WO2023121384A1 - miR-499-5p 활성화제를 포함하는 뒤센 근이영양증 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

miR-499-5p 활성화제를 포함하는 뒤센 근이영양증 예방 또는 치료용 조성물 Download PDF

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WO2023121384A1
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mir
muscular dystrophy
duchenne muscular
activator
msc
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장종욱
전홍배
박상언
오신지
정장빈
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사회복지법인 삼성생명공익재단
이엔셀 주식회사
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    • C12Q2600/178—Oligonucleotides characterized by their use miRNA, siRNA or ncRNA

Definitions

  • composition for preventing or treating Duchenne muscular dystrophy comprising a miR-499-5p activator.
  • Duchenne muscular dystrophy is an X-chromosome related recessive disorder characterized by progressive loss of muscle mass and function. It is caused by a mutation in the dystrophin gene, with a probability of about 1 in 3,500 in men. It is characterized by progressive skeletal and cardiac muscle weakness and leads to premature death, usually around the age of 20.
  • DMD Duchenne muscular dystrophy
  • Various therapeutic approaches for Duchenne muscular dystrophy have been attempted in preclinical and clinical studies, but no treatment that has shown an effective clinical course has been reported so far.
  • most of the treatment methods currently under development are only gene therapies targeting a single target for dystrophin. Multiple pathogenic mechanisms, such as muscle degeneration, inflammation, and fibrosis, are involved in Duchenne muscular dystrophy, so multi-targeted drug therapy may be more effective.
  • mesenchymal stem cells are safe and beneficial treatment methods for various pathologies.
  • Mesenchymal stem cells are mesenchymal tissue-derived cells that can be obtained from autologous or allogeneic sources, and can differentiate into fat, cartilage, and bone formation lineages, and engraft into muscle tissue to differentiate into muscle cells.
  • various proteins secreted from mesenchymal stem cells have therapeutic effects, and paracrine factors maintain homeostasis by regulating inflammatory and immune responses at the lesion site, enabling multi-targeted therapy.
  • One aspect is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating Duchenne muscular dystrophy (DMD) containing a miR-499-5p activator.
  • DMD Duchenne muscular dystrophy
  • Another aspect is to provide a cell therapy agent for treating Duchenne muscular dystrophy containing a miR-499-5p activator.
  • Another aspect is to provide a composition for diagnosing Duchenne muscular dystrophy including an agent for measuring the expression level of miR-499-5p.
  • Another aspect is to provide a kit for diagnosing Duchenne muscular dystrophy including the composition.
  • Another aspect is to provide an information providing method for diagnosing Duchenne muscular dystrophy, including measuring the expression level of miR-499-5p in a sample of an individual.
  • One aspect provides a pharmaceutical composition for preventing or treating Duchenne muscular dystrophy (DMD) containing a miR-499-5p activator. Another aspect provides a method for preventing or treating Duchenne muscular dystrophy comprising administering a miR-499-5p activator to a subject in need thereof. Another aspect provides a preventive or therapeutic use of a pharmaceutical composition containing a miR-499-5p activator for Duchenne Muscular Dystrophy (DMD).
  • DMD Duchenne muscular dystrophy
  • Another aspect provides a preventive or therapeutic use of a pharmaceutical composition containing a miR-499-5p activator for Duchenne Muscular Dystrophy (DMD).
  • microRNA or miRNA, miR
  • miR miRNA
  • the term "microRNA (or miRNA, miR)” is a single-stranded RNA molecule of 21 to 25 nt that binds to the 3'UTR of mRNA to regulate gene expression in eukaryotes. That is, the microRNA is involved in development, cell proliferation and death, fat metabolism, and tumorigenesis by regulating the expression of a target protein.
  • the miR-499-5p includes variants having one or more substitutions, insertions, deletions, and combinations thereof, which are functional equivalents having changes that do not reduce its activity. In one embodiment, it was confirmed that the miR-499-5p promotes recovery of fibrotic muscle by down-regulating the TGF- ⁇ receptor.
  • the miR-499-5p can specifically bind to the TGF- ⁇ receptor.
  • the TGF- ⁇ receptor may be, for example, TGF ⁇ R1 or TGF ⁇ R3. That is, the miR-499-5p can have an anti-fibrotic effect by specifically binding to the TGF- ⁇ receptor.
  • the miR-499-5p activator may be mesenchymal stem cells.
  • the mesenchymal stem cells may be derived from umbilical cord, umbilical cord blood, bone marrow, placenta, fat, and the like.
  • the umbilical cord may refer to a line that connects the mother body and the belly so that the mammalian fetus can grow in the placenta. It can mean a structured organization. Therefore, in one embodiment, the mesenchymal stem cells may be umbilical cord or cord blood-derived mesenchymal stem cells, specifically, Wharton's jelly-derived mesenchymal stem cells (WJ-MSCs).
  • WJ-MSCs Wharton's jelly-derived mesenchymal stem cells
  • the mesenchymal stem cells may express MMP-1 or be genetically engineered to overexpress MMP-1 compared to parental cells.
  • skeletal muscle treatment effects such as reduction of intracellular creatine kinase, behavioral recovery, muscle regeneration, inhibition of apoptosis and reduction of fibrosis were confirmed by intravenous injection of WJ-MSCs at a specific cell number into 3- to 5-month-old Mdx mice. That is, the dose-dependent effect of WJ-MSCs in Mdx mice and the treatment of skeletal muscle by single intravenous administration, not local administration, were confirmed, and miR-499-5p expression was changed in the skeletal muscle of Mdx mice for the treatment of Duchenne muscular dystrophy. The optimal dose and usage of WJ-MSCs were identified.
  • the composition may include mesenchymal stem cells in a cell number of 1x10 2 to 1x10 8 .
  • the composition may contain 1x10 2 to 1x10 8 cells, 1x10 3 to 1x10 7 cells, 5x10 3 to 1x10 7 cells, 5x10 3 to 5x10 6 cells, 1x10 4 to 1x10 6 cells, and 5x10 4 to 5x10 4 cells.
  • Mesenchymal stem cells may be included in the number of 1x10 6 cells. At this time, when the content of the mesenchymal stem cells is less than or exceeds the above range, there is a problem in that the creatine kinase level reduction, muscle strength increasing effect and fibrosis relieving effect cannot be sufficiently exhibited.
  • the composition may be administered intravenously.
  • Duchenne muscular dystrophy is a disease with the highest incidence among progressive muscular dystrophy, and the gastrocnemius muscle becomes hard and hypertrophic at the beginning of the onset, gradually degenerating and weakening the skeletal and cardiac muscles of the entire body.
  • intramuscular injection IM
  • IM intramuscular injection
  • the composition is directly administered to the muscle, since the movement of the stem cells contained in the composition from the administration site to the periphery is limited, there is a problem in that the composition must be administered several times to various sites.
  • IV injections are effective and have a clear response because the drug reaches the necessary tissues in the body through the heart within 1 to 2 minutes.
  • stem cells can show the ability to go to damaged areas by themselves, that is, the homing effect, they can move to the skeletal muscle or diaphragm area where the disease appears and show a therapeutic effect.
  • WJ-MSC as a result of confirming the distribution of WJ-MSC in the gastrocnemius veins of normal controls and Mdx mice intravenously administered with WJ-MSC, it was confirmed that more cells remained in the gastrocnemius of Mdx mice compared to normal controls. there was.
  • a composition containing a miR-499-5p activator eg, WJ-MSC
  • the activator can move into the gastrocnemius muscle to exhibit a therapeutic effect, effective for initial treatment.
  • compositions for the prevention or treatment of Duchenne muscular dystrophy are oral formulations such as powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, aerosols, external preparations, suppositories and sterile injection solutions, respectively, according to conventional methods. It may be formulated and used in a form, and suitable carriers, excipients or diluents commonly used in the preparation of pharmaceutical compositions may be included for formulation.
  • carrier or excipient or diluent examples include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia gum, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, undecided various compounds or mixtures including vaginal cellulose, polyvinyl pyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil, and the like.
  • diluents or excipients such as commonly used fillers, weighting agents, binders, wetting agents, disintegrants, and surfactants.
  • a solid preparation for oral administration may be prepared by mixing the pulse extract with at least one excipient, for example, starch, calcium carbonate, sucrose or lactose, gelatin, and the like.
  • excipients for example, starch, calcium carbonate, sucrose or lactose, gelatin, and the like.
  • lubricants such as magnesium stearate and talc may also be used.
  • Liquid preparations for oral administration include suspensions, solutions for oral use, emulsions, syrups, etc., and various excipients such as wetting agents, sweeteners, aromatics, preservatives, etc. may be included in addition to water and liquid paraffin, which are commonly used simple diluents. .
  • Formulations for parenteral administration include sterilized aqueous solutions, water-insoluble agents, suspensions, emulsions, freeze-dried preparations, and suppositories.
  • Propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, and injectable esters such as ethyl oleate may be used as non-aqueous solvents and suspensions.
  • injectable esters such as ethyl oleate
  • a base for suppositories witepsol, macrogol, tween 61, cacao butter, laurin paper, glycerol gelatin, and the like can be used.
  • a preferred dosage of the pharmaceutical composition for preventing or treating Duchenne muscular dystrophy varies depending on the patient's condition, body weight, disease severity, drug type, administration route and duration, but can be appropriately selected by those skilled in the art. However, for desirable effects, it may be administered at 0.0001 to 2,000 mg/kg per day, preferably 0.001 to 2,000 mg/kg. Administration may be administered once a day or divided into several times. However, the scope of the present invention is not limited by the dosage.
  • the pharmaceutical composition for preventing or treating Duchenne muscular dystrophy may be administered to mammals such as rats, mice, livestock, and humans through various routes. All modes of administration can be administered, for example, by oral, rectal or intravenous, intramuscular, subcutaneous, intrauterine dural or intracerebroventricular injection.
  • Another aspect provides a health functional food composition for preventing or improving Duchenne muscular dystrophy, comprising miRNA-499-5p activator as an active ingredient. Details of the miRNA-499-5p activator are as described above.
  • the compound when used as an additive to the health functional food, it can be added as it is or used together with other foods or food ingredients, and can be used appropriately according to a conventional method.
  • the mixing amount of the active ingredient can be appropriately determined according to each purpose of use, such as prevention, health, or treatment.
  • the formulation of the health functional food may be in the form of a powder, granule, pill, tablet, or capsule, as well as a general food or beverage form.
