WO2023174457A1 - Muteínas derivadas de la interleucina-2 humana con actividad superagonista - Google Patents

Muteínas derivadas de la interleucina-2 humana con actividad superagonista Download PDF

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WO2023174457A1
WO2023174457A1 PCT/CU2023/050001 CU2023050001W WO2023174457A1 WO 2023174457 A1 WO2023174457 A1 WO 2023174457A1 CU 2023050001 W CU2023050001 W CU 2023050001W WO 2023174457 A1 WO2023174457 A1 WO 2023174457A1
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muteins
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receptor
group
mutein according
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PCT/CU2023/050001
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Gertrudis Rojas Dorantes
Ernesto RELOVA HERNÁNDEZ
Tania Carmenate Portilla
Kalet LEÓN MONZÓN
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Centro De Inmunología Molecular
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/5434—IL-12
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto

Definitions

  • the present invention is related to the branch of Biotechnology, particularly with a family of mutated proteins (muteins) derived from human interleukin-2 (IL-2), which have an increased binding capacity to the beta chain of the receptor.
  • muteins derived from human interleukin-2
  • IL-2 and a favorable developability profile, which give them powerful superagonist activity in vitro and in vivo.
  • IL-2 was originally described as a T cell growth factor (Smith, K.A. Immunol. Rev. 51: 337-357, 1980), it is currently known as a regulator with dual functions in the immune response (Malek , T.R. Annu. Rev. Immunol. 26: 453-479, 2008; Hoyer K.K. et al., Immunol. Rev. 226: 19-28, 2008), which promotes or negatively modulates the effector functions of the immune system.
  • IL-2 The functional dichotomy of IL-2 has opened wide possibilities for its exploitation in order to produce contrasting therapeutic effects on the immune system and modulate the immune response in one direction or another in different scenarios. Its use in high doses has shown its immunopotentiating capacity, useful for stimulating anti-tumor responses (Klapper, JA et al., Cancer. 113: 293-301, 2008). Beyond pharmacological manipulation, protein engineering of the molecule itself has led to selective modulation of interactions with the different subunits of the receptor, and consequent alteration of the natural balance between immunostimulatory and immunoregulatory functions.
  • mutated variants of IL-2 with superagonist properties have been described, in which the increase of the beta subunit binding capacity leads to potent stimulation of CD8+ T and NK effector cells, and a strong antitumor effect (Levin, AM et al., Nature. 484: 529-533, 2012).
  • the dimeric beta/gamma receptor present at high levels in effector cells By strengthening the interaction with the dimeric beta/gamma receptor present at high levels in effector cells, the relative contribution of the alpha subunit characteristic of regulatory T cells decreases and therefore, molecules with functions biased towards immunopotentiation of the response are created. immune.
  • superkine H9 come from selection from libraries presented on the surface of yeast cells (Levin, AM et al., Nature.
  • the inventors of the present invention defined, from the directed evolution of human interleukin-2 displayed on filamentous phages, discrete sets of mutations with regularities not previously described nor predictable from the structural analysis of human IL-2, whose introduction increases the ability of the cytokine to bind to the beta subunit of its receptor and therefore stimulate cells of the immune system that carry the dimeric IL-2 receptor.
  • the IL-2 variants modified in this way are distinguished from other superagonists described in the prior art due to better developability in terms of expression levels, low tendency to aggregation, and thermal stability, which give them greater superagonist capacity and anti-tumor activity in vivo.
  • This discovery lays the foundations for the exploitation of these vahantes on an industrial scale to obtain therapeutic products, useful in the immunotherapy of cancer, immunodeficiencies and in the ex vivo stimulation of immune cells for adoptive immunotherapy protocols.
  • the present invention is based on the identification of sets of mutations located in the vicinity of the binding interface with the beta chain of the IL-2 receptor from libraries of human IL-2 variants displayed on filamentous phages. .
  • the selection of phages by affinity to the recombinant extracellular domain of the beta chain leads to the isolation of variants with increased binding capacity to it.
  • the sets of mutations identified by this route are diverse, but present regularities that determine the properties of the selected variants. Particularly, they are distinguished by the presence of changes in at least two of the positions 81, 83, 84 and 87 of the primary amino acid sequence of IL-2, which result in a net negative charge of segment 81 -87 equal to or greater than -2. Another distinctive element of them is the presence preferably of the I92L substitution or the original lie residue in position 92, without other substituents in said position.
  • the sequence regularities are shown in Table 1 (SEQ ID NO. 1-13).
  • positions 80 can be mutated by the amino acids Phe, Val, Met or lie, position 82 by Ala, position 85 by lie, Val or Met, position 86 by Val, position 89 by Leu or Met. and position 93 for lie or Leu (SEQ ID NO. 14-26).
  • the present invention comprises the genetic construction of new recombinant molecules through the introduction of the previously identified mutations, alone or combined with the K35E, K35D and K35Q mutations (SEQ ID NO. 27-52) and/or with others. substitutions known for their effects on the properties of IL-2 (SEQ ID NO. 127-152), and the fusion to the genes encoding for proteins of interest such as antibodies, their domains and fragments, albumin, capsid proteins of filamentous phages, cytokines and others.
  • the object of the present invention are the recombinant proteins produced from the genetic constructions previously described in expression systems in prokaryotic host cells such as E. coli and eukaryotes such as HEK-293, CHO, NSO, insect cells and yeast. These proteins have an increased binding capacity to the beta chain of the receptor, a characteristic for which they were selected and which leads to a powerful superagonist activity on cells that carry the dimehco beta/gamma receptor of IL-2. Unlike superkine H9 and other similar molecules described in the prior art, said muteins are further distinguished by a profile favorable developability (high expression levels, low tendency to aggregation and high thermal stability).
  • the set of properties of the muteins obtained as part of the present invention gives them better developability, and a greater capacity to stimulate effector cells of the immune system and anti-tumor activity in vivo, compared to the original IL-2. and with the superkina H9.
  • compositions comprising the muteins described here in a concentration range of 1 mg/ml to 20 mg/ml and a pharmaceutically suitable excipient.
  • the object of the present invention is the use of muteins and recombinant molecules derived from them as drugs for the immunotherapy of cancer, immunodeficiencies, and in the ex vivo stimulation of immune cells for adoptive immunotherapy protocols.
  • the present invention is based on the identification of sets of mutations in the IL-2 sequence shown in Figure 1, to which the C125S change was introduced with respect to the sequence of wild-type IL-2 (shading in gray). These sets of mutations are located in the vicinity of the binding interface of human IL-2 to the beta chain of its receptor, and were selected from libraries on filamentous phages. These sets of mutations increase the ability of the cytokine to bind to the beta subunit of the receptor, and therefore stimulate cells of the immune system that carry the dimeric IL-2 receptor.
  • Various recombinant proteins derived from mutated variants of IL-2 are constructed, including additional substitutions and fusion to other protein domains.
  • polypeptides derived from human IL-2 with mutations that lead to an increase in their binding capacity to the beta subunit of the receptor.
  • the genes corresponding to these variants are inserted into phagomid-type expression vectors (fused to one of the genes that encode the capsid proteins of filamentous phages) and are used for the production of viral particles that are displayed on their surface.
  • the protein vahants can include different degrees of diversification (soft or strong randomization) throughout the entire sequence or in a group of pre-defined positions. Each of the original residues at these positions can be replaced by a mixture of the 20 amino acids or by a subgroup of chosen residues. Diversification can be achieved through random or site-directed mutagenesis.
  • the selection of the phages with the greatest binding capacity to the beta chain is based on the incubation of the phage mixtures from the libraries on a support where a recombinant protein containing the extracellular domain of the beta subunit of the receptor is immobilized. IL-2, removal of unbound phages by washing, and elution of bound phages. Several similar selection cycles can be carried out.
  • the analysis of the DNA sequences inserted in the selected phagomids reveals regularities that allow the identification of the most abundant substitutions (and their combinations) potentially related to the increase in binding capacity. Screening of an initial library can be used to identify hot spots that modulate interaction, followed by finer exploration of those hot spots and their neighborhood through secondary libraries.
  • vahantes to interact with the beta subunit can be evaluated in binding assays such as the solid-phase immunoenzymatic assay (ELISA) or other similar ones with phages.
  • binding assays such as the solid-phase immunoenzymatic assay (ELISA) or other similar ones with phages.
  • ELISA solid-phase immunoenzymatic assay
  • the signals obtained in the assay can be normalized. binding, with respect to the signals detected with a molecule that reacts equivalently with all the variants, such as an antibody directed against a common tag peptide fused to them.
  • vahants are obtained with different sequences, but that meet certain regularities.
  • the first is the presence of non-silent mutations (with a change in the encoded amino acid) in at least two of the selected positions within the group that includes residues 81, 83, 84 and 87 of the primary sequence of IL-2, which are in a net negative charge of the segment 81 -87 equal to or greater than -2.
  • Another regularity is the frequent presence of the I92L mutation (predominant), without other substituents in said position.
  • Table 1 comprising thirteen classes of muteins (SEQ ID NO. 113).
  • the thirteen classes of IL-2 killed variants that meet the regularities identified as part of the present invention are named by the letters of the Latin alphabet, from A to M).
  • Group I (basic) amino acids (aa) comprise Arg, Lys and His residues.
  • Group II (acidic) AAs comprise Asp and Glu residues.
  • Group III (neutral) AAs include the residues Ala, Asn, Gly, Gln, lie, Leu, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Val, Trp, and Tyr. Cys is excluded from the possible substituents.
  • the sets of mutations that lead to an increase in the interaction with the beta subunit of the receptor have been identified, they are introduced by site-directed mutagenesis in the IL-2 coding genes contained in different expression vectors designed for the modification of host cells. bacterial, yeast, or cell lines derived from insects or mammals (both plasmids and viral vectors). These sets of mutations can match combinations of substitutions isolated directly from phage selection, but new combinations can also be designed between them.
  • substitution for amino acids E, D or Q can additionally be introduced at position 35 of the primary sequence of IL-2, whose beneficial effect on secretion levels, resistance to aggregation and the biological activity of molecules derived from IL-2 is known (WO2018/0910003; Rojas, G et al., Sci. Reports. 9: 800, 2019). From these IL-2 mutein sequences, other recombinant molecules can be constructed through genetic fusion with proteins such as albumin, Fe regions and variable domains of antibodies, complete antibodies and other cytokines.
  • the molecules described above can be obtained from: a. the transformation of host bacteria (such as Escherichia coli) or yeast cells with the corresponding plasmids. b. the transfection of insect cells with plasmids or baculovirus-derived vectors. c. the transient or stable transfection of host cells such as HEK-293, CHO, NS0 and others derived from mammals with the corresponding plasmids, as well as the transduction of said host cells with viral vectors that contain the genes of interest.
  • the increase in the binding capacity of muteins to the beta subunit of the receptor can be demonstrated through immunochemical methods such as ELISA or by measuring the surface plasmon resonance (BIAcoreTM equipment).
  • the binding capacity of the recombinant proteins derived from the mutated variants described in the present invention to the beta chain of the IL-2 receptor is greater than that of their counterparts based on the original IL-2. Characterization of the developability profile of muteins and recombinant proteins derived from them
  • the set of properties grouped under the term "developability profile” includes biophysical characteristics such as the tendency to aggregation and thermal stability, as well as the secretion levels of the proteins of interest in different recombinant protein production systems. All of them have a direct influence on the feasibility of developing production processes and obtaining appropriate biological products for their final application.
  • Thermal stability is characterized through the comparison of molecules treated at high temperatures with their untreated counterparts, to detect the change in their properties associated with thermal stress.
  • Secretion levels can be measured in different expression systems based on genetically modified host cells, with the use of methods that allow quantification of secreted molecules in supernatant samples. Quantification of purified proteins from a given volume of supernatant allows yields to be determined directly.
  • the mutated variants of human IL-2 described as part of the present invention and the recombinant molecules derived therefrom are distinguished by a favorable developability profile, characterized by higher levels of secretion as soluble proteins from host cells, a lower aggregation tendency and increased thermal stability, compared to their counterparts containing the original IL-2 or superkine H9 sequence.
