WO2023167232A1 - オートタキシン測定試薬のキャリブレーター、オートタキシン測定試薬のキャリブレーション方法、オートタキシン測定キット、オートタキシンの測定方法、診断補助キット、及び診断補助方法 - Google Patents

オートタキシン測定試薬のキャリブレーター、オートタキシン測定試薬のキャリブレーション方法、オートタキシン測定キット、オートタキシンの測定方法、診断補助キット、及び診断補助方法 Download PDF

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    • G—PHYSICS
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    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids

Definitions

  • the present invention provides a composition that can be used as a calibrator (hereinafter sometimes referred to as a “standard substance”) when measuring the activity or mass of ATX contained in human specimens, etc., and a method using the same.
  • aim to Measuring mass may include measuring concentration.
  • An autotaxin measurement kit includes a calibrator for the autotaxin measurement reagent of any one of [1] to [21] and an autotaxin measurement reagent.
  • the disease for which diagnostic aid is to be provided may be heart disease.
  • the disease for which diagnostic aid is to be provided may be a thyroid disease.
  • the hematopoietic tumor may be lymphoma.
  • the measured value may be activity or mass.
  • the heart disease may be any one selected from the group consisting of heart failure, congestive heart failure, and dilated cardiomyopathy.
  • the autotaxin measuring reagent calibrator according to the embodiment contains autotaxin (ATX), at least one of serum and plasma, and further contains a sugar alcohol. Further, the autotaxin measuring reagent calibrator according to the embodiment contains autotaxin and a sugar alcohol, and the sugar alcohol is trehalose, lactose, maltose, or saccharose.
  • the concentration of ATX in the calibrator is, for example, 5 U/L or more and 50 U/L or less, 5 U/L or more and 30 U/L or less, 5 U/L or more and 20 U/L or less, or 5 U/L or more and 16 U/L or less.
  • the ATX measurement reagent is not particularly limited as long as it can measure ATX.
  • the ATX measurement reagent may contain lysophosphatidylcholine.
  • the lysophosphatidylcholine may be myristoyl lysophosphatidylcholine.
  • the obtained ATX active fraction was concentrated with Centramate (PALL Corporation) 10K to 200 mL. 1800 mL of 10 mmol/L Tris-HCl (pH 7.5) was added. Concentration to 200 mL and addition of 1800 mL buffer were repeated twice to obtain approximately 200 mL of human-derived recombinant ATX. Human-derived recombinant ATX was subjected to SDS-PAGE. A photograph of SDS-PAGE is shown in FIG. In addition, human-derived recombinant ATX activity was measured in each purification step. Table 8 shows the measurement results.
  • sample Twenty-seven human serum specimens used as samples in this example were purchased from Busicom Japan.
  • Figure 2 shows a comparison of the ATX activity (U/L) contained in the human specimens of the 27 measured samples and the ATX mass (mg/L) contained in the human specimens.
  • the human-derived recombinant ATX prepared in Example 2 5% sugar alcohol, and human serum were mixed, 1 mL each was dispensed into vacuum vials (Nippon Electronic Glass Co., Ltd.), and the mixture was kept at -50°C. Freeze for 2 hours. Then, it was dried at ⁇ 50° C. for 0.5 hours, ⁇ 15° C. for 46 hours, and 15° C. for 20 hours, and was sealed with a frozen rubber stopper and a screw cap to obtain a freeze-dried composition. As a control, a freeze-dried composition containing human-derived recombinant ATX and human serum but containing no sugar alcohol was prepared (no addition in Table 11).

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Abstract

ヒト検体などに含まれるオートタキシンの活性又は質量を測定する際に、キャリブレーターとして使用できる組成物、及びそれを用いる方法等を提供する。オートタキシンと、血清及び血漿の少なくともいずれかと、を含むキャリブレーターであって、さらに糖アルコールを含む、オートタキシン測定試薬のキャリブレーター。オートタキシン測定試薬を用いて、前記のキャリブレーターに含まれるオートタキシンを測定することを含む、オートタキシン測定試薬のキャリブレーション方法。

