WO2023167232A1 - Calibrator for autotaxin measurement reagent, calibration method for autotaxin measurement reagent, autotaxin measurement kit, autotaxin measurement method, diagnosis assistance kit, and diagnosis assistance method - Google Patents

Calibrator for autotaxin measurement reagent, calibration method for autotaxin measurement reagent, autotaxin measurement kit, autotaxin measurement method, diagnosis assistance kit, and diagnosis assistance method Download PDF

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信一 酒瀬川
友和 板井
喜丸 大窪
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    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids

Definitions

  • the present invention provides a composition that can be used as a calibrator (hereinafter sometimes referred to as a “standard substance”) when measuring the activity or mass of ATX contained in human specimens, etc., and a method using the same.
  • aim to Measuring mass may include measuring concentration.
  • An autotaxin measurement kit includes a calibrator for the autotaxin measurement reagent of any one of [1] to [21] and an autotaxin measurement reagent.
  • the disease for which diagnostic aid is to be provided may be heart disease.
  • the disease for which diagnostic aid is to be provided may be a thyroid disease.
  • the hematopoietic tumor may be lymphoma.
  • the measured value may be activity or mass.
  • the heart disease may be any one selected from the group consisting of heart failure, congestive heart failure, and dilated cardiomyopathy.
  • the autotaxin measuring reagent calibrator according to the embodiment contains autotaxin (ATX), at least one of serum and plasma, and further contains a sugar alcohol. Further, the autotaxin measuring reagent calibrator according to the embodiment contains autotaxin and a sugar alcohol, and the sugar alcohol is trehalose, lactose, maltose, or saccharose.
  • the concentration of ATX in the calibrator is, for example, 5 U/L or more and 50 U/L or less, 5 U/L or more and 30 U/L or less, 5 U/L or more and 20 U/L or less, or 5 U/L or more and 16 U/L or less.
  • the ATX measurement reagent is not particularly limited as long as it can measure ATX.
  • the ATX measurement reagent may contain lysophosphatidylcholine.
  • the lysophosphatidylcholine may be myristoyl lysophosphatidylcholine.
  • the obtained ATX active fraction was concentrated with Centramate (PALL Corporation) 10K to 200 mL. 1800 mL of 10 mmol/L Tris-HCl (pH 7.5) was added. Concentration to 200 mL and addition of 1800 mL buffer were repeated twice to obtain approximately 200 mL of human-derived recombinant ATX. Human-derived recombinant ATX was subjected to SDS-PAGE. A photograph of SDS-PAGE is shown in FIG. In addition, human-derived recombinant ATX activity was measured in each purification step. Table 8 shows the measurement results.
  • sample Twenty-seven human serum specimens used as samples in this example were purchased from Busicom Japan.
  • Figure 2 shows a comparison of the ATX activity (U/L) contained in the human specimens of the 27 measured samples and the ATX mass (mg/L) contained in the human specimens.
  • the human-derived recombinant ATX prepared in Example 2 5% sugar alcohol, and human serum were mixed, 1 mL each was dispensed into vacuum vials (Nippon Electronic Glass Co., Ltd.), and the mixture was kept at -50°C. Freeze for 2 hours. Then, it was dried at ⁇ 50° C. for 0.5 hours, ⁇ 15° C. for 46 hours, and 15° C. for 20 hours, and was sealed with a frozen rubber stopper and a screw cap to obtain a freeze-dried composition. As a control, a freeze-dried composition containing human-derived recombinant ATX and human serum but containing no sugar alcohol was prepared (no addition in Table 11).

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Abstract

Provided are: a composition that can be used as a calibrator when measuring the activity or mass of autotaxin contained in a human specimen or the like; a method of using the composition; and the like. This calibrator for an autotaxin measurement reagent comprises: autotaxin; and serum and/or blood plasma. The calibrator further comprises a sugar alcohol. This calibration method for an autotaxin measurement reagent comprises: measuring autotaxin contained in the calibrator using the autotaxin measurement reagent.

Description

オートタキシン測定試薬のキャリブレーター、オートタキシン測定試薬のキャリブレーション方法、オートタキシン測定キット、オートタキシンの測定方法、診断補助キット、及び診断補助方法Autotaxin measurement reagent calibrator, autotaxin measurement reagent calibration method, autotaxin measurement kit, autotaxin measurement method, diagnostic aid kit, and diagnostic aid method
　本発明は、オートタキシンの活性又は質量を測定するオートタキシン測定試薬のキャリブレーター、オートタキシン測定試薬のキャリブレーション方法、オートタキシン測定キット、オートタキシンの測定方法、診断補助キット、及び診断補助方法に関する。 The present invention relates to an autotaxin measuring reagent calibrator for measuring autotaxin activity or mass, an autotaxin measuring reagent calibration method, an autotaxin measuring kit, an autotaxin measuring method, a diagnostic aid kit, and a diagnostic aid method.
  オートタキシン（以下、「ＡＴＸ」と記載する場合がある）は、エクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼ２又はリゾホスホリパーゼＤとも呼ばれる酵素である。ＡＴＸは、リゾホスファチジルコリン（以下、「ＬＰＣ」と記載する場合がある）を生体活性のシグナル伝達分子であるリゾホスファチジン酸（以下、「ＬＰＡ」と記載する場合がある）に変換する作用がある。非特許文献１は、血漿又は血清中のＬＰＡ濃度が、ＡＴＸ活性及び／又は質量と相関することを開示している。 Autotaxin (hereinafter sometimes referred to as "ATX") is an enzyme also called ectonucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase 2 or lysophospholipase D. ATX has the effect of converting lysophosphatidylcholine (hereinafter sometimes referred to as "LPC") into lysophosphatidic acid (hereinafter sometimes referred to as "LPA"), which is a bioactive signaling molecule. Non-Patent Document 1 discloses that LPA concentration in plasma or serum correlates with ATX activity and/or mass.
　非特許文献２は、ＬＰＡが、線維化、疼痛、癌、炎症、及び動脈硬化などの生体の異常に関与することを開示している。特許文献１は、ヒト組織あるいは体液中のＡＴＸの活性、質量、及び／又は濃度が、様々な疾病により変動する可能性があり、ＡＴＸの活性、質量、及び／又は濃度を測定することで、これらの疾病の診断やリスクを判断できる可能性を開示している。 Non-Patent Document 2 discloses that LPA is involved in biological abnormalities such as fibrosis, pain, cancer, inflammation, and arteriosclerosis. Patent Document 1 discloses that the activity, mass, and/or concentration of ATX in human tissues or body fluids may vary due to various diseases, and by measuring the activity, mass, and/or concentration of ATX, It discloses the possibility of determining the diagnosis and risk of these diseases.
　ＡＴＸを測定する方法として、ＡＴＸの質量を免疫学的に測定する方法、及びＡＴＸが有するリゾホスホリパーゼＤ活性を測定する方法がある。特許文献２はリゾホスホリパーゼＤ活性を測定する方法などを開示している。特許文献１は、ヒト検体中に含まれるヒト由来ＡＴＸの質量を免疫学的に測定する方法、及びＡＴＸのもつリゾホスホリパーゼＤ活性を測定する方法などを開示している。特許文献３から６は、ＡＴＸのアイソフォームの質量を免疫学的に測定する方法を開示している。 As methods for measuring ATX, there are a method for immunologically measuring the mass of ATX and a method for measuring the lysophospholipase D activity of ATX. Patent Document 2 discloses a method for measuring lysophospholipase D activity and the like. Patent Document 1 discloses a method for immunologically measuring the mass of human-derived ATX contained in a human sample, a method for measuring the lysophospholipase D activity of ATX, and the like. Patent Documents 3 to 6 disclose methods for immunologically measuring the mass of ATX isoforms.
　特許文献７、非特許文献１、及び非特許文献３は、ＡＴＸを製造する方法を開示している。特許文献３から６は、ＡＴＸのアイソフォームの製造方法を開示している。特許文献７、非特許文献１、非特許文献４、及び非特許文献５は、ヒト由来組換えＡＴＸの製造方法を開示している。 Patent Document 7, Non-Patent Document 1, and Non-Patent Document 3 disclose methods of manufacturing ATX. Patent Documents 3 to 6 disclose methods for producing ATX isoforms. Patent Document 7, Non-Patent Document 1, Non-Patent Document 4, and Non-Patent Document 5 disclose methods for producing human-derived recombinant ATX.
国際公開第２０１１／０８１２１４号WO2011/081214 特開２００４－１５９５３１号公報Japanese Patent Application Laid-Open No. 2004-159531 特開２０１３－１４５５８号公報JP 2013-14558 A 特開２０１４－１２５４８１号公報JP 2014-125481 A 特開２０１５－７２１９５号公報JP 2015-72195 A 特開２０１５－７２１９６号公報JP 2015-72196 A 特開２０１１－３７８０２号公報Japanese Unexamined Patent Application Publication No. 2011-37802
　本発明は、ヒト検体などに含まれるＡＴＸの活性又は質量を測定する際に、キャリブレーター（以下、「標準物質」と記載する場合がある）として使用できる組成物、及びそれを用いる方法等を提供することを目的する。質量を測定することは、濃度を測定することを含む場合がある。 The present invention provides a composition that can be used as a calibrator (hereinafter sometimes referred to as a “standard substance”) when measuring the activity or mass of ATX contained in human specimens, etc., and a method using the same. aim to Measuring mass may include measuring concentration.
　［１］　本発明の態様に係るオートタキシン測定試薬のキャリブレーターは、オートタキシンと、血清及び血漿の少なくともいずれかと、を含み、さらに糖アルコールを含む。 [1] The autotaxin measuring reagent calibrator according to the aspect of the present invention contains autotaxin, at least one of serum and plasma, and further contains a sugar alcohol.
　［２］　［１］のオートタキシン測定試薬のキャリブレーターにおいて、血清又は血漿が、ヒト由来であってもよい。 [2] In the autotaxin measuring reagent calibrator of [1], the serum or plasma may be of human origin.
　［３］　［１］又は［２］のオートタキシン測定試薬のキャリブレーターにおいて、血清又は血漿が、健常人由来であってもよい。 [3] In the autotaxin measuring reagent calibrator of [1] or [2], the serum or plasma may be derived from a healthy subject.
　［４］　［１］から［３］のいずれかのオートタキシン測定試薬のキャリブレーターにおいて、糖アルコールがサッカロース、トレハロース、マンニトール、又はソルビトールであってもよい。 [4] In the autotaxin measuring reagent calibrator of any one of [1] to [3], the sugar alcohol may be saccharose, trehalose, mannitol, or sorbitol.
　［５］　［１］から［４］のいずれかのオートタキシン測定試薬のキャリブレーターが、０．５質量％以上２０質量％以下の濃度で糖アルコールを含んでいてもよく、好ましくは０．５質量％以上１０質量％以下の濃度で糖アルコールを含んでいてもよい。 [5] The autotaxin measuring reagent calibrator of any one of [1] to [4] may contain a sugar alcohol at a concentration of 0.5% by mass or more and 20% by mass or less, preferably 0.5% by mass. % or more and 10% by mass or less of sugar alcohol.
　［６］　［１］から［５］のいずれかのオートタキシン測定試薬のキャリブレーターにおいて、オートタキシンが、ヒト由来オートタキシンであってもよい。 [6] In the autotaxin measuring reagent calibrator of any one of [1] to [5], the autotaxin may be human-derived autotaxin.
　［７］　［１］から［６］のいずれかのオートタキシン測定試薬のキャリブレーターにおいて、オートタキシンのアミノ酸配列が、配列番号１に記載の遺伝子配列に対応していてもよい。 [7] In the autotaxin measuring reagent calibrator of any one of [1] to [6], the amino acid sequence of autotaxin may correspond to the gene sequence set forth in SEQ ID NO:1.
　［８］　［１］から［６］のいずれかのオートタキシン測定試薬のキャリブレーターにおいて、オートタキシンのアミノ酸配列が、配列番号１に記載の遺伝子配列と９０％以上の同一性を有する遺伝子配列に対応し、オートタキシンが、リゾホスファチジルコリンを加水分解する活性を有していてもよい。 [8] In the autotaxin measuring reagent calibrator of any one of [1] to [6], the amino acid sequence of autotaxin corresponds to a gene sequence having 90% or more identity with the gene sequence described in SEQ ID NO: 1 However, autotaxin may have activity to hydrolyze lysophosphatidylcholine.
　［９］　［１］から［６］のいずれかのオートタキシン測定試薬のキャリブレーターにおいて、オートタキシンのアミノ酸配列が、配列番号１に記載の遺伝子配列において、１又は数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された遺伝子配列に対応し、オートタキシンが、リゾホスファチジルコリンを加水分解する活性を有していてもよい。 [9] In the autotaxin measuring reagent calibrator of any one of [1] to [6], the amino acid sequence of autotaxin is the gene sequence described in SEQ ID NO: 1, with deletion or substitution of one or several bases Or, corresponding to the added gene sequence, autotaxin may have the activity of hydrolyzing lysophosphatidylcholine.
　［１０］　［１］から［９］のいずれかのオートタキシン測定試薬のキャリブレーターが、５Ｕ／Ｌ以上５０Ｕ／Ｌ以下の濃度でオートタキシンを含んでいてもよく、好ましくは５Ｕ／Ｌ以上３０Ｕ／Ｌ以下の濃度でオートタキシンを含んでいてもよく、さらに好ましくは５Ｕ／Ｌ以上２０Ｕ／Ｌ以下の濃度でオートタキシンを含んでいてもよく、特に好ましくは５Ｕ／Ｌ以上１６Ｕ／Ｌ以下の濃度でオートタキシンを含んでいてもよい。 [10] The calibrator for the autotaxin measurement reagent of any one of [1] to [9] may contain autotaxin at a concentration of 5 U/L or more and 50 U/L or less, preferably 5 U/L or more and 30 U/L or more. It may contain autotaxin at a concentration of L or less, more preferably at a concentration of 5 U/L or more and 20 U/L or less, and particularly preferably at a concentration of 5 U/L or more and 16 U/L or less. may contain autotaxin.
