KR20150094311A - 퇴행성 신경계 질환 치료제 스크리닝 방법 - Google Patents

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Abstract

FUS (fused in sarcoma) 돌연변이와 PRMT1 (protein arginine methyltransferase 1) 단백질의 결합을 저해하여 FUS 응집체 형성을 감소시키는 퇴행성 신경계 질환 치료제를 스크리닝하는 방법으로, (a) 세포에 FUS 돌연변이 단백질을 발현시키는 단계; (b) 상기 세포에 산화스트레스 유발 물질 처리하는 단계; (c) 상기 세포에 시험 물질을 접촉시키는 단계; (d) 상기 시험 물질을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 FUS 돌연변이와 PRMT1 단백질의 결합 저해 및 FUS 응집체 형성을 감소시키는 물질을 퇴행성 신경계 질환 치료제로 선별하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.

Description

퇴행성 신경계 질환 치료제 스크리닝 방법 {A Method for Screening an Agent for Treating a Neuro-Degenerative Disease}
본 발명은 퇴행성 신경계 질환 치료제를 스크리닝 하는 방법에 관한 것이다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 출원인에 의해 구체적으로 밝혀진 FUS (fused in sarcoma) 돌연변이와 PRMT1 (protein arginine methyltransferase 1) 단백질의 결합 및 이에 의한 FUS 응집체 형성과 관련된 퇴행성 신경계 질환의 병리학적 메커니즘을 근거로 하여 퇴행성 신경계 질환 예를 들어, 루게릭병 또는 전측두엽성 치매를 치료하기 위한 치료제를 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.
FUS는 RNA/DNA결합 단백질로서, FUS의 N-말단은 전사 활성과 연관되어 있는 한편, C-말단은 단백질 및 RNA 결합에 관여하는 것으로 알려져 있다. 또한, FUS가 전사 인자인 AP2, GCF, Sp1에 대한 인지 사이트 가지는 것으로 확인된 바 있다.
최근 루게릭병 환자나 전측두엽성 치매 환자에게서 FUS의 여러 돌연변이가 발견되었다고 보고된 바 있다.
이러한 돌연변이와 관련하여, 흥미롭게도 FUS돌연변이 단백질은 핵 내의 원래 위치에서 벗어나 핵 밖으로 빠져 나온 뒤 스트레스 과립(stress granule)에 위치하여 응집체를 이루는 것으로 보고되고 있다.
그러나, 루게릭병 환자나 전측두엽성 치매 환자에게서 발견되는 이들 FUS돌연변이 단백질의 비정상적인 위치와 응집체 축척과 관련된 메커니즘 연구는 거의 알려진 바 없으며, 이에 근거한 치료법에 대해서도 전무한 실정이다.
이에, 본 출원의 발명자들은 FUS돌연변이 단백질에 근거한 루게릭병 또는 전측두엽성 치매와 같은 퇴행성 신경계 질환의 메커니즘을 연구하던 중, FUS돌연변이 단백질과 비정상적으로 결합하는 단백질을 동정하였다.
더욱이, FUS돌연변이 단백질과 동정된 단백질의 결합을 억제하는 경우 스트레스 과립에 위치하는 FUS 응집체의 개수를 감소시킬 수 있음을 확인하였다.
이를 통해 퇴행성 신경계 질환의 핵심 기전을 설명할 수 있을 뿐 아니라, 이러한 기전을 근거로 신규 치료제 확립에 기초적인 단서를 마련해 줄 수 있을 것이다.
본 출원의 발명자들은 FUS돌연변이 단백질에 의한 루게릭병 또는 전측두엽성 치매와 같은 퇴행성 신경계 질환의 유발을 연구하던 중, FUS돌연변이 단백질과 PRMT1 단백질의 결합 저해 및 이에 의한 FUS 응집체 형성 감소 메커니즘을 통해 퇴행성 신경계 질환 예를 들어 루게릭병 또는 전측두엽성 치매의 치료제를 스크리닝할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 FUS (fused in sarcoma) 돌연변이와 PRMT1 (protein arginine methyltransferase 1) 단백질의 결합을 저해하여 FUS 응집체 형성을 감소시키는 퇴행성 신경계 질환 치료제를 스크리닝하는 방법으로,
(a) 세포에 FUS 돌연변이 단백질을 발현시키는 단계;
(b) 상기 세포에 산화스트레스 유발 물질 처리하는 단계;
(c) 상기 세포에 시험 물질을 접촉시키는 단계;
(d) 상기 시험 물질을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 FUS 돌연변이와 PRMT1 단백질의 결합 저해 및 FUS 응집체 형성을 감소시키는 물질을 퇴행성 신경계 질환 치료제로 선별하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 퇴행성 신경계 질환 치료제 스크리닝 방법을 통해 FUS 돌연변이와 PRMT1 단백질의 결합 저해 및 FUS 응집체 형성을 감소시키는 퇴행성 신경계 질환의 치료에 사용될 수 있는 후보 물질군을 스크리닝할 수 있다.
