WO2022080791A1 - Prmt1 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자를 포함하는 신경 근육 질환의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents
Prmt1 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자를 포함하는 신경 근육 질환의 예방 또는 치료용 조성물 Download PDFInfo
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Definitions
- the present invention relates to the use of a PRMT1 protein expressed in motor neurons and neuromuscular junctions and a gene encoding the same for the prevention or treatment of neuromuscular diseases.
- Neuromuscular disease is a disease that occurs in peripheral nerves and muscles.
- Peripheral nerves are nerve networks that branch off from the central nervous system and connect distant end organs such as muscles and skin with the central nervous system. It plays a role in transmitting sensory information, such as pain sensation, to the central nervous system.
- Peripheral nervous system disease is a disease of the peripheral nerve itself, a disorder of the peripheral nerve caused by damage to the peripheral nerve by a disease of the peripheral nerve and the surrounding tissue, a neuromuscular junction where the peripheral nerve is connected to the muscle, and a disease of the muscle itself.
- Typical clinical symptoms of peripheral nervous system disease include paralysis or motor neuron symptoms in which muscle strength decreases, numbness or numbness in the hands or toes, and pain.
- Motor nerve disease caused by abnormalities of the peripheral nervous system as described above means a neurological disease that is damaged by degenerative progression of the motor nerve that controls its activity but normal muscle strength, genetic factors, environmental factors, It is caused by various causes such as poison poisoning, viral infection, complications of other diseases, and aging.
- Motor neuron disease refers to a case in which unwanted exercise or desired exercise cannot be performed due to muscle control disorders.
- Lou Gehrig's disease (ALS) is known as a representative motor neuron disease that can lead to death by slowing movement of limbs and gradually weakening pronunciation, swallowing, and respiration. Shortly thereafter, respiratory failure and other complications due to respiratory muscle paralysis can lead to death.
- ALS Lou Gehrig's disease
- a fundamental treatment method for motor neuron disease has not been developed at present, and only conservative measures such as alleviation of symptoms or pain relief through drugs or rehabilitation treatment are being taken.
- PRMT1 protein arginine N-methyltransferase 1
- Homo sapiens Gene ID: 3276; Mus musculus Gene ID: 15469 is one of the protein arginine methylation enzymes. The mechanisms at the neuromuscular junction are unknown.
- the present inventors conducted a study on the PRMT1 (Protein arginine methyltransferase 1) gene expressed in motor neurons and neuromuscular junctions while studying various proteins and genes related to motor neuron damage, and the regulation of the gene Through the discovery that it is possible to prevent motor nerve cell damage due to cellular stress induced by various causes, and to achieve therapeutic and alleviation effects for diseases caused by this, the present invention has been completed.
- PRMT1 Protein arginine methyltransferase 1
- composition for protecting motor neuron cells including a PRMT1 protein or a gene encoding the same.
- Another object of the present invention is to provide a composition for preventing, improving or treating a neuromuscular disease, comprising a PRMT1 protein or a gene encoding the same.
- Another object of the present invention is to provide a method for screening a substance for preventing, improving, or treating neuromuscular diseases in relation to the expression of PRMT1.
- the present invention provides a composition for protecting motor neurons comprising a PRMT1 protein or a gene encoding the same.
- the present invention also provides a method for protecting motor neurons, comprising administering the PRMT1 protein or a gene encoding the same to an individual in need thereof.
- the present invention also provides the use of PRMT1 protein or a gene encoding the same for protecting motor neurons.
- the present invention also provides the use of a PRMT1 protein or a gene encoding the same for the manufacture of a drug for protecting motor neurons.
- the present invention provides a composition for preventing, improving or treating neuromuscular diseases, comprising a PRMT1 protein or a gene encoding the same.
- the present invention also provides a method for preventing, improving or treating a neuromuscular disease, comprising administering a PRMT1 protein or a gene encoding the same to an individual in need thereof.
- the present invention also provides the use of PRMT1 protein or a gene encoding the same for the prevention, improvement or treatment of neuromuscular diseases.
- the present invention also provides the use of a PRMT1 protein or a gene encoding the same for the manufacture of a drug for the prevention, improvement or treatment of neuromuscular diseases.
- the composition of the present invention has a protective, ameliorating or therapeutic effect on motor nerves and neuromuscular diseases, so pharmaceuticals, health functional food, functional food, animal feed, cell culture composition, etc. It can be used for various purposes.
- the present invention provides a method comprising: i) treating a candidate substance in a motor neuron in vitro; ii) measuring the expression or activity of Prmt1 in motor neurons treated with the candidate substance; And iii) compared to the untreated group, it provides a method for screening a therapeutic substance for a neuromuscular disease, comprising the step of selecting candidate substances that enhance the expression or activity of Prmt1 as a therapeutic agent for neuromuscular disease.
- the present invention relates to a composition for protecting motor neurons comprising a PRMT1 protein or a gene encoding the same.
- the present invention also relates to a method for protecting motor neurons, comprising administering the PRMT1 protein or a gene encoding the same to an individual in need thereof.
- the present invention also relates to the use of PRMT1 protein or a gene encoding the same for protecting motor neurons.
- the present invention also relates to the use of a PRMT1 protein or a gene encoding the same for the manufacture of a drug for protecting motor neurons.
- the motor neuron cell protection of the present invention includes protecting it from degenerative damage of the motor nerve due to aging, but is not limited thereto, but is not limited thereto, to improve survival rate, maintain weight, maintain behavioral ability, repair damaged nerves, repair DNA damage , which protects nerve cells from cellular stress, and means to relieve and alleviate various stresses that may be generated in motor nerve cells due to various factors such as aging.
- the protection of motor neurons is to prevent damage to motor neurons from aging, oxidative stress, and inflammatory stress, resulting in muscle atrophy and fibrosis, and to reduce the stress sensitivity of motor neurons, damaged Including promoting reneurogenesis of motor neurons.
- the present invention relates to a composition for preventing, improving or treating neuromuscular diseases, including the PRMT1 protein or a gene encoding the same.
- the present invention also relates to a method for preventing, improving or treating a neuromuscular disease, comprising administering a PRMT1 protein or a gene encoding the same to an individual in need thereof.
- the present invention also relates to the use of PRMT1 protein or a gene encoding the same for the prevention, improvement or treatment of neuromuscular diseases.
- the present invention also relates to the use of a PRMT1 protein or a gene encoding the same for the manufacture of a medicament for the prevention, improvement or treatment of neuromuscular diseases.
- Neuromuscular disease is a neuromuscular disease that is caused by abnormalities in the peripheral nervous system, which is a neurological disease that is damaged by degenerative progression of the motor nerve that controls muscle movement.