  • the presence of the I92L change is associated with the improvement of these properties.
  • all variants that contain the I92F change present in superkine H9 and in other muteins derived from IL-2 with increased binding capacity to the beta chain of the receptor (Levin, AM et al., Nature.
  • the superagonist activity of the new molecules is evidenced through the in vitro stimulation of purified cells that express the dimeric beta/gamma IL2 receptor, whose proliferation is detected by flow cytometry methods.
  • experimental animals are treated with muteins and the populations of interest are also monitored by flow cytometry.
  • the recombinant proteins derived from the muteins described as part of the present invention show an increased capacity to stimulate cells carrying the dimeric IL-2 receptor in vitro with respect to those containing the original IL-2 and to an extent not less than that of the superkina H9. Its ability to stimulate cell populations of this type in vivo exceeds both that of proteins based on the original IL-2 and the reported variant H9.
  • the anti-tumor effect of recombinant proteins derived from muteins can be demonstrated in animal models of malignant tumors.
  • the administration of these proteins to animals inoculated with syngeneic transplantable tumor cell lines can prevent tumor formation, slow tumor growth or reduce the formation of metastases in various organs.
  • the recombinant proteins derived from the muteins described as part of the present invention have anti-tumor effects such as those described in experimental tumor models, in a magnitude superior to their counterparts containing the original IL-2, and even surpass them in some experimental systems. to which include the superkina H9 reported in the previous art.
  • the muteins object of the present invention can be found as an active ingredient, forming part of different pharmaceutical compositions appropriate for them, and a pharmaceutically acceptable vehicle.
  • concentrations of the active ingredient in said pharmaceutical compositions are in the range of 1 mg/ml to 20 mg/ml.
  • Suitable pharmaceutical carriers include, but are not limited to: saline, pH neutral phosphate buffered saline, and the like. Other buffering agents, dispersing agents, and non-toxic inert substances appropriate for delivery to a patient may be included in the compositions of the present invention.
  • the compositions may be solutions suitable for administration, and are normally sterile and free of undesirable particles.
  • This invention also includes the possible therapeutic applications of the muteins described here with the objective of enhancing the natural or vaccine-induced immune response in diseases such as cancer or immunodeficiencies where T-elector cells are particularly relevant.
  • the use in the in vitro expansion of T and NK cells for adoptive transfer therapies is contemplated.
  • the muteins of the present invention must be administered to a subject carrying the disease independently or combined with other muteins or with other substances that facilitate or enhance their therapeutic action.
  • the administration route may be any of the administration routes described by the prior art for the parenteral administration of drugs. It may preferably be administered intravenously, intramuscularly, subcutaneously or intratumorally.
  • the muteins of the present invention can be used in combination with therapeutic cancer vaccines.
  • the muteins of the present invention must be administered at doses high enough to guarantee a concentration thereof in the lymph node or peripheral site relevant to the disease under study, which is in the range of concentrations for which muteins show an immune-stimulating effect.
  • the dose in question must therefore be adjusted for the type of disease and route of administration under study.
  • the dose in the case of tumor therapy, the dose must be adjusted to achieve concentrations of mutein inside the tumor and/or in the loco-regional lymph node that guarantee the stimulation of an antitumor immune response.
  • the dose ranges to be explored can range from 20 pg/Kg of weight to 200 pg/Kg of weight.
  • the dose of mutein to be used should be lower or equivalent in activity (determined using CTLL-2 line assay) to that traditionally used for native IL-2. .
  • the number of administrations to be applied must also be adjusted to the biodistribution of the mutein in question.
  • the effective concentrations referred to above should be maintained for a period of time ranging from 2 days to 30 consecutive days.
  • the frequency of administrations may decrease and the dose should be adjusted accordingly; In this case the dose range varies from 100 pg/Kg of weight to 1 mg/Kg of weight.
  • the mutein administration scheme may be similar to that applied in traditional therapy.
  • Therapeutic action should be understood as the total or partial remission of the symptoms of the disease.
  • the decrease in tumor volume or the increase in relapse time will be, among others, the criterion for remission of the disease.
  • polypeptides of the invention are particularly useful in the therapy of tumors such as, among others, melanomas, kidney tumors, ovarian, breast and lung tumors. They can also be useful in immunodeficiencies such as HIV and severe combined immunodeficiency.
  • Figure 1 Primary amino acid sequence of the original IL-2 (T3-T 133) taken as a basis for the construction of muteins on filamentous phages.
  • Figure 3 Representation of the global profile of sequences isolated from the S1 library after phage selection on the recombinant extracellular domain of the beta subunit of the receptor.
  • Figure 5 Increased binding capacity of the phage mixture selected from library S1.
  • Figure 7 Reactivity determined by ELISA of IL-2 variants on filamentous phages selected from library S2.
  • Figure 8 Primary amino acid sequence of IL-2 (A1 -T 133).
  • Figure 9 Performance of proteins fused to human Fe in the transient transfection system of HEK-293T cells adapted to grow in suspension.
  • Figure 10. Productivity of stable clones producing fusion proteins of IL-2 muteins to human IgG 1 Fe.
  • Figure 11 Binding capacity of human Fe fusion proteins derived from IL-2 muteins selected from the S1 library to the beta chain of the receptor.
  • Figure 12. Binding capacity of human Fe fusion proteins derived from IL-2 muteins selected from the S2 library, to the beta chain of the receptor.
  • FIG. 14 In vivo expansion of the population of activated effector T cells (CD8+CD44h ⁇ CD122h ⁇ ). The number of cells in each mouse is shown.
  • FIG. 15 In vivo expansion of the regulatory T cell population (CD4+CD25+Foxp3+). The number of cells in each mouse is shown.
  • Example 1 Construction of a soft randomization library of the interface of human IL-2 on filamentous phages with the beta subunit of the IL-2 receptor and selection of mutated variants therefrom
  • the 7 x 10 7 member library was constructed by Kunkel mutagenesis (Kunkel, T., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 488-492, 1985) with two degenerate antisense mutagenic oligonucleotides.
  • the oligonucleotides introduced limited variability at 14 positions (seven in each of amino acid segments 12-23 and 81-95 of IL-2) ( Figure 2).
  • the residues to be mutated were chosen due to their location at the interface with the beta chain ( ⁇ 5 ⁇ ) in the structure of the IL-2/receptor complex (PDB code 2B5I).
  • PDB code 2B5I beta chain
  • These oligonucleotides included 90% of the nucleotide complementary to the original in each position of the triplets to be diversified, and the remaining 10% of a mixture of the other three nucleotides.
  • amino acids that exhibited a higher frequency of mutations in this panel were R81 (preferentially replaced by D), I92 (I92L) and S87 (S87D). These three positions were chosen as hot spots that modulate the interaction with the beta subunit of the receptor.
  • Example 2 Combinatorial exploration of the neighborhood of hot spots identified through secondary phage libraries
  • Library S1 included full randomization of the hot spots R81 and S87 and the neighboring (also solvent-exposed) residues R83 and D84, as well as the replacement of the adjacent residue P82 by the Pro/Ala mixture.
  • the S2 library included, in addition to the previous modifications, the replacement of residues I92 (hot spot) and other amino acids of the hydrophobic core close to the interface with the beta chain (L80, L85, I86, I89 and V93), by a mixture of hydrophobic residues (Phe/lle/Met/Leu/Val).
  • the reactivity of the phage mixtures obtained after two and three cycles of selection was evaluated by ELISA on plates coated with the recombinant extracellular domain of the beta subunit of the receptor and with the unrelated protein bovine serum albumin. Bound phages were detected with a horseradish peroxidase-conjugated anti-phage antibody. Phages that presented the original non-mutated IL-2 and its H9 variant (superkine) were used as controls. The functional result of the selection was an increase in reactivity with the beta chain of the phage mixture (Figure 5).
  • Figure 6 shows the sequences obtained (SEQ ID NO. 100-1 12) after three cycles of selection of phages from the S2 library on the recombinant extracellular domain of the beta subunit of the receptor.
  • the first line shows the original IL-2 (with the diversified residues shaded in gray), and below it the variants isolated after three cycles of selection on the recombinant extracellular domain of the beta subunit of the immobilized receptor. Dashes indicate conservation of the original IL-2 residue at a given position. The number of times that each vahant was repeated within the sample of 54 clones analyzed is shown in parentheses. The numbers at the end of each line represent the net charge of segment 81 -87 on each selected vahant.
  • the binding capacity of the new variants to the extracellular domain of the beta subunit of the IL-2 receptor was evaluated by ELISA. To do this, the plates were coated with the recombinant extracellular domain of the beta subunit of the IL-2 receptor. Bound phages were detected with an anti-M13 antibody conjugated to horseradish peroxidase. Simultaneously, its binding to a plate coated with the monoclonal antibody 9E10 directed against the c-myc peptide that is fused to the proteins presented on the phages was determined, to establish the level of presentation of each one. The relationship between the signals obtained with both coatings (relative reactivity) is represented as a measure of the intrinsic binding capacity of each vahant to the beta subunit. The original IL-2 and superkine H9, also displayed on phages, were used as controls.
  • Figure 7 shows a greater binding capacity of these variants with respect to human IL-2 and in some cases also to H9 presented on phages.
  • the characterization of the vahants selected on phages as soluble proteins was carried out in the format of fusion proteins to the N-terminal end of an Fe region of human lgG1 (SEQ ID NO. 113).
  • the expression system chosen was the transient transfection of HEK-293T cells adapted to grow in suspension (J ger et al., BMC BiotechnoL 13: 52, 2013).
  • the first two amino acids (Ala-Pro) of IL-2 absent in the molecules presented on phages, were added and the K35E mutation was introduced, with a demonstrated beneficial effect on the developability of IL-2. 2 (Rojas, G. et al., Sci. Reports. 9: 800, 2019).
  • Figure 8 shows the primary sequence of IL-2 taken as a basis for the production in eukaryotic cells, to which the pertinent changes were introduced at the interface with the beta chain. These changes were designed based on the results of screening the initial soft interface randomization library and the secondary libraries S1 and S2.
  • the variants presented on phages 1 A and 2B were chosen, due to their high reactivity against the beta chain, their recurrent presence among the selected clones and the net negative charge of -2 in segment 81 -87. From them, two fusion proteins were constructed, mentioned hereinafter as 8 OFDPHDVVE 87 +I92L-I-V93L (SEQ ID NO. 1 18) and 8 OVPPEDLIA 87 +I92L (SEQ ID NO. 1 19) respectively for their sequence at the interface with the beta chain.
  • Variant 8 OVPPEDLIA 87 +I92L (SEQ ID NO. 1 19) does not share any mutation with superkine H9, therefore it represents a new structural solution for the increased interaction with the beta subunit. With the intention of optimizing it, another variant was designed ( 8 OVPPEDLIE 87 +I92L) (SEQ ID NO. 120), which also incorporates the S87E mutation, which was frequently selected from the library and increases the net negative charge of the interface (-3 ).
  • the variants designed and built were: 8OFDPADVVE 8 7+I92L (SEQ ID NO. 121) 8OFDPADVVE 8 7+I92F (SEQ ID NO. 125) 8O FDPEDVVE 87 +I92L (SEQ ID NO. 122) 8O FDPEDVVE 87 +I92F (SEQ ID NO. 126)
  • Figure 9 illustrates the mass yields of protein A affinity purification from 1 L of culture supernatant of the different fusion proteins in a transient transfection experiment of HEK-293T cells in suspension.
  • the decreased secretion levels of the fusion proteins containing superkine H9 (30 mg/L of supernatant), as well as the other two designed muteins that include the I92F change in their sequence ( ⁇ 33 mg/L) were striking. .
  • the rest of the muteins designed from the results of phage library screening were produced at higher levels (>67 mg/L). This result was the first evidence of the favorable developability profile associated with the new muteins, and suggested the deleterious effect of the I92F mutation present in superkine H9 on their production.
