WO2023113151A1

WO2023113151A1 - 염증성 질환 개선, 예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: WO2023113151A1
Application number: PCT/KR2022/013419
Authority: WO
Inventors: 박종환; 조정용; 안재훈; 송은정; 장아라; 박지연; 김영준
Original assignee: Industry Foundation of Chonnam National University
Current assignee: Industry Foundation of Chonnam National University
Priority date: 2021-12-15
Filing date: 2022-09-07
Publication date: 2023-06-22
Anticipated expiration: 2024-06-15
Also published as: KR20230090730A; KR102900205B1

Abstract

본 발명은 염증성 질환 개선, 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 구체적으로는, 에스타피아틴 (estafiatin)을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 개선, 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

Description

염증성 질환 개선, 예방 또는 치료용 조성물

본 특허출원은 2021년 12월 15일에 대한민국 특허청에 제출된 대한민국 특허출원 제10-2021-0179758호에 대하여 우선권을 주장하며, 상기 특허출원의 개시 사항은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.

생체 내의 면역계는 외부 병원체의 침입이나 생체 내의 비정상적인 세포반응에 대하여 사이토카인을 포함하는 다양한 염증 인자를 분비하여 항상성을 유지한다. 이러한 항상성의 균형이 붕괴되어 염증반응이 과도하게 유발되는 경우에 염증성 질환이 발생하게 된다.

이러한 염증성 질환에는 폐렴, 치주염, 간염, 패혈증 (sepsis) 등과 같은 감염성 염증 질환이 있고, 류마티스관절염, 다발성경화증 등과 같은 자가면역질환이 있다. 또한, 궤양성 대장염, 크론병 등의 염증성 장질환있고, 비만, 당뇨, 동맥경화 등의 대사성질환이 있으며, 알츠하이머, 파킨슨병 등과 같은 신경병성 질환 등이 있다.

세포막과 세포질 내에 존재하는 패턴인식 수용체 (pattern recognition receptor, PRR)는 병원체 연관 분자유형 (pathogen-associated molecular pattern, PAMP) 및 세포 손상 연관 분자유형 (damage-associated molecular pattern, DAMP)를 인식하고 NF-κB, MAP-키나제 (MAP-Kinase)와 같은 염증성 전사인자를 활성화를 통해 인터루킨-6 (interleukin-6, IL-6), 종양 괴사 인자-α (tumor necrosis factor-α, TNF-α), IL-1β 유도성 산화질소 합성효소 (inducible nitric oxide synthase, iNOS)를 포함하는 다양한 염증 단백질의 발현을 증가시킨다.

한편, 대부분의 염증성 단백질과는 다르게 IL-1β 및 IL-18을 포함하는 일부 염증성 단백질은 인플라마좀 (Inflammasome)이라는 특이적인 면역신호기전 활성에 의해 세포 외부로 방출된다.

그리고, 대사질환, 신경변성질환, 자가면역질환과 같은 다양한 질병에서 NLRP3 인플라마좀이 일반적인 염증활성 기전보다 더 특이적으로 질병의 발병 및 예후에 연관되어 있는 것으로 확인되었다. 이에, NLRP3 인플라마좀이 다양한 염증매개 질환의 핵심 제어인자로 대두되며, NLRP3 인플라마좀 억제기반 신약연구개발이 전세계적으로 활발하게 진행되고 있다.

한편, 천연물로부터 질병을 예방 또는 억제할 수 있는 생리활성 물질에 대한 연구가 증대되고 있고, 특히 생리활성물질의 보고 알려진 해양식물의 탐색에 관한 연구 및 해조류로부터 질병을 억제하거나 개선시킬 수 있는 소재를 찾으려는 연구가 활발히 진행되고 있다.

비쑥 (Artemisia scoparia)은 국화과에 속하는 다년초로 바닷가 모래땅에서 자라는 식용 및 약용 염생식물이다. 비쑥 추출물에서 분리한 에스타피아틴 (estafiatin)은 대표적인 세스퀴테르펜 락톤 (sesquiterpene lactone)으로 알려져 있으며 세스퀴테르펜 락톤은 대부분 국화과 식물에서 발견된다.