　［１１］　［１］から［１０］のいずれかのオートタキシン測定試薬のキャリブレーターが、０．０５ｍｇ／Ｌ以上１０ｍｇ／Ｌ以下の濃度でオートタキシンを含んでいてもよく、好ましくは０．０５ｍｇ／Ｌ以上５ｍｇ／Ｌ以下の濃度でオートタキシンを含んでいてもよく、さらに好ましくは０．０５ｍｇ／Ｌ以上３ｍｇ／Ｌ以下の濃度でオートタキシンを含んでいてもよく、特に好ましくは０．０５ｍｇ／Ｌ以上１ｍｇ／Ｌ以下の濃度でオートタキシンを含んでいてもよい。 [11] The calibrator for the autotaxin measurement reagent of any one of [1] to [10] may contain autotaxin at a concentration of 0.05 mg/L or more and 10 mg/L or less, preferably 0.05 mg/L. Autotaxin may be contained at a concentration of L or more and 5 mg/L or less, more preferably 0.05 mg/L or more and 3 mg/L or less, and particularly preferably 0.05 mg/L. It may contain autotaxin at a concentration of L or more and 1 mg/L or less.
　［１２］　［１］から［１１］のいずれかのオートタキシン測定試薬のキャリブレーターが、凍結乾燥試薬であってもよい。 [12] The calibrator for the autotaxin measurement reagent of any one of [1] to [11] may be a freeze-dried reagent.
　［１３］　本発明の態様に係るオートタキシン測定試薬のキャリブレーターは、オートタキシンと、糖アルコールと、を含み、糖アルコールが、トレハロース、ラクトース、マルトース、又はサッカロースである。当該［１３］のオートタキシン測定試薬のキャリブレーターは、血清及び血漿を含まない。 [13] The autotaxin measuring reagent calibrator according to the aspect of the present invention contains autotaxin and a sugar alcohol, and the sugar alcohol is trehalose, lactose, maltose, or saccharose. The autotaxin measuring reagent calibrator of [13] does not contain serum or plasma.
　［１４］　［１３］のオートタキシン測定試薬のキャリブレーターが、０．５質量％以上２０質量％以下の濃度で糖アルコールを含んでいてもよく、好ましくは０．５質量％以上１０質量％以下の濃度で糖アルコールを含んでいてもよい。 [14] The calibrator for the autotaxin measurement reagent of [13] may contain a sugar alcohol at a concentration of 0.5% by mass or more and 20% by mass or less, preferably 0.5% by mass or more and 10% by mass or less. Concentrations may include sugar alcohols.
　［１５］　［１３］又は［１４］のオートタキシン測定試薬のキャリブレーターにおいて、オートタキシンが、ヒト由来オートタキシンであってもよい。 [15] In the autotaxin measuring reagent calibrator of [13] or [14], the autotaxin may be human-derived autotaxin.
　［１６］　［１３］から［１５］のいずれかのオートタキシン測定試薬のキャリブレーターにおいて、オートタキシンのアミノ酸配列が、配列番号１に記載の遺伝子配列に対応していてもよい。 [16] In the autotaxin measuring reagent calibrator of any one of [13] to [15], the amino acid sequence of autotaxin may correspond to the gene sequence set forth in SEQ ID NO:1.
　［１７］　［１３］から［１５］のいずれかのオートタキシン測定試薬のキャリブレーターにおいて、オートタキシンのアミノ酸配列が、配列番号１に記載の遺伝子配列と９０％以上の同一性を有する遺伝子配列に対応し、オートタキシンが、リゾホスファチジルコリンを加水分解する活性を有していてもよい。 [17] In the autotaxin measuring reagent calibrator of any one of [13] to [15], the amino acid sequence of autotaxin corresponds to a gene sequence having 90% or more identity with the gene sequence described in SEQ ID NO: 1 However, autotaxin may have activity to hydrolyze lysophosphatidylcholine.
　［１８］　［１３］から［１５］のいずれかのオートタキシン測定試薬のキャリブレーターにおいて、オートタキシンのアミノ酸配列が、配列番号１に記載の遺伝子配列において、１又は数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された遺伝子配列に対応し、オートタキシンが、リゾホスファチジルコリンを加水分解する活性を有していてもよい。 [18] In the autotaxin measuring reagent calibrator of any one of [13] to [15], the amino acid sequence of autotaxin is the gene sequence described in SEQ ID NO: 1, with deletion or substitution of one or several bases Or, corresponding to the added gene sequence, autotaxin may have the activity of hydrolyzing lysophosphatidylcholine.
　［１９］　［１３］から［１８］のいずれかのオートタキシン測定試薬のキャリブレーターが、５Ｕ／Ｌ以上５０Ｕ／Ｌ以下の濃度でオートタキシンを含んでいてもよく、好ましくは５Ｕ／Ｌ以上３０Ｕ／Ｌ以下の濃度でオートタキシンを含んでいてもよく、さらに好ましくは５Ｕ／Ｌ以上２０Ｕ／Ｌ以下の濃度でオートタキシンを含んでいてもよく、特に好ましくは５Ｕ／Ｌ以上１６Ｕ／Ｌ以下の濃度でオートタキシンを含んでいてもよい。 [19] The calibrator for the autotaxin measurement reagent of any one of [13] to [18] may contain autotaxin at a concentration of 5 U/L or more and 50 U/L or less, preferably 5 U/L or more and 30 U/L or more. It may contain autotaxin at a concentration of L or less, more preferably at a concentration of 5 U/L or more and 20 U/L or less, and particularly preferably at a concentration of 5 U/L or more and 16 U/L or less. may contain autotaxin.
　［２０］　［１３］から［１９］のいずれかのオートタキシン測定試薬のキャリブレーターが、０．０５ｍｇ／Ｌ以上１０ｍｇ／Ｌ以下の濃度でオートタキシンを含んでいてもよく、好ましくは０．０５ｍｇ／Ｌ以上５ｍｇ／Ｌ以下の濃度でオートタキシンを含んでいてもよく、さらに好ましくは０．０５ｍｇ／Ｌ以上３ｍｇ／Ｌ以下の濃度でオートタキシンを含んでいてもよく、特に好ましくは０．０５ｍｇ／Ｌ以上１ｍｇ／Ｌ以下の濃度でオートタキシンを含んでいてもよい。 [20] The calibrator for the autotaxin measurement reagent of any one of [13] to [19] may contain autotaxin at a concentration of 0.05 mg/L or more and 10 mg/L or less, preferably 0.05 mg/L. Autotaxin may be contained at a concentration of L or more and 5 mg/L or less, more preferably 0.05 mg/L or more and 3 mg/L or less, and particularly preferably 0.05 mg/L. It may contain autotaxin at a concentration of L or more and 1 mg/L or less.
　［２１］　［１３］から［２０］のいずれかのオートタキシン測定試薬のキャリブレーターが、凍結乾燥試薬であってもよい。 [21] The calibrator for the autotaxin measurement reagent of any one of [13] to [20] may be a freeze-dried reagent.
　［２２］　本発明の態様に係るオートタキシン測定試薬のキャリブレーション方法は、オートタキシン測定試薬を用いて、［１］から［２１］のいずれかのオートタキシン測定試薬のキャリブレーターに含まれるオートタキシンを測定することを含む。 [22] A method for calibrating an autotaxin measurement reagent according to an aspect of the present invention is a method for calibrating autotaxin contained in a calibrator of an autotaxin measurement reagent according to any one of [1] to [21] using an autotaxin measurement reagent. Including measuring.
　［２３］　［２２］のオートタキシン測定試薬のキャリブレーション方法において、測定することにおいて、キャリブレーターに含まれるオートタキシンの活性又は質量を測定してもよい。 [23] In the autotaxin measurement reagent calibration method of [22], the activity or mass of the autotaxin contained in the calibrator may be measured in the measurement.
　［２４］　［２２］又は［２３］のオートタキシン測定試薬のキャリブレーション方法において、オートタキシンの活性と質量との関係を表す１次関数を用いて、キャリブレーターに含まれるオートタキシンの活性の測定値から、キャリブレーターに含まれるオートタキシンの質量を算出してもよい。 [24] In the autotaxin measurement reagent calibration method of [22] or [23], the measured value of the autotaxin activity contained in the calibrator using a linear function representing the relationship between the autotaxin activity and the mass may be used to calculate the mass of autotaxin contained in the calibrator.
　［２５］　［２２］から［２４］のいずれかのオートタキシン測定試薬のキャリブレーション方法において、オートタキシン測定試薬が、リゾホスファチジルコリンを含んでいてもよい。リゾホスファチジルコリンが、ミリストイルリゾホスファチジルコリンであってもよい。 [25] In the autotaxin measurement reagent calibration method of any one of [22] to [24], the autotaxin measurement reagent may contain lysophosphatidylcholine. The lysophosphatidylcholine may be myristoyl lysophosphatidylcholine.
　［２６］　本発明の態様に係るオートタキシン測定キットは、［１］から［２１］のいずれかのオートタキシン測定試薬のキャリブレーターと、オートタキシン測定試薬と、を含む。 [26] An autotaxin measurement kit according to an aspect of the present invention includes a calibrator for the autotaxin measurement reagent of any one of [1] to [21] and an autotaxin measurement reagent.
　［２７］　［２６］のオートタキシン測定キットにおいて、オートタキシン測定試薬が、リゾホスファチジルコリンを含んでいてもよい。リゾホスファチジルコリンが、ミリストイルリゾホスファチジルコリンであってもよい。 [27] In the autotaxin measurement kit of [26], the autotaxin measurement reagent may contain lysophosphatidylcholine. The lysophosphatidylcholine may be myristoyl lysophosphatidylcholine.
　［２８］　本発明の態様に係るオートタキシンの測定方法は、（ａ）オートタキシン測定試薬を用いて、［１］から［２１］のいずれかのオートタキシン測定試薬のキャリブレーターに含まれるオートタキシンを測定することと、（ｂ）オートタキシン測定試薬を用いて、検体に含まれるオートタキシンを測定することと、（ｃ）キャリブレーターに含まれるオートタキシンの測定値を用いて、検体に含まれるオートタキシンの測定値を補正することと、を含む。 [28] A method for measuring autotaxin according to an aspect of the present invention comprises: (a) autotaxin contained in a calibrator of an autotaxin measuring reagent according to any one of [1] to [21] using an autotaxin measuring reagent; (b) measuring autotaxin contained in the specimen using an autotaxin measurement reagent; and (c) autotaxin contained in the specimen using the measured value of autotaxin contained in the calibrator. and correcting the measurements of
　［２９］　［２８］のオートタキシンの測定方法において、測定値が、活性又は質量であってもよい。 [29] In the autotaxin measuring method of [28], the measured value may be activity or mass.
　［３０］　［２８］又は［２９］のオートタキシンの測定方法において、オートタキシンの活性と質量との関係を表す１次関数を用いて、検体に含まれるオートタキシンの活性の補正された測定値から、検体に含まれるオートタキシンの質量を算出してもよい。 [30] In the method for measuring autotaxin of [28] or [29], the measured value of the activity of autotaxin contained in the specimen is corrected using a linear function representing the relationship between the activity of autotaxin and the mass may be used to calculate the mass of autotaxin contained in the sample.
　［３１］　［２８］から［３０］のいずれかのオートタキシンの測定方法において、オートタキシン測定試薬が、リゾホスファチジルコリンを含んでいてもよい。リゾホスファチジルコリンが、ミリストイルリゾホスファチジルコリンであってもよい。 [31] In the autotaxin measuring method of any one of [28] to [30], the autotaxin measuring reagent may contain lysophosphatidylcholine. The lysophosphatidylcholine may be myristoyl lysophosphatidylcholine.
　［３２］　本発明の態様に係る診断補助キットは、［１］から［２１］のいずれかのオートタキシン測定試薬のキャリブレーターと、オートタキシン測定試薬と、を含む。 [32] A diagnostic aid kit according to an aspect of the present invention includes a calibrator for the autotaxin measurement reagent of any one of [1] to [21] and an autotaxin measurement reagent.
　［３３］　［３２］の診断補助キットにおいて、オートタキシン測定試薬が、リゾホスファチジルコリンを含んでいてもよい。リゾホスファチジルコリンが、ミリストイルリゾホスファチジルコリンであってもよい。 [33] In the diagnostic aid kit of [32], the autotaxin measuring reagent may contain lysophosphatidylcholine. The lysophosphatidylcholine may be myristoyl lysophosphatidylcholine.
　［３４］　［３２］又は［３３］の診断補助キットにおいて、診断補助対象の疾患が、肝線維化、慢性肝疾患、悪性リンパ腫、及び膵疾患からなる群から選択されるいずれかであってもよい。 [34] In the diagnostic aid kit of [32] or [33], even if the disease targeted for diagnostic aid is selected from the group consisting of liver fibrosis, chronic liver disease, malignant lymphoma, and pancreatic disease good.
　［３５］　［３２］から［３４］のいずれかの診断補助キットにおいて、診断補助対象の疾患が、心臓病であってもよい。 [35] In the diagnostic aid kit of any one of [32] to [34], the disease for which diagnostic aid is to be provided may be heart disease.
　［３６］　［３５］の診断補助キットにおいて、心臓病が、心不全、うっ血性心不全、及び拡張型心筋症からなる群から選択されるいずれかであってもよい。 [36] In the diagnostic aid kit of [35], the heart disease may be any one selected from the group consisting of heart failure, congestive heart failure, and dilated cardiomyopathy.
　［３７］　［３２］から［３４］のいずれかの診断補助キットにおいて、診断補助対象の疾患が、甲状腺疾患であってもよい。 [37] In the diagnostic aid kit according to any one of [32] to [34], the disease for which diagnostic aid is to be provided may be a thyroid disease.
　［３８］　［３７］の診断補助キットにおいて、甲状腺疾患が、甲状腺機能亢進症又はバセドウ病であってもよい。 [38] In the diagnostic aid kit of [37], the thyroid disease may be hyperthyroidism or Graves' disease.
　［３９］　［３２］から［３４］のいずれかの診断補助キットにおいて、診断補助対象の疾患が、神経障害であってもよい。 [39] In the diagnostic aid kit of any one of [32] to [34], the disease for which diagnostic aid is to be provided may be neuropathy.