  • Example 4 Stable production of fusion proteins based on IL-2 muteins from lentiviral transduction of HEK-293 cells adapted to grow in suspension
  • Clones were obtained by lentiviral transduction of HEK-293 cells adapted to grow in suspension with the genetic constructs of interest derived from the pL6WBIast vector. The five best producing clones of each variant were included in the study. The concentration of fusion protein in the supernatants was determined by ELISA in microtiter plates coated with an anti-IL-2 antibody. Fusion proteins were detected with an anti-human IgG antibody conjugated to horseradish peroxidase.
  • Figure 10 illustrates the productivity of the clones obtained.
  • a clear superiority of the clones producing the fusion proteins containing a the new muteins with respect to those produced by them include superkine H9.
  • One of the variants (8O DPEDVVE 8 7+I92L) (SEQ ID NO. 122) produces even better than the rest.
  • Example 5 Demonstration of the increased binding capacity to the beta chain and the low tendency to aggregation of the fusion proteins containing the new muteins
  • fusion proteins (at 60 ng/mL), purified from the supernatant of HEK-293-T cells adapted to grow in suspension and transfected with the corresponding genetic constructs, were incubated on ELISA plates coated with the recombinant extracellular domain of the beta subunit of the receptor, and were detected with an anti-human Fc antibody conjugated to horseradish peroxidase.
  • Fusion proteins derived from the new muteins are designated according to the sequences they contain at their interface with the beta chain (segments 81-87 and position 92). Fusion proteins derived from the original IL-2 and superkine H9 were used as controls.
  • the first generation of fusion proteins (derived from the screening of the S1 library) showed an increased capacity to bind to the extracellular domain of the beta subunit of the receptor with respect to its counterpart containing the original IL-2 ( Figure 1 1). in the same range as that of the fusion protein based on superkine H9. The introduction of the I92L change in these molecules had no additional impact on the binding capacity to the receptor subunit.
  • the size exclusion chromatography profile of the variants 8iDPQDLIE 8 7 (SEQ ID NO. 114) and 8iVPEDLIE 87 (SEQ ID NO. 115) revealed the presence of a higher peak corresponding to the expected homodimer according to the specific dimehzation capacity of the Fe fragment (92-95%), accompanied by at least one minority peak of high molecular size aggregates (Table 2).
  • Table 2 For the versions of these fusion proteins that include the I92L change ( 8 I DPQDLIE 87 -I-I92L ( SEQ ID NO. 116) and 8 IVPEDLIE 8 7+I92L) aggregates were not evident and practically all of the protein (>98%) was found in its homodimeric form.
  • the second generation of fusion proteins (derived from the S2 library screening) had heterogeneous behavior in terms of aggregation levels. While the two molecules that included by design the I92F change showed a complex pattern of unwanted aggregation and a minor proportion of non-aggregated homodimer (Table 3), the fusion proteins containing the muteins selected directly from the library and those designed that included a Leu residue at position 92 had a very low tendency to aggregation (>95% homodimenous purified product) (Table 3). Table 3. Aggregation status of human Fe fusion proteins derived from second generation muteins.
  • the two fusion proteins with a high tendency to aggregation which had already been distinguished from the rest by their lower levels of secretion (Example 3), were excluded from subsequent analyses.
  • the rest of the fusion proteins purified from the supernatant of HEK-293-T cells adapted to grow in suspension and transfected with the corresponding genetic constructs and at a concentration of 30ng/mL, were incubated on ELISA plates coated with the domain. recombinant extracellular beta subunit of the receptor, and were detected with an anti-human Fc antibody conjugated to horseradish peroxidase. Fusion proteins derived from the original IL-2 and superkine H9 were used as controls.
  • the purified proteins were incubated at 50°C for 48 and 72h, before being evaluated by ELISA on microtiter plates coated with the recombinant extracellular domain of the beta subunit of the receptor. Bound proteins were detected with an anti-human Fc antibody conjugated to horseradish peroxidase. The relative reactivity of each treated protein was calculated taking as reference (100%) the reactivity of the same untreated protein. The fusion protein based on superkine H9 was included as a control.
  • Figure 13 shows how the muteins object of the present invention have greater thermal stability, evidenced by the conservation of the binding capacity of the fusion proteins corresponding to the beta chain by more than 82%. This result contrasts with the drastic loss of reactivity (greater than 76%) of the fusion protein containing superkine H9 when subjected to similar conditions.
  • Example 6 Demonstration of the superagonist capacity in vitro and in vivo of the new muteins on cells that present the dimeric beta/gamma receptor of IL-2
  • CD8+ T cells were purified from non-immunized mice and labeled with CTV. They were stimulated with each of the fusion proteins under study and the decrease in fluorescence in the cells was evaluated by flow cytometry, as an indicator of the proteins' ability to induce the proliferation of this cell population. Non-cells were used as controls. stimulated and cells treated with fusion proteins containing the original IL-2 and superkine H9.
  • the fusion proteins containing the four new IL-2 muteins studied induced the proliferation of 93-96% of CD8+ T cells, with a behavior similar to that of the protein based on superkine H9 (Table 5).
  • the fusion protein of IL-2 to human Fe had a moderate effect, only inducing the proliferation of 55.3% of the cells.
  • in vivo stimulation experiments showed a greater effect of fusion proteins based on the new muteins, compared to their counterpart containing superkine H9.
  • mice After daily treatment for four consecutive days of each group of animals with 5.6 pg intraperitoneally of each of the fusion proteins, on the fifth day the mice were sacrificed, their spleens were removed, macerated and the cells were analyzed by flow cytometry. For statistical analysis, a one-tailed ANOVA was used, followed by a Tukey's multiple comparisons test (p ⁇ 0.05).
  • CD8+CD44h ⁇ CD122h ⁇ The number of activated CD8+ T lymphocytes (CD8+CD44h ⁇ CD122h ⁇ ) increased significantly in the groups treated with the fusion proteins containing the new muteins, compared to the animals treated with IL-2/Fc7LALA, H9/ FcLALA and the control group that only received phosphate-buffered saline (PBS) ( Figure 14).
  • fusion proteins based on the new muteins fused to human Fe LALA was studied in the MB16/FO melanoma experimental metastasis model. 100,000 cells of this tumor line were inoculated through the tail vein of C57BL/6 mice and each group of animals was then treated with an intraperitoneal injection of 5.6 pg of each of the fusion proteins containing the IL-2 muteins. Treatment with the fusion proteins was repeated every 24 h until the fifth day. Lung metastases were counted 21 days after initial inoculation. For statistical analysis, a one-tailed ANOVA was used, followed by a Tukey's multiple comparisons test (p ⁇ 0.05).
  • the count of lung metastases showed a significant reduction in the animals treated with the fusion proteins containing the new muteins compared to the animals in the control group treated with PBS and those that received the IL-2/FcLALA or H9/FcLALA proteins ( Figure 16).
  • a human Fe fusion protein (LALA version) was designed and constructed that contains a variant of IL-2 with the sequence 8OVPPEDLIE 8 7+I92L at the interface with the beta chain of the receptor and the mutations R38A, F42A, Y45A and E62A. , known to break the interaction with the alpha chain in a variant called non-alpha IL-2 and additionally the K35E mutation whose effects on increasing IL2 secretion are known (Rojas, G et al., Sci. Reports. 9 : 800, 2019).
  • the above set of mutations is described in SEQ ID NO. 4 of patent EP 3 543 252 B1. This protein was produced in the transient transfection system of HEK293-T cells adapted to growth in suspension already described.
  • the anti-tumor effect of the combined mutein-based fusion protein was studied in the MB16/F0 melanoma experimental metastasis model, in comparison with fusion proteins that only contained the changes in one of the interfaces.
  • 100,000 tumor cells were inoculated through the tail vein of C57BL/6 mice and each group of animals was then treated with an intraperitoneal injection of 1.9 pg of each of the fusion proteins containing IL muteins. -2. Treatment with the fusion proteins was repeated every 24 h until the fifth day. Lung metastases were counted 21 days after initial inoculation. For statistical analysis, a one-tailed ANOVA was used, followed by a Tukey's multiple comparisons test (p ⁇ 0.05).
  • Figure 17 shows the lower formation of metastasis in the animals treated with the combined mutein-based fusion protein, compared to those that received PBS, the control fusion protein containing the original IL-2 and the fusion proteins. containing changes only in one of the two interfaces (non-alpha mutein and 8OVPPEDLIE 8 7+I92L variant).

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Abstract

La presente invención se relaciona con la rama de la Biotecnología, y se basa en la identificación de conjuntos de mutaciones de IL-2 en las proximidades de la interfaz con la cadena beta de su receptor, a través de la selección de variantes provenientes de bibliotecas sobre fagos filamentosos por afinidad al dominio extracelular de la cadena beta. Las proteínas recombinantes derivadas de estas variantes muestran un perfil de desarrollabilidad muy favorable, en cuanto a sus altos niveles de expresión, baja tendencia a la agregación, y alta estabilidad térmica. Además, en comparación con la IL-2 original no mutada, y con otras muteínas superagonistas descritas, tienen una mayor capacidad de estimulación de las poblaciones efectoras del sistema inmune que portan el receptor dimérico de la IL-2 y una mayor actividad anti-tumoral in vivo.

Description

MUTEÍNAS DERIVADAS DE LA INTERLEUCINA-2 HUMANA CON ACTIVIDAD SUPERAGONISTA
CAMPO DE LA TÉCNICA
La presente invención se relaciona con la rama de la Biotecnología, particularmente con una familia de proteínas mutadas (muteínas) derivadas de la lnterleucina-2 (IL-2) humana, las cuales tienen una capacidad incrementada de unión a la cadena beta del receptor de la IL-2 y un perfil favorable de desarrollabilidad, que les confieren una potente actividad superagonista in vitro e in vivo.
ANTECEDENTES
Si bien la IL-2 fue descrita originalmente como un factor de crecimiento de las células T (Smith, K.A. Immunol. Rev. 51 : 337-357, 1980), se conoce actualmente como un regulador con funciones duales en la respuesta inmune (Malek, T.R. Annu. Rev. Immunol. 26: 453-479, 2008; Hoyer K.K. y otros, Immunol. Rev. 226: 19-28, 2008), que promueve o modula negativamente las funciones efectoras del sistema inmune. Aunque la presencia constitutiva del receptor dimérico de afinidad intermedia beta/gamma en las células efectoras del sistema inmune media las potentes funciones inmunoestimuladoras de la IL-2, la existencia de altos niveles de la cadena alfa en la superficie de las células T reguladoras las dota de un receptor trimérico de alta afinidad, que permite la utilización preferencia! de la citocina por esta población celular con respecto a otras células inmunes (Malek, T.R. y Castro, I. Immunity. 33: 153-165, 2010). Como consecuencia, en estado fisiológico el rol esencial de la IL-2 es el mantenimiento de la tolerancia inmunológica (Malek, T.R. y Bayer, A.L. Nat. Rev. Immunol. 4: 665-674, 2004) a través de la estimulación de las células T reguladoras.