도 1은 HEK 293T세포에 Flag-FUS(야생형 또는 돌연변이)를 발현하고 Flag항체를 이용하여 면역침강법을 수행한 후, 은 염색한 결과를 나타낸다.
도 2는 PRMT1이 세포 내 환경에서 실질적으로 FUS 돌연변이와 결합하고 있는지 공면역침강법(co-immuoprecipitation)을 수행한 결과를 나타낸다.
도 3은 도 2의 면역침강법 결과를 정량화한 그래프이다.
도 4는 산화 스트레스 (Sodium arsenite)를 처리하거나 처리하지 않은 경우 FUS의 응집체 형성 및 세포 내 위치를 확인한 실험 결과를 나타낸다.
도 5는 도 4의 결과를 정량화한 그래프이다.
도 6은 FUS 야생형이 발현된 신경세포에서 PRMT1의 발현을 PRMT1 siRNA로 감소시킨 결과 및 그 결과를 정량화한 그래프이다.
도 7은 FUS 돌연변이가 발현된 신경세포에서 PRMT1의 발현을 PRMT1 siRNA로 감소시킨 결과 및 그 결과를 정량화한 그래프이다.
본 출원의 발명자들은 퇴행성 신경계 질환에서 FUS (fused in sarcoma) 돌연변이와 특이적으로 결합하는 PRMT1 (protein arginine methyltransferase 1) 단백질을 동정하고, FUS 돌연변이와 PRMT1 단백질의 결합을 저해하여 FUS 응집체 형성을 감소시킴으로써 퇴행성 신경계 질환을 치료할 수 있음을 밝혀내었으며, 이러한 메커니즘이 퇴행성 신경계 질환의 치료제를 스크리닝에 사용될 수 있음을 확인하였다.
본 발명은 FUS (fused in sarcoma) 돌연변이와 PRMT1 (protein arginine methyltransferase 1) 단백질의 결합을 저해하여 FUS 응집체 형성을 감소시키는 퇴행성 신경계 질환 치료제를 스크리닝하는 방법으로,
(a) 세포에 FUS 돌연변이 단백질을 발현시키는 단계;
(b) 상기 세포에 산화스트레스 유발 물질 처리하는 단계;
(c) 상기 세포에 시험 물질을 접촉시키는 단계;
(d) 상기 시험 물질을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 FUS 돌연변이와 PRMT1 단백질의 결합 저해 및 FUS 응집체 형성을 감소시키는 물질을 퇴행성 신경계 질환 치료제로 선별하는 단계를 포함한다.
상기 FUS 돌연변이는 루게릭병 환자나 전측두엽성 치매 환자에서 관련 증상을 유발하는 서열번호 1의 R521C 돌연변이 또는 서열번호 2의 P525L 돌연변이일 수 있다. FUS 돌연변이 중 R521C는 야생형의 521번째 아미노산인 R(Arginine)이 C(Cystein)으로 변이된 것이며, P525L은 야생형의 525번째 아미노산인 P(Proline)이 L(Leucine)으로 변이된 형태이다. 야생형의 경우, 핵에 주로 위치하고 있는데 반해, R521C는 핵밖쪽 세포질에도 분포하고 있으며 응집체를 형성하는 표현형을 보이고 P525L은 거의 대부분이 세포질에 위치하며 R521C와 마찬가지로 응집체를 형성한다.
또한, 본 출원의 발명자에 의해 FUS 돌연변이에 결합하는 것으로 동정된 상기 PRMT1 단백질은 서열번호 3의 아미노산 서열을 가진다.