　［４０］　［３９］の診断補助キットにおいて、神経障害が、帯状疱疹後神経痛、腰部癒着性くも膜炎、胸部脊髄炎、腰椎神経根障害、頸椎症性脊髄症、化学療法誘発性末梢神経障害、栄養代謝性多発神経障害、及び頚髄軟化症からなる群から選択されるいずれかであってもよい。 [40] In the diagnostic aid kit of [39], neuropathy includes postherpetic neuralgia, lumbar adhesive arachnoiditis, thoracic myelitis, lumbar radiculopathy, cervical spondylotic myelopathy, chemotherapy-induced peripheral neuropathy, It may be any one selected from the group consisting of nutritional metabolic polyneuropathy and cervical myelomalacia.
　［４１］　［３２］から［３４］のいずれかの診断補助キットにおいて、診断補助対象の疾患が、中枢神経への癌細胞の浸潤であってもよい。 [41] In the diagnostic aid kit of any one of [32] to [34], the disease for which diagnostic aid is to be provided may be infiltration of cancer cells into the central nervous system.
　［４２］　［４１］の診断補助キットにおいて、癌細胞が、造血器腫瘍由来であってもよい。 [42] In the diagnostic aid kit of [41], the cancer cells may be derived from hematopoietic tumors.
　［４３］　［４２］の診断補助キットにおいて、造血器腫瘍が、リンパ腫であってもよい。 [43] In the diagnostic aid kit of [42], the hematopoietic tumor may be lymphoma.
　［４４］　［３２］から［３４］のいずれかの診断補助キットにおいて、診断補助対象が、妊娠又は妊娠高血圧症候群であってもよい。 [44] In the diagnostic aid kit of any one of [32] to [34], the diagnostic aid target may be pregnancy or pregnancy-induced hypertension.
　［４５］　本発明の態様に係る診断補助方法は、（ａ）オートタキシン測定試薬を用いて、［１］から［２１］のいずれかのオートタキシン測定試薬のキャリブレーターに含まれるオートタキシンを測定することと、（ｂ）オートタキシン測定試薬を用いて、検体に含まれるオートタキシンを測定することと、（ｃ）キャリブレーターに含まれるオートタキシンの測定値を用いて、検体に含まれるオートタキシンの測定値を補正することと、（ｄ）検体に含まれるオートタキシンの補正された測定値に基づき、疾患を特定することと、を含む。 [45] A diagnostic aid method according to an aspect of the present invention comprises (a) measuring autotaxin contained in a calibrator of an autotaxin measuring reagent according to any one of [1] to [21] using an autotaxin measuring reagent (b) measuring autotaxin contained in the sample using an autotaxin measuring reagent; and (c) measuring autotaxin contained in the sample using the measured value of autotaxin contained in the calibrator. (d) identifying a disease based on the corrected measurement of autotaxin contained in the specimen.
　［４６］　［４５］の診断補助方法において、測定値が、活性又は質量であってもよい。 [46] In the diagnostic aid method of [45], the measured value may be activity or mass.
　［４７］　［４５］又は［４６］の診断補助方法において、オートタキシンの活性と質量との関係を表す１次関数を用いて、検体に含まれるオートタキシンの活性の補正された測定値から、検体に含まれるオートタキシンの質量を算出してもよい。 [47] In the diagnostic aid method of [45] or [46], using a linear function representing the relationship between autotaxin activity and mass, from the corrected measured value of autotaxin activity contained in the specimen, The mass of autotaxin contained in the specimen may be calculated.
　［４８］　［４５］から［４７］のいずれかの診断補助方法において、オートタキシン測定試薬が、リゾホスファチジルコリンを含んでいてもよい。リゾホスファチジルコリンが、ミリストイルリゾホスファチジルコリンであってもよい。 [48] In any of the diagnostic aid methods from [45] to [47], the autotaxin measuring reagent may contain lysophosphatidylcholine. The lysophosphatidylcholine may be myristoyl lysophosphatidylcholine.
　［４９］　［４５］から［４８］のいずれかの診断補助方法において、診断補助対象の疾患が、肝線維化、慢性肝疾患、悪性リンパ腫、及び膵疾患からなる群から選択されるいずれかであってもよい。 [49] In the diagnostic assistance method of any one of [45] to [48], the disease to be diagnosed is any selected from the group consisting of liver fibrosis, chronic liver disease, malignant lymphoma, and pancreatic disease There may be.
　［５０］　［４５］から［４９］のいずれかの診断補助方法において、診断補助対象の疾患が、心臓病であってもよい。 [50] In the diagnostic assistance method of any one of [45] to [49], the disease for which diagnostic assistance is to be provided may be heart disease.
　［５１］　［５０］の診断補助方法において、心臓病が、心不全、うっ血性心不全、及び拡張型心筋症からなる群から選択されるいずれかであってもよい。 [51] In the diagnostic aid method of [50], the heart disease may be any one selected from the group consisting of heart failure, congestive heart failure, and dilated cardiomyopathy.
　［５２］　［４５］から［４９］のいずれかの診断補助方法において、診断補助対象の疾患が、甲状腺疾患であってもよい。 [52] In any of the diagnostic assistance methods of [45] to [49], the disease for which diagnostic assistance is to be provided may be a thyroid disease.
　［５３］　［５２］の診断補助方法において、甲状腺疾患が、甲状腺機能亢進症又はバセドウ病であってもよい。 [53] In the diagnostic aid method of [52], the thyroid disease may be hyperthyroidism or Graves' disease.
　［５４］　［４５］から［４９］のいずれかの診断補助方法において、診断補助対象の疾患が、神経障害であってもよい。 [54] In any of the diagnostic assistance methods of [45] to [49], the disease for which diagnostic assistance is to be provided may be neuropathy.
　［５５］　［５４］の診断補助方法において、神経障害が、帯状疱疹後神経痛、腰部癒着性くも膜炎、胸部脊髄炎、腰椎神経根障害、頸椎症性脊髄症、化学療法誘発性末梢神経障害、栄養代謝性多発神経障害、及び頚髄軟化症からなる群から選択されるいずれかであってもよい。 [55] In the diagnostic aid method of [54], the neuropathy includes postherpetic neuralgia, lumbar adhesive arachnoiditis, thoracic myelitis, lumbar radiculopathy, cervical spondylotic myelopathy, chemotherapy-induced peripheral neuropathy, It may be any one selected from the group consisting of nutritional metabolic polyneuropathy and cervical myelomalacia.
　［５６］　［４５］から［４９］のいずれかの診断補助方法において、診断補助対象の疾患が、中枢神経への癌細胞の浸潤であってもよい。 [56] In the method for assisting diagnosis according to any one of [45] to [49], the disease to be assisted in diagnosis may be invasion of cancer cells into the central nervous system.
　［５７］　［５６］の診断補助方法において、癌細胞が造血器腫瘍由来であってもよい。 [57] In the diagnostic aid method of [56], the cancer cells may be derived from a hematopoietic tumor.
　［５８］　［５７］の診断補助方法において、造血器腫瘍が、リンパ腫であってもよい。 [58] In the diagnostic aid method of [57], the hematopoietic tumor may be lymphoma.
　［５９］　［４５］から［４９］のいずれかの診断補助方法において、診断補助対象が、妊娠又は妊娠高血圧症候群であってもよい。 [59] In the diagnostic assistance method of any one of [45] to [49], the diagnostic assistance target may be pregnancy or pregnancy-induced hypertension syndrome.
　本発明によれば、ヒト検体などに含まれるＡＴＸの活性又は質量を測定する際に、キャリブレーターとして使用できる組成物、及びそれを用いる方法等を提供可能である。 According to the present invention, it is possible to provide a composition that can be used as a calibrator when measuring the activity or mass of ATX contained in human specimens, etc., and a method of using the same.
精製したヒト由来組換えＡＴＸをＳＤＳ－ＰＡＧＥに供した結果を示す写真である。1 is a photograph showing the results of subjecting purified human-derived recombinant ATX to SDS-PAGE. ヒト検体に含まれるＡＴＸの活性を、実施例２に係る組成物をキャリブレーターとして使用して測定し、濃度と比較した結果を表すグラフである。4 is a graph showing the results of measuring the activity of ATX contained in human specimens using the composition of Example 2 as a calibrator and comparing the results with the concentration.
　以下、本発明を実施するための形態（以下、「実施形態」ということがある）について説明する。本発明は、以下の実施形態に限定されるものではなく、その要旨の範囲内で種々変形して実施できる。また、以下に示す実施形態は、この発明の技術的思想を具体化するための方法等を例示するものであって、これらの例示に限定されるものではない。 A mode for carrying out the present invention (hereinafter sometimes referred to as "embodiment") will be described below. The present invention is not limited to the following embodiments, and various modifications can be made within the scope of the gist of the present invention. Moreover, the embodiments shown below are intended to exemplify methods and the like for embodying the technical idea of the present invention, and are not limited to these exemplifications.
　実施形態に係るオートタキシン測定試薬のキャリブレーターは、オートタキシン（ＡＴＸ）と、血清及び血漿の少なくともいずれかと、を含み、さらに糖アルコールを含む。また、実施形態に係るオートタキシン測定試薬のキャリブレーターは、オートタキシンと、糖アルコールと、を含み、糖アルコールが、トレハロース、ラクトース、マルトース、又はサッカロースである。 The autotaxin measuring reagent calibrator according to the embodiment contains autotaxin (ATX), at least one of serum and plasma, and further contains a sugar alcohol. Further, the autotaxin measuring reagent calibrator according to the embodiment contains autotaxin and a sugar alcohol, and the sugar alcohol is trehalose, lactose, maltose, or saccharose.
　実施形態に係るキャリブレーターは、例えば、以下の用途で用いられ得る。 The calibrator according to the embodiment can be used, for example, for the following purposes.
　（ｉ）ヒト検体などのＡＴＸの測定値を算出する；キャリブレーターに含まれるＡＴＸと、ヒト検体などに含まれるＡＴＸと、の活性又は質量を同時に測定し、それぞれの測定値の比例関係から、ヒト検体などに含まれるＡＴＸの活性又は質量を算出する。 (i) Calculate the measured value of ATX in a human sample, etc.; The activity or mass of ATX contained in a specimen or the like is calculated.
　(ｉｉ)ＡＴＸの活性又は質量を測定するための試薬の精度を管理する；既知の活性、質量、及び／又は濃度のＡＴＸが含まれるキャリブレーターを試薬で測定して得られる吸光度、及び反応速度などの変化量は、試薬組成や測定条件をもとに理論的に演算できる。キャリブレーターを測定したときの変化量が、理論的変化量±許容誤差の範囲内に入っていることを確認する事で、試薬が一定の基準内の精度を保っていることを確認する。 (ii) control the accuracy of reagents for measuring the activity or mass of ATX; such as absorbance and reaction rate obtained by measuring calibrators containing known activity, mass, and/or concentration of ATX with reagents; can be theoretically calculated based on the reagent composition and measurement conditions. By confirming that the amount of change when measuring the calibrator is within the range of theoretical variation ± tolerance, it is confirmed that the reagent maintains accuracy within a certain standard.
　実施形態に係るキャリブレーターに含まれるＡＴＸは、検体がヒト由来である場合、例えば、ヒト由来である。ＡＴＸの活性及び／又は質量を測定する試薬の組成や測定条件が変化した場合、ＡＴＸを測定して得られる吸光度変化、反応速度などの変化量は、ヒト由来のＡＴＸは、ヒト由来以外のＡＴＸと比較して、より同じ挙動で変化する傾向にある。 The ATX contained in the calibrator according to the embodiment is human-derived, for example, when the sample is human-derived. When the composition of the reagent for measuring the activity and/or mass of ATX and/or the measurement conditions are changed, the amount of change in the absorbance change, reaction rate, etc. obtained by measuring ATX may be Compared to , it tends to change with more of the same behavior.
　ＡＴＸは、配列番号１に記載のヒト由来ＡＴＸ遺伝子から生成してもよい。したがって、ＡＴＸのアミノ酸配列が、配列番号１に記載の遺伝子配列に対応していてもよい。 ATX may be produced from the human-derived ATX gene set forth in SEQ ID NO:1. Therefore, the amino acid sequence of ATX may correspond to the gene sequence set forth in SEQ ID NO:1.
　あるいは、ＡＴＸがリゾホスファチジルコリンを加水分解する活性を有する範囲内で、ＡＴＸのアミノ酸配列が、配列番号１に記載の遺伝子配列と９０％以上の同一性を有する遺伝子配列に対応していてもよい。 Alternatively, the amino acid sequence of ATX may correspond to a gene sequence having 90% or more identity with the gene sequence set forth in SEQ ID NO: 1, as long as ATX has the activity of hydrolyzing lysophosphatidylcholine.
　あるいは、ＡＴＸがリゾホスファチジルコリンを加水分解する活性を有する範囲内で、ＡＴＸのアミノ酸配列が、配列番号１に記載の遺伝子配列において、１又は数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された遺伝子配列に対応していてもよい。 Alternatively, the amino acid sequence of ATX is a gene in which one or several bases are deleted, substituted, or added in the gene sequence shown in SEQ ID NO: 1 within the range where ATX has the activity of hydrolyzing lysophosphatidylcholine. May correspond to an array.
　キャリブレーターにおけるＡＴＸの濃度は、適正な既知量であることが好ましい。ＡＴＸ活性及び／又は質量を測定することで疾病の診断やリスクを判断する場合、キャリブレーターにおけるＡＴＸの濃度は、臨床上の精度が求められている範囲の濃度であることが好ましい。キャリブレーターを分析機器の精度を管理する目的で使用する場合、キャリブレーターにおけるＡＴＸの濃度は、測定可能範囲の上限又は下限に近い濃度であることが好ましい。 The concentration of ATX in the calibrator is preferably an appropriate known amount. When diagnosing a disease or judging risk by measuring ATX activity and/or mass, the concentration of ATX in the calibrator is preferably within the range where clinical accuracy is required. When a calibrator is used for the purpose of controlling the accuracy of an analytical instrument, the concentration of ATX in the calibrator is preferably close to the upper or lower limit of the measurable range.
　キャリブレーターにおけるＡＴＸの濃度は、例えば、５Ｕ／Ｌ以上５０Ｕ／Ｌ以下、５Ｕ／Ｌ以上３０Ｕ／Ｌ以下、５Ｕ／Ｌ以上２０Ｕ／Ｌ以下、あるいは５Ｕ／Ｌ以上１６Ｕ／Ｌ以下である。 The concentration of ATX in the calibrator is, for example, 5 U/L or more and 50 U/L or less, 5 U/L or more and 30 U/L or less, 5 U/L or more and 20 U/L or less, or 5 U/L or more and 16 U/L or less.