La dicotomía funcional de la IL-2 ha abierto amplias posibilidades para su explotación a fin de producir efectos terapéuticos contrapuestos sobre el sistema inmune y modular la respuesta inmune en uno u otro sentido en diferentes escenarios. Su uso en altas dosis ha evidenciado su capacidad inmunopotenciadora, útil para estimular respuestas anti- tumorales (Klapper, J.A. y otros, Cancer. 113: 293-301 , 2008). Más allá de la manipulación farmacológica, la modificación por ingeniería de proteínas de la molécula en sí misma ha conducido a la modulación selectiva de las interacciones con las distintas subunidades del receptor, y la consiguiente alteración del balance natural entre las funciones inmunoestimuladora e inmunorreguladora. Por ejemplo, se han descrito variantes mutadas de la IL-2 con propiedades superagonistas, en las que el incremento de la capacidad de unión a la subunidad beta conduce a la estimulación potente de las células efectoras T CD8+ y NK, y a un fuerte efecto antitumoral (Levin, A.M. y otros, Nature. 484: 529-533, 2012). Al fortalecerse la interacción con el receptor dimérico beta/gamma presente en altos niveles en las células efectoras, disminuye la contribución relativa de la subunidad alfa característica de las células T reguladoras y por tanto, se crean moléculas con funciones sesgadas hacia la inmunopotenciación de la respuesta inmune. Estas muteínas, entre las cuales la más estudiada es la llamada superkina H9, provienen de la selección a partir de bibliotecas presentadas sobre la superficie de células de levadura (Levin, A.M. y otros, Nature. 484: 529-533, 2012). Dicha plataforma tecnológica ha dominado los procedimientos de evolución in vitro de la IL-2 (Rao, B.M. y otros, Protein Eng. 16:1081 -1087, 2003). A pesar de que la IL-2 se presentó sobre fagos filamentosos hace más de dos décadas (Buchli, P.J. y otros, Arch. Biochem. Biophys. 339: 79-84, 1997; Vispo, N.S. y otros, Immunotechnology. 3: 185-193, 1997), esta tecnología no ha sido útil hasta el momento para encontrar nuevos conjuntos de mutaciones que modulen las interacciones de la IL-2 con sus receptores.
La modificación de las propiedades funcionales de las citocinas mediante la introducción de mutaciones individuales o conjuntos discretos de ellas a menudo resulta en efectos deletéreos sobre la estabilidad y solubilidad de las moléculas, que tienen un impacto negativo en sus niveles de expresión como proteínas recombinantes, su perfil de desarrollabilidad como agentes terapéuticos, y finalmente sobre su actividad biológica. Estas limitaciones han conducido a enfoques más drásticos de rediseño de novo de agonistas estables a partir de la optimización extensiva in silico y la selección por afinidad a los receptores (Silva, D-A.y otros, Nature. 565: 186-191 , 2019). Estas moléculas se alejan grandemente de la secuencia primaria de las citocinas naturales, por lo que su posible inmunogenicidad e interacciones no deseadas dentro del organismo son motivos de preocupación.
Sorprendentemente, los inventores de la presente invención definieron, a partir de la evolución dirigida de la lnterleucina-2 humana presentada sobre fagos filamentosos, conjuntos discretos de mutaciones con regularidades no descritas anteriormente ni predecibles a partir del análisis estructural de la IL-2 humana, cuya introducción aumenta la capacidad de la citocina de unirse a la subunidad beta de su receptor y por tanto de estimular a células del sistema inmune que portan el receptor dimérico de la IL- 2. Las variantes de IL-2 así modificadas se distinguen de otros superagonistas descritos en el arte previo por una mejor desarrollabilidad en cuanto a niveles de expresión, baja tendencia a la agregación, y estabilidad térmica, que les confieren mayor capacidad superagonista y actividad anti-tumoral in vivo. Dicho hallazgo sienta las bases para la explotación de estas vahantes a escala industrial para obtener productos terapéuticos, útiles en la inmunoterapia del cáncer, las inmunodeficiencias y en la estimulación ex vivo de células inmunes para protocolos de inmunoterapia adoptiva.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
En una realización la presente invención se basa en la identificación de conjuntos de mutaciones localizadas en las proximidades de la interfaz de unión con la cadena beta del receptor de la IL-2 a partir de bibliotecas de vahantes de IL-2 humana presentadas sobre fagos filamentosos. La selección de fagos por afinidad al dominio extracelular recombinante de la cadena beta conduce al aislamiento de variantes con capacidad incrementada de unión al mismo. Los conjuntos de mutaciones identificados por esta vía son diversos, pero presentan regularidades que determinan las propiedades de las variantes seleccionadas. Particularmente se distinguen por la presencia de cambios en al menos dos de las posiciones 81 , 83, 84 y 87 de la secuencia primaria de aminoácidos de la IL-2, que resultan en una carga negativa neta del segmento 81 -87 igual o mayor a -2. Otro elemento distintivo de las mismas es la presencia preferentemente de la sustitución I92L o del residuo original lie en la posición 92, sin otros sustituyentes en dicha posición. Las regularidades de las secuencias se muestran en la Tabla 1 (SEQ ID NO. 1 -13).
Opcionalmente, se pueden mutar las posiciones 80 por los aminoácidos Phe, Val, Met o lie, la posición 82 por Ala, la posición 85 por lie, Val o Met, la posición 86 por Val, la posición 89 por Leu o Met. y la posición 93 por lie o Leu (SEQ ID NO. 14-26).
En otra realización la presente invención comprende la construcción genética de nuevas moléculas recombinantes a través de la introducción de las mutaciones anteriormente identificadas, solas o combinadas con las mutaciones K35E, K35D y K35Q (SEQ ID NO. 27-52) y/o con otras sustituciones conocidas por sus efectos sobre las propiedades de la IL-2 (SEQ ID NO. 127-152), y la fusión a los genes codificantes para proteínas de interés como los anticuerpos, sus dominios y fragmentos, albúmina, proteínas de la cápside de fagos filamentosos, citocinas y otras.
Son también objeto de la presente invención las proteínas recombinantes producidas a partir de las construcciones genéticas anteriormente descritas en sistemas de expresión en células hospederas procariotas como E. coliy eucariotas como HEK-293, CHO, NSO, células de insecto y levaduras. Estas proteínas poseen una capacidad incrementada de unión a la cadena beta del receptor, característica por la que fueron seleccionadas y que conduce a una potente actividad superagonista sobre células que portan el receptor diméhco beta/gamma de la IL-2. A diferencia de la superkina H9 y otras moléculas similares descritas en el arte previo, dichas muteínas se distinguen además por un perfil favorable de desarrollabilidad (altos niveles de expresión, baja tendencia a la agregación y elevada estabilidad térmica). El conjunto de las propiedades de las muteínas obtenidas como parte de la presente invención les confiere una mejor desarrollabilidad, y una mayor capacidad de estimulación de las células efectoras del sistema inmune y actividad anti-tumoral in vivo, en comparación con la IL-2 original y con la superkina H9.
Son también objeto de la presente invención las composiciones farmacéuticas que comprende las muteínas aquí descritas en un rango de concentración de 1 mg/ml a 20 mg/ml y un excipiente farmacéuticamente adecuado.
En otra realización es objeto de la presente invención el uso de las muteínas y las moléculas recombinantes derivadas de las mismas como fármacos para la inmunoterapia del cáncer, las inmunodeficiencias, y en la estimulación ex vivo de células inmunes para protocolos de inmunoterapia adoptiva.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
La presente invención se basa en la identificación de conjuntos de mutaciones en la secuencia de la IL-2 que se muestra en la Figura 1 , a la cual se le introdujo el cambio C125S con respecto a la secuencia de la IL-2 salvaje (sombreado en gris). Estos conjuntos de mutaciones se encuentran localizadas en las proximidades de la interfaz de unión de la IL-2 humana a la cadena beta de su receptor, y fueron seleccionadas a partir de bibliotecas sobre fagos filamentosos. Dichos conjuntos de mutaciones aumentan la capacidad de la citocina de unirse a la subunidad beta del receptor, y por tanto estimular a células del sistema inmune que portan el receptor dimérico de la IL-2. Se construyen proteínas recombinantes diversas derivadas de las vahantes mutadas de la IL-2, que incluyen sustituciones adicionales y la fusión a otros dominios proteicos. Se demuestra que el perfil de desarrollabilidad de las moléculas así modificadas es favorable, debido a sus altos niveles de expresión, baja tendencia a la agregación y elevada estabilidad térmica, que les confieren mayor capacidad superagonista y actividad anti-tumoral in vivo. Se evidencia la superioridad de las propiedades de las nuevas muteínas sobre las moléculas recombinantes equivalentes, obtenidas en igual formato y sistema de expresión a partir de la IL-2 no mutada y de la superkina H9 ya conocida como parte del arte previo.
Selección de conjuntos de mutaciones que aumentan la interacción con la cadena beta del receptor a partir de bibliotecas de variantes de la IL-2 presentadas sobre fagos filamentosos.
La selección de polipéptidos derivados de la IL-2 humana, con mutaciones que conducen al incremento de su capacidad de unión a la subunidad beta del receptor puede realizarse a partir de bibliotecas de vanantes de la IL-2 presentadas sobre fagos filamentosos. Los genes correspondientes a dichas variantes se insertan dentro de vectores de expresión de tipo fagomidio (fusionados a uno de los genes que codifica para las proteínas de la cápside de los fagos filamentosos) y se utilizan para la producción de partículas virales que exponen en su superficie las vahantes proteicas. Las bibliotecas pueden incluir distintos grados de diversificación (aleatorización suave o fuerte) a lo largo de toda la secuencia o en un grupo de posiciones pre-definidas. Cada uno de los residuos originales en estas posiciones puede reemplazarse por una mezcla de los 20 aminoácidos o por un subgrupo de residuos escogidos. La diversificación puede lograrse a través de la mutagénesis al azar o sitio-dirigida.
La selección de los fagos con mayor capacidad de unión a la cadena beta se basa en la incubación de las mezclas de fagos provenientes de las bibliotecas sobre un soporte donde se inmoviliza una proteína recombinante que contiene el dominio extracelular de la subunidad beta del receptor de la IL-2, la eliminación de los fagos no unidos mediante lavados, y la elución de los fagos unidos. Pueden realizarse varios ciclos de selección similares. El análisis de las secuencias de ADN insertadas en los fagomidios seleccionados revela regularidades que permiten identificar aquellas sustituciones más abundantes (y sus combinaciones) potencialmente relacionadas con el aumento de la capacidad de unión. Puede utilizarse el tamizaje de una biblioteca inicial para identificar puntos calientes que modulan la interacción, seguida por la exploración más fina de esos puntos y su vecindad a través de bibliotecas secundarias.
La capacidad de las vahantes de interactuar con la subunidad beta puede evaluarse en ensayos de unión como el ensayo inmunoenzimático en fase sólida (ELISA) u otros similares con los fagos. Para segregar los efectos directos sobre la capacidad de unión a la cadena beta (que son los que se persiguen) de los posibles cambios en los niveles de presentación sobre fagos de las vahantes de la IL-2, pueden normalizarse las señales obtenidas en el ensayo de unión, con respecto a las señales detectadas con una molécula que reaccione de manera equivalente con todas las vahantes, como un anticuerpo dirigido contra un péptido etiqueta común fusionado a ellas.
Como resultado de los procesos selectivos se obtienen vahantes diversas con secuencias diferentes, pero que cumplen ciertas regularidades. La primera es la presencia de mutaciones no silentes (con cambio del aminoácido codificado) en al menos dos de las posiciones seleccionadas dentro del grupo que comprende los residuos 81 , 83, 84 y 87 de la secuencia primaria de la IL-2, que resultan en una carga negativa neta del segmento 81 -87 igual o mayor que -2. Otra regularidad es la presencia frecuente de la mutación I92L (predominante), sin otros sustituyentes en dicha posición. Las diversas combinaciones de residuos que cumplen dichas regularidades se ¡lustran en la Tabla 1 , que comprende trece clases de muteínas (SEQ ID NO. 113). Estos cambios pueden opcionalmente ir acompañados de otras modificaciones en las posiciones 80, 82, 85, 86, 89 y 93 (SEQ ID NO. 14-26). Dichas combinaciones de mutaciones conducen a una mayor reactividad de las vahantes de IL-2 sobre fagos con 5 la subunidad beta del receptor, en comparación con la IL-2 original.
Tabla 1. Regularidades de la secuencia primaria de las trece clases de vahantes mutadas de la IL-2 humana identificadas como parte de la presente invención
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Las trece clases de variantes matadas de la IL-2 que cumplen las regularidades identificadas como parte de la presente invención se denominan con las letras del alfabeto latino, desde la A hasta la M).
Los aminoácidos (aa) del grupo I (básicos) comprenden residuos Arg, Lys e His.