세스퀴테르펜 락톤 계열의 여러 가지 컴파운드에서 항비만, 항암, 그리고 항산화 효과가 있음이 과학적으로 입증되고 있으나, 염증성 질환에 대한 효과에 대한 연구는 알려진 바가 없는 실정이며, 환자에서는 치료가 제한적인 경우가 많아 이를 보완할 신규 약물의 개발이 계속해서 요구된다.

본 발명자들은 염증성 질환 개선, 예방 또는 치료용 조성물을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 에스타피아틴 (estafiatin)이 염증성 질환에 효과를 나타낸 다는 것을 규명함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

이에, 본 발명의 목적은 에스타피아틴을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 에스타피아틴을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 에스타피아틴의 염증성 질환 개선, 예방 또는 치료 용도를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 에스타피아틴을 이용한 염증성 질환 치료 방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 에스타피아틴 (estafiatin)을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 예방 또는 치료용 약제학적 조성물, 에스타피아틴을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 예방 또는 개선용 식품 조성물, 에스타피아틴의 염증성 질환 개선, 예방 또는 치료 용도, 및 에스타피아틴을 이용한 염증성 질환 치료 방법에 관한 것이다.

이하 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.

본 발명의 일 예는 에스타피아틴 (estafiatin)을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다.

본 명세서의 용어 "에스타피아틴"은 C₁₅H₁₈O₃의 분자식의 화합물로 246.3 g/mol 몰질량을 가지며, 구조식은 하기 구조식 I과 같다:

[구조식 I]

본 발명에 있어서 염증성 질환은 감염성 염증질환, 자가면역질환, 염증성 장질환 및 통풍으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서 감염성 염증질환은 폐렴, 위염, 뇌수막염, 치주염, 간염, 패혈증, 기관지염, 중이염, 부비동염, 인후염 및 골수염으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서 자가면역질환은 류마티스 관절염, 전신 홍반성 루푸스, 쇼그렌 증후군, 전신 경화증, 혈관염, 피부근염 및 다발근염으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서 염증성 장질환은 궤양성 대장염, 궤양성 십이지장염, 크론병, 장염 및 허혈성 대장염으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 약제학적 조성물은 비쑥 추출물의 약제학적 유효량을 포함하는 것일 수 있다.

본 명세서에서 용어 "유효성분으로 포함하는"이란, 비쑥 추출물의 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양을 포함하는 것을 의미한다.

본 명세서상의 용어 "약제학적 유효량"은 상술한 비쑥 추출물의 효능 또는 활성을 달성하는데 충분한 양을 의미한다.

본 발명의 조성물은 비쑥 추출물 이외에 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 담체, 부형제 및 희석제 등의 보조제를 추가로 포함하는 것일 수 있다.

본 발명의 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.

제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용할 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트 (calcium carbonate), 수크로스 (sucrose) 또는 락토오스 (lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다.

경구를 위한 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 연고제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제, 경피제 등이 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌 글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.

좌제의 제제로는 위텝솔 (witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 약제학적 조성물은 인간을 포함하는 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여 방식은 통상적으로 사용되는 모든 방식일 수 있으며, 예컨대, 경구, 피부, 정맥, 근육, 피하 등의 경로로 투여될 수 있으며, 바람직하게는 경구로 투여될 수 있다.

예를 들면, 본 발명의 조성물은 전분 또는 락토오즈를 함유하는 정제 형태로, 또는 단독 또는 부형제를 함유하는 캡슐 형태로, 또는 맛을 내거나 색을 띄게 하는 화학 약품을 함유하는 엘릭시르 또는 현탁제 형태로 경구, 구강 내 또는 혀 밑 투여될 수 있다. 이러한 액체 제제는 현탁제 (예를 들면, 메틸셀룰로오즈, 위텝솔 (witepsol)과 같은 반합성 글리세라이드 또는 행인유 (apricot kernel oil)와 PEG-6 에스테르의 혼합물 또는 PEG-8과 카프릴릭/카프릭 글리세라이드의 혼합물과 같은 글리세라이드 혼합물)와 같은 약제학적으로 허용 가능한 첨가제와 함께 제형화 될 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여방식, 환자의 연령, 체중, 성별, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다.

