KR20220048340A - Prmt1 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자를 포함하는 신경 근육 질환의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents
Prmt1 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자를 포함하는 신경 근육 질환의 예방 또는 치료용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 PRMT1(Protein arginine methyltransferase 1) 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자를 이용하여, 운동 신경, 특히 신경근 접합부에서 산화 스트레스 등에 의한 운동 신경 손상에 의해 유발되는 신경 근육 질환의 예방 또는 치료 용도 및 상기 PRMT1의 발현을 활성화하는 후보 물질을 스크리닝 하기 위한 방법에 대한 것이다. 운동 신경 또는 신경근 접합부에서 Prmt1이 결손된 경우, 노화에 의한 퇴행성 운동 신경의 손상 악화, 산화 스트레스 및 염증에 의한 DNA 손상이 유발되어 신경 근육 질환이 유발될 수 있으므로, 상기 PRMT1 단백질 및 이를 암호화하는 유전자의 과발현 및 활성을 통해 상기 질환의 치료를 가능하게 할 수 있다.
Description
본 발명은 운동 신경 및 신경 근육 접합부에서 발현하는 PRMT1 단백질 및 이를 암호화하는 유전자의 신경 근육 질환의 예방 또는 치료 용도에 대한 것이다.
신경 근육 질환이란, 말초신경과 근육에 생기는 질병으로, 말초신경이란 중추신경계에서 갈라져 나와 근육이나 피부 등 멀리 떨어진 말단 장기를 중추신경계와 연결 시켜주는 신경 그물망을 의미하며 중추신경계에서 결정된 명령을 근육 등 말단 장기에 전달하거나 통각 등의 감각 정보를 중추신경계로 전달하는 역할을 한다.
말초신경계 질환은 말초신경 자체의 질병, 말초신경과 인접해 있는 주위 조직의 질병에 의해 말초신경이 손상되어 생기는 말초신경의 기능장애, 말초신경이 근육과 연결되는 신경근 접합부, 근육 자체에 생긴 질환을 포함한다. 말초신경계 질환의 대표적인 임상 증상은 마비나 근육의 힘이 줄어드는 운동 신경증상, 손 혹은 발끝이 저리거나 감각이 무뎌지는 현상, 통증 등이 있다.
상기와 같은 말초 신경계의 이상으로 인하여 유발되는 운동 신경 질환은 근력은 정상이나, 이의 활동을 통제하는 운동 신경이 퇴행적 진행을 일으켜 손상된 신경학적 질환을 의미하는 것으로, 유전적 요인, 환경적 요인, 독극물 중독, 바이러스 감염, 다른 질환의 합병증, 노화 등 다양한 원인에 의해 발생된다. 운동 신경 질환은 근력 조절 장애로 인한 원치 않는 운동이나, 원하는 운동을 할 수 없는 경우를 말한다. 예를 들어 팔다리의 움직임이 둔화되며, 발음, 삼킴, 호흡 등이 점차적으로 약해져 사망에 이를 수 있는 대표적인 운동 신경 질환으로 루게릭병(ALS)이 알려져 있으며, 발병하면 증상의 진행이 빨라 4-5년 이내 호흡근육 마비로 인한 호흡부전 및 기타 합병증으로 인하여 사망에 이르기도 한다. 그러나 운동 신경 질환에 대한 근본적인 치료 방법은 현재 개발되어 있지 않은 실정이며, 약물이나 재활치료 등을 통하여 증상의 완화 또는 고통 경감 등의 보존적 조치만이 취해지고 있을 뿐이다.
또한, 인구의 고령화에 따라 특히 노화에 의한 퇴행성 운동 신경 질환의 유병률이 높아지고 있으며, 이는 인간의 삶의 질에 큰 영향을 줄 수 있으므로, 근본적인 원인과 치료 방법에 대한 연구가 요구되고 있는 실정이다.
PRMT1(protein arginine N-methyltransferase 1)은 단백질 아르기닌 메틸화 효소의 하나이며, 최근에 다양한 기능에 대한 연구가 진행되고 있으나, 아직까지 운동 신경 또는 신경 근육 접합부에서의 기작에 대하여 알려진 바가 없다.