Description

オートタキシン測定試薬のキャリブレーター、オートタキシン測定試薬のキャリブレーション方法、オートタキシン測定キット、オートタキシンの測定方法、診断補助キット、及び診断補助方法
　本発明は、オートタキシンの活性又は質量を測定するオートタキシン測定試薬のキャリブレーター、オートタキシン測定試薬のキャリブレーション方法、オートタキシン測定キット、オートタキシンの測定方法、診断補助キット、及び診断補助方法に関する。
  オートタキシン（以下、「ＡＴＸ」と記載する場合がある）は、エクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼ２又はリゾホスホリパーゼＤとも呼ばれる酵素である。ＡＴＸは、リゾホスファチジルコリン（以下、「ＬＰＣ」と記載する場合がある）を生体活性のシグナル伝達分子であるリゾホスファチジン酸（以下、「ＬＰＡ」と記載する場合がある）に変換する作用がある。非特許文献１は、血漿又は血清中のＬＰＡ濃度が、ＡＴＸ活性及び／又は質量と相関することを開示している。
　非特許文献２は、ＬＰＡが、線維化、疼痛、癌、炎症、及び動脈硬化などの生体の異常に関与することを開示している。特許文献１は、ヒト組織あるいは体液中のＡＴＸの活性、質量、及び／又は濃度が、様々な疾病により変動する可能性があり、ＡＴＸの活性、質量、及び／又は濃度を測定することで、これらの疾病の診断やリスクを判断できる可能性を開示している。
　ＡＴＸを測定する方法として、ＡＴＸの質量を免疫学的に測定する方法、及びＡＴＸが有するリゾホスホリパーゼＤ活性を測定する方法がある。特許文献２はリゾホスホリパーゼＤ活性を測定する方法などを開示している。特許文献１は、ヒト検体中に含まれるヒト由来ＡＴＸの質量を免疫学的に測定する方法、及びＡＴＸのもつリゾホスホリパーゼＤ活性を測定する方法などを開示している。特許文献３から６は、ＡＴＸのアイソフォームの質量を免疫学的に測定する方法を開示している。
　特許文献７、非特許文献１、及び非特許文献３は、ＡＴＸを製造する方法を開示している。特許文献３から６は、ＡＴＸのアイソフォームの製造方法を開示している。特許文献７、非特許文献１、非特許文献４、及び非特許文献５は、ヒト由来組換えＡＴＸの製造方法を開示している。
国際公開第２０１１／０８１２１４号 特開２００４－１５９５３１号公報 特開２０１３－１４５５８号公報 特開２０１４－１２５４８１号公報 特開２０１５－７２１９５号公報 特開２０１５－７２１９６号公報 特開２０１１－３７８０２号公報
Ｃ１ｉｎ　Ｃｈｉｍ　Ａｃｔａ、３８８巻、５１－５８頁、２００８年 Ｎａｔｕｒｅ、４１１巻、４９４－４９８頁、２００１年 Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ、２５６巻、２５２４－２５２９頁、１９９２年 Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｘｐｒ　Ｐｕｒｉｆ、５９巻、９－１７頁、２００８年 Ａｃｔａ　Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ　Ｓｅｃｔ、Ｆ６７巻、４５０－４５３頁、２０１１年
　本発明は、ヒト検体などに含まれるＡＴＸの活性又は質量を測定する際に、キャリブレーター（以下、「標準物質」と記載する場合がある）として使用できる組成物、及びそれを用いる方法等を提供することを目的する。質量を測定することは、濃度を測定することを含む場合がある。
　［１］　本発明の態様に係るオートタキシン測定試薬のキャリブレーターは、オートタキシンと、血清及び血漿の少なくともいずれかと、を含み、さらに糖アルコールを含む。
　［２］　［１］のオートタキシン測定試薬のキャリブレーターにおいて、血清又は血漿が、ヒト由来であってもよい。
　［３］　［１］又は［２］のオートタキシン測定試薬のキャリブレーターにおいて、血清又は血漿が、健常人由来であってもよい。
　［４］　［１］から［３］のいずれかのオートタキシン測定試薬のキャリブレーターにおいて、糖アルコールがサッカロース、トレハロース、マンニトール、又はソルビトールであってもよい。
　［５］　［１］から［４］のいずれかのオートタキシン測定試薬のキャリブレーターが、０．５質量％以上２０質量％以下の濃度で糖アルコールを含んでいてもよく、好ましくは０．５質量％以上１０質量％以下の濃度で糖アルコールを含んでいてもよい。
　［６］　［１］から［５］のいずれかのオートタキシン測定試薬のキャリブレーターにおいて、オートタキシンが、ヒト由来オートタキシンであってもよい。
　［７］　［１］から［６］のいずれかのオートタキシン測定試薬のキャリブレーターにおいて、オートタキシンのアミノ酸配列が、配列番号１に記載の遺伝子配列に対応していてもよい。
　［８］　［１］から［６］のいずれかのオートタキシン測定試薬のキャリブレーターにおいて、オートタキシンのアミノ酸配列が、配列番号１に記載の遺伝子配列と９０％以上の同一性を有する遺伝子配列に対応し、オートタキシンが、リゾホスファチジルコリンを加水分解する活性を有していてもよい。
　［９］　［１］から［６］のいずれかのオートタキシン測定試薬のキャリブレーターにおいて、オートタキシンのアミノ酸配列が、配列番号１に記載の遺伝子配列において、１又は数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された遺伝子配列に対応し、オートタキシンが、リゾホスファチジルコリンを加水分解する活性を有していてもよい。
　［１０］　［１］から［９］のいずれかのオートタキシン測定試薬のキャリブレーターが、５Ｕ／Ｌ以上５０Ｕ／Ｌ以下の濃度でオートタキシンを含んでいてもよく、好ましくは５Ｕ／Ｌ以上３０Ｕ／Ｌ以下の濃度でオートタキシンを含んでいてもよく、さらに好ましくは５Ｕ／Ｌ以上２０Ｕ／Ｌ以下の濃度でオートタキシンを含んでいてもよく、特に好ましくは５Ｕ／Ｌ以上１６Ｕ／Ｌ以下の濃度でオートタキシンを含んでいてもよい。
　［１１］　［１］から［１０］のいずれかのオートタキシン測定試薬のキャリブレーターが、０．０５ｍｇ／Ｌ以上１０ｍｇ／Ｌ以下の濃度でオートタキシンを含んでいてもよく、好ましくは０．０５ｍｇ／Ｌ以上５ｍｇ／Ｌ以下の濃度でオートタキシンを含んでいてもよく、さらに好ましくは０．０５ｍｇ／Ｌ以上３ｍｇ／Ｌ以下の濃度でオートタキシンを含んでいてもよく、特に好ましくは０．０５ｍｇ／Ｌ以上１ｍｇ／Ｌ以下の濃度でオートタキシンを含んでいてもよい。
　［１２］　［１］から［１１］のいずれかのオートタキシン測定試薬のキャリブレーターが、凍結乾燥試薬であってもよい。
　［１３］　本発明の態様に係るオートタキシン測定試薬のキャリブレーターは、オートタキシンと、糖アルコールと、を含み、糖アルコールが、トレハロース、ラクトース、マルトース、又はサッカロースである。当該［１３］のオートタキシン測定試薬のキャリブレーターは、血清及び血漿を含まない。
　［１４］　［１３］のオートタキシン測定試薬のキャリブレーターが、０．５質量％以上２０質量％以下の濃度で糖アルコールを含んでいてもよく、好ましくは０．５質量％以上１０質量％以下の濃度で糖アルコールを含んでいてもよい。
　［１５］　［１３］又は［１４］のオートタキシン測定試薬のキャリブレーターにおいて、オートタキシンが、ヒト由来オートタキシンであってもよい。
　［１６］　［１３］から［１５］のいずれかのオートタキシン測定試薬のキャリブレーターにおいて、オートタキシンのアミノ酸配列が、配列番号１に記載の遺伝子配列に対応していてもよい。
　［１７］　［１３］から［１５］のいずれかのオートタキシン測定試薬のキャリブレーターにおいて、オートタキシンのアミノ酸配列が、配列番号１に記載の遺伝子配列と９０％以上の同一性を有する遺伝子配列に対応し、オートタキシンが、リゾホスファチジルコリンを加水分解する活性を有していてもよい。
　［１８］　［１３］から［１５］のいずれかのオートタキシン測定試薬のキャリブレーターにおいて、オートタキシンのアミノ酸配列が、配列番号１に記載の遺伝子配列において、１又は数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された遺伝子配列に対応し、オートタキシンが、リゾホスファチジルコリンを加水分解する活性を有していてもよい。
　［１９］　［１３］から［１８］のいずれかのオートタキシン測定試薬のキャリブレーターが、５Ｕ／Ｌ以上５０Ｕ／Ｌ以下の濃度でオートタキシンを含んでいてもよく、好ましくは５Ｕ／Ｌ以上３０Ｕ／Ｌ以下の濃度でオートタキシンを含んでいてもよく、さらに好ましくは５Ｕ／Ｌ以上２０Ｕ／Ｌ以下の濃度でオートタキシンを含んでいてもよく、特に好ましくは５Ｕ／Ｌ以上１６Ｕ／Ｌ以下の濃度でオートタキシンを含んでいてもよい。
　［２０］　［１３］から［１９］のいずれかのオートタキシン測定試薬のキャリブレーターが、０．０５ｍｇ／Ｌ以上１０ｍｇ／Ｌ以下の濃度でオートタキシンを含んでいてもよく、好ましくは０．０５ｍｇ／Ｌ以上５ｍｇ／Ｌ以下の濃度でオートタキシンを含んでいてもよく、さらに好ましくは０．０５ｍｇ／Ｌ以上３ｍｇ／Ｌ以下の濃度でオートタキシンを含んでいてもよく、特に好ましくは０．０５ｍｇ／Ｌ以上１ｍｇ／Ｌ以下の濃度でオートタキシンを含んでいてもよい。
　［２１］　［１３］から［２０］のいずれかのオートタキシン測定試薬のキャリブレーターが、凍結乾燥試薬であってもよい。
　［２２］　本発明の態様に係るオートタキシン測定試薬のキャリブレーション方法は、オートタキシン測定試薬を用いて、［１］から［２１］のいずれかのオートタキシン測定試薬のキャリブレーターに含まれるオートタキシンを測定することを含む。
　［２３］　［２２］のオートタキシン測定試薬のキャリブレーション方法において、測定することにおいて、キャリブレーターに含まれるオートタキシンの活性又は質量を測定してもよい。
　［２４］　［２２］又は［２３］のオートタキシン測定試薬のキャリブレーション方法において、オートタキシンの活性と質量との関係を表す１次関数を用いて、キャリブレーターに含まれるオートタキシンの活性の測定値から、キャリブレーターに含まれるオートタキシンの質量を算出してもよい。
　［２５］　［２２］から［２４］のいずれかのオートタキシン測定試薬のキャリブレーション方法において、オートタキシン測定試薬が、リゾホスファチジルコリンを含んでいてもよい。リゾホスファチジルコリンが、ミリストイルリゾホスファチジルコリンであってもよい。
　［２６］　本発明の態様に係るオートタキシン測定キットは、［１］から［２１］のいずれかのオートタキシン測定試薬のキャリブレーターと、オートタキシン測定試薬と、を含む。
　［２７］　［２６］のオートタキシン測定キットにおいて、オートタキシン測定試薬が、リゾホスファチジルコリンを含んでいてもよい。リゾホスファチジルコリンが、ミリストイルリゾホスファチジルコリンであってもよい。