본 발명의 조성물을 인간에게 적용하는 구체예에 있어서, 본 발명의 조성물은 단독으로 투여될 수 있으나, 일반적으로 투여방식과 표준 약제학적 관행 (standard phamaceutical practice)을 고려하여 선택된 약제학적 담체와 혼합되어 투여될 수 있다.

본 발명의 추출물 함유 조성물의 투여 용량은 환자의 나이, 몸무게, 성별, 투여형태, 건강상태 및 질환 정도에 따라 달라질 수 있으며, 의사 또는 약사의 판단에 따라 일정 시간간격으로 1일 1회 내지 수회로 분할 투여할 수도 있다.

본 발명에 있어서 약제학적 조성물은 비쑥 추출물의 함량을 체중 1 kg 당 5 내지 500 mg/day, 5 내지 400 mg/day, 5 내지 300 mg/day, 5 내지 200 mg/day, 5 내지 100 mg/day, 10 내지 500 mg/day, 10 내지 400 mg/day, 10 내지 300 mg/day, 10 내지 200 mg/day, 10 내지 100 mg/day, 20 내지 500 mg/day, 20 내지 400 mg/day, 20 내지 300 mg/day, 20 내지 200 mg/day, 20 내지 100 mg/day, 50 내지 500 mg/day, 50 내지 400 mg/day, 50 내지 300 mg/day 또는 50 내지 200 mg/day, 예를 들어, 50 내지 100 mg/day 범위로 하여 투여되는 것일 수 있다.

본 발명의 비쑥 추출물 함유 조성물의 1일 투여량이 상기 투여 용량 미만이면 유의성 있는 효과를 얻을 수 없으며, 그 이상을 초과하는 경우 비경제적일 뿐만 아니라 상용량의 범위를 벗어나므로 바람직하지 않은 부작용이 나타날 우려가 발생할 수 있으므로, 상기 범위로 하는 것이 좋다.

본 명세서상 용어 "치료"는 본 발명에 따른 조성물의 투여로 염증성 질환의 증상이 호전되거나 완치되는 모든 행위를 의미한다.

본 명세서상 용어 "예방"은 본 발명에 따른 조성물의 투여로 염증성 질환의 증상을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에 있어서 에스타피아틴은 비쑥 추출물 유래인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 명세서상 용어 "비쑥"은 국화과 (Compositae)의 쑥속 (Artemisia)에 속하는 다년초 식물로서, 바닷가 모래땅에서 자라는 다년초로서 사철쑥과 닮았으나 냄새가 다르다. 사철쑥은 줄기가 나무처럼 되어 있어 겨울철에도 죽지 않지만 비쑥은 겨울철에 줄기가 완전히 말라 죽는 것이 특징이다. 비쑥은 한방에서는 거의 쓰지 않는 희귀한 풀이다.

본 발명에 있어서 비쑥은 잎, 줄기, 열매, 뿌리 및 꽃으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있으며, 예를 들어, 잎일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서 비쑥 추출물은 비쑥을 극성 용매, 비극성 용매 또는 이들의 혼합 용매로 추출하여 얻어진 조추출물일 수 있다.