- the neuromuscular disease is a disease classified as a neuromuscular junction and muscle disease (G70-G73 on the disease classification code), and myasthenia gravis, myoneuropathy, muscular dystrophy, dystonia, myopathy, muscle of primary disorders, myasthenia gravis, and Lambert-Eaton syndrome.
- the motor neuron disease includes amyotrophic lateral sclerosis (ALS), infantile progressive spinal muscular atrophy (SMA), progressive bulbar palsy, and pseudobulbar palsy. , progressive muscular atrophy (PMA), progressive lateral sclerosis (PLS), monomelic amyotrophy (MMA) or Huntington's disease, and other motor neuron diseases.
- ALS amyotrophic lateral sclerosis
- SMA infantile progressive spinal muscular atrophy
- PLS progressive bulbar palsy
- the composition of the present invention can be used for various purposes such as pharmaceuticals, health functional food, functional food, animal feed, cell culture composition, etc., and prevents damage to motor nerve cells to treat the neuromuscular disease has a preventive, ameliorating or therapeutic effect on
- prevention refers to any action capable of inhibiting or delaying the onset of neuromuscular disease by administration of the pharmaceutical composition according to the present invention.
- treatment refers to any action in which symptoms are improved or beneficial by administration of the pharmaceutical composition according to the present invention.
- the term “individual” may refer to any animal, including humans, that needs motor neuron cell protection according to the present invention or has or is likely to develop a neuromuscular disease.
- the animal may be a mammal, such as a cow, a horse, a sheep, a pig, a goat, a camel, an antelope, a dog, a cat, and the like, in need of treatment for symptoms similar thereto as well as humans.
- the pharmaceutical composition of the present invention may be formulated in the form of powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, aerosols, etc., external preparations, suppositories, and sterile injection solutions according to conventional methods. and may further include a carrier or excipient necessary for the formulation.
- Pharmaceutically acceptable carriers, excipients and diluents that may be additionally included in the active ingredient include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia gum, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinyl pyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, magnesium stearate and mineral oil.
- it is prepared using commonly used diluents or excipients such as fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrants, and surfactants.
- solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, etc., and these solid preparations include at least one or more excipients in the extract or compound at least cotton, starch, calcium carbonate , sucrose or lactose, gelatin, etc. are mixed and prepared.
- lubricants such as magnesium stearate and talc are also used.
- Liquid formulations for oral administration include suspensions, internal solutions, emulsions, syrups, etc.
- various excipients such as wetting agents, sweeteners, fragrances, and preservatives may be included. there is.
- Formulations for parenteral administration include sterile aqueous solutions, non-aqueous solutions, suspensions, emulsions, freeze-dried preparations, and suppositories.
- Non-aqueous solvents and suspending agents include propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, and injectable esters such as ethyl oleate.
- injectable esters such as ethyl oleate.
- As the base of the suppository witepsol, macrogol, tween 61, cacao butter, laurin, glycerogelatin and the like can be used.
- the pharmaceutical composition of the present invention may be administered orally or parenterally (intravenous injection, subcutaneous, intraperitoneal or topical application) according to a desired method, and the dosage may vary depending on the patient's condition and weight, the degree of disease and the drug form; It depends on the route and time of administration, and may be selected in an appropriate form by those skilled in the art.
- the pharmaceutical composition of the present invention is administered in a pharmaceutically effective amount.
- pharmaceutically effective amount is a reasonable amount applicable to medical treatment, means an amount sufficient to treat a disease, and the criteria are the patient's disease, severity, drug activity, sensitivity to drugs, administration time , administration route and excretion rate, treatment period, concomitant ingredients, and other factors.
- the pharmaceutical composition of the present invention may be administered as an individual therapeutic agent or in combination with other therapeutic agents, and may be administered sequentially or simultaneously with conventional therapeutic agents. Taking all of the above factors into consideration, the dosage can be determined at a level capable of minimizing side effects, which can be easily determined by those skilled in the art.
- the dosage of the pharmaceutical composition may vary depending on the age, weight, severity, sex, etc. of the patient, and is generally 0.001 to 150 mg per 1 kg of body weight, more preferably 0.01 to 100 mg daily or every other day, It can be administered 1 to 3 times a day. However, this is exemplary, and the dosage may be set differently if necessary.
- composition of the present invention may be a food or a health functional food, and in particular, the "health functional food” is manufactured and processed using raw materials or ingredients useful for the human body according to Act No. 6727 of the Health Functional Food Act. It means one food, and “functional” means to control nutrients for the structure and function of the human body or to consume for the purpose of obtaining useful effects for health purposes, such as physiological action.
- the food or health functional food of the present invention is a pharmaceutical dosage form such as powder, granule, tablet, capsule, pill, suspension, emulsion, syrup, etc. or tea bag, leachate, beverage for the purpose of preventing and improving motor neuron disease. It can be manufactured and processed into health functional foods such as , candy, jelly, and gum.
- the food or health functional food composition of the present invention may be used as a food additive, and may be commercialized alone or in combination with other ingredients. Also used in nutrients, vitamins, electrolytes, flavoring agents, colorants and enhancers, pectic acid and its salts, alginic acid and its salts, organic acids, protective colloidal thickeners, pH adjusters, stabilizers, preservatives, glycerin, alcohols, carbonated beverages Carbonating agents and the like may be included. The above components may be used alone or in combination, and may be used in combination in an appropriate amount.
- the present invention comprises the steps of: i) treating a candidate substance to a motor neuron in vitro; ii) measuring the expression or activity of Prmt1 in motor neurons treated with the candidate substance; And iii) compared to the untreated group, it provides a method of screening a therapeutic substance for a motor neuron disease, comprising the step of selecting candidate substances that enhance the expression or activity of Prmt1 as a therapeutic agent for motor neuron disease.
- the step of measuring the expression or activity of PRMT1 may be performed through various methods capable of measuring the amount of RNA or protein generated by the expression of the PRMT1 gene.
- the expression level of RNA was confirmed using RT-PCR (real-time PCR), microarray, Northern blotting, etc., and protein activity and expression were determined by immunoprecipitation, immunostaining, chromatin immunostaining, enzyme immunoassay ( ELISA), Western blotting, etc. may be used, and the method is not limited thereto.
- composition of the present invention includes a PRMT1 protein or a gene encoding the same, wherein the PRMT1 protein is a factor that plays an important role in preventing damage to motor nerve cells, preventing damage to motor nerves from stress caused by various factors, the above It has the effect of preventing, improving and treating motor nerve damage and motor nerve disease caused by degenerative factors.
- Prmt1 mnKO motor neuron-specific Prmt1-deficient mouse
- Figure 2 shows the results of confirming the weight loss due to aging in Prmt1 mnKO mice.
- FIG. 14 is a view confirming the result of increased expression of DNA damage-related gene ( ⁇ -H2AX) in the motor neuron cell line (NSC34) in which PRMT1 protein expression is suppressed.