  • the type of food is not particularly limited, and examples of food to which the substance can be added include meat, sausage, bread, chocolate, candy, snacks, confectionery, pizza, ramen, other noodles, gum, and dairy products including ice cream. , various soups, beverages, tea, drinks, alcoholic beverages and vitamin complexes, etc., and may include all foods in a conventional sense.
  • the compound when preparing food or beverage, may be added in an amount of 15 parts by weight or less, preferably 10 parts by weight or less, based on 100 parts by weight of the raw material.
  • the amount in the case of long-term intake for the purpose of health and hygiene or health control, the amount may be less than the above range, and since there is no problem in terms of safety in that fractions from natural products are used, an amount greater than the above range can also be used
  • beverages may contain various flavoring agents or natural carbohydrates as additional components, like conventional beverages.
  • the aforementioned natural carbohydrates may be monosaccharides such as glucose and fructose, disaccharides such as maltose and sucrose, polysaccharides such as dextrin and cyclodextrin, and sugar alcohols such as xylitol, sorbitol, and erythritol.
  • sweetener natural sweeteners such as thaumatin and stevia extract, or synthetic sweeteners such as saccharin and aspartame may be used.
  • the ratio of the natural carbohydrate may be about 0.01 to 0.04 g, preferably about 0.02 to 0.03 g per 100 mL of the beverage according to the present invention.
  • the health functional food for preventing or improving Duchenne muscular dystrophy includes various nutrients, vitamins, electrolytes, flavors, coloring agents, pectic acid and salts thereof, alginic acid and salts thereof, organic acids, protective colloidal thickeners, and pH adjusting agents. , stabilizers, preservatives, glycerin, alcohol, carbonation agents used in carbonated beverages.
  • the composition for improving sleep of the present invention may contain fruit flesh for the production of natural fruit juice, fruit juice beverages and vegetable beverages. These components may be used independently or in combination. The ratio of these additives is not limited, but is generally selected from the range of 0.01 to 0.1 parts by weight based on 100 parts by weight of the health functional food of the present invention.
  • Another aspect provides a cell therapy agent for the treatment of Duchenne muscular dystrophy comprising a miR-499-5p activator. Details of the miR-499-5p activator are as described above.
  • cell therapy agent refers to proliferating and selecting living autologous, allogenic, or xenogenic cells in vitro or using various methods to restore the function of cells and tissues. It refers to drugs for the purpose of treatment, diagnosis, and prevention through a series of actions that change characteristics.
  • the miR-499-5p activator promotes the expression of miR-499-5p by expressing MMP-1 in myotube cells, and downregulates the activation of TGF- ⁇ receptor and the phosphorylation of smad2/3. As the fibrotic muscle is restored by controlling, it can be used for the prevention or treatment of Duchenne muscular dystrophy.
  • Another aspect provides a composition for diagnosing Duchenne muscular dystrophy comprising an agent capable of specifically detecting the expression level of miR-499-5p. Details of the miR-499-5p are as described above.
  • the term "agent capable of specifically detecting the expression level of miRNA” refers to a substance that can be used to specifically identify or detect the miRNA in a sample of an individual.
  • the agent may be, for example, a primer, a probe, or an antisense nucleic acid.
  • Another aspect provides a kit for diagnosing Duchenne muscular dystrophy comprising the composition. Details of the composition are as described above.
  • the kit may include primers, probes, or antisense nucleic acids capable of specifically detecting the expression level of miR-499-5p, and in addition, one or more other component compositions, solutions, or devices suitable for analysis may be included. there is.
  • the kit may be a RT-PCR kit, a microarray chip kit, or a protein kit.
  • Another aspect provides an information providing method for diagnosing Duchenne muscular dystrophy comprising measuring the expression level of miR-499-5p in a biological sample of an individual. Details of the miR-499-5p are as described above. In one embodiment, the method may include determining that Duchenne muscular dystrophy is present when the expression level of miR-499-5p is decreased compared to a control group.
  • the subject means a patient to be diagnosed with Duchenne muscular dystrophy.
  • the subject may be a vertebrate, mammal, amphibian, reptile, bird, etc., and may be a mammal, for example, a human ( Homo sapiens ) or a Korean.
  • the biological sample may include samples such as tissue, tumor tissue, lung tumor tissue, cells, whole blood, serum, plasma, saliva, sputum, cerebrospinal fluid, or urine isolated from an individual.
  • the expression level of miR-499-5p was measured by Western blotting, reverse transcription polymerase reaction (RT-PCR), competitive reverse transcription polymerase reaction (Competitive RT-PCR), real-time reverse transcription polymerase reaction (Real-time RT-PCR), RNase protection assay (RPA), Northern blotting, DNA chip, and the like.
  • Another aspect includes contacting miR-499-5p with a test substance;
  • a method for screening a therapeutic agent for Duchenne muscular dystrophy comprising selecting a test substance having an increased expression level of miR-499-5p compared to an untreated control group as a therapeutic agent for Duchenne muscular dystrophy.
  • Another aspect is contacting a test substance to muscle cells in which the expression of miR-499-5p0 is reduced compared to a normal control group; Measuring the level of fibronectin or p-smad2/3 in the muscle cells; and selecting a test substance having a reduced level of fibronectin or p-smad2/3 compared to a control group not treated with the test substance as a treatment for Duchenne muscular dystrophy.
  • test substance for example, a drug candidate, test compound or test composition may be a small molecule compound, antibody, antisense nucleotide, short interfering RNA, short hairpin RNA, nucleic acid, protein, peptide, Other extracts or natural products may be included.
  • the contact may be performed in vitro.
  • the miR-499-5p activator promotes the expression of miR-499-5p by expressing MMP-1 in myotube cells, downregulates the activation of TGF- ⁇ receptors and smad2/3 phosphorylation, thereby reducing fiber As it restores sexual muscles, it can be used for prevention or treatment of Duchenne muscular dystrophy.
  • Figure 1a shows the results of mouse muscle strength measurement after intravenous injection of WJ-MSC into the Mdx mouse model.
  • Figure 1b is a result of measuring the level of creatine kinase in serum after intravenous injection of WJ-MSC into Mdx mice.
  • Figure 1c shows the result of confirming the expression level of fibrosis area, myosin heavy chain (Myosin heavy chain, MHC) and annexin V after intravenous injection of WJ-MSC into Mdx mice.
  • Figure 1d shows the results of measuring the fibrotic area, myosin heavy chain (MHC), and annexin V expression levels with Image J after intravenous injection of WJ-MSC into Mdx mice.
  • MHC myosin heavy chain
  • Figure 2a shows a heat map of miRNAs commonly expressed in humans, Mdx mice, and healthy mice.
  • Figure 2b shows the relative expression of miRNA-499 before and after intravenous injection of WJ-MSC into Mdx mice.
  • Figure 2c is the result of confirming the expression level of miR-499-5p by MMP-1 protein.
  • Figure 3a shows the result of confirming the relative expression level of TGF ⁇ R1 before and after intravenous injection of WJ-MSC into Mdx mice.
  • Figure 3b is the result of confirming the relative expression level of TGF ⁇ R3 before and after intravenous injection of WJ-MSC into Mdx mice.
  • Figures 4a and 4b are the results of confirming the anti-fibrotic effect of skeletal muscle after intravenous injection of WJ-MSC to Mdx mice.
  • 4c and 4d are results confirming the anti-fibrotic effect of the diaphragm after intravenous injection of WJ-MSC into Mdx mice.
  • 5a and 5b show the results of measuring the phosphorylation level of Smad2/3 after intravenous injection of WJ-MSC into Mdx mice.
  • 6a is a result of quantifying intra-organ DNA after intravenous injection of WJ-MSC into normal control and Mdx mice.
  • 6b and 6c show the results of measuring fibrosis over time after intravenous injection of WJ-MSCs into Mdx mice.
  • Figure 7a shows the results of miR-499-5p transfection or TGF- ⁇ inhibitor treatment after oxidative stress was induced in mouse myotubes.
  • 7D shows the results of confirming the expression of myosin heavy chain, fibronectin, and p-smad2/3 by inducing oxidative stress in mouse myotubes, transfecting miR-499-5p or treating them with a TGF- ⁇ inhibitor.
  • Figure 8 shows the anti-fibrotic effect of miR-499-5p in skeletal muscle of Duchenne muscular dystrophy.
  • the WJ-MSCs were mixed with 100 ⁇ L of PBS to form a suspension before injection, and then injected as slowly as possible. Thereafter, muscle strength of the forelimbs and/or hindlimbs of the mice was measured using a grip strength measuring instrument (BIO GS3, BIOSEB, Vitrolles, France). As a control group, C57BL/10ScSnJ mice (The Jackson Laboratory, USA) were used.
  • Figure 1a shows the results of mouse muscle strength measurement after intravenous injection of WJ-MSC into the Mdx mouse model.
  • muscle strength of the forelimbs (left), forelimbs, and hindlimbs (right) of Mdx mice administered with WJ-MSCs increased compared to the control group not administered with WJ-MSCs.
  • muscle strength increased in a concentration-dependent manner at doses 1 to 3, and decreased at doses 4 and above. That is, by administering WJ-MSC in a specific dose, the effect of increasing muscle strength can be exhibited.
  • the level of creatine kinase (Creatine Kinase, CK) in mouse serum was measured. Specifically, after collecting mouse blood by inducing retro-orbital plexus bleeding of Mdx mice administered with WJ-MSC in Example 1-1, incubation at 22-24 ° C. for 1 hour or more and centrifuged at 15,000x g for 10 minutes to collect the upper layer of clear serum. Then, serum creatine kinase activity was measured using a Creatine Kinase Activity Assay Kit (Colorimetric).
  • Figure 1b is a result of measuring the level of creatine kinase in serum after intravenous injection of WJ-MSC into Mdx mice.
  • Mdx mouse muscles The degree of fibrosis, muscle cell regeneration, and anti-apoptosis effects of Mdx mouse muscles by the administration of mesenchymal stem cells were confirmed. Specifically, the Mdx mouse to which WJ-MSC was administered in Example 1-1 was euthanized, and after removing the skin, the gastrocnemius muscle and diaphragm were removed and fixed in 4% paraformaldehyde for 24 hours. Thereafter, the muscle was embedded in paraffin, cut into 4 ⁇ m, and stained with Sirius Red to observe muscle fibrosis.
