WO2023140407A1 - 쿠메스트롤을 포함하는 근감소증 예방 또는 치료용 약학 조성물 - Google Patents

쿠메스트롤을 포함하는 근감소증 예방 또는 치료용 약학 조성물 Download PDF

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WO2023140407A1
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WO
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muscle
cumestrol
sarcopenia
preventing
pharmaceutical composition
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PCT/KR2022/001163
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유준일
하영술
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경상국립대학교병원
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    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/365—Lactones
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    • A61K31/37—Coumarins, e.g. psoralen
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system

Definitions

  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating sarcopenia.
  • Sarcopenia began in 1989 when Irwin Rosenberg introduced the term 'sarcopenia', and it is a compound word of "sarco" meaning muscle in Greek and "penia” meaning reduction.
  • Sarcopenia refers to a disease in which muscle strength decreases due to a decrease in muscle mass due to various reasons such as aging.
  • the main causes of sarcopenia include nerve damage, skeletal muscle damage, reduced activity due to knee joint damage, use of glucocorticoids, cancer, and aging.
  • a decrease in muscle mass due to sarcopenia can affect overall physical health by causing a decrease in metabolism, adult diseases caused by an increase in body fat, and bone diseases.
  • An object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating sarcopenia.
  • An object of the present invention is to provide a food composition for preventing or improving sarcopenia.
  • An object of the present invention is to provide a method for preventing or treating sarcopenia.
  • a pharmaceutical composition for preventing or treating sarcopenia comprising coumestrol or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • composition inhibits the transcriptional activity of FoxO1 (Forkhead box O1) to reduce the expression of at least one selected from the group consisting of MuRF1 (Muscle ring finger 1) or MAFbx (muscle atrophy F-box).
  • FoxO1 Formhead box O1
  • MuRF1 Muscle ring finger 1
  • MAFbx muscle atrophy F-box
  • a food composition for preventing or improving sarcopenia comprising cumestrol or a food chemically acceptable salt thereof.
  • a method for preventing or treating sarcopenia comprising administering cumestrol or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the pharmaceutical composition and food composition of the present invention can increase muscular strength, muscular endurance, and muscle fiber thickness, and ultimately exhibit preventive and/or therapeutic effects on sarcopenia.
  • the pharmaceutical composition and food composition of the present invention can reduce the expression of proteins associated with muscular atrophy by inhibiting FoxO1, a transcription factor, through inhibition of AMPK activity.
  • Figure 1 shows the results of confirming the effect of cumestrol on the expression of proteins related to muscular atrophy in the gastrocnemius of the dexamethasone-induced muscular atrophy mouse model.
  • Figures 2 and 3 show the results of confirming the effect of cumestrol on the expression of proteins related to muscular atrophy in the gastrocnemius of the dexamethasone-induced muscular atrophy mouse model.
  • Figure 4 shows the results of confirming the effect of cumestrol on the expression of muscular atrophy-related proteins in the tibialis anterior muscle of the dexamethasone-induced muscular atrophy mouse model.
  • 5 and 6 show the results confirming the effect of cumestrol on the expression of proteins related to muscular atrophy in the tibialis anterior muscle of the dexamethasone-induced muscular atrophy mouse model.
  • Figure 7 shows the results of confirming the effect of cumestrol on body weight, endurance, and grip strength in the dexamethasone-induced muscular atrophy mouse model.
  • Figure 8 shows the results of confirming the effect of cumestrol on body weight, muscle mass and long extensor weight in the dexamethasone-induced muscular atrophy mouse model.
  • FIG. 11 is a schematic diagram of the mechanism by which cumesterol acts on sarcopenia.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating sarcopenia comprising coumestrol or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • Coumestrol (3,9-dihydroxy-6H-benzofuro (3,2-c)
  • benzopyran-6-one is a compound represented by Formula 1 (C 15 H 8 O 5 ).
  • Coumestrol is one of the phytoestrogens, and is mainly found in seeds, roots, or leaves of leguminosae and comositae plants. It is a kind of isoflavonoid and can be classified as a coumestan-based compound, and is known to have an estrogenic effect.
  • the compound of Formula 1 may be a material isolated from nature or chemically synthesized.
  • composition of the present invention may reduce the expression of at least one selected from the group consisting of MuRF1 (Muscle ring finger 1) and MAFbx (muscle atrophy F-box) by including cumestrol or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • MuRF1 Muscle ring finger 1
  • MAFbx muscle atrophy F-box
  • MuRF1 and MAFbx are downstream proteins of AMPK.
  • AMPK is known to be involved in the induction of muscle atrophy by directly involved in muscle protein degradation through the activation of the ubiquitin-proteasome pathway.
  • MAFbx is an F-box type E3 ligase
  • MuRF1 is a Ring Finger type E3 ligase.
  • Cumestrol can affect the expression of FoxOs, an AMPK downstream transcription factor.
  • cumestrol can inhibit the transcriptional activity of FoxO1 (Forkhead box O1). Meanwhile, cumestrol may not affect the expression of FoxO3.
  • cumestrol can reduce the expression of muscle ring finger 1 (MuRF1) and muscle atrophy F-box (MAFbx) by inhibiting the transcriptional activity of FoxO1 (Forkhead box O1), and can prevent, treat or improve sarcopenia.
  • MoRF1 muscle ring finger 1
  • MAFbx muscle atrophy F-box
  • FoxO1 FoxO1
  • pharmaceutically acceptable means that a compound or composition exhibits properties that do not cause serious irritation to an object, cell, tissue, etc. to which it is administered and do not impair the biological activity and physical properties of the compound.
  • pharmaceutically acceptable salt refers to a salt prepared using a specific compound according to the present invention with a relatively non-toxic acid or base.
  • a pharmaceutically acceptable salt may be, for example, an acid addition salt or a metal salt.
  • Acid addition salts can be formed from inorganic acids such as hydrochloric acid, nitric acid, phosphoric acid, sulfuric acid, hydrobromic acid, hydroiodic acid, nitrous acid or phosphorous acid and non-toxic organic acids such as aliphatic mono- and dicarboxylates, phenyl-substituted alkanoates, hydroxy alkanoates and alkanedioates, aromatic acids, aliphatic and aromatic sulfonic acids.
  • inorganic acids such as hydrochloric acid, nitric acid, phosphoric acid, sulfuric acid, hydrobromic acid, hydroiodic acid, nitrous acid or phosphorous acid
  • non-toxic organic acids such as aliphatic mono- and dicarboxylates, phenyl-substituted alkanoates, hydroxy alkanoates and alkanedioates, aromatic acids, aliphatic and aromatic sulfonic acids.
