riboflavin.
  • Riboflavin can be manufactured through chemical synthesis and various fermentation methods, and in fermentation methods, microorganisms such as Bacillus subtilis strain, Ashbya gossypii , and various yeast strains are used. In addition, since even the fermentation method using ascibia gossipi yeast has low productivity in the manufacturing process, a method to improve riboflavin production has been developed (US Patent No. 5981212).
  • One object of this application is to provide microorganisms deposited under deposit number KCCM12835P.
  • Another object of the present application is to provide a method for producing riboflavin, comprising culturing the microorganism in a medium.
  • Another object of the present application is to provide a composition for producing riboflavin containing the microorganism or its culture.
  • Another object of the present application is to provide a use of microorganisms or cultures of the microorganisms for producing riboflavin.
  • the microorganism deposited under the deposit number KCCM12835P of this application has a high riboflavin production ability.
  • microorganism deposited under deposit number KCCM12835P.
  • the microorganism may produce riboflavin, but is not limited thereto.
  • the microorganism may be a microorganism with improved riboflavin production ability compared to the wild type (combined with unmodified microorganism; for example, ATCC13032), but is not limited thereto.
  • riboflavin refers to vitamin B2, a type of water-soluble vitamin, and can also be used interchangeably with lactoflavin.
  • riboflavin-producing microorganism or “riboflavin-producing microorganism” includes both wild-type microorganisms and microorganisms that have undergone natural or artificial genetic modification, and shall not be used interchangeably with “microorganism having the ability to produce riboflavin.” It is a microorganism whose specific mechanism is weakened or strengthened due to reasons such as insertion of foreign genes, enhanced activity of intrinsic genes, or inactivation, and can be genetically modified to produce the desired product (e.g., riboflavin). It may be a microorganism containing.
  • the microorganism deposited under the deposit number KCCM12835P in this application may be a microorganism with an increased production capacity of riboflavin and/or a target product in which riboflavin is involved in production compared to a wild-type microorganism, but is not limited thereto.
  • the microorganism deposited under the deposit number KCCM12835P in this application can produce riboflavin without additional genetic recombination, so it may be a microorganism that produces riboflavin at a low cost, but is not limited thereto.
  • non-modified microorganism refers to “untransformed microorganism (strain)”, “non-mutated microorganism (strain)”, “parent microorganism”, “parent strain”, “wild type microorganism (strain)”, or “reference microorganism (strain)” Can be used interchangeably with .
  • the target strain for comparing the increase in riboflavin production ability may be the wild-type microorganism Corynebacterium glutamicum ATCC13032 or another mutant strain (e.g., CJ-25 strain), but is not limited thereto. .
  • the microorganism deposited with the above deposit number KCCM12835P may be about 84 times higher than Corynebacterium glutamicum ATCC1303 and about 13 times higher than Corynebacterium glutamicum CJ-25 strain, but the + increase It is not limited to this as long as it has a value.
  • the microorganism deposited under the deposit number KCCM12835P of the present application may be a microorganism of the genus Corynebacterium ( Corynebacterium sp. ).
  • Corynebacterium genus microorganisms in the present application may include all Corynebacterium genus microorganisms. Specifically, Corynebacterium glutamicum ( Corynebacterium glutamicum ), Corynebacterium crudilactis ( Corynebacterium deserti ), Corynebacterium efficiens , Corynebacterium callunae , Corynebacterium stationis, Corynebacterium singulare , Corynebacterium halotolerans , Corynebacterium Corynebacterium striatum , Corynebacterium ammoniagenes, Corynebacterium pollutisoli , Corynebacterium imitans , Corynebacterium testudino It may be Corynebacterium testudinoris , Corynebacterium crenatum , or Corynebacterium flavescens , and more specifically, Corynebacterium
  • the microorganism deposited under the deposit number KCCM12835P in this application is Corynebacterium glutamicum, which is mutated from the wild-type microorganism Corynebacterium glutamicum ATCC13032 and has an increased riboflavin production ability compared to the wild-type microorganism. It could be a cum microorganism.
  • the culture of the present application includes culture solution, culture filtrate, concentrated culture filtrate, concentrate, dried product, freeze-dried product, lysate, It may include, but is not limited to, diluted liquid, fermented product, lysate obtained by collecting and crushing the cells of the above-mentioned microorganisms.
  • the concentrate can be obtained by centrifuging or evaporating the culture
  • the freeze-dried product can be obtained by freeze-drying the culture using a freeze dryer, etc.
  • the lysate can be obtained by physically removing the microorganism.
  • the fermented product of a specific microorganism includes not only the fermented material itself, but also the fermented product generated from the microorganism, such as a microbial culture medium in which the microorganism and the fermented material coexist, its filtrate, dilution, concentrate, dried product, and lysate. It can contain all kinds of substances.
  • the term “culturing” means growing the microorganism under appropriately controlled environmental conditions.