　あるいは、キャリブレーターにおけるＡＴＸの濃度は、例えば、０．０５ｍｇ／Ｌ以上１０ｍｇ／Ｌ以下、０．０５ｍｇ／Ｌ以上５ｍｇ／Ｌ以下、０．０５ｍｇ／Ｌ以上３ｍｇ／Ｌ以下、あるいは０．０５ｍｇ／Ｌ以上１ｍｇ／Ｌ以下である。 Alternatively, the concentration of ATX in the calibrator is, for example, 0.05 mg/L or more and 10 mg/L or less, 0.05 mg/L or more and 5 mg/L or less, 0.05 mg/L or more and 3 mg/L or less, or 0.05 mg/L It is more than 1 mg/L or less.
　キャリブレーターに含まれる血清又は血漿は、例えば、ヒト由来である。血清又は血漿が、健常人由来であってもよい。 The serum or plasma contained in the calibrator is, for example, human-derived. Serum or plasma may be from healthy individuals.
　キャリブレーターにおける血清の濃度は、例えば、３０．０％（ｗ／ｖ）以上９９．５％以下、５０％以上９９．５％以下、あるいは８０％以上９９．５％以下である。また、キャリブレーターにおける血漿の濃度は、例えば、３０．０％（ｗ／ｖ）以上９９．５％以下、５０％以上９９．５％以下、あるいは８０％以上９９．５％以下である。 The serum concentration in the calibrator is, for example, 30.0% (w/v) or more and 99.5% or less, 50% or more and 99.5% or less, or 80% or more and 99.5% or less. In addition, the plasma concentration in the calibrator is, for example, 30.0% (w/v) or more and 99.5% or less, 50% or more and 99.5% or less, or 80% or more and 99.5% or less.
　キャリブレーターに含まれる糖アルコールの例としては、サッカロース、トレハロース、マンニトール、及びソルビトールが挙げられるが、特に限定されない。 Examples of sugar alcohols contained in calibrators include, but are not limited to, saccharose, trehalose, mannitol, and sorbitol.
　キャリブレーターにおける糖アルコールの濃度は、例えば、０．５質量％以上２０質量％以下、あるいは０．５質量％以上１０質量％以下である。 The concentration of the sugar alcohol in the calibrator is, for example, 0.5% by mass or more and 20% by mass or less, or 0.5% by mass or more and 10% by mass or less.
　実施形態に係るオートタキシン測定試薬のキャリブレーターは、凍結乾燥試薬であってもよい。 The calibrator of the autotaxin measurement reagent according to the embodiment may be a freeze-dried reagent.
　検体の測定値や分析機器の精度管理が適正であるためには、キャリブレーターに含まれるＡＴＸの活性又は質量が、初期値から変化していないこと、すなわち、数ヶ月あるいは年単位で様々な条件で保存されたキャリブレーターに含まれるＡＴＸの活性又は質量が、長期間同一とみなせることが望まれる。これに対し、実施形態に係るオートタキシン測定試薬のキャリブレーターは、安定化剤として、血清及び血漿の少なくともいずれかと、糖アルコールと、を含むことにより、様々な保存条件下で、ＡＴＸの活性及び質量を、長期間維持することが可能である。 In order for the measured values of specimens and the quality control of analytical instruments to be appropriate, the activity or mass of ATX contained in the calibrator must not change from the initial value, that is, under various conditions over several months or years. It is desired that the activity or mass of ATX contained in stored calibrators can be considered the same over time. On the other hand, the autotaxin measuring reagent calibrator according to the embodiment contains at least one of serum and plasma and sugar alcohol as stabilizers, so that the activity and mass of ATX can be reduced under various storage conditions. can be maintained for a long period of time.
　実施形態に係るＡＴＸ測定試薬のキャリブレーション方法は、ＡＴＸ測定試薬を用いて、上述した実施形態に係るＡＴＸ測定試薬のキャリブレーターに含まれるＡＴＸを測定することを含む。上述したように、実施形態に係るキャリブレーターにおいては、ＡＴＸの活性及び質量が、長期保存を経ても変化しにくい。したがって、実施形態に係るキャリブレーターにおけるＡＴＸの活性及び質量は、既知の初期値を維持しているとみなせる。よって、当該初期値と、ＡＴＸ測定試薬で測定されたＡＴＸの活性及び／又は質量の測定値と、に基づいて、ＡＴＸ測定試薬の測定能をキャリブレーションすることが可能である。 A method for calibrating an ATX measuring reagent according to an embodiment includes measuring ATX contained in a calibrator of an ATX measuring reagent according to the above-described embodiment using an ATX measuring reagent. As described above, in the calibrator according to the embodiment, the ATX activity and mass are less likely to change even after long-term storage. Therefore, it can be considered that the ATX activity and mass in the calibrator according to the embodiment are maintained at known initial values. Therefore, it is possible to calibrate the measurement ability of the ATX measurement reagent based on the initial value and the measured value of the ATX activity and/or mass measured with the ATX measurement reagent.
　実施形態に係るＡＴＸ測定試薬のキャリブレーション方法において、ＡＴＸの活性と質量との関係を表す、予め取得された１次関数を用いて、キャリブレーターに含まれるＡＴＸの活性の測定値から、キャリブレーターに含まれるＡＴＸの質量を算出してもよい。 In the method for calibrating the ATX measurement reagent according to the embodiment, the measured value of the activity of ATX contained in the calibrator is calculated from the measured value of the activity of ATX contained in the calibrator using a linear function obtained in advance, which represents the relationship between the activity and the mass of ATX. You may calculate the mass of ATX that is stored.
　上述したように、ＡＴＸを測定する様々な方法がある。したがって、実施形態に係るＡＴＸ測定試薬のキャリブレーション方法において、ＡＴＸ測定試薬は、ＡＴＸを測定できれば、特に限定されない。ＡＴＸ測定試薬は、リゾホスファチジルコリンを含んでいてもよい。リゾホスファチジルコリンは、ミリストイルリゾホスファチジルコリンであってもよい。 As mentioned above, there are various ways to measure ATX. Therefore, in the calibration method for the ATX measurement reagent according to the embodiment, the ATX measurement reagent is not particularly limited as long as it can measure ATX. The ATX measurement reagent may contain lysophosphatidylcholine. The lysophosphatidylcholine may be myristoyl lysophosphatidylcholine.
　実施形態に係るＡＴＸ測定キットは、上述したＡＴＸ測定試薬のキャリブレーターと、ＡＴＸ測定試薬と、を含む。ＡＴＸ測定試薬で検体のＡＴＸを測定する前に、上述したように、ＡＴＸ測定試薬でキャリブレーターに含まれるＡＴＸを測定することにより、ＡＴＸ測定試薬の測定能をキャリブレーションすることが可能である。 The ATX measurement kit according to the embodiment includes the above-described ATX measurement reagent calibrator and ATX measurement reagent. Before measuring the ATX of the specimen with the ATX measuring reagent, it is possible to calibrate the measuring ability of the ATX measuring reagent by measuring the ATX contained in the calibrator with the ATX measuring reagent as described above.
　実施形態に係るＡＴＸの測定方法は、（ａ）ＡＴＸ測定試薬を用いて、上述したＡＴＸ測定試薬のキャリブレーターに含まれるＡＴＸを測定することと、（ｂ）ＡＴＸ測定試薬を用いて、検体に含まれるＡＴＸを測定することと、（ｃ）キャリブレーターに含まれるＡＴＸの測定値を用いて、検体に含まれるＡＴＸの測定値を補正することと、を含む。 A method for measuring ATX according to an embodiment includes (a) measuring ATX contained in the above-described ATX measuring reagent calibrator using an ATX measuring reagent, and (b) measuring ATX contained in a sample using the ATX measuring reagent. (c) correcting the measured ATX contained in the sample using the measured ATX contained in the calibrator.
　測定値は、活性であってもよいし、質量であってもよい。例えば、キャリブレーターに含まれるＡＴＸの既知の活性、質量、又は濃度と、キャリブレーターに含まれるＡＴＸの測定値と、の関係を用いて、検体に含まれるＡＴＸの測定値を補正してもよい。例えば、キャリブレーターに含まれるＡＴＸの既知の活性、質量、又は濃度と、キャリブレーターに含まれるＡＴＸの測定値と、の比を用いて、検体に含まれるＡＴＸの測定値を補正してもよい。測定値が活性である場合、ＡＴＸの活性と質量との関係を表す、予め取得された１次関数を用いて、検体に含まれるＡＴＸの活性の補正された測定値から、検体に含まれるＡＴＸの質量を算出してもよい。 The measured value may be activity or mass. For example, the relationship between the known activity, mass, or concentration of ATX contained in the calibrator and the measured value of ATX contained in the calibrator may be used to correct the measured value of ATX contained in the sample. For example, the ratio of the known activity, mass, or concentration of ATX contained in the calibrator and the measured value of ATX contained in the calibrator may be used to correct the measured value of ATX contained in the sample. If the measured value is activity, ATX contained in the sample is obtained from the corrected measured value of the activity of ATX contained in the sample using a previously acquired linear function representing the relationship between the activity and mass of ATX. You may calculate the mass of.
　実施形態に係る診断補助キットは、上述したＡＴＸ測定試薬のキャリブレーターと、ＡＴＸ測定試薬と、を含む。上述したように、ＡＴＸ測定試薬で検体のＡＴＸを測定する前に、ＡＴＸ測定試薬でキャリブレーターに含まれるＡＴＸを測定することにより、ＡＴＸ測定試薬の測定能をキャリブレーションすることが可能である。そのため、検体に含まれるＡＴＸの活性及び／又は質量を、正確に評価することが可能である。よって、検体に含まれるＡＴＸの活性及び／又は質量から、検体の提供者の疾患を正確に診断補助することが可能である。 The diagnostic aid kit according to the embodiment includes the above-described ATX measurement reagent calibrator and ATX measurement reagent. As described above, it is possible to calibrate the measurement ability of the ATX measurement reagent by measuring ATX contained in the calibrator with the ATX measurement reagent before measuring ATX of the sample with the ATX measurement reagent. Therefore, it is possible to accurately evaluate the activity and/or mass of ATX contained in the sample. Therefore, the activity and/or mass of ATX contained in the sample can be used to accurately assist the diagnosis of the sample provider's disease.
　実施形態に係る診断補助キットの診断補助対象の疾患の例としては、肝線維化、慢性肝疾患、悪性リンパ腫、膵疾患、心臓病、甲状腺疾患、及び神経障害が挙げられるが、特に限定されない。心臓病の例としては、心不全、うっ血性心不全、及び拡張型心筋症が挙げられるが、特に限定されない。甲状腺疾患の例としては、甲状腺機能亢進症、及びバセドウ病が挙げられるが、特に限定されない。神経障害の例としては、帯状疱疹後神経痛、腰部癒着性くも膜炎、胸部脊髄炎、腰椎神経根障害、頸椎症性脊髄症、化学療法誘発性末梢神経障害、栄養代謝性多発神経障害、及び頚髄軟化症が挙げられるが、特に限定されない。 Examples of diseases for which the diagnosis aid kit according to the embodiment can provide diagnostic assistance include, but are not limited to, liver fibrosis, chronic liver disease, malignant lymphoma, pancreatic disease, heart disease, thyroid disease, and neuropathy. Examples of heart disease include, but are not limited to, heart failure, congestive heart failure, and dilated cardiomyopathy. Examples of thyroid diseases include, but are not limited to, hyperthyroidism and Graves' disease. Examples of neuropathies include postherpetic neuralgia, lumbar adhesive arachnoiditis, thoracic myelitis, lumbar radiculopathy, cervical spondylotic myelopathy, chemotherapy-induced peripheral neuropathy, nutrient-metabolic polyneuropathy, and cervical cancer. Examples include, but are not limited to, myelomalacia.
　実施形態に係る診断補助キットの診断補助対象の疾患の例としては、中枢神経への癌細胞の浸潤が挙げられるが、特に限定されない。癌細胞は、造血器腫瘍由来であってもよいが、特に限定されない。造血器腫瘍は、リンパ腫であってもよいが、特に限定されない。 An example of a disease for which diagnostic assistance is to be provided by the diagnostic aid kit according to the embodiment includes infiltration of cancer cells into the central nervous system, but is not particularly limited. Cancer cells may be derived from hematopoietic tumors, but are not particularly limited. A hematopoietic tumor may be a lymphoma, but is not particularly limited.
　実施形態に係る診断補助キットの診断補助対象は、妊娠又は妊娠高血圧症候群であってもよいが、特に限定されない。 The diagnostic assistance target of the diagnostic assistance kit according to the embodiment may be pregnancy or pregnancy-induced hypertension syndrome, but is not particularly limited.
　実施形態に係る診断補助方法は、（ａ）ＡＴＸ測定試薬を用いて、上述したＡＴＸ測定試薬のキャリブレーターに含まれるＡＴＸを測定することと、（ｂ）ＡＴＸ測定試薬を用いて、検体に含まれるＡＴＸを測定することと、（ｃ）キャリブレーターに含まれるＡＴＸの測定値を用いて、検体に含まれるＡＴＸの測定値を補正することと、（ｄ）検体に含まれるＡＴＸの補正された測定値に基づき、疾患を特定することと、を含む。 The method for assisting diagnosis according to the embodiment includes (a) measuring ATX contained in the calibrator of the ATX measuring reagent described above using the ATX measuring reagent, and (b) using the ATX measuring reagent to measure ATX contained in the specimen. (c) correcting the measured value of ATX contained in the specimen using the measured value of ATX contained in the calibrator; and (d) the corrected measured value of ATX contained in the specimen. and identifying the disease based on.
　測定値は、活性であってもよいし、質量であってもよい。測定値が活性である場合、ＡＴＸの活性と質量との関係を表す、予め取得された１次関数を用いて、検体に含まれるＡＴＸの活性の補正された測定値から、検体に含まれるＡＴＸの質量を算出してもよい。 The measured value may be activity or mass. If the measured value is activity, ATX contained in the sample is obtained from the corrected measured value of the activity of ATX contained in the sample using a previously acquired linear function representing the relationship between the activity and mass of ATX. You may calculate the mass of.