  • Such pharmaceutically non-toxic salts are sulfate, pyrosulfate, bisulphate, sulfite, bisulfite, nitrate, phosphate, monohydrogen phosphate, dihydrogen phosphate, metaphosphate, pyrophosphate, chloride, bromide, iodide, fluoride, acetate, propionate, decanoate, caprylate, acrylate, formate, isobutyrate, caprate, heptane Noate, propylate, oxalate, malonate, succinate, suberate, sebacate, fumarate, maleate, butyne-1,4-dioate, nucleic acid-1,6-dioate, benzoate, chlorobenzoate, methylbenzoate, dinitrobenzoate, hydroxybenzoate, methoxybenzoate, phthalate, terephthalate, benzenesulfonate , ethenesulfonate, chloro
  • the metal salt may be a sodium, potassium or calcium salt.
  • Metal salts can be prepared using bases, for example, alkali metal or alkaline earth metal salts can be obtained by dissolving the compound in an excess alkali metal hydroxide or alkaline earth metal hydroxide solution, filtering the undissolved compound salt, and evaporating and/or drying the filtrate.
  • Sarcopenia refers to a condition in which muscles in the body are abnormally reduced or weakened due to various reasons such as aging, so that physical activity is not smooth. Sarcopenia was assigned a unique number of M62.84 in the 2016 International Classification of Disease, Tenth Revision, Clinical Modification (ICD-10-CM) Code, and was classified as a disease.
  • Sarcopenia may be caused by at least one cause selected from the group consisting of nerve damage, skeletal muscle damage, reduced activity due to knee joint damage, use of glucocorticoids, cancer, and aging.
  • prevention refers to overall prevention as well as preventive measures that result in any degree of reduction in the likelihood of developing a condition to be prevented or of a reoccurring or recurring condition, including slight, substantial or major reduction in the likelihood of developing or recurring of the condition, wherein the degree of reduction in likelihood is at least a minor reduction.
  • treatment refers to treatment that results in a beneficial effect on a subject or patient suffering from the condition being treated, including not only cure but also relief of any degree, including minor, substantial, major, and the degree of relief being at least minor.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be formulated and used in the form of oral formulations such as powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, aerosols, external preparations, suppositories and sterile injection solutions according to conventional methods, but is not limited thereto.
  • Carriers, excipients and diluents that may be included in the composition include lactose, dextrose, sucrose, dextrin, maltodextrin, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, gum acacia, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinyl pyrrolidone, water, methylhydroxy benzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil, but are not limited thereto. When formulated, it is prepared using diluents or excipients such as commonly used fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrants, and surfactants, but is not limited thereto.
  • Solid preparations for oral administration include, but are not limited to, tablets, pills, powders, granules, capsules, etc., such solid preparations are prepared by mixing the compound with at least one or more excipients, for example, starch, calcium carbonate, sucrose or lactose, gelatin, and the like.
  • excipients for example, starch, calcium carbonate, sucrose or lactose, gelatin, and the like.
  • lubricants such as magnesium stearate and talc may also be used.
  • Liquid preparations for oral administration include suspensions, solutions for oral use, emulsions, syrups, etc., and various excipients such as wetting agents, sweeteners, aromatics, preservatives, etc. may be included in addition to water and liquid paraffin, which are commonly used simple diluents.
  • Formulations for parenteral administration include sterilized aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, freeze-dried formulations, and suppositories.
  • Propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, and injectable esters such as ethyl oleate may be used as non-aqueous solvents and suspending agents.
  • As a base for the suppository witepsol, macrogol, tween 61, cacao butter, laurin paper, glycerogeratin and the like may be used.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is administered in a pharmaceutically effective amount.
  • pharmaceutically effective amount means an amount sufficient to treat a disease at a reasonable benefit / risk ratio applicable to medical treatment, and an effective dose level may be determined according to the type of patient's disease, severity, drug activity, drug sensitivity, administration time, administration route and discharge rate, treatment period, factors including concurrently used drugs, and other factors well known in the medical field.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be administered as an individual therapeutic agent or in combination with other therapeutic agents, may be administered sequentially or simultaneously with conventional therapeutic agents, and may be administered single or multiple times. Considering all of the above factors, it is important to administer an amount that can obtain the maximum effect with the minimum amount without side effects, which can be easily determined by a person skilled in the art.
  • the effective amount may vary depending on the patient's age, sex, and body weight, and is generally 1 to 6000 mg per kg of body weight, preferably 60 to 600 mg, which may be administered once or divided into three doses. However, since it may increase or decrease according to the route of administration, severity of disease, sex, weight, age, etc., the dosage is not limited to the scope of the present invention in any way.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be provided by mixing with conventionally known substances for preventing or treating sarcopenia.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be administered in combination with a known compound exhibiting a preventive or therapeutic effect on sarcopenia.
  • the present invention provides a food composition for preventing or improving sarcopenia comprising cumestrol or a food-acceptable salt thereof.
  • Cumestrol and sarcopenia have been described above, so a detailed description thereof will be omitted.
  • accepted food means that the compound or composition does not cause serious irritation to the organism, cells, tissues, etc. to which it is administered, and exhibits characteristics that do not impair the biological activity and physical properties of the compound.
  • acceptable food salt refers to a salt prepared using a specific compound according to the present invention and a relatively non-toxic acid or base, and the acceptable salt may be, for example, an acid addition salt or a metal salt.
  • the acid addition salt and the metal salt may be within the above range, but are not limited thereto.
  • the food composition may be prepared and processed in the form of tablets, capsules, powders, granules, liquids, pills and the like.
  • a food composition may contain conventional food additives, and its suitability as a food additive is determined by the standards and standards for the item in accordance with the General Rules of the Food Additive Code and General Test Methods approved by the Food and Drug Administration, unless otherwise specified.
  • Items listed in the Food Additives Codex include, for example, chemical compounds such as ketones, glycine, calcium citrate, nicotinic acid, and cinnamic acid; natural additives such as persimmon pigment, licorice extract, crystalline cellulose, kaoliang pigment, and guar gum; It includes, but is not limited to, mixed preparations such as sodium L-glutamate preparations, alkali additives for noodles, preservative preparations, and tar color preparations.
  • chemical compounds such as ketones, glycine, calcium citrate, nicotinic acid, and cinnamic acid
  • natural additives such as persimmon pigment, licorice extract, crystalline cellulose, kaoliang pigment, and guar gum
  • a food composition in the form of a tablet may be granulated by a conventional method of mixing the composition with an excipient, a binder, a disintegrant, and other additives, and then compression molded by adding a lubricant or the like, or directly compressed.
  • the food composition in the form of a tablet may contain a flavoring agent and the like, if necessary.
  • hard capsules may be prepared by filling a mixture obtained by mixing the composition with additives such as excipients in a conventional hard capsule
  • soft capsules may be prepared by filling a mixture obtained by mixing the composition with additives such as excipients into a capsule base such as gelatin.
  • the soft capsule may contain a plasticizer such as glycerin or sorbitol, a coloring agent, a preservative, and the like, if necessary.