  • the culture process of the present application can be carried out according to appropriate media and culture conditions known in the art. This culture process can be easily adjusted and used by a person skilled in the art depending on the strain selected. Specifically, the culture may be batch, continuous, or fed-batch, but is not limited thereto.
  • the term "medium” refers to a material that is mainly mixed with nutrients necessary for cultivating the microorganisms, and supplies nutrients and growth factors, including water, which are essential for survival and development.
  • the medium and other culture conditions used for cultivating the microorganisms of the present application can be any medium used for cultivating ordinary microorganisms without particular restrictions, but the microorganisms of the present application can be grown with an appropriate carbon source, nitrogen source, personnel, and inorganic substances. It can be cultured under aerobic conditions in a typical medium containing compounds, amino acids, and/or vitamins, while controlling temperature, pH, etc.
  • the carbon source includes carbohydrates such as glucose, saccharose, lactose, fructose, sucrose, maltose, etc.; Sugar alcohols such as mannitol, sorbitol, etc., organic acids such as pyruvic acid, lactic acid, citric acid, etc.; Amino acids such as glutamic acid, methionine, lysine, etc. may be included.
  • natural organic nutrient sources such as starch hydrolyzate, molasses, blackstrap molasses, rice bran, cassava, bagasse and corn steep liquor can be used, specifically glucose and sterilized pre-treated molasses (i.e. converted to reducing sugars).
  • Carbohydrates such as molasses
  • various other carbon sources in an appropriate amount can be used without limitation. These carbon sources may be used alone or in combination of two or more types, but are not limited thereto.
  • the nitrogen source includes inorganic nitrogen sources such as ammonia, ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium acetate, ammonium phosphate, anmonium carbonate, and ammonium nitrate; Organic nitrogen sources such as amino acids such as glutamic acid, methionine, and glutamine, peptone, NZ-amine, meat extract, yeast extract, malt extract, corn steep liquor, casein hydrolyzate, fish or its decomposition products, defatted soybean cake or its decomposition products, etc. can be used These nitrogen sources may be used individually or in combination of two or more types, but are not limited thereto.
  • inorganic nitrogen sources such as ammonia, ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium acetate, ammonium phosphate, anmonium carbonate, and ammonium nitrate
  • Organic nitrogen sources such as amino acids such as glutamic acid, methionine, and glutamine, peptone, NZ-amine, meat extract, yeast
  • the agent may include monopotassium phosphate, dipotassium phosphate, or a corresponding sodium-containing salt.
  • Inorganic compounds may include sodium chloride, calcium chloride, iron chloride, magnesium sulfate, iron sulfate, manganese sulfate, and calcium carbonate, and may also include amino acids, vitamins, and/or appropriate precursors. These components or precursors can be added to the medium batchwise or continuously. However, it is not limited to this.
  • the temperature of the medium may be 10°C to 60°C, 20°C to 50°C, specifically 25°C to 40°C, but is not limited thereto.
  • the culturing period may continue until the desired production amount of useful substances is obtained, and may specifically be from 1 hour to 160 hours, but is not limited thereto.
  • the riboflavin production method of the present application includes preparing the microorganism of the present application, preparing a medium for culturing the strain, or a combination thereof (in any order), for example, the culture It may be additionally included before the step.
  • the method of recovering the riboflavin involves collecting the desired riboflavin using a suitable method known in the art according to the microorganism culture method of the present application, such as a batch, continuous, or fed-batch culture method. You can. For example, centrifugation, filtration, crystallization, treatment with protein precipitants (salting out), extraction, ultrasonic disruption, ultrafiltration, dialysis, molecular sieve chromatography (gel filtration), adsorption chromatography, ion exchange chromatography, affinity. Various chromatographies such as chromatography, HPLC, and a combination of these methods can be used, and the desired riboflavin can be recovered from the medium or microorganism using a suitable method known in the art.
  • microorganisms and riboflavin deposited under the above deposit number KCCM12835P are the same as described in other embodiments.
  • the composition may further include a cryoprotectant or excipient.
  • the cryoprotectant or excipient may be a non-naturally occurring material or a naturally occurring material, but is not limited thereto.
  • the cryoprotectant or excipient may be a material with which the microorganism does not naturally come into contact, or a material that is not naturally contained simultaneously with the microorganism, but is not limited thereto.
  • Corynebacterium glutamicum ATCC13032 which is easy to culture, is a GRAS (Generally recognized as safe) strain, and is capable of rapid growth, was selected as a microbial strain for riboflavin production. This strain was cultured in CM medium at 30°C for 16 hours to re-secure a single microbial community.