- ⁇ -H2AX DNA damage-related gene
- the laboratory animal breeding room maintained constant conditions (temperature 22 ⁇ 2 °C, humidity 55 ⁇ 5%). A 12-hour photoperiod and a 12-hour dark cycle were adapted per day.
- mice carrying the Prmt1-floxed allele were crossed with transgenic mice expressing Cre under the control of the Hb9 promoter (Hb9-Cre provided by Jackson Laboratory).
- Hb9-Cre provided by Jackson Laboratory.
- animals were anesthetized with 4% isoflurane and then maintained by continuous inhalation of 2% isoflurane on a surface heated to 37°C.
- the skin was incised posteriorly parallel to the left femur.
- the sciatic nerve was injured for 10 s using forceps after exposure to the mid-thigh region. After denervation, the nerves were repositioned, the muscles were closed with surgically soluble sutures, and the skin incisions were closed with suture tape.
- Carprofen (5mg/kg) was administered subcutaneously for postoperative pain control.
- Open field testing was performed in an open plastic container (30x30x30 cm). At the beginning of each experiment, mice were placed on the corners of a plastic container and movements were recorded for 20 min. Movement distance and speed were analyzed using Noldus EthoVision 13.0 tracking software. Motor coordination and balance were measured using a rotarod device (Model 7600, Ugo Basile). For the fixed speed rotarod test (17 rpm), mice received three exercises for 3 days before the actual experiment and then placed in a rotating cylinder. A 200 second cut-off per session was used. For the accelerated rotarod test (4-40 rpm for 300 s), mice were subjected to three practice trials for 3 days before the actual experiment. In both experiments, the time to drop off the rotarod was recorded.
- NSC34 cells were cultured in DMEM media based on 10% FBS, 1% GlutaMAX, 10 units/mL penicillin, and 10 ⁇ g/mL streptomycin. NSC 34 cells were transfected with pcDNA and PRMT1-HA plasmid using Mirus transfection reagent.
- Adenoviral pLKO.1-puro and PRMT1-shRNA were transfected into the cells.
- lysis buffer (20mM Tris-HCl, pH8, 150mM NaCl, 1% Triton X, Proteinase Inhibitor) is added to the cells and lysed for 30 minutes, centrifuged at 13000rpm for 30 minutes, and the lysed sample is quantified, The same amount of protein was subjected to SDS-PAGE electrophoresis and transferred to a PVDF membrane. After the corresponding primary antibody and secondary antibody reaction, using an ECL reagent, the expression level of the protein was confirmed by exposing it to an X-ray film.
- NSC34 cells and muscle tissue were homogenized with FastPrepR-24 (MP Biomedicals), and RNA was extracted using an easy-spin Total RNA Extraction Kit (iNtRON Biotechnology). Fold changes in gene expression were normalized relative to expression of the ribosomal gene L32.
- the tissues used in the experiment were the tibialis anterior and extensor digitorum longus muscle, and the tibialis anterior muscle was frozen and fixed with OCT compound using liquid nitrogen immediately after separation, and then placed in a cryogenic freezer at -80°C. kept. Tissue sections were cut to a thickness of 7 ⁇ m using a frozen section maintained at ⁇ 20° C., and the degree of fibrosis was observed after Sirius Red staining.
- Immunohistochemical staining was performed using the tibialis anterior muscle isolated from the animal tissue. Frozen sections stored in a cryogenic freezer at -80°C were washed twice in 1xPBS. It was fixed at room temperature for 15 minutes using 4% paraformaldehyde, and washed twice in 1xPBS. The tissue and permeation buffer (0.5% Triton-X/PBS) were reacted at room temperature for 5 minutes and washed twice in 1xPBS. The tissue and TE buffer were reacted at 100° C. for 10 minutes for antigen retrieval, and washed twice in 1xPBS.
- the primary antibody (Laminin) was diluted 1:500 in blocking buffer and reacted at 4°C for 12 hours, followed by 2 in 1xPBS. washed once. After reacting the secondary antibody, it was washed twice in 1xPBS and then encapsulated and analyzed with a fluorescence microscope.
- neuromuscular junction staining was performed using extensor long extensor muscle isolated from the animal tissue.
- the extensor long extensor muscle was immediately fixed using 4% paraformaldehyde at room temperature for 15 minutes, and washed 3 times in 1xPBS.
- blocking buffer 3% BSA, 0.5% Triton-X
- the primary antibody Neuroofilament, Synaptophysin
- the secondary antibody and the BTX antibody conjugated with the secondary antibody were reacted at room temperature for 2 hours, washed twice in 1xPBS, encapsulated, and analyzed with a fluorescence microscope.
- the survival rate and body weight of mice deficient in Prmt1 specifically for motor neurons were measured for each age. As a result, it was confirmed that the survival rate and body weight of the mice rapidly decreased as the aging progressed compared to the wild type ( FIGS. 1 and 2 ). That is, it was confirmed that Prmt1 expressed in motor neurons plays an important role in the survival rate and weight maintenance of especially aging mice.
- Sciatic nerve injury was induced in Prmt1 mnKO mice and normal mice (Prmt1 f/f ), respectively, re-innervation was induced for 28 days, and the mice were sacrificed after behavioral analysis.
- PRMT1 present in the motor nerve plays an important role in the reneurization of the damaged motor nerve.
- NMJ staining In neuromuscular junction staining (NMJ staining), the thickness of motor neuron axons and the size of neuromuscular junction marker ⁇ -BTX (Alpha_Bungarotoxin) in FDB (Flexor digitorum brevis muscle) and EDL (Extensor digitorum longus) muscles of Prmt1 mnKO mice were determined by Prmt1. It was confirmed that it was thinner and smaller than f/f mice (FIG. 10). From this, it can be confirmed that, in the case of Prmt1 mnKO mice, reneurization was delayed in the axon.
- FDB Felexor digitorum brevis muscle
- EDL Extensor digitorum longus
- PRMT1 was overexpressed in the NSC34 cell line, which is a motor neuron, and the mRNA expression of the stress gene was observed through qPCR after treatment with TNF ⁇ causing cellular stress.
- TNF ⁇ -treated motor neurons the expression levels of both ROS stress markers (Gpx1, Sod1, Sod2) and inflammatory stress markers (Ccl2, Cxcl1, Cxcl10) were increased, but when PRMT1 was overexpressed, it was confirmed that all of the markers were significantly reduced. (FIG. 15). From these results, it can be confirmed that when PRMT1 is overexpressed in motor neurons, it has an effect of protecting cellular stress.