이에, 본 발명자들은 운동 신경 세포 손상과 연관성이 있는 다양한 단백질 및 유전자를 연구하던 중, 운동신경 및 신경근 접합부에서 발현하는 PRMT1(Protein arginine methyltransferase 1) 유전자에 대한 연구를 진행하여, 상기 유전자의 조절을 통해 다양한 원인에 의해 유발된 세포 스트레스로 인한 운동 신경 세포 손상을 방지하고, 이로 인해 유발되는 질병에 대한 치료 및 완화 효과를 달성할 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 PRMT1 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자를 포함하는, 운동 신경 세포 보호용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 PRMT1 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자를 포함하는, 신경 근육 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, PRMT1의 발현 여부와 관련하여 신경 근육 질환의 예방, 개선 또는 치료 물질을 스크리닝하는 방법을 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 PRMT1 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자를 포함하는 운동 신경 세포 보호용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해서 본 발명은, PRMT1 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자를 포함하는, 신경 근육 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 양태로서, 본 발명의 조성물은 운동 신경에 대한 보호 및 신경 근육 질환에 대한 예방, 개선 또는 치료 효과를 가지므로, 의약품, 건강기능식품, 기능성 식품, 동물용 사료, 세포 배양액 조성물 등 다양한 용도로 활용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 ⅰ) in vitro 상에서 운동 신경 세포에 후보 물질을 처리하는 단계; ⅱ) 상기 후보 물질을 처리한 운동 신경 세포에서 Prmt1의 발현 또는 활성을 측정하는 단계; 및 ⅲ)미처리군과 비교하여 Prmt1의 발현 또는 활성을 증진시키는 후보 물질들을 신경 근육 질환 치료제 후보 물질로 선정하는 단계를 포함하는, 신경 근육 질환의 치료 물질을 스크리닝 하는 방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 PRMT1 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자를 포함하는 운동 신경 세포 보호용 조성물에 대한 것이다. 상기 본 발명의 운동 신경 세포 보호는, 특히 노화로 인한 운동 신경의 퇴행성 손상으로부터 이를 보호하는 것을 포함하며, 이에 제한되는 것은 아니나, 생존율 향상, 체중 유지, 행동능력 유지, 손상된 신경 복구, DNA 손상 복구, 세포 스트레스로부터 신경세포를 보호하는 것으로, 노화 등 다양한 요인에 의하여 운동 신경 세포에서 발생될 수 있는 다양한 스트레스를 완화하고 경감시키는 것을 의미한다.
본 발명의 일 양태로서, 상기 운동 신경 세포의 보호는 노화, 산화스트레스, 염증성 스트레스로부터 운동 신경 세포의 손상, 이로 인한 근육 위축 및 섬유화를 방지하고, 운동 신경세포의 스트레스 민감성을 감소시키는 것이며, 손상된 운동 신경세포의 재 신경화를 촉진하는 것을 포함한다.
또한 본 발명은 PRMT1 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자를 포함하는, 신경 근육 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 대한 것이다.
신경 근육 질환은 말초 신경계의 이상으로 인하여 유발되는 운동 신경 질환은 근육 운동을 통제하는 운동 신경이 퇴행적 진행을 일으켜 손상된 신경학적 질환으로, 근이영양증, 운동 신경 질환, 근병증, 신경근 접합부 질환 등이 포함된다. 또한, 이에 제한되는 것은 아니나, 상기 신경 근육질환은 신경근접합부 및 근육의 질환으로 분류(질병분류기호 상 G70-G73)되는 질환으로서, 중증근무력증, 근신경장애, 근디스트로피, 근긴장장애, 근병증, 근육의 원발성 장애, 근무력증후군, 람베르트-이튼 증후군 등이 포함된다. 또한, 상기 운동 신경 질환은 근위축성 측삭경화증(amyotrophic lateral sclerosis, ALS), 척수성 진행성 근위축(infantile progressive spinal muscular atrophy, SMA), 진행성 핵상마비(progressive bulbar palsy), 가연수성마비(pseudobulbar palsy), 진행성 근육위축(progressive muscular atrophy, PMA), 진행성 축삭경화증(progressive lateral sclerosis, PLS), 단일 사지 근위축증(monomelic amyotrophy, MMA) 또는 헌팅턴 병 등이 포함되며, 기타 운동 신경원 질환을 포함한다.
본 발명의 일 양태로서, 본 발명의 조성물은 의약품, 건강기능식품, 기능성 식품, 동물용 사료, 세포 배양액 조성물 등 다양한 용도로 활용될 수 있으며, 운동 신경 세포의 손상을 방지하여 상기 신경 근육 질환에 대한 예방, 개선 또는 치료 효과를 가진다.
