WO2023113402A1 - 근질환 개선, 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

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WO2023113402A1
WO2023113402A1 PCT/KR2022/020129 KR2022020129W WO2023113402A1 WO 2023113402 A1 WO2023113402 A1 WO 2023113402A1 KR 2022020129 W KR2022020129 W KR 2022020129W WO 2023113402 A1 WO2023113402 A1 WO 2023113402A1
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muscle
dioscin
present
pharmaceutical composition
composition
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PCT/KR2022/020129
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석영미
김효정
정지운
이준엽
김보미
유재명
윤경실
김용연
심재갈
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한국한의약진흥원
국립암센터
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    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
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    • A23V2200/30—Foods, ingredients or supplements having a functional effect on health
    • A23V2200/316—Foods, ingredients or supplements having a functional effect on health having an effect on regeneration or building of ligaments or muscles

Definitions

  • the present invention relates to a composition for improving, preventing or treating myopathy.
  • Myopathies are classified into hereditary myopathies, degenerative myopathies, inflammatory myopathies, endocrine myopathies, metabolic myopathies, congenital myopathies, and the like, depending on the cause. Complaints of marked muscle weakness in the proximal part of the upper or lower extremities, resulting in a Gower sign. As the disease progresses, muscle tone decreases or muscle atrophy becomes evident. In particular, muscle cramp symptoms often appear in congenital myopathy, Becker muscular dystrophy, and myopathy accompanied by myoglobinuria. Sometimes muscle pain may appear and may show muscle atrophy, but pseudohypertrophy may appear due to compensation.
  • Muscle atrophy is a decrease in the size of muscle cells, a decrease in the number of myofibrils in the muscle, and a decrease in skeletal muscle mass.
  • Skeletal muscle accounts for 40% of body weight, and proteolysis of skeletal muscle increases and protein synthesis decreases, resulting in muscle atrophy.
  • sarcopenia a phenomenon in which muscle mass and strength rapidly decrease due to muscle atrophy.
  • the causes of muscle atrophy include fasting, inactivity, denervation, aging, and steroid abuse.
  • the basal metabolic rate itself is reduced when the muscle mass is reduced, when blood glucose rises due to this, the incidence of diabetes may increase.
  • glucocorticoids are involved in the regulation of immune responses, regulation of glucose, fat, and anti-inflammatory responses, but long-term administration causes side effects such as muscle atrophy and diabetes, which reduce muscle mass.
  • Type II muscles composed of fast-twitch muscle fibers are selectively affected after administration of steroids, so patients treated with steroids lose the ability to generate maximum muscle strength rather than change in muscle endurance.
  • glucocorticoid receptor GR
  • FOG Forkhead box O
  • Murf1 and Atrogin1 act as ubiquitin ligases that are specifically expressed in muscle cells, and their expression is increased, resulting in ubiquitination of muscle proteins and degradation in a proteasome-dependent manner, resulting in muscle loss do.
  • muscle mass may decrease by up to 60% and muscle function may be significantly lost. Not only can independent daily life become impossible, but it can also lead to fractures and falls, depression, obesity, type 2 diabetes, disability, and even death.
  • the mortality rate of patients suffering from sarcopenia is more than twice as high as that of general patients, and there is a large difference in mortality even without special diseases, and it is urgent to prepare a plan to solve this problem.
  • An object of the present invention is to provide a composition for improving, preventing or treating myopathy.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating myopathy, containing Dioscin as an active ingredient.
  • the muscle disease is preferably muscle atrophy or sarcopenia.
  • the present invention provides a food composition for improving myopathy containing Dioscin as an active ingredient.
  • the present invention provides a health functional food for improving muscle diseases containing Dioscin as an active ingredient.
  • composition of the present invention contains Dioscin as an active ingredient to improve, prevent, and treat muscle diseases through muscle strengthening, in particular, muscle diseases accompanied by muscle atrophy or sarcopenia. effective.
  • Figure 2 is the result of confirming the mRNA expression level of the myogenic inhibitory factor according to the Dioscin treatment.
  • HDAC1 and HDAC2 histone deacetylases
  • FIG. 4 is a diagram showing the results of testing histone acetylated proteins according to Dioscin treatment.
  • 5 is a diagram showing the results of histone deacetylated protein test according to Dioscin treatment.
  • 6 is a schematic diagram showing the signal pathway for inhibiting muscle atrophy of Dioscin.
  • Dioscin inhibits the overexpression of Atrogin1 and MuRF (muscle RING-finger protein)1, which are ubiquitin ligases specifically expressed in muscle cells, and regulates muscle atrophy factors It has been confirmed that it inhibits the activity of Forkhead box (FOX) O, and strengthens muscles by inhibiting Myostatin (growth differentiation factor 8), which is involved in the inhibition of muscle tissue production.
  • FX Forkhead box
  • Myostatin growth differentiation factor 8
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating myopathy containing Dioscin as an active ingredient.
  • Dioscin as an active ingredient.
  • the Dioscin of the present invention is particularly effective for muscle atrophy or sarcopenia among muscle diseases.
  • Dioscin is a kind of steroid saponin obtained from the root of Dioscorea tokoro MAKINO, with a chemical formula of C 45 H 72 O 16 and a molecular weight of 869.06 MW.
  • the melting point of Dioscin is 288°C, the specific light intensity is [ ⁇ ]D-115°, and it is easily soluble in ethanol, but slightly insoluble in acetone.
  • Dioscin has a structure in which a small molecule of glucose and two molecules of rhamnose are bound to diosgenin of an aglycone. It is toxic, emetic, and hemolytic.