  • GRAS Generally recognized as safe
  • the wild-type Corynebacterium glutamicum ATCC13032 strain re-secured through Example 1-1 was grown in a liquid medium with sufficient nitrogen nutrients at 30°C until the OD 600 reached about 0.8. I ordered it. A portion of the strain culture was taken and re-cultured in a 5 ml batch of sufficient nutrient liquid. After culturing at 30°C for about 4 to 6 hours, when the OD reached about 1, it was centrifuged at 4,000 rpm for 20 minutes. Afterwards, the supernatant was discarded and the remaining bacterial mass was separated again using 5 ml of citrate buffer solution.
  • NTG was added at a concentration of 400 ug/ml, incubated at 30°C for about 50 minutes, centrifuged, and the collected cells were washed in a washing solution (K 2 HPO 4 , KH 2 PO 4 , (NH 4 ) The washing process was carried out twice using 2 PO 4 and Sodium Citrate).
  • the washed bacterial mass was dissolved in a washing solution and added to riboflavin-deficient minimal medium containing roseoflavin at a concentration of 50 to 200 ug/ml ((NH 4 ) 2 SO 4 20 g/L, urea 5 g/L, KH 2 PO 4 1 g/L, K 2 HPO 4 1 g/L, MgSO 4 ⁇ 7H 2 O 0.25 g/L, CaCl 2 10 mg/L, FeSO 4 ⁇ 7H 2 O 10 mg/L , MnSO 4 ⁇ H 2 O 10 mg/L, ZnSO 4 ⁇ 7H 2 O 1 mg/L, CuSO 4 ⁇ 5H 2 O 0.2 mg/L, NiCl 2 ⁇ 6H 2 O 0.02 mg/L, biotin 0.2 mg/L , 3,4-dihydroxybenzoic acid 30 mg/L, pH 7.0), a solution diluted from 10 -5 to 10 -7 of the washed bacterial mass was spread on two hundred sheets.
  • the riboflavin production ability of the mutant strains selected in Example 1 was evaluated.
  • the wild type strain (Corynebacterium glutamicum ATCC13032) and each mutant strain selected in Example 1 above were cultured in 25 ml of titer medium (glucose 50g/L, (NH 4 ) 2 SO 4 30g/L, yeast extract 5g/L).
  • riboflavin concentration 800 ul of culture medium sample containing bacterial cells was collected and the riboflavin concentration contained in the medium was measured.
  • the mutant strains all showed a higher riboflavin production ability than the 0.8 mg/L of the parent strain ATCC13032, but the CJ-78 strain showed a significantly superior production of 67 mg/L compared to 5 ⁇ 34.2 mg/L of the remaining strains. Selected.
  • the results of the parent strain, selected strain (CJ-78 strain), and strain with the lowest production capacity (CJ-25 strain) are shown in Table 1 below.
  • the selected CJ-78 strain was named CV02-0355, and was deposited with the Korea Microbiological Conservation Center, a depository under the Budapest Treaty, on November 27, 2020, and received accession number KCCM12835P.

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Abstract

본 출원은 기탁번호 KCCM12835P로 기탁된 미생물; 상기 미생물을 이용한 리보플라빈 생산 방법; 상기 미생물 또는 이의 배양물을 포함하는 리보플라빈 생산용 조성물; 및 상기 미생물 또는 이의 배양물의 리보플라빈 생산 용도에 관한 것이다.

Description

리보플라빈 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 미생물 및 이를 이용한 리보플라빈을 생산하는 방법
본 출원은 기탁번호 KCCM12835P로 기탁된 미생물; 상기 미생물을 이용한 리보플라빈 생산 방법; 상기 미생물 또는 이의 배양물을 포함하는 리보플라빈 생산용 조성물; 및 상기 미생물 또는 이의 배양물의 리보플라빈 생산 용도에 관한 것이다.
리보플라빈(riboflavin)은 수용성 비타민의 한 종류로 비타민 B2이다. 리보플라빈 유도체로 플라보조효소인 FAD, FMN이 존재하는데 보편적으로 모든 유기 세포체의 산화 환원 반응에 필요하다. 이러한 이유로, 모든 동식물 및 다수의 미생물이 리보플라빈을 합성한다.
리보플라빈은 화학적 합성법 및 다양한 발효법으로 제조가 가능하고 발효법에서는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 균주, 아시비아 고시피(Ashbya gossypii) 및 다양한 효모 균주 등의 미생물이 사용되고 있다. 또한, 아시비아 고시피 효모를 이용한 발효법 조차도 제조 공정에서 생산성이 낮으므로, 리보플라빈 생산을 향상시키기 위한 방법이 개발된 바 있다(미국 등록특허 제5981212호).
그러나, 코리네박테리움 속 미생물을 이용하여, 별도의 재조합 변이 없이도 비교적 저가의 비용으로 리보플라빈을 생산을 증가시키는 방법은 아직 개발되지 않은 실정이다.