　［２８］　本発明の態様に係るオートタキシンの測定方法は、（ａ）オートタキシン測定試薬を用いて、［１］から［２１］のいずれかのオートタキシン測定試薬のキャリブレーターに含まれるオートタキシンを測定することと、（ｂ）オートタキシン測定試薬を用いて、検体に含まれるオートタキシンを測定することと、（ｃ）キャリブレーターに含まれるオートタキシンの測定値を用いて、検体に含まれるオートタキシンの測定値を補正することと、を含む。
　［２９］　［２８］のオートタキシンの測定方法において、測定値が、活性又は質量であってもよい。
　［３０］　［２８］又は［２９］のオートタキシンの測定方法において、オートタキシンの活性と質量との関係を表す１次関数を用いて、検体に含まれるオートタキシンの活性の補正された測定値から、検体に含まれるオートタキシンの質量を算出してもよい。
　［３１］　［２８］から［３０］のいずれかのオートタキシンの測定方法において、オートタキシン測定試薬が、リゾホスファチジルコリンを含んでいてもよい。リゾホスファチジルコリンが、ミリストイルリゾホスファチジルコリンであってもよい。
　［３２］　本発明の態様に係る診断補助キットは、［１］から［２１］のいずれかのオートタキシン測定試薬のキャリブレーターと、オートタキシン測定試薬と、を含む。
　［３３］　［３２］の診断補助キットにおいて、オートタキシン測定試薬が、リゾホスファチジルコリンを含んでいてもよい。リゾホスファチジルコリンが、ミリストイルリゾホスファチジルコリンであってもよい。
　［３４］　［３２］又は［３３］の診断補助キットにおいて、診断補助対象の疾患が、肝線維化、慢性肝疾患、悪性リンパ腫、及び膵疾患からなる群から選択されるいずれかであってもよい。
　［３５］　［３２］から［３４］のいずれかの診断補助キットにおいて、診断補助対象の疾患が、心臓病であってもよい。
　［３６］　［３５］の診断補助キットにおいて、心臓病が、心不全、うっ血性心不全、及び拡張型心筋症からなる群から選択されるいずれかであってもよい。
　［３７］　［３２］から［３４］のいずれかの診断補助キットにおいて、診断補助対象の疾患が、甲状腺疾患であってもよい。
　［３８］　［３７］の診断補助キットにおいて、甲状腺疾患が、甲状腺機能亢進症又はバセドウ病であってもよい。
　［３９］　［３２］から［３４］のいずれかの診断補助キットにおいて、診断補助対象の疾患が、神経障害であってもよい。
　［４０］　［３９］の診断補助キットにおいて、神経障害が、帯状疱疹後神経痛、腰部癒着性くも膜炎、胸部脊髄炎、腰椎神経根障害、頸椎症性脊髄症、化学療法誘発性末梢神経障害、栄養代謝性多発神経障害、及び頚髄軟化症からなる群から選択されるいずれかであってもよい。
　［４１］　［３２］から［３４］のいずれかの診断補助キットにおいて、診断補助対象の疾患が、中枢神経への癌細胞の浸潤であってもよい。
　［４２］　［４１］の診断補助キットにおいて、癌細胞が、造血器腫瘍由来であってもよい。
　［４３］　［４２］の診断補助キットにおいて、造血器腫瘍が、リンパ腫であってもよい。
　［４４］　［３２］から［３４］のいずれかの診断補助キットにおいて、診断補助対象が、妊娠又は妊娠高血圧症候群であってもよい。
　［４５］　本発明の態様に係る診断補助方法は、（ａ）オートタキシン測定試薬を用いて、［１］から［２１］のいずれかのオートタキシン測定試薬のキャリブレーターに含まれるオートタキシンを測定することと、（ｂ）オートタキシン測定試薬を用いて、検体に含まれるオートタキシンを測定することと、（ｃ）キャリブレーターに含まれるオートタキシンの測定値を用いて、検体に含まれるオートタキシンの測定値を補正することと、（ｄ）検体に含まれるオートタキシンの補正された測定値に基づき、疾患を特定することと、を含む。
　［４６］　［４５］の診断補助方法において、測定値が、活性又は質量であってもよい。
　［４７］　［４５］又は［４６］の診断補助方法において、オートタキシンの活性と質量との関係を表す１次関数を用いて、検体に含まれるオートタキシンの活性の補正された測定値から、検体に含まれるオートタキシンの質量を算出してもよい。
　［４８］　［４５］から［４７］のいずれかの診断補助方法において、オートタキシン測定試薬が、リゾホスファチジルコリンを含んでいてもよい。リゾホスファチジルコリンが、ミリストイルリゾホスファチジルコリンであってもよい。
　［４９］　［４５］から［４８］のいずれかの診断補助方法において、診断補助対象の疾患が、肝線維化、慢性肝疾患、悪性リンパ腫、及び膵疾患からなる群から選択されるいずれかであってもよい。
　［５０］　［４５］から［４９］のいずれかの診断補助方法において、診断補助対象の疾患が、心臓病であってもよい。
　［５１］　［５０］の診断補助方法において、心臓病が、心不全、うっ血性心不全、及び拡張型心筋症からなる群から選択されるいずれかであってもよい。
　［５２］　［４５］から［４９］のいずれかの診断補助方法において、診断補助対象の疾患が、甲状腺疾患であってもよい。
　［５３］　［５２］の診断補助方法において、甲状腺疾患が、甲状腺機能亢進症又はバセドウ病であってもよい。
　［５４］　［４５］から［４９］のいずれかの診断補助方法において、診断補助対象の疾患が、神経障害であってもよい。
　［５５］　［５４］の診断補助方法において、神経障害が、帯状疱疹後神経痛、腰部癒着性くも膜炎、胸部脊髄炎、腰椎神経根障害、頸椎症性脊髄症、化学療法誘発性末梢神経障害、栄養代謝性多発神経障害、及び頚髄軟化症からなる群から選択されるいずれかであってもよい。
　［５６］　［４５］から［４９］のいずれかの診断補助方法において、診断補助対象の疾患が、中枢神経への癌細胞の浸潤であってもよい。
　［５７］　［５６］の診断補助方法において、癌細胞が造血器腫瘍由来であってもよい。
　［５８］　［５７］の診断補助方法において、造血器腫瘍が、リンパ腫であってもよい。
　［５９］　［４５］から［４９］のいずれかの診断補助方法において、診断補助対象が、妊娠又は妊娠高血圧症候群であってもよい。
　本発明によれば、ヒト検体などに含まれるＡＴＸの活性又は質量を測定する際に、キャリブレーターとして使用できる組成物、及びそれを用いる方法等を提供可能である。
精製したヒト由来組換えＡＴＸをＳＤＳ－ＰＡＧＥに供した結果を示す写真である。 ヒト検体に含まれるＡＴＸの活性を、実施例２に係る組成物をキャリブレーターとして使用して測定し、濃度と比較した結果を表すグラフである。
　以下、本発明を実施するための形態（以下、「実施形態」ということがある）について説明する。本発明は、以下の実施形態に限定されるものではなく、その要旨の範囲内で種々変形して実施できる。また、以下に示す実施形態は、この発明の技術的思想を具体化するための方法等を例示するものであって、これらの例示に限定されるものではない。
　実施形態に係るオートタキシン測定試薬のキャリブレーターは、オートタキシン（ＡＴＸ）と、血清及び血漿の少なくともいずれかと、を含み、さらに糖アルコールを含む。また、実施形態に係るオートタキシン測定試薬のキャリブレーターは、オートタキシンと、糖アルコールと、を含み、糖アルコールが、トレハロース、ラクトース、マルトース、又はサッカロースである。
　実施形態に係るキャリブレーターは、例えば、以下の用途で用いられ得る。
　（ｉ）ヒト検体などのＡＴＸの測定値を算出する；キャリブレーターに含まれるＡＴＸと、ヒト検体などに含まれるＡＴＸと、の活性又は質量を同時に測定し、それぞれの測定値の比例関係から、ヒト検体などに含まれるＡＴＸの活性又は質量を算出する。
　(ｉｉ)ＡＴＸの活性又は質量を測定するための試薬の精度を管理する；既知の活性、質量、及び／又は濃度のＡＴＸが含まれるキャリブレーターを試薬で測定して得られる吸光度、及び反応速度などの変化量は、試薬組成や測定条件をもとに理論的に演算できる。キャリブレーターを測定したときの変化量が、理論的変化量±許容誤差の範囲内に入っていることを確認する事で、試薬が一定の基準内の精度を保っていることを確認する。
　実施形態に係るキャリブレーターに含まれるＡＴＸは、検体がヒト由来である場合、例えば、ヒト由来である。ＡＴＸの活性及び／又は質量を測定する試薬の組成や測定条件が変化した場合、ＡＴＸを測定して得られる吸光度変化、反応速度などの変化量は、ヒト由来のＡＴＸは、ヒト由来以外のＡＴＸと比較して、より同じ挙動で変化する傾向にある。
　ＡＴＸは、配列番号１に記載のヒト由来ＡＴＸ遺伝子から生成してもよい。したがって、ＡＴＸのアミノ酸配列が、配列番号１に記載の遺伝子配列に対応していてもよい。
　あるいは、ＡＴＸがリゾホスファチジルコリンを加水分解する活性を有する範囲内で、ＡＴＸのアミノ酸配列が、配列番号１に記載の遺伝子配列と９０％以上の同一性を有する遺伝子配列に対応していてもよい。
　あるいは、ＡＴＸがリゾホスファチジルコリンを加水分解する活性を有する範囲内で、ＡＴＸのアミノ酸配列が、配列番号１に記載の遺伝子配列において、１又は数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された遺伝子配列に対応していてもよい。
　キャリブレーターにおけるＡＴＸの濃度は、適正な既知量であることが好ましい。ＡＴＸ活性及び／又は質量を測定することで疾病の診断やリスクを判断する場合、キャリブレーターにおけるＡＴＸの濃度は、臨床上の精度が求められている範囲の濃度であることが好ましい。キャリブレーターを分析機器の精度を管理する目的で使用する場合、キャリブレーターにおけるＡＴＸの濃度は、測定可能範囲の上限又は下限に近い濃度であることが好ましい。
　キャリブレーターにおけるＡＴＸの濃度は、例えば、５Ｕ／Ｌ以上５０Ｕ／Ｌ以下、５Ｕ／Ｌ以上３０Ｕ／Ｌ以下、５Ｕ／Ｌ以上２０Ｕ／Ｌ以下、あるいは５Ｕ／Ｌ以上１６Ｕ／Ｌ以下である。
　あるいは、キャリブレーターにおけるＡＴＸの濃度は、例えば、０．０５ｍｇ／Ｌ以上１０ｍｇ／Ｌ以下、０．０５ｍｇ／Ｌ以上５ｍｇ／Ｌ以下、０．０５ｍｇ／Ｌ以上３ｍｇ／Ｌ以下、あるいは０．０５ｍｇ／Ｌ以上１ｍｇ／Ｌ以下である。
　キャリブレーターに含まれる血清又は血漿は、例えば、ヒト由来である。血清又は血漿が、健常人由来であってもよい。
　キャリブレーターにおける血清の濃度は、例えば、３０．０％（ｗ／ｖ）以上９９．５％以下、５０％以上９９．５％以下、あるいは８０％以上９９．５％以下である。また、キャリブレーターにおける血漿の濃度は、例えば、３０．０％（ｗ／ｖ）以上９９．５％以下、５０％以上９９．５％以下、あるいは８０％以上９９．５％以下である。
　キャリブレーターに含まれる糖アルコールの例としては、サッカロース、トレハロース、マンニトール、及びソルビトールが挙げられるが、特に限定されない。