  • the food composition in the form of a ring may be prepared by molding a mixture of the composition, excipients, binders, disintegrants, etc. in a conventionally known method, and, if necessary, may be coated with sucrose or other coating agents, or starch, The surface may be coated with a material such as talc.
  • a food composition in the form of a granule may be prepared by a conventionally known method of a mixture of the composition and an excipient, a binder, a disintegrant, etc., and may contain a flavoring agent, a flavoring agent, and the like, if necessary.
  • Food compositions include beverages, meat, chocolate, foods, and confectionery. It may be pizza, ramen, other noodles, chewing gum, candy, ice cream, alcoholic beverages, vitamin complexes, and health supplements.
  • the food composition may be applied orally for use as a nutrient, and the application form is not particularly limited.
  • the daily intake is preferably 5000 mg or less, more preferably 2000 mg or less, and most preferably 500 to 1500 mg or 650 mg daily.
  • one tablet can be administered with water once a day.
  • the present invention provides a composition for inhibiting the expression of at least one selected from the group consisting of FoxO1 (Forkhead box O1), MuRF1 (Muscle ring finger 1) and MAFbx (muscle atrophy F-box) containing cumestrol or a salt thereof.
  • FoxO1 Formhead box O1
  • MuRF1 Muscle ring finger 1
  • MAFbx muscle atrophy F-box
  • composition for inhibiting expression can inhibit the expression of FoxO1 (Forkhead box O1), MuRF1 (Muscle ring finger 1) and MAFbx (muscle atrophy F-box) in vitro .
  • FoxO1 Formhead box O1
  • MuRF1 Muscle ring finger 1
  • MAFbx muscle atrophy F-box
  • the present invention provides a method for preventing or treating sarcopenia comprising administering cumestrol or a pharmaceutically acceptable salt thereof to a subject.
  • Cumestrol and sarcopenia have been described above, so a detailed description thereof will be omitted.
  • the subject may be a subject diagnosed with sarcopenia or a subject prior to onset of sarcopenia.
  • the subject may be an animal including a mammal.
  • the administration method may be oral administration or parenteral administration, and the specific method is not limited.
  • dexamethasone treatment group control group, Control
  • dexamethasone + Coumestrol treatment group experimental group, DC
  • control group Control
  • DC group dexamethasone + Coumestrol treatment group
  • mice each were randomly classified and used for the experiment.
  • 20 mg/kg of dexamethasone was intraperitoneally administered between 10 and 11 am every day for 14 days in the control group and the DC group.
  • no drug including vehicle was administered to the control group.
  • the DC treatment group was orally administered with cumestrol once daily at a dose of 200 mg/kg from 1 week before dexamethasone administration until the end of the experiment. Body weight was measured every 3 days before and after administration of dexamethasone.
  • Each control group and experimental group were euthanized on the day the experiment ended, and the left tibialis anterior muscle and gastrocnemius muscle were rapidly frozen in liquid nitrogen and stored at -80 ° C for use in identifying target proteins through Western blot.
  • Forelimb grip strength was measured in grams using a grip strength device (Bioseb, Chaville, France). The gauge was attached to a stainless steel T-bar. To test the grip strength, the mouse was held by its tail, placed with its front paws on the T-bar, and the tail was gently pulled back at a constant rate of about 2 cm/sec until the grip was released. The average of 5 measurements in each animal was calculated and evaluated.
  • Myoblasts were seeded at 3 ⁇ 10 5 /well in a 6-well culture plate containing 90% DMEM, 10% FBS, 100 units/ml of penicillin and streptomycin (PS)-added growth medium, and cultured in a 37°C CO 2 incubator.
  • a differentiation medium containing 2% horse serum (HS) and 100 unit/ml PS was used and cultured for 7 days while exchanging the differentiation medium once every 2 days.
  • HS horse serum
  • muscle atrophy was induced by treatment with dexamethasone (1 ⁇ M) or TNF- ⁇ (20 ng/ml) for 48 hours.
  • MuRF1 (Mm01185221_m1), MAFbx (Mm00499523_m1), MyoD (Mm00440387_m1), MyoG (Mm00446194_m1) and Myostatin (Mm01254559_m1) were used. After denaturation at 95°C for 10 minutes, the amplification was repeated 40 times at intervals of 15 seconds at 95°C and 60 seconds at 60°C, and the data obtained were analyzed.
  • mice muscle tissue was obtained, washed twice with cold PBS, dissolved in RIPA buffer, and total protein was extracted.
  • the extracted protein was separated using a 7.5% or 10% acrylamide gel and then transferred to a nitrocellulose membrane.
  • the membrane was blocked in a blocking buffer (0.1% Tween 20, 5% skim milk) and then incubated overnight at 4°C with a primary antibody.
  • the cells were washed with TBST 3 times, reacted with a peroxidase-conjugated secondary antibody for 1 hour, and then washed 3 times with TBST again. Protein bands were identified using the ECL detection system.
  • May-Grunwald and Giemsa staining which clearly shows the cell nucleus and root canal structure, was performed using cells treated with cumestrol, a useful component of field crops, and inducing muscle atrophy.
  • the differentiated myotube cells were washed with PBS, fixed with 100% methanol, and stained with May-Grunwald staining solution diluted in a 1:3 ratio in sodium phosphate buffer (1 mM NaH 2 PO 4 H 2 O, 1 mM Na 2 HPO 4 , pH 6.0) for 5 minutes.
  • the stained cells were washed with distilled water and stained for 10 minutes by adding Giemsa staining solution diluted in distilled water at a ratio of 1:10. Randomly divided into 4 compartments, stained cells were photographed under a microscope at 100 magnification, and cells were randomly selected in each compartment and the diameter of myotubes was measured using the ImageJ program.
  • the right tibialis anterior and gastrocne-mius muscles were removed, embedded in OCT compound (Lab-Tek; Miles Laboratories, Inc., Naperville, IL, USA), an embedding agent for frozen sections, and immediately frozen. Frozen section slides were prepared using a cryosection machine (Leica CM 1950; Heidelberg, Germany) to a thickness of 5 ⁇ m, and blocked with 10% goat serum at room temperature for 1 hour.
  • MPK is known to be involved in the induction of muscle atrophy by directly involved in muscle protein degradation through the activation of the ubiquitin-proteasome pathway.
  • AMPK When AMPK is activated, it activates the ubiquitin-proteasome pathway through the increase of MAFbx/atrogin-1, an F-box type E3 ligase, and MuRF1, a Ring Finger type E3 ligase, which are muscle-specific ubiquitin ligases specifically expressed in skeletal muscle via FoxO3a, resulting in muscle atrophy. Therefore, changes in the expression of AMPK and muscular atrophy-related proteins according to the treatment of cumestrol, a useful component of field crops, were confirmed.