본 발명에 있어서 극성 용매는 물, 알코올, 아세트산, 디메틸 포름아미드 (dimethyl formamide; DMFO) 및 디메틸 술폭시드 (dimethyl sulfoxide; DMSO) 로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서 알코올은 탄소수 1 내지 4개의 직쇄 또는 분지형 알코올, 예를 들어, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 노말-프로판올, 이소-프로판올, 노말-부탄올, 1-펜탄올, 2-부톡시에탄올, 에틸렌글리콜 또는 이들의 혼합물인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서 용매 물과 알코올의 혼합물인 경우에는 10% 이상 내지 100% (v/v) 미만, 20%이상 내지 100% (v/v) 미만, 30%이상 내지 100% (v/v) 미만, 40%이상 내지 100% (v/v) 미만, 50% 이상 내지 100% (v/v) 미만, 50%이상 내지 95% (v/v) 미만, 50%이상 내지 92% (v/v) 미만, 60% 이상 내지 100% (v/v) 미만, 60% 이상 내지 95% (v/v) 미만, 60% 이상 내지 92% (v/v) 미만, 70% 이상 내지 100% (v/v) 미만, 70% 이상 내지 95% (v/v) 미만, 70% 이상 내지 92% (v/v) 미만, 80% 이상 내지 100% (v/v) 미만, 80% 이상 내지 95% (v/v) 미만, 80% 이상 내지 92% 미만의 탄소수 1 내지 4개의 직쇄 또는 분지형 알코올 수용액일 수 있으며, 예를 들어, 90% (v/v)일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서 분획물은 용매로 추출한 조추출물을 노멀헥산으로 용매분획하여 얻은 노멀헥산 획분, 용매로 추출한 조추출물을 노멀헥산으로 용매분획 후 남은 수용액 획분에 클로로포름으로 용매분획하여 얻은 클로로포름 획분, 용매로 추출한 조추출물을 노멀헥산으로 용매분획 후 남은 수용액 획분에 클로로포름으로 용매분획 후 남은 수용액 획분에 에틸아세테이트로 용매분획하여 얻은 에틸아세테이트 획분, 용매로 추출한 조추출물을 노멀헥산으로 용매분획 후 남은 수용액 획분에 클로로포름으로 용매분획 후 남은 수용액 획분에 에틸아세테이트로 용매분획 후 남은 수용액 획분에 수포화부탄올로 용매분획하여 얻은 수포화부탄올 획분, 및 이들의 혼합으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 분획물일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 조성물에 포함된 비쑥 추출물은 천연식물재료로서 세포 독성이 없다.

본 발명의 다른 일 예는 에스타피아틴을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 예방 또는 개선용 식품 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 있어서 감염성 염증질환은 폐렴, 치주염, 간염 및 패혈증으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서 자가면역질환은 류마티스관절염 및 다발성경화증으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 식품 조성물을 식품 첨가물로 사용할 경우, 상기 식품조성물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조 시에 본 발명의 식품조성물은 원료에 대하여 15 중량% 이하, 바람직하게는 10 중량% 이하의 양으로 첨가될 수 있다.

상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 식품을 모두 포함한다.

상기 음료는 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 당업자의 선택에 의해 적절하게 결정될 수 있다.

상기 외에 본 발명의 식품조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 식품조성물은 천연 과일주스, 과일주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율 또한 당업자에 의해 적절히 선택될 수 있다.

상기 식품 조성물에 있어서, 상기 약제학적 조성물과 중복되는 내용은 본 명세서의 복잡성을 고려하여 생략한다.

본 명세서상 용어 "개선"은 본 발명에 따른 조성물의 투여로 염증성 질환의 증상이 호전되거나 완치되는 모든 행위를 의미한다.

본 발명의 또 다른 일 예는 비쑥 추출물을 제조하는 방법에 관한 것이다.

본 명세서상 용어 "추출물"은 당업계에서 조추출물 (crude extract)로 통용되는 의미를 갖지만, 광의적으로는 추출물을 추가적으로 분획 (fractionation)한 분획물도 포함한다. 즉, 비쑥 추출물은 추출용매를 이용하여 얻은 것뿐만 아니라, 여기에 정제과정을 추가적으로 적용하여 얻은 것도 포함한다. 예를 들어, 상기 추출물을 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외 여과막을 통과시켜 얻은 분획, 다양한 크로마토그래피 (크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)에 의한 분리 등, 추가적으로 실시된 다양한 정제 방법을 통해 얻어진 분획도 본 발명의 비쑥 추출물에 포함되는 것이다. 또한, 비쑥 추출물은 용액, 농축물 또는 분말 상태일 수 있다.

본 발명에 사용된 추출 방법은 통상적으로 사용되는 모든 방법일 수 있으며, 예를 들어, 냉침, 열수추출, 초음파 추출, 또는 환류 냉각 추출법일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 비쑥 추출물의 제조 과정을 보다 상세하게 설명하면 다음과 같다:

비쑥 분말의 중량에 대하여 약 8 내지 50배 중량의 추출용매로 상온 추출한다. 추출 후 여과하여 여과액을 모은다. 추출 온도는 특별한 제한은 없지만 15 내지 110℃ 바람직하게는 20 내지 90℃인 것이 좋다.