　キャリブレーターにおける糖アルコールの濃度は、例えば、０．５質量％以上２０質量％以下、あるいは０．５質量％以上１０質量％以下である。
　実施形態に係るオートタキシン測定試薬のキャリブレーターは、凍結乾燥試薬であってもよい。
　検体の測定値や分析機器の精度管理が適正であるためには、キャリブレーターに含まれるＡＴＸの活性又は質量が、初期値から変化していないこと、すなわち、数ヶ月あるいは年単位で様々な条件で保存されたキャリブレーターに含まれるＡＴＸの活性又は質量が、長期間同一とみなせることが望まれる。これに対し、実施形態に係るオートタキシン測定試薬のキャリブレーターは、安定化剤として、血清及び血漿の少なくともいずれかと、糖アルコールと、を含むことにより、様々な保存条件下で、ＡＴＸの活性及び質量を、長期間維持することが可能である。
　実施形態に係るＡＴＸ測定試薬のキャリブレーション方法は、ＡＴＸ測定試薬を用いて、上述した実施形態に係るＡＴＸ測定試薬のキャリブレーターに含まれるＡＴＸを測定することを含む。上述したように、実施形態に係るキャリブレーターにおいては、ＡＴＸの活性及び質量が、長期保存を経ても変化しにくい。したがって、実施形態に係るキャリブレーターにおけるＡＴＸの活性及び質量は、既知の初期値を維持しているとみなせる。よって、当該初期値と、ＡＴＸ測定試薬で測定されたＡＴＸの活性及び／又は質量の測定値と、に基づいて、ＡＴＸ測定試薬の測定能をキャリブレーションすることが可能である。
　実施形態に係るＡＴＸ測定試薬のキャリブレーション方法において、ＡＴＸの活性と質量との関係を表す、予め取得された１次関数を用いて、キャリブレーターに含まれるＡＴＸの活性の測定値から、キャリブレーターに含まれるＡＴＸの質量を算出してもよい。
　上述したように、ＡＴＸを測定する様々な方法がある。したがって、実施形態に係るＡＴＸ測定試薬のキャリブレーション方法において、ＡＴＸ測定試薬は、ＡＴＸを測定できれば、特に限定されない。ＡＴＸ測定試薬は、リゾホスファチジルコリンを含んでいてもよい。リゾホスファチジルコリンは、ミリストイルリゾホスファチジルコリンであってもよい。
　実施形態に係るＡＴＸ測定キットは、上述したＡＴＸ測定試薬のキャリブレーターと、ＡＴＸ測定試薬と、を含む。ＡＴＸ測定試薬で検体のＡＴＸを測定する前に、上述したように、ＡＴＸ測定試薬でキャリブレーターに含まれるＡＴＸを測定することにより、ＡＴＸ測定試薬の測定能をキャリブレーションすることが可能である。
　実施形態に係るＡＴＸの測定方法は、（ａ）ＡＴＸ測定試薬を用いて、上述したＡＴＸ測定試薬のキャリブレーターに含まれるＡＴＸを測定することと、（ｂ）ＡＴＸ測定試薬を用いて、検体に含まれるＡＴＸを測定することと、（ｃ）キャリブレーターに含まれるＡＴＸの測定値を用いて、検体に含まれるＡＴＸの測定値を補正することと、を含む。
　測定値は、活性であってもよいし、質量であってもよい。例えば、キャリブレーターに含まれるＡＴＸの既知の活性、質量、又は濃度と、キャリブレーターに含まれるＡＴＸの測定値と、の関係を用いて、検体に含まれるＡＴＸの測定値を補正してもよい。例えば、キャリブレーターに含まれるＡＴＸの既知の活性、質量、又は濃度と、キャリブレーターに含まれるＡＴＸの測定値と、の比を用いて、検体に含まれるＡＴＸの測定値を補正してもよい。測定値が活性である場合、ＡＴＸの活性と質量との関係を表す、予め取得された１次関数を用いて、検体に含まれるＡＴＸの活性の補正された測定値から、検体に含まれるＡＴＸの質量を算出してもよい。
　実施形態に係る診断補助キットは、上述したＡＴＸ測定試薬のキャリブレーターと、ＡＴＸ測定試薬と、を含む。上述したように、ＡＴＸ測定試薬で検体のＡＴＸを測定する前に、ＡＴＸ測定試薬でキャリブレーターに含まれるＡＴＸを測定することにより、ＡＴＸ測定試薬の測定能をキャリブレーションすることが可能である。そのため、検体に含まれるＡＴＸの活性及び／又は質量を、正確に評価することが可能である。よって、検体に含まれるＡＴＸの活性及び／又は質量から、検体の提供者の疾患を正確に診断補助することが可能である。
　実施形態に係る診断補助キットの診断補助対象の疾患の例としては、肝線維化、慢性肝疾患、悪性リンパ腫、膵疾患、心臓病、甲状腺疾患、及び神経障害が挙げられるが、特に限定されない。心臓病の例としては、心不全、うっ血性心不全、及び拡張型心筋症が挙げられるが、特に限定されない。甲状腺疾患の例としては、甲状腺機能亢進症、及びバセドウ病が挙げられるが、特に限定されない。神経障害の例としては、帯状疱疹後神経痛、腰部癒着性くも膜炎、胸部脊髄炎、腰椎神経根障害、頸椎症性脊髄症、化学療法誘発性末梢神経障害、栄養代謝性多発神経障害、及び頚髄軟化症が挙げられるが、特に限定されない。
　実施形態に係る診断補助キットの診断補助対象の疾患の例としては、中枢神経への癌細胞の浸潤が挙げられるが、特に限定されない。癌細胞は、造血器腫瘍由来であってもよいが、特に限定されない。造血器腫瘍は、リンパ腫であってもよいが、特に限定されない。
　実施形態に係る診断補助キットの診断補助対象は、妊娠又は妊娠高血圧症候群であってもよいが、特に限定されない。
　実施形態に係る診断補助方法は、（ａ）ＡＴＸ測定試薬を用いて、上述したＡＴＸ測定試薬のキャリブレーターに含まれるＡＴＸを測定することと、（ｂ）ＡＴＸ測定試薬を用いて、検体に含まれるＡＴＸを測定することと、（ｃ）キャリブレーターに含まれるＡＴＸの測定値を用いて、検体に含まれるＡＴＸの測定値を補正することと、（ｄ）検体に含まれるＡＴＸの補正された測定値に基づき、疾患を特定することと、を含む。
　測定値は、活性であってもよいし、質量であってもよい。測定値が活性である場合、ＡＴＸの活性と質量との関係を表す、予め取得された１次関数を用いて、検体に含まれるＡＴＸの活性の補正された測定値から、検体に含まれるＡＴＸの質量を算出してもよい。
　ＡＴＸの活性は、例えば、ＬＰＣ（ｌｙｓｏｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）から遊離するコリンを測定することにより、測定することができる。反応は、１００μＬの反応系で行うことができる。例えば、１００ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ　９．０）、５００ｍｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ、５ｍｍｏｌ／ＬのＭｇＣｌ２、５ｍｍｏｌ／ＬのＣａＣｌ２、及び０．０５％のＴｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００存在下、２０μＬのＡＴＸを含むサンプルを２ｍｍｏｌ／Ｌの１－ｍｙｒｉｓｔｏｙｌ（１４：０）－ＬＰＣと３７℃で３時間反応させる。遊離したコリンを、コリンオキシダーゼ、西洋わさびペルオキシダーゼ、及びＴＯＯＳ試薬を用いて、吸光分光測定装置により検出することで、サンプル中のＡＴＸの活性を測定することが可能である。以下の実施例においても、当該方法を用いてＡＴＸの活性を測定した。
　ＡＴＸの濃度は、例えば、免疫学的検定により測定することができる。例えば、第１のセル及び第２のセルを用意する。第１のセルに、磁性微粒子に固定された抗ＡＴＸラットモノクローナル抗体を含む凍結乾燥組成物を入れる。第２のセルに、アルカリ性ホスファターゼで標識された抗ＡＴＸラットモノクローナル抗体の凍結乾燥組成物を入れる。第１のセルに、水とＡＴＸを含むサンプルを入れて、凍結乾燥組成物を溶解する。また、第２のセルに、水を入れて、凍結乾燥組成物を溶解する。第１のセルにおいて凍結乾燥組成物が溶解すると、磁性微粒子に固定された抗ＡＴＸラットモノクローナル抗体と、ＡＴＸと、の第１反応が開始する。一定時間、一定温度で反応させたのち、洗浄水で洗浄することにより、未反応のＡＴＸを除去する。次に、第２のセルの内容物を第２のセルに移すことにより、アルカリ性ホスファターゼで標識された抗ＡＴＸラットモノクローナル抗体と、ＡＴＸと、の第２反応が開始する。一定時間、一定温度で反応させたのち、洗浄水で洗浄することにより、未反応のアルカリ性ホスファターゼで標識された抗ＡＴＸラットモノクローナル抗体を除去する。その後、ＡＴＸの基質として3-(5-tert-Butyl-4,4-dimethyl-2,6,7-trioxabicyclo[3.2.0]hept-1-yl) phenylphosphate disodium saltを第２のセルに添加し、ＡＴＸにより基質が分解することにより生じる発光の強度を測定することにより、サンプル中のＡＴＸの濃度を測定することが可能である。以下の実施例においても、当該方法を用いてＡＴＸの濃度を測定した。
　以下、本発明を実施例及び参考例（以下、「実施例等」と呼ぶことがある。）により更に具体的に説明するが、本発明の範囲は以下の実施例等に限定されるものではない。例えば、本実施例等における「キャリブレーター」、「糖アルコール」、及び「キット」とは、本発明の一具体例にすぎず、本発明の範囲を何ら限定するものではない。また、遺伝子操作技術は、例えばマニアティスらの方法（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，ｅｔ　ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　１９８２年、１９８９年）、基礎から学ぶ遺伝子工学（第２版、田村隆明、２０１７年、羊土社）、遺伝子工学（野島博、２０１３年、東京化学同人）、蛋白質・酵素の基礎実験法（改訂第２版、堀尾武一、１９９４年南光堂）、国際公開第２０１３／０６５７７２号、及び市販の各種酵素、キット類に添付された手順書等に従えば実施できるものである。
　文中の略語は下記の意味を示す。
　ＡＴＸ：オートタキシン（Ａｕｔｏｔａｘｉｎ）
　ＳＤＳ：ドデシル硫酸ナトリウム（Ｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ）
　ＰＡＧＥ：ポリアクリルアミドゲル電気泳動（Ｐｏｌｙ　Ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ　Ｇｅｌ　Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）
　（参考例１：ヒト由来ＡＴＸを４℃から１０℃で保存した場合のＡＴＸの活性の変化）
　１０　ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）に溶解した５Ｕ／ｍＬから６Ｕ／ｍＬのヒト由来ＡＴＸを約４℃から１０℃で２日間冷蔵保存し、当該ヒト由来ＡＴＸの活性の変化を測定した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
  