  • MuRF1 and MAFbx proteins which are sub-steps of AMPK, was increased in the gastrocnemius muscle of the dexamethasone-induced proximal mouse model, and when the field crop useful ingredient cumestrol was administered, the expression was reduced, indicating that there was an effect of inhibiting muscle atrophy (see Figs. 1 and 2 and 3). A similar effect was also shown in the tibialis anterior muscle (see FIGS. 4 and 5 and 6).
  • the expression level of FoxOs an AMPK downstream transcription factor
  • the expression of FoxO1 increased in the tibialis anterior muscle and gastrocnemius muscle of the dexamethasone-induced muscular atrophy mouse model, and the expression level decreased when cumestrol was administered.
  • the expression level of FoxO3 protein did not increase in the dexamethasone-treated group, and it increased in the cumestrol-treated group, suggesting that the FoxO3 muscular atrophy-related signaling pathway is not a regulatory mechanism of the protective effect of cumestrol.
  • a dexamethasone-induced muscular atrophy mouse model was created and the efficacy of inhibiting muscular atrophy induced by cumestrol, a useful component of field crops, was analyzed.
  • the weight change there was no significant difference in body weight between the four groups during the adaptation period of the experimental animals (see Fig. 7 above).
  • the Dexa group showed a significant difference in body weight compared to the control group.
  • the DC group like the Dexa group, had a significant difference in body weight compared to the control group. No significant differences were observed between the DC and Dexa groups after dexamethasone administration.
  • the DC group showed a significant difference from the Dexa group (refer to the middle of FIG. 7).
  • the grip strength of the Dexa group decreased compared to the control group.
  • the grip strength was 102.43 g, showing a significant difference compared to the Dexa group (see FIG. 7 below).
  • the tibialis anterior muscle and the gastrocnemius muscle which are muscles of the hind leg, were cut out from the same mouse model and weighed. The weight of these muscles decreased in the Dexa group.
  • the tibialis anterior muscle there was no significant difference in muscle mass in the DC-administered group, and in the case of the gastrocnemius muscle, there was no significant difference in muscle mass in the DC-administered group (see FIG. 8).
  • an important feature of skeletal muscle atrophy is a decrease in myofiber size and number.
  • mouse muscle tissue was fluorescently stained with wheat germ agglutinin, Alexa Fluor488 conjugate (W11261; invitrogen/Thermo Fisher Scientific, US) antibody, and images were taken.
  • W11261 wheat germ agglutinin
  • Alexa Fluor488 conjugate W11261; invitrogen/Thermo Fisher Scientific, US
  • images were taken.
  • muscle fibers atrophy as a whole in the Dexa group, and the thickness of muscle fibers decreased.
  • an increase in muscle fiber thickness was observed in the gastrocnemius muscle of the DC-administered group (see FIGS. 9 and 10).

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Abstract

본 발명은 근감소증 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 쿠메스트롤 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함함으로써 근력, 근지구력, 근섬유의 굵기를 증가시킬 수 있고, 궁극적으로 근감소증의 예방 및/또는 치료 효과를 나타낼 수 있다.

Description

쿠메스트롤을 포함하는 근감소증 예방 또는 치료용 약학 조성물
본 발명은 근감소증 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
근감소증은 1989년 Irwin Rosenberg가 'sarcopenia'라는 용어를 도입하면서 시작되었으며, 그리스어에서 근육을 의미하는 “sarco”와 감소되는 것을 의미하는 “penia”가 합성된 단어이다. 근감소증은 노화 등의 다양한 이유로 인한 근육량의 감소에 따른 근력이 저하된 질환을 의미한다. 근감소증의 주요 원인은 신경손상, 골격근의 손상, 무릎 관절의 손상으로 인한 활동성 저하, 당질코르티코이드의 사용, 암, 노화 등이 있다. 근감소증으로 인한 근육양의 감소는 신진대사의 감소, 체지방의 증가에 따른 성인병 유발, 뼈 질환 등을 일으켜 전반적인 신체 건강에 영향을 줄 수 있다.
운동을 통해 단백질 합성 능력을 증가시키며 노인들의 근육의 힘이나 운동성을 증가시킬 수 있다고 보고되고 있으나 이는 장기적 치료방법으로 부적절하다. 이에 근감소증 예방, 개선 또는 치료에 효과적인 물질의 개발 및 연구가 필요한 실정이다.
본 연구는 농총진흥청의 지원을 받아 시행되었다(PJ014155052019):
[과제 고유번호] 1395059085
[과제번호] PJ014155052019
[부처명] 농촌진흥청
[과제관리(전문)기관명] 농촌진흥청
[연구사업명] 식량작물유용성분증진핵심기술개발(R&D)
[연구과제명] 재배 조건에 따른 밭작물 유용성분 증진 기술 개발
[과제수행기관명] 경상대학교병원
[연구기간] 2019~2023
본 발명은 근감소증 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 근감소증 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 근감소증 예방 또는 치료 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
1. 쿠메스트롤(coumestrol) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 근감소증 예방 또는 치료용 약학 조성물.
2. 위 1에 있어서, 상기 조성물은 FoxO1(Forkhead box O1)의 전사활성을 억제하여 MuRF1(Muscle ring finger 1) 또는 MAFbx(muscle atrophy F-box) 로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 발현을 감소시키는, 근감소증 예방 또는 치료용 약학 조성물.
3. 쿠메스트롤 또는 이의 식품학적으로 허용가능한 염을 포함하는 근감소증 예방 또는 개선용 식품 조성물.
4. 쿠메스트롤 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 투여하는 단계;를 포함하는 근감소증 예방 또는 치료 방법.
본 발명 약학 조성물 및 식품 조성물은 근력, 근지구력, 근섬유의 굵기를 증가시킬 수 있고, 궁극적으로 근감소증의 예방 및/또는 치료 효과를 나타낼 수 있다.
본 발명 약학 조성물 및 식품 조성물은 AMPK 활성 억제를 통한 전사인자인 FoxO1을 억제함으로써 근위축 관련 단백질의 발현을 감소시킬 수 있다.
도 1은 덱사메타손 유도 근위축 마우스 모델의 비복근에서 쿠메스트롤이 근위축 관련 단백질 발현에 미치는 영향을 확인한 결과를 나타낸다.
도 2 및 3은 덱사메타손 유도 근위축 마우스 모델의 비복근에서 쿠메스트롤이 근위축 관련 단백질 발현에 미치는 영향을 확인한 결과를 나타낸다.
도 4는 덱사메타손 유도 근위축 마우스 모델의 전경골근에서 쿠메스트롤이 근위축 관련 단백질 발현에 미치는 영향을 확인한 결과를 나타낸다.
도 5 및 6은 덱사메타손 유도 근위축 마우스 모델의 전경골근에서 쿠메스트롤이 근위축 관련 단백질 발현에 미치는 영향을 확인한 결과를 나타낸다.