  • prevention refers to all activities to suppress or delay the onset of myopathies by administration of the pharmaceutical composition according to the present invention.
  • treatment refers to any activity that improves or beneficially changes symptoms caused by myopathy by administration of the pharmaceutical composition according to the present invention.
  • composition containing the dioscin as an active ingredient of the present invention may further contain one or more active ingredients exhibiting the same or similar functions to the above ingredients.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further include a pharmaceutically acceptable carrier in addition to dioscin.
  • the type of carrier that can be used in the present invention is not particularly limited, and any carrier commonly used in the art may be used.
  • Non-limiting examples of the carrier include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, saline, sterile water, Ringer's solution, buffered saline, albumin injection solution, xylitol, erythritol, maltitol, maltodextrin, glycerol, ethanol, and the like. can These may be used alone or in combination of two or more.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be used by adding other pharmaceutically acceptable additives such as antioxidants, excipients, diluents, buffers or bacteriostats, surfactants, binders, fillers, bulking agents, wetting agents, disintegrants , a dispersant or a lubricant may be additionally added and used.
  • other pharmaceutically acceptable additives such as antioxidants, excipients, diluents, buffers or bacteriostats, surfactants, binders, fillers, bulking agents, wetting agents, disintegrants , a dispersant or a lubricant may be additionally added and used.
  • dioscin may be included in an amount of 0.00001% to 99.99% by weight, preferably 0.1% to 90% by weight, more preferably 0.1% by weight based on the total weight of the pharmaceutical composition. It may be included in % to 70% by weight, more preferably 0.1% to 50% by weight, but is not limited thereto and may vary depending on the condition of the subject to be administered, the type of specific disease, the degree of progression, and the like. If necessary, it may be included in the entire content of the pharmaceutical composition.
  • the pharmaceutically effective amount and effective dosage of the pharmaceutical composition of the present invention may vary depending on the formulation method, administration method, administration time and/or route of administration of the pharmaceutical composition, and Type and degree of reaction, type of subject to be administered, age, weight, general health condition, symptom or severity of disease, sex, diet, excretion, drugs used simultaneously or at different times in the subject, or components of other compositions, etc. It can vary according to various factors including, and similar factors well known in the medical field, and those skilled in the art can easily determine and prescribe an effective dosage for the desired treatment.
  • the daily dose of the pharmaceutical composition of the present invention is about 0.01 to 1000 mg/kg, preferably 0.1 to 100 mg/kg, and may be administered once or several times a day.
  • Administration of the pharmaceutical composition of the present invention may be administered once a day, or may be divided and administered several times.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be administered as an individual therapeutic agent or in combination with other therapeutic agents, and may be administered sequentially or simultaneously with conventional therapeutic agents. Considering all of the above factors, it can be administered in an amount that can obtain the maximum effect with the minimum amount without side effects, which can be easily determined by those skilled in the art.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be additionally used in combination with various methods such as hormone therapy and drug therapy to prevent, improve, or treat myopathy.
  • the term "administration” means introducing the pharmaceutical composition of the present invention to a patient by any suitable method, and the route and method of administration of the pharmaceutical composition of the present invention may be independent, respectively, and the purpose Any administration route and administration method may be followed without particular limitation, as long as the pharmaceutical composition can reach the corresponding site.
  • the pharmaceutical composition may be administered by oral administration or parenteral administration, and may be formulated into various dosage forms suitable for oral administration or parenteral administration.
  • Non-limiting examples of preparations for oral administration using the pharmaceutical composition of the present invention include oily suspensions, troches, lozenges, tablets, aqueous suspensions, prepared powders, granules, emulsions, hard capsules, and soft capsules, syrups or elixirs; and the like.
  • a binder such as sorbitol, mannitol, starch, amylopectin, cellulose lactose, saccharose or gelatin; lubricating oils such as magnesium stearate, calcium stearate, sodium stearyl fumarate or polyethylene glycol wax; excipients such as dicalcium phosphate and the like; A disintegrant such as corn starch or sweet potato starch may be used, and aromatics, syrups, sweeteners, and the like may also be used.
  • a liquid carrier such as fatty oil may be additionally used in addition to the above-mentioned materials.
  • intramuscular administration As a method for parenteral administration of the pharmaceutical composition of the present invention, intramuscular administration, transdermal administration, intravenous administration, intraperitoneal administration, or subcutaneous administration may be used, and a method of applying, spraying, or inhaling the composition to a diseased area It can also be used, but is not limited thereto.
  • Non-limiting examples of parenteral preparations using the pharmaceutical composition of the present invention include injection solutions, suppositories, ointments, powders for application, oils, powders for respiratory inhalation, aerosols for sprays, creams, and the like.
  • aqueous solutions In order to formulate the pharmaceutical composition of the present invention for parenteral administration, sterilized aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, freeze-dried preparations, external preparations, etc. may be used. Vegetable oils, propylene glycol, polyethylene glycol, injectable esters such as ethyl oleate, and the like can be used.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is formulated as an injection solution
  • the pharmaceutical composition of the present invention is mixed in water together with a stabilizer or buffer to prepare a solution or suspension, which is used for unit administration in an ampoule or vial. can be formulated.
  • a propellant or the like may be mixed with additives so that the water-dispersed concentrate or wet powder is dispersed.