상기 단계 (a)는 세포에서 FUS 돌연변이 단백질을 발현시키는 단계이다. FUS 돌연변이 단백질은 예를 들어 HEK293T 세포에 FUS 돌연변이 DNA 포함 벡터를 트랜스펙션(transfection)시키는 과정을 통해 발현될 수 있다.
이후, 상기 단계 (b) 세포에 산화스트레스 유발 물질 처리하는 단계를 진행한다. 상기 산화스트레스는 예를 들어, 세포 배양 중 나트륨 아르세나이트 약물(sodium arsenite drug)을 첨가하여 유발시킬 수 있다.
상기 단계 (c)는 세포에 시험 물질을 접촉시키는 단계이다. 시험 물질을 처리하여 세포 중 발현되는 FUS 돌연변이와 PRMT1 단백질의 결합 및 FUS 응집체 형성 변화 여부를 확인할 수 있는 상태라면 특별히 제한되지 않으며, 특정 성장 시점의 배양 신경세포에 시험 물질을 첨가하고 인큐베이션하는 단계일 수 있다.
상기 단계 (d)는 상기 시험 물질을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 FUS 돌연변이와 PRMT1 단백질의 결합 저해 및 FUS 응집체 형성을 감소시키는 물질을 퇴행성 신경계 질환 치료제로 선별하는 단계이다.
상기 FUS 돌연변이와 PRMT1 단백질의 결합 저해의 측정 방법은 제한없이 사용될 수 있으나 예를 들어, 면역침강법을 통해 은 염색(silver staining)한 결과를 확인하여 측정할 수 있다. 이후, 면역침강법 결과를 통상 당업자가 실시하는 방법을 통해 정량화(실시예 1 참조)하고 시험 물질을 처리하지 않은 대조군과 비교함으로써 FUS 돌연변이와 PRMT1 단백질의 결합 저해 정도를 측정할 수 있다.
상기 FUS 응집체 형성 감소의 측정은 제한없이 사용될 수 있으나 예를 들어, 면역세포화학법을 수행하여 응집체 개수를 확인하여 정량화함으로써 측정할 수 있다. 이후, 정량화 결과를 시험 물질을 처리하지 않은 대조군과 비교함으로써 FUS 응집체 형성 감소 정도를 측정할 수 있다.
위 측정 방법을 통한 결과 확인 후, 시험 물질이 시험 물질을 처리하지 않은 대조군에 비하여 FUS 돌연변이와 PRMT1 단백질의 결합 저해 및 FUS 응집체 형성을 감소시키는 경우 본 발명에 따른 스크리닝 방법에서 목적하는 퇴행성 신경계 질환 치료제로 선별할 수 있다.
본 발명의 퇴행성 신경계 질환은 신경세포의 손상으로 인하여 유발되는 것을 특징으로 하며, 신경세포 손상으로 인하여 유발되는 퇴행성 신경계 질환으로는 예를 들어, 전측두엽성 치매 또는 루게릭 질환이 포함될 수 있다.
실시예
이하 실시예 및 실험예를 들어 더욱 설명하나, 본 발명이 이들 실시예 및 실험예에 의해 제한되는 것은 아니다.
[실시예 1] FUS 돌연변이와 비정상적으로 결합하는 PRMT1 동정
트랜스펙션
HEK293T 세포(293 FT cells-life technology (CAT# 700-07))를 준비한 후, 대조군은 트랜스펙션되지 않은 상태이고 FLAG-FUS(WT), FLAG-FUS(R521C), FLAG-FUS(P525L) DNA 1ug씩을 칼슘 포스페이트(Clontech, #631312) 방법으로 트랜스펙션하였다.
37℃, 5% CO2 조건에서 22hr시간 동안 인큐베이션하였다. PBS 워싱 2회 진행 후, 50mM Tris pH 7.5, 150mM Nacl, 1% TX-100, 2mM EDTA, 1X 프로테아제 저해제 및 DW up to 50mL 조성의 용해 버퍼(이하, IP 용해 버퍼)를 이용하여 면역침강법(immunoprecipitation)을 진행하였다.