본 명세서에서 용어 "예방"은 본 발명에 따른 상기 약학적 조성물의 투여에 의해 신경 근육 질환을 억제시키거나 발병을 지연시킬 수 있는 모든 행위를 의미한다.
본 명세서에서 용어 "치료"는 본 발명에 따른 상기 약학적 조성물의 투여에 의해 증세가 호전되거나 이롭게 되는 모든 행위를 말한다.
본 발명의 상기 약학적 조성물은 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 상기 제형화에 필요한 담체 혹은 부형제 등을 추가로 포함할 수 있다. 상기 유효 성분에 추가로 포함될 수 있는 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등이 포함된다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.
예를 들어, 경구 투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물 또는 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 적어도 면, 전분, 칼슘카보네이트 (calcium carbonate), 수크로스 (sucrose) 또는 락토오스 (lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구 투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 또는 비경구 투여(정맥주사, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)될 수 있으며, 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도 및 약물 형태, 투여 경로 및 시간에 따라 다르며, 당업자에 의해 적절한 형태로 선택될 수 있다.
본 발명의 상기 약학적 조성물은, 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에서 "약학적으로 유효한 양"이란 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 양으로, 질병을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 그 기준은 환자의 질환, 중증도, 약물 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 병용되는 성분 및 기타 사항에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 상기 약학적 조성물은, 개별 치료제 혹은 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 상기 요소들을 모두 고려하여 부작용을 최소화할 수 있는 수준으로 투여량을 결정할 수 있고, 이는 당업자에 의해 용이한 수준으로 결정될 수 있다. 구체적으로 상기 약학적 조성물의 투여량은 환자의 연령, 체중, 중증도, 성별 등에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로 체중 1kg 당 0.001 내지 150 mg, 보다 바람직하게는 0.01 내지 100mg 의 양을 매일 또는 격일, 1일 1 내지 3회 투여할 수 있다. 다만, 이는 예시적인 것으로, 상기 투여량은 필요에 달리 설정할 수 있다.
또한 본 발명의 상기 조성물은 식품 또는 건강기능식품일 수 있으며, 특히 상기 "건강기능식품"은 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 의미하며, "기능성"이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다.
본 발명의 상기 식품 또는 건강기능식품은, 운동 신경 질환의 예방 및 개선을 위한 목적으로 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 환제, 현탁액, 에멀젼, 시럽 등 약학적 투여 형태 또는 티백, 침출자, 음료, 캔디, 젤리, 껌 등의 건강 기능식품으로 제조 및 가공이 가능하다.
본 발명의 상기 식품 또는 건강기능식품 조성물은, 식품 첨가물로 사용될 수 있으며, 단독으로 혹은 다른 성분과 조합하여 제품화될 수 있다. 또한, 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제 및 증진제, 펙트산 및 이의 염, 알긴산 및 이의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등이 포함될 수 있다. 상기 성분은 단독 혹은 조합하여 사용될 수 있으며, 적절한 함량으로 조합되어 사용할 수 있다.
또한 본 발명은, ⅰ) in vitro 상에서 운동 신경 세포에 후보 물질을 처리하는 단계; ⅱ) 상기 후보 물질을 처리한 운동 신경 세포에서 Prmt1의 발현 또는 활성을 측정하는 단계; 및 ⅲ)미처리군과 비교하여 Prmt1의 발현 또는 활성을 증진시키는 후보 물질들을 운동 신경 질환 치료제 후보 물질로 선정하는 단계를 포함하는, 운동 신경 질환의 치료 물질을 스크리닝 하는 방법을 제공한다.
본 발명에서 상기 PRMT1의 발현 또는 활성을 측정하는 단계는 PRMT1 유전자의 발현에 의해 생성된 RNA 또는 단백질의 양을 측정할 수 있는 다양한 방법을 통해 실시될 수 있다. 바람직하게, RNA의 발현량은 RT-PCR(실시간 PCR), 마이크로 어레이, 노던 블롯팅 등을 이용하여 확인하였으며, 단백질의 활성 및 발현은 면역 침강, 면역염색, 크로마틴 면역염색, 효소면역분석(ELISA), 웨스턴 블롯팅 등의 방법으로 확인할 수 있으며, 그 방법에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 조성물은 PRMT1 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자를 포함하며, 상기 PRMT1 단백질은 운동 신경 세포의 손상 방지와 관련된 중요한 역할을 담당하고 있는 인자로서, 다양한 요인에 의한 스트레스로부터 운동 신경의 손상 방지, 상기 운동 신경 손상 및 퇴행성 요인에 의한 운동 신경 질환 등에 대한 예방, 개선 및 치료 효과를 가진다.