5 Los aa del grupo II (ácidos) comprenden los residuos Asp y Glu.
Los aa del grupo III (neutros) incluyen los residuos Ala, Asn, Gly, Gln, lie, Leu, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Val, Trp y Tyr. Se excluye la Cys de los posibles sustituyentes. Introducción de las mutaciones identificadas en proteínas recombinantes derivadas de la IL-2 y caracterización de sus propiedades de unión
Una vez identificados los conjuntos de mutaciones que conducen a un aumento de la interacción con la subunidad beta del receptor se introducen por mutagénesis sitio- dirigida en los genes codificantes de la IL-2 contenidos en distintos vectores de expresión diseñados para la modificación de células hospederas bacterianas, de levadura, o líneas celulares derivadas de insectos o de mamíferos (tanto plasmidios como vectores virales). Estos conjuntos de mutaciones pueden coincidir con las combinaciones de sustituciones aisladas directamente de la selección de fagos, pero también pueden diseñarse combinaciones nuevas entre ellas.
Puede adicionalmente introducirse en la posición 35 de la secuencia primaria de la IL-2 la sustitución por los aminoácidos E, D o Q (SEQ ID NO. 27-52), cuyo efecto beneficioso sobre los niveles de secreción, la resistencia a la agregación y la actividad biológica de moléculas derivadas de la IL-2 se conoce (WO2018/0910003; Rojas, G y otros, Sci. Reports. 9: 800, 2019). A partir de estas secuencias de las muteínas de IL-2 se pueden construir otras moléculas recombinantes a través de la fusión genética con proteínas como la albúmina, las regiones Fe y los dominios variables de los anticuerpos, anticuerpos completos y otras citocinas.
Las moléculas anteriormente descritas pueden obtenerse a partir de: a. la transformación de bacterias hospederas (como la Escherichia coli) o células de levadura con los plasmidios correspondientes. b. la transfección de células de insecto con plasmidios o vectores derivados de baculovirus. c. la transfección transitoria o estable de células hospederas como HEK-293, CHO, NS0 y otras derivadas de mamíferos con los plasmidios correspondientes, así como de la transducción de dichas células hospederas con vectores virales que contengan los genes de interés.
El aumento en la capacidad de unión de las muteínas a la subunidad beta del receptor puede demostrarse a través de métodos inmunoquímicos como el ELISA o de la medición de la resonancia de los plasmones de superficie (equipo BIAcore™). La capacidad de unión de las proteínas recombinantes derivadas de las variantes mutadas descritas en la presente invención a la cadena beta del receptor de la IL-2, es mayor que la de la de sus contrapartes basadas en la IL-2 original. Caracterización del perfil de desarrollabilidad de las muteínas y de las proteínas recombinantes derivadas de ellas
El conjunto de propiedades agrupadas bajo el término "perfil de desarrollabilidad" incluye características biofísicas como la tendencia a la agregación y la estabilidad térmica, así como los niveles de secreción de las proteínas de interés en distintos sistemas de producción de proteínas recombinantes. Todas ellas tienen una influencia directa en la factibilidad de desarrollar procesos productivos y obtener productos biológicos apropiados para su aplicación final.
La tendencia a la agregación se estudia por cromatografía de exclusión molecular que detecta la presencia y proporción de especies monoméricas y agregados de distinta talla. La existencia de agregados resistentes a la desnaturalización se demuestra mediante electroforesis en geles de poliacrilamida con SDS.
La estabilidad térmica se caracteriza a través de la comparación de las moléculas tratadas a altas temperaturas con sus contrapartidas sin tratar, para detectar el cambio de sus propiedades asociado al estrés térmico.
Los niveles de secreción pueden medirse en distintos sistemas de expresión basados en células hospederas genéticamente modificadas, con el uso de métodos que permitan cuantificar las moléculas secretadas en muestras de sobrenadante. La cuantificación de las proteínas purificadas a partir de un volumen dado de sobrenadante permite determinar directamente los rendimientos.
Las vahantes mutadas de la IL-2 humana descritas como parte de la presente invención y las moléculas recombinantes derivadas de ellas se distinguen por un perfil favorable de desarrollabilidad, caracterizado por mayores niveles de secreción como proteínas solubles a partir de las células hospederas, una menor tendencia a la agregación y una estabilidad térmica incrementada, en comparación con sus contrapartes que contienen la secuencia original de la IL-2 o la de la superkina H9. La presencia del cambio I92L se asocia con el mejoramiento de estas propiedades. En contraposición, todas las vahantes que contienen el cambio I92F, presente en la superkina H9 y en otras muteínas derivadas de la IL-2 con capacidad incrementada de unión a la cadena beta del receptor (Levin, A.M. y otros, Nature. 484: 529-533, 2012; W02020/260270 A1 ), muestran propiedades desfavorables de desarrollabilidad, como niveles disminuidos de secreción por las células hospederas, alta propensión a la agregación, y una pobre estabilidad térmica. La exclusión del cambio I92F de las muteínas reivindicadas como parte de la presente invención, y la introducción preferencial de un residuo de Leu en dicha posición son claves para la obtención del perfil favorable de desarrollabilidad que distingue a este grupo de muteínas y les confiere una ventaja sobre las moléculas con propiedades similares de unión a la cadena beta del receptor descritas como parte del arte previo. Demostración del carácter superagonista de las muteínas sobre células que portan el receptor dimérico beta/gamma de la IL-2 in vitro e in vivo
La actividad superagonista de las nuevas moléculas se evidencia a través de la estimulación in vitro de células purificadas que expresan el receptor dimérico beta/gamma de la IL2, cuya proliferación se detecta por métodos de citometría de flujo. Para demostrar el efecto in vivo de las muteínas sobre la expansión de poblaciones inmunológicas efectoras se tratan animales de experimentación con las muteínas y se monitorean las poblaciones de interés también por citometría de flujo.
Las proteínas recombinantes derivadas de las muteínas descritas como parte de la presente invención muestran una capacidad incrementada de estimular in vitro células portadoras del receptor dimérico de la IL-2 con respecto a las que contienen la IL-2 original y en una medida no inferior a la de la superkina H9. Su capacidad de estimular poblaciones celulares de este tipo in vivo supera tanto a la de las proteínas basadas en la IL-2 original como en la vahante reportada H9.
Demostración del efecto anti-tumoral de las muteínas
El efecto anti-tumoral de las proteínas recombinantes derivadas de las muteínas puede demostrarse en modelos animales de tumores malignos. La administración de dichas proteínas a animales inoculados con líneas celulares de tumores trasplantadles singénicos puede evitar la formación de tumores, enlentecer el crecimiento tumoral o disminuir la formación de metástasis en diversos órganos.
Las proteínas recombinantes derivadas de las muteínas descritas como parte de la presente invención tienen efectos anti-tumorales como los descritos en modelos experimentales de tumores, en una magnitud superior a sus contrapartes que contienen la IL-2 original, e incluso superan en algunos sistemas experimentales a las que incluyen a la superkina H9 reportada en el arte previo.
Composiciones farmacéuticas
Las muteínas objeto de la presente invención se pueden encontrar como ingrediente activo, formando parte de diferentes composiciones farmacéuticas apropiadas para las mismas, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Las concentraciones del ingrediente activo en dichas composiciones farmacéuticas se encuentran en el rango de 1 mg/ml a 20 mg/ml.
Entre los vehículos farmacéuticamente adecuados se incluyen, pero no se limitan a: solución salina, salina amortiguada con fosfato pH neutro, y otros parecidos. Otros agentes de amortiguación, agentes dispersos, y sustancias inertes no tóxicas apropiadas para entregar a un paciente podrán ser incluidas en las composiciones de la presente invención. Las composiciones podrán ser soluciones apropiadas para la administración, y son normalmente estériles y libres de partículas indeseables.
Aplicación terapéutica y métodos de tratamiento
Esta invención incluye además las posibles aplicaciones terapéuticas de las muteínas aquí descritas con el objetivo de potenciar la respuesta inmune natural o inducida por vacunas en enfermedades como el cáncer o inmunodeficiencias donde las células T electoras sean particularmente relevantes. Además, se contempla el uso en la expansión in vitro de células T y NK para terapias de transferencia adoptiva.
Para su uso terapéutico, las muteínas de la presente invención deberán ser administrados a un sujeto portador de la enfermedad de forma independiente o combinado con otras muteínas o con otras sustancias que faciliten o potencien su acción terapéutica. La ruta de administración podrá ser cualquiera de las rutas de administración descritas por el arte previo para la administración parenteral de fármacos. Podrá administrarse preferiblemente por vía intravenosa, intramuscular, subcutánea o intratumoral.
Las muteínas de la presente invención pueden ser usadas en combinación con vacunas terapéuticas para cáncer.
Para obtener el efecto terapéutico deseado, las muteínas de la presente invención deberán ser administradas a dosis suficientemente altas como para garantizar una concentración de las mismas en el nodo linfático o sitio periférico relevante para la enfermedad en estudio, que esté en el rango de concentraciones para el cual las muteínas muestran un efecto immune-estimulador. La dosis en cuestión deberá por tanto ser ajustada para el tipo de enfermedad y via de administración en estudio. Por ejemplo en el caso de terapia de tumores, la dosis debe ajustarse para lograr concentraciones de la muteína en el interior del tumor y/o en el nodo linfático loco- regional que garanticen la estimulación de una respuesta inmune antitumoral. Los rangos de dosis a explorar pueden abarcar desde 20 pg/Kg de peso hasta 200 pg/Kg de peso. Para aquellas aplicaciones en que la muteína sustituya una terapia tradicional con IL-2 nativa, la dosis de muteína a utilizar debe ser menor o equivalente en actividad (determinada usando ensayo con línea CTLL-2) a la usada tradicionalmente para la IL- 2 nativa.
El número de administraciones a aplicar deberá también ajustarse a la biodistribución de la muteína en cuestión. En general se deberá lograr sostener las concentraciones efectivas antes referidas por un tiempo que va desde 2 días hasta 30 días consecutivos. Note por ejemplo que si la muteína es acoplada a una proteína transportadora, la frecuencia de administraciones puede disminuir y la dosis de la misma deberá ser ajustada en consecuencia; en este caso el rango de dosis varía desde 100 pg/Kg de peso hasta 1 mg/Kg de peso. Para aplicaciones donde se sustituya a la IL-2 nativa, el esquema de administración de la muteína podrá ser similar al aplicado en la terapia tradicional.
Debe entenderse por acción terapéutica la remisión total o parcial de los síntomas de la enfermedad. En cáncer, la disminución del volumen tumoral o el incremento del tiempo de recaída será, entre otros, el criterio de remisión de la enfermedad.
Los polipéptidos de la invención son particularmente útiles en la terapia de tumores tales como entre otros melanomas, tumores renales, tumores de ovario, mama y pulmón. También pueden ser útiles en inmunodeficiencias como el VIH y la inmunodeficiencia severa combinada.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1. Secuencia primaria de aminoácidos de la IL-2 original (T3-T 133) tomada como base para la construcción de las muteínas sobre fagos filamentosos.
Figura 2. Secuencias de los segmentos modificados (12-23 y 81 -87) en la biblioteca de aleatorización suave de la interfaz de la IL-2 con la subunidad beta del receptor.
Figura 3. Representación del perfil global de secuencias aisladas de la biblioteca S1 después de la selección de fagos sobre el dominio extracelular recombinante de la subunidad beta del receptor.
Figura 4. Cargas del segmento 81 -87 en las vahantes seleccionadas de la biblioteca S1.
Figura 5. Capacidad incrementada de unión de la mezcla de fagos seleccionados de la biblioteca S1 .
Figura 6. Secuencias del segmento modificado (80-93) de la IL-2 en los clones seleccionados a partir de la biblioteca S2.
Figura 7. Reactividad determinada por ELISA de las vahantes de IL-2 sobre fagos filamentosos seleccionadas a partir de la biblioteca S2.
Figura 8. Secuencia primaria de aminoácidos de la IL-2 (A1 -T 133).