　ＡＴＸの活性は、例えば、ＬＰＣ（ｌｙｓｏｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）から遊離するコリンを測定することにより、測定することができる。反応は、１００μＬの反応系で行うことができる。例えば、１００ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ　９．０）、５００ｍｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ、５ｍｍｏｌ／ＬのＭｇＣｌ２、５ｍｍｏｌ／ＬのＣａＣｌ２、及び０．０５％のＴｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００存在下、２０μＬのＡＴＸを含むサンプルを２ｍｍｏｌ／Ｌの１－ｍｙｒｉｓｔｏｙｌ（１４：０）－ＬＰＣと３７℃で３時間反応させる。遊離したコリンを、コリンオキシダーゼ、西洋わさびペルオキシダーゼ、及びＴＯＯＳ試薬を用いて、吸光分光測定装置により検出することで、サンプル中のＡＴＸの活性を測定することが可能である。以下の実施例においても、当該方法を用いてＡＴＸの活性を測定した。 ATX activity can be measured, for example, by measuring choline liberated from LPC (lysophosphatidylcholine). Reactions can be performed in 100 μL reaction systems. For example, 20 μL in the presence of 100 mmol/L Tris-HCl (pH 9.0), 500 mmol/L NaCl, 5 mmol/L MgCl 2 , 5 mmol/L CaCl 2 and 0.05% Triton X-100. of ATX is reacted with 2 mmol/L of 1-myristoyl (14:0)-LPC at 37° C. for 3 hours. ATX activity in a sample can be measured by detecting liberated choline with an absorption spectrometer using choline oxidase, horseradish peroxidase, and TOOS reagent. In the following examples, the ATX activity was also measured using this method.
　ＡＴＸの濃度は、例えば、免疫学的検定により測定することができる。例えば、第１のセル及び第２のセルを用意する。第１のセルに、磁性微粒子に固定された抗ＡＴＸラットモノクローナル抗体を含む凍結乾燥組成物を入れる。第２のセルに、アルカリ性ホスファターゼで標識された抗ＡＴＸラットモノクローナル抗体の凍結乾燥組成物を入れる。第１のセルに、水とＡＴＸを含むサンプルを入れて、凍結乾燥組成物を溶解する。また、第２のセルに、水を入れて、凍結乾燥組成物を溶解する。第１のセルにおいて凍結乾燥組成物が溶解すると、磁性微粒子に固定された抗ＡＴＸラットモノクローナル抗体と、ＡＴＸと、の第１反応が開始する。一定時間、一定温度で反応させたのち、洗浄水で洗浄することにより、未反応のＡＴＸを除去する。次に、第２のセルの内容物を第２のセルに移すことにより、アルカリ性ホスファターゼで標識された抗ＡＴＸラットモノクローナル抗体と、ＡＴＸと、の第２反応が開始する。一定時間、一定温度で反応させたのち、洗浄水で洗浄することにより、未反応のアルカリ性ホスファターゼで標識された抗ＡＴＸラットモノクローナル抗体を除去する。その後、ＡＴＸの基質として3-(5-tert-Butyl-4,4-dimethyl-2,6,7-trioxabicyclo[3.2.0]hept-1-yl) phenylphosphate disodium saltを第２のセルに添加し、ＡＴＸにより基質が分解することにより生じる発光の強度を測定することにより、サンプル中のＡＴＸの濃度を測定することが可能である。以下の実施例においても、当該方法を用いてＡＴＸの濃度を測定した。 The concentration of ATX can be measured, for example, by an immunoassay. For example, a first cell and a second cell are prepared. A first cell contains a lyophilized composition comprising an anti-ATX rat monoclonal antibody immobilized on magnetic microparticles. A second cell contains a lyophilized composition of anti-ATX rat monoclonal antibody labeled with alkaline phosphatase. A first cell is filled with a sample containing water and ATX to dissolve the lyophilized composition. The second cell is also filled with water to dissolve the lyophilized composition. Dissolution of the lyophilized composition in the first cell initiates a first reaction between the anti-ATX rat monoclonal antibody immobilized on the magnetic microparticles and ATX. After reacting at a constant temperature for a certain period of time, unreacted ATX is removed by washing with washing water. A second reaction between the alkaline phosphatase-labeled anti-ATX rat monoclonal antibody and ATX is then initiated by transferring the contents of the second cell to the second cell. After reacting at a constant temperature for a certain period of time, unreacted alkaline phosphatase-labeled anti-ATX rat monoclonal antibody is removed by washing with washing water. Then, 3-(5-tert-Butyl-4,4-dimethyl-2,6,7-trioxabicyclo[3.2.0]hept-1-yl)phenylphosphate disodium salt was added to the second cell as a substrate for ATX. , the concentration of ATX in the sample can be determined by measuring the intensity of luminescence produced by the decomposition of the substrate by ATX. Also in the following examples, the concentration of ATX was measured using this method.
　以下、本発明を実施例及び参考例（以下、「実施例等」と呼ぶことがある。）により更に具体的に説明するが、本発明の範囲は以下の実施例等に限定されるものではない。例えば、本実施例等における「キャリブレーター」、「糖アルコール」、及び「キット」とは、本発明の一具体例にすぎず、本発明の範囲を何ら限定するものではない。また、遺伝子操作技術は、例えばマニアティスらの方法（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，ｅｔ　ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　１９８２年、１９８９年）、基礎から学ぶ遺伝子工学（第２版、田村隆明、２０１７年、羊土社）、遺伝子工学（野島博、２０１３年、東京化学同人）、蛋白質・酵素の基礎実験法（改訂第２版、堀尾武一、１９９４年南光堂）、国際公開第２０１３／０６５７７２号、及び市販の各種酵素、キット類に添付された手順書等に従えば実施できるものである。 Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples and reference examples (hereinafter sometimes referred to as "examples, etc."), but the scope of the present invention is not limited to the following examples, etc. do not have. For example, the “calibrators”, “sugar alcohols” and “kits” in the Examples and the like are only specific examples of the present invention and do not limit the scope of the present invention. In addition, genetic manipulation techniques include, for example, the method of Maniatis et al. 2013, Yodosha), Genetic Engineering (Hiroshi Nojima, 2013, Tokyo Kagaku Dojin), Basic Experimental Methods for Proteins and Enzymes (Revised 2nd Edition, Takekazu Horio, Nankodo, 1994), International Publication No. 2013/065772 No. 1, various commercially available enzymes, and the procedures attached to the kits can be followed.
　文中の略語は下記の意味を示す。
　ＡＴＸ：オートタキシン（Ａｕｔｏｔａｘｉｎ）
　ＳＤＳ：ドデシル硫酸ナトリウム（Ｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ）
　ＰＡＧＥ：ポリアクリルアミドゲル電気泳動（Ｐｏｌｙ　Ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ　Ｇｅｌ　Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ） Abbreviations in the text have the following meanings.
ATX: Autotaxin
SDS: Sodium dodecyl sulfate
PAGE: Poly Acrylamide Gel Electrophoresis
　（参考例１：ヒト由来ＡＴＸを４℃から１０℃で保存した場合のＡＴＸの活性の変化）
　１０　ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）に溶解した５Ｕ／ｍＬから６Ｕ／ｍＬのヒト由来ＡＴＸを約４℃から１０℃で２日間冷蔵保存し、当該ヒト由来ＡＴＸの活性の変化を測定した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
   (Reference Example 1: Changes in ATX activity when human-derived ATX is stored at 4°C to 10°C)
5 U/mL to 6 U/mL human-derived ATX dissolved in 10 mmol/L Tris-HCl (pH 7.5) was refrigerated at about 4° C. to 10° C. for 2 days, and changes in activity of the human-derived ATX were observed. It was measured.
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　表１に示すように、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌに溶解した約５Ｕ／ｍＬから６Ｕ／ｍＬのヒト由来ＡＴＸを約４℃から１０℃で７日間冷蔵保存したところ、ヒト由来ＡＴＸの活性が約１０％低下した。 As shown in Table 1, when approximately 5 U/mL to 6 U/mL of human ATX dissolved in Tris-HCl was refrigerated at approximately 4°C to 10°C for 7 days, the activity of human ATX decreased by approximately 10%. did.
　（参考例２：安定化剤として血清を用いてヒト由来ＡＴＸを約１０℃で保存した場合の活性の変化）
　３Ｕ／Ｌから５Ｕ／Ｌのヒト由来ＡＴＸを、安定化剤として市販の第１の血清製品及び第２の血清製品を用いて約１０℃で２ヶ月間冷蔵保存し、当該ヒト由来ＡＴＸの活性の変化を測定した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
   (Reference Example 2: Change in activity when human-derived ATX is stored at about 10°C using serum as a stabilizer)
3 U/L to 5 U/L of human-derived ATX is stored refrigerated at about 10° C. for 2 months using the commercially available first serum product and second serum product as stabilizers, and the activity of the human-derived ATX is measured. was measured.
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　表２に示すように、３Ｕ／Ｌから５Ｕ／Ｌのヒト由来ＡＴＸを、安定化剤として市販の第１の血清製品及び第２の血清製品を用いて約１０℃で２ヶ月間冷蔵保存したところ、ヒト由来ＡＴＸの活性が約１０％低下した。したがって、安定化剤として血清のみを用いると、長期冷蔵保存により、ＡＴＸの活性が低下することが示された。 As shown in Table 2, 3 U/L to 5 U/L of human-derived ATX was stored refrigerated at about 10° C. for 2 months using commercial primary and secondary serum products as stabilizers. However, the activity of human-derived ATX decreased by about 10%. Therefore, it was shown that long-term refrigerated storage reduces the activity of ATX when serum alone is used as a stabilizer.
　（参考例３：ヒト由来ＡＴＸを約－２０℃及び約－４０℃で凍結保存した場合の活性の変化）
　５Ｕ／ｍＬから６Ｕ／ｍＬのヒト由来ＡＴＸを約－２０℃及び約－４０℃で７日間凍結保存し、当該ヒト由来ＡＴＸの活性の変化を測定した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
   (Reference Example 3: Changes in activity when human-derived ATX is cryopreserved at about -20°C and about -40°C)
Human-derived ATX at 5 U/mL to 6 U/mL was cryopreserved at about −20° C. and about −40° C. for 7 days, and changes in activity of the human-derived ATX were measured.
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　表３に示すように、５Ｕ／ｍＬから６Ｕ／ｍＬのヒト由来ＡＴＸを約－２０℃及び約－４０℃で７日間凍結保存したところ、ヒト由来ＡＴＸの活性が約１０％低下した。 As shown in Table 3, when 5 U/mL to 6 U/mL of human-derived ATX was cryopreserved at about -20°C and about -40°C for 7 days, the activity of human-derived ATX decreased by about 10%.
　（参考例４：安定化剤としてヒトγグロブリンを用いてヒト由来ＡＴＸを約－１０℃で保存した場合の活性の変化）
　安定化剤としてヒトγグロブリンを用いて、３Ｕ／Ｌから４Ｕ／Ｌのヒト由来ＡＴＸを約－１０℃で１週間凍結保存し、当該ヒト由来ＡＴＸの活性の変化を測定した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
   (Reference Example 4: Activity change when human-derived ATX is stored at about -10°C using human γ globulin as a stabilizer)
Using human γ globulin as a stabilizer, 3 U/L to 4 U/L of human-derived ATX was cryopreserved at about −10° C. for 1 week, and changes in activity of the human-derived ATX were measured.
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　表４に示すように、安定化剤としてヒトγグロブリンを用いて、３Ｕ／Ｌから４Ｕ／Ｌのヒト由来ＡＴＸを約－１０℃で１週間凍結保存したところ、ヒト由来ＡＴＸの活性が約２５％低下した。したがって、安定化剤としてヒトγグロブリンのみを用いると、長期凍結保存により、ＡＴＸの活性が低下することが示された。 As shown in Table 4, 3 U/L to 4 U/L of human-derived ATX was cryopreserved at about −10° C. for 1 week using human γ globulin as a stabilizer. % decreased. Therefore, it was shown that long-term cryopreservation reduces the activity of ATX when human gamma globulin alone is used as a stabilizing agent.
　（参考例５：安定化剤として血清を用いてヒト由来ＡＴＸを約－１５℃で保存した場合の活性の変化）
　安定化剤として市販の第１の血清製品及び第２の血清製品を用いて、３Ｕ／Ｌから５Ｕ／Ｌのヒト由来ＡＴＸを約－１５℃で８週間凍結保存し、当該ヒト由来ＡＴＸの活性の変化を測定した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
   (Reference Example 5: Changes in activity when human-derived ATX is stored at about -15°C using serum as a stabilizer)
Using the commercially available first serum product and second serum product as stabilizers, 3 U / L to 5 U / L of human-derived ATX is frozen at about -15 ° C. for 8 weeks, and the activity of the human-derived ATX was measured.
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　表５に示すように、安定化剤として市販の第１の血清製品及び第２の血清製品を用いて３Ｕ／Ｌから５Ｕ／Ｌのヒト由来ＡＴＸを約－１５℃で７週間凍結保存したところ、ヒト由来ＡＴＸの活性が約４０％から５０％低下した。したがって、安定化剤として血清のみを用いると、長期凍結保存により、ＡＴＸの活性が低下することが示された。 As shown in Table 5, 3 U/L to 5 U/L of human-derived ATX was cryopreserved at about -15°C for 7 weeks using the commercially available first and second serum products as stabilizers. , the activity of human-derived ATX was reduced by about 40% to 50%. Therefore, it was shown that long-term cryopreservation reduces the activity of ATX when serum alone is used as a stabilizing agent.
　（参考例６：安定化剤として糖アルコールを用いてヒト由来ＡＴＸを凍結乾燥し約４℃から１０℃で保存した場合の活性の変化）
　安定化剤として糖アルコールを用いてヒト由来ＡＴＸを凍結乾燥し、約４℃から１０℃で当該ヒト由来ＡＴＸを１９７日間保存し、当該ヒト由来ＡＴＸの活性の変化を測定した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
   (Reference Example 6: Changes in activity when human-derived ATX is freeze-dried using a sugar alcohol as a stabilizer and stored at about 4°C to 10°C)
Human-derived ATX was freeze-dried using a sugar alcohol as a stabilizer, stored at about 4° C. to 10° C. for 197 days, and changes in activity of the human-derived ATX were measured.