  • composition of the present invention When the pharmaceutical composition of the present invention is formulated into ointments, oils, creams, powders for application, skin external preparations, etc., animal oils, vegetable oils, waxes, paraffins, polyethylene glycols, silicones, bentonites, silicas, talc, starch, tras It can be formulated using Kant, cellulose derivatives, zinc oxide and the like as carriers.
  • the present invention provides a food composition for improving myopathy containing Dioscin as an active ingredient.
  • the term "improvement” refers to all activities that improve or beneficially change myopathy by administering the composition of the present invention.
  • the dioscin is preferably included in an amount of 0.00001 to 50% by weight compared to the food composition for improving myopathy. If it is less than 0.00001% by weight, the effect is insufficient, and if it exceeds 50% by weight, the increase in effect compared to the amount used is insignificant, which is uneconomical.
  • the food composition for improving myopathy of the present invention is, for example, noodles, gums, dairy products, ice creams, meats, grains, caffeinated beverages, general beverages, chocolates, breads, snacks, confectionery products, candies, pizzas, jellies, alcoholic beverages, It may be any one selected from alcohol, vitamin complexes, and other health supplements, but is not necessarily limited thereto.
  • the food composition of the present invention when used as a food additive, it may be added as it is or used together with other foods or food ingredients, and may be appropriately used according to conventional methods.
  • the present invention provides a health functional food for improving muscle diseases containing Dioscin as an active ingredient.
  • health functional food refers to food manufactured and processed using raw materials or ingredients having functional properties useful for the human body in accordance with the Health Functional Food Act No. 6727, and “functional” refers to the structure of the human body. And it refers to intake for the purpose of obtaining useful effects for health purposes such as regulating nutrients for functions or physiological functions.
  • the food composition and health functional food of the present invention may include additional ingredients that are commonly used and can improve odor, taste, and visual properties.
  • it may include biotin, folate, panthotenic acid, vitamins A, C, D, E, B1, B2, B6, B12, niacin, and the like.
  • minerals such as chromium (Cr), magnesium (Mg), manganese (Mn), copper (Cu), zinc (Zn), iron (Fe), and calcium (Ca) may be included.
  • amino acids such as cysteine, valine, lysine, and tryptophan may be included.
  • preservatives potassium sorbate, sodium benzoate, salicylic acid, sodium dihydroacetate, etc.
  • coloring agents tar colorant, etc.
  • coloring agents sodium nitrite, sodium nitrite, etc.
  • bleaching agents sodium sulfite
  • disinfectants bleaching powder and high bleaching powder, sodium hypochlorite, etc.
  • swelling agent alum, D-potassium hydrogen tartrate, etc.
  • strengthening agent emulsifier, thickener (thickener), coating agent, antioxidant (butylhydroxyanisole (BHA), butylhydroxytoluene (BHT), etc.
  • Food additives such as seasonings (MSG monosodium glutamate, etc.), sweeteners (dulcin, cyclemate, saccharin, sodium, etc.), flavorings (vanillin, lactones, etc.), gum base, antifoaming agent, solvent, improver, etc. can be added.
  • the additive may be selected according to the type of food and
  • the content of dioscin is not particularly limited, and may be variously changed according to the condition of the subject to be administered, the type of specific disease, the degree of progression, and the like. If necessary, it may also be included in the total content of food.
  • Dioscin was dissolved in DMSO and treated, and the treatment concentration in each evaluation step can be confirmed through the following experimental results.
  • L6 rat myoblasts were purchased from ATCC (American Type Culture Collection, Manassa, VA, USA), DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's medium) containing 10% FBS and 0.5% antibiotic-antimycotic. antimycotic) was added and cultured in a 37°C, 5% CO 2 incubator.
  • DMEM differentiation medium containing 2% horse serum was replaced every 2 days for 100% confluent cells. After 5-7 days, the formation of myotubes was observed under a microscope, and differentiation inhibition was induced by treatment with Dexamethasone (DEXA, 20 nmol/L) to induce muscle atrophy, which was used in the following experiments.
  • DEXA Dexamethasone
  • L6 mouse myoblasts were inoculated into a 6-well plate, differentiated in DMEM medium supplemented with 2% horse greens, and then treated with dexamethasone (DEXA, 20 nmol/L) and the extract for 8 hours.
  • Cells were recovered and RNA extracted with Trizol reagent (Izol reagent, Invitrogen, Carlsbad, CA) was quantified using a spectrophotometer, and cDNA was synthesized from 3 ⁇ g of RNA using RevertAidTM first strand cDNA synthesis kit (Fermentas). .
  • qRT-PCR was performed using an ABI Prism 7500 sequence detection system (Applied Biosystems; Foster City, CA) using 4 ⁇ l of cDNA, specific primers and Sybergreen master mix (Takara). The reaction results were compared relative to the expression level by calculating the 2 - ⁇ Ct value.
  • the genes used were atrogin-1/MAFbx, MuRF1, FOXO3A, and FOXO1, and the expression levels of target mRNAs were expressed as ratios after normalization with GAPDH.
  • Dioscin was determined to be effective in improving muscular atrophy.
  • Dioscin acts as a growth differentiation factor and acts on the self-secretion of muscle formation, and accordingly, Dioscin was determined to be effective in muscle formation.
  • HDAC Histone deacetylases, histone deacetylases
  • Dioscin was administered at different concentrations (10, 30, 100, 300 ⁇ g/ml or 1, 3, 10 ⁇ g/ml) in cells (HeLa cells) or sample alone (cell free system). ml) to measure the enzymatic activity of HDAC1 and HDAC2.