본 발명의 해결하고자 하는 과제는 기탁번호 KCCM12835P로 기탁된 미생물; 상기 미생물을 이용한 리보플라빈 생산 방법; 상기 미생물 또는 이의 배양물을 포함하는 리보플라빈 생산용 조성물; 및 상기 미생물 또는 이의 배양물의 리보플라빈 생산 용도를 제공하는 것이다.
본 출원의 하나의 목적은 기탁번호 KCCM12835P로 기탁된 미생물을 제공하는 것이다.
본 출원의 다른 하나의 목적은 상기 미생물을 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 리보플라빈 생산 방법을 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 하나의 목적은 상기 미생물 또는 이의 배양물을 포함하는 리보플라빈 생산용 조성물을 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 하나의 목적은 미생물 또는 상기 미생물의 배양물의 리보플라빈 생산 용도를 제공하는 것이다.
본 출원의 기탁번호 KCCM12835P로 기탁된 미생물은 리보플라빈 생산능이 높은 효과가 있다.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 출원에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다. 또한, 본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 출원이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 출원의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 출원의 일 양태는 기탁번호 KCCM12835P로 기탁된 미생물을 제공한다. 구체적으로, 상기 미생물은 리보플라빈(riboflavin)을 생산하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 미생물은 야생형(비변형 미생물과 혼용; 예를 들어, ATCC13032)에 비해 리보플라빈 생산능이 향상된 미생물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서 "리보플라빈(riboflavin)"은 수용성 비타민의 한 종류로 비타민 B2를 의미하며, 락토플라빈(lactoflavin)과도 혼용될 수 있다.
본 출원에서 용어 "미생물" 또는 "균주"는 야생형 미생물이나, 자연적 또는 인위적으로 유전적 변형이 일어난 미생물을 모두 포함하며, 외부 유전자가 삽입되거나 내재적 유전자의 활성이 강화되거나 약화되거나 불활성화 되는 등의 원인으로 인해서 특정 기작이 약화되거나 강화된 미생물을 모두 포함하는 개념이다. 상기 미생물은 재조합 미생물일 수 있고, 상기 재조합은 형질전환과 같은 유전적 변형(genetically modification)에 의해 이루어질 수 있다.
본 출원에서 기탁번호 KCCM12835P로 기탁된 미생물은 목적산물의 생산능을 갖는 미생물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 출원의 미생물은 자연적으로 목적산물의 생산능을 갖는 미생물 또는 목적산물의 생산능이 없는 모균주에 목적산물 생산능이 부여된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일 예로, 상기 목적산물은 리보플라빈 및/또는 리보플라빈이 생산에 관여하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일 구현 예로, 본 출원의 기탁번호 KCCM12835P로 기탁된 미생물은 상기 기탁번호 KCCM12835P로 기탁된 미생물과 동일한 미생물이라면 유래, 확보 방법, 변이 방법 등에 제한하지 않고 포함될 수 있다.
본 출원에서 용어, "리보플라빈을 생산하는 미생물" 또는 "리보플라빈을 생산하는 미생물"은 야생형 미생물이나 자연적 또는 인위적으로 유전적 변형이 일어난 미생물을 모두 포함하며, "리보플라빈 생산능을 갖는 미생물"과 혼용될 수 있고, 외부 유전자 삽입, 내재적 유전자의 활성 강화, 불활성화 등의 원인으로 인해서 특정 기작이 약화되거나 강화된 미생물로서, 목적하는 산물(예를 들어, 리보플라빈)의 생산을 위하여 유전적 변형(modification)을 포함하는 미생물일 수 있다.
구체적으로, 본 출원에서 리보플라빈 또는 목적산물을 생산하는 미생물, 또는 리보플라빈 또는 목적산물 생산능을 갖는 미생물은, 리보플라빈, 또는 목적산물 생합성 경로 내 유전자 일부가 강화 또는 약화되거나, 리보플라빈, 또는 목적산물 분해 경로 내 유전자 일부가 강화 또는 약화된 미생물 일 수 있다.