면역침강법
IP 용해 버퍼를 넣고 얼음 위에서 플레이트를 15분 인큐베이션 시킨 다음, 각각 1.5mL 튜브로 옮겨 균일화시킨 뒤 4℃, 13000rpm, 15분 동안 센트리퓨즈하였다. 프리-비드(Pre-bead)로 사용할 비드(bead)를 워싱하고, 2번의 센트리퓨즈가 끝이 나면 비드에 있는 상등액을 버리고 센트리퓨즈한 샘플의 상등액을 넣은 다음 콜드룸(cold room)에서 3시간 인큐베이션 하였다.
4℃, 13000rpm, 2~3분 센트리퓨즈한 후 새 1.5mL 튜브에 상등액을 옮겨 담고, 새로운 튜브를 준비하여 인풋(input)을 4% 덜어 둔 다음 (5xSDS 넣어 99℃ 로 끓인 뒤 냉동보관), 튜브에 플래그(flag)를 3ul 넣어 콜드룸에서 오버나이트로 인큐베이션 시켜주었다. 오버나이트 후, 비드를 새 튜브에 덜어 워싱 하였으며, 샘플을 비드에 넣고 콜드룸에서 7hr 인큐베이션 시켰다.
4℃, 2~3min 13,000rpm 센트리퓨즈를 한 후 상등액을 버리고, 용해 버퍼 800㎕를 넣고 콜드룸에서 30min 인큐베이션을 시켰으며 이 과정을 2회 반복하였다.
상등액을 버린 비드에 2x SDS 를 넣고 끓인 후 아이스 보관한 후 얻은 샘플을 SDS-PAGE 겔 로딩(100v 약 2hr) 하였다.
SDS PAGE 젤 로딩 후 익스포즈(expose)용은 트랜스퍼하고, 은 염색(silver staining)용은 바로 은 염색을 진행하였다.
Transfer - Expose
트랜스퍼(80v 2hr) 후 5% 스킴-밀크(skim-milk)에 인큐베이션한 다음, 1'Ab FLAG(1:50000), PRMT1(1:1000)을 붙인 후 오버나이트 하였다. TBST(Tris-Buffered Saline and Tween 20) 워싱 10min씩 3번 진행 후 2'Ab Mouse(1:20000), Rabbit(1:10000) 1hr 인큐베이션하고 TBST 워싱 10min씩 3번 진행 후 익스포즈 하였다.
Silver Staining
[표 1]
Figure pat00001

표 1과 같이 은 염색 용액을 제조한 후, 50 ml 겔 픽싱 용액 1을 넣고 전자레인지에서 30초 돌리고 10분 쉐이킹 후 제거한 다음 50 ml 겔 픽싱 용액 2를 넣고 전자레인지에서 30초 돌리고 10분 쉐이킹 후 제거하는 과정을 반복하였다. 50 ml 증류수를 넣은 후 20분 동안 충분히 세척하고, 50ml 센시타이징 용액을 1분 동안 쉐이킹 후 제거하였으며, 1분 동안 50 ml 증류수로 2회 세척하였다.
사용하기 전에 포름알데히드 27 ul 첨가하고, 50 ml 염색 용액을 20분 동안 쉐이킹 후 제거한 다음 50ml 증류수로 20초 동안 2회 워싱하였다. 50ml 중 25ml 현상 용액 (사용하기 전에 포름알데히드 13.5 ul) 을 넣고 발현시킨 후 제거하고 새로운 25ml 현상 용액을 넣고 쉐이킹하며 발현시켰다. 원하는 밴드가 나오면 현상 용액을 제거하고 정지 용액을 넣고 5분 동안 쉐이킹하였다.
그 실험 결과를 도 1 내지 도 3에 나타내었다.
도 1은 FUS(WT), R521C, P525L과 결합하는 단백질을 동정하기 위해서 Flag-FUS(야생형 또는 돌연변이)를 HEK 293T세포에 발현하고 Flag항체를 이용하여 면역침강법을 수행한 후, 은 염색한 결과이다. 도 1에 따르면, 별도 표시되어 있는 바와 같이 R521C단백질에 특이적으로 결합하는 밴드를 확인할 수 있었다.
밴드를 통해 확인된 단백질은 질량 분석기를 이용하여 단백질의 이중 질량 스펙트럼을 얻고, 단백질 서열 데이터베이스를 사용하여 각각의 질량 스펙트럼에 해당되는 펩타이드의 아미노산 서열을 예를 들어 SEQUEST® 또는 Mascot와 같은 소프트웨어를 사용하여 검색한 다음 그 결과를 통합 분석하여 단백질을 분석하였다. 질량분석법을 통해 분석한 결과 R521C에 나타난 밴드는 PRMT1임을 확인하였다.