　表１に示すように、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌに溶解した約５Ｕ／ｍＬから６Ｕ／ｍＬのヒト由来ＡＴＸを約４℃から１０℃で７日間冷蔵保存したところ、ヒト由来ＡＴＸの活性が約１０％低下した。
　（参考例２：安定化剤として血清を用いてヒト由来ＡＴＸを約１０℃で保存した場合の活性の変化）
　３Ｕ／Ｌから５Ｕ／Ｌのヒト由来ＡＴＸを、安定化剤として市販の第１の血清製品及び第２の血清製品を用いて約１０℃で２ヶ月間冷蔵保存し、当該ヒト由来ＡＴＸの活性の変化を測定した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
  
　表２に示すように、３Ｕ／Ｌから５Ｕ／Ｌのヒト由来ＡＴＸを、安定化剤として市販の第１の血清製品及び第２の血清製品を用いて約１０℃で２ヶ月間冷蔵保存したところ、ヒト由来ＡＴＸの活性が約１０％低下した。したがって、安定化剤として血清のみを用いると、長期冷蔵保存により、ＡＴＸの活性が低下することが示された。
　（参考例３：ヒト由来ＡＴＸを約－２０℃及び約－４０℃で凍結保存した場合の活性の変化）
　５Ｕ／ｍＬから６Ｕ／ｍＬのヒト由来ＡＴＸを約－２０℃及び約－４０℃で７日間凍結保存し、当該ヒト由来ＡＴＸの活性の変化を測定した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
  
　表３に示すように、５Ｕ／ｍＬから６Ｕ／ｍＬのヒト由来ＡＴＸを約－２０℃及び約－４０℃で７日間凍結保存したところ、ヒト由来ＡＴＸの活性が約１０％低下した。
　（参考例４：安定化剤としてヒトγグロブリンを用いてヒト由来ＡＴＸを約－１０℃で保存した場合の活性の変化）
　安定化剤としてヒトγグロブリンを用いて、３Ｕ／Ｌから４Ｕ／Ｌのヒト由来ＡＴＸを約－１０℃で１週間凍結保存し、当該ヒト由来ＡＴＸの活性の変化を測定した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
  
　表４に示すように、安定化剤としてヒトγグロブリンを用いて、３Ｕ／Ｌから４Ｕ／Ｌのヒト由来ＡＴＸを約－１０℃で１週間凍結保存したところ、ヒト由来ＡＴＸの活性が約２５％低下した。したがって、安定化剤としてヒトγグロブリンのみを用いると、長期凍結保存により、ＡＴＸの活性が低下することが示された。
　（参考例５：安定化剤として血清を用いてヒト由来ＡＴＸを約－１５℃で保存した場合の活性の変化）
　安定化剤として市販の第１の血清製品及び第２の血清製品を用いて、３Ｕ／Ｌから５Ｕ／Ｌのヒト由来ＡＴＸを約－１５℃で８週間凍結保存し、当該ヒト由来ＡＴＸの活性の変化を測定した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
  