본 출원 미생물의 리보플라빈 생산능이 "강화" 또는 "증가"한다는 것은, 본 출원 미생물 이외의 다른 미생물, 모균주 또는 비변형 미생물이 본래 가지고 있던 리보플라빈 생산능에 비하여 향상된 것을 의미한다. 일 예로, 본 출원 미생물은 다른 미생물의 리보플라빈 생산능에 비하여 약 1% 이상, 10% 이상, 100% 이상 200% 이상 500% 이상 1000% 이상, 1100% 이상, 1200% 이상, 1300% 이상 향상된 것일 수 있으며, 약 1.01배 이상, 2배 이상, 5배 이상, 10배이상, 11배 이상, 12배 이상, 13배 이상 향상된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 용어 "약(about)"은 ±0.5, ±0.4, ±0.3, ±0.2, ±0.1 등을 모두 포함하는 범위로, 약 이란 용어 뒤에 나오는 수치와 동등하거나 유사한 범위의 수치를 모두 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
일 구현예로, 본 출원에서 기탁번호 KCCM12835P로 기탁된 미생물은 야생형 미생물에 비해 리보플라빈 및/또는 리보플라빈이 생산에 관여하는 목적산물의 생산능이 증가된 미생물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일 구현예로, 본 출원에서 기탁번호 KCCM12835P로 기탁된 미생물은 추가적인 유전자 재조합 없이도 리보플라빈을 생산할 수 있으므로, 저가의 비용으로 리보플라빈을 생산하는 미생물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서 용어, "비변형 미생물(균주)"은 자연적으로 발생할 수 있는 돌연변이를 포함하는 미생물(균주)을 제외하는 것이 아니며, 야생형 미생물(균주) 또는 천연형 미생물(균주) 자체이거나, 자연적 또는 인위적 요인에 의한 유전적 변이로 형질이 변화되기 전 미생물(균주)을 의미할 수 있다. 예를 들어, 상기 비변형 미생물은 본 출원의 리보플라빈 생산능이 증가되지 않거나 증가되기 전의 균주를 의미할 수 있다. 상기 "비변형 미생물"은 "변형 전 미생물(균주)", "비변이 미생물(균주)", "모미생물", "모균주", "야생형 미생물(균주)" 또는 "기준 미생물(균주)"과 상호 교환적으로 사용될 수 있다.
상기 리보플라빈 생산능의 증가 여부를 비교하는 대상 균주는 야생형 미생물인 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) ATCC13032 또는 다른 변이 균주(예를 들어, CJ-25 균주)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일 예로, 상기 기탁번호 KCCM12835P로 기탁된 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC1303에 비해 약 84배, 코리네박테리움 글루타미쿰 CJ-25 균주에 비해 약 13배 이상 높아진 것일 수 있으나, + 증가 값을 갖는 한 이에 제한되지 않는다.
하나의 구체 예로, 본 출원의 기탁번호 KCCM12835P로 기탁된 미생물은 코리네박테리움 속(Corynebacterium sp.) 미생물일 수 있다.
본 출원의 "코리네박테리움 속 미생물"은 모든 코리네박테리움 속 미생물을 포함할 수 있다. 구체적으로, 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum), 코리네박테리움 크루디락티스(Corynebacterium crudilactis), 코리네박테리움 데세르티(Corynebacterium deserti), 코리네박테리움 이피시엔스(Corynebacterium efficiens), 코리네박테리움 칼루내(Corynebacterium callunae), 코리네박테리움 스테셔니스(Corynebacterium stationis), 코리네박테리움 싱굴라레(Corynebacterium singulare), 코리네박테리움 할로톨레란스(Corynebacterium halotolerans), 코리네박테리움 스트리아툼(Corynebacterium striatum), 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes), 코리네박테리움 폴루티솔리(Corynebacterium pollutisoli), 코리네박테리움 이미탄스(Corynebacterium imitans), 코리네박테리움 테스투디노리스(Corynebacterium testudinoris) 코리네박테리움 크레나툼(Corynebacterium crenatum), 또는 코리네박테리움 플라베스센스(Corynebacterium flavescens)일 수 있고, 더욱 구체적으로는 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일 구현예로, 본 출원에서 기탁번호 KCCM12835P로 기탁된 미생물은 야생형 미생물인 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) ATCC13032로부터 변이되어 상기 야생형 미생물에 비해 리보플라빈 생산능이 증가된 코리네박테리움 글루타미쿰 미생물일 수 있다.
본 출원의 배양물은 기탁번호 KCCM12835P로 기탁된 미생물을 배양 배지에서 배양하여 수득한 배양액, 배양 여과액, 농축 배양 여과액, 상기 배양액 및/또는 여과액의 농축물, 건조물, 동결건조물, 파쇄물, 희석액, 발효물, 상기 미생물의 균체를 포집해서 파쇄시킨 용해물 등을 포함하는 것일 수 있으며, 이에 제한되지 않는다. 일 예로, 상기 농축물은 상기 배양물을 원심분리 또는 증발시켜 수득할 수 있으며, 상기 동결건조물은 상기 배양물을 동결건조기 등을 이용하여 동결건조하여 수득할 수 있으며, 파쇄물은 상기 미생물을 물리적으로 또는 초음파처리하여 수득할 수 있으며, 상기 분획물은 상기 배양물, 파쇄물 등을 원심분리, 크로마토그래피 등의 방법을 적용하여 수득할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 일 예로, 상기 배양물은 고상, 액상, 유동상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 출원에서, 특정 미생물의 발효물은 발효된 물질 자체뿐만 아니라, 미생물 및 발효된 물질이 공존하는 미생물 배양 배지, 이의 여과액, 희석액, 농축액, 건조물, 용해물 등 상기 미생물로부터 발생한 발효물을 포함하는 모든 종류의 물질을 포함할 수 있다. 상기 배양 여과액은 본 출원의 기탁된 미생물을 실질적으로 포함하지 않는 것을 의미할 수 있으나, 여기서 실질적으로는 여과등에 의해 분리되는 특정 미생물을 배제한다는 것을 의미하는 것일 수 있고, 반드시 여과액에 미생물이 완전히 배제된다는 것을 의미하지는 않는다.