  • Muscle cell regeneration was performed by incubating fixed gastrocnemius muscle sections with Myosin heavy chain (MHC) antibody (#MAB4470, 1/1000 dilution; R&D Systems, MN, USA) for 18 hours at 4°C, followed by secondary Detection was performed by incubation with the antibody Alexa Fluor® 488 AffiniPure Goat Anti-mouse IgG (H+L) (A10680, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Then, the gastrocnemius muscle sections were counterstained with Hoechst 33342 (H1339, Thermo Fisher Scientific).
  • MHC Myosin heavy chain
  • Figure 1c shows the result of confirming the expression level of fibrosis area, myosin heavy chain (Myosin heavy chain, MHC) and annexin V after intravenous injection of WJ-MSC into Mdx mice.
  • Figure 1d shows the results of measuring the fibrotic area, myosin heavy chain (MHC), and annexin V expression levels with Image J after intravenous injection of WJ-MSC into Mdx mice.
  • MHC myosin heavy chain
  • WJ-MSC dose 3 exhibited a therapeutic effect with the lowest dose. That is, dose 3 was determined as the optimal dose for the treatment of muscular dystrophy because fibrosis relief, muscle regeneration, and anti-apoptosis effects did not significantly increase at high doses.
  • RNA sequencing and data analysis were performed. Specifically, total RNA was extracted from the mouse gastrocnemius skeletal muscle of Examples 1-3 using TRIzol Reagent (Invitrogen, Waltham, MA, USA). RNA quality was then assessed using an Agilent 2100 Bioanalyzer and RNA 6000 Pico Chips (Agilent Technologies, Amsterdam, The Netherlands) and RNA concentration was measured on a NanoDrop 2000 spectrophotometer (Thermo Fisher Scientific).
  • miRNA library construction was performed using the NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep kit (New England BioLabs, Inc., Ipswich, MA, USA), and single-end sequencing of 75 bp reads was used on the NextSeq500 system (Illumina, San Francisco). Diego, CA, USA) system to generate high-throughput sequences. Sequence reads were mapped using Bowtie 2, and mature miRNA (mature miRNA) sequences were used for reference. Read counts mapped to mature miRNA sequences were extracted from alignment files using bedtools (v2.25.0) and Bioconductor using the R statistical programming language (version 3.2.2; R development Core Team, 2011). Inter-sample comparisons were made using the quantile normalization method, and heatmap clustering was performed using MeV (version 4.9.0).
  • Figure 2a shows a heat map of miRNAs commonly expressed in humans, Mdx mice, and healthy mice.
  • Example 2-1 the expression level of miR-499-5p in muscular dystrophy was analyzed. Specifically, miRNA was isolated from the mouse gastrocnemius skeletal muscle of Examples 1-3 using the mirVanaTM miRNA Isolation Kit (Invitrogen). Then, the miRNA concentration was measured using a Qubit microRNA Assay kit and a Qubit 4 fluorometer (Invitrogen). The isolated miRNA was reverse transcribed into cDNA at a concentration of 5 ng/ ⁇ L using the TaqMan Advanced miRNA cDNA Synthesis Kit (Applied Biosystems, Waltham, MA, USA).
  • qPCR was performed on a QuantStudioTM 6 Flex Real-Time PCR system (Applied Biosystems) using TaqManTM Fast Advanced Master Mix (Applied Biosystems) in fast cycling mode.
  • Levels of hsa-miR-499-5p were measured using the TaqmanTM Advanced miRNA assay (Invitrogen). All reactions were performed in triplicate, and comparative quantification of each target gene was performed based on the cycle threshold (CT) normalized to miR-26a-5p using the DDCT method proposed by Livak and Schmittgen.
  • CT cycle threshold
  • Figure 2b shows the relative expression of miRNA-499 before and after intravenous injection of WJ-MSC into Mdx mice.
  • miR-499-5p is a miRNA that is down-regulated in Duchenne muscular dystrophy, and its expression level is increased by intravenous injection of mesenchymal stem cells.
  • Figure 2c is the result of confirming the expression level of miR-499-5p by MMP-1 protein.
  • RNA-499-5p by mesenchymal stem cells works through any mechanism in the treatment of muscular dystrophy.
  • target receptor of miRNA-499-5p was predicted by a bioinformatic method (TargetScan).
  • TargetScan bioinformatic method
  • highly assisted miR-466-5p target sites were detected in mouse TGF ⁇ R1 and TGF ⁇ R3.
  • direct binding to miRNA-499-5p was confirmed by measuring the expression levels of TGF ⁇ R1 and TGF ⁇ R3 mRNA.
  • total RNA was isolated from the mouse gastrocnemius skeletal muscle of Examples 1-3 using TRIzol Reagent. Afterwards, RNA was reverse transcribed into cDNA using SuperScript IV Reverse Transcriptase (Invitrogen).
  • PCR amplification was performed using the primers in Table 1 and 2 x Power SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems) after initial denaturation at 95 ° C for 10 minutes, followed by 15 seconds at 95 ° C and 55 seconds at 55 ° C for 40 seconds. repeated times.
  • Figure 3a shows the result of confirming the relative expression level of TGF ⁇ R1 before and after intravenous injection of WJ-MSC into Mdx mice.
  • Figure 3b is the result of confirming the relative expression level of TGF ⁇ R3 before and after intravenous injection of WJ-MSC into Mdx mice.
  • miR-499-5p targets TGF ⁇ R1 and TGF ⁇ R3, which are key factors of fibrosis.
  • Example 1-3 The anti-fibrotic effect in muscular dystrophy by mesenchymal stem cells was confirmed. Specifically, the skeletal muscle and diaphragm of the Mdx mice (3 dose injections) obtained in Example 1-3 were stained with H&E and Sirius Red in the same manner as in Example 1-3, and muscle fibrosis was observed. In addition, fibronectin antibody (ab2413, at 1/200 dilution, Abcam) was used as the primary antibody and Alexa Fluor® 594 AffiniPure Goat Anti-rabbit IgG (H+L) (A11037, Thermo Fisher Scientific) was used as the secondary antibody. Immunohistochemistry was performed in the same manner as in Examples 1-3 except for the above.
  • Figures 4a and 4b are the results of confirming the anti-fibrotic effect of skeletal muscle after intravenous injection of WJ-MSC to Mdx mice.
  • 4c and 4d are results confirming the anti-fibrotic effect of the diaphragm after intravenous injection of WJ-MSC into Mdx mice.
  • the Sirius Red staining area and fibronectin detection intensity were relatively increased in Mdx mice compared to the control group, but significantly decreased by injection of WJ-MSC.
  • the intensity of detection of fibronectin in myocytes and diaphragm tissue decreased to a level similar to or lower than that of the normal control group. That is, mesenchymal stem cells are effective in preventing or treating muscular dystrophy by reducing muscle fibrosis.
  • the level of Smad2/3 phosphorylation was measured by Western blotting.
  • the mouse myoblast cell line C2C12 (ACTC CRL-1772) was supplemented with 10% fetal bovine serum (Gibco BRL, MA, USA), 100 U/mL penicillin and 100 ⁇ g/mL streptomycin (Gibco BRL).
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle's medium (Biowest SAS, Nuaille, France) was cultured at 5% CO 2 and 37°C.
  • the culture medium was differentiated into myotubes while replacing the culture medium with a differentiation medium supplemented with 5% horse serum (Gibco BRL) for 5 days.
  • the root canal was scraped off the culture dish and placed in ice-cold radioimmunoprecipitation buffer (9.8 mol/L UREA, 4% CHAPS, 130 mmol/L dithiothreitol, 40 mmol/L Tris HCl, 0.1% sodium dodecyl sulfate, 1 mmol/L EDT). , and protease/phosphatase inhibitor cocktail) to extract total protein. Subsequently, proteins were quantified using Bradford assay (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA).
  • Equal amounts of protein were resolved by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis and transferred to polyvinylidene difluoride membranes (Bio-Rad Laboratories). After blocking with 5% skim milk, fibronectin (ab2413, 1/10,000 dilution, Abcam), p-smad2/3 (8828S, 1/1000 dilution, Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA), and smad2/ 3 (3102S, 1/1000 dilution, Cell Signaling Technology) overnight at 4°C.
  • the membrane was washed three times with TBST, and goat anti-rabbit IgG HRP-conjugated antibody (GTX213110-01, 1/10,000 dilution; GeneTex, Irvine, CA, USA) or goat anti-mouse IgG HRP-conjugated antibody (GTX213111 -01, 1/10,000 dilution; GeneTex) for 1 hour at room temperature.
  • goat anti-rabbit IgG HRP-conjugated antibody GTX213110-01, 1/10,000 dilution; GeneTex, Irvine, CA, USA
  • goat anti-mouse IgG HRP-conjugated antibody GTX213111 -01, 1/10,000 dilution; GeneTex
  • 5a and 5b show the results of measuring the phosphorylation level of Smad2/3 after intravenous injection of WJ-MSC into Mdx mice.
  • WJ-MSC present in the gastrocnemius muscle, heart, liver, lung, and spleen of Mdx mice intravenously injected with WJ-MSC in Example 1-1 were quantified.
  • PCR was performed in a 20 ⁇ L reaction containing 10 ⁇ L of 2 x Power SYBRTM Green PCR Master Mix (4367659, Thermo Fisher Scientific), 1 ⁇ L of each primer at 10 pmol/ ⁇ L, and 8 ⁇ L of DNA at various concentrations.
  • PCR was performed using the QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System (Thermo Fisher Scientific) in MicroAmp Optical 384-Well Reaction Plates (4326270, Thermo Fisher Scientific). After initial denaturation at 95°C for 10 minutes, the process of 95°C for 15 seconds and 68°C for 30 seconds was repeated 40 times.
  • Example 1-3 In order to confirm the therapeutic effect of mesenchymal stem cells on muscular dystrophy, the duration of the anti-fibrotic effect in muscle was confirmed. Specifically, the skeletal muscle of the Mdx mouse obtained in Example 1-3 was stained with Sirius Red in the same manner as in Example 1-3, and muscle fibrosis was observed.
  • 6b and 6c show the results of measuring fibrosis over time after intravenous injection of WJ-MSCs into Mdx mice.
  • fibrosis-induced myotubes were treated with 10 ⁇ M glaunisertib (LY2157299, S2230, Selleck Chemicals, Houston, TX, USA) for 24 hours in a serum-free medium. Thereafter, Sirius Red staining was performed in the same manner as in Examples 1-3 to confirm collagen accumulation, and immunohistochemistry was performed to confirm deposition of collagen I.