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Abstract
본 발명은 PRMT1(Protein arginine methyltransferase 1) 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자를 이용하여, 운동 신경, 특히 신경근 접합부에서 산화 스트레스 등에 의한 운동 신경 손상에 의해 유발되는 신경 근육 질환의 예방 또는 치료 용도 및 상기 PRMT1의 발현을 활성화하는 후보 물질을 스크리닝 하기 위한 방법에 대한 것이다. 운동 신경 또는 신경근 접합부에서 Prmt1이 결손된 경우, 노화에 의한 퇴행성 운동 신경의 손상 악화, 산화 스트레스 및 염증에 의한 DNA 손상이 유발되어 신경 근육 질환이 유발될 수 있으므로, 상기 PRMT1 단백질 및 이를 암호화하는 유전자의 과발현 및 활성을 통해 상기 질환의 치료를 가능하게 할 수 있다.
Description
본 발명은 운동 신경 및 신경 근육 접합부에서 발현하는 PRMT1 단백질 및 이를 암호화하는 유전자의 신경 근육 질환의 예방 또는 치료 용도에 대한 것이다.
신경 근육 질환이란, 말초신경과 근육에 생기는 질병으로, 말초신경이란 중추신경계에서 갈라져 나와 근육이나 피부 등 멀리 떨어진 말단 장기를 중추신경계와 연결시켜주는 신경 그물망을 의미하며 중추신경계에서 결정된 명령을 근육 등 말단 장기에 전달하거나 통각 등의 감각 정보를 중추신경계로 전달하는 역할을 한다.
말초신경계 질환은 말초신경 자체의 질병, 말초신경과 인접해 있는 주위 조직의 질병에 의해 말초신경이 손상되어 생기는 말초신경의 기능장애, 말초신경이 근육과 연결되는 신경근 접합부, 근육 자체에 생긴 질환을 포함한다. 말초신경계 질환의 대표적인 임상 증상은 마비나 근육의 힘이 줄어드는 운동 신경증상, 손 혹은 발끝이 저리거나 감각이 무뎌지는 현상, 통증 등이 있다.
상기와 같은 말초 신경계의 이상으로 인하여 유발되는 운동 신경 질환은 근력은 정상이나, 이의 활동을 통제하는 운동 신경이 퇴행적 진행을 일으켜 손상된 신경학적 질환을 의미하는 것으로, 유전적 요인, 환경적 요인, 독극물 중독, 바이러스 감염, 다른 질환의 합병증, 노화 등 다양한 원인에 의해 발생된다. 운동 신경 질환은 근력 조절 장애로 인한 원치 않는 운동이나, 원하는 운동을 할 수 없는 경우를 말한다. 예를 들어 팔다리의 움직임이 둔화되며, 발음, 삼킴, 호흡 등이 점차적으로 약해져 사망에 이를 수 있는 대표적인 운동 신경 질환으로 루게릭 병(ALS)이 알려져 있으며, 발병하면 증상의 진행이 빨라 4-5년 이내 호흡근육 마비로 인한 호흡부전 및 기타 합병증으로 인하여 사망에 이르기도 한다. 그러나 운동 신경 질환에 대한 근본적인 치료 방법은 현재 개발되어 있지 않은 실정이며, 약물이나 재활치료 등을 통하여 증상의 완화 또는 고통 경감 등의 보존적 조치만이 취해지고 있을 뿐이다.
또한, 인구의 고령화에 따라 특히 노화에 의한 퇴행성 운동 신경 질환의 유병률이 높아지고 있으며, 이는 인간의 삶의 질에 큰 영향을 줄 수 있으므로, 근본적인 원인과 치료 방법에 대한 연구가 요구되고 있는 실정이다.
PRMT1(protein arginine N-methyltransferase 1) (Homo sapiens Gene ID: 3276; Mus musculus Gene ID: 15469)은 단백질 아르기닌 메틸화 효소의 하나이며, 최근에 다양한 기능에 대한 연구가 진행되고 있으나, 아직까지 운동 신경 또는 신경 근육 접합부에서의 기작에 대하여 알려진 바가 없다.
이에, 본 발명자들은 운동 신경 세포 손상과 연관성이 있는 다양한 단백질 및 유전자를 연구하던 중, 운동신경 및 신경근 접합부에서 발현하는 PRMT1 (Protein arginine methyltransferase 1) 유전자에 대한 연구를 진행하여, 상기 유전자의 조절을 통해 다양한 원인에 의해 유발된 세포 스트레스로 인한 운동신경 세포 손상을 방지하고, 이로 인해 유발되는 질병에 대한 치료 및 완화 효과를 달성할 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 PRMT1 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자를 포함하는, 운동 신경 세포 보호용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 PRMT1 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자를 포함하는, 신경 근육 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, PRMT1의 발현 여부와 관련하여 신경 근육 질환의 예방, 개선 또는 치료 물질을 스크리닝하는 방법을 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 PRMT1 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자를 포함하는 운동 신경 세포 보호용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, PRMT1 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자를 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 운동 신경 세포 보호 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, PRMT1 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 운동 신경 세포 보호 용도를 제공한다.
본 발명은 또한, 운동 신경 세포 보호를 위한 약물의 제조를 위한 PRMT1 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 용도를 제공한다.
또한, 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해서 본 발명은, PRMT1 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자를 포함하는, 신경 근육 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, PRMT1 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자를 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 신경 근육 질환의 예방, 개선 또는 치료방법을 제공한다.
본 발명은 또한, PRMT1 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 신경 근육 질환의 예방, 개선 또는 치료 용도를 제공한다.
본 발명은 또한, 신경 근육 질환의 예방, 개선 또는 치료를 위한 약물의 제조를 위한 PRMT1 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 용도를 제공한다.
본 발명의 일 양태로서, 본 발명의 조성물은 운동 신경에 대한 보호 및 신경 근육 질환에 대한 예방, 개선 또는 치료 효과를 가지므로, 의약품, 건강기능식품, 기능성 식품, 동물용 사료, 세포 배양액 조성물 등 다양한 용도로 활용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 i) in vitro 상에서 운동 신경 세포에 후보 물질을 처리하는 단계; ii) 상기 후보 물질을 처리한 운동 신경 세포에서 Prmt1의 발현 또는 활성을 측정하는 단계; 및 iii) 미처리군과 비교하여 Prmt1의 발현 또는 활성을 증진시키는 후보 물질들을 신경 근육 질환 치료제 후보 물질로 선정하는 단계를 포함하는, 신경 근육 질환의 치료 물질을 스크리닝 하는 방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 PRMT1 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자를 포함하는 운동 신경 세포 보호용 조성물에 대한 것이다.
본 발명은 또한, PRMT1 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자를 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 운동 신경 세포 보호 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한, PRMT1 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 운동 신경 세포 보호 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또한, 운동 신경 세포 보호를 위한 약물의 제조를 위한 PRMT1 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 용도에 관한 것이다.