Figura 9. Rendimiento de las proteínas fusionadas al Fe humano en el sistema de transfección transitoria de células HEK-293T adaptadas a crecer en suspensión. Figura 10. Productividad de los clones estables productores de proteínas de fusión de las muteínas de IL-2 al Fe de IgG 1 humana.
Figura 11. Capacidad de unión de las proteínas de fusión al Fe humano derivadas de las muteínas de IL-2 seleccionadas a partir de la biblioteca S1 a la cadena beta del receptor. Figura 12. Capacidad de unión de las proteínas de fusión al Fe humano derivadas de las muteínas de IL-2 seleccionadas a partir de la biblioteca S2, a la cadena beta del receptor.
Figura 13. Reactividad relativa frente a la cadena beta después de un tratamiento de las proteínas de fusión a 50eC.
Figura 14. Expansión in vivo de la población de células T efectoras activadas (CD8+CD44h¡ CD122h¡). Se muestra el número de células en cada ratón.
Figura 15. Expansión in vivo de la población de células T reguladoras (CD4+CD25+Foxp3+). Se muestra el número de células en cada ratón.
Figura 16. Efecto anti-metastásico de las proteínas de fusión al Fe humano LALA que contienen a las muteínas de IL-2.
Figura 17. Efecto anti-metastásico de las proteínas de fusión que contienen muteínas combinadas con capacidad de unión incrementada a la cadena beta del receptor y disminuida con la cadena alfa en el modelo MB16/FO.
EJEMPLOS
Ejemplo 1. Construcción de una biblioteca de aleatorización suave de la interfaz de la IL-2 humana sobre fagos filamentosos con la subunidad beta del receptor de la IL-2 y selección de variantes mutadas a partir de ella
Para la identificación inicial de posiciones que modulen la interacción de la IL-2 con la subunidad beta del receptor se utilizó, a diferencia de la diversificación al azar empleada en trabajos anteriores (Levin, A.M. y otros, Nature. 484: 529-533, 2012), una estrategia de aleatorización suave focalizada en la interfaz de interés. Como base se utilizó la construcción genética descrita (Rojas, G. y otros, Immunobiology 218: 105-113, 2013; Rojas, G. y Carménate, T., Methods Mol. Biol.1701 : 535-560, 2018) que contiene el gen codificante para la IL-2 humana (residuos T3-T133, C125S, Figura 1 ) fusionado al gen de la proteína III del bacteriófago filamentoso M13. La biblioteca de 7 x 107 miembros se construyó por mutagénesis de Kunkel (Kunkel, T., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 488-492, 1985) con dos oligonucleótidos mutagénicos degenerados antisentido. Los oligonucleótidos introdujeron variabilidad limitada en 14 posiciones (siete en cada uno de los segmentos aminoacídicos 12-23 y 81 -95 de la IL-2) (Figura 2). Los residuos a mutar se escogieron debido a su ubicación en la interfaz con la cadena beta (< 5Á) en la estructura del complejo IL-2/receptor (código PDB 2B5I). Estos oligonucleótidos incluyeron el 90% del nucleótido complementario al original en cada posición de los tripletos a diversificar, y el 10% restante de una mezcla de los otros tres nucleótidos.
Se produjeron los fagos de la biblioteca según un protocolo descrito (Marks, J.D. y otros, J. Mol. Biol. 222: 581-597, 1991 ), y se seleccionaron los fagos con capacidad de unión a la superficie de inmunotubos recubiertos con el dominio extracelular recombinante de la subunidad beta humana. La secuenciación de una muestra de los fagomidios obtenidos después de tres ciclos de selección evidenció la presencia de variantes mutadas como se evidencia en la Figura 2. En la primera línea de dicha Figura aparece la IL-2 original (con los residuos a modificar sombreados en gris), y debajo las vahantes aisladas después de tres ciclos de selección. Los guiones indican la conservación del residuo original de la IL-2 en una posición dada. Entre paréntesis se muestra la frecuencia de cada variante en la muestra de 41 clones analizados después de la selección. El asterisco (*) representa la existencia de otras mutaciones fuera de la región modificada intencionalmente.
Los aminoácidos que exhibieron una mayor frecuencia de mutaciones en este panel fueron R81 (sustituida preferentemente por D), I92 (I92L) y S87 (S87D). Estas tres posiciones se escogieron como puntos calientes que modulan la interacción con la subunidad beta del receptor.
Ejemplo 2. Exploración combinatoria de la vecindad de los puntos calientes identificados a través de bibliotecas secundarias sobre fagos
Se construyeron dos bibliotecas secundarias (S1 y S2) por técnicas similares a las descritas en el ejemplo anterior. La biblioteca S1 incluyó la aleatorización total de los puntos calientes R81 y S87 y de los residuos vecinos (también expuestos al solvente) R83 y D84, así como la sustitución del residuo adyacente P82 por la mezcla Pro/Ala.
La biblioteca S2 incluyó, además de las modificaciones anteriores, el reemplazo de los residuos I92 (punto caliente) y otros aminoácidos del núcleo hidrofóbico cercano a la interfaz con la cadena beta (L80, L85, I86, I89 y V93), por una mezcla de residuos hidrofóbicos (Phe/lle/Met/Leu/Val).
Si bien los trabajos precedentes habían abordado la diversificación del núcleo hidrofóbico de la IL-2 (Levin, A.M. y otros, Nature. 484: 529-533, 2012), la aleatorización de residuos protuberantes altamente expuestos al solvente para modular positivamente la interacción de la IL-2 con la cadena beta es novedosa.
La secuenciación de una muestra de clones obtenidos de la biblioteca S1 , después de tres ciclos de selección sobre inmunotubos recubiertos con el dominio extracelular recombinante de la subunidad beta del receptor, evidenció una amplia diversidad. Se encontraron 48 secuencias únicas (SEQ ID NO. 53-100), ninguna repetida más de tres veces, pero que cumplían ciertas regularidades como se muestra en la Figura 3, donde las letras representan los aminoácidos codificados en cada posición del segmento 81 - 87. El tamaño de cada letra es proporcional a la frecuencia de aparición del residuo correspondiente en una posición dada. Los residuos básicos de Arg de las posiciones 81 y 83 resultaron reemplazados por varios aminoácidos, entre ellos Asp y Glu (ácidos). En la mayoría se conservó el carácter ácido del residuo D84, sustituido preferentemente por Glu. El aminoácido S87 fue reemplazado frecuentemente tanto por Glu como por Asp. Este patrón de selección reveló la posible importancia de la acumulación de cargas negativas en el segmento 81 - 87 de la IL-2 para el aumento de la interacción con la cadena beta. Mientras que la IL-2 tiene una carga positiva neta (+1 ) en esta zona y la carga de la vahante H9 descrita en el arte previo es -1 , entre las nuevas vahantes seleccionadas a partir de la biblioteca S1 predominaron las vahantes con cargas negativas netas de -2 y -3 en el segmento 81 - 87, pese a que ese segmento en la biblioteca sin seleccionar era mayormente neutro debido a la aleatorización (Figura 4).
La reactividad de las mezclas de fagos obtenidas después de dos y tres ciclos de selección se evaluó mediante ELISA sobre placas recubiertas con el dominio extracelular recombinante de la subunidad beta del receptor y con la proteína no relacionada albúmina sérica bovina. Los fagos unidos se detectaron con un anticuerpo anti-fago conjugado a peroxidasa de rábano picante. Como controles se utilizaron los fagos que presentaban la IL-2 original no mutada y su variante H9 (superkina). El resultado funcional de la selección fue un incremento de la reactividad con la cadena beta de la mezcla de fagos (Figura 5).
En la Figura 6 se muestran las secuencias obtenidas (SEQ ID NO. 100-1 12) después de tres ciclos de selección de los fagos de la biblioteca S2 sobre el dominio extracelular recombinante de la subunidad beta del receptor. En la primera línea aparece la IL-2 original de partida (con los residuos diversificados sombreados en gris), y debajo las variantes aisladas después de tres ciclos de selección sobre el dominio extracelular recombinante de la subunidad beta del receptor inmovilizado. Los guiones indican la conservación del residuo original de la IL-2 en una posición dada. Entre paréntesis se muestra la cantidad de veces que cada vahante se repitió dentro de la muestra de 54 clones analizada. Los números al final de cada línea representan la carga neta del segmento 81 -87 en cada vahante seleccionada.
Como se muestra en la Figura 6 se obtuvieron doce secuencias diversas (SEQ ID NO. 100-1 12), con diferente abundancia relativa. Las vahantes seleccionadas se distinguieron por la presencia mayohtaha de la sustitución I92L; la desaparición de los residuos originales de Arg en las posiciones 81 y 83; el hallazgo frecuente de residuos ácidos en las posiciones 81 , 83 y 87; y la conservación del carácter ácido del residuo D84 (solamente sustituido por Glu). Este patrón de secuencias resultó en una carga negativa neta considerable (-2 o mayor) en el segmento 81 -87. Los datos anteriores reforzaron la importancia de las interacciones electrostáticas para optimizar la unión a la subunidad beta. Si bien hubo coincidencias entre las secuencias seleccionadas a partir de la biblioteca S2 y la superkina H9 descrita en el arte previo (la aparición eventual de los cambios L80F, R81 D, L85V e I86V), existieron diferencias marcadas entre ellas. Las secuencias aisladas de la biblioteca S2 incluyeron mayoritariamente el cambio I92L, en contraposición con la mutación I92F presente en la H9. Esta última conserva la R83, mientras que en las nuevas vahantes este residuo está sustituido. La S87 se conserva también en la H9, pero está frecuentemente reemplazada por aminoácidos ácidos en las nuevas vahantes, La carga neta del segmento 81 -87 es más negativa en las variantes de la biblioteca (-2, -3) que en La H9 (-1 ). Los resultados demostraron la posibilidad de obtener variantes de la IL-2 humana con una capacidad incrementada de unión a la cadena beta a través de soluciones estructurales diversas y diferentes a la de la H9.
Se evaluó la capacidad de unión de las nuevas vahantes al dominio extracelular de la subunidad beta del receptor de la IL-2 mediante ELISA. Para ello se recubrieron las placas con el dominio extracelular recombinante de la subunidad beta del receptor de la IL-2. Los fagos unidos se detectaron con un anticuerpo anti-M13 conjugado a peroxidasa de rábano picante. Simultánemente se determinó su unión a una placa recubierta con el anticuerpo monoclonal 9E10 dirigido contra el péptido c-myc que está fusionado a las proteínas presentadas sobre los fagos, para establecer el nivel de presentación de cada una. Se representa la relación entre las señales obtenidas con ambos recubrimientos (reactividad relativa) como medida de la capacidad intrínseca de unión de cada vahante a la subunidad beta. Como controles se utilizaron la IL-2 original y la superkina H9, también presentadas sobre fagos.
En la Figura 7 se observa una mayor capacidad de unión de estas vahantes con respecto a la IL-2 humana y en algunos casos también a la H9 presentada sobre fagos.
Ejemplo 3. Diseño de proteínas de fusión derivadas de las nuevas variantes de IL-2 y producción por transfección transitoria
La caracterización de las vahantes seleccionadas sobre fagos como proteínas solubles se realizó en el formato de proteínas de fusión al extremo N-terminal de una región Fe de lgG1 humana (SEQ ID NO. 113). El sistema de expresión elegido fue la transfección transitoria de células HEK-293T adaptadas a crecer en suspensión (J ger y otros, BMC BiotechnoL 13: 52, 2013). Para la producción en hospederos eucariotas se adicionaron los dos primeros aminoácidos (Ala-Pro) de la IL-2, ausentes en las moléculas presentadas sobre fagos, y se introdujo la mutación K35E, con un efecto beneficioso demostrado sobre la desarrollabilidad de la IL-2 (Rojas, G. y otros, Sci. Reports. 9: 800, 2019). La Figura 8 muestra la secuencia primaria de la IL-2 tomada como base para la producción en células eucariotas, a la cual se le introdujeron los cambios pertinentes en la interfaz con la cadena beta. Dichos cambios se diseñaron a partir de los resultados del tamizaje de la biblioteca inicial de aleatoñzación suave de la interfaz y de las bibliotecas secundarias S1 y S2.