  • TSA Tricostation A, HDAC inhibitor, 0.3 ⁇ g/ml
  • Dioscin was treated by concentration (10, 30, 100, 300 ⁇ g/ml (A), 1, 3, 10 ⁇ g/ml (B)) in either a cell free system or HeLa cell to produce HDAC1 and HDAC2
  • concentration 10, 30, 100, 300 ⁇ g/ml (A), 1, 3, 10 ⁇ g/ml (B)
  • HDAC1 and HDAC2 were reduced in a concentration-dependent manner (Fig. 3 (A), (B)).
  • dioscin was treated for 16 hours at each concentration (1, 3, 10 ⁇ g/ml). Thereafter, the cells were homogenized with a lysis buffer, left on ice for 10 minutes, and then centrifuged at 12,000 rpm to recover the supernatant.
  • the amount of protein in the recovered supernatant was quantified by the BCA method, electrophoresed by SDS-PAGE, transferred to a nitrocellulose membrane, and immunoblot was performed with the target protein antibody.
  • HRP Het-radish peroxidase-coupled secondary antibody
  • HRP Hetyl histone-coupled secondary antibody
  • the antibodies used were Acetyl histone H3, histone H3, Acetyl histone H4, histone H4, HDAC1, HDAC2, and ⁇ -actin, and the expression level of the target protein was normalized to histone H3, histone H4, and ⁇ -actin. (ratio).
  • FIG. 4 is a diagram showing the results of testing histone acetylated proteins according to Dioscin treatment.
  • FIG. 5 is a diagram showing the results of histone deacetylated protein test according to Dioscin treatment.
  • FIG. 6 a schematic diagram showing the muscle atrophy inhibitory signal pathway of Dioscin is shown in FIG. 6 .

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Abstract

본 발명은 근질환 개선, 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 조성물은 디오스신(Dioscin)을 유효성분으로 함유함으로써 근육 강화를 통한 근질환, 그 중에서도 근위축(Muscle atrophy) 또는 근감소(sarcopenia)를 동반하는 근질환의 개선, 예방 및 치료에 보다 효과적이다.

Description

근질환 개선, 예방 또는 치료용 조성물
본 발명은 근질환 개선, 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
근질환은 원인에 따라 유전성 근질환, 퇴행성 근질환, 염증성 근질환, 내분비성 근질환, 대사성 근질환, 선천성 근질환 등으로 분류된다. 상지 또는 하지의 근위부(proximal part)에 뚜렷한 근력약화를 호소하여 고워 징후(Gower sign) 현상을 보인다. 병이 점차 진행함에 따라 근긴장성(muscle tone)이 감소하거나 근위축이 뚜렷해진다. 특히 선청성 근질환, 베커(Becker) 근이영양증, 마이오글로빈뇨(myoglobinuria)를 동반한 근질환 등에서 근경련(muscle cramp) 증상이 흔히 나타난다. 때로는 근육의 통증이 나타나기도 하며 근위축을 보일 수 있지만, 보상작용에 의해 가성비대(pseudohypertrophy)가 나타날 수도 있다.
근위축(muscle atrophy)은 근세포의 크기가 저하 되어，근육의 근원섬유 숫자가 감소하여 골격근 질량이 줄어드는 것이다. 골격근은 체중의 40%를 차지하며，골격근의 단백분해가 증가되고 단백합성이 감소하여 근위축이 초래된다. 또한, 근위축에 의한 근육량과 근력이 급격하게 감소하는 현상을 근감소증이라고 한다.
근위축을 유발하는 원인은 금식, 활동저하(inactivity), 탈신경(denervation), 노화 및 스테로이드 남용이 있다. 또한, 근육량이 줄어들면 기초대사량 자체가 줄어들기 때문에, 이로 인하여 혈중 포도당이 상승하게 되면 당뇨 발병률이 증가하게 되기도 한다.
스테로이드 호르몬은 부신피질에서 분비되며 글루코코르티코이드(glucocorticoid)는 면역반응의 조절，포도당，지방，항염증 반응의 조절 등에 관여하지만, 장기간 투여하면 근질량이 감소되는 근위축과 당뇨병 등의 부작용이 유발된다. 스테로이드 투여 후 속근섬유(fast-twitch musc1e fiber)로 이루어진 Type II 근육은 선택적으로 영향을 받아서 스테로이드 치료를 받은 환자들은 근지구력의 변화보다도 최대 근력을 발생시키는 능력을 소실하게 된다.
한편, 당질코르티코이드 수용체(Glucocorticoid Receptor; GR)가 활성화되면 FOXO(Forkhead box O)가 근위축 전사인자로 작용한다. 여기서, Murf1와 Atrogin1은 근세포에 특이하게 발현하는 유비퀴틴리가아제(ubiquitin ligase)로 작용하며, 발현이 증가되어 근육 단백질들이 유비퀴틴화(ubiquitination)되고 프로테아좀(proteosome) 의존적으로 분해되어 근손실이 유발된다.
한편, 노화나 스테이드호르몬에 의한 근위축과 근감소증을 계속 방치할 경우 근육량이 최대 60%까지 줄고, 근육의 기능도 현저히 잃을 수 있다. 독립적인 일상생활이 불가능해질 뿐만 아니라 골절과 낙상, 우울증, 비만, 제2 당뇨병, 장애, 나아가 사망으로까지 이어질 수 있다. 또한, 같은 암환자라도 근감소증을 앓는 환자가 일반 환자보다 사망률이 2배 이상으로 높고 특별한 질병이 없어도 사망률에서 큰 차이가 나타나는 실정으로, 이를 해결하기 위한 방안의 마련이 시급하다.