본 출원의 다른 하나의 양태는 본 출원의 기탁번호 KCCM12835P로 기탁된 미생물을 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 리보플라빈 생산 방법을 제공한다.
본 출원에서, 용어 "배양"은 상기 미생물을 적당히 조절된 환경 조건에서 생육시키는 것을 의미한다. 본 출원의 배양과정은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양 과정은 선택되는 균주에 따라 당업자가 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 구체적으로 상기 배양은 회분식, 연속식 및 유가식일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원에서 용어, "배지"는 상기 미생물을 배양하기 위해 필요로 하는 영양물질을 주성분으로 혼합한 물질을 의미하며, 생존 및 발육에 불가결한 물을 비롯하여 영양물질 및 발육인자 등을 공급한다. 구체적으로, 본 출원의 미생물의 배양에 사용되는 배지 및 기타 배양 조건은 통상의 미생물의 배양에 사용되는 배지라면 특별한 제한 없이 어느 것이나 사용할 수 있으나, 본 출원의 미생물을 적당한 탄소원, 질소원, 인원, 무기화합물, 아미노산 및/또는 비타민 등을 함유한 통상의 배지 내에서 호기성 조건 하에서 온도, pH 등을 조절하면서 배양할 수 있다.
본 출원에서 상기 탄소원으로는 글루코오스, 사카로오스, 락토오스, 프룩토오스, 수크로오스, 말토오스 등과 같은 탄수화물; 만니톨, 소르비톨 등과 같은 당 알코올, 피루브산, 락트산, 시트르산 등과 같은 유기산; 글루탐산, 메티오닌, 라이신 등과 같은 아미노산 등이 포함될 수 있다. 또한, 전분 가수분해물, 당밀, 블랙스트랩 당밀, 쌀겨울, 카사버, 사탕수수 찌꺼기 및 옥수수 침지액 같은 천연의 유기 영양원을 사용할 수 있으며, 구체적으로는 글루코오스 및 살균된 전처리 당밀(즉, 환원당으로 전환된 당밀) 등과 같은 탄수화물이 사용될 수 있으며, 그 외의 적정량의 탄소원을 제한 없이 다양하게 이용할 수 있다. 이들 탄소원은 단독으로 사용되거나 2 종 이상이 조합되어 사용될 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 질소원으로는 암모니아, 황산암모늄, 염화암모늄, 초산암모늄, 인산암모늄, 탄산안모늄, 질산암모늄 등과 같은 무기질소원; 글루탐산, 메티오닌, 글루타민 등과 같은 아미노산, 펩톤, NZ-아민, 육류 추출물, 효모 추출물, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 카세인 가수분해물, 어류 또는 그의 분해생성물, 탈지 대두 케이크 또는 그의 분해 생성물 등과 같은 유기 질소원이 사용될 수 있다. 이들 질소원은 단독으로 사용되거나 2 종 이상이 조합되어 사용될 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 인원으로는 인산 제1칼륨, 인산 제2칼륨, 또는 이에 대응되는 소디움-함유 염 등이 포함될 수 있다. 무기화합물로는 염화나트륨, 염화칼슘, 염화철, 황산마그네슘, 황산철, 황산망간, 탄산칼슘 등이 사용될 수 있으며, 그 외에 아미노산, 비타민 및/또는 적절한 전구체 등이 포함될 수 있다. 이들 구성성분 또는 전구체는 배지에 회분식 또는 연속식으로 첨가될 수 있다. 그러나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 상기 미생물의 배양 중에 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산, 황산 등과 같은 화합물을 배지에 적절한 방식으로 첨가하여, 배지의 pH를 조정할 수 있다. 또한, 배양 중에는 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 또한, 배지의 호기 상태를 유지하기 위하여, 배지 내로 산소 또는 산소 함유 기체를 주입하거나 혐기 및 미호기 상태를 유지하기 위해 기체의 주입 없이 혹은 질소, 수소 또는 이산화탄소 가스를 주입할 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
배지의 온도는 10℃내지 60℃, 20℃ 내지 50℃, 구체적으로는 25℃내지 40℃일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 배양 기간은 유용 물질의 원하는 생성량이 수득될 때까지 계속될 수 있으며, 구체적으로는 1 시간 내지 160 시간일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
구체적으로, 코리네박테리움 속 균주에 대한 배양 배지는 문헌["Manual of Methods for General Bacteriology" by the American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981)]에서 찾아 볼 수 있다.