도 1은 운동 신경 특이적 Prmt1 결핍 마우스(Prmt1 mnKO )에 있어, 노화 기반 생존율을 관찰한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 Prmt1 mnKO 마우스의 노화에 의한 체중 감소를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 Prmt1 mnKO 마우스에서, 노화에 의한 행동 능력 변화를 관찰하기 위하여 뒷다리 움켜쥠(limp clasping) 증상을 확인한 결과이다.
도 4는 Open field test에서 Prmt1 mnKO 마우스의 움직인 거리와 속도를 대조군과 비교한 결과이다.
도 5는 Rotarod test에서 Prmt1 mnKO 마우스가 버티는 시간을 대조군과 비교한 결과이다.
도 6은 Prmt1 mnKO 마우스의 운동 신경 손상 후 뒷다리 근육 무게가 회복되는 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 Prmt1 mnKO 마우스의 TA 근육에서 근섬유 크기가 현저히 감소된 것을 확인한 결과이다.
도 8은 Prmt1 mnKO 마우스의 근육 섬유화 정도를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 Prmt1 mnKO 마우스의 신경 재생 및 근위축 마커의 발현 정도를 대조군과 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 Prmt1 mnKO 마우스에서 축색 돌기의 재신경화 정도를 대조군과 비교하여 확인한 결과이다.
도 11은 Prmt1 mnKO 마우스의 스트레스 관련 민감성 증가 여부를 DNA 손상 마커의 발현을 통해 확인한 결과이다.
도 12는 PRMT1 단백질 발현을 억제시킨 운동신경 세포주(NSC34)에서 스트레스 관련 단백질의 발현량 증가를 웨스턴 블럿 분석을 통하여 확인한 결과이다.
도 13은 PRMT1 단백질 발현을 억제시킨 운동신경 세포주(NSC34)에서 ROS 검출이 증가되었음을 DHR123 staining으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 14는 PRMT1 단백질 발현을 억제시킨 운동신경 세포주(NSC34)에서 DNA 손상 관련 유전자(γ-H2AX)의 발현이 증가된 결과를 확인한 것이다.
도 15는 PRMT1 단백질을 과발현 시킨 운동신경 세포주(NSC34)에서, TNFα 처리로 유발된 세포 스트레스에 의한 신경 세포 보호 효과를 산화스트레스 마커 및 염증성 마커의 감소를 통해 확인한 결과이다.
도 2는 Prmt1 mnKO 마우스의 노화에 의한 체중 감소를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 Prmt1 mnKO 마우스에서, 노화에 의한 행동 능력 변화를 관찰하기 위하여 뒷다리 움켜쥠(limp clasping) 증상을 확인한 결과이다.
도 4는 Open field test에서 Prmt1 mnKO 마우스의 움직인 거리와 속도를 대조군과 비교한 결과이다.
도 5는 Rotarod test에서 Prmt1 mnKO 마우스가 버티는 시간을 대조군과 비교한 결과이다.
도 6은 Prmt1 mnKO 마우스의 운동 신경 손상 후 뒷다리 근육 무게가 회복되는 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 Prmt1 mnKO 마우스의 TA 근육에서 근섬유 크기가 현저히 감소된 것을 확인한 결과이다.
도 8은 Prmt1 mnKO 마우스의 근육 섬유화 정도를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 Prmt1 mnKO 마우스의 신경 재생 및 근위축 마커의 발현 정도를 대조군과 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 Prmt1 mnKO 마우스에서 축색 돌기의 재신경화 정도를 대조군과 비교하여 확인한 결과이다.
도 11은 Prmt1 mnKO 마우스의 스트레스 관련 민감성 증가 여부를 DNA 손상 마커의 발현을 통해 확인한 결과이다.
도 12는 PRMT1 단백질 발현을 억제시킨 운동신경 세포주(NSC34)에서 스트레스 관련 단백질의 발현량 증가를 웨스턴 블럿 분석을 통하여 확인한 결과이다.