  • a primary antibody against myosin heavy chain #MAB4470, diluted 1/10,000; R&D Systems
  • Figure 7a shows the results of miR-499-5p transfection or TGF- ⁇ inhibitor treatment after oxidative stress was induced in mouse myotubes.
  • 7D shows the results of confirming the expression of myosin heavy chain, fibronectin, and p-smad2/3 by inducing oxidative stress in mouse myotubes, transfecting miR-499-5p or treating them with a TGF- ⁇ inhibitor.
  • the expression of fibronectin and p-smad2/3 was markedly increased by H 2 O 2 , and fibronectin and p-smad2 by miR-499-5p transfection or galunisertip treatment. It was confirmed that the expression level of /3 was lower than that of the normal control group. On the other hand, the expression of myosin heavy chain was decreased by H 2 O 2 , but it was confirmed that it was significantly increased by miR-499-5p transfection or galunisertip treatment. That is, since miR-499-5p can exhibit an anti-fibrotic effect by inhibiting the TGF- ⁇ signaling pathway, it can be used to prevent or treat Duchenne muscular dystrophy.

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Abstract

miR-499-5p 활성화제를 포함하는 뒤센 근이영양증 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, miR-499-5p 활성화제는 근관 세포에서 MMP-1을 발현함으로써 miR-499-5p의 발현을 촉진하고, TGF-β 수용체의 활성화 및 smad2/3 인산화를 하향조절함으로써 섬유성 근육을 회복하는바, 뒤센 근이영양증의 예방 또는 치료에 이용될 수 있다.

Description

miR-499-5p 활성화제를 포함하는 뒤센 근이영양증 예방 또는 치료용 조성물
본 출원은 2021년 12월 23일 출원된 대한민국 특허출원 제 10-2021-0186584호를 우선권으로 주장하고, 상기 명세서 전체는 본 출원의 참고문헌이다.
miR-499-5p 활성화제를 포함하는 뒤센 근이영양증 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
뒤센 근이영양증(Duchenne muscular Dystrophy, DMD)은 근육량과 기능의 점진적인 손실을 특징으로 하는 X-염색체 관련 열성 장애이다. 이는 남성의 약 3,500분의 1의 확률로, 디스트로핀 유전자의 돌연변이에 의해 발생한다. 진행성 골격 및 심장 근육 약화가 특징이며, 보통 약 20세에 조기 사망한다. 현재 뒤센 근이영양증에 대한 효과적인 치료방법은 없으며, 질병의 진행을 완화시키는 치료만이 있다. 전임상 및 임상 연구에서 뒤센 근이영양증에 대한 다양한 치료적 접근 방법이 시도되고 있으나, 현재까지 임상 경과가 효과적으로 나타난 치료법은 보고되지 않았다. 뿐만 아니라, 현재 개발 중인 대부분의 치료방법은 디스트로핀에 대한 단일 표적을 타겟으로 하는 유전자 치료법에 불과하다. 뒤센 근이영양증에는 근육 변성, 염증 및 섬유증과 같은 여러 병원성 기전이 관련되어 있으므로 다중 표적 약물 치료가 더 효과적일 수 있다.
최근 수많은 임상 시험에서는 중간엽줄기세포가 다양한 병리학에 대하여 안전하고 유익한 치료 방법임을 보여주고 있다. 중간엽줄기세포는 자가 또는 동종 공급원에서 얻을 수 있는 중배엽 조직 유래 세포로서, 지방, 연골 및 골 형성 계통으로 분화될 수 있으며 근육 조직에 생착하여 근육세포로의 분화가 가능하다. 또한, 중간엽줄기세포에서 분비되는 다양한 단백질은 치료 효과가 있으며, 파라크린(paracrine) 인자는 병변 부위의 염증 및 면역 반응을 조절하여 항상성을 유지함으로써, 다중 표적 치료를 가능하게 한다.
따라서, 병변 부위의 염증 및 면역 반응을 조절하여 뒤센 근이영양증을 효과적으로 치료할 수 있는 새로운 치료법의 개발이 필요하다.
일 양상은 miR-499-5p 활성화제를 포함하는 뒤센 근이영양증(Duchenne muscular Dystrophy, DMD) 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
다른 양상은 miR-499-5p 활성화제를 포함하는 뒤센 근이영양증 치료용 세포치료제를 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 miR-499-5p의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 뒤센 근이영양증 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 상기 조성물을 포함하는 뒤센 근이영양증 진단용 키트를 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 개체의 시료에서 miR-499-5p의 발현 수준을 측정하는 단계;를 포함하는 뒤센 근이영양증 진단을 위한 정보제공방법을 제공하는 것이다.
일 양상은 miR-499-5p 활성화제를 포함하는 뒤센 근이영양증(Duchenne muscular Dystrophy, DMD) 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 다른 양상은 miR-499-5p 활성화제를 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 뒤센 근이영양증 예방 또는 치료 방법을 제공한다. 또 다른 양상은 miR-499-5p 활성화제를 포함하는 약학적 조성물의 뒤센 뒤센 근이영양증(Duchenne muscular Dystrophy, DMD) 예방 또는 치료용도를 제공한다.
본 명세서에서 용어, "microRNA(또는 miRNA, miR)"는 21~25nt의 단일 가닥 RNA 분자로서 mRNA의 3'UTR에 결합하여 진핵생물의 유전자 발현을 조절하는 물질이다. 즉, 상기 microRNA는 표적단백질의 발현을 조절함으로써 발생, 세포증식 및 사멸, 지방대사, 종양형성 등에 관여한다. 일 구체예에 있어서, 상기 miR-499-5p는 이의 활성을 저하하지 않는 변화를 갖는 기능적 등가물인 하나 이상의 치환, 삽입, 결실 및 이들의 조합을 갖는 변형체를 포함한다. 일 실시예에서는 상기 miR-499-5p가 TGF-β 수용체를 하향-조절함으로써 섬유화된 근육의 회복을 촉진하는 것을 확인하였다. 따라서, 상기 miR-499-5p는 TGF-β 수용체와 특이적으로 결합할 수 있다. 상기 TGF-β 수용체는 예를 들어, TGFβR1, TGFβR3 등인 것일 수 있다. 즉, 상기 miR-499-5p는 상기 TGF-β 수용체와 특이적으로 결합함으로써 항-섬유화 효과를 가질 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 miR-499-5p 활성화제는 중간엽줄기세포인 것일 수 있다. 상기 중간엽줄기세포는 제대, 제대혈, 골수, 태반, 지방 등으로부터 유래된 것일 수 있다. 탯줄은 포유류의 태아가 태반에서 성장할 수 있도록 모체와 배를 연결해주는 줄을 의미할 수 있으며, 일반적으로 와튼 젤리(Wharton's Jelly)로 둘러싸인 3개의 혈관, 즉, 2개의 배꼽 동맥과 1개의 배꼽 정맥으로 구성된 조직을 의미할 수 있다. 따라서, 일 구체예에 있어서, 상기 중간엽줄기세포는 제대 또는 제대혈 유래 중간엽줄기세포일 수 있으며, 구체적으로 왓튼 젤리-유래 중간엽줄기세포(Wharton's jelly-derived mesenchymal stem cells, WJ-MSCs)인 것일 수 있다. 일 실시예에서는 Mdx 마우스에서 중간엽줄기세포에서 유도된 MMP-1에 의하여 miR-499-5p 발현 수준이 증가됨으로써 항-섬유화 효과를 나타내는 것을 확인하였다. 따라서, 다른 구체예에 있어서, 상기 중간엽줄기세포는 MMP-1을 발현하거나, 모세포에 비하여 MMP-1을 과발현하도록 유전적으로 조작된 것일 수 있다.
일 실시예에서는 3~5개월령의 Mdx 마우스에 WJ-MSCs을 특정 세포 수로 정맥 주사함으로써 세포 내 크레아틴 키나아제 감소, 행동 회복, 근육 재생, 세포사멸 억제 및 섬유화 감소 등과 같은 골격근 치료 효과를 확인하였다. 즉, Mdx 마우스에서 WJ-MSCs의 용량 의존적 효과와 국소 투여가 아닌 단일 정맥 투여에 의한 골격근 치료를 확인하였고, Mdx 마우스의 골격근에서 miR-499-5p 발현이 변화하는 것을 함으로써 뒤센 근이영양증의 치료를 위한 WJ-MSCs의 최적 용량 및 용법을 밝혀냈다. 따라서, 상기 조성물은 1x102 내지 1x108 세포 수의 중간엽줄기세포를 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 조성물은 1x102 내지 1x108 세포 수, 1x103 내지 1x107 세포 수, 5x103 내지 1x107 세포 수, 5x103 내지 5x106 세포수, 1x104 내지 1x106 세포 수, 5x104 내지 1x106 세포 수로 중간엽줄기세포를 포함할 수 있다. 이때, 상기 중간엽줄기세포의 함량이 상기 범위 미만이거나 또는 상기 범위를 초과하는 경우, 크레아틴 키나제 수준 감소, 근력 증가 효과 및 섬유화 완화 효과를 충분히 발휘 할 수 없다는 문제점이 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 조성물은 정맥 투여되는 것일 수 있다.
일반적으로 뒤센 근이영양증은 진행성 근이영양증 중에서 가장 발생 빈도가 높은 질환으로, 발병 초기에 비복근이 딱딱해지고 비대해지면서 점진적으로 몸 전체의 골격과 심장 근육의 퇴화 및 약화가 나타난다. 한편, 근육 주사(Intramuscular, IM)는 근육에 약제를 직접 투여하는 것으로 근육에 혈관이 풍부하기 때문에 흡수가 빠르다는 장점이 있다. 그러나, 근육에 상기 조성물을 직접 투여하는 경우, 조성물 내 함유된 줄기세포가 투여 부위로부터 주변부로의 이동이 제한적이기 때문에, 여러 부위에 수 차례 투여해야하는 문제점이 있다. 반면, 정맥 주사(Intravenous, IV)는 약물이 1~2분 내 심장을 거쳐 신체의 필요한 조직에 도달하기 때문에 약효가 신속하고 반응이 확실하다. 특히, 줄기세포는 손상된 부위로 스스로 찾아갈 수 있는 능력, 즉 호밍 효과(Homing effect)를 나타낼 수 있기 때문에 병증이 나타나는 골격 근육이나 횡경막 부위로 이동하여 치료 효과를 나타낼 수 있다. 일 실시예에서는 정맥에 WJ-MSC을 투여한 정상 대조군과 Mdx 마우스의 비복근 내 정맥에 WJ-MSC의 분포를 확인한 결과, 정상 대조군에 비하여 Mdx 마우스의 비복근에서 더 많은 세포가 잔존해 있음을 확인할 수 있었다. 즉, 뒤센 근이영양증 개체의 정맥에 miR-499-5p 활성화제(예를 들어, WJ-MSC)를 포함하는 조성물을 주사함으로써, 상기 활성화제가 비복근 내로 이동하여 치료 효과를 나타낼 수 있는바, 뒤센 근이영양증의 초기 치료에 효과적이다.