도 2는 은 염색에서 FUS(R521)와 비정상적으로 많이 결합하고 있는 것으로 나온 PRMT1이 세포 내 환경에서 실질적으로 FUS(R521)와 결합하고 있는지 알아보기 위해서 공면역침강법(co-immuoprecipitation)을 수행한 결과를 나타낸 것이다. 도 2에 따르면, 면역침강법 결과 중 FUS(R521C)부분에서 PRMT1의 밴드가 강함을 확인할 수 있었다.
도 3은 도 2의 면역침강법 결과를 면역침강된 flag 밴드로 정규화(normalization)하여 정량화한 그래프이다. 도 3에서 볼 수 있듯이 야생형에 비해서 R521C와 결합하는 PRMT1의 양은 약 3배 정도가 증가함을 확인할 수 있었다.
[실시예 2] FUS 돌연변이 응집체 형성
트랜스펙션
배양한 프라이머리 세포에 리포펙타민을 이용하여 트랜스펙션하고 인큐베이션하였다. 1hr 20min 후 200~300ul media를 빼고, 새로운 유지 미디어(maintanance media)를 넣어 준 다음 1~2일 동안 인큐베이션하였다. 플레이트에 있는 미디어 500ul를 새 튜브에 덜은 후 새로운 미디어 500ul와 나트륨 아르세나이트(sodium arsenite drug) 0.5uM를 넣고 1hr 인큐베이션하였다. 리커버리 샘플(recovery sample)을 제외한 나머지는 고정(fixation)시켰다. PBS 워싱 후 4% PFA(paraformaldehyde)를 이용하여 10min분 동안 PBS 워싱 3회 진행하였다. 리커버리 샘플의 경우 PBS 워싱 후 3번에 덜어놓은 media 500ul와 새로운 유지 미디어 500ul를 섞어 넣어 준 후 20min 인큐베이션 뒤 고정하였다.
[면역세포화학법]
플레이트의 1xPBS를 석션하고, 0.1% Triton-X100 400ul를 넣은 다음 7-10min뒤 석션하였다. 1xPBS를 400㎕ 넣고 5min 뒤 석션한 후 2회 반복하였다. 3% BSA를 400㎕ 넣고 1시간 뒤 석션하였다. 1xPBS를 400㎕ 넣고 5min 뒤 석션 후 2회 반복하였으며, 1xPBS에 1차 항체를 희석한 다음 PBS를 석션 후 희석시킨 1차 항체 50㎕를 글라스 위에 살살 뿌려준 다음 1H 상온 인큐베이션 하였다. 1xPBS를 400㎕ 넣고 5min 뒤 석션한 후 2회 반복하였으며, 1x PBS에 2차 항체를 희석하였다. PBS를 석션 후 희석시킨 2차 항체 50㎕를 글라스 위에 살살 뿌려준 다음 1시간 동안 상온 인큐베이션 하였다. 1x PBS를 400㎕ 넣고 5min 뒤 석션한 후 2회 반복하였다. 봉입(mounting)을 진행하고, 각 샘플을 1/8로 나눈 다음 2칸 이상 카운팅하여 각 샘플 당 %를 구하였다.
그 결과를 도 4 및 도 5에 나타내었으며, 이들 결과는 배양된 신경세포에 FUS(WT), FUS(R521C)를 발현 시키고 나트륨 아르세나이트를 이용하여 산화 스트레스 (Sodium arsenite)를 처리(drug O)하거나 하지 않은(drug X) 경우 FUS의 응집체(aggregates) 형성 및 세포 내 위치를 확인한 실험 결과이다.
도 4를 참조하면, 신경세포에서 발현된 야생형은 주로 핵 안에 위치하고 있고, R521C는 핵에도 존재하지만 1-2개 정도 세포질에서 응집체(aggregates(inclusion))로 보이는 것을 확인할 수 있었다.
그러나, 산화 스트레스를 더 준 경우에는 R521C 돌연변이 단백질의 경우 R521C가 급격히 응집체를 생성시키며, 이러한 응집체는 스트레스 과립 마커 단백질인 PABP (poly(A)-binding protein)와 함께 발현(co-localization)됨을 확인하였다(data not shown). 따라서, 산화 스트레스에 의해 R521C 돌연변이 단백질이 FUS(WT)에 비해 급격히 스트레스 과립으로 재위치되고, 응집됨을 확인할 수 있다.