A partir de los productos de la biblioteca S1 se diseñaron dos proteínas de fusión con mutaciones frecuentemente seleccionadas (R81 D/R81 V, R83Q/R83E y S87E) y una carga negativa neta de -3 en el segmento 81 -87. Estas variantes se mencionan en lo adelante como 8I DPQDLIE87 (SEQ ID NO. 114) y 8i VPEDLIE87 (SEQ ID NO. 115) por su secuencia primaria en este segmento. En ellas se mantuvo la lie original en la posición 92. La introducción del cambio adicional I92L (seleccionado repetidamente desde el tamizaje inicial de la biblioteca de aleatoñzación suave) dio lugar a otras dos proteínas de fusión: 8I DPQDLIE87 +I92L (SEQ ID NO. 1 16) y 8IVPEDLIE87 +I92L (SEQ ID NO. 1 17).
Entre las moléculas seleccionadas de la biblioteca S2 se escogieron las variantes presentadas sobre fagos 1 A y 2B, debido a su alta reactividad frente a la cadena beta, su presencia recurrente entre los clones seleccionados y la carga negativa neta de -2 en el segmento 81 -87. A partir de ellas se construyeron dos proteínas de fusión, mencionadas en lo adelante como 8OFDPHDVVE87+I92L-I-V93L (SEQ ID NO. 1 18) y 8OVPPEDLIA87+I92L (SEQ ID NO. 1 19) respectivamente por su secuencia en la interfaz con la cadena beta.
La variante 8OVPPEDLIA87+I92L (SEQ ID NO. 1 19) no comparte ninguna mutación con la superkina H9, por lo que representa una nueva solución estructural para el aumento de interacción con la subunidad beta. Con la intención de optimizarla se diseñó otra variante (8OVPPEDLIE87+I92L) (SEQ ID NO. 120), que incorpora además la mutación S87E, que fue seleccionada frecuentemente de la biblioteca e incrementa la carga negativa neta de la interfaz (-3).
Por el contrario, la secuencia de otros clones seleccionados de la biblioteca S2 sí se solapa con la de la superkina H9, por lo que se exploró como posible vía de optimización la combinación de los cambios presentes en la H9 con los rasgos distintivos nuevos de las variantes seleccionadas a partir de nuestras bibliotecas. Se mantuvieron así los cambios L80F, R81 D, L85V y I86V de la H9 (también seleccionados a partir de la biblioteca de fagos), pero se sustituyó la R83 por Ala o Glu (ambas frecuentemente seleccionadas de la biblioteca de fagos) y se introdujo el cambio S87E (mutación recurrente entre las nuevas variantes). Como la posición 92 en la H9 está ocupada por un residuo de Phe y en las variantes seleccionadas se encontró mayoñtañamente el cambio I92L, se evaluaron ambos residuos (Phe y Leu) en esta posición. Las variantes diseñadas y construidas fueron: 8OFDPADVVE87+I92L (SEQ ID NO. 121 ) 8OFDPADVVE87+I92F (SEQ ID NO. 125) 8OFDPEDVVE87+I92L (SEQ ID NO. 122) 8OFDPEDVVE87+I92F (SEQ ID NO. 126)
La Figura 9 ¡lustra los rendimientos en términos de masa de la purificación por afinidad a proteína A partiendo de 1 L de sobrenadante de cultivo de las distintas proteínas de fusión en un experimento de transfección transitoria de células HEK-293T en suspensión. Resultaron llamativos los niveles disminuidos de secreción de las proteínas de fusión que contienen a la superkina H9 (30 mg/L de sobrenadante), así como de las otras dos muteínas diseñadas que incluyen en su secuencia el cambio I92F (<33 mg/L). Por el contrario, el resto de las muteínas diseñadas a partir de los resultados del tamizaje de las bibliotecas sobre fagos se produjeron a mayores niveles (>67 mg/L). Este resultado fue una primera evidencia del perfil favorable de desarrollabilidad asociado a las nuevas muteínas, y sugirió el efecto deletéreo de la mutación I92F presente en la superkina H9 sobre la producción de las mismas.
Ejemplo 4. Producción estable de las proteínas de fusión basadas en las muteínas de IL-2 a partir de la transducción lentiviral de células HEK-293 adaptadas a crecer en suspensión
El clonaje de los cassettes de expresión de las construcciones genéticas utilizadas para la transfección transitoria en el vector lentiviral pL6WBIast permitió la generación de clones estables productores de un subgrupo de las proteínas de fusión descritas en el ejemplo anterior:
8OVPPEDLIA87+I92L (SEQ ID NO. 1 19) 8OVPPEDLIE87+I92L (SEQ ID NO. 120) 8OFDPADVVE87+I92L (SEQ ID NO. 121 ) 8OFDPEDVVE87+I92L (SEQ ID NO. 122) Los clones se obtuvieron por transducción lentiviral de células HEK-293 adaptadas a crecer en suspensión con las construcciones genéticas de interés derivadas del vector pL6WBIast. Se incluyeron en el estudio los cinco mejores clones productores de cada variante. La concentración de proteína de fusión en los sobrenadantes se determinó por ELISA en placas de microtitulación recubiertas con un anticuerpo anti-IL-2. Las proteínas de fusión se detectaron con un anticuerpo anti-lgG humana conjugado a peroxidasa de rábano picante. Se utilizó como patrón una preparación de la proteína de fusión IL-2/Fc (K35E). Para el análisis estadístico se utilizó un ANOVA de una cola, seguido por una prueba de comparaciones múltiples de Tukey (p<0.05). La Figura 10 ¡lustra la productividad de los clones obtenidos. A pesar de la heterogeneidad entre los clones, presumiblemente debida a las diferencias en la localización y multiplicidad de la integración del ADN foráneo en el genoma de las células hospederas, se observó una clara superioridad de los clones productores de las proteínas de fusión que contienen a las nuevas muteínas con respecto a los que producen la que incluyen a la superkina H9. Una de las variantes (8O DPEDVVE87+I92L) (SEQ ID NO. 122) se produce incluso mejor que el resto. Estos datos reafirmaron la ¡dea de un perfil favorable de desarrollabilidad asociado a las nuevas vahantes.
Ejemplo 5. Demostración de la capacidad incrementada de unión a la cadena beta y la baja tendencia a la agregación de las proteínas de fusión que contienen las nuevas muteínas
Las proteínas de fusión (a 60 ng/mL), purificadas a partir del sobrenadante de células HEK-293-T adaptadas a crecer en suspensión y transfectadas con las construcciones genéticas correspondientes, se incubaron sobre placas de ELISA recubiertas con el dominio extracelular recombinante de la subunidad beta del receptor, y se detectaron con un anticuerpo anti-Fc humano conjugado a peroxidasa de rábano picante. Las proteínas de fusión derivadas de las nuevas muteínas se designan según las secuencias que contienen en su interfaz con la cadena beta (segmentos 81 -87 y posición 92). Como controles se utilizaron proteínas de fusión derivadas de la IL-2 original y de la superkina H9.
La primera generación de proteínas de fusión (derivadas del tamizaje de la biblioteca S1 ) mostró una capacidad incrementada de unión al dominio extracelular de la subunidad beta del receptor con respecto a su contrapartida que contiene a la IL-2 original (Figura 1 1 ), en el mismo rango que la de la proteína de fusión basada en la superkina H9. La introducción del cambio I92L en estas moléculas no tuvo un impacto adicional en la capacidad de unión a la subunidad del receptor.
El perfil de cromatografía de exclusión molecular de las vahantes 8iDPQDLIE87 (SEQ ID NO. 114) y 8iVPEDLIE87 (SEQ ID NO. 115> reveló la presencia de un pico mayohtaho correspondiente al homodímero esperado de acuerdo a la capacidad de dimehzación específica del fragmento Fe (92-95%), acompañado de al menos un pico minoritario de agregados de alta talla molecular (Tabla 2). Para las versiones de estas proteínas de fusión que incluyen el cambio I92L (8I DPQDLIE87-I-I92L (SEQ ID NO. 116) y 8IVPEDLIE87+I92L) (SEQ ID NO. 1 17) no fueron evidentes los agregados y prácticamente la totalidad de la proteína (>98%) se encontró en su forma homodimérica. A pesar de estas diferencias y de la influencia positiva de la mutación I92L, todas las proteínas de fusión basadas en las nuevas muteínas presentaron una baja tendencia a la agregación en comparación con su contrapartida basada en la superkina H9, que se encontró mayoritariamente en forma de agregados de alta talla (Tabla 2).
Tabla 2. Estado de agregación de las proteínas de fusión a Fe humano derivadas de las muteínas de primera generación
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La segunda generación de proteínas de fusión (derivadas del tamizaje de la biblioteca S2) tuvo un comportamiento heterogéneo en cuanto a niveles de agregación. Mientras que las dos moléculas que incluyen por diseño el cambio I92F mostraron un patrón complejo de agregación indeseada y una proporción minoritaria del homodímero no agregado (Tabla 3), las proteínas de fusión que contienen las muteínas seleccionadas directamente de la biblioteca y las diseñadas que incluyen un residuo de Leu en la posición 92 tuvieron una tendencia muy baja a la agregación (> 95% de producto purificado homodiméñeo) (Tabla 3). Tabla 3. Estado de agregación de las proteínas de fusión a Fe humano derivadas de las muteínas de segunda generación
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Las dos proteínas de fusión con alta tendencia a la agregación, que ya se habían distinguido del resto por sus niveles menores de secreción (Ejemplo 3) fueron excluidas de los análisis posteriores. El resto de las proteínas de fusión, purificadas a partir del sobrenadante de células HEK-293-T adaptadas a crecer en suspensión y transfectadas con las construcciones genéticas correspondientes y a una concentración de 30ng/mL, se incubaron sobre placas de ELISA recubiertas con el dominio extracelular recombinante de la subunidad beta del receptor, y se detectaron con un anticuerpo anti- Fc humano conjugado a peroxidasa de rábano picante. Como controles se utilizaron proteínas de fusión derivadas de la IL-2 original y de la superkina H9.
Las muteínas de segunda generación analizadas, además de su baja tendencia a la agregación, mostraron una capacidad incrementada de unión a la cadena beta, superior en al menos un 50% en ELISA a la de la proteína basada en la superkina H9 (Figura 12).
Este resultado se corroboró a través de la medición de la afinidad y los parámetros cinéticos de la interacción con la subunidad beta por BIAcore™ (Tabla 4). Las proteínas de fusión derivadas de las muteínas descritas en la presente invención tuvieron una mayor afinidad que las que comprenden a la IL-2 no mutada (reducción de la constante de equilibrio de disociación KD en más de 90 veces con respecto a ella) y a la superkina H9 (reducción de más de 3 veces en la KD). Este incremento se debió a una cinética de asociación (kon) más rápida, unida a una disminución en la constante de velocidad de disociación kOft ).
Tabla 4. Medición por BIAcore™ de las constantes de equilibrio y parámetros cinéticos de la interacción con la cadena beta del receptor de las proteínas de fusión que contienen muteínas derivadas de la IL-2
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Las proteínas purificadas se incubaron a 50°C durante 48 y 72h, antes de evaluarlas por ELISA sobre placas de microtitulación recubiertas con el dominio extracelular recombinante de la subunidad beta del receptor. Las proteínas unidas se detectaron con un anticuerpo anti-Fc humano conjugado a peroxidasa de rábano picante. Se calculó la reactividad relativa de cada proteína tratada tomando como referencia (100%) la reactividad de la misma proteína sin tratar. Se incluyó como control la proteína de fusión basada en la superkina H9.
En la Figura 13 se observa como las muteínas objeto de la presente invención tienen una mayor estabilidad térmica, evidenciada por la conservación de la capacidad de unión de las proteínas de fusión correspondientes a la cadena beta en más de un 82%. Dicho resultado contrasta con la pérdida drástica de reactividad (mayor del 76%) de la proteína de fusión que contiene a la superkina H9 al ser sometida a condiciones similares.