일 양상에 따른 뒤센 근이영양증의 예방 또는 치료용 약학 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구제 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화되어 사용할 수 있고, 제형화를 위하여 약학 조성물의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다.
상기 담체 또는, 부형제 또는 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리게이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 포함한 다양한 화합물 혹은 혼합물을 들 수 있다.
제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 중량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 제조할 수 있다.
경구 투여를 위한 고형제제는 상기 두류 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘보네이트, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 제조할 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용할 수 있다.
경구를 위한 액상 제제로는 현탁액, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용하는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등을 포함할 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수용성제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등을 사용할 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤젤라틴 등을 사용할 수 있다.
일 양상에 따른 뒤센 근이영양증의 예방 또는 치료용 약학 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태, 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서는 1일 0.0001 내지 2,000 mg/kg으로, 바람직하게는 0.001 내지 2,000 mg/kg으로 투여할 수 있다. 투여는 하루에 한 번 투여할 수도 있고, 수회 나누어서 투여할 수도 있다. 다만, 상기 투여량에 의해서 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
일 양상에 따른 뒤센 근이영양증의 예방 또는 치료용 약학 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유 동물에 다양한 경로로 투여할 수 있다. 투여의 모든 방식은 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관내(intracerebroventricular) 주사에 의해서 투여할 수 있다.
다른 양상은 miRNA-499-5p 활성화제를 유효성분으로 포함하는 뒤센 근이영양증의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다. 상기 miRNA-499-5p 활성화제의 구체적인 내용은 전술한 바와 같다.
일 양상에 따른 뒤센 근이영양증의 예방 또는 개선용 건강기능식품에 있어서, 상기 화합물을 건강기능식품의 첨가물로 사용하는 경우 이를 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 예방, 건강 또는 치료 등의 각 사용 목적에 따라 적합하게 결정할 수 있다.
건강기능식품의 제형은 산제, 과립제, 환, 정제, 캡슐제의 형태뿐만 아니라 일반 식품 또는 음료의 형태 어느 것이나 가능하다.
상기 식품의 종류에는 특별히 제한은 없고, 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸콜렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 식품을 모두 포함할 수 있다.
일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 상기 화합물은 원료 100 중량부에 대하여 15 중량부 이하, 바람직하게는 10 중량부 이하의 양으로 첨가할 수 있다. 그러나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 또한 천연물로부터의 분획물을 이용하는 점에서 안전성 면에서 문제가 없으므로 상기 범위 이상의 양으로도 사용할 수 있다.
일 양상에 따른 건강기능식품 중 음료는 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜일 수 있다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명에 따른 음료 100 mL당 약 0.01 ~ 0.04 g, 바람직하게는 약 0.02 ~ 0.03 g일 수 있다.
상기 외에 일 양상에 따른 뒤센 근이영양증의 예방 또는 개선용 건강기능식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제를 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 수면 개선용 조성물은 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 혼합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 제한되지 않으나 본 발명의 건강기능식품 100 중량부 대비 0.01 ~ 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
다른 양상은 miR-499-5p 활성화제를 포함하는 뒤센 근이영양증의 치료용 세포치료제를 제공한다. 상기 miR-499-5p 활성화제의 구체적인 내용은 전술한 바와 같다.
본 명세서에서 용어, "세포치료제"는 세포와 조직의 기능을 복원하기 위하여 살아있는 자가(autologous), 동종(allogenic), 또는 이종(xenogenic)의 세포를 체외에서 증식, 선별하거나 여러가지 방법으로 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 일련의 행위를 통하여 치료, 진단, 예방의 목적으로 하는 의약품을 의미한다.
상기한 바와 같이, 일 양상에 따른 miR-499-5p 활성화제는 근관 세포에서 MMP-1을 발현함으로써 miR-499-5p의 발현을 촉진하고, TGF-β 수용체의 활성화 및 smad2/3 인산화를 하향조절함으로써 섬유성 근육을 회복하는바, 뒤센 근이영양증의 예방 또는 치료에 이용될 수 있다.
다른 양상은 miR-499-5p의 발현 수준을 특이적으로 검출할 수 있는 제제를 포함하는 뒤센 근이영양증 진단용 조성물을 제공한다. 상기 miR-499-5p의 구체적인 내용은 전술한 바와 같다.
본 명세서에서 용어, "miRNA의 발현 수준을 특이적으로 검출할 수 있는 제제"란 개체의 시료 내에서 상기 miRNA을 특이적으로 확인하거나 검출하기 위하여 사용할 수 있는 물질을 의미한다. 상기 제제는 예를 들어, 프라이머, 프로브 또는 안티센스 핵산 등인 것일 수 있다.
또 다른 양상은 상기 조성물을 포함하는 뒤센 근이영양증 진단용 키트를 제공한다. 상기 조성물의 구체적인 내용은 전술한 바와 같다.
상기 키트는 miR-499-5p의 발현 수준을 특이적으로 검출할 수 있는 프라이머, 프로브 또는 안티센스 핵산이 포함될 수 있고, 이에 추가로 분석에 적합한 1종 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치가 포함될 수 있다. 일 구체예에 있어서, 상기 키트는 RT-PCR 키트, 마이크로어레이 칩 키트, 단백질 키트인 것일 수 있다.
또 다른 양상은 개체의 생물학적 시료에서 miR-499-5p의 발현 수준을 측정하는 단계;를 포함하는 뒤센 근이영양증 진단을 위한 정보제공방법을 제공한다. 상기 miR-499-5p의 구체적인 내용은 전술한 바와 같다. 일 구체예에 있어서, 상기 방법은 대조군과 비교하여 miR-499-5p의 발현 수준이 감소하는 경우, 뒤센 근이영양증인 것으로 판단하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 개체는 뒤센 근이영양증을 진단하고자 하는 환자를 의미한다. 상기 개체는 척추동물일 수 있고, 포유류, 양서류, 파충류, 조류 등일 수 있고, 포유동물일 수 있으며, 예를 들면 인간 (Homo sapiens), 한국인일 수 있다.
상기 생물학적 시료는 개체로부터 분리된 조직, 종양 조직, 폐 종양 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액 또는 뇨와 같은 시료 등을 포함할 수 있다.
상기 miR-499―5p의 발현 수준 측정은 웨스턴 블랏팅 (Western blotting), 역전사 중합효소반응 (RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응 (Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응 (Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법 (RNase protection assay: RPA), 노던 블랏팅 (Northern blotting), DNA 칩 등에 의해 수행될 수 있다.
또 다른 양상은 miR-499-5p와 피검 물질을 접촉시키는 단계; 무처리 대조군에 비하여 상기 miR-499-5p의 발현 수준을 증가시킨 피검 물질을 뒤센 근이영양증 치료제로 선별하는 단계를 포함하는 뒤센 근이영양증의 치료제 스크리닝 방법을 제공한다. 또 다른 양상은 정상 대조군에 비해 miR-499-5p0의 발현이 감소된 근육 세포에 피검 물질을 접촉시키는 단계; 상기 근육 세포의 피브로넥틴 또는 p-smad2/3의 수준을 측정하는 단계; 및 상기 피검 물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 피브로넥틴 또는 p-smad2/3의 수준을 감소시킨 피검 물질을 뒤센 근이영양증 치료제로 선별하는 단계를 포함하는 뒤센 근이영양증의 치료제 스크리닝 방법을 제공한다. 상기 miR-499-5p의 구체적인 내용은 전술한 바와 같다. 상기 피검 물질, 예를 들면, 약물 후보 물질, 피검 화합물 또는 피검 조성물은 저분자 화합물, 항체, 안티센스 뉴클레오티드, 작은 간섭 RNA(short interfering RNA), 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA), 핵산, 단백질, 펩티드, 기타 추출물 또는 천연물을 포함할 수 있다. 상기 접촉은 시험관 내(in vitro)에서 수행되는 것일 수 있다.
일 양상에 따른 조성물은 miR-499-5p 활성화제는 근관 세포에서 MMP-1을 발현함으로써 miR-499-5p의 발현을 촉진하고, TGF-β 수용체의 활성화 및 smad2/3 인산화를 하향조절함으로써 섬유성 근육을 회복하는 바, 뒤센 근이영양증의 예방 또는 치료에 이용될 수 있다.
도 1a는 Mdx 마우스 모델에 WJ-MSC를 정맥 주사한 후, 마우스 근력을 측정한 결과를 나타낸다.
도 1b는 Mdx 마우스에 WJ-MSC를 정맥 주사한 후, 혈청 내 크레아틴 키나제 수준을 측정한 결과이다.
도 1c는 Mdx 마우스에 WJ-MSC를 정맥 주사한 후, 섬유화 영역, 미오신 중쇄(Myosin heavy chain, MHC) 및 아넥신 V 발현 수준을 확인한 결과이다.
도 1d는 Mdx 마우스에 WJ-MSC를 정맥 주사한 후, 섬유화 영역, 미오신 중쇄(Myosin heavy chain, MHC) 및 아넥신 V 발현 수준을 이미지 J로 측정한 결과이다.
도 2a는 인간과 Mdx 마우스 및 건강한 마우스에서 공통적으로 발현되는 miRNA을 히트맵으로 나타낸 것이다.
도 2b는 Mdx 마우스에 WJ-MSC를 정맥 주사하기 전과 후의 상대적 miRNA-499 발현을 나타낸 것이다.
도 2c는 MMP-1 단백질에 의한 miR-499-5p의 발현 수준을 확인한 결과이다.
도 3a는 Mdx 마우스에 WJ-MSC를 정맥 주사하기 전과 후의 상대적 TGFβR1의 발현 수준을 확인한 결과이다.