도 13은 PRMT1 단백질 발현을 억제시킨 운동신경 세포주(NSC34)에서 ROS 검출이 증가되었음을 DHR123 staining으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 14는 PRMT1 단백질 발현을 억제시킨 운동신경 세포주(NSC34)에서 DNA 손상 관련 유전자(γ-H2AX)의 발현이 증가된 결과를 확인한 것이다.
도 15는 PRMT1 단백질을 과발현 시킨 운동신경 세포주(NSC34)에서, TNFα 처리로 유발된 세포 스트레스에 의한 신경 세포 보호 효과를 산화스트레스 마커 및 염증성 마커의 감소를 통해 확인한 결과이다.
이하, 본 명세서를 구체적으로 설명하기 위해 실시예를 들어 상세히 설명한다. 그러나, 본 명세서에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 명세서의 범위가 아래에서 상술하는 실시예들에 한정되는 것으로 해석되지는 않는다. 본 명세서의 실시예들은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 명세서를 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
실시예 1. 재료 및 실험 방법
1-1)
실험 모델 제작
실험동물 사육실은 일정한 조건 (온도 22±2 ℃ 습도 55±5%)을 유지하였다. 1일 12시간의 광주기와 12시간의 암주기를 적응하였다.
Prmt1-floxed 대립 유전자(EUCOMM에서 입수한 Prmt1 f/f )를 보유한 마우스를 Hb9 프로모터 (Jackson Laboratory에서 제공하는 Hb9-Cre)의 제어 하에 Cre를 발현하는 형질 전환 마우스와 교배시켰다. 좌골 신경 탈 신경화 수술의 경우, 동물을 4% 이소플루란으로 마취 유도한 다음 37℃로 가열된 표면에서 2% 이소플루란을 지속적으로 흡입하여 유지했다. 피부는 왼쪽 대퇴골과 평행하게 뒤쪽으로 절개되었다. 좌골 신경은 허벅지 중간 부분에 노출 된 후 집게를 사용하여 10 초 동안 손상되었다. 탈 신경화 후, 신경을 원래 자리로 재배치하고 근육을 외과용 용해 가능한 봉합사로 닫고 피부 절개를 봉합 테이프로 봉합했다. Carprofen (5mg/kg)은 수술 후 통증 조절을 위해 피하로 투여되었다.
1-2)
행동분석
PRMT1 f/f 와 PRMT1 hb9cre 마우스의 행동 차이를 분석하기 위해 Open field 및 로타로드(Rota-rod) 테스트를 수행하였다.
Open field 테스트는 개방형 플라스틱 용기 (30x30x30 cm)에서 수행되었다. 각 실험이 시작될 때 마우스를 플라스틱 용기의 모서리에 놓고 20 분 동안 움직임을 기록했다. Noldus EthoVision 13.0 추적 소프트웨어를 통해 이동 거리와 속도를 분석하였다. 로타로드 장치 (모델 7600, Ugo Basile)를 사용하여 운동 조정 및 균형을 측정하였다. 고정 속도 로타로드 테스트(17rpm)를 위해, 마우스는 실제 실험 전에 3일 동안 세 번의 연습을 받은 다음 회전하는 실린더에 배치되었다. 세션 당 200 초 컷-오프가 사용되었다. 가속 로타로드 테스트 (300 초 동안 4-40rpm)를 위해 마우스는 실제 실험 전에 3일 동안 세 번의 연습 시험을 받았다. 상기 두 실험 모두 로타로드에서 떨어지는 시간을 기록하였다.
1-3)
세포 배양 및 형질감염
NSC34 세포는 DMEM media를 기반으로 10%의 FBS, 1%의 GlutaMAX, 10 units/mL 페니실린, 10μg/mL 스트렙토마이신의 조성에서 배양하였다. NSC 34 세포에 Mirus transfection reagent를 사용, pcDNA, PRMT1-HA 플라스미드를 형질감염 시켰다.
NSC 34 cell에 PRMT1 발현을 결손 시키기 위하여 Adenoviral pLKO. 1-puro, PRMT1-shRNA를 cell에 형질감염 시켰다.
1-4)
단백질 및 RNA 분석
세포 수확 후, 세포에 Lysis buffer(20mM Tris-HCl, pH8, 150mM NaCl, 1% Triton X, Proteinase Inhibitor)를 첨가하여 30분간 용해한 뒤, 13000rmp에서 30분간 원심 분리 후, 세포 용해 샘플을 정량 하여, 동일양의 단백질을 SDS-PAGE 전기영동을 하고 PVDF membrane으로 옮겼다. 해당하는 1차 항체 및 2차 항체 반응 후 ECL reagent를 이용하여, X-ray 필름에 노출시켜 단백질 발현량을 확인하였다.