Los resultados anteriores demuestran, en su conjunto, que la incorporación de las mutaciones seleccionadas de nuestras bibliotecas de fagos, le confieren a la IL-2 y las proteínas recombinantes derivadas de ella una capacidad incrementada de unión a la subunidad beta, unida a un perfil favorable de desarrollabilidad en términos de niveles de expresión, baja propensión a la agregación y alta estabilidad térmica. Este último grupo de propiedades representa una ventaja sustancial con respecto a las moléculas similares descritas en el arte previo (Levin, A.M. y otros, Nature. 484: 529-533, 2012).
Ejemplo 6. Demostración de la capacidad superagonista in vitro e in vivo de las nuevas muteínas sobre células que presentan el receptor dimerico beta/gamma de la IL-2
Para estudiar el efecto in vitro de las proteínas de fusión basadas en las muteínas de IL-2 fusionadas a Fe humano, se purificaron células T CD8+ a partir de ratones no inmunizados y se marcaron con CTV. Se estimularon con cada una de las proteínas de fusión en estudio y se evaluó por citometría de flujo la disminución de la fluorescencia en las células, como un indicador de capacidad de las proteínas de inducir la proliferación de esta población celular. Se utilizaron como controles células no estimuladas y células tratadas con las proteínas de fusión que contienen a la IL-2 original y a la superkina H9.
Las proteínas de fusión que contienen a las cuatro nuevas muteínas de la IL-2 estudiadas indujeron la proliferación del 93-96% de las células T CD8+, con un comportamiento similar al de la proteína basada en la superkina H9 (Tabla 5). Por el contrario, la proteína de fusión de la IL-2 al Fe humano tuvo un efecto moderado, solo indujo la proliferación del 55,3% de las células. Estos resultados demostraron la capacidad superagonista in vitro de las nuevas vahantes sobre células que portan el receptor diméheo beta/gamma de la IL-2.
Tabla 5. Expansión in vitro de células T CD8+ inducida por las proteínas de fusión que contienen a las muteínas de IL-2
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Para los experimentos in vivo se utilizaron versiones de las proteínas de fusión que contenían el FcLALA (con las mutaciones L234A y L235A) (SEQ ID NO. 123) para evitar su unión a los receptores Fe gamma y la ocurrencia de efectos inmunológicos mediados por estos más allá de la acción de las muteínas. Estas nuevas proteínas de fusión se designaron como:
8OVPPEDLIA87+I92L/LALA (SEQ ID NO. 119)
8OVPPEDLIE87+I92L/LALA (SEQ ID NO. 120)
8OFDPADVVE87+I92L/LALA (SEQ ID NO. 121 ) 8OFDPEDVVE87+I92L/LALA (SEQ ID NO. 122)
A diferencia del escenario anterior, los experimentos de estimulación in vivo evidenciaron un mayor efecto de las proteínas de fusión basadas en las nuevas muteinas, en comparación con su contrapartida que contiene a la superkina H9. Después de un tratamiento diario durante cuatro días consecutivos de cada grupo de animales con 5,6 pg por vía intraperitoneal de cada una de las proteínas de fusión, al quinto día se sacrificaron los ratones, se extrajeron sus bazos, se maceraron y se analizaron las células por citometría de flujo. Para el análisis estadístico se utilizó un ANOVA de una cola, seguido por una prueba de comparaciones múltiples de Tukey (p<0.05).
La cantidad de linfocitos T CD8+ activados (CD8+CD44h¡CD122h¡) aumentó significativamente en los grupos tratados con las proteínas de fusión que contienen a las nuevas muteínas, en comparación con los animales tratados con la IL-2/Fc7LALA, la H9/FcLALA y el grupo control que solo recibió solución salina tamponada por fosfatos (PBS) (Figura 14).
Por el contrario, la población de células T reguladoras (CD4+CD25+FoxP3+), si bien se expandió en los animales tratados con todas las proteínas de fusión con respecto a los del grupo control, no mostró diferencias entre los animales que recibieron las nuevas proteínas de fusión (Figura 15) y los que fueron inoculados con las proteínas IL-2/Fc y H9/Fc utilizadas como controles. Estos resultados demuestran la ventaja selectiva de las nuevas muteínas con afinidad incrementada por la subunidad beta del receptor para la activación in vivo de las células efectoras del sistema inmune que portan el receptor dimérico beta/gamma, con respecto a la IL-2 y a la superkina H9 descrita en el arte previo. Su mayor potencial efector no va acompañado de un aumento en la función reguladora, por lo que el balance neto debe potenciar las funciones efectoras del sistema inmune.
Estos resultados demuestran la ventaja selectiva de las nuevas muteínas con afinidad incrementada por la subunidad beta del receptor para la activación in vivo de las células efectoras del sistema inmune que portan el receptor dimérico beta/gamma, con respecto a la IL-2 y a la superkina H9 descrita en el arte previo.
Ejemplo 7. Demostración del efecto anti-tumoral de las nuevas muteínas
El efecto anti-tumoral de las proteínas de fusión basadas en las nuevas muteínas fusionadas a Fe humano LALA se estudió en el modelo de metástasis experimentales de melanoma MB16/FO. Se inocularon 100 000 células de esa línea tumoral por la vena de la cola de ratones C57BL/6 y a continuación se trató a cada grupo de animales con una inyección intraperitoneal de 5,6 pg de cada una de las proteínas de fusión que contienen a las muteínas de IL-2. El tratamiento con las proteínas de fusión se repitió cada 24 h hasta el quinto día. Se contaron las metástasis pulmonares a los 21 días después de la inoculación inicial. Para el análisis estadístico se utilizó un ANOVA de una cola, seguido por una prueba de comparaciones múltiples de Tukey (p<0.05). El conteo de metástasis pulmonares evidenció una reducción significativa en los animales tratados con las proteínas de fusión que contienen las nuevas muteínas con respecto a los animales del grupo control tratados con PBS y a los que recibieron las proteínas IL-2/FcLALA o H9/FcLALA (Figura 16).
Se demostró así el efecto anti-tumoral de las nuevas muteínas, en un escenario donde ni la IL-2 original ni la superkina H9 en un formato equivalente de proteínas de fusión tienen efecto anti-metastásico. Estos resultados corroboraron la mayor actividad biológica in vivo de las nuevas muteínas superagonistas en comparación no solo con la IL-2 original, sino con respecto a un superagonista descrito en el arte previo.
Ejemplo 8. Combinación de las mutaciones identificadas en la interfaz con la cadena beta del receptor con sustituciones conocidas por romper la interacción con la cadena alfa
Se diseñó y construyó una proteína de fusión al Fe humano (versión LALA) que contiene una variante de IL-2 con la secuencia 8OVPPEDLIE87+I92L en la interfaz con la cadena beta del receptor y las mutaciones R38A, F42A, Y45A y E62A, conocidas por romper la interacción con la cadena alfa en una variante llamada IL-2 no-alfa y adicionalmente la mutación K35E cuyos efectos sobre el aumento de la secreción de la IL2 se conocen (Rojas, G y otros, Sci. Reports. 9: 800, 2019). El conjunto anterior de mutaciones está descrito en la SEQ ID NO. 4 de la patente EP 3 543 252 B1 . Se produjo esta proteína en el sistema de transfección transitoria de células HEK293-T adaptadas a crecer en suspensión ya descrito.
El efecto anti-tumoral de la proteína de fusión basada en la muteína combinada (SEQ ID NO. 124) se estudió en el modelo de metástasis experimentales de melanoma MB16/F0, en comparación con las proteínas de fusión que solo contenían los cambios en una de las interfaces. Se inocularon 100 000 células tumorales por la vena de la cola de ratones C57BL/6 y a continuación se trató a cada grupo de animales con una inyección intraperitoneal de 1 ,9 pg de cada una de las proteínas de fusión que contienen a las muteínas de IL-2. El tratamiento con las proteínas de fusión se repitió cada 24 h hasta el quinto día. Se contaron las metástasis pulmonares 21 días después de la inoculación inicial. Para el análisis estadístico se utilizó un ANOVA de una cola, seguido por una prueba de comparaciones múltiples de Tukey (p<0.05). La Figura 17 muestra la menor formación de metástasis en los animales tratados con la proteína de fusión basada en la muteína combinada, con respecto a los que recibieron PBS, la proteína de fusión control que contiene a la IL-2 original y las proteínas de fusión que contienen cambios solo en una de las dos interfaces (muteina no-alfa y variante 8OVPPEDLIE87+I92L). Estos resultados demuestran la utilidad de combinar las mutaciones en la interfaz con la cadena beta del receptor de la IL-2, descritas como parte de la presente invención, con otras sustituciones conocidas por sus efectos sobre las propiedades de la IL-2.

Claims

MUTEINAS DERIVADAS DE LA INTERLEUCINA-2 HUMANA CON ACTIVIDAD SUPERAGONISTA REIVINDICACIONES
1. Una muteína derivada de la interleucina-2 (IL-2) humana que comprende: sustituciones de aminoácidos en al menos dos de las posiciones 81 , 83, 84 y 87 de la secuencia primaria de aminoácidos de la IL-2 que resultan en una carga negativa neta del segmento 81 -87 igual o mayor a -2 y opcionalmente contiene el cambio I92L.
2. La muteína según la reivindicación 1 donde las posiciones 81 y 83 se sustituyen por los aminoácidos que se seleccionan del grupo que comprende: Lys, His, Asp, Glu, Ala, Asn, Gly, Gln, lie, Leu, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Val, Trp y Tyr.
3. La muteína según cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2 donde las posiciones 84 y 87 se sustituyen por los aminoácidos que se seleccionan del grupo que comprende: Asp, Glu, Ala, Asn, Gly, Gln, lie, Leu, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Val, Trp y Tyr.
4. La muteína según cualquiera de las reivindicaciones 1 -3 donde la posición 80 se sustituye por los aminoácidos que se seleccionan del grupo que comprende: Phe, Val, Met e lie.
5. La muteína según cualquiera de las reivindicaciones 1 -4 donde la posición 82 se sustituye por Ala.
6. La muteína según cualquiera de las reivindicaciones 1 -5 donde la posición 85 se sustituye por los aminoácidos que se seleccionan del grupo que comprende: lie, Val y Met.
7. La muteína según cualquiera de las reivindicaciones 1 -6 donde la posición 86 se sustituye por Val.
8. La muteína según cualquiera de las reivindicaciones 1 -7 donde la posición 89 se sustituye por los aminoácidos que se seleccionan del grupo que comprende Leu y Met.
9. La muteína según cualquiera de las reivindicaciones 1 -3 donde la posición 93 se sustituye por los aminoácidos que se seleccionan del grupo que comprende: lie y Leu.
10. La muteína según cualquiera de las reivindicaciones 1 -9 donde la posición 35 se sustituye por los aminoácidos que se seleccionan del grupo que comprende: Glu, Asp y Gln.
11. La muteína según cualquiera de las reivindicaciones 1 -10 donde se introducen las mutaciones R38A, F42A, Y45A y E62A.
12. La muteína según cualquiera de las reivindicaciones 1 -11 caracterizada porque está fusionada a alguna de las proteínas que se seleccionan del grupo que comprende:
- proteínas de la cápside de los fagos filamentosos;
- albúmina;
- la región Fe de los anticuerpos;
- anticuerpos completos;
- fragmentos de anticuerpo que incluyan sus dominios variables y
- otras citocinas
13. Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende la muteína de cualquiera de las reivindicaciones 1 -12 en un rango de concentración de 1 mg/ml a 20 mg/ml y un excipiente farmacéuticamente adecuado.
14. Uso de las muteínas de cualquiera de las reivindicaciones 1 -13 con fines terapéuticos en el tratamiento del cáncer y las inmunodeficiencias.
15. Uso de las muteínas de cualquiera de las reivindicaciones 1 -13 en la expansión in vitro de células T y NK para terapias de transferencia adoptiva.
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