또한, 스트레스 상황에서 자주 볼 수 있는 스트레스 과립은 단백질 합성 등을 일시적으로 저해할 수 있는 구조로서, 스트레스 상황이 사라지만 그 구조도 사라진다고 알려져 있는데 회복 실험(산화 스트레스 후 스트레스 과립에서 FUS 양성 응집 여부)을 진행하여 본 결과, FUS의 야생형에서는 스트레스 과립의 위치가 원래의 위치로 돌아가고 스트레스 과립의 개수도 줄어드는 반면, R521C의 경우에는 산화 스트레스에 의해서 유도되었던 스트레스 과립과 FUS의 응집 (스트레스 과립 중 응집)이 그대로 세포질 내에 축척되어 있는 현상을 확인할 수 있다.
따라서, R521C의 돌연변이에서는 스트레스시 스트레스 과립으로의 이동이 증가할 뿐 아니라 스트레스 과립에서의 위치 회복(핵으로 재위치 되어야 함)에도 문제가 있음을 발견하였다.
도 5는 도 4의 결과를 정량화한 그래프로, 스트레스 과립 중 FUS 양성 응집체를 보이는 신경세포의 개수를 측정하였다. 도 5를 참조하면, 야생형에 비해 R521C 돌연변이 단백질에서 형성된 응집체의 수가 현저히 많음을 확인할 수 있다.
[실시예 3] FUS 돌연변이와 PRMT1 결합에 의한 응집체 형성
pSUPER.neo-GFP vector (Oligoengine) 를 사용하여 shRNA(short hairpin RNA)를 제작하였다. ShPRMT1 세 종류를 만든 후 세가지 중 내인성 PRMT1 레벨(endogenous PRMT1 level)이 가장 낮게 나타나는 하기 서열번호 4의 센스(sense) 및 서열번호 5의 안티센스(anti-sense) 프라이머를 사용하여 실험을 진행하였다. 아래 서열 중 밑줄 표시 부분이 타겟하는 PRMT1의 서열이다.
[서열번호 4] PRMT1 마우스 센스
5'- GATCCCC GATTGTCAAAGCCAACAAG TTCAAGAGA CTTGTTGGCTTTGACAATC TTTTTA-3'
[서열번호 5] PRMT1 마우스 안티센스
5'- AGCTTAAAAA GATTGTCAAAGCCAACAAG TCTCTTGAA CTTGTTGGCTTTGACAATC GGG-3'
3일차 분화된 신경세포에 대조군으로 PSUPER(shRNA 제작 VECTOR) + FUS야생형, PSUPER+R521C, shPRMT1+FUS야생형, shPRMT1+R521C를 각각 리포펙타민(lipofectamine) 2000(Invitrogen, USA)과 OptiMEM(Gibco)를 이용하여 트랜스펙션하였다. 고정 후 내인성 FUS 항체를 이용하여 면역세포화학법 진행 후 내인성 FUS의 레벨이 감소하였는지 확인하였다.
그 결과를 도 6 및 도 7에 나타내었다.
이들 결과는 FUS(R521C)와 PRMT1의 비정상적인 결합이 산화 스트레스에 의해서 유도되는 스트레스 과립의 형성 및 역학(dynamics)에 미치는 영향을 연구하기 위해서 배양된 신경세포에 PRMT1의 발현을 PRMT1 siRNA로 감소시킨 결과이다.
도 6 및 도 7을 참조하면, PRMT1가 결여되면 야생형에서는 세포 내로의 재위치가 증가하였고, R521C 경우에는 R521C 양성 스트레스 과립의 개수가 감소함을 확인할 수 있다.
따라서, PRMT1은 산화적 스트레스 상황에서 FUS가 핵 밖으로 나가는 것을 억제하고 있는 반면, FUS(R521C)는 돌연변이에 의해서 PRMT1이 같이 결합해서 나가므로 PRMT1이 없는 경우에는 FUS 양성 스트레스 과립의 축척이 감소하는 것을 확인할 수 있다.