NSC34 세포 및 근육 조직은 FastPrepR-24 (MP Biomedicals)로 균질화 하였고, easy-spin Total RNA Extraction Kit (iNtRON Biotechnology)를 사용하여 RNA를 추출하였다. 유전자 발현의 배수 변화는 리보솜 유전자 L32의 발현에 대비하여 정규화되었다.
1-5)
조직학 및 면역 형광 분석
실험에 사용된 조직은 전경골근 및 장지신근(Tibialis anterior, extensor digitorum longus muscle)을 사용하였으며, 전경골근은 분리 즉시 액화질소를 이용하여 OCT compound로 동결 고정을 한 후, -80
의 초저온 냉동고에 보관하였다. 조직 절편은 영하 20도로 유지되는 동결 절편기을 이용하여 7um의 두께로 절단하였고, Sirius Red 염색 후 섬유화 정도를 관찰하였다.
상기 동물 조직에서 분리한 전경골근을 사용하여 면역조직화학염색을 실시하였다. -80
의 초저온 냉동고에 보관된 동결절편을 1xPBS에 2번 세척하였다. 4% 파라포름알데하이드 (paraformaldehyde)을 사용하여 15분간 상온에서 고정을 시키고, 1xPBS에 2번 세척하였다. 조직과 투과용 버퍼 (0.5% Triton-X / PBS) 를 5분간 상온에서 반응시키고 1xPBS에 2번 세척하였다. 조직과 TE buffer를 사용하여 100
에서 10분간 반응시켜 항원성부활(Antigen retrieval)을 하고, 1xPBS에 2번 세척하였다. Blocking buffer (5% Goat serum, 0.1% Triton-X)로 1시간 동안 blocking을 한 후에 일차항체(Laminin)을 Blocking buffer에 1:500으로 희석하여 4
에서 12시간 동안 반응시킨 후, 1xPBS에 2번 세척하였다. 2차 항체를 반응시킨 후, 1xPBS에 2번 세척한 후에 봉입하여 형광현미경으로 분석하였다.
또한 상기 동물 조직에서 분리한 장지신근을 사용하여 신경근 접합부 염색(NMJ staining)을 실시하였다. 장지신근 근육을 분리 즉시 4% 파라포름알데하이드 (paraformaldehyde)을 사용하여 15분간 상온에서 고정을 시키고, 1xPBS에 3번 세척하였다. Blocking buffer (3% BSA, 0.5% Triton-X)로 2시간 동안 blocking 한 후에 1차 항체(Neurofilament, Synaptophysin)를 Blocking buffer에 1:300으로 희석하여 4
에서 24시간 동안 반응시킨 후, 1xPBS에 3번 세척하였다. 2차 항체와 2차 항체가 접합된 BTX antibody를 실온에서 2시간 반응시킨 후, 1xPBS에 2번 세척한 후 봉입하여 형광현미경으로 분석하였다.
1-6)
통계분석
모든 값은 평균±SEM 또는 SD로 표시되었다. 통계적 유의성은 쌍 또는 짝이 없는 양측 스튜던트 t 검정 또는 분산 분석(ANOVA) 검정에 이어 Tukey의 검정에 의해 계산되었다. 차이는 P<0.05에서 유의한 것으로 간주되었다.
실험예 1. 운동신경 특이적 Prmt1 결손에 의한 영향
1-1)
Prmt1 결손 마우스의 노화 기반 생존율, 체중 감소 효과
운동 신경 (motor neuron)특이적으로 Prmt1이 결핍된 마우스(Prmt1 mnKO )의 생존률 및 체중을 각 월령별로 측정하였다. 그 결과, 야생형에 비하여 노화가 진행될수록 마우스의 생존률과 체중이 급격히 감소됨을 확인하였다 (도 1 및 도 2). 즉, 운동 신경에서 발현되는 Prmt1 은 특히 노화 마우스의 생존율과 체중 유지에 중요한 역할을 담당한다는 사실을 확인하였다.