본 출원의 리보플라빈 생산방법은, 본 출원의 미생물을 준비하는 단계, 상기 균주를 배양하기 위한 배지를 준비하는 단계, 또는 이들의 조합(순서에 무관, in any order)을, 예를 들어, 상기 배양하는 단계 이전에, 추가로 포함할 수 있다.
본 출원의 리보플라빈 생산방법 또는 제조방법은, 상기 배양에 따른 배지(배양이 수행된 배지) 또는 본 출원의 미생물로부터 리보플라빈을 회수하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 상기 회수하는 단계는 상기 배양하는 단계 이후에 추가로 포함될 수 있다.
상기 리보플라빈을 회수하는 방법은 본 출원의 미생물의 배양 방법, 예를 들어 회분식, 연속식 또는 유가식 배양 방법 등에 따라 당해 기술 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 목적하는 리보플라빈을 수집(collect)하는 것일 수 있다. 예를 들어, 원심분리, 여과, 결정화 단백질 침전제에 의한 처리(염석법), 추출, 초음파 파쇄, 한외여과, 투석법, 분자체 크로마토그래피(겔여과), 흡착크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피 등의 각종 크로마토그래피, HPLC 및 이들의 방법을 조합하여 사용될 수 있으며, 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배지 또는 미생물로부터 목적하는 리보플라빈을 회수할 수 있다.
상기 생산방법은, 추가적인 정제 공정을 포함할 수 있다. 상기 정제공정은 당해 기술분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여, 회수된 리보플라빈을 정제할 수 있다. 일 예에서, 본 출원의 리보플라빈 생산방법이 회수 단계와 정제 단계를 모두 포함하는 경우, 상기 회수 단계와 정제 단계는 순서에 상관없이 이시적(또는 연속적)으로 수행되거나, 동시에 또는 하나의 단계로 통합되어 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 기탁번호 KCCM12835P로 기탁된 미생물 및 리보플라빈 등은 다른 양태에서 기재한 바와 같다.
본 출원의 또 다른 하나의 양태는 본 출원의 기탁번호 KCCM12835P로 기탁된 미생물 및 상기 미생물의 배양물 중 어느 하나 이상을 포함하는, 리보플라빈 생산용 조성물을 제공한다.
상기 리보플라빈 생산용 조성물은 상기 기탁번호 KCCM12835P로 기탁된 미생물 및 상기 미생물의 배양물 중 어느 하나 이상에 의해 리보플라빈을 생산할 수 있는 조성물을 의미할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 조성물은 상기 기탁번호 KCCM12835P로 기탁된 미생물 또는 상기 미생물의 배양물를 작동시킬 수 있는 구성을 제한 없이 포함할 수 있다.
상기 조성물은 동결보호제 또는 부형제를 추가로 포함할 수 있다. 상기 동결보호제 또는 부형제는 비자연적으로 발생한(non-naturally occurring) 물질 또는 자연적으로 발생한 물질일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 하나의 구체 예로, 상기 동결보호제 또는 부형제는 상기 미생물이 자연적으로 접촉하지 않는 물질, 또는 상기 미생물과 자연적으로 동시에 포함되지 않는 물질일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 기탁번호 KCCM12835P로 기탁된 미생물, 배양물, 및 리보플라빈 등은 다른 양태에서 기재한 바와 같다.
본 출원의 또 다른 하나의 양태는 본 출원의 기탁번호 KCCM12835P로 기탁된 미생물 또는 상기 미생물의 배양물의 리보플라빈 생산 용도를 제공한다.
상기 기탁번호 KCCM12835P로 기탁된 미생물, 배양물, 및 리보플라빈 등은 다른 양태에서 기재한 바와 같다.
이하 본 출원을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예 및 실험예는 본 출원을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 출원의 범위가 이들 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 리보플라빈 생산 균주 탐색
1-1: 변이 대상 균주 선정 및 활성화
리보플라빈 생산을 위한 미생물 균주로 배양이 용이하고 GRAS (Generally recognized as safe) 균주이면서 빠른 성장이 가능한 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) ATCC13032를 선정하였다. 이 균주를 CM 배지에서 30℃조건 하에 16시간 배양하여 단일 미생물 군집을 재 확보 하였다.
1-2: 변이 균주 제작
균주의 돌연변이 유발을 위하여 상기 실시예 1-1을 통해 재 확보된 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 균주를 질소영양 성분이 충분한 액체 배지에서 30℃조건 하에 OD 600이 약 0.8에 달할 때까지 성장 시켰다. 균주 배양액 일부를 취해 5 ml의 충분한 영양분이 있는 액체 배치에 다시 배양하였다. 30℃에서 약 4 내지 6 시간 배양한 후, OD가 약 1에 도달했을 때, 4,000 rpm 으로 20분간 원심 분리하였다. 이후, 상층액은 버리고 시트레이트(citrate) 버퍼용액 5 ml을 이용하여 잔존하는 균체 덩어리를 다시 분리시켰다. 여기에 400 ug/ml의 농도로 NTG를 첨가하고 30℃에서 약 50분 간 배양하고 원심분리 과정을 진행하여 모아진 균체를 워싱(washing) 용액 (K2HPO4, KH2PO4, (NH4)2PO4 및 Sodium Citrate)을 이용하여 2번 세척 과정을 진행하였다.