도 7은 덱사메타손 유도 근위축 마우스 모델에서 쿠메스트롤이 체중, 지구력, 악력에 미치는 영향을 확인한 결과를 나타낸다.
도 8은 덱사메타손 유도 근위축 마우스 모델에서 쿠메스트롤이 체중, 근무게 및 장지신근 무게에 미치는 영향을 확인한 결과를 나타낸다.
도 9 및 10은 덱사메타손 유도 근위축 마우스 모델에서 쿠메스트롤이 근섬유 굵기 변화에 미치는 영향을 확인한 결과를 나타낸다.
도 11은 쿠메스테롤이 근감소증에 작용하는 메커니즘을 도식화한 것이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 쿠메스트롤(coumestrol) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 근감소증 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
쿠메스트롤(coumestrol, 3,9-dihydroxy-6H-benzofuro(3,2-c)(1)benzopyran-6-one)은 하기 화학식 1(C15H8O5)로 표현되는 화합물이다.
[화학식 1]
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쿠메스트롤(coumestrol)은 식물성 에스트로겐 중 하나로서, 주로 콩과(leguminosae), 국화과(comositae) 식물의 씨앗, 뿌리 또는 잎 등에서 발견된다. 이는 이소플라보노이드(isoflavonoid)의 일종으로 쿠메스탄(coumestan) 계열의 화합물로 분류될 수 있으며, 에스트로겐 효과를 가지고 있는 것으로 알려져 있다.
화학식 1의 화합물은 천연으로부터 분리된 물질이거나, 화학적으로 합성된 것일 수 있다.
본 발명의 조성물은 쿠메스트롤 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함함으로써 MuRF1(Muscle ring finger 1) 또는 MAFbx(muscle atrophy F-box)로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 발현을 감소시킬 수 있다.
MuRF1 및 MAFbx는 AMPK의 하위 단계의 단백질이다. AMPK는 ubiquitin-proteasome 경로의 활성화를 통한 근육 단백질 분해에 직접적으로 관여함으로서 근위축 유발에 관여하는 것으로 알려져 있다. MAFbx는 F-box type E3 ligase이고, MuRF1는 Ring Finger 유형의 E3 ligase이다.
쿠메스트롤은 AMPK 하위 단계 전사인자인 FoxOs 발현에 영향을 미칠 수 있다.
일 구현예에 따르면, 쿠메스트롤은 FoxO1(Forkhead box O1)의 전사활성을 억제할 수 있다. 한편, 쿠메스트롤은 FoxO3의 발현에는 영향을 미치지 않을 수 있다.
일 구현예에 따르면, 쿠메스트롤은 FoxO1(Forkhead box O1)의 전사활성을 억제하여 MuRF1(Muscle ring finger 1) 및 MAFbx(muscle atrophy F-box)의 발현을 감소시킬 수 있고, 근감소증을 예방, 치료 또는 개선시킬 수 있다.
용어 "약학적으로 허용 가능한"은 화합물 또는 조성물이 투여되는 개체, 세포, 조직 등에 심각한 자극을 유발하지 않고 화합물의 생물학적 활성과 물성들을 손상시키지 않는 특성을 나타내는 것을 의미한다.
용어 "약학적으로 허용 가능한 염"은 본 발명에 따른 특정 화합물과 비교적 무독성인 산 또는 염기를 이용해서 조제되는 염을 의미한다. 약학적으로 허용 가능한 염은 예를 들어 산 부가염 또는 금속염일 수 있다.
산 부가염은 염산, 질산, 인산, 황산, 브롬화수소산, 요드화수소산, 아질산 또는 아인산과 같은 무기산류와 지방족 모노 및 디카르복실레이트, 페닐-치환된 알카노에이트, 하이드록시 알카노에이트 및 알칸디오에이트, 방향족 산류, 지방족 및 방향족 설폰산류와 같은 무독성 유기산으로부터 형성될 수 있다. 이러한 약학적으로 무독한 염은 설페이트, 피로설페이트, 바이설페이트, 설파이트, 바이설파이트, 니트레이트, 포스페이트, 모노하이드로겐 포스페이트, 디하이드로겐 포스페이트, 메타포스페이트, 피로포스페이트, 클로라이드, 브로마이드, 아이오다이드, 플루오라이드, 아세테이트, 프로피오네이트, 데카노에이트, 카프릴레이트, 아크릴레이트, 포메이트, 이소부티레이트, 카프레이트, 헵타노에이트, 프로피을레이트, 옥살레이트, 말로네이트, 석시네이트, 수베레이트, 세바케이트, 푸마레이트, 말리에이트, 부틴- 1,4-디오에이트, 핵산-1，6-디오에이트, 벤조에이트, 클로로벤조에이트, 메틸벤조에이트, 디니트로 벤조에이트, 하이드록시벤조에이트, 메톡시벤조에이트, 프탈레이트, 테레프탈레이트, 벤젠설포네이트, 를투엔설포네이트, 클로로벤젠설포네이트, 크실렌설포네이트, 페닐아세테이트, 페닐프로피오네이트, 페닐부티레이트, 시트레이트, 락테이트, β_하이드톡시부티레이트, 글리콜레이트, 말레이트, 타트레이트, 메탄설포네이트, 프로판설포네이트, 나프탈렌-1-설포네이트, 나프탈렌-2-설포네이트 또는 만델레이트를 포함할 수 있다. 예를 들어, 산 부가염은 화합물을 과량의 산 수용액 중에 용해시키고, 염을 수화성 유기 용매, 예컨대 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 아세토니트릴을 사용하여 침전시켜 수득할 수 있다.
금속염은 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염일 수 있다. 금속염은 염기를 사용하여 제조할 수 있으며, 예를 들어, 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염은 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리 토금속 수산화물 용액 중에 용해하고, 비용해 화합물 염을 여과하고 여액을 증발 및/또는 건조시켜 수득할 수 있다.
근감소증은 노화 등의 다양한 이유로 체내의 근육이 비정상적으로 감소하거나 약해져 신체활동이 원활하지 않은 상태를 의미한다. 근감소증은 2016년 국제질병분류 (International Classification of Disease, Tenth Revision, Clinical Modification(ICD-10-CM) Code, ICD-10-CM)에서 M62.84의 고유번호를 부여 받게 되어 질병으로 분류되었다.
근감소증은 신경 손상, 골격근 손상, 무릎 관절 손상으로 인한 활동성 저하, 당질코르티코이드의 사용, 암 및 노화로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 원인으로 유발된 것일 수 있다.
용어 "예방"은 전체 예방 뿐만 아니라 병태의 발병 또는 재발병의 가능성의 경미한, 실질적인 또는 큰 감소를 포함하여 예방될 병태 또는 재발생 또는 재발하는 병태의 발병 가능성의 임의의 정도의 감소를 초래하는 예방적 조치를 지칭하고, 가능성 감소의 정도는 적어도 경미한 감소이다.