본 발명은 근질환을 개선, 예방 또는 치료하기 위한 조성물을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.
본 발명은 디오스신(Dioscin)을 유효성분으로 함유하는 근질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 약학 조성물에 있어, 상기 근질환은, 바람직하게는 근위축(Muscle atrophy) 또는 근감소(sarcopenia)인 것이 좋다.
한편, 본 발명은 디오스신(Dioscin)을 유효성분으로 함유하는 근질환 개선용 식품 조성물을 제공한다.
한편, 본 발명은 디오스신(Dioscin)을 유효성분으로 함유하는 근질환 개선용 건강기능식품을 제공한다.
본 발명의 조성물은 디오스신(Dioscin)을 유효성분으로 함유함으로써 근육 강화를 통한 근질환, 그 중에서도 근위축(Muscle atrophy) 또는 근감소(sarcopenia)를 동반하는 근질환의 개선, 예방 및 치료에 보다 효과적이다.
도 1은 디오스신 처리에 따른 근위축 인자의 mRNA 발현량을 확인한 결과이다.
도 2는 디오스신 처리에 따른 근육생성 억제 인자의 mRNA 발현량을 확인한 결과이다.
도 3은 디오스신 처리에 따른 히스톤탈아세틸화 효소(HDAC1과 HDAC2)의 효소활성을 비교한 결과이다.
도 4는 디오스신 처리에 따른 히스톤 아세틸화 단백질 검사 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 디오스신 처리에 따른 히스톤 탈아세틸화 단백질 검사 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 디오스신의 근위축 억제 신호 경로를 나타낸 모식도이다.
본 발명의 일 실시예에서는 디오스신(Dioscin)이 근세포에 특이적으로 발현하는 유비퀴틴 리가아제(ubiquitin ligase)인 Atrogin1과 MuRF(muscle RING-finger protein)1의 과발현을 억제하고, 근위축인자를 조절하는 Forkhead box(FOX) O의 활성을 억제하며, 근육조직의 생성억제에 관여하는 마이오스타틴(Myostatin, growth differentiation factor 8)을 억제하여 근육을 강화시킴을 확인한 바 있다.
또한, 본 발명의 일 실시예에서는 근위축과 근육강화의 개선에 관련되어 있다고 알려진 TSA(Tricostation A, HDAC inhibitor)와 유사한 효과가 있음을 확인하였고, 디오스신(Dioscin)을 농도 누적적으로 처리하여 HDAC1과 HDAC2의 효소활성을 조사한 결과 HDAC1/2(Histone deacetylase, 히스톤탈아세틸화 효소)의 억제효과를 확인하였으며, 히스톤아세틸 단백질인 아세틸 히스톤 H3(Acetyl histone H3)와 아세틸 히스톤 H4(Acetyl histone H4)를 증가시켜며, HDAC1과 HDAC2의 단백질을 억제시킴을 확인한 바 있다.
이에, 본 발명은 디오스신(Dioscin)을 유효성분으로 함유하는 근질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다. 상기한 바와 같이 본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명의 디오스신은 근질환 중에서도 특히 근위축(Muscle atrophy) 또는 근감소(sarcopenia)에 효과적임을 확인하였다.
디오스신(Dioscin)은 화학식 C45H72O16, 분자량 869.06MW로, 마과식물 왕마(Dioscorea tokoro MAKINO)의 뿌리에서 얻은 스테로이드사포닌의 일종이다. 디오스신의 녹는점은 288℃, 비광선도 [α]D－115°이며, 에탄올에는 잘 녹지만 아세톤에는 미용(微溶)한다. 디오스신은 아글리콘의 디오스게닌에 소분자의 포도당과 2분자의 람노오스가 결합한 구조를 갖는다. 유독성이며, 최토성(催吐性), 용혈성을 갖는다.
본 발명에서 사용되는 용어, "예방"이란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 근질환을 억제하거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어, "치료"란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 근질환에 의한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 상기 디오스신을 유효성분으로 포함하는 조성물은 상기 성분에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 디오스신 이외에 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용될 수 있는 담체의 종류는 특별히 제한되지 아니하며 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 담체라면 어느 것이든 사용할 수 있다. 상기 담체의 비제한적인 예로는, 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사 용액, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 말토덱스트린, 글리세롤, 에탄올 등을 들 수 있다. 이들은 단독으로 사용되거나 2종 이상을 혼합하여 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 약학적 조성물은 필요한 경우, 항산화제, 부형제, 희석제, 완충액 또는 정균제 등 기타 약학적으로 허용 가능한 첨가제들을 첨가하여 사용할 수 있으며, 계면 활성제, 결합제, 충진제, 증량제, 습윤제, 붕해제, 분산제 또는 윤활제 등을 부가적으로 첨가하여 사용할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물에 있어서, 디오스신은 약학적 조성물의 전체의 중량을 기준으로 0.00001중량％ 내지 99.99중량％로 포함될 수 있으며, 바람직하게는 0.1중량% 내지 90중량%, 보다 바람직하게는 0.1중량% 내지 70중량%, 더욱 바람직하게는 0.1중량% 내지 50중량%로 포함될 수 있으나, 이에 한정되지 않으며 투여 대상의 상태, 구체적인 병증의 종류, 진행 정도 등에 따라 다양하게 변경될 수 있다. 필요한 경우, 약학적 조성물의 전체 함량으로도 포함될 수 있다.