마지막으로, 세척된 균체 덩어리를 워싱 용액에 풀고, 로제오플라빈(roseoflavin)이 50 내지 200 ug/ml의 농도로 포함된 리보플라빈 결핍 최소 배지((NH4)2SO4 20 g/L, urea 5 g/L, KH2PO4 1 g/L, K2HPO4 1 g/L, MgSO4·7H2O 0.25 g/L, CaCl2 10 mg/L, FeSO4·7H2O 10 mg/L, MnSO4·H2O 10 mg/L, ZnSO4·7H2O 1 mg/L, CuSO4·5H2O 0.2 mg/L, NiCl2·6H2O 0.02 mg/L, biotin 0.2 mg/L, 3,4-dihydroxybenzoic acid 30 mg/L, pH 7.0) 이백여장에 상기 세척된 균체 덩어리를 10-5 내지 10-7 까지 희석한 용액을 도말하였다. 이 과정을 통해 균주를 로제오플라빈에 순응시켜 리보플라빈 생합성 억제특성에 관계없이 리보플라빈을 합성할 수 있는 균주를 선별하고자 하였다. 로제오플라빈이 도포된 최소배지에서 3 내지 4일 후 배양되어 자란 120여개의 콜로니들을 확보, 이들 각 균주를 CM 배지에 옮겨 도말하고 30도에서 16시간 배양하여 보관 배지로 제작하였다.
실시예 2. 변이 균주의 리보플라빈 생산능 평가
상기 실시예 1에서 선별된 변이 균주들을 대상으로 리보플라빈 생산능을 평가하였다.
야생형 균주(코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032) 및 상기 실시예 1에서 선별된 각 변이 균주를 25 ml의 역가 배지 (포도당 50g/L, (NH4)2SO4 30g/L, yeast extract 5g/L, 옥수수 침지 고형분(Corn Steep Solids) 5 g, KH2PO4 2g/L, K2HPO4 4g/L, MgSO4·7H2O 1g/L, biotin 100㎍/L, 티아민 염산염 1,000㎍/L, 칼슘-판토텐산 2000㎍/L, 니코틴아미드 3,000㎍/L, CaCO3 30g/L, pH 7.0)를 함유하는 250 ml의 코너-배플 플라스크에 접종하고 32°C에서 200rpm으로 배양하였다.
리보플라빈 농도 측정을 위해 균체를 포함한 배양액 샘플 800 ul를 채취하여 배지에 포함된 리보플라빈 농도를 측정하였다. 변이 균주들은 모균주인 ATCC13032균주의 0.8mg/L에 비하여 모두 높은 리보플라빈 생산능을 나타내었으나 나머지 균주들의 5 ~ 34.2mg/L에 비해 67mg/L로 현저히 우수한 생산량을 나타낸 CJ-78 균주를 최종적으로 선별하였다. 모균주, 선별 균주(CJ-78 균주) 및 생산량능이 가장 낮은 균주(CJ-25 균주)의 결과를 하기 표 1에 나타내었다.
Genotype 24hr
OD 600 잔당 리보플라빈 (mg/L)
Corynebacterium glutamicum ATCC13032 98.4 0.1 0.8
CJ-78 81.4 0.1 67.1
CJ-25 85.6 0.1 5.0
선별된 CJ-78 균주를 CV02-0355로 명명하고, 부다페스트조약 하의 수탁기관인 한국미생물보존센터에 2020년 11월 27일자로 기탁하여 수탁번호 KCCM12835P를 부여 받았다.
이상의 설명으로부터, 본 출원이 속하는 기술분야의 당업자는 본 출원이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 출원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 출원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
Figure PCTKR2023007738-appb-img-000001

Claims (7)

  1. 기탁번호 KCCM12835P로 기탁된 미생물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 미생물은 리보플라빈(riboflavin)을 생산하는, 미생물.
  3. 제1항에 있어서. 상기 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)인, 미생물.
  4. 제1항의 미생물을 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 리보플라빈 생산 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 방법은 상기 배지 또는 미생물로부터 리보플라빈을 회수하는 단계를 추가로 포함하는, 리보플라빈 생산 방법.
  6. 제1항의 미생물 및 상기 미생물의 배양물 중 어느 하나 이상을 포함하는, 리보플라빈 생산용 조성물.
  7. 제1항의 미생물 또는 상기 미생물의 배양물의 리보플라빈 생산 용도.
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