상기 본 발명의 운동 신경 세포 보호는, 특히 노화로 인한 운동 신경의 퇴행성 손상으로부터 이를 보호하는 것을 포함하며, 이에 제한되는 것은 아니나, 생존율 향상, 체중 유지, 행동능력 유지, 손상된 신경 복구, DNA 손상 복구, 세포 스트레스로부터 신경세포를 보호하는 것으로, 노화 등 다양한 요인에 의하여 운동 신경 세포에서 발생될 수 있는 다양한 스트레스를 완화하고 경감시키는 것을 의미한다.
본 발명의 일 양태로서, 상기 운동 신경 세포의 보호는 노화, 산화 스트레스, 염증성 스트레스로부터 운동 신경 세포의 손상, 이로 인한 근육 위축 및 섬유화를 방지하고, 운동 신경세포의 스트레스 민감성을 감소시키는 것이며, 손상된 운동 신경세포의 재 신경화를 촉진하는 것을 포함한다.
또한 본 발명은 PRMT1 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자를 포함하는, 신경 근육 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 대한 것이다.
본 발명은 또한, PRMT1 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자를 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 신경 근육 질환의 예방, 개선 또는 치료방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한, PRMT1 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 신경 근육 질환의 예방, 개선 또는 치료 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또한, 신경 근육 질환의 예방, 개선 또는 치료를 위한 약물의 제조를 위한 PRMT1 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 용도에 관한 것이다.
신경 근육 질환은 말초 신경계의 이상으로 인하여 유발되는 운동 신경 질환은 근육 운동을 통제하는 운동 신경이 퇴행적 진행을 일으켜 손상된 신경학적 질환으로, 근이영양증, 운동 신경 질환, 근병증, 신경근 접합부 질환 등이 포함된다. 또한, 이에 제한되는 것은 아니나, 상기 신경 근육질환은 신경근접합부 및 근육의 질환으로 분류(질병분류기호 상 G70-G73)되는 질환으로서, 중증근무력증, 근신경장애, 근디스트로피, 근긴장장애, 근병증, 근육의 원발성 장애, 근무력증후군, 람베르트-이튼 증후군 등이 포함된다. 또한, 상기 운동 신경 질환은 근위축성 측삭경화증 (amyotrophic lateral sclerosis, ALS), 척수성 진행성 근위축 (infantile progressive spinal muscular atrophy, SMA), 진행성 핵상마비 (progressive bulbar palsy), 가연수성마비 (pseudobulbar palsy), 진행성 근육위축 (progressive muscular atrophy, PMA), 진행성 축삭경화증 (progressive lateralsclerosis, PLS), 단일 사지 근위축증 (monomelic amyotrophy, MMA) 또는 헌팅턴 병 등이 포함되며, 기타 운동 신경원 질환을 포함한다.
본 발명의 일 양태로서, 본 발명의 조성물은 의약품, 건강기능식품, 기능성 식품, 동물용 사료, 세포 배양액 조성물 등 다양한 용도로 활용될 수 있으며, 운동 신경 세포의 손상을 방지하여 상기 신경 근육 질환에 대한 예방, 개선 또는 치료 효과를 가진다.
본 명세서에서 용어 "예방"은 본 발명에 따른 상기 약학적 조성물의 투여에 의해 신경 근육 질환을 억제시키거나 발병을 지연시킬 수 있는 모든 행위를 의미한다.
본 명세서에서 용어 "치료"는 본 발명에 따른 상기 약학적 조성물의 투여에 의해 증세가 호전되거나 이롭게 되는 모든 행위를 말한다.
본 명세서에서 용어 “개체”는 본 발명에 따른 운동 신경 세포 보호가 필요하거나, 신경 근육 질환이 발병하였거나 발병할 가능성이 있는 인간을 포함한 모든 동물을 의미할 수 있다. 상기 동물은 인간뿐만 아니라 이와 유사한 증상의 치료를 필요로 하는 소, 말, 양, 돼지, 염소, 낙타, 영양, 개, 고양이 등의 포유동물일 수 있다.
본 발명의 상기 약학적 조성물은 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 상기 제형화에 필요한 담체 혹은 부형제 등을 추가로 포함할 수 있다. 상기 유효 성분에 추가로 포함될 수 있는 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등이 포함된다. 제제화 할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.
예를 들어, 경구 투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물 또는 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 적어도 면, 전분, 칼슘카보네이트 (calcium carbonate), 수크로스 (sucrose) 또는 락토오스 (lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구 투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 또는 비경구 투여(정맥주사, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)될 수 있으며, 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도 및 약물 형태, 투여 경로 및 시간에 따라 다르며, 당업자에 의해 적절한 형태로 선택될 수 있다.
본 발명의 상기 약학적 조성물은, 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에서 "약학적으로 유효한 양"이란 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 양으로, 질병을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 그 기준은 환자의 질환, 중증도, 약물 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 병용되는 성분 및 기타 사항에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 상기 약학적 조성물은, 개별 치료제 혹은 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 상기 요소들을 모두 고려하여 부작용을 최소화할 수 있는 수준으로 투여량을 결정할 수 있고, 이는 당업자에 의해 용이한 수준으로 결정될 수 있다. 구체적으로 상기 약학적 조성물의 투여량은 환자의 연령, 체중, 중증도, 성별 등에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로 체중 1kg 당 0.001 내지 150 mg, 보다 바람직하게는 0.01 내지 100 mg의 양을 매일 또는 격일, 1일 1 내지 3회 투여할 수 있다. 다만, 이는 예시적인 것으로, 상기 투여량은 필요에 달리 설정할 수 있다.
또한 본 발명의 상기 조성물은 식품 또는 건강기능식품일 수 있으며, 특히 상기 "건강기능식품"은 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 의미하며, "기능성"이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다.
본 발명의 상기 식품 또는 건강기능식품은, 운동 신경 질환의 예방 및 개선을 위한 목적으로 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 환제, 현탁액, 에멀젼, 시럽 등 약학적 투여 형태 또는 티백, 침출자, 음료, 캔디, 젤리, 껌 등의 건강 기능 식품으로 제조 및 가공이 가능하다.
본 발명의 상기 식품 또는 건강기능식품 조성물은, 식품 첨가물로 사용될 수 있으며, 단독으로 혹은 다른 성분과 조합하여 제품화될 수 있다. 또한, 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제 및 증진제, 펙트산 및 이의 염, 알긴산 및 이의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등이 포함될 수 있다. 상기 성분은 단독 혹은 조합하여 사용될 수 있으며, 적절한 함량으로 조합되어 사용할 수 있다.
또한 본 발명은, i) in vitro 상에서 운동 신경 세포에 후보 물질을 처리하는 단계; ii) 상기 후보 물질을 처리한 운동 신경 세포에서 Prmt1의 발현 또는 활성을 측정하는 단계; 및 iii) 미처리군과 비교하여 Prmt1의 발현 또는 활성을 증진시키는 후보 물질들을 운동 신경 질환 치료제 후보 물질로 선정하는 단계를 포함하는, 운동 신경 질환의 치료 물질을 스크리닝 하는 방법을 제공한다.