　表５に示すように、安定化剤として市販の第１の血清製品及び第２の血清製品を用いて３Ｕ／Ｌから５Ｕ／Ｌのヒト由来ＡＴＸを約－１５℃で７週間凍結保存したところ、ヒト由来ＡＴＸの活性が約４０％から５０％低下した。したがって、安定化剤として血清のみを用いると、長期凍結保存により、ＡＴＸの活性が低下することが示された。
　（参考例６：安定化剤として糖アルコールを用いてヒト由来ＡＴＸを凍結乾燥し約４℃から１０℃で保存した場合の活性の変化）
　安定化剤として糖アルコールを用いてヒト由来ＡＴＸを凍結乾燥し、約４℃から１０℃で当該ヒト由来ＡＴＸを１９７日間保存し、当該ヒト由来ＡＴＸの活性の変化を測定した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
  
　表６に示すように、保存期間０日で凍結乾燥組成物を復水した後のヒト由来ＡＴＸの活性は、約４Ｕ／Ｌであった。安定化剤としてトレハロース、サッカロース、ラクトース又はマンノースを用いてヒト由来ＡＴＸを凍結乾燥し、約４℃から１０℃で１９７日間保存したところ、ヒト由来ＡＴＸの活性は表６に記載のとおりであった。
　（参考例７：安定化剤として血清を用いてヒト由来ＡＴＸを凍結乾燥し約４℃から１０℃で保存した場合の活性の変化）
　安定化剤として血清を用いてヒト由来ＡＴＸを凍結乾燥し、当該ヒト由来ＡＴＸを約４℃から１０℃で３カ月間保存し、当該ヒト由来ＡＴＸの活性の変化を測定した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
  
　表７に示すように、安定化剤として血清を用いてヒト由来ＡＴＸを凍結乾燥し、当該ヒト由来ＡＴＸを約４℃から１０℃で３カ月間保存したところ、ヒト由来ＡＴＸの活性が約１５％低下した。したがって、安定化剤として血清のみを用いると、長期凍結保存により、ＡＴＸの活性が低下することが示された。
　［実施例１：キャリブレーター及び検体に含まれるＡＴＸの活性測定方法］
　キャリブレーター及び検体に含まれるＡＴＸの活性は、特に断りがない限り、Ｎａｋａｍｕｒａ　Ｋ　ｅｔ　ａｌ．　Ｃｌｉｎ　Ｃｈｉｍ　Ａｃｔａ．，　３８８（１－２），　５１－５８（２００８）に記載の方法を用いて測定した。具体的には、１００ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ　９．０）、５００ｍｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ、５ｍｍｏｌ／ＬのＭｇＣｌ２、５ｍｍｏｌ／ＬのＣａＣｌ２、及び０．０５％のＴｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００存在下、２０μＬのＡＴＸを含むサンプルを２ｍｍｏｌ／Ｌの１－ｍｙｒｉｓｔｏｙｌ（１４：０）－ＬＰＣと３７℃で３時間反応させた。遊離したコリンを、コリンオキシダーゼ、西洋わさびペルオキシダーゼ、及びＴＯＯＳ試薬を用いて、吸光分光測定装置により検出して、サンプル中のＡＴＸの活性を測定した。なお本実施例において、（Ｕ／Ｌ）は（ｎｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍＬ）と表現する場合もある。
　本活性測定方法で、ＡＴＸの活性又は質量の測定においてキャリブレーターとして使用するための組成物に含まれるＡＴＸの活性（Ｕ／Ｌ）を測定することができることを確認した。
　［実施例２：ヒト由来組換えＡＴＸの製造方法］
　配列番号１に記載のヒト由来ＡＴＸ遺伝子を全合成した。全合成した配列をｐＯｐｔｉＶＥＣ－ＴＯＰＯベクター（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にクローニングし、ＡＴＸ発現ベクターを得た。得られた発現ベクターをチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてトランスフェクションした。得られた細胞をＲ　Ｔ　Ｓｃｈｉｍｋｅ　ｅｔ　ａｌ．　Ｂｒ　Ｊ　Ｃａｎｃｅｒ．，　５１（４）　４５９－４６５（１０８５）に記載の方法に従い、ＡＴＸ遺伝子の増幅を行い、ＡＴＸ産生細胞を得た。
　ＡＴＸ産生細胞を４ｍｍｏｌ／ＬのＬ－アラニル－Ｌ－グルタミンを含む１２ｍＬのＣＨＯ細胞用無血清培地（ＢａｌａｎＣＤ　ＣＨＯ　ＧＲＯＷＴＨ　Ａ、富士フイルム和光純薬）に懸濁し、２５０ｍＬ容量のＴフラスコにて３７℃、５％ＣＯ２条件で１週間、ＡＴＸ産生細胞を培養した。培養液全量に４ｍｍｏｌ／ＬのＬ－アラニル－Ｌ－グルタミンを含む１６０ｍＬのＣＨＯ細胞用無血清培地（ＢａｌａｎＣＤ　ＣＨＯ　ＧＲＯＷＴＨ　Ａ、富士フイルム和光純薬）に懸濁し、８００ｍＬ容量Ｔフラスコ２本に等量ずつわけ、３７℃、５％ＣＯ２条件で１週間、ＡＴＸ産生細胞を培養した。
　得られたＡＴＸ産生細胞を含む培養液をＲｅａｄｙＴｏＰｒｏｃｅｓｓＷＡＶＥ２５（Ｃｙｔｉｖａ）の手順に従い、ＣＥＬＬＢＡＧ２２Ｌ／ｐＨＯＰＴ，ＤＯＯＰＴ（Ｃｙｔｉｖａ）に無菌的に移送し、４ｍｍｏｌ／ＬのＬ－アラニル－Ｌ－グルタミンを含む１ＬのＣＨＯ細胞用無血清培地（ＢａｌａｎＣＤ　ＣＨＯ　ＧＲＯＷＴＨ　Ａ、富士フイルム和光純薬）をさらに移送した。３７℃、５％ＣＯ２、攪拌速度１５ｒｐｍ、振盪角度６°、０．２Ｌ／ｍｉｎのガスフローの条件で１週間、ＡＴＸ産生細胞を培養した。１週間後さらに９Ｌの４ｍｍｏｌ／ＬのＬ－アラニル－Ｌ－グルタミンを含むＣＨＯ細胞用無血清培地（ＢａｌａｎＣＤ　ＣＨＯ　ＧＲＯＷＴＨ　Ａ、富士フイルム和光純薬）を移送し、２週間、ＡＴＸ産生細胞を培養した。
　得られた培養液を２０００ｇ、１５分、４℃の条件で遠心分離し、ヒト由来組換えＡＴＸを含む培養上清を得た。得られた培養上清をセントラメイト（ＰＡＬＬ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）１０Ｋにて濃縮した。途中詰まりが発生した場合は２０００ｇ、１５分、４℃の条件で遠心分離した。約６００ｍＬまで濃縮した後、濃縮脱塩バッファー（１０ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ９．０）、１ｍｍｏｌ／Ｌ　ＣａＣｌ２）を１４００ｍＬ加え、再びセントラメイト（ＰＡＬＬ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）１０Ｋにて約６００ｍＬになるまで濃縮した。濃縮脱塩バッファー（１０ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ９．０）、１ｍｍｏｌ／Ｌ　ＣａＣｌ２）を１４００ｍＬ加え、約６００ｍＬになるまで濃縮する操作を２回繰り返し、得られた約６００ｍＬの濃縮脱塩サンプルを２０００ｇ、１５分、４℃の条件で遠心分離し、上清を回収した。
　得られた培養上清を平衡化バッファー（１０ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ９．０）、１ｍｍｏｌ／Ｌ　ＣａＣｌ２）で平衡化したＱ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗ（Ｃｙｔｉｖａ）を充填したカラムに吸着させた。その後、平衡化バッファー、及び溶出バッファー（１０ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ９．０）、１ｍｍｏｌ／Ｌ　ＣａＣｌ２、０．３ｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ）を用いた１０ＣＶ（Ｃｏｌｕｍｎ　Ｖｏｌｕｍｅ）のリニアグラジエントにより溶出した。ＡＴＸ活性測定をおこない、ＡＴＸ活性を有する画分を回収した。
　得られたＡＴＸ活性画分をセントラメイト（ＰＡＬＬ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）１０Ｋにて濃縮し、２００ｍＬまで濃縮した。１０ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）を１８００ｍＬ加えた。２００ｍＬまでの濃縮と１８００ｍＬバッファー添加を２回繰り返し、約２００ｍＬのヒト由来組換えＡＴＸを得た。ヒト由来組換えＡＴＸをＳＤＳ－ＰＡＧＥに供した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥの写真を図１に示す。また、各精製工程におけるヒト由来組換えＡＴＸ活性を測定した。測定した結果を表８に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
  