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　表６に示すように、保存期間０日で凍結乾燥組成物を復水した後のヒト由来ＡＴＸの活性は、約４Ｕ／Ｌであった。安定化剤としてトレハロース、サッカロース、ラクトース又はマンノースを用いてヒト由来ＡＴＸを凍結乾燥し、約４℃から１０℃で１９７日間保存したところ、ヒト由来ＡＴＸの活性は表６に記載のとおりであった。 As shown in Table 6, the activity of human-derived ATX after rehydration of the freeze-dried composition with a storage period of 0 days was about 4 U/L. Human ATX was lyophilized using trehalose, saccharose, lactose or mannose as a stabilizer and stored at about 4°C to 10°C for 197 days. .
　（参考例７：安定化剤として血清を用いてヒト由来ＡＴＸを凍結乾燥し約４℃から１０℃で保存した場合の活性の変化）
　安定化剤として血清を用いてヒト由来ＡＴＸを凍結乾燥し、当該ヒト由来ＡＴＸを約４℃から１０℃で３カ月間保存し、当該ヒト由来ＡＴＸの活性の変化を測定した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
   (Reference Example 7: Changes in activity when human-derived ATX is freeze-dried using serum as a stabilizer and stored at about 4°C to 10°C)
Human-derived ATX was lyophilized using serum as a stabilizer, stored at about 4° C. to 10° C. for 3 months, and changes in activity of the human-derived ATX were measured.
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　表７に示すように、安定化剤として血清を用いてヒト由来ＡＴＸを凍結乾燥し、当該ヒト由来ＡＴＸを約４℃から１０℃で３カ月間保存したところ、ヒト由来ＡＴＸの活性が約１５％低下した。したがって、安定化剤として血清のみを用いると、長期凍結保存により、ＡＴＸの活性が低下することが示された。 As shown in Table 7, human-derived ATX was lyophilized using serum as a stabilizer and stored at about 4°C to 10°C for 3 months. % decreased. Therefore, it was shown that long-term cryopreservation reduces the activity of ATX when serum alone is used as a stabilizing agent.
　［実施例１：キャリブレーター及び検体に含まれるＡＴＸの活性測定方法］
　キャリブレーター及び検体に含まれるＡＴＸの活性は、特に断りがない限り、Ｎａｋａｍｕｒａ　Ｋ　ｅｔ　ａｌ．　Ｃｌｉｎ　Ｃｈｉｍ　Ａｃｔａ．，　３８８（１－２），　５１－５８（２００８）に記載の方法を用いて測定した。具体的には、１００ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ　９．０）、５００ｍｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ、５ｍｍｏｌ／ＬのＭｇＣｌ２、５ｍｍｏｌ／ＬのＣａＣｌ２、及び０．０５％のＴｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００存在下、２０μＬのＡＴＸを含むサンプルを２ｍｍｏｌ／Ｌの１－ｍｙｒｉｓｔｏｙｌ（１４：０）－ＬＰＣと３７℃で３時間反応させた。遊離したコリンを、コリンオキシダーゼ、西洋わさびペルオキシダーゼ、及びＴＯＯＳ試薬を用いて、吸光分光測定装置により検出して、サンプル中のＡＴＸの活性を測定した。なお本実施例において、（Ｕ／Ｌ）は（ｎｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍＬ）と表現する場合もある。 [Example 1: Method for measuring activity of ATX contained in calibrator and sample]
Unless otherwise specified, the activity of ATX contained in the calibrator and sample was determined according to Nakamura K et al. Clin Chim Acta. , 388(1-2), 51-58 (2008). Specifically, 100 mmol/L Tris-HCl (pH 9.0), 500 mmol/L NaCl, 5 mmol/L MgCl 2 , 5 mmol/L CaCl 2 , and 0.05% Triton X-100 present. Below, a sample containing 20 μL of ATX was reacted with 2 mmol/L of 1-myristoyl (14:0)-LPC at 37° C. for 3 hours. Released choline was detected by an absorption spectrophotometer using choline oxidase, horseradish peroxidase, and TOOS reagents to measure the activity of ATX in the samples. In this example, (U/L) may be expressed as (nmol/min/mL).
　本活性測定方法で、ＡＴＸの活性又は質量の測定においてキャリブレーターとして使用するための組成物に含まれるＡＴＸの活性（Ｕ／Ｌ）を測定することができることを確認した。 It was confirmed that this activity measurement method can measure the activity (U/L) of ATX contained in a composition to be used as a calibrator in measuring the activity or mass of ATX.
　［実施例２：ヒト由来組換えＡＴＸの製造方法］
　配列番号１に記載のヒト由来ＡＴＸ遺伝子を全合成した。全合成した配列をｐＯｐｔｉＶＥＣ－ＴＯＰＯベクター（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にクローニングし、ＡＴＸ発現ベクターを得た。得られた発現ベクターをチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてトランスフェクションした。得られた細胞をＲ　Ｔ　Ｓｃｈｉｍｋｅ　ｅｔ　ａｌ．　Ｂｒ　Ｊ　Ｃａｎｃｅｒ．，　５１（４）　４５９－４６５（１０８５）に記載の方法に従い、ＡＴＸ遺伝子の増幅を行い、ＡＴＸ産生細胞を得た。 [Example 2: Method for producing human-derived recombinant ATX]
The human-derived ATX gene shown in SEQ ID NO: 1 was totally synthesized. The fully synthesized sequence was cloned into the pOptiVEC-TOPO vector (ThermoFisher Scientific) resulting in an ATX expression vector. The resulting expression vector was transfected into Chinese hamster ovary cells (CHO cells) using Lipofectamine2000 (ThermoFisher Scientific). The resulting cells were analyzed according to RT Schimke et al. Br J Cancer. , 51(4) 459-465 (1085), the ATX gene was amplified to obtain ATX-producing cells.
　ＡＴＸ産生細胞を４ｍｍｏｌ／ＬのＬ－アラニル－Ｌ－グルタミンを含む１２ｍＬのＣＨＯ細胞用無血清培地（ＢａｌａｎＣＤ　ＣＨＯ　ＧＲＯＷＴＨ　Ａ、富士フイルム和光純薬）に懸濁し、２５０ｍＬ容量のＴフラスコにて３７℃、５％ＣＯ２条件で１週間、ＡＴＸ産生細胞を培養した。培養液全量に４ｍｍｏｌ／ＬのＬ－アラニル－Ｌ－グルタミンを含む１６０ｍＬのＣＨＯ細胞用無血清培地（ＢａｌａｎＣＤ　ＣＨＯ　ＧＲＯＷＴＨ　Ａ、富士フイルム和光純薬）に懸濁し、８００ｍＬ容量Ｔフラスコ２本に等量ずつわけ、３７℃、５％ＣＯ２条件で１週間、ＡＴＸ産生細胞を培養した。 ATX-producing cells were suspended in 12 mL of serum-free medium for CHO cells (BalanCD CHO GROWTH A, Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) containing 4 mmol/L of L-alanyl-L-glutamine, and incubated at 37°C in a 250 mL T-flask. , cultured ATX-producing cells for 1 week in 5% CO2 conditions. Suspended in 160 mL of serum-free medium for CHO cells (BalanCD CHO GROWTH A, Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) containing 4 mmol/L of L-alanyl-L-glutamine in the total volume of the culture solution, and an equal amount was added to two 800 mL T-flasks. The ATX-producing cells were cultured separately at 37° C., 5% CO 2 for 1 week.
　得られたＡＴＸ産生細胞を含む培養液をＲｅａｄｙＴｏＰｒｏｃｅｓｓＷＡＶＥ２５（Ｃｙｔｉｖａ）の手順に従い、ＣＥＬＬＢＡＧ２２Ｌ／ｐＨＯＰＴ，ＤＯＯＰＴ（Ｃｙｔｉｖａ）に無菌的に移送し、４ｍｍｏｌ／ＬのＬ－アラニル－Ｌ－グルタミンを含む１ＬのＣＨＯ細胞用無血清培地（ＢａｌａｎＣＤ　ＣＨＯ　ＧＲＯＷＴＨ　Ａ、富士フイルム和光純薬）をさらに移送した。３７℃、５％ＣＯ２、攪拌速度１５ｒｐｍ、振盪角度６°、０．２Ｌ／ｍｉｎのガスフローの条件で１週間、ＡＴＸ産生細胞を培養した。１週間後さらに９Ｌの４ｍｍｏｌ／ＬのＬ－アラニル－Ｌ－グルタミンを含むＣＨＯ細胞用無血清培地（ＢａｌａｎＣＤ　ＣＨＯ　ＧＲＯＷＴＨ　Ａ、富士フイルム和光純薬）を移送し、２週間、ＡＴＸ産生細胞を培養した。 The resulting culture medium containing ATX-producing cells was aseptically transferred to CELLBAG22L/pHOPT, DOOPT (Cytiva) according to the procedure of ReadyToProcessWAVE25 (Cytiva), and 1 L of CHO containing 4 mmol/L of L-alanyl-L-glutamine was added. Cell serum-free medium (BalanCD CHO GROWTH A, FUJIFILM Wako Pure Chemical) was also transferred. The ATX-producing cells were cultured for one week under the conditions of 37° C., 5% CO 2 , a stirring speed of 15 rpm, a shaking angle of 6°, and a gas flow of 0.2 L/min. After 1 week, 9 L of serum-free medium for CHO cells (BalanCD CHO GROWTH A, Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) containing 4 mmol/L L-alanyl-L-glutamine was transferred, and ATX-producing cells were cultured for 2 weeks. .
　得られた培養液を２０００ｇ、１５分、４℃の条件で遠心分離し、ヒト由来組換えＡＴＸを含む培養上清を得た。得られた培養上清をセントラメイト（ＰＡＬＬ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）１０Ｋにて濃縮した。途中詰まりが発生した場合は２０００ｇ、１５分、４℃の条件で遠心分離した。約６００ｍＬまで濃縮した後、濃縮脱塩バッファー（１０ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ９．０）、１ｍｍｏｌ／Ｌ　ＣａＣｌ２）を１４００ｍＬ加え、再びセントラメイト（ＰＡＬＬ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）１０Ｋにて約６００ｍＬになるまで濃縮した。濃縮脱塩バッファー（１０ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ９．０）、１ｍｍｏｌ／Ｌ　ＣａＣｌ２）を１４００ｍＬ加え、約６００ｍＬになるまで濃縮する操作を２回繰り返し、得られた約６００ｍＬの濃縮脱塩サンプルを２０００ｇ、１５分、４℃の条件で遠心分離し、上清を回収した。 The resulting culture solution was centrifuged at 2000 g for 15 minutes at 4° C. to obtain a culture supernatant containing human-derived recombinant ATX. The resulting culture supernatant was concentrated with Centramate (PALL Corporation) 10K. When clogging occurred, centrifugation was performed at 2000 g for 15 minutes at 4°C. After concentrating to about 600 mL, 1400 mL of concentrated desalting buffer (10 mmol/L Tris-HCl (pH 9.0), 1 mmol/L CaCl 2 ) was added, and concentrated again with Centramate (PALL Corporation) 10K to about 600 mL. did. The operation of adding 1400 mL of concentrated desalted buffer (10 mmol/L Tris-HCl (pH 9.0), 1 mmol/L CaCl 2 ) and concentrating to about 600 mL was repeated twice to obtain a concentrated desalted sample of about 600 mL. was centrifuged at 2000 g for 15 minutes at 4° C., and the supernatant was recovered.
　得られた培養上清を平衡化バッファー（１０ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ９．０）、１ｍｍｏｌ／Ｌ　ＣａＣｌ２）で平衡化したＱ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗ（Ｃｙｔｉｖａ）を充填したカラムに吸着させた。その後、平衡化バッファー、及び溶出バッファー（１０ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ９．０）、１ｍｍｏｌ／Ｌ　ＣａＣｌ２、０．３ｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ）を用いた１０ＣＶ（Ｃｏｌｕｍｎ　Ｖｏｌｕｍｅ）のリニアグラジエントにより溶出した。ＡＴＸ活性測定をおこない、ＡＴＸ活性を有する画分を回収した。 The obtained culture supernatant was adsorbed on a column filled with Q Sepharose Fast Flow (Cytiva) equilibrated with an equilibration buffer (10 mmol/L Tris-HCl (pH 9.0), 1 mmol/L CaCl 2 ). After that, elution was performed with a linear gradient of 10 CV (Column Volume) using an equilibration buffer and an elution buffer (10 mmol/L Tris-HCl (pH 9.0), 1 mmol/L CaCl2, 0.3 mol/L NaCl). ATX activity was measured and fractions having ATX activity were collected.
　得られたＡＴＸ活性画分をセントラメイト（ＰＡＬＬ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）１０Ｋにて濃縮し、２００ｍＬまで濃縮した。１０ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）を１８００ｍＬ加えた。２００ｍＬまでの濃縮と１８００ｍＬバッファー添加を２回繰り返し、約２００ｍＬのヒト由来組換えＡＴＸを得た。ヒト由来組換えＡＴＸをＳＤＳ－ＰＡＧＥに供した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥの写真を図１に示す。また、各精製工程におけるヒト由来組換えＡＴＸ活性を測定した。測定した結果を表８に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
   The obtained ATX active fraction was concentrated with Centramate (PALL Corporation) 10K to 200 mL. 1800 mL of 10 mmol/L Tris-HCl (pH 7.5) was added. Concentration to 200 mL and addition of 1800 mL buffer were repeated twice to obtain approximately 200 mL of human-derived recombinant ATX. Human-derived recombinant ATX was subjected to SDS-PAGE. A photograph of SDS-PAGE is shown in FIG. In addition, human-derived recombinant ATX activity was measured in each purification step. Table 8 shows the measurement results.
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　実施例２で作製したヒト由来組換えＡＴＸを、以下の実施例のヒト由来ＡＴＸとして使用した。 The human-derived recombinant ATX produced in Example 2 was used as human-derived ATX in the following examples.
　［実施例３：キャリブレーターとして使用するための凍結組成物の調製］
　実施例２で作製した５０μＬのヒト由来組換えＡＴＸと、３０ｍＬの市販のヒト血清製品と、を混ぜ合わせ各５００μＬずつエッペンチューブに分注し、－８０℃で凍結して、凍結組成物を得た。 Example 3 Preparation of Frozen Compositions for Use as Calibrators
50 μL of human-derived recombinant ATX prepared in Example 2 and 30 mL of commercially available human serum product are mixed, 500 μL each is dispensed into Eppendorf tubes, and frozen at −80° C. to obtain a frozen composition. Ta.