추출공정은 1회 또는 수회 반복할 수 있으며, 본 발명의 한 바람직한 예에서는 1차 추출 후 다시 재추출하는 방법을 채택할 수 있는데, 이는 추출물을 대량 생산하는 경우 효과적으로 여과를 한다 하더라도 자체의 수분 함량이 높기 때문에 손실이 발생하게 되어 1차 추출만으로는 추출효율이 떨어지므로 이를 방지하기 위함이다. 또한, 각 단계별 추출효율을 검증한 결과 2차 추출에 의해 전체 추출량의 80 내지 90% 정도가 추출되는 것으로 밝혀졌다.

본 발명에 있어서 추출공정을 2회 바람직하게는 8 내지 12 부피배로 환류 추출하는 것일 수 있다. 추출 후 여과하고 이전에 얻어진 반복하는 경우, 상기 얻어진 잔사에 다시 추출용매, 약 5 내지 15 부피배, 여과액과 합쳐서 감압 농축을 하여 비쑥 추출물을 제조한다. 이와 같이 2차에 걸친 추출 및 각각의 추출 후 얻어진 여과액을 혼합함으로써 추출 효율을 높일 수 있으나, 본 발명의 추출물이 추출 회수에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서 비쑥 추출물 제조 시에 사용되는 용매의 양이 너무 적으면 교반이 어렵게 되고 추출물의 용해도가 낮아져 추출효율이 떨어지게 되고, 지나치게 많은 경우는 다음의 정제단계에서 사용되는 용매의 사용량이 많아져 경제적이지 못하여 취급상 문제가 발생할 수 있으므로, 용매의 사용량은 상기 범위로 하는 것이 좋다.

이와 같이 얻어진 여과된 추출물은 의약품 및 식품 원료로 사용하기에 적합하도록 잔존하는 저급 알코올의 함량을 조절하기 위하여 농축물 총량의 약 10 내지 30배, 바람직하게는 15 내지 25배, 보다 바람직하게는 약 20 중량배의 물로 1 내지 5회, 바람직하게는 2 내지 3회 공비 농축하고 재차 동량의 물을 가하여 균질 하게 현탁시킨 후 동결 건조하여 분말상태의 비쑥 추출물로 제조될 수 있다.

도 1은 에스타피아틴 (estafiatin)의 구조식이다.

도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 마우스 대식세포에 에스타피아틴을 처리한 후 세포독성을 평가하여 세포생존율을 측정한 결과 그래프이다.

도 3a는 본 발명의 일 실시예에 따라 LPS로 자극된 마우스 대식세포에 에스타피아틴을 처리한 후 염증성 사이토카인 IL-6의 유전자 발현량을 측정한 결과 그래프이다.

도 3b는 본 발명의 일 실시예에 따라 LPS로 자극된 마우스 대식세포에 에스타피아틴을 처리한 후 염증성 사이토카인 TNF-α의 유전자 발현량을 측정한 결과 그래프이다.

도 3c는 본 발명의 일 실시예에 따라 LPS로 자극된 마우스 대식세포에 에스타피아틴을 처리한 후 iNOS의 유전자 발현량을 측정한 결과 그래프이다.

도 4a는 본 발명의 일 실시예에 따라 LPS로 자극된 마우스 대식세포에 에스타피아틴을 처리한 후 염증성 사이토카인 IL-6의 단백질 발현량을 측정한 결과 그래프이다.

도 4b는 본 발명의 일 실시예에 따라 LPS로 자극된 마우스 대식세포에 에스타피아틴을 처리한 후 염증성 사이토카인 TNF-α의 단백질 발현량을 측정한 결과 그래프이다.

도 5는 본 발명의 일 실시예에 따라 LPS로 자극된 마우스 대식세포에 에스타피아틴을 처리한 후 iNOS 단백질 발현량을 측정한 웨스턴블롯 결과이다.