용어 "치료"는 치유뿐만 아니라 경미한 완화, 실질적인 완화, 주요 완화를 포함하는 임의의 정도의 완화를 포함하여 치료될 병태를 앓고 있는 대상체 또는 환자에게 유리한 효과를 초래하는 처치를 지칭하고, 완화 정도는 적어도 경미한 완화이다.
본 발명의 약학적 조성물은 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
조성물에 함유될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오즈, 덱스트로즈, 수크로스, 덱스트린, 말토덱스트린, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면 활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제되나, 이에 제한되지 않는다.
경구 투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며 이에 제한되지는 않으나, 이러한 고형제제는 상기 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다.
경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에서 "약제학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 통상의 기술자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물에서 유효량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 ㎏당 1 내지 6000 ㎎, 바람직하게는 60 내지 600 ㎎을 1회 또는 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나, 투여 경로, 질병의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명 약학 조성물은 종래에 알려져 있는 근감소증 예방 또는 치료용 물질과 혼합하여 제공될 수도 있다. 본 발명 약학 조성물은 근감소증 예방 또는 치료 효과를 나타내는 공지의 화합물과 병행하여 투여할 수 있다.
또한, 본 발명은 쿠메스트롤 또는 이의 식품학적으로 허용가능한 염을 포함하는 근감소증 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
쿠메스트롤, 근감소증에 대해서는 전술한 바 있어 구체적인 설명은 생략한다.
용어 "식품학적으로 허용 가능한"은 화합물 또는 조성물이 투여되는 개체, 세포, 조직 등에 심각한 자극을 유발하지 않고 화합물의 생물학적 활성과 물성들을 손상시키지 않는 특성을 나타내는 것을 의미한다.
용어 "식품학적으로 허용 가능한 염"은 본 발명에 따른 특정 화합물과 비교적 무독성인 산 또는 염기를 이용해서 조제되는 염을 의미하며, 식품학적으로 허용 가능한 염은 예를 들어 산 부가염 또는 금속염일 수 있고, 산 부가염 및 금속염은 전술한 범위 내의 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
식품 조성물은 정제, 캡슐, 분말, 과립, 액상, 환 등의 형태로 제조 및 가공될 수 있다.
식품 조성물은 통상의 식품 첨가물을 포함할 수 있으며, 식품 첨가물로서의 적합 여부는 다른 규정이 없는 한, 식품의약품안전청에 승인된 식품 첨가물 공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다.
식품 첨가물 공전에 수재된 품목으로는 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산칼슘, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성물; 감색소, 감초추출물, 결정셀룰로오스, 고량색소, 구아검 등의 천연첨가물; L-글루타민산나트륨 제제, 면류 첨가알칼리제, 보존료제제, 타르색소제제 등의 혼합제제류 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
예를 들어, 정제 형태의 식품 조성물은 상기 조성물을 부형제, 결합제, 붕해제 및 다른 첨가제와 혼합한 혼합물을 통상의 방법으로 과립화한 다음, 활택제 등을 넣어 압축 성형하거나, 상기 혼합물을 직접 압축 성형할 수 있다. 또한 상기 정제 형태의 식품 조성물은 필요에 따라 교미제 등을 함유할 수도 있다.
캡슐 형태의 식품 조성물 중 경질 캡슐제는 통상의 경질 캡슐에 상기 조성물을 부형제 등의 첨가제와 혼합한 혼합물을 충진하여 제조할 수 있으며, 연질 캡슐제는 상기 조성물을 부형제 등의 첨가제와 혼합한 혼합물을 젤라틴과 같은 캡슐기제에 충진하여 제조할 수 있다. 상기 연질 캡슐제는 필요에 따라 글리세린 또는 소르비톨 등의 가소제, 착색제, 보존제 등을 함유할 수 있다.
환 형태의 식품 조성물은 상기 조성물과 부형제, 결합제, 붕해제 등을 혼합한 혼합물을 기존에 공지된 방법으로 성형하여 조제할 수 있으며, 필요에 따라 백당이나 다른 제피제로 제피할 수 있으며, 또는 전분, 탈크와 같은 물질로 표면을 코팅할 수도 있다.
과립 형태의 식품 조성물은 상기 조성물과 부형제, 결합제, 붕해제 등을 혼합한 혼합물을 기존에 공지된 방법으로 입상으로 제조할 수 있으며, 필요에 따라 착향제, 교미제 등을 함유할 수 있다.
식품 조성물은 음료류, 육류, 초코렛, 식품류, 과자류. 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 사탕류, 아이스크림류, 알코올 음료류, 비타민 복합제 및 건강보조식품류 등일 수 있다.
식품 조성물은 영양제의 용도로 경구 적용될 수 있으며, 적용 형태는 특별히 제한되지 않는다. 예를 들면 경구 투여되는 경우, 하루 섭취량은 5000㎎ 이하인 것이 바람직하고, 하루 섭취량이 2000㎎ 이하인 것이 보다 바람직하며, 하루 섭취량이 500 내지 1500㎎, 또는 650㎎인 것이 가장 바람직하다. 캡슐제 또는 정제로 제제화하는 경우, 1일 1회 1정을 물과 함께 투여할 수 있다.
또한, 본 발명은 쿠메스트롤 또는 이의 염을 포함하는 FoxO1(Forkhead box O1), MuRF1(Muscle ring finger 1) 및 MAFbx(muscle atrophy F-box) 로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 발현 억제용 조성물을 제공한다.
상기 발현 억제용 조성물은 시험관 내(in vitro)에서 FoxO1(Forkhead box O1), MuRF1(Muscle ring finger 1) 및 MAFbx(muscle atrophy F-box)의 발현을 억제할 수 있다.
또한, 본 발명은 개체에 쿠메스트롤 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 투여하는 단계;를 포함하는 근감소증 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
쿠메스트롤, 근감소증에 대해서는 전술한 바 있어 구체적인 설명은 생략한다.
개체는 근감소증으로 진단된 개체 또는 근감소증 발병 전 개체일 수 있다. 개체는 포유류를 포함한 동물일 수 있다.
투여 방법은 경구투여 또는 비경구 투여일 수 있으며, 구체적인 방법이 제한되지 않는다.
이하, 본 발명을 구체적으로 설명하기 위해 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다.