　実施例３から、キャリブレーターとして適正な濃度のヒト由来ＡＴＸ及びヒト血清製品を含む、キャリブレーターとして使用するための凍結組成物を製造可能であることが示された。 Example 3 showed that it is possible to manufacture a frozen composition for use as a calibrator, containing human-derived ATX and human serum products at appropriate concentrations as a calibrator.
　［実施例４：安定化剤として糖アルコールと血清を用いたＡＴＸ凍結乾燥組成物の約４℃から１０℃における安定性評価］
　安定化剤として、サッカロース又はトレハロースと、市販の第２の血清製品又は第３の血清製品と、を用いて、以下の方法を用いて凍結乾燥を行った。 [Example 4: Stability evaluation at about 4°C to 10°C of ATX freeze-dried composition using sugar alcohol and serum as stabilizers]
Using saccharose or trehalose and a commercially available second serum product or third serum product as stabilizers, freeze-drying was performed using the following method.
　実施例２で作製したヒト由来組換えＡＴＸと、糖アルコールと、ヒト血清と、を、表９に記載の濃度で混ぜ合わせ、各１ｍＬずつバキュームバイアル（日本電子硝子株式会社）に分注し、－５０℃で２時間凍結した。その後、－５０℃で０．５時間、－１５℃で４６時間、１５℃で２０時間乾燥し、凍結ゴム栓、スクリューキャップをし、凍結乾燥組成物を得た。 The human-derived recombinant ATX prepared in Example 2, the sugar alcohol, and the human serum were mixed at the concentrations shown in Table 9, and each 1 mL was dispensed into a vacuum vial (Nippon Electronic Glass Co., Ltd.), Freeze at -50°C for 2 hours. Then, it was dried at −50° C. for 0.5 hours, −15° C. for 46 hours, and 15° C. for 20 hours, and was sealed with a frozen rubber stopper and a screw cap to obtain a freeze-dried composition.
　得られた凍結乾燥組成物を約４℃から１０℃で１３ヶ月間保存し、ＡＴＸ活性の変化を測定した。キャリブレーターとして実施例３に記載の凍結組成物を使用した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
   The freeze-dried composition obtained was stored at about 4° C. to 10° C. for 13 months, and changes in ATX activity were measured. The frozen composition described in Example 3 was used as calibrator.
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　表９に示すように、保存期間０日で凍結乾燥組成物を復水した後のＡＴＸ活性は１２Ｕ／Ｌから１６Ｕ／Ｌであった。安定化剤としてサッカロース又はトレハロースと、市販の第２の血清製品又は第３の血清製品を用いてヒト由来ＡＴＸを凍結乾燥し、約４℃から１０℃で１３ヶ月間、ヒト由来ＡＴＸを保存したところ、少なくとも１３カ月間、ヒト由来ＡＴＸの活性は実質的に変化しなかった。 As shown in Table 9, the ATX activity after rehydration of the freeze-dried composition with a storage period of 0 days was from 12 U/L to 16 U/L. Human ATX was lyophilized using saccharose or trehalose as a stabilizer and a commercially available secondary or tertiary serum product and stored at about 4°C to 10°C for 13 months. However, the activity of human-derived ATX remained substantially unchanged for at least 13 months.
　実施例４は、キャリブレーターとして適正な濃度のヒト由来ＡＴＸ、糖アルコール（サッカロース又はトレハロース）、及びヒト血清を含む凍結乾燥組成物において、ヒト由来ＡＴＸの活性が、約４℃から１０℃の保存条件下で、少なくとも１３カ月間、初期値から実質的に変化しなかったことを示した。よって、ＡＴＸの活性又は質量の測定において、これらの凍結乾燥物を、キャリブレーターとして使用できることが示された。 Example 4 shows that in a freeze-dried composition containing appropriate concentrations of human-derived ATX, a sugar alcohol (saccharose or trehalose), and human serum as a calibrator, the activity of human-derived ATX is maintained under storage conditions of about 4°C to 10°C. Below, it was shown to be virtually unchanged from the initial value for at least 13 months. Therefore, it was shown that these lyophilisates can be used as calibrators in measuring the activity or mass of ATX.
　［実施例５：安定化剤として糖アルコールと血清を用いたＡＴＸ凍結乾燥組成物の約４℃から１０℃における安定性評価］ [Example 5: Stability evaluation at about 4°C to 10°C of an ATX freeze-dried composition using sugar alcohol and serum as stabilizers]
　安定化剤としてトレハロース（１％）を用い、市販の第１の血清製品を用いて、実施例３に記載の方法でヒト由来ＡＴＸの凍結乾燥組成物を得た。得られた凍結乾燥組成物を約４℃から１０℃で３ヶ月間保存し、ヒト由来ＡＴＸの活性変化を測定した。キャリブレーターとして実施例３に記載の凍結組成物を使用した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
   A lyophilized composition of human-derived ATX was obtained by the method described in Example 3 using trehalose (1%) as a stabilizing agent and using a commercial first serum product. The resulting freeze-dried composition was stored at about 4° C. to 10° C. for 3 months, and changes in human-derived ATX activity were measured. The frozen composition described in Example 3 was used as calibrator.
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
　表１０に示すように、保存期間０日で凍結乾燥組成物を復水した後のＡＴＸ活性は５Ｕ／Ｌから６Ｕ／Ｌであった。安定化剤としてトレハロース及び市販の第１の血清製品を用いてヒト由来ＡＴＸを凍結乾燥し、約４℃から１０℃で３ヶ月間保存したところ、少なくとも３カ月間、ヒト由来ＡＴＸの活性は実質的に変化しなかった。 As shown in Table 10, the ATX activity after rehydration of the freeze-dried composition with a storage period of 0 days was 5 U/L to 6 U/L. Lyophilization of human ATX using trehalose as a stabilizing agent and a commercial first serum product and storage at about 4° C. to 10° C. for 3 months showed that the activity of human ATX was substantially reduced for at least 3 months. did not change substantially.
　実施例５は、キャリブレーターとして適正な濃度のヒト由来ＡＴＸ、糖アルコール（トレハロース）、及びヒト血清を含む凍結乾燥組成物において、ヒト由来ＡＴＸの活性が、約４℃から１０℃の保存条件下で少なくとも３カ月間、初期値から実質的に変化しなかったことを示した。よって、これらの凍結乾燥組成物が、ＡＴＸの活性又は質量の測定においてキャリブレーターとして使用できることが示された。 Example 5 shows that in a freeze-dried composition containing appropriate concentrations of human-derived ATX, a sugar alcohol (trehalose), and human serum as a calibrator, the activity of human-derived ATX is reduced under storage conditions of about 4°C to 10°C. It was shown to be virtually unchanged from initial values for at least 3 months. Thus, it was demonstrated that these lyophilized compositions can be used as calibrators in the determination of ATX activity or mass.
　［実施例６：実施例４の組成物をキャリブレーターとして使用してヒト検体に含まれるＡＴＸの活性を測定する方法］ [Example 6: Method for measuring the activity of ATX contained in a human specimen using the composition of Example 4 as a calibrator]
　（試料）
　本実施例で試料として使用した２７個のヒト血清検体は、ビジコムジャパン株式会社より購入した。 (sample)
Twenty-seven human serum specimens used as samples in this example were purchased from Busicom Japan.
　（キャリブレーター）
　実施例４と同様に安定化剤としてサッカロース及び血清を用いて凍結乾燥したヒト由来ＡＴＸを含む凍結乾燥組成物をキャリブレーターとして使用した。このキャリブレーター（凍結乾燥組成物）を復水した後のＡＴＸ活性を実施例１に記載の方法で測定したところ、１２．２Ｕ／Ｌであった。 (Calibrator)
A freeze-dried composition containing human-derived ATX freeze-dried using saccharose and serum as stabilizers in the same manner as in Example 4 was used as a calibrator. The ATX activity after reconstitution of this calibrator (freeze-dried composition) was measured by the method described in Example 1 and found to be 12.2 U/L.
　（ヒト検体に含まれるＡＴＸ活性（Ｕ／Ｌ）の測定）
　実施例１に記載の方法でヒト検体に含まれるＡＴＸ活性（Ｕ／Ｌ）を測定した。さらに、ヒト検体に含まれるＡＴＸ活性（Ｕ／Ｌ）の測定値を、キャリブレーターに含まれるＡＴＸ活性の測定値を用いて補正した。 (Measurement of ATX activity (U/L) contained in human specimen)
ATX activity (U/L) contained in human samples was measured by the method described in Example 1. Furthermore, the measured value of ATX activity (U/L) contained in the human sample was corrected using the measured value of ATX activity contained in the calibrator.
　（ヒト検体に含まれるＡＴＸ質量（ｍｇ／Ｌ）の測定）
　ヒト検体に含まれるＡＴＸ質量（ｍｇ／Ｌ）は、株式会社エスアールエル（本社所在地　東京都新宿区西新宿二丁目1番1号）に委託し、市販のＥテスト「ＴＯＳＯＨ」ＩＩオートタキシンを使用して測定した。 (Measurement of ATX mass (mg/L) contained in human specimen)
The mass of ATX (mg/L) contained in human specimens was measured by SRL Co., Ltd. (head office location: 2-1-1 Nishi-Shinjuku, Shinjuku-ku, Tokyo) using the commercially available E-test "TOSOH" II autotaxin. measured by
　測定した２７の試料のヒト検体に含まれるＡＴＸ活性（Ｕ／Ｌ）と、ヒト検体に含まれるＡＴＸ質量（ｍｇ／Ｌ）の値と、を比較して図２に示した。 Figure 2 shows a comparison of the ATX activity (U/L) contained in the human specimens of the 27 measured samples and the ATX mass (mg/L) contained in the human specimens.
　図２に示したように、ヒト検体に含まれるＡＴＸ活性（ｙ軸）は、市販のＥテスト「ＴＯＳＯＨ」ＩＩオートタキシンを使用して測定したヒト検体に含まれるＡＴＸ質量（ｘ軸）と、相関式ｙ＝１３．６２４ｘ＋４．３１８６、相関係数ｒ＝０．９８４５で相関した。したがって、実施例に係るキャリブレーター、とＡＴＸ活性を測定する試薬と、をＡＴＸ活性を測定するためのキットとし、ヒト検体に含まれる質量を算出できることが示された。 As shown in FIG. 2, the ATX activity (y-axis) contained in the human specimen is the ATX mass (x-axis) contained in the human specimen measured using the commercially available E-test "TOSOH" II autotaxin, Correlation was obtained with a correlation formula of y=13.624x+4.3186 and a correlation coefficient of r=0.9845. Therefore, it was shown that the mass contained in a human sample can be calculated by using the calibrator according to the example and the reagent for measuring ATX activity as a kit for measuring ATX activity.
　実施例６により、凍結乾燥されていたキャリブレーターを含むＡＴＸの活性又は質量を測定するためのキットを提供できること、及び凍結乾燥されていたキャリブレーターを用いてＡＴＸの活性又は質量を測定する方法を提供できることが示された。 Example 6 can provide a kit for measuring the activity or mass of ATX containing a lyophilized calibrator, and can provide a method for measuring the activity or mass of ATX using the lyophilized calibrator. It has been shown.
　［実施例７：安定化剤として糖アルコールと血清を用いたＡＴＸ凍結乾燥組成物の３７℃における安定性評価］
　安定化剤として、トレハロース、サッカロース、Ｄ（－）マンニトール、又はＤ（－）ソルビトールと、市販の第２の血清製品と、を用いて、以下の方法を用いて凍結乾燥を行った。 [Example 7: Evaluation of stability at 37°C of ATX freeze-dried composition using sugar alcohol and serum as stabilizers]
Using trehalose, saccharose, D(-) mannitol, or D(-) sorbitol as stabilizers and a second commercially available serum product, freeze-drying was performed using the following method.
　実施例２で作製したヒト由来組換えＡＴＸと、５％の糖アルコールと、ヒト血清と、を、混ぜ合わせ、各１ｍＬずつバキュームバイアル（日本電子硝子株式会社）に分注し、－５０℃で２時間凍結した。その後、－５０℃で０．５時間、－１５℃で４６時間、１５℃で２０時間乾燥し、凍結ゴム栓、スクリューキャップをし、凍結乾燥組成物を得た。また、コントロールとして、ヒト由来組換えＡＴＸとヒト血清を含み、糖アルコールを含まない凍結乾燥組成物を作製した（表１１の無添加）。 The human-derived recombinant ATX prepared in Example 2, 5% sugar alcohol, and human serum were mixed, 1 mL each was dispensed into vacuum vials (Nippon Electronic Glass Co., Ltd.), and the mixture was kept at -50°C. Freeze for 2 hours. Then, it was dried at −50° C. for 0.5 hours, −15° C. for 46 hours, and 15° C. for 20 hours, and was sealed with a frozen rubber stopper and a screw cap to obtain a freeze-dried composition. As a control, a freeze-dried composition containing human-derived recombinant ATX and human serum but containing no sugar alcohol was prepared (no addition in Table 11).
　得られた凍結乾燥組成物を３７℃で保存し、ＡＴＸ活性の変化を測定した。キャリブレーターとして実施例３に記載の凍結組成物を使用した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
   The freeze-dried composition obtained was stored at 37° C., and changes in ATX activity were measured. The frozen composition described in Example 3 was used as calibrator.
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
　表１１に示すように、８週間の保存期間後においても、トレハロース、サッカロース、Ｄ（－）マンニトール、及びＤ（－）ソルビトールを用いると、ヒト由来ＡＴＸの残存活性は９６％以上であり、糖アルコールを含まない場合（表１１の無添加）と比較し高かった。 As shown in Table 11, even after an 8-week storage period, when trehalose, saccharose, D(-) mannitol, and D(-) sorbitol were used, the residual activity of human-derived ATX was 96% or more. It was higher than the case without alcohol (no addition in Table 11).