1-2)
Prmt1 결손 마우스의 노화에 의한 행동 능력 변화
운동 신경 (motor neuron)특이적으로 Prmt1이 결핍된 마우스(Prmt1 mnKO mice)의 경우, 도 3에서 보듯이, 뒷다리를 움켜잡는 행동(limp clasping) 현상이 관찰되어, 운동신경이 퇴화되었음을 확인할 수 있었다. 또한, 행동 평가로서 Open field test를 시행하여 확인한 결과, 도 4와 같이, Prmt1 mnKO 마우스에서 움직인 거리 및 보행속도가 정상 마우스(Prmt1 f/f )에 비해 감소된 것을 확인하였다.
또한 운동능력의 조절 능력을 평가하기 위한 로타로드 테스트를 진행한 결과, 도 5에서 보듯이, Prmt1 f/f 에 비해 Prmt1 mnKO 마우스에서 버티는 시간이 짧아졌음을 확인하였다. 위와 같은 실험 결과로부터, 운동 신경에서 Prmt1이 노화된 마우스의 행동 능력을 유지하는데 중요한 역할을 담당하는 것을 알 수 있다.
1-3)
Prmt1 결손 마우스의 신경 회복 지연
Prmt1 mnKO 마우스와 정상 마우스(Prmt1 f/f )에 각각 좌골신경손상(Sciatic nerve injury)를 유발하고, 28일 간 재신경화(re-innervation)를 유도한 후, 행동 분석 후에 마우스를 희생하였다.
Prmt1 mnKO 마우스와 Prmt1 f/f 의 뒷다리 근육 무게를 측정하여 비교한 결과, Prmt1 mnKO 마우스에서 근육 회복이 지연됨을 확인하였으며(도 6), TA (Tibialis anterior muscle)근육을 라미닌 염색으로 확인한 결과, Prmt1 mnKO 마우스의 근섬유(myofiber)의 크기가 현저히 감소되어 있음을 확인할 수 있었다. (도 7)
또한 근육 위축 시 증가되는 것으로 알려져 있는 섬유화(fibrosis) 정도를 확인하기 위하여 근육 세포에 대하여 Sirius red staining을 수행한 결과, Prmt1 mnKO 마우스에서 섬유화의 정도가 증가되어 있고(도 8), TA 근육에 대한 qPCR 결과에서 탈신경(Denervation) 및 근위축을 나타내는 마커가 Prmt1 f/f 마우스에 비해 증가되어 있는 것을 확인할 수 있었다(도 9).
즉, 상기 결과로부터 운동 신경에 존재하는 PRMT1은 손상된 운동 신경의 재신경화에 중요한 역할을 수행함을 알 수 있다.
1-4)
Prmt1 결손 마우스의 축색 돌기의 재 신경화 지연
신경근 접합부 염색(NMJ staining)에서, Prmt1 mnKO 마우스의 FDB(Flexor digitorum brevis muscle) 및 EDL(Extensor digitorum longus) 근육에서 운동 신경 축색 돌기의 두께와 신경근 접합부 마커인 α-BTX (Alpha-Bungarotoxin)의 크기가 Prmt1 f/f 마우스에 비해 얇고 작은 것을 확인할 수 있었다(도 10). 이로부터, Prmt1 mnKO 마우스의 경우, 축색 돌기에서 재신경화가 지연되었음을 확인할 수 있다.
1-5)
Prmt1 결손 마우스의 DNA 손상 및 스트레스 민감성 증가
Prmt1 mnKO 마우스의 DNA 손상 및 스트레스 관련 민감성을 확인하기 위하여 마우스의 뒷다리 근육의 움직임을 담당하는 요추 척수(Lumbar spinal cord)를 serial section한 후, 운동신경 마커인 CHAT (Choline acetyltransferase)과 gamma H2AX를 co-staining한 후 관찰하였다. 그 결과, DNA 손상 마커인 gamma H2AX의 발현이 Prmt1 f/f 대비 증가한 것을 확인할 수 있었다(도 11). 상기 결과로부터, Prmt1 이 결핍된 운동 신경세포는 스트레스와 관련된 민감성이 증가되어 있음을 알 수 있다.
실험예 2. 운동신경 세포에서 PRMT1 발현에 의한 효과
2-1) PRMT1 발현 억제 시, 세포 스트레스 증가 효과
운동신경 세포인 NSC34 세포주에 shPRMT1 아데노바이러스를 이용하여 PRMT1 발현을 저해하여 세포주에서 발현되는 세포 스트레스 마커의 발현량 변화를 확인하였다. 그 결과, 도 12에서 보듯이 웨스턴 블롯팅 분석에서 스트레스 관련 단백질인 p-eIF2a 및 c-caspase3의 발현이 대조군 대비 현저히 증가하였고, DNA 손상 단백질인 gamma H2AX의 발현도 대조군 대비 증가됨을 확인하였다. 또한, ROS staining 인 DHR123 (Dihydrorhodamine 123) staining을 통하여 PRMT1의 발현이 저해된 NSC34 cell에서 대조군 대비 ROS의 검출량이 증가됨을 확인하였다(도 13).