실험 방법
1. 덱사메타손 유도 근위축 마우스 모델 제작
동물실험을 수행하기 위하여 경상대학교 동물실험윤리위원회에서 승인(GNU-180823-M0044)을 받았으며, 규정에 따라 동물실험에 관한 윤리 과정을 준수하여 연구를 진행하였다. 실험동물은 (주)코아텍(Seoul, Korea)에서 구입한 6주령 수컷 C57BL/6 마우스를 사용하였다. 실험동물은 온도 24±2℃, 상대습도 40~60%, 조도 150~300 lux, 12시간 간격의 명암 주기 환경에서 1주일 간 적응시킨 후 실험에 사용하였다. 적응 기간 동안 일반식이를 공급하였으며 식수로 멸균수를 자유롭게 섭취하도록 하였고, 적응 기간 후 덱사메타손(dexamethasone) 처리군(대조군, Control), 덱사메타손 + 쿠메스트롤(Coumestrol) 처리군(실험군, DC)으로 나누어 각 9마리씩 무작위로 분류하여 실험에 사용하였다. 실험동물 적응 기간 후 근위축 모델을 만들기 위해 control군과 DC군에 매일 오전 10~11시 사이에 덱사메타손 20 mg/kg을 14일간 복강 투여하였다. 같은 기간 동안 control군에는 vehicle 포함 아무 약물도 투여하지 않다. DC 처리군은 덱사메타손 투여 1주일 전부터 실험 종료일까지 쿠메스트롤을 200 mg/kg의 복용량으로 매일 1회 경구 투여하였다. 체중은 덱사메타손 투여 전과 투여 후 3일 단위로 측정하였다. 각 대조군과 실험군은 실험이 종료되는 날 안락사 시켰고, 좌측 전경골근과 비복근은 웨스턴 블롯을 통해 타겟 단백질을 확인하는데 사용하기 위해 액체 질소에서 급속 냉동하여 -80℃에서 보관하였다.
2. 트레드밀 테스트
마우스 러닝 테스트는 트레드밀 머신(treadmill machine)(Panlab, Barcelona, Spain)을 이용해 속도, 지속 시간, 거리를 측정하고, 소프트웨어(SeDaCom v2.0.02, Panlab, Barcelona, Spain)를 사용하여 조절하였다. 이 테스트에서 적응 보행 속도는 10 cm/sec로 3분 동안 달리도록 설정하였고, 75 cm/sec의 최대 속도에 도달하기까지 4분마다 4 cm/sec로 증속하여 마우스를 지칠 때까지 달리게 하였다. 적응 보행 속도와 달리기 속도는 모든 군에 대해 동일하게 적용하였고, 러닝머신의 각 레일 뒤에서 전기 자극(1.1 mA)을 주어 강제로 달리게 하였다. 지칠 때까지 걸리는 시간(time to exhaustion)을 비교하여 각 개체의 운동능력을 평가하였다. 지침 (exhaustion)이 발생한 시각은 앞다리가 레일에 놓이고 뒷다리는 3초 동안 전기 장치에 놓여있는 시간으로 정의하였다.
3. 그립 강도 테스트
그립 강도 장치 (Bioseb, Chaville, France)를 이용해 앞다리 그립 강도를 그램 단위로 측정하였다. 게이지는 스테인레스 스틸 T-바에 부착하였다. 그립 강도를 시험하기 위해 마우스의 꼬리를 잡고 마우스를 T-바에 앞발로 놓은 다음 그립이 풀릴 때까지 약 2 cm/sec의 일정한 속도로 꼬리를 부드럽게 뒤로 잡아당겼다. 각 동물에서 5회 측정치의 평균을 계산하여 평가하였다.
4. qPCR을 이용한 근감소증 관련 바이오마커 분석
90% DMEM, 10% FBS, 100 unit/ml의 페니실린과 스트렙토마이신(PS)이 첨가된 성장배지를 포함하는 6-well culture plate에 근아세포를 3×105/well로 seeding하고 37℃ CO2 배양기에서 배양하였다. C2C12 근아세포를 근관세포로 분화시키기 위하여 2% horse serum (HS)과 100 unit/ml PS가 포함된 분화배지를 사용하여 2일에 한 번씩 분화배지를 교환하면서 7일간 배양하였다. 근감소 세포모델로 덱사메타손(1 μM)을 처리하거나 TNF-α (20 ng/ml)를 48시간 처리하여 근위축(muscle atrophy)을 유도하였다. 이때 밭작물 유용성분인 쿠메스트롤(SIGMA)을 동시에 혼합하여 48시간동안 처리하였다. 세포를 차가운 PBS로 2번 세척하고 Trizol 용액을 이용하여 전체 RNA를 분리하였다. 추출한 2 ug RNA는 iScriptTM cDNA Synthesis Kit (Bio-Rad)를 이용하여 메뉴얼에 따라 cDNA로 합성하였고, mRNA 발현은 TaqMan analysis를 사용하여 ViiATM7 Real-Time PCR System (Applied Biosystems)에서 실행하였다. Primer는 MuRF1 (Mm01185221_m1), MAFbx (Mm00499523_m1), MyoD (Mm00440387_m1), MyoG (Mm00446194_m1)와 Myostatin (Mm01254559_m1)을 사용하였다. 95℃에서 10분간 변성 후, 95℃에서 15초, 60℃에서 60초의 간격으로 40회 반복하여 증폭 후 얻어진 자료를 분석하였다.
5. 웨스턴 블로팅을 이용한 근감소증 관련 바이오마커 분석
덱사메타손 유도 근위축 마우스 모델에서 쿠메스트롤을 경구투여한 후 마우스 근육조직을 수득하여 차가운 PBS로 2번 수세하고 RIPA 버퍼로 용해하여 전체 단백질을 추출하였다. 추출한 단백질을 7.5% 또는 10% 아크릴아마이드 젤을 이용하여 단백질을 분리 한 후 니트로셀룰로스 멤브레인(nitrocellulose membrane)에 트랜스퍼(transfer)하였다. 블로킹 버퍼(blocking buffer) (0.1% Tween 20, 5% skim milk)에서 멤브레인을 블로킹한 다음 1차 항체(primary antibody)와 함께 4℃에서 밤새 배양하였다. 다음날 TBST로 3회 수세하고 퍼옥시다아제-컨쥬게이션된 2차 항체(secondary antibody)로 1시간 동안 반응시킨 후 다시 TBST로 3회 수세하였다. ECL detection 시스템을 이용하여 단백질 밴드를 확인하였다.
6. 근관세포 분화도 비교 분석
밭작물 유용성분인 쿠메스트롤을 처리하고 근위축(muscle atrophy)을 유도한 세포를 이용하여 세포핵과 근관 구조를 명확하게 보여주는 May-Grunwald and Giemsa staining을 수행하였다. 분화 유도된 근관세포를 PBS로 수세하고 100% 메탄올로 고정한 후 sodium phosphate buffer (1 mM NaH2PO4 H2O, 1 mM Na2HPO4, pH 6.0)에 1:3 비율로 희석한 May-Grunwald staining solution을 첨가하여 5분간 염색하였다. 염색된 세포를 증류수로 수세하고 증류수에 1:10 비율로 희석한 Giemsa staining solution을 첨가하여 10분간 염색하였다. 임의로 4개의 구획을 나누어 100 배율의 현미경으로 염색이 끝난 세포들을 촬영 하였고, 각각의 구획에서 랜덤하게 세포를 선정하여 ImageJ 프로그램으로 근관세포(myotube)의 직경을 측정하였다.