본 발명에서 상기 PRMT1의 발현 또는 활성을 측정하는 단계는 PRMT1 유전자의 발현에 의해 생성된 RNA 또는 단백질의 양을 측정할 수 있는 다양한 방법을 통해 실시될 수 있다. 바람직하게, RNA의 발현량은 RT-PCR(실시간 PCR), 마이크로 어레이, 노던 블롯팅 등을 이용하여 확인하였으며, 단백질의 활성 및 발현은 면역 침강, 면역염색, 크로마틴 면역염색, 효소면역분석(ELISA), 웨스턴 블롯팅 등의 방법으로 확인할 수 있으며, 그 방법에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 조성물은 PRMT1 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자를 포함하며, 상기 PRMT1 단백질은 운동 신경 세포의 손상 방지와 관련된 중요한 역할을 담당하고 있는 인자로서, 다양한 요인에 의한 스트레스로부터 운동 신경의 손상 방지, 상기 운동 신경 손상 및 퇴행성 요인에 의한 운동 신경 질환 등에 대한 예방, 개선 및 치료 효과를 가진다.
도 1은 운동 신경 특이적 Prmt1 결핍 마우스(Prmt1mnKO)에 있어, 노화 기반 생존율을 관찰한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 Prmt1mnKO 마우스의 노화에 의한 체중 감소를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 Prmt1mnKO 마우스에서, 노화에 의한 행동 능력 변화를 관찰하기 위하여 뒷다리 움켜쥠(limp clasping) 증상을 확인한 결과이다.
도 4는 Open field test에서 Prmt1mnKO 마우스의 움직인 거리와 속도를 대조군과 비교한 결과이다.
도 5는 Rotarod test에서 Prmt1mnKO 마우스가 버티는 시간을 대조군과 비교한 결과이다.
도 6은 Prmt1mnKO 마우스의 운동 신경 손상 후 뒷다리 근육 무게가 회복되는 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 Prmt1mnKO 마우스의 TA 근육에서 근섬유 크기가 현저히 감소된 것을 확인한 결과이다.
도 8은 Prmt1mnKO 마우스의 근육 섬유화 정도를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 Prmt1mnKO 마우스의 신경 재생 및 근위축 마커의 발현 정도를 대조군과 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 Prmt1mnKO 마우스에서 축색 돌기의 재신경화 정도를 대조군과 비교하여 확인한 결과이다.
도 11은 Prmt1mnKO 마우스의 스트레스 관련 민감성 증가 여부를 DNA 손상 마커의 발현을 통해 확인한 결과이다.
도 12는 PRMT1 단백질 발현을 억제시킨 운동신경 세포주(NSC34)에서 스트레스 관련 단백질의 발현량 증가를 웨스턴 블럿 분석을 통하여 확인한 결과이다.
도 13은 PRMT1 단백질 발현을 억제시킨 운동신경 세포주(NSC34)에서 ROS 검출이 증가되었음을 DHR123 staining으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 14는 PRMT1 단백질 발현을 억제시킨 운동신경 세포주(NSC34)에서 DNA 손상 관련 유전자(γ-H2AX)의 발현이 증가된 결과를 확인한 것이다.
도 15는 PRMT1 단백질을 과발현 시킨 운동신경 세포주(NSC34)에서, TNFα 처리로 유발된 세포 스트레스에 의한 신경 세포 보호 효과를 산화스트레스 마커 및 염증성 마커의 감소를 통해 확인한 결과이다.
이하, 본 명세서를 구체적으로 설명하기 위해 실시예를 들어 상세히 설명한다. 그러나, 본 명세서에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 명세서의 범위가 아래에서 상술하는 실시예들에 한정되는 것으로 해석되지는 않는다. 본 명세서의 실시예들은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 명세서를 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
실시예 1. 재료 및 실험 방법
1-1) 실험 모델 제작
실험동물 사육실은 일정한 조건 (온도 22±2 ℃, 습도 55±5%)을 유지하였다. 1일 12시간의 광주기와 12시간의 암주기를 적응하였다.
Prmt1-floxed 대립 유전자(EUCOMM에서 입수한 Prmt1f/f)를 보유한 마우스를 Hb9 프로모터 (Jackson Laboratory에서 제공하는 Hb9-Cre)의 제어 하에 Cre를 발현하는 형질 전환 마우스와 교배시켰다. 좌골 신경 탈 신경화 수술의 경우, 동물을 4% 이소플루란으로 마취 유도한 다음 37℃로 가열된 표면에서 2% 이소플루란을 지속적으로 흡입하여 유지했다. 피부는 왼쪽 대퇴골과 평행하게 뒤쪽으로 절개되었다. 좌골 신경은 허벅지 중간 부분에 노출된 후 집게를 사용하여 10 초 동안 손상되었다. 탈 신경화 후, 신경을 원래 자리로 재배치하고 근육을 외과용 용해가능한 봉합사로 닫고 피부 절개를 봉합 테이프로 봉합했다. Carprofen (5mg/kg)은 수술 후 통증 조절을 위해 피하로 투여되었다.
1-2) 행동분석
PRMT1f/f와 PRMT1 hb9cre 마우스의 행동 차이를 분석하기 위해 Open field 및 로타로드(Rota-rod) 테스트를 수행하였다.
Open field 테스트는 개방형 플라스틱 용기 (30x30x30 cm)에서 수행되었다. 각 실험이 시작될 때 마우스를 플라스틱 용기의 모서리에 놓고 20 분 동안 움직임을 기록했다. Noldus EthoVision 13.0 추적 소프트웨어를 통해 이동 거리와 속도를 분석하였다. 로타로드 장치 (모델 7600, Ugo Basile)를 사용하여 운동 조정 및 균형을 측정하였다. 고정 속도 로타로드 테스트(17rpm)를 위해, 마우스는 실제 실험 전에 3일 동안 세 번의 연습을 받은 다음 회전하는 실린더에 배치되었다. 세션 당 200 초 컷-오프가 사용되었다. 가속 로타로드 테스트 (300초 동안 4-40rpm)를 위해 마우스는 실제 실험 전에 3일 동안 세 번의 연습 시험을 받았다. 상기 두 실험 모두 로타로드에서 떨어지는 시간을 기록하였다.
1-3) 세포 배양 및 형질감염
NSC34 세포는 DMEM media를 기반으로 10%의 FBS, 1%의 GlutaMAX, 10 units/mL 페니실린, 10μg/mL 스트렙토마이신의 조성에서 배양하였다. NSC 34 세포에 Mirus transfection reagent를 사용, pcDNA, PRMT1-HA 플라스미드를 형질감염시켰다.