　実施例２で作製したヒト由来組換えＡＴＸを、以下の実施例のヒト由来ＡＴＸとして使用した。
　［実施例３：キャリブレーターとして使用するための凍結組成物の調製］
　実施例２で作製した５０μＬのヒト由来組換えＡＴＸと、３０ｍＬの市販のヒト血清製品と、を混ぜ合わせ各５００μＬずつエッペンチューブに分注し、－８０℃で凍結して、凍結組成物を得た。
　実施例３から、キャリブレーターとして適正な濃度のヒト由来ＡＴＸ及びヒト血清製品を含む、キャリブレーターとして使用するための凍結組成物を製造可能であることが示された。
　［実施例４：安定化剤として糖アルコールと血清を用いたＡＴＸ凍結乾燥組成物の約４℃から１０℃における安定性評価］
　安定化剤として、サッカロース又はトレハロースと、市販の第２の血清製品又は第３の血清製品と、を用いて、以下の方法を用いて凍結乾燥を行った。
　実施例２で作製したヒト由来組換えＡＴＸと、糖アルコールと、ヒト血清と、を、表９に記載の濃度で混ぜ合わせ、各１ｍＬずつバキュームバイアル（日本電子硝子株式会社）に分注し、－５０℃で２時間凍結した。その後、－５０℃で０．５時間、－１５℃で４６時間、１５℃で２０時間乾燥し、凍結ゴム栓、スクリューキャップをし、凍結乾燥組成物を得た。
　得られた凍結乾燥組成物を約４℃から１０℃で１３ヶ月間保存し、ＡＴＸ活性の変化を測定した。キャリブレーターとして実施例３に記載の凍結組成物を使用した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
  
　表９に示すように、保存期間０日で凍結乾燥組成物を復水した後のＡＴＸ活性は１２Ｕ／Ｌから１６Ｕ／Ｌであった。安定化剤としてサッカロース又はトレハロースと、市販の第２の血清製品又は第３の血清製品を用いてヒト由来ＡＴＸを凍結乾燥し、約４℃から１０℃で１３ヶ月間、ヒト由来ＡＴＸを保存したところ、少なくとも１３カ月間、ヒト由来ＡＴＸの活性は実質的に変化しなかった。
　実施例４は、キャリブレーターとして適正な濃度のヒト由来ＡＴＸ、糖アルコール（サッカロース又はトレハロース）、及びヒト血清を含む凍結乾燥組成物において、ヒト由来ＡＴＸの活性が、約４℃から１０℃の保存条件下で、少なくとも１３カ月間、初期値から実質的に変化しなかったことを示した。よって、ＡＴＸの活性又は質量の測定において、これらの凍結乾燥物を、キャリブレーターとして使用できることが示された。
　［実施例５：安定化剤として糖アルコールと血清を用いたＡＴＸ凍結乾燥組成物の約４℃から１０℃における安定性評価］
　安定化剤としてトレハロース（１％）を用い、市販の第１の血清製品を用いて、実施例３に記載の方法でヒト由来ＡＴＸの凍結乾燥組成物を得た。得られた凍結乾燥組成物を約４℃から１０℃で３ヶ月間保存し、ヒト由来ＡＴＸの活性変化を測定した。キャリブレーターとして実施例３に記載の凍結組成物を使用した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
  
　表１０に示すように、保存期間０日で凍結乾燥組成物を復水した後のＡＴＸ活性は５Ｕ／Ｌから６Ｕ／Ｌであった。安定化剤としてトレハロース及び市販の第１の血清製品を用いてヒト由来ＡＴＸを凍結乾燥し、約４℃から１０℃で３ヶ月間保存したところ、少なくとも３カ月間、ヒト由来ＡＴＸの活性は実質的に変化しなかった。
　実施例５は、キャリブレーターとして適正な濃度のヒト由来ＡＴＸ、糖アルコール（トレハロース）、及びヒト血清を含む凍結乾燥組成物において、ヒト由来ＡＴＸの活性が、約４℃から１０℃の保存条件下で少なくとも３カ月間、初期値から実質的に変化しなかったことを示した。よって、これらの凍結乾燥組成物が、ＡＴＸの活性又は質量の測定においてキャリブレーターとして使用できることが示された。
　［実施例６：実施例４の組成物をキャリブレーターとして使用してヒト検体に含まれるＡＴＸの活性を測定する方法］
　（試料）
　本実施例で試料として使用した２７個のヒト血清検体は、ビジコムジャパン株式会社より購入した。
　（キャリブレーター）
　実施例４と同様に安定化剤としてサッカロース及び血清を用いて凍結乾燥したヒト由来ＡＴＸを含む凍結乾燥組成物をキャリブレーターとして使用した。このキャリブレーター（凍結乾燥組成物）を復水した後のＡＴＸ活性を実施例１に記載の方法で測定したところ、１２．２Ｕ／Ｌであった。
　（ヒト検体に含まれるＡＴＸ活性（Ｕ／Ｌ）の測定）
　実施例１に記載の方法でヒト検体に含まれるＡＴＸ活性（Ｕ／Ｌ）を測定した。さらに、ヒト検体に含まれるＡＴＸ活性（Ｕ／Ｌ）の測定値を、キャリブレーターに含まれるＡＴＸ活性の測定値を用いて補正した。
　（ヒト検体に含まれるＡＴＸ質量（ｍｇ／Ｌ）の測定）
　ヒト検体に含まれるＡＴＸ質量（ｍｇ／Ｌ）は、株式会社エスアールエル（本社所在地　東京都新宿区西新宿二丁目1番1号）に委託し、市販のＥテスト「ＴＯＳＯＨ」ＩＩオートタキシンを使用して測定した。
　測定した２７の試料のヒト検体に含まれるＡＴＸ活性（Ｕ／Ｌ）と、ヒト検体に含まれるＡＴＸ質量（ｍｇ／Ｌ）の値と、を比較して図２に示した。
　図２に示したように、ヒト検体に含まれるＡＴＸ活性（ｙ軸）は、市販のＥテスト「ＴＯＳＯＨ」ＩＩオートタキシンを使用して測定したヒト検体に含まれるＡＴＸ質量（ｘ軸）と、相関式ｙ＝１３．６２４ｘ＋４．３１８６、相関係数ｒ＝０．９８４５で相関した。したがって、実施例に係るキャリブレーター、とＡＴＸ活性を測定する試薬と、をＡＴＸ活性を測定するためのキットとし、ヒト検体に含まれる質量を算出できることが示された。
　実施例６により、凍結乾燥されていたキャリブレーターを含むＡＴＸの活性又は質量を測定するためのキットを提供できること、及び凍結乾燥されていたキャリブレーターを用いてＡＴＸの活性又は質量を測定する方法を提供できることが示された。
　［実施例７：安定化剤として糖アルコールと血清を用いたＡＴＸ凍結乾燥組成物の３７℃における安定性評価］
　安定化剤として、トレハロース、サッカロース、Ｄ（－）マンニトール、又はＤ（－）ソルビトールと、市販の第２の血清製品と、を用いて、以下の方法を用いて凍結乾燥を行った。
　実施例２で作製したヒト由来組換えＡＴＸと、５％の糖アルコールと、ヒト血清と、を、混ぜ合わせ、各１ｍＬずつバキュームバイアル（日本電子硝子株式会社）に分注し、－５０℃で２時間凍結した。その後、－５０℃で０．５時間、－１５℃で４６時間、１５℃で２０時間乾燥し、凍結ゴム栓、スクリューキャップをし、凍結乾燥組成物を得た。また、コントロールとして、ヒト由来組換えＡＴＸとヒト血清を含み、糖アルコールを含まない凍結乾燥組成物を作製した（表１１の無添加）。
　得られた凍結乾燥組成物を３７℃で保存し、ＡＴＸ活性の変化を測定した。キャリブレーターとして実施例３に記載の凍結組成物を使用した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
  