도 3b는 Mdx 마우스에 WJ-MSC를 정맥 주사하기 전과 후의 상대적 TGFβR3의 발현 수준을 확인한 결과이다.
도 4a 및 도 4b는 Mdx 마우스에 WJ-MSC를 정맥 주사한 후, 골격근의 항-섬유화 효과를 확인한 결과이다.
도 4c 및 도 4d는 Mdx 마우스에 WJ-MSC를 정맥 주사한 후, 횡경막의 항-섬유화 효과를 확인한 결과이다.
도 5a 및 도 5b는 Mdx 마우스에 WJ-MSC를 정맥 주사한 후, Smad2/3 인산화 수준을 측정한 결과이다.
도 6a는 정상 대조군 및 Mdx 마우스에 WJ-MSC를 정맥 주사한 후, 기관 내 DNA를 정량화한 결과이다.
도 6b 및 도 6c는 Mdx 마우스에 WJ-MSC를 정맥 주사한 후, 시간에 따른 섬유화를 측정한 결과이다.
도 7a는 마우스 근관에 산화적 스트레스를 유발한 후, miR-499-5p의 형질주입 또는 TGF-β 억제제를 처리한 결과를 나타내는 것이다.
도 7b는 마우스 근관에 산화적 스트레스를 유발한 후, miR-499-5p로 형질주입하여 근관에서의 콜라겐 축적을 확인한 결과이다.
도 7c는 마우스 근관에 산화적 스트레스를 유발한 후, miR-499-5p로 형질주입하여 근관에서의 콜라겐 Ⅰ 침적을 확인한 결과이다.
도 7d는 마우스 근관에 산화적 스트레스를 유발한 후, miR-499-5p 형질주입 또는 TGF-β 억제제를 처리하여 미오신 중쇄, 피브로넥틴, p-smad2/3의 발현을 확인한 결과이다.
도 8은 뒤센근이영양증의 골격근에서 miR-499-5p에 의한 항-섬유화 효과를 나타내는 것이다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1. 왓튼젤리-유래 중간엽줄기세포(WJ-MCS)의 근이영양증 치료 효과 확인
1-1. 그립 강도 측정(Grip Strength Measurements)
중간엽줄기세포의 근이영양증 치료 효과를 확인하기 위하여 마우스의 앞다리 및 뒷다리의 근력을 측정하였다. 먼저, 왓튼 젤리-유래 중간엽줄기세포(Wharton's jelly-derived mesenchymal stem cells, WJ-MSCs)를 공지된 방법에 따라 분리한 후, 삼성서울병원의 우수의약품제조 및 품질관리시설(Good Manufacturing Practice facility)의 표준운영절차에 따라 배양하였다. 이후, 3~5개월령의 뒤센 근이영양증 C57BL/10ScSn-Dmdmdx/J (mdx) 마우스(The Jackson Laboratory, USA)의 꼬리 측면에 상기 WJ-MSCs를 다양한 용량(dose)(5 x 103(용량 1), 1 x 104(용량 2), 5 x 104(용량 3), 1 x 105(용량 4), 5 x 105(용량 5))으로 정맥 투여하였다. 덩어리진 세포는 혈관 내 색전증을 유발할 수 있으므로, 주입 전에 상기 WJ-MSC를 PBS 100 μL에 혼합하여 현탁액을 만든 후, 가능한 한 천천히 주입하였다. 이후, 그립 강도 측정기(BIO GS3, BIOSEB, Vitrolles, France)를 사용하여 마우스의 앞다리 및/또는 뒷다리의 근력을 측정하였다. 대조군으로는 C57BL/10ScSnJ 마우스(The Jackson Laboratory, USA)를 사용하였다.
도 1a는 Mdx 마우스 모델에 WJ-MSC를 정맥 주사한 후, 마우스 근력을 측정한 결과를 나타낸다.
그 결과, 도 1a에 나타낸 바와 같이, WJ-MSC를 투여하지 않은 대조군과 비교하여 WJ-MSC를 투여한 Mdx 마우스의 앞다리(좌)와 앞다리 및 뒷다리(우) 근력이 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 특히, 용량 1 내지 3에서 농도 의존적으로 근력이 증가하였으며, 용량 4 이상에서는 감소하는 경향을 나타내었다. 즉, WJ-MSC를 특정한 용량으로 투여함으로써 근력 상승 효과를 나타낼 수 있다.
1-2. 혈청 내 크레아틴 키나제(Creatine Kinase, CK) 수준 측정
중간엽줄기세포의 투여 용량에 의한 증상 완화 효과를 확인하기 위하여 마우스 혈청 내 크레아틴 키나제(Creatine Kinase, CK)의 수준을 측정하였다. 구체적으로, 상기 실시예 1-1에서 WJ-MSC를 투여한 Mdx 마우스의 안와후방 신경총의 출혈(Retro-orbital plexus bleeding)을 유발하여 마우스 혈액을 수집한 후, 22~24℃에서 1시간 이상 인큐베이션하고, 15,000x g에서 10분 동안 원심분리하여 투명한 혈청의 상층을 수집하였다. 이후, Creatine Kinase Activity Assay Kit (Colorimetric)를 사용하여 혈청 내 크레아틴 키나제 활성을 측정하였다.
도 1b는 Mdx 마우스에 WJ-MSC를 정맥 주사한 후, 혈청 내 크레아틴 키나제 수준을 측정한 결과이다.
그 결과, 도 1b에 나타낸 바와 같이, WJ-MSC를 투여하지 않은 대조군과 비교하여, WJ-MSC를 투여한 Mdx 마우스에서 크레아틴 키나제의 수준이 유의적으로 감소하였다. 특히, 용량 3 내지 5의 투여시 더 낮은 용량과 비교하여 크레아틴 키나제 수준의 현저한 감소량을 나타내었다.
1-3. 근육 내 섬유화 수준, 근육세포 재생 및 항-세포사멸 효과 확인
중간엽줄기세포의 투여에 의한 Mdx 마우스 근육의 섬유화 정도, 근육세포 재생 및 항-세포사멸 효과를 확인하였다. 구체적으로, 상기 실시예 1-1에서 WJ-MSC를 투여한 Mdx 마우스를 안락사 시키고, 피부를 제거한 후 비복근 및 횡경막을 제거하여 4% 파라포름알데히드에 24시간 동안 고정시켰다. 이후, 근육을 파라핀에 포매하여(embedded in) 4 ㎛로 절단하고 Sirius Red로 염색하여 근섬유화를 관찰하였다. 근육세포 재생은 고정된 비복근 절편을 미오신 중쇄(Myosin heavy chain, MHC) 항체 (#MAB4470, 1/1000로 희석; R&D Systems, MN, USA)와 함께 4℃에서 18시간 동안 배양한 후, 2차 항체인 Alexa Fluor® 488 AffiniPure Goat Anti-mouse IgG (H+L) (A10680, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)와 함께 배양하여 검출하였다. 이후, 상기 비복근 절편을 Hoechst 33342(H1339, Thermo Fisher Scientific)로 대조 염색하였다.
도 1c는 Mdx 마우스에 WJ-MSC를 정맥 주사한 후, 섬유화 영역, 미오신 중쇄(Myosin heavy chain, MHC) 및 아넥신 V 발현 수준을 확인한 결과이다.
도 1d는 Mdx 마우스에 WJ-MSC를 정맥 주사한 후, 섬유화 영역, 미오신 중쇄(Myosin heavy chain, MHC) 및 아넥신 V 발현 수준을 이미지 J로 측정한 결과이다.
그 결과, 도 1c 및 도 1d에 나타낸 바와 같이, WJ-MSC를 투여하지 않은 대조군과 비교하여, WJ-MSC를 투여한 Mdx 마우스에서 Sirius Red 염색 영역이 유의하게 감소하였으며, 용량 3 투여시 섬유증 완화 효과를 나타내었다. 또한, WJ-MSC를 투여하지 않은 대조군과 비교하여, WJ-MSC를 투여한 Mdx 마우스에서 미오신 중쇄의 강도가 유의하게 증가하였으며, 용량 3 투여시 미오신 중쇄의 강도가 현저하게 증가하여 근육세포 재생 효과를 나타내었다. 또한, WJ-MSC를 투여하지 않은 대조군과 비교하여, WJ-MSC를 투여한 Mdx 마우스에서는 WJ-MSC 용량 1 내지 3 투여시 아넥신 V 발현 수준이 농도 의존적으로 감소하였으나, 용량 4 투여시 아넥신 V 발현 수준이 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 상기와 같은 결과로부터 WJ-MSC 용량 3이 가장 적은 투여량으로 치료 효과를 나타내는 것을 확인할 수 있었다. 즉, 섬유증 완화, 근육재생 및 항-세포사멸 효과가 고용량에서 유의하게 증가하지 않았기 때문에 근이영양증 치료를 위한 최적의 용량으로 용량 3을 결정하였다.
실시예 2. 근이영양증에서 발현되는 miRNA 시퀀싱 및 분석
2-1. 근이영양증에서 차별 발현되는 miRNA 확인
근이영양증에서 차별 발현되는 miRNA를 확인하기 위하여, miRNA 시퀀싱 및 데이터 분석을 수행하였다. 구체적으로, 상기 실시예 1-3의 마우스 비복근 골격근(skeletal muscle)에서 TRIzol Reagent (Invitrogen, Waltham, MA, USA)를 이용하여 총 RNA를 추출하였다. 이후, Agilent 2100 Bioanalyzer 및 RNA 6000 Pico Chips(Agilent Technologies, Amsterdam, The Netherlands)를 사용하여 RNA 품질을 평가하고 NanoDrop 2000 분광광도계(Thermo Fisher Scientific)에서 RNA 농도를 측정하였다. miRNA 라이브러리 구성은 NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep kit(New England BioLabs, Inc., Ipswich, MA, USA)를 사용하여 수행하였으며, 75bp 리드(reads)의 단일-말단 시퀀싱을 사용하여 NextSeq500 system (Illumina, San Diego, CA, USA) 시스템에서 고 처리량(High-throughput) 서열을 생성하였다. 서열 리드는 Bowtie 2를 사용하여 매핑(mapping)하였고, 참조를 위하여 성숙한 miRNA(mature miRNA) 서열을 사용하였다. 성숙한 miRNA 서열에 매핑된 리드 카운트를 bedtools(v2.25.0) 및 R 통계 프로그래밍 언어(버전 3.2.2; R development Core Team, 2011)를 사용하는 Bioconductor를 사용하여 정렬 파일에서 추출하였다. 분위수 정규화 방법을 사용하여 샘플 간 비교하였고, MeV(버전 4.9.0)를 사용하여 히트맵 클러스터링을 수행하였다.