NSC 34 cell에 PRMT1 발현을 결손 시키기 위하여 Adenoviral pLKO.1-puro, PRMT1-shRNA를 cell에 형질감염 시켰다.
1-4) 단백질 및 RNA 분석
세포 수확 후, 세포에 Lysis buffer(20mM Tris-HCl, pH8, 150mM NaCl, 1% Triton X, Proteinase Inhibitor)를 첨가하여 30분간 용해한 뒤, 13000rpm에서 30분간 원심 분리 후, 세포 용해 샘플을 정량 하여, 동일양의 단백질을 SDS-PAGE 전기영동을 하고 PVDF membrane으로 옮겼다. 해당하는 1차 항체 및 2차 항체 반응 후 ECL reagent를 이용하여, X-ray 필름에 노출시켜 단백질 발현량을 확인하였다.
NSC34 세포 및 근육 조직은 FastPrepR-24 (MP Biomedicals)로 균질화 하였고, easy-spin Total RNA Extraction Kit (iNtRON Biotechnology)를 사용하여 RNA를 추출하였다. 유전자 발현의 배수 변화는 리보솜 유전자 L32의 발현에 대비하여 정규화되었다.
1-5) 조직학 및 면역 형광 분석
실험에 사용된 조직은 전경골근 및 장지신근(Tibialis anterior, extensor digitorum longus muscle)을 사용하였으며, 전경골근은 분리 즉시 액화질소를 이용하여 OCT compound로 동결 고정을 한 후, -80℃의 초저온 냉동고에 보관하였다. 조직 절편은 영하 20℃로 유지되는 동결 절편기을 이용하여 7um의 두께로 절단하였고, Sirius Red 염색 후 섬유화 정도를 관찰하였다.
상기 동물 조직에서 분리한 전경골근을 사용하여 면역조직화학염색을 실시하였다. -80℃의 초저온 냉동고에 보관된 동결절편을 1xPBS에 2번 세척하였다. 4% 파라포름알데하이드 (paraformaldehyde)을 사용하여 15분간 상온에서 고정을 시키고, 1xPBS에 2번 세척하였다. 조직과 투과용 버퍼 (0.5% Triton-X/PBS)를 5분간 상온에서 반응시키고 1xPBS에 2번 세척하였다. 조직과 TE buffer를 사용하여 100℃에서 10분간 반응시켜 항원성부활(Antigen retrieval)을 하고, 1xPBS에 2번 세척하였다. Blocking buffer (5% Goat serum, 0.1% Triton-X)로 1시간 동안 blocking을 한 후에 일차항체(Laminin)을 Blocking buffer에 1:500으로 희석하여 4℃에서 12시간 동안 반응시킨 후, 1xPBS에 2번 세척하였다. 2차 항체를 반응시킨 후, 1xPBS에 2번 세척한 후에 봉입하여 형광현미경으로 분석하였다.
또한 상기 동물 조직에서 분리한 장지신근을 사용하여 신경근 접합부 염색(NMJ staining)을 실시하였다. 장지신근 근육을 분리 즉시 4% 파라포름알데하이드 (paraformaldehyde)을 사용하여 15분간 상온에서 고정을 시키고, 1xPBS에 3번 세척하였다. Blocking buffer (3% BSA, 0.5% Triton-X)로 2시간 동안 blocking 후에 1차 항체(Neurofilament, Synaptophysin)를 Blocking buffer에 1:300으로 석하여 4℃에서 24시간 동안 반응시킨 후, 1xPBS에 3번 세척하였다. 2차 항체와 2차 항체가 접합된 BTX antibody를 실온에서 2시간 반응시킨 후, 1xPBS에 2번 세척한 후 봉입하여 형광현미경으로 분석하였다.
1-6) 통계분석
모든 값은 평균±SEM 또는 SD로 표시되었다. 통계적 유의성은 쌍 또는 짝이 없는 양측 스튜던트 t 검정 또는 분산 분석(ANOVA) 검정에 이어 Tukey의 검정에 의해 계산되었다. 차이는 P<0.05에서 유의한 것으로 간주되었다.
실험예 1. 운동신경 특이적 Prmt1 결손에 의한 영향
1-1) Prmt1 결손 마우스의 노화 기반 생존율, 체중 감소 효과
운동 신경 (motor neuron)특이적으로 Prmt1이 결핍된 마우스 (Prmt1mnKO)의 생존률 및 체중을 각 월령별로 측정하였다. 그 결과, 야생형에 비하여 노화가 진행될수록 마우스의 생존률과 체중이 급격히 감소됨을 확인하였다 (도 1 및 도 2). 즉, 운동 신경에서 발현되는 Prmt1 은 특히 노화 마우스의 생존율과 체중 유지에 중요한 역할을 담당한다는 사실을 확인하였다.
1-2) Prmt1 결손 마우스의 노화에 의한 행동 능력 변화
운동 신경 (motor neuron)특이적으로 Prmt1이 결핍된 마우스 (Prmt1mnKO mice)의 경우, 도 3에서 보듯이, 뒷다리를 움켜잡는 행동(limp clasping) 현상이 관찰되어, 운동신경이 퇴화되었음을 확인할 수 있었다. 또한, 행동 평가로서 Open field test를 시행하여 확인한 결과, 도 4와 같이, Prmt1mnKO 마우스에서 움직인 거리 및 보행속도가 정상 마우스(Prmt1f/f)에 비해 감소된 것을 확인하였다.
또한 운동능력의 조절 능력을 평가하기 위한 로타로드 테스트를 진행한 결과, 도 5에서 보듯이, Prmt1f/f에 비해 Prmt1mnKO 마우스에서 버티는 시간이 짧아졌음을 확인하였다. 위와 같은 실험 결과로부터, 운동 신경에서 Prmt1이 노화된 마우스의 행동 능력을 유지하는데 중요한 역할을 담당하는 것을 알 수 있다.
1-3) Prmt1 결손 마우스의 신경 회복 지연
Prmt1mnKO 마우스와 정상 마우스(Prmt1f/f)에 각각 좌골신경손상 (Sciatic nerve injury)를 유발하고, 28일 간 재신경화(re-innervation)를 유도한 후, 행동 분석 후에 마우스를 희생하였다.
Prmt1mnKO 마우스와 Prmt1f/f의 뒷다리 근육 무게를 측정하여 비교한 결과, Prmt1mnKO 마우스에서 근육 회복이 지연됨을 확인하였으며(도 6), TA (Tibialis anterior muscle)근육을 라미닌 염색으로 확인한 결과, Prmt1mnKO 마우스의 근섬유(myofiber)의 크기가 현저히 감소되어 있음을 확인할 수 있었다. (도 7).