즉, 본 발명의 약학적 조성물의 약학적 유효량, 유효 투여량은 약학적 조성물의 제제화 방법, 투여 방식, 투여 시간 및/또는 투여 경로 등에 의해 다양해질 수 있으며, 약학적 조성물의 투여로 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 투여 대상이 되는 개체의 종류, 연령, 체중, 일반적인 건강 상태, 질병의 증세나 정도, 성별, 식이, 배설, 해당 개체에 동시 또는 이시에 함께 사용되는 약물 기타 조성물의 성분 등을 비롯한 여러 인자 및 의약 분야에서 잘 알려진 유사 인자에 따라 다양해질 수 있으며, 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 목적하는 치료에 효과적인 투여량을 용이하게 결정하고 처방할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 약학적 조성물의 일일 투여량은 약 0.01 내지 1000mg/kg이고, 바람직하게는 0.1 내지 100mg/kg이며, 하루 일회 내지 수회에 나누어 투여할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 투여는 하루에 1회 투여될 수 있고, 수 회에 나누어 투여될 수도 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양으로 투여할 수 있으며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 근질환을 예방, 개선 또는 치료하기 위하여 추가적으로 호르몬 치료, 약물치료 등의 다양한 방법들과 병용하여 사용될 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 본 발명의 약학적 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 본 발명의 약학적 조성물의 투여 경로 및 투여 방식은 각각 독립적일 수 있으며, 목적하는 해당 부위에 상기 약학적 조성물이 도달할 수 있는 한, 특별한 제한 없이 임의의 투여 경로 및 투여 방식에 따를 수 있다.
상기 약학적 조성물은 경구 투여 또는 비경구 투여 방식으로 투여할 수 있으며, 경구 투여 또는 비경구 투여를 위한 적합하고 다양한 제형으로 제제화되어 사용될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물을 이용한 경구 투여용 제제의 비제한적인 예로는, 유성 현탁액, 트로키제(troches), 로젠지(lozenge), 정제, 수용성 현탁액, 조제 분말, 과립, 에멀젼, 하드 캡슐, 소프트 캡슐, 시럽 또는 엘릭시르제 등을 들 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물을 경구 투여용으로 제제화하기 위하여, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아밀로펙틴, 셀룰로오스 락토오스, 사카로오스 또는 젤라틴 등과 같은 결합제; 스테아르산 마그네슘, 스테아르산 칼슘, 스테아릴 푸마르산 나트륨 또는 폴리에틸렌 글리콜 왁스 등과 같은 윤활유; 디칼슘 포스페이트 등과 같은 부형제; 옥수수 전분 또는 고구마 전분 등과 같은 붕해제 등을 사용할 수 있으며, 방향제, 시럽제, 감미제 등도 사용할 수 있다. 나아가 캡슐제의 경우에는 상기 언급한 물질 외에도 지방유와 같은 액체 담체 등을 추가로 사용할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 비경구 투여 방법으로는, 근육 내 투여, 경피 투여, 정맥 내 투여, 복강 내 투여 또는 피하 투여 등을 이용할 수 있으며, 상기 조성물을 질환 부위에 도포하거나 분무, 흡입하는 방법 또한 이용할 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 약학적 조성물을 이용한 비경구용 제제의 비제한적인 예로는, 주사액, 좌제, 연고, 도포용 파우더, 오일, 호흡기 흡입용 분말, 스프레이용 에어로졸제, 크림 등을 들 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물을 비경구 투여용으로 제제화하기 위하여, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결 건조 제제, 외용제 등을 사용할 수 있으며, 상기 비수성용제, 현탁제로는 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물을 주사액으로 제제화하는 경우, 본 발명의 약학적 조성물을 안정제 또는 완충제와 함께 물에서 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고 이를 앰플(ampoule) 또는 바이알(vial)의 단위 투여용으로 제제화할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물을 에어로졸제로 제제화하는 경우, 수분산된 농축물 또는 습윤 분말이 분산되도록 추진제 등이 첨가제와 함께 배합할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물을 연고, 오일, 크림, 도포용 파우더, 피부 외용제 등으로 제제화하는 경우에는, 동물성 유, 식물성 유, 왁스, 파라핀, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 산화 아연 등을 담체로 사용하여 제제화할 수 있다.
한편, 본 발명은 디오스신(Dioscin)을 유효성분으로 함유하는 근질환 개선용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 용어, "개선"이란, 본 발명의 조성물의 투여로 근질환이 호전 또는 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 근질환 개선용 식품 조성물에 있어, 상기 디오스신은 바람직하게 근질환 개선용 식품 조성물 대비 0.00001~50 중량% 포함되는 것이 좋다. 0.00001 중량% 미만일 경우에는 그 효과가 미비하고, 50 중량%를 초과하는 경우에는 사용량 대비 효과 증가가 미미하여 비경제적이다.
본 발명의 근질환 개선용 식품 조성물은 일 예로, 면류, 껌류, 유제품류, 아이스크림류, 육류, 곡류, 카페인 음료, 일반음료, 초콜릿, 빵류, 스낵류, 과자류, 사탕, 피자, 젤리, 알코올성 음료, 술, 비타민 복합제 및 그 밖의 건강보조식품류 중 선택되는 어느 하나일 수 있으나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 식품 조성물을 식품 첨가물로 사용할 경우, 이를 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다.
한편, 본 발명은 디오스신(Dioscin)을 유효성분으로 함유하는 근질환 개선용 건강기능식품을 제공한다.
상기 "건강기능식품"이라 함은 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 의미하며, "기능성"이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다.