도 2a는 인간과 Mdx 마우스 및 건강한 마우스에서 공통적으로 발현되는 miRNA을 히트맵으로 나타낸 것이다.
그 결과, 도 2a에 나타낸 바와 같이, 건강한 마우스와 비교하여 근이영양증 마우스에서 몇몇의 miRNA가 하향 조절되었으며, 그 중에서도 miR-499-5p의 발현이 가장 많이 감소하는 것을 확인할 수 있었다.
2-2. 근이영양증에서 miR-499-5p의 발현 수준 확인
상기 실시예 2-1의 miRNA 시퀀싱 결과를 확인하기 위하여, 근이영양증에서 miR-499-5p의 발현 수준을 분석하였다. 구체적으로, 상기 실시예 1-3의 마우스 비복근 골격근(skeletal muscle)에서 mirVana쪠 miRNA Isolation Kit(Invitrogen)를 사용하여 miRNA를 분리하였다. 이후, Qubit microRNA Assay kit와 Qubit 4 fluorometer(Invitrogen)를 이용하여 miRNA 농도를 측정하였다. TaqMan쪠 Advanced miRNA cDNA 합성 키트(Applied Biosystems, Waltham, MA, USA)를 사용하여 5 ng/μL의 농도에서 분리된 miRNA를 cDNA로 역전사 하였다. 이후, 빠른 사이클링 모드에서 TaqMan쪠 Fast Advanced Master Mix(Applied Biosystems)를 사용하여 QuantStudio쪠 6 Flex Real-Time PCR 시스템(Applied Biosystems)에서 qPCR을 수행하였다. Taqman쪠 Advanced miRNA 분석(Invitrogen)을 사용하여 hsa-miR-499-5p(분석 ID: 478139_mir)의 수준을 측정하였다. 모든 반응은 3회 수행되었으며, 각 표적 유전자의 비교 정량은 Livak과 Schmittgen이 제안한 DDCT 방법을 사용하여 miR-26a-5p로 정규화한 사이클 임계값(CT)을 기반으로 수행하였다.
도 2b는 Mdx 마우스에 WJ-MSC를 정맥 주사하기 전과 후의 상대적 miRNA-499 발현을 나타낸 것이다.
그 결과, 도 2b에 나타낸 바와 같이, 정상 대조군에 비하여 Mdx 마우스에서 miR-499-5p의 발현이 상대적으로 감소였으나, Mdx 마우스에 WJ-MSC를 주사한 경우, miR-499-5p의 발현이 현저하게 증가한 것을 확인할 수 있었다. 즉, miR-499-5p는 뒤센 근이영양증에서 하향조절되는 miRNA로서, 중간엽줄기세포의 정맥 주사에 의해 발현 수준이 증가하는 것을 알 수 있다.
2-3. MMP-1 단백질에 의한 miR-499-5p 발현 수준 증가 확인
이전 연구에서 WJ-MSC가 근관에서 MMP-1을 통해 Mdx 마우스 및 in vitro 섬유증 모델의 골격근 섬유증을 완화시키는 것을 확인한 바 있다. 따라서, 상기 결과를 바탕으로 MMP-1 단백질에 의하여 miR-499-5p 발현 수준의 증가 여부를 확인하였다. 구체적으로, 인간 재조합 MMP-1 20 ng을 Mdx 마우스의 비복근에 주사한 후, 7일째 되는 날 마우스를 희생시켰다. 이후, 상기 실시예 2-2와 동일한 방법으로 miR-499-5p의 발현 수준을 확인하였다.
도 2c는 MMP-1 단백질에 의한 miR-499-5p의 발현 수준을 확인한 결과이다.
그 결과, 도 2c에 나타낸 바와 같이, 대조군과 비교하여 Mdx 마우스에서 miR-499-5p의 발현이 감소하였으나, MMP-1 단백질에 의하여 Mdx 마우스에서 miR-499-5p의 발현 수준이 대조군의 miR-499-5p 발현 수준 이상을 회복한 것을 확인할 수 있었다. 즉, WJ-MSC는 MMP-1를 유도하여 근이영양증에서 miR-499-5p의 발현 수준을 증가시키는 바, 항-섬유화 효과를 나타낼 수 있다.
실시예 3. miRNA-499-5p의 표적 수용체 확인
중간엽줄기세포에 의한 miR-499-5p의 증가가 근이영양증 치료에 있어서 어떠한 메커니즘을 통해 작용하는지 여부를 확인하였다. 먼저, 생물정보학적 방법(TargetScan)으로 miRNA-499-5p의 표적 수용체를 예측하였다. 그 결과, 마우스 TGFβR1 및 TGFβR3에서 고도로 보조된 miR-466-5p 표적 부위가 감지되었다. 이에 따라, TGFβR1 및 TGFβR3 mRNA 발현 수준을 측정하여 miRNA-499-5p와 직접적으로 결합하는지 여부를 확인하였다. 구체적으로, 상기 실시예 1-3의 마우스 비복근 골격근(skeletal muscle)에서 TRIzol Reagent를 사용하여 총 RNA를 분리하였다. 이후, SuperScript IV Reverse Transcriptase (Invitrogen)를 사용하여 RNA를 cDNA로 역전사 하였다. PCR 증폭은 하기 표 1의 프라이머 및 2 x Power SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems)을 사용하여 95℃에서 10분 동안 초기 변성(denaturation)후, 95℃에서 15초 및 55℃에서 55초의 과정을 40 회 반복하였다.
단백질 서열번호 프라이머
GAPDH 1 정방향 5'-CATGGCCTTCCGTGTTCCTA-3'
2 역방향 5'-CATGGCCTTCCGTGTTCCTA-3'
mouse TGFβR1 3 정방향 5'-ATGGGCTTAGTGTTCTGG-3'
4 역방향 5'-CCTGTTGGCTGAGTTGTG-3'
mouse TGFβR3 5 정방향 5'-GGAGGTGCATGTCCTGAATC-3'
6 역방향 5'-CAGACTTGTGGTGGATGTGG-3'
도 3a는 Mdx 마우스에 WJ-MSC를 정맥 주사하기 전과 후의 상대적 TGFβR1의 발현 수준을 확인한 결과이다.
도 3b는 Mdx 마우스에 WJ-MSC를 정맥 주사하기 전과 후의 상대적 TGFβR3의 발현 수준을 확인한 결과이다.
그 결과, 도 3a 및 도 3b에 나타낸 바와 같이, 대조군과 비교하여 Mdx 마우스에서 TGFβR1 및 TGFβR3의 발현이 현저하게 증가하였으나, WJ-MSC 주사 후 TGFβR1 및 TGFβR3의 발현이 정상 대조군과 유사한 수준으로 감소하는 것을 확인할 수 있었다.
즉, miR-499-5p는 섬유증의 핵심 인자인 TGFβR1 및 TGFβR3을 표적으로 하는 것을 알 수 있다.
실시예 4. 근이영양증 치료 효과 확인
4-1. 골격근 및 횡경막에서의 항-섬유화 효과 확인
중간엽줄기세포에 의한 근이영양증에서의 항-섬유화 효과를 확인하였다. 구체적으로, 상기 실시예 1-3에서 획득한 Mdx 마우스(용량 3 주사)의 골격근 및 횡경막을 상기 실시예 1-3과 동일한 방법으로 H&E 및 Sirius Red로 염색하여 근섬유화를 관찰하였다. 또한, 1차 항체로 fibronectin antibody(ab2413, at 1/200 dilution, Abcam) 및 2차 항체로 Alexa Fluor® 594 AffiniPure Goat Anti-rabbit IgG (H+L)(A11037, Thermo Fisher Scientific)를 사용하였다는 점을 제외하고는 상기 실시예 1-3과 동일한 방법으로 면역조직화학을 수행하였다.
도 4a 및 도 4b는 Mdx 마우스에 WJ-MSC를 정맥 주사한 후, 골격근의 항-섬유화 효과를 확인한 결과이다.
도 4c 및 도 4d는 Mdx 마우스에 WJ-MSC를 정맥 주사한 후, 횡경막의 항-섬유화 효과를 확인한 결과이다.
그 결과, 도 4a 내지 도 4d에 나타낸 바와 같이, 대조군과 비교하여 Mdx 마우스에서 Sirius Red 염색 영역 및 피브로넥틴 검출 강도가 상대적으로 증가하였으나, WJ-MSC의 주사에 의해 유의하게 감소한 것을 확인할 수 있었다. 특히, 근세포 및 횡경막 조직에서의 피브로넥틴 검출 강도는 정상 대조군과 유사하거나 더 낮은 수준으로 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 즉, 중간엽줄기세포는 근육의 섬유화를 감소시킴으로써 근이영양증의 예방 또는 치료에 효과가 있다.
4-2. TGF-β 신호 전달에 의한 항-섬유화 효과 확인
TGF-β 신호전달에 의한 항-섬유화 효과를 확인하기 위하여 웨스턴블랏을 이용해 Smad2/3 인산화 수준을 측정하였다. 구체적으로, 마우스 근모세포주(myoblast cell) C2C12(ACTC CRL-1772)을 10% 소태아혈청(Gibco BRL, MA, USA), 100 U/mL 페니실린 및 100 ㎍/mL 스트렙토마이신(Gibco BRL)이 보충된 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's) 배지(Biowest S.A.S, Nuaille, France)에서 5% CO2, 37℃에서 배양하였다. 이후, 배양 배지를 5% 말 혈청(Gibco BRL)이 보충된 분화 배지로 5일 동안 교체하면서 근관(myotube)으로 분화시켰다. 배양 접시에서 근관을 긁어내고, 얼음처럼 차가운 방사성면역침전 완충액 (9.8 mol/L UREA, 4% CHAPS, 130 mmol/L dithiothreitol, 40 mmol/L Tris HCl, 0.1% sodium dodecyl sulfate, 1 mmol/L EDT, 및 protease/phosphatase inhibitor cocktail)에 용해하여 총 단백질을 추출하였다. 이후, Bradford assay (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)를 사용하여 단백질을 정량하였다. 동일한 양의 단백질을 나트륨 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide) 겔 전기영동으로 분해하고 폴리비닐리덴 디플루오라이드 막(Bio-Rad Laboratories)으로 옮겼다. 5% 스킴밀크로 블로킹한 후, 피브로넥틴 (ab2413, 1/10,000로 희석, Abcam), p-smad2/3 (8828S, 1/1000로 희석, Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA), 및 smad2/3 (3102S, 1/1000로 희석, Cell Signaling Technology)에 대한 1차 항체로 4℃에서 오버나잇(overnight)하였다. 이후, 상기 막을 TBST로 3회 세척하고, goat anti-rabbit IgG HRP-conjugated antibody (GTX213110-01, 1/10,000 dilution; GeneTex, Irvine, CA, USA) 또는 goat anti-mouse IgG HRP-conjugated antibody (GTX213111-01, 1/10,000 dilution; GeneTex)의 2차 항체로 1시간 동안 실온에서 인큐베이션 하였다.