또한, 운동신경 세포인 NSC34 세포주에 shPRMT1 아데노바이러스를 이용하여 PRMT1 발현을 저해하고 DNA 손상 관련 유전자인 γ-H2AX 염색하였을 때, γ-H2AX 발현이 대조군 대비 현저히 증가하였음을 확인하였다. (도 14)
2-2) PRMT1 과발현 시, 세포 스트레스로부터 신경 세포 보호 효과
운동신경 세포인 NSC34 세포주에 PRMT1을 과발현시키고, 세포 스트레스를 야기하는 TNFα 처리 후 qPCR을 통해 스트레스 유전자의 mRNA 발현을 관찰하였다. TNFα 처리된 운동신경 세포에서는 ROS 스트레스 마커 (Gpx1, Sod1, Sod2) 및 염증성 스트레스 마커 (Ccl2, Cxcl1, Cxcl10)들의 발현량이 모두 증가하였으나, PRMT1이 과발현된 경우, 상기 마커들 모두가 현저히 감소되었음을 확인하였다(도 15). 이와 같은 결과로부터, 운동 신경 세포에 PRMT1을 과발현시킨 경우에 세포 스트레스를 보호할 수 있는 효과를 가짐을 확인할 수 있다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
Claims (10)
- PRMT1 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자를 포함하는 운동 신경 세포 보호용 조성물.
- 제 1항에 있어서,
상기 운동 신경 세포 보호는 노화, 산화 스트레스 및 염증에 의한 운동 신경 세포의 손상을 방지하는 것임을 특징으로 하는, 운동신경세포 보호용 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 조성물은 손상된 운동 신경 세포의 재 신경화를 촉진하는 것임을 특징으로 하는, 운동 신경 세포 보호용 조성물. - PRMT1 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자를 포함하는, 신경 근육 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제4항에 있어서,
상기 신경 근육 질환은 근이영양증, 운동 신경 질환, 근병증 및 신경근 접합부 질환을 포함하는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물. - 제5항에 있어서,
상기 운동 신경 질환은 근위축성 측삭경화증(amyotrophic lateral sclerosis, ALS), 척수성 진행성 근위축(infantile progressive spinal muscular atrophy, SMA), 진행성 핵상마비(progressive bulbar palsy), 가연수성마비(pseudobulbar palsy), 진행성 근육위축(progressive muscular atrophy, PMA), 진행성 축삭경화증(progressive lateral sclerosis, PLS), 단일 사지 근위축증(monomelic amyotrophy, MMA) 및 헌팅턴 병을 포함하는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물. - PRMT1 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자를 포함하는, 신경 근육 질환의 예방 또는 개선용 건강 기능 식품 조성물.
- 제7항에 있어서,
상기 신경 근육 질환은 근이영양증, 운동 신경 질환, 근병증 및 신경근 접합부 질환을 포함하는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물. - 제8항에 있어서,
상기 운동 신경 질환은 근위축성 측삭경화증(amyotrophic lateral sclerosis, ALS), 척수성 진행성 근위축(infantile progressive spinal muscular atrophy, SMA), 진행성 핵상마비(progressive bulbar palsy), 가연수성마비(pseudobulbar palsy), 진행성 근육위축(progressive muscular atrophy, PMA), 진행성 축삭경화증(progressive lateral sclerosis, PLS), 단일 사지 근위축증(monomelic amyotrophy, MMA) 및 헌팅턴 병을 포함하는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물. - ⅰ) 운동 신경 세포 또는 신경근 접합부에 후보 물질을 처리하는 단계;
ⅱ) 상기 후보 물질을 처리한 운동 신경 세포 또는 신경근 접합부에서 PRMT1의 발현 또는 활성을 측정하는 단계; 및
ⅲ)비 처리군과 비교하여 PRMT1의 발현 또는 활성을 증진시키는 후보 물질들을 선정하는 단계를 포함하는 신경 근육 질환의 예방, 개선 또는 치료 물질의 스크리닝 방법.
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