본 발명의 식품 조성물 및 건강기능식품은 통상 사용되어 냄새, 맛, 시각 등을 향상시킬 수 있는 추가 성분을 포함할 수 있다. 예들 들어, 비오틴(biotin), 폴레이트(folate), 판토텐산(panthotenic acid), 비타민 A, C, D, E, B1, B2, B6, B12, 니아신(niacin) 등을 포함할 수 있다. 또한, 크롬(Cr), 마그네슘(Mg), 망간(Mn), 구리(Cu), 아연(Zn), 철(Fe), 칼슘(Ca) 등의 미네랄을 포함할 수 있다. 또한, 시스테인, 발린, 라이신, 트립토판 등의 아미노산을 포함할 수 있다. 또한, 방부제(소르빈산 칼륨, 벤조산나트륨, 살리실산, 디히드로초산나트륨 등), 착색제(타르색소 등), 발색제(아질산 나트륨, 아초산 나트륨 등), 표백제(아황산나트륨), 살균제(표백분과 고도 표백분, 차아염소산나트륨 등), 팽창제(명반, D-주석산수소칼륨 등), 강화제, 유화제, 증점제(호료), 피막제, 산화방지제(부틸히드록시아니졸(BHA), 부틸히드록시톨루엔(BHT) 등), 조미료(MSG 글루타민산나트륨 등), 감미료(둘신, 사이클레메이트, 사카린, 나트륨 등), 향료(바닐린, 락톤류 등), 검기초제, 거품억제제, 용제, 개량제 등의 식품 첨가물(food additives)을 첨가할 수 있다. 상기 첨가물은 식품의 종류에 따라 선별되고 적절한 양으로 사용될 수 있다.
본 발명의 건강기능식품에 있어, 디오스신의 함량은 특별히 제한되지 않으며, 투여 대상의 상태, 구체적인 병증의 종류, 진행 정도 등에 따라 다양하게 변경될 수 있다. 필요한 경우, 식품의 전체 함량으로도 포함될 수 있다.
이하, 본 발명의 내용을 하기 실시예 또는 실험예를 통해 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예 또는 실험예에만 한정되는 것은 아니고, 그와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 포함한다.
[실시예 1: 디오스신의 근질환 예방 및 개선 효과의 평가]
디오스신의 근질환 예방 및 개선 효과를 평가하기 위하여, 디오스신(Dioscin)을 DMSO에 용해하여 처리하였으며, 각 평가 단계에서의 처리 농도는 하기 실험 결과를 통해 확인할 수 있다.
또한, 평가를 위하여 L6 쥐 근아세포(myoblast)를 ATCC(American Type Culture Collection, Manassa, VA, USA)에서 분양 받았으며, DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's medium)에 10% FBS 및 0.5% 항생제-항진균제(antibiotic-antimycotic)가 첨가된 배지로 37℃, 5% CO2 항온반응기에서 배양하였다. 근아세포를 근관세포(myotube)로 분화시키기 위하여, 100% 세포 배양(confluent) 상태의 세포를 대상으로 2% 말 혈청이 포함된 DMEM 분화배지를 매 2일마다 교체하였다. 5-7일 후 근관(myotube)이 형성된 것을 현미경으로 관찰하고, 근위축 유도를 위하여 Dexamethasone(DEXA, 20 nmol/L)을 처리하여 분화억제를 유도하였으며, 이를 하기 실험에 이용하였다.
1. 근위축 인자의 유전자 검사
L6 쥐 근아세포를 6-well 플레이트에 접종한 후, 2% 말 청 첨가 DMEM 배지로 분화시킨 후, 덱사메타손 (Dexamethasone; DEXA, 20nmol/L)과 추출물을 8시간 동안 처리하였다. 세포를 회수하여 트라이졸 시약(Izol reagent, Invitrogen, Carlsbad, CA)으로 추출한 RNA를 분광광도계를 이용하여 정량하고, RevertAidTM first strand cDNA synthesis kit(Fermentas)를 이용하여 3㎍의 RNA에서 cDNA를 합성하였다. qRT-PCR은 ABI Prism 7500 sequence detection system (Applied Biosystems; Foster City, CA)을 이용하여, 4㎕의 cDNA, 특이적인 프라이머와 Sybergreen master mix(Takara)를 이용하여 실시하였다. 반응결과는 2- ΔΔCt 값을 계산하여 발현량을 상대비교하였다. 사용된 유전자는 atrogin-1/MAFbx, MuRF1, FOXO3A, FOXO1이며, 타겟 mRNA의 발현량은 GAPDH로 보정(normalization) 한 후 비(ratio)로 나타내었다.
분화시킨 근육세포(L6)에서 DEXA의 처리에 의해 증가된 근위축 인자의 mRNA 발현량과 디오스신의 처리에 의해 감소된 mRNA 발현량 비교을 비교한 결과, DEXA를 처리하여 근위축을 유발시킨 분화시킨 근육세포에 디오스신을 처리하자, 근위축 인자인 MuRF-1, atrogin-1, FOXO3A, FOXO1의 유전자 발현이 감소되었음을 확인하였다 (도 1). 도 1은 디오스신 처리에 따른 근위축 인자의 mRNA 발현량을 확인한 결과이다.
해당 결과에 따라, 디오스신은 근위축의 개선에 효과적인 것으로 판단되었다.
2. 근육생성 억제 인자의 유전자 검사
사용된 유전자가 Myostatin인 것을 제외하고는 상기 근위축 인자의 유전자 검사와 동일한 방식으로 실험을 진행하였다.