　表１１に示すように、８週間の保存期間後においても、トレハロース、サッカロース、Ｄ（－）マンニトール、及びＤ（－）ソルビトールを用いると、ヒト由来ＡＴＸの残存活性は９６％以上であり、糖アルコールを含まない場合（表１１の無添加）と比較し高かった。
　［実施例８：安定化剤として糖アルコールを用いてヒト由来ＡＴＸを凍結乾燥し３７℃で保存した場合の活性の変化）
　安定化剤として糖アルコールを用いてヒト由来ＡＴＸを凍結乾燥し、３７℃で当該ヒト由来ＡＴＸを保存し、当該ヒト由来ＡＴＸの活性の変化を測定した。糖アルコールの濃度は、いずれも５％であった。なお、本実施例では、血清及び血漿を添加しておらず、表１２の無添加は糖アルコールも添加していない。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
  
　表１２に示すように、安定化剤として、トレハロース、ラクトース、マルトース、及びサッカロースを用いると、３週間の保存期間後においても、ヒト由来ＡＴＸの残存活性は８８％以上であった。

Claims (34)

  1. 　オートタキシンと、血清及び血漿の少なくともいずれかと、を含むキャリブレーターであって、さらに糖アルコールを含む、オートタキシン測定試薬のキャリブレーター。
  2. 　前記血清又は前記血漿がヒト由来である、請求項１に記載のオートタキシン測定試薬のキャリブレーター。
  3. 　前記血清又は前記血漿が、健常人由来である、請求項１又は２に記載のオートタキシン測定試薬のキャリブレーター。
  4. 　前記糖アルコールがサッカロース、トレハロース、マンニトール、又はソルビトールである、請求項１に記載のオートタキシン測定試薬のキャリブレーター。
  5. 　０．５質量％以上２０質量％以下の濃度で前記糖アルコールを含む、請求項１から４のいずれか１項に記載のオートタキシン測定試薬のキャリブレーター。
  6. 　前記オートタキシンがヒト由来オートタキシンである、請求項１から５のいずれか１項に記載のオートタキシン測定試薬のキャリブレーター。
  7. 　前記オートタキシンのアミノ酸配列が、配列番号１に記載の遺伝子配列に対応する、請求項１から６のいずれか１項に記載のオートタキシン測定試薬のキャリブレーター。
  8. 　前記オートタキシンのアミノ酸配列が、配列番号１に記載の遺伝子配列と９０％以上の同一性を有する遺伝子配列に対応し、前記オートタキシンが、リゾホスファチジルコリンを加水分解する活性を有する、請求項１から７のいずれか１項に記載のオートタキシン測定試薬のキャリブレーター。
  9. 　前記オートタキシンのアミノ酸配列が、配列番号１に記載の遺伝子配列において、１又は数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された遺伝子配列に対応し、前記オートタキシンが、リゾホスファチジルコリンを加水分解する活性を有する、請求項１から８のいずれか１項に記載のオートタキシン測定試薬のキャリブレーター。
  10. 　５Ｕ／Ｌ以上５０Ｕ／Ｌ以下の濃度で前記オートタキシンを含む、請求項１から９のいずれか１項に記載のオートタキシン測定試薬のキャリブレーター。
  11. 　０．０５ｍｇ／Ｌ以上１０ｍｇ／Ｌ以下の濃度で前記オートタキシンを含む、請求項１から１０のいずれか１項に記載のオートタキシン測定試薬のキャリブレーター。
  12. 　凍結乾燥試薬である、請求項１から１１のいずれか１項に記載のオートタキシン測定試薬のキャリブレーター。
  13. 　オートタキシン測定試薬を用いて、請求項１から１２のいずれか１項に記載のキャリブレーターに含まれるオートタキシンを測定することを含む、オートタキシン測定試薬のキャリブレーション方法。
  14. 　前記測定することにおいて、前記キャリブレーターに含まれるオートタキシンの活性又は質量を測定する、請求項１３に記載のオートタキシン測定試薬のキャリブレーション方法。
  15. 　オートタキシンの活性と質量との関係を表す１次関数を用いて、前記キャリブレーターに含まれるオートタキシンの活性の測定値から、前記キャリブレーターに含まれるオートタキシンの質量を算出する、請求項１３又は１４に記載のオートタキシン測定試薬のキャリブレーション方法。
  16. 　前記オートタキシン測定試薬が、リゾホスファチジルコリンを含む、請求項１３から１５のいずれか１項に記載のオートタキシン測定試薬のキャリブレーション方法。
  17. 　請求項１から１２のいずれか１項に記載のキャリブレーターと、
    　オートタキシン測定試薬と、
    　を含む、オートタキシン測定キット。
  18. 　前記オートタキシン測定試薬が、リゾホスファチジルコリンを含む、請求項１７に記載のオートタキシン測定キット。
  19. 　オートタキシン測定試薬を用いて、請求項１から１２のいずれか１項に記載のキャリブレーターに含まれるオートタキシンを測定することと、
    　前記オートタキシン測定試薬を用いて、検体に含まれるオートタキシンを測定することと、
    　前記キャリブレーターに含まれるオートタキシンの測定値を用いて、前記検体に含まれるオートタキシンの測定値を補正することと、
    　を含む、オートタキシンの測定方法。
  20. 　前記測定値が活性又は質量である、請求項１９に記載のオートタキシンの測定方法。
  21. 　オートタキシンの活性と質量との関係を表す１次関数を用いて、前記検体に含まれるオートタキシンの活性の補正された測定値から、前記検体に含まれるオートタキシンの質量を算出する、請求項１９又は２０に記載のオートタキシンの測定方法。
  22. 　前記オートタキシン測定試薬が、リゾホスファチジルコリンを含む、請求項１９から２１のいずれか１項に記載のオートタキシンの測定方法。
  23. 　請求項１から１２のいずれか１項に記載のキャリブレーターと、
    　オートタキシン測定試薬と、
    　を含む、診断補助キット。
  24. 　前記オートタキシン測定試薬が、リゾホスファチジルコリンを含む、請求項２３に記載の診断補助キット。
  25. 　診断補助対象の疾患が肝線維化、慢性肝疾患、悪性リンパ腫、及び膵疾患からなる群から選択されるいずれかである、請求項２３又は２４に記載の診断補助キット。
  26. 　診断補助対象の疾患が神経障害である、請求項２３又は２４に記載の診断補助キット。
  27. 　前記神経障害が、帯状疱疹後神経痛、腰部癒着性くも膜炎、胸部脊髄炎、腰椎神経根障害、頸椎症性脊髄症、化学療法誘発性末梢神経障害、栄養代謝性多発神経障害、及び頚髄軟化症からなる群から選択されるいずれかである、請求項２６に記載の診断補助キット。
  28. 　オートタキシン測定試薬を用いて、請求項１から１２のいずれか１項に記載のキャリブレーターに含まれるオートタキシンを測定することと、
    　前記オートタキシン測定試薬を用いて、検体に含まれるオートタキシンを測定することと、
    　前記キャリブレーターに含まれるオートタキシンの測定値を用いて、前記検体に含まれるオートタキシンの測定値を補正することと、
    　前記検体に含まれるオートタキシンの補正された測定値に基づき、疾患を特定することと、
    　を含む、診断補助方法。
  29. 　前記測定値が活性又は質量である、請求項２８に記載の診断補助方法。
  30. 　オートタキシンの活性と質量との関係を表す１次関数を用いて、前記検体に含まれるオートタキシンの活性の補正された測定値から、前記検体に含まれるオートタキシンの質量を算出する、請求項２８又は２９に記載の診断補助方法。
  31. 　前記オートタキシン測定試薬が、リゾホスファチジルコリンを含む、請求項２８から３０のいずれか１項に記載の診断補助方法。
  32. 　診断補助対象の疾患が肝線維化、慢性肝疾患、悪性リンパ腫、及び膵疾患からなる群から選択されるいずれかである、請求項２８から３１のいずれか１項に記載の診断補助方法。
  33. 　診断補助対象の疾患が神経障害である、請求項２８から３１のいずれか１項に記載の診断補助方法。
  34. 　前記神経障害が、帯状疱疹後神経痛、腰部癒着性くも膜炎、胸部脊髄炎、腰椎神経根障害、頸椎症性脊髄症、化学療法誘発性末梢神経障害、栄養代謝性多発神経障害、及び頚髄軟化症からなる群から選択されるいずれかである、請求項３３に記載の診断補助方法。
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