이러한 결과는 정량화한 그래프에서도 확인할 수 있었다. 스트레스 과립 중 FUS 양성 응집체를 보이는 신경세포의 개수를 측정한 결과, 야생형에 비해 R521C 돌연변이 단백질에서 형성된 응집체의 수가 현저히 많음을 확인할 수 있다.
<110> LEE, Jin-A RHU, hyun-hee <120> A Method for Screening an Agent for Treating a Neuro-Degenerative Disease <130> p130938 <160> 5 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 526 <212> PRT <213> human <400> 1 Met Ala Ser Asn Asp Tyr Thr Gln Gln Ala Thr Gln Ser Tyr Gly Ala 1 5 10 15 Tyr Pro Thr Gln Pro Gly Gln Gly Tyr Ser Gln Gln Ser Ser Gln Pro 20 25 30 Tyr Gly Gln Gln Ser Tyr Ser Gly Tyr Ser Gln Ser Thr Asp Thr Ser 35 40 45 Gly Tyr Gly Gln Ser Ser Tyr Ser Ser Tyr Gly Gln Ser Gln Asn Thr 50 55 60 Gly Tyr Gly Thr Gln Ser Thr Pro Gln Gly Tyr Gly Ser Thr Gly Gly 65 70 75 80 Tyr Gly Ser Ser Gln Ser Ser Gln Ser Ser Tyr Gly Gln Gln Ser Ser 85 90 95 Tyr Pro Gly Tyr Gly Gln Gln Pro Ala Pro Ser Ser Thr Ser Gly Ser 100 105 110 Tyr Gly Ser Ser Ser Gln Ser Ser Ser Tyr Gly Gln Pro Gln Ser Gly 115 120 125 Ser Tyr Ser Gln Gln Pro Ser Tyr Gly Gly Gln Gln Gln Ser Tyr Gly 130 135 140 Gln Gln Gln Ser Tyr Asn Pro Pro Gln Gly Tyr Gly Gln Gln Asn Gln 145 150 155 160 Tyr Asn Ser Ser Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Asn 165 170 175 Tyr Gly Gln Asp Gln Ser Ser Met Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly 180 185 190 Gly Tyr Gly Asn Gln Asp Gln Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Tyr 195 200 205 Gly Gln Gln Asp Arg Gly Gly Arg Gly Arg Gly Gly Ser Gly Gly Gly 210 215 220 Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Tyr Asn Arg Ser Ser Gly Gly Tyr Glu 225 230 235 240 Pro Arg Gly Arg Gly Gly Gly Arg Gly Gly Arg Gly Gly Met Gly Gly 245 250 255 Ser Asp Arg Gly Gly Phe Asn Lys Phe Gly Gly Pro Arg Asp Gln Gly 260 265 270 Ser Arg His Asp Ser Glu Gln Asp Asn Ser Asp Asn Asn Thr Ile Phe 275 280 285 Val Gln Gly Leu Gly Glu Asn Val Thr Ile Glu Ser Val Ala Asp Tyr 290 295 300 Phe Lys Gln Ile Gly Ile Ile Lys Thr Asn Lys Lys Thr Gly Gln Pro 305 310 315 320 Met Ile Asn Leu Tyr Thr Asp Arg Glu Thr Gly Lys Leu Lys Gly Glu 325 330 335 Ala Thr Val Ser Phe Asp Asp Pro Pro Ser Ala Lys Ala Ala Ile Asp 340 345 350 Trp Phe Asp Gly Lys Glu Phe Ser Gly Asn Pro Ile Lys Val Ser Phe 355 360 365 Ala Thr Arg Arg Ala Asp Phe Asn Arg Gly Gly Gly Asn Gly Arg Gly 370 375 380 Gly Arg Gly Arg Gly Gly Pro Met Gly Arg Gly Gly Tyr Gly Gly Gly 385 390 395 400 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Arg Gly Gly Phe Pro Ser Gly Gly Gly Gly 405 410 415 Gly Gly Gly Gln Gln Arg Ala Gly Asp Trp Lys Cys Pro Asn Pro Thr 420 425 430 Cys Glu Asn Met Asn Phe Ser Trp Arg Asn Glu Cys Asn Gln Cys Lys 435 440 445 Ala Pro Lys Pro Asp Gly Pro Gly Gly Gly Pro Gly Gly Ser His Met 450 455 460 Gly Gly Asn Tyr Gly