도 6은 본 발명의 일 실시예에 따라 LPS로 자극된 마우스 대식세포에 에스타피아틴을 처리한 후 염증성 전사인자 (p65, p38, JNK, ERK)의 인산화를 측정한 결과를 나타낸 웨스턴블롯 결과이다.

도 7a는 본 발명의 일 실시예에 따라 LPS+ATP로 유도된 NLRP3 인플라마좀에 에스타피아틴을 처리한 후 NLRP3 인플라마좀 억제효과 (IL-1β의 방출량)를 측정한 결과 그래프이다.

도 7b는 본 발명의 일 실시예에 따라 LPS+Nigericin로 유도된 NLRP3 인플라마좀에 에스타피아틴을 처리한 후 NLRP3 인플라마좀 억제효과 (IL-1β의 방출량)를 측정한 결과 그래프이다.

도 7c는 본 발명의 일 실시예에 따라 LPS+MSU로 유도된 NLRP3 인플라마좀에 에스타피아틴을 처리한 후 NLRP3 인플라마좀 억제효과 (IL-1β의 방출량)를 측정한 결과 그래프이다.

도 8a는 본 발명의 일 실시예에 따라 LPS+ATP로 유도된 NLRP3 인플라마좀에 에스타피아틴을 처리한 후 NLRP3 인플라마좀 억제효과 (카스파제 1, IL-1β 및 β-actin 단백질 생성량)을 측정한 결과이다.

도 8b는 본 발명의 일 실시예에 따라 LPS+Nigericin로 유도된 NLRP3 인플라마좀에 에스타피아틴을 처리한 후 NLRP3 인플라마좀 억제효과 (카스파제 1, IL-1β 및 β-actin 단백질 생성량)을 측정한 결과이다.

도 8c는 본 발명의 일 실시예에 따라 LPS+MSU로 유도된 NLRP3 인플라마좀에 에스타피아틴을 처리한 후 NLRP3 인플라마좀 억제효과 (카스파제 1, IL-1β 및 β-actin 단백질 생성량)을 측정한 결과이다.

도 9a는 본 발명의 일 실시예에 따라 LPS로 유도된 마우스 패혈성 쇼크 (septic shock) 동물모델에 에스타피아틴을 투여한 후 복강액 (Peritoneal fluid) 내 염증성 사이토카인 IL-6의 생성 억제효과를 측정한 결과 그래프이다.

도 9b는 본 발명의 일 실시예에 따라 LPS로 유도된 마우스 패혈성 쇼크 (septic shock) 동물모델에 에스타피아틴을 투여한 후 복강액 (Peritoneal fluid) 내 염증성 사이토카인 TNF-α의 생성 억제효과를 측정한 결과 그래프이다.

도 9c는 본 발명의 일 실시예에 따라 LPS로 유도된 마우스 패혈성 쇼크 (septic shock) 동물모델에 에스타피아틴을 투여한 후 복강액 (Peritoneal fluid) 내 염증성 사이토카인 IL-1β의 생성 억제효과를 측정한 결과 그래프이다.

도 9d는 본 발명의 일 실시예에 따라 LPS로 유도된 마우스 패혈성 쇼크 (septic shock) 동물모델에 에스타피아틴을 투여한 후 복강액 (Peritoneal fluid) 내 염증성 사이토카인 CXCL1의 생성 억제효과를 측정한 결과 그래프이다.

도 9e는 본 발명의 일 실시예에 따라 LPS로 유도된 마우스 패혈성 쇼크 (septic shock) 동물모델에 에스타피아틴을 투여한 후 복강액 (Peritoneal fluid) 내 염증성 사이토카인 CXCL2의 생성 억제효과를 측정한 결과 그래프이다.

도 10a은 본 발명의 일 실시예에 따라 LPS로 유도된 마우스 패혈성 쇼크 (septic shock) 동물모델에 에스타피아틴을 투여한 후 혈청 (Serum) 내 염증성 사이토카인 IL-6의 생성 억제효과를 측정한 결과 그래프이다.