7. 근육 조직의 조직학적 분석
우측 전경골근(tibialis anterior)과 비복근(gastrocne-mius)을 적출하여 동결절편용 포매제인 OCT compound (Lab-Tek; Miles Laboratories, Inc., Naperville, IL, USA)에 포매한 후 즉시 동결시켰다. 냉동절편기(Leica CM 1950; Heidelberg, Germany)를 이용하여 5um 두께로 절편한 동결절편 슬라이드 표본을 제작하고, 1시간 상온에서 10% goat serum으로 blocking을 하였다. 항체로 Wheat germ agglutinin, Alexa Fluor488 conjugate(W11261: invitrogen/Thermo Fisher Scientific, US)antibody를 1:500 농도로 희석하여 O/N동안 4℃에서 염색을 하고, 정립현미경(Nikon Eclipse ni DS-Ri2: Nikon, Tokyo, Japan)을 사용하여 관찰하였다.
실험 결과
1. 덱사메타손 유도 근감소 마우스 모델에서 근감소 억제 기전 분석
MPK는 유비퀴틴-프로테아솜 경로의 활성화를 통한 근육 단백질 분해에 직접적으로 관여함으로서 근위축 유발에 관여하는 것으로 알려져 있다. AMPK가 활성화되면 FoxO3a를 경유하여 골격근에서 특이적으로 발현되는 muscle-specific ubiquitin ligases로서 F-box type E3 ligase인 MAFbx/atrogin-1 및 Ring Finger 유형의 E3 ligase인 MuRF1의 증가를 통한 유비퀴틴-프로테아좀 경로를 활성화하여 근위축을 유발시킨다. 따라서 밭작물 유용성분인 쿠메스트롤의 처리에 따른 AMPK 및 근위축 관련 단백질의 발현 변화를 확인하였다. 덱사메타손 유도 근위측 마우스 모델의 비복근에서 AMPK의 하위 단계인 MuRF1과 MAFbx 단백질의 발현을 증가시켰으며 밭작물 유용성분 쿠메스트롤을 투여한 경우 발현이 감소되어 근위축 억제효능이 있음을 보여주었다(도 1 및 도 2 및 3 참조). 또한 전경골근에서도 유사한 효과를 나타내었다(도 4 및 도 5 및 6 참조).
다음으로 AMPK 하위 단계 전사인자인 FoxOs의 발현정도를 관찰하였다. 먼저 덱사메타손 유도 근위축 마우스 모델의 전경골근과 비복근에서 FoxO1의 발현이 증가하였고, 쿠메스트롤을 투여한 경우 발현량이 감소하였다. 하지만 덱사메타손 처리군에서 FoxO3의 단백질의 발현량은 증가하지 않았고, 쿠메스트롤 투여군에서 증가하여 FoxO3의 근위축 관련 신호전달 경로는 쿠메스트롤에 의한 근위축 보호효과의 조절 기전은 아닌 것으로 사료된다.
상기 결과를 통해 쿠메스트롤이 덱사메타손 처리에 의하여 유발된 근위축을 억제한다는 것을 알 수 있었으며, 이러한 현상은 AMPK 활성 억제를 통한 전사인자인 FoxO1을 억제함으로써 유비퀴틴-프로케아좀 경로의 차단에 의한 것으로 사료된다.
2. 덱사메타손 유도 근감소 마우스 모델에서 근감소 억제 효능평가
덱사메타손 유도 근위축 마우스 모델을 만들어 밭작물 유용성분 쿠메스트롤이 유발하는 근위축 억제 효능을 분석하였다. 먼저 체중 변화를 측정한 결과 실험동물의 적응 기간 동안 네 군 사이의 유의한 체중 차이는 없었다(도 7 위 참조). 덱사메타손(Dexa) 투여 7일 후부터 실험 종료일까지 Dexa군은 대조군과 비교하여 유의한 차이로 체중이 적게 나타났다. DC군도 Dexa군과 마찬가지로 대조군에 대하여 유의한 차이로 체중이 적었다. 덱사메타손 투여 후 DC군과 Dexa군 사이의 유의한 차이는 관찰되지 않았다.
트레드밀 테스트 결과에서 DC군은 Dexa군과 유의한 차이를 보였다(도 7 중간 참조). 동일한 마우스로 시행한 그립 강도 테스트에서 대조군에 비해 Dexa군의 악력이 감소하였다. 반면에, DC군에서 악력이 102.43 g으로 Dexa군과 비교하여 유의한 차이를 보나타내었다(도 7 아래 참조). 이를 통해 덱사메타손에 의해 유도된 근위축 모델의 근 기능 감소가 밭작물 유용성분인 쿠메스트롤의 복용에 의하여 어느 정도 회복되었음을 알 수 있었다.
다음으로 동일한 마우스 모델에서 뒷발 근육인 전경골근과 비복근을 잘라내어 무게를 측정하였다. Dexa군에서 이들 근의 무게는 감소하였다. 전경골근의 경우 DC 투여군에서 근육량이 유의한 체중 차이는 없었고, 비복근의 경우도 마찬가지로 DC 투여군에서 근육량이 유의한 체중 차이는 없었다(도 8 참조). 일반적으로 골격 근 위축의 중요한 특징은 근섬유(myofiber) 크기와 수의 감소이다. 따라서 근감소 모델 마우스의 전경골근과 비복근 조직을 면역형광 염색을 수행하여 근섬유의 형태 변화의 조직학적인 특징을 비교하였다. 구체적으로 마우스 근육 조직을 wheat germ agglutinin, Alexa Fluor488 conjugate (W11261; invitrogen/Thermo Fisher Scientific, US) antibody로 형광염색하고 이미지를 촬영하였다. 그 결과 대조군에 비하여 Dexa군에서 전체적으로 근섬유가 위축되어 근섬유의 굵기가 감소하였다. 이에 비하여 DC 투여군의 비복근에서 근섬유 굵기의 증가가 관찰되었다(도 9 및 10 참조).

Claims (4)

  1. 쿠메스트롤 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 근감소증 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 조성물은 FoxO1(Forkhead box O1)의 전사활성을 억제하여 MuRF1(Muscle ring finger 1) 또는 MAFbx(muscle atrophy F-box) 로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 발현을 감소시키는, 근감소증 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  3. 쿠메스트롤 또는 이의 식품학적으로 허용가능한 염을 포함하는 근감소증 예방 또는 개선용 식품 조성물.
  4. 쿠메스트롤 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 투여하는 단계;를 포함하는 근감소증 예방 또는 치료 방법.
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