또한 근육 위축 시 증가되는 것으로 알려져 있는 섬유화(fibrosis) 정도를 확인하기 위하여 근육 세포에 대하여 Sirius red staining을 수행한 결과, Prmt1mnKO 마우스에서 섬유화의 정도가 증가되어 있고(도 8), TA 근육에 대한 qPCR 결과에서 탈신경(Denervation) 및 근위축을 나타내는 마커가 Prmt1f/f 마우스에 비해 증가되어 있는 것을 확인할 수 있었다(도 9).
즉, 상기 결과로부터 운동 신경에 존재하는 PRMT1은 손상된 운동 신경의 재신경화에 중요한 역할을 수행함을 알 수 있다.
1-4) Prmt1 결손 마우스의 축색 돌기의 재 신경화 지연
신경근 접합부 염색(NMJ staining)에서, Prmt1mnKO 마우스의 FDB(Flexor digitorum brevis muscle) 및 EDL(Extensor digitorum longus) 근육에서 운동 신경 축색 돌기의 두께와 신경근 접합부 마커인 α-BTX (Alpha_Bungarotoxin)의 크기가 Prmt1f/f 마우스에 비해 얇고 작은 것을 확인할 수 있었다(도 10). 이로부터, Prmt1mnKO 마우스의 경우, 축색 돌기에서 재신경화가 지연되었음을 확인할 수 있다.
1-5) Prmt1 결손 마우스의 DNA 손상 및 스트레스 민감성 증가
Prmt1mnKO 마우스의 DNA 손상 및 스트레스 관련 민감성을 확인하기 위하여 마우스의 뒷다리 근육의 움직임을 담당하는 요추 척수(Lumbar spinal cord)를 serial section한 후, 운동신경 마커인 CHAT (Choline acetyltransferase)과 gamma H2AX를 co-staining한 후 관찰하였다. 그 결과, DNA 손상 마커인 gamma H2AX의 발현이 Prmt1f/f 대비 증가한 것을 확인할 수 있었다(도 11). 상기 결과로부터, Prmt1 이 결핍된 운동 신경세포는 스트레스와 관련된 민감성이 증가되어 있음을 알 수 있다.
실험예 2. 운동신경 세포에서 PRMT1 발현에 의한 효과
2-1) PRMT1 발현 억제 시, 세포 스트레스 증가 효과
운동신경 세포인 NSC34 세포주에 shPRMT1 아데노바이러스를 이용하여 PRMT1 발현을 저해하여 세포주에서 발현되는 세포 스트레스 마커의 발현량 변화를 확인하였다. 그 결과, 도 12에서 보듯이 웨스턴 블롯팅 분석에서 스트레스 관련 단백질인 p-eIF2a 및 c-caspase3의 발현이 대조군 대비 현저히 증가하였고, DNA 손상 단백질인 gamma H2AX의 발현도 대조군 대비 증가됨을 확인하였다. 또한, ROS staining 인 DHR123 (Dihydrorhodamine 123) staining을 통하여 PRMT1의 발현이 저해된 NSC34 cell에서 대조군 대비 ROS의 검출량이 증가됨을 확인하였다(도 13).
또한, 운동신경 세포인 NSC34 세포주에 shPRMT1 아데노바이러스를 이용하여 PRMT1 발현을 저해하고 DNA 손상 관련 유전자인 γ-H2AX 염색하였을 때, γ-H2AX 발현이 대조군 대비 현저히 증가하였음을 확인하였다. (도 14).
2-2) PRMT1 과발현 시, 세포 스트레스로부터 신경 세포 보호 효과
운동신경 세포인 NSC34 세포주에 PRMT1을 과발현시키고, 세포 스트레스를 야기하는 TNFα 처리 후 qPCR을 통해 스트레스 유전자의 mRNA 발현을 관찰하였다. TNFα 처리된 운동신경 세포에서는 ROS 스트레스 마커 (Gpx1, Sod1, Sod2) 및 염증성 스트레스 마커 (Ccl2, Cxcl1, Cxcl10)들의 발현량이 모두 증가하였으나, PRMT1이 과발현된 경우, 상기 마커들 모두가 현저히 감소되었음을 확인하였다(도 15). 이와 같은 결과로부터, 운동 신경 세포에 PRMT1을 과발현시킨 경우에 세포 스트레스를 보호할 수 있는 효과를 가짐을 확인할 수 있다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
Claims (10)
- PRMT1 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자를 포함하는 운동 신경 세포 보호용 조성물.
- 제1항에 있어서,상기 운동 신경 세포 보호는 노화, 산화 스트레스 및 염증에 의한 운동 신경세포의 손상을 방지하는 것임을 특징으로 하는, 운동 신경 세포 보호용 조성물.
- 제1항에 있어서,상기 조성물은 손상된 운동 신경 세포의 재 신경화를 촉진하는 것임을 특징으로 하는, 운동 신경 세포 보호용 조성물.
- PRMT1 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자를 포함하는, 신경 근육 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제4항에 있어서,상기 신경 근육 질환은 근이영양증, 운동 신경 질환, 근병증 및 신경근 접합부 질환을 포함하는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제5항에 있어서,상기 운동 신경 질환은 근위축성 측삭경화증(amyotrophic lateral sclerosis, ALS), 척수성 진행성 근위축(infantile progressive spinal muscular atrophy, SMA), 진행성 핵상마비(progressive bulbar palsy), 가연수성마비 (pseudobulbar palsy), 진행성 근육위축(progressive muscular atrophy, PMA), 진행성 축삭경화증(progressive lateral sclerosis, PLS), 단일 사지 근위축증 (monomelic amyotrophy, MMA) 및 헌팅턴 병을 포함하는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
- PRMT1 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자를 포함하는, 신경 근육 질환의 예방 또는 개선용 건강 기능 식품 조성물.
- 제7항에 있어서,상기 신경 근육 질환은 근이영양증, 운동 신경 질환, 근병증 및 신경근 접합부 질환을 포함하는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제8항에 있어서,상기 운동 신경 질환은 근위축성 측삭경화증(amyotrophic lateral sclerosis, ALS), 척수성 진행성 근위축(infantile progressive spinal muscular atrophy, SMA), 진행성 핵상마비(progressive bulbar palsy), 가연수성마비 (pseudobulbar palsy), 진행성 근육위축(progressive muscular atrophy, PMA), 진행성 축삭경화증(progressive lateral sclerosis, PLS), 단일 사지 근위축증 (monomelic amyotrophy, MMA) 및 헌팅턴 병을 포함하는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
- i) 운동 신경 세포 또는 신경근 접합부에 후보 물질을 처리하는 단계;ii) 상기 후보 물질을 처리한 운동 신경 세포 또는 신경근 접합부에서 PRMT1의 발현 또는 활성을 측정하는 단계; 및iii) 비 처리군과 비교하여 PRMT1의 발현 또는 활성을 증진시키는 후보 물질들을 선정하는 단계를 포함하는 신경 근육 질환의 예방, 개선 또는 치료 물질의 스크리닝 방법.
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