Asp Asp Arg Arg Gly Gly Arg Gly Gly Tyr Asp 465 470 475 480 Arg Gly Gly Tyr Arg Gly Arg Gly Gly Asp Arg Gly Gly Phe Arg Gly 485 490 495 Gly Arg Gly Gly Gly Asp Arg Gly Gly Phe Gly Pro Gly Lys Met Asp 500 505 510 Ser Arg Gly Glu His Arg Gln Asp Cys Arg Glu Arg Pro Tyr 515 520 525 <210> 2 <211> 526 <212> PRT <213> human <400> 2 Met Ala Ser Asn Asp Tyr Thr Gln Gln Ala Thr Gln Ser Tyr Gly Ala 1 5 10 15 Tyr Pro Thr Gln Pro Gly Gln Gly Tyr Ser Gln Gln Ser Ser Gln Pro 20 25 30 Tyr Gly Gln Gln Ser Tyr Ser Gly Tyr Ser Gln Ser Thr Asp Thr Ser 35 40 45 Gly Tyr Gly Gln Ser Ser 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Val Glu Leu Pro Val Glu Lys Val Asp Ile Ile Ile 145 150 155 160 Ser Glu Trp Met Gly Tyr Cys Leu Phe Tyr Glu Ser Met Leu Asn Thr 165 170 175 Val Leu Tyr Ala Arg Asp Lys Trp Leu Ala Pro Asp Gly Leu Ile Phe 180 185 190 Pro Asp Arg Ala Thr Leu Tyr Val Thr Ala Ile Glu Asp Arg Gln Tyr 195 200 205 Lys Asp Tyr Lys Ile His Trp Trp Glu Asn Val Tyr Gly Phe Asp Met 210 215 220 Ser Cys Ile Lys Asp Val Ala Ile Lys Glu Pro Leu Val Asp Val Val 225 230 235 240 Asp Pro Lys Gln Leu Val Thr Asn Ala Cys Leu Ile Lys Glu Val Asp 245 250 255 Ile Tyr Thr Val Lys Val Glu Asp Leu Thr Phe Thr Ser Pro Phe Cys 260 265 270 Leu Gln Val Lys Arg Asn Asp Tyr Val His Ala Leu Val Ala Tyr Phe 275 280 285 Asn Ile Glu Phe Thr Arg Cys His Lys Arg Thr Gly Phe Ser Thr Ser 290 295 300 Pro Glu Ser Pro Tyr Thr His Trp Lys Gln Thr Val Phe Tyr Met Glu 305 310 315 320 Asp Tyr Leu Thr Val Lys Thr Gly Glu Glu Ile Phe Gly Thr Ile Gly 325 330 335 Met Arg Pro Asn Ala Lys Asn Asn Arg Asp Leu Asp Phe Thr Ile Asp 340 345 350 Leu Asp Phe Lys 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Claims (5)

  1. FUS (fused in sarcoma) 돌연변이와 PRMT1 (protein arginine methyltransferase 1) 단백질의 결합을 저해하여 FUS 응집체 형성을 감소시키는 퇴행성 신경계 질환 치료제를 스크리닝하는 방법으로,
    (a) 세포에 FUS 돌연변이 단백질을 발현시키는 단계;
    (b) 상기 세포에 산화스트레스 유발 물질 처리하는 단계;
    (c) 상기 세포에 시험 물질을 접촉시키는 단계;
    (d) 상기 시험 물질을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 FUS 돌연변이와 PRMT1 단백질의 결합 저해 및 FUS 응집체 형성을 감소시키는 물질을 퇴행성 신경계 질환 치료제로 선별하는 단계를 포함하는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 FUS 돌연변이는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 PRMT1 단백질은 서열번호 3의 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 단계 (d)의 FUS 돌연변이와 PRMT1 단백질의 결합 저해 및 FUS 응집체 형성 감소는 면역침강법 (immunoprecipitation) 또는 면역세포화학법 (immunocytochemistry)으로 측정하는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기 퇴행성 신경계 질환은 전측두엽성 치매 또는 루게릭 질환인 것을 특징으로 하는 방법.
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WO2023171587A1 (ja) * 2022-03-08 2023-09-14 大原薬品工業株式会社 変異ＦＵＳの発現を選択的に抑制する修飾ｓｉＲＮＡ

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