분화시킨 근육세포(L6)에서 DEXA의 처리에 의해 증가된 근육생성 억제 인자인 Myostatin의 mRNA 발현량과 디오스신의 처리에 의해 감소된 mRNA 발현량을 비교한 결과, DEXA를 처리하여 근위축을 유발시킨 분화시킨 근육세포에 디오스신을 처리하자, 근육생성을 억제하는 Myostatin(growth differentiation factor 8)의 유전자 발현이 감소되었음을 확인하였다 (도 2). 도 2는 디오스신 처리에 따른 근육생성 억제 인자의 mRNA 발현량을 확인한 결과이다.
해당 결과에 의하면, 디오스신이 성장분화인자로 작용하며 근육생성의 자가 분비에 작용한 것으로 판단되었으며, 이에 따라 디오스신은 근육생성에 효과적인 것으로 판단되었다.
3. HDAC(Histone deacetylases, 히스톤탈아세틸화 효소) 효소활성 검사
HDAC(Histone deacetylases, 히스톤탈아세틸화 효소) 활성은 HDACs가 아세틸 리신(K) 아미노산으로부터 아세틸기(O=C-CH3)를 제거하는 정도를 측정하였다. 즉, 아세틸레이트 라이신(Lys-Ac) 사이드 체인을 포함하는 HDAC 형광 기질을 정제된 HDAC 효소와 함께 배양하였는데, HDAC에 의해 아세틸 그룹이 라이신(K)에서 제거된 경우, 이 용액은 형광성을 허용하는 염료를 방출한다. 그 형광 수치를 측정하여 HDAC 활성을 분석한 것이다.
HDACs의 효소활성을 조사하기 위하여, 디오스신(Dioscin)을 시료단독(cell free system)이나 세포(HeLa cell)에서 농도별로(10, 30, 100, 300㎍/㎖ 혹은 1, 3, 10㎍/㎖) 처리하여 HDAC1과 HDAC2의 효소활성을 측정하였다. 근위축과 근육강화에 개선이 있다고 알려진 TSA(Tricostation A, HDAC inhibitor, 0.3㎍/㎖)를 비교하여 실험하였다.
디오스신을 시료단독(cell free system)이나 세포(HeLa cell)에서 농도별로(10, 30, 100, 300㎍/㎖ (A), 1, 3, 10㎍/㎖ (B)) 처리하여 HDAC1과 HDAC2의 효소활성을 비교한 결과, HDAC1과 HDAC2의 효소 활성을 농도의존적으로 감소시킴을 확인하였다 (도 3의 (A), (B)).
또한, HDAC 억제제로 알려진 TSA(Tricostation A, 0.3㎍/㎖)을 처리하였을 때, 디오스신(Dioscin)과 비슷하게 HDAC1과 HDAC2의 효소 활성을 감소시킴을 확인하였다 (도 3의 (A)). 도 3은 디오스신 처리에 따른 히스톤탈아세틸화 효소(HDAC1과 HDAC2)의 효소활성을 비교한 결과이다.
4. 히스톤 아세틸화 단백질 검사
실험을 위하여, 농도별로(1, 3, 10㎍/㎖) 디오스신을 16시간 동안 처리하였다. 이후, 세포를 용해완충액으로 균질화한 뒤, 얼음 위에서 10분간 방치한 후 12,000rpm에서 원심분리하여 상층액을 회수하였다.
회수된 상층액 속의 단백질량은 BCA 방법으로 정량하고, SDS-PAGE로 전기영동을 한 후에 니트로섬유소막(nitrocellulose membrane)으로 옮겨 목적 단백질 항체로 이뮤노블롯(immunoblot)을 시행하였다.
이후, HRP(Horse-radish peroxidase)가 결합된 이차항체를 두 시간 동안 반응시키고 ECL로 필름에 인화하였다. 사용된 항체는 Acetyl histone H3, histone H3, Acetyl histone H4, histone H4, HDAC1, HDAC2와 β-actin이며, 타겟 단백질의 발현량은 histone H3, histone H4와 β-actin으로 보정(normalization)한 후 비(ratio)로 나타내었다.
디오스신을 처리하여 아세틸 히스톤 H3(Acetyl H3)와 아세틸 히스톤 H4(Acetyl H4)의 단백질 발현을 비교한 결과, Acetyl H3와 Acetyl H4의 단백질 발현이 농도의존적으로 증가되었음을 확인하였다 (도 4). 도 4는 디오스신 처리에 따른 히스톤 아세틸화 단백질 검사 결과를 나타낸 도이다.
또한, 디오스신(Dioscin)을 처리하여 HDAC1과 HDAC2의 단백질 발현을 비교한 결과, HDAC1과 HDAC2의 단백질의 발현이 농도의존적으로 감소되었음을 확인하였다 (도 5). 도 5는 디오스신 처리에 따른 히스톤 탈아세틸화 단백질 검사 결과를 나타낸 도이다.
한편, 상기한 결과를 종합하여, 도 6에 디오스신의 근위축 억제 신호 경로를 나타낸 모식도를 나타내었다.

Claims (4)

  1. 디오스신(Dioscin)을 유효성분으로 함유하는 근질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 근질환은,
    근위축(Muscle atrophy) 또는 근감소(sarcopenia)인 것을 특징으로 하는 근질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  3. 디오스신(Dioscin)을 유효성분으로 함유하는 근질환 개선용 식품 조성물.
  4. 디오스신(Dioscin)을 유효성분으로 함유하는 근질환 개선용 건강기능식품.
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