　［実施例８：安定化剤として糖アルコールを用いてヒト由来ＡＴＸを凍結乾燥し３７℃で保存した場合の活性の変化）
　安定化剤として糖アルコールを用いてヒト由来ＡＴＸを凍結乾燥し、３７℃で当該ヒト由来ＡＴＸを保存し、当該ヒト由来ＡＴＸの活性の変化を測定した。糖アルコールの濃度は、いずれも５％であった。なお、本実施例では、血清及び血漿を添加しておらず、表１２の無添加は糖アルコールも添加していない。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
   [Example 8: Changes in activity when human-derived ATX is freeze-dried using a sugar alcohol as a stabilizer and stored at 37°C)
Human-derived ATX was freeze-dried using a sugar alcohol as a stabilizer, stored at 37° C., and changes in activity of the human-derived ATX were measured. The concentration of sugar alcohol was 5% in each case. In addition, serum and plasma were not added in this example, and sugar alcohol was not added to the non-additive samples in Table 12.
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
　表１２に示すように、安定化剤として、トレハロース、ラクトース、マルトース、及びサッカロースを用いると、３週間の保存期間後においても、ヒト由来ＡＴＸの残存活性は８８％以上であった。 As shown in Table 12, when trehalose, lactose, maltose, and saccharose were used as stabilizers, the residual activity of human-derived ATX was 88% or more even after a 3-week storage period.

Claims (34)

  1. 　オートタキシンと、血清及び血漿の少なくともいずれかと、を含むキャリブレーターであって、さらに糖アルコールを含む、オートタキシン測定試薬のキャリブレーター。 A calibrator containing autotaxin and at least one of serum and plasma, and a calibrator for an autotaxin measurement reagent, further containing a sugar alcohol.
  2. 　前記血清又は前記血漿がヒト由来である、請求項１に記載のオートタキシン測定試薬のキャリブレーター。 The autotaxin measuring reagent calibrator according to claim 1, wherein said serum or said plasma is of human origin.
  3. 　前記血清又は前記血漿が、健常人由来である、請求項１又は２に記載のオートタキシン測定試薬のキャリブレーター。 The autotaxin measuring reagent calibrator according to claim 1 or 2, wherein said serum or said plasma is derived from healthy individuals.
  4. 　前記糖アルコールがサッカロース、トレハロース、マンニトール、又はソルビトールである、請求項１に記載のオートタキシン測定試薬のキャリブレーター。 The autotaxin measuring reagent calibrator according to claim 1, wherein the sugar alcohol is saccharose, trehalose, mannitol, or sorbitol.
  5. 　０．５質量％以上２０質量％以下の濃度で前記糖アルコールを含む、請求項１から４のいずれか１項に記載のオートタキシン測定試薬のキャリブレーター。 The autotaxin measuring reagent calibrator according to any one of claims 1 to 4, containing the sugar alcohol at a concentration of 0.5% by mass or more and 20% by mass or less.
  6. 　前記オートタキシンがヒト由来オートタキシンである、請求項１から５のいずれか１項に記載のオートタキシン測定試薬のキャリブレーター。 The autotaxin measuring reagent calibrator according to any one of claims 1 to 5, wherein the autotaxin is human-derived autotaxin.
  7. 　前記オートタキシンのアミノ酸配列が、配列番号１に記載の遺伝子配列に対応する、請求項１から６のいずれか１項に記載のオートタキシン測定試薬のキャリブレーター。 The autotaxin measuring reagent calibrator according to any one of claims 1 to 6, wherein the autotaxin amino acid sequence corresponds to the gene sequence set forth in SEQ ID NO:1.
  8. 　前記オートタキシンのアミノ酸配列が、配列番号１に記載の遺伝子配列と９０％以上の同一性を有する遺伝子配列に対応し、前記オートタキシンが、リゾホスファチジルコリンを加水分解する活性を有する、請求項１から７のいずれか１項に記載のオートタキシン測定試薬のキャリブレーター。 2. From claim 1, wherein the amino acid sequence of said autotaxin corresponds to a gene sequence having 90% or more identity with the gene sequence set forth in SEQ ID NO: 1, and said autotaxin has activity to hydrolyze lysophosphatidylcholine. 8. Calibrator for autotaxin measurement reagent according to any one of 7.
  9. 　前記オートタキシンのアミノ酸配列が、配列番号１に記載の遺伝子配列において、１又は数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された遺伝子配列に対応し、前記オートタキシンが、リゾホスファチジルコリンを加水分解する活性を有する、請求項１から８のいずれか１項に記載のオートタキシン測定試薬のキャリブレーター。 The autotaxin amino acid sequence corresponds to the gene sequence shown in SEQ ID NO: 1 in which one or several bases are deleted, substituted, or added, and the autotaxin hydrolyzes lysophosphatidylcholine. The autotaxin measuring reagent calibrator according to any one of claims 1 to 8, which has an activity to
  10. 　５Ｕ／Ｌ以上５０Ｕ／Ｌ以下の濃度で前記オートタキシンを含む、請求項１から９のいずれか１項に記載のオートタキシン測定試薬のキャリブレーター。 The autotaxin measuring reagent calibrator according to any one of claims 1 to 9, which contains the autotaxin at a concentration of 5 U/L or more and 50 U/L or less.
  11. 　０．０５ｍｇ／Ｌ以上１０ｍｇ／Ｌ以下の濃度で前記オートタキシンを含む、請求項１から１０のいずれか１項に記載のオートタキシン測定試薬のキャリブレーター。 The autotaxin measuring reagent calibrator according to any one of claims 1 to 10, containing the autotaxin at a concentration of 0.05 mg/L or more and 10 mg/L or less.
  12. 　凍結乾燥試薬である、請求項１から１１のいずれか１項に記載のオートタキシン測定試薬のキャリブレーター。 The autotaxin measuring reagent calibrator according to any one of claims 1 to 11, which is a freeze-dried reagent.
  13. 　オートタキシン測定試薬を用いて、請求項１から１２のいずれか１項に記載のキャリブレーターに含まれるオートタキシンを測定することを含む、オートタキシン測定試薬のキャリブレーション方法。 A method for calibrating an autotaxin measurement reagent, comprising measuring autotaxin contained in the calibrator according to any one of claims 1 to 12 using an autotaxin measurement reagent.
  14. 　前記測定することにおいて、前記キャリブレーターに含まれるオートタキシンの活性又は質量を測定する、請求項１３に記載のオートタキシン測定試薬のキャリブレーション方法。 The autotaxin measuring reagent calibration method according to claim 13, wherein the measuring includes measuring the activity or mass of autotaxin contained in the calibrator.
  15. 　オートタキシンの活性と質量との関係を表す１次関数を用いて、前記キャリブレーターに含まれるオートタキシンの活性の測定値から、前記キャリブレーターに含まれるオートタキシンの質量を算出する、請求項１３又は１４に記載のオートタキシン測定試薬のキャリブレーション方法。 15. The mass of autotaxin contained in the calibrator is calculated from the measured value of the autotaxin activity contained in the calibrator using a linear function representing the relationship between autotaxin activity and mass. A method for calibrating an autotaxin measuring reagent according to .
  16. 　前記オートタキシン測定試薬が、リゾホスファチジルコリンを含む、請求項１３から１５のいずれか１項に記載のオートタキシン測定試薬のキャリブレーション方法。 The autotaxin measurement reagent calibration method according to any one of claims 13 to 15, wherein the autotaxin measurement reagent contains lysophosphatidylcholine.
  17. 　請求項１から１２のいずれか１項に記載のキャリブレーターと、
    　オートタキシン測定試薬と、
    　を含む、オートタキシン測定キット。     A calibrator according to any one of claims 1 to 12;
    an autotaxin measuring reagent;
    An autotaxin assay kit, comprising:
  18. 　前記オートタキシン測定試薬が、リゾホスファチジルコリンを含む、請求項１７に記載のオートタキシン測定キット。 The autotaxin measurement kit according to claim 17, wherein the autotaxin measurement reagent contains lysophosphatidylcholine.
  19. 　オートタキシン測定試薬を用いて、請求項１から１２のいずれか１項に記載のキャリブレーターに含まれるオートタキシンを測定することと、
    　前記オートタキシン測定試薬を用いて、検体に含まれるオートタキシンを測定することと、
    　前記キャリブレーターに含まれるオートタキシンの測定値を用いて、前記検体に含まれるオートタキシンの測定値を補正することと、
    　を含む、オートタキシンの測定方法。     Measuring autotaxin contained in the calibrator according to any one of claims 1 to 12 using an autotaxin measurement reagent;
    measuring autotaxin contained in a specimen using the autotaxin measurement reagent;
    correcting the measured value of autotaxin contained in the specimen using the measured value of autotaxin contained in the calibrator;
    A method for measuring autotaxin, comprising:
  20. 　前記測定値が活性又は質量である、請求項１９に記載のオートタキシンの測定方法。 The method for measuring autotaxin according to claim 19, wherein the measured value is activity or mass.
  21. 　オートタキシンの活性と質量との関係を表す１次関数を用いて、前記検体に含まれるオートタキシンの活性の補正された測定値から、前記検体に含まれるオートタキシンの質量を算出する、請求項１９又は２０に記載のオートタキシンの測定方法。 Calculating the mass of autotaxin contained in the sample from the corrected measurement value of the autotaxin activity contained in the sample using a linear function representing the relationship between autotaxin activity and mass 21. The method for measuring autotaxin according to 19 or 20.
  22. 　前記オートタキシン測定試薬が、リゾホスファチジルコリンを含む、請求項１９から２１のいずれか１項に記載のオートタキシンの測定方法。 The method for measuring autotaxin according to any one of claims 19 to 21, wherein the reagent for measuring autotaxin contains lysophosphatidylcholine.
  23. 　請求項１から１２のいずれか１項に記載のキャリブレーターと、
    　オートタキシン測定試薬と、
    　を含む、診断補助キット。     A calibrator according to any one of claims 1 to 12;
    an autotaxin measuring reagent;
    A diagnostic aid kit, comprising:
  24. 　前記オートタキシン測定試薬が、リゾホスファチジルコリンを含む、請求項２３に記載の診断補助キット。 The diagnostic aid kit according to claim 23, wherein the autotaxin measuring reagent contains lysophosphatidylcholine.
  25. 　診断補助対象の疾患が肝線維化、慢性肝疾患、悪性リンパ腫、及び膵疾患からなる群から選択されるいずれかである、請求項２３又は２４に記載の診断補助キット。 The diagnostic aid kit according to claim 23 or 24, wherein the disease to be diagnosed is selected from the group consisting of liver fibrosis, chronic liver disease, malignant lymphoma, and pancreatic disease.
  26. 　診断補助対象の疾患が神経障害である、請求項２３又は２４に記載の診断補助キット。 The diagnostic aid kit according to claim 23 or 24, wherein the disease targeted for diagnostic aid is neuropathy.
  27. 　前記神経障害が、帯状疱疹後神経痛、腰部癒着性くも膜炎、胸部脊髄炎、腰椎神経根障害、頸椎症性脊髄症、化学療法誘発性末梢神経障害、栄養代謝性多発神経障害、及び頚髄軟化症からなる群から選択されるいずれかである、請求項２６に記載の診断補助キット。 The neuropathy is postherpetic neuralgia, lumbar adhesive arachnoiditis, thoracic myelitis, lumbar radiculopathy, cervical spondylotic myelopathy, chemotherapy-induced peripheral neuropathy, nutrient-metabolic polyneuropathy, and cervical spinal cord malacia 27. The diagnostic aid kit according to claim 26, which is any selected from the group consisting of diseases.
  28. 　オートタキシン測定試薬を用いて、請求項１から１２のいずれか１項に記載のキャリブレーターに含まれるオートタキシンを測定することと、
    　前記オートタキシン測定試薬を用いて、検体に含まれるオートタキシンを測定することと、
    　前記キャリブレーターに含まれるオートタキシンの測定値を用いて、前記検体に含まれるオートタキシンの測定値を補正することと、
    　前記検体に含まれるオートタキシンの補正された測定値に基づき、疾患を特定することと、
    　を含む、診断補助方法。     Measuring autotaxin contained in the calibrator according to any one of claims 1 to 12 using an autotaxin measurement reagent;
    measuring autotaxin contained in a specimen using the autotaxin measurement reagent;
    correcting the measured value of autotaxin contained in the specimen using the measured value of autotaxin contained in the calibrator;
    identifying a disease based on corrected measurements of autotaxin contained in the specimen;
    A diagnostic aid method, comprising:
  29. 　前記測定値が活性又は質量である、請求項２８に記載の診断補助方法。 The diagnostic aid method according to claim 28, wherein the measured value is activity or mass.
  30. 　オートタキシンの活性と質量との関係を表す１次関数を用いて、前記検体に含まれるオートタキシンの活性の補正された測定値から、前記検体に含まれるオートタキシンの質量を算出する、請求項２８又は２９に記載の診断補助方法。 Calculating the mass of autotaxin contained in the sample from the corrected measurement value of the autotaxin activity contained in the sample using a linear function representing the relationship between autotaxin activity and mass 29. The diagnostic aid method according to 28 or 29.
  31. 　前記オートタキシン測定試薬が、リゾホスファチジルコリンを含む、請求項２８から３０のいずれか１項に記載の診断補助方法。 The diagnostic aid method according to any one of claims 28 to 30, wherein the autotaxin measuring reagent contains lysophosphatidylcholine.
  32. 　診断補助対象の疾患が肝線維化、慢性肝疾患、悪性リンパ腫、及び膵疾患からなる群から選択されるいずれかである、請求項２８から３１のいずれか１項に記載の診断補助方法。 The diagnostic assistance method according to any one of claims 28 to 31, wherein the disease to be diagnosed is any one selected from the group consisting of liver fibrosis, chronic liver disease, malignant lymphoma, and pancreatic disease.
  33. 　診断補助対象の疾患が神経障害である、請求項２８から３１のいずれか１項に記載の診断補助方法。 The diagnostic assistance method according to any one of claims 28 to 31, wherein the disease to be diagnosed is neuropathy.
  34. 　前記神経障害が、帯状疱疹後神経痛、腰部癒着性くも膜炎、胸部脊髄炎、腰椎神経根障害、頸椎症性脊髄症、化学療法誘発性末梢神経障害、栄養代謝性多発神経障害、及び頚髄軟化症からなる群から選択されるいずれかである、請求項３３に記載の診断補助方法。 The neuropathy is postherpetic neuralgia, lumbar adhesive arachnoiditis, thoracic myelitis, lumbar radiculopathy, cervical spondylotic myelopathy, chemotherapy-induced peripheral neuropathy, nutrient-metabolic polyneuropathy, and cervical spinal cord malacia 34. The diagnostic aid method according to claim 33, which is any selected from the group consisting of diseases.
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