도 5a 및 도 5b는 Mdx 마우스에 WJ-MSC를 정맥 주사한 후, Smad2/3 인산화 수준을 측정한 결과이다.
그 결과, 도 5a 및 도 5b에 나타낸 바와 같이, 대조군과 비교하여 Mdx군에서 피브로넥틴 및 p-smad2/3의 발현이 현저하게 증가하였으나, WJ-MSC에 의해 정상 대조군과 유의한 수준으로 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 즉, Smad2/3 인산화는 피브로넥틴의 발현과 유사한 양상을 나타내는 바, TGF-β 신호전달 경로를 활성화시킴으로써 섬유화을 억제할 수 있다.
4-3. WJ-MSC의 조직 내 분포 확인
중간엽줄기세포의 조직 내 분포를 확인하였다. 구체적으로, 상기 실시예 1-1에서 WJ-MSC를 정맥 주사한 Mdx 마우스의 비복근, 심장, 간, 폐 및 비장에 존재하는 WJ-MSC를 정량화하였다. PCR은 2 x Power SYBR쪠 Green PCR Master Mix(4367659, Thermo Fisher Scientific) 10 μL, 10 pmol/μL 각 프라이머 1 μL 및 다양한 농도의 DNA 8 μL를 포함하는 20 μL 반응물에서 수행하였다. PCR은 MicroAmp Optical 384-Well Reaction Plates (4326270, Thermo Fisher Scientific)에서 QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System (Thermo Fisher Scientific)을 사용하여 수행하였다. 95℃에서 10분 동안 초기 변성한 후, 95℃ 15초, 68℃ 30초의 과정을 40 회 반복하였다.
정상 대조군 Mdx 마우스
Human DNA
(ng/gDNA의 100 ng)		 SEM Human DNA
(ng/gDNA의 100 ng)		 SEM
비복근 0.01 0 2.73 0.59
심장 15.00 12.14 2.29 1.09
간 109.49 22.66 48.82 23.57
폐 4.43 1.71 37.42 15.09
비장 12.48 3.68 7.86 3.57
도 6a는 정상 대조군 및 Mdx 마우스에 WJ-MSC를 정맥 주사한 후, 기관 내 DNA를 정량화한 결과이다.
그 결과, 표 2 및 도 6a에 나타낸 바와 같이, 대조군(좌)과 비교하여 Mdx 마우스(우)의 비복근에서 더 많은 세포가 잔존해 있음을 확인할 수 있었다. 즉, 근이영양증 개체에 정맥 투여된 WJ-MCS는 근육으로 이동하는 것을 알 수 있다.
4-4. WJ-MSC의 지속 시간 확인
중간엽줄기세포의 근이영양증 치료 효과를 확인하기 위하여, 근육에서 항-섬유화 효과 지속 시간을 확인하였다. 구체적으로, 상기 실시예 1-3에서 획득한 Mdx 마우스의 골격근을 상기 실시예 1-3과 동일한 방법으로 Sirius Red로 염색하여 근섬유화를 관찰하였다.
도 6b 및 도 6c는 Mdx 마우스에 WJ-MSC를 정맥 주사한 후, 시간에 따른 섬유화를 측정한 결과이다.
그 결과, 도 6b 및 도 6c에 나타낸 바와 같이, 대조군과 비교하여 Mdx 마우스의 근육에서 섬유화 영역이 현저하게 증가하였으며, WJ-MSC 주사 후 4일 내지 4주 동안 지속적으로 감소하는 것을 확인할 수 있었다.
4-5. 산화적 스트레스에 의한 섬유화의 치료 효과 확인
산화적 스트레스에 의해 유도된 섬유증에 대한 중간엽줄기세포의 치료 효과를 확인하였다. 구체적으로, 상기 실시예 4-2와 동일한 방법으로 C2C12 세포주를 근관(myotube)으로 분화시킨 후, 성장 배지에 2 mM H2O2(Sigma, MO, USA)를 첨가하고 24시간 동안 추가로 배양하여 섬유화를 유도하였다. 이후, 무혈청 배지에서 상기 근관을 인간 miR-499-5p mimic (GenePharma, Shanghai, China) 30 nmol/L로 형질주입하였다. 또한, 무혈청 배지에서 섬유화 유도된 근관을 10 μM 갈루니서팁(glaunisertib)(LY2157299, S2230, Selleck Chemicals, Houston, TX, USA)로 24시간 동안 처리하였다. 이후, 콜라겐 축적을 확인하기 위하여 상기 실시예 1-3과 동일한 방법으로 Sirius Red 염색을 수행하고, 콜라겐 Ⅰ의 침적을 확인하기 위하여 면역조직화학을 수행하였다. 또한, 상기 근관 내 단백질 발현을 확인하기 위하여 미오신 중쇄(#MAB4470, 1/10,000로 희석; R&D Systems)에 대한 1차 항체를 추가로 사용하였다는 점을 제외하고는 실시예 4-2와 동일한 방법으로 웨스턴 블랏을 수행하였다.
도 7a는 마우스 근관에 산화적 스트레스를 유발한 후, miR-499-5p의 형질주입 또는 TGF-β 억제제를 처리한 결과를 나타내는 것이다.
*그 결과, 도 7a에 나타낸 바와 같이, H2O2에 의해 근관의 손상을 유발하였으나 세포 사멸이 유도되지는 않았다. 또한, 갈루니서팁 및 miR-499-5p에 의해 손상된 근관의 회복이 유도되는 것을 확인할 수 있었다.
도 7b는 마우스 근관에 산화적 스트레스를 유발한 후, miR-499-5p로 형질주입하여 근관에서의 콜라겐 축적을 확인한 결과이다.
도 7c는 마우스 근관에 산화적 스트레스를 유발한 후, miR-499-5p로 형질주입하여 근관에서의 콜라겐 Ⅰ 침적을 확인한 결과이다.
그 결과, 도 7b 및 도 7c에 나타낸 바와 같이, H2O2에 의하여 콜라겐 축적 및 콜라겐 Ⅰ 침적이 현저하게 증가하였으며, miR-499-5p 형질주입에 의하여 정상 대조군 보다 낮은 수준으로 회복되는 것을 확인할 수 있었다. 즉, miR-499-5p는 콜라겐 축적 및 콜라겐 Ⅰ 침적을 억제함으로써 섬유증 치료 효과를 나타낼 수 있다.
도 7d는 마우스 근관에 산화적 스트레스를 유발한 후, miR-499-5p 형질주입 또는 TGF-β 억제제를 처리하여 미오신 중쇄, 피브로넥틴, p-smad2/3의 발현을 확인한 결과이다.
그 결과, 도 7d에 나타낸 바와 같이, H2O2에 의하여 피브로넥틴 및 p-smad2/3의 발현이 현저하게 증가하였으며, miR-499-5p 형질주입 또는 갈루니서팁 처리에 의하여 피브로넥틴 및 p-smad2/3의 발현 수준이 정상 대조군보다 감소한 것을 확인할 수 있었다. 반면, 미오신 중쇄의 발현은 H2O2에 의하여 감소하였으나, miR-499-5p 형질주입 또는 갈루니서팁 처리에 의하여 유의하게 증가한 것을 확인할 수 있었다. 즉, miR-499-5p는 TGF-β 신호전달 경로를 억제함으로써 항 섬유화 효과를 나타낼 수 있는 바, 뒤센 근이영양증의 예방 또는 치료에 이용될 수 있다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims (10)

  1. miR-499-5p 활성화제를 포함하는 뒤센 근이영양증(Duchenne muscular Dystrophy, DMD) 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 miR-499-5p 활성화제는 왓튼 젤리-유래 중간엽줄기세포(Wharton's jelly-derived mesenchymal stem cells, WJ-MSCs)인 것인, 약학적 조성물.
  3. 청구항 2에 있어서, 상기 중간엽줄기세포는 MMP-1을 발현하거나 또는 모세포에 비하여 MMP-1을 과발현하도록 유전적으로 조작된 것인, 약학적 조성물.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 miR-499-5p는 TGFβ 수용체와 결합하는 것인, 약학적 조성물.
  5. 청구항 1에 있어서, 정맥 투여되는 것인, 약학적 조성물.
  6. miR-499-5p 활성화제를 포함하는 뒤센 근이영양증 치료용 세포치료제.
  7. miR-499-5p의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 뒤센 근이영양증 진단용 조성물.
  8. 청구항 7의 조성물을 포함하는 뒤센 근이영양증 진단용 키트.
  9. 개체의 시료에서 miR-499-5p의 발현 수준을 측정하는 단계;를 포함하는 뒤센 근이영양증 진단을 위한 정보제공방법.
  10. 청구항 9에 있어서, 대조군과 비교하여 miR-499-5p의 발현 수준이 감소하는 경우, 뒤센 근이영양증인 것으로 판단하는 단계를 포함하는 것인, 정보제공방법.
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KR20100057022A (ko) * 2007-07-31 2010-05-28 보드 오브 리전츠 더 유니버시티 오브 텍사스 시스템 마이오신 발현 및 근섬유 동일성을 제어하는 마이크로-ｒｎａｓ

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XU MENG, CHEN XIAOLING, CHEN DAIWEN, YU BING, LI MINGZHOU, HE JUN, HUANG ZHIQING: "MicroRNA-499-5p regulates skeletal myofiber specification via NFATc1/MEF2C pathway and Thrap1/MEF2C axis", LIFE SCIENCE, vol. 215, 15 December 2018 (2018-12-15), GB , pages 236 - 245, XP093075193, ISSN: 0024-3205, DOI: 10.1016/j.lfs.2018.11.020 *

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