도 10b은 본 발명의 일 실시예에 따라 LPS로 유도된 마우스 패혈성 쇼크 (septic shock) 동물모델에 에스타피아틴을 투여한 후 혈청 (Serum) 내 염증성 사이토카인 TNF-α의 생성 억제효과를 측정한 결과 그래프이다.

도 10c은 본 발명의 일 실시예에 따라 LPS로 유도된 마우스 패혈성 쇼크 (septic shock) 동물모델에 에스타피아틴을 투여한 후 혈청 (Serum) 내 염증성 사이토카인 IL-1β의 생성 억제효과를 측정한 결과 그래프이다.

도 10d은 본 발명의 일 실시예에 따라 LPS로 유도된 마우스 패혈성 쇼크 (septic shock) 동물모델에 에스타피아틴을 투여한 후 혈청 (Serum) 내 염증성 사이토카인 CXCL1의 생성 억제효과를 측정한 결과 그래프이다.

도 10e은 본 발명의 일 실시예에 따라 LPS로 유도된 마우스 패혈성 쇼크 (septic shock) 동물모델에 에스타피아틴을 투여한 후 혈청 (Serum) 내 염증성 사이토카인 CXCL2의 생성 억제효과를 측정한 결과 그래프이다.

도 11은 본 발명의 일 실시예에 따라 LPS로 유도된 마우스 패혈성 쇼크 동물모델에 에스타피아틴을 투여한 후 치사율(Lethality) 개선효과를 측정한 결과 그래프이다.

에스타피아틴을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.

이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.

본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 "%"는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (중량/중량) %, 고체/액체는 (중량/부피) %, 및 액체/액체는 (부피/부피) %이다.

제조예 1. 비쑥 에탄올 수용액 추출물의 제조

비쑥 지상부 분말 140 g를 95% (V/V)의 에탄올 2.2 L를 가하여 호모게나이저로 분쇄한 다음 상온에서 24시간 동안 추출하였으며, 여과지 (No. 2, Whatman)로 여과를 행하여 에탄올 수용액 추출여액을 얻었다. 또한 잔사에 95% (V/V)의 에탄올 1 L를 가하여 상기와 동일 방법으로 재차 추출 및 여과하였다. 얻어진 에탄올 수용액 추출 여액은 아스피레이터가 장착된 진공농축기 (A-3S, Eyela, Tokyo, Japan)를 사용하여 45℃에서 감압 농축하여 비쑥 에탄올 수용액 추출물을 제조하였다.

제조예 2. 에스타피아틴의 분리

제조예 1에서 얻어진 비쑥 에탄올 수용액 추출물을 2차 증류수 (1.2 L)로 현탁시킨 다음 노멀헥산 (1.2 L)으로 3회 반복 용매분획하여 노멀헥산 획분을 얻은 다음, 수용액 획분에 클로로포름 (CHCl₃, 1.2 L)으로 3회 반복 용매분획하여 클로로포름 획분을 얻었다. 이어 수용액 획분에 에틸아세테이트 (EtOAc, 1.2 L)로 3회 반복 용매분획하여 에틸아세테이트 획분을 얻고, 수용액 획분에 수포화부탄올 (BuOH, 0.9 L)로 3회 반복 용매분획하여 수포화부탄올 획분을 얻었다. 얻어진 각 획분을 진공농축기를 이용하여 45℃에서 감압 농축하여 노멀헥산 분획물, 클로로포름 분획물, 에틸아세테이트 분획물, 및 수포화부탄올 분획물을 제조하였다.

에틸아세테이트 분획물 (13.74 g)을 대상으로 실리카젤 컬럼이 장착된 MPLC를 이용하여 정제하였다. 즉, 에틸아세테이트 분획물 (13.74 g)을 실리카젤에 흡착시켜 컬럼에 충진시킨 다음 이를 실리카젤 컬럼 (SNAP KP-Sil 340 g, Biotage, Seongnam, Korea)에 연결하였다. 이후 클로로포름/메탄올 = 9:1, 4:6 및 0:10 (v/v) 용매계로 한 단계별 (step-wise) 용출 방법 (각 단계 별 3,400 mL, 100 mL/min)으로 용출 및 분획하였다.

상기 실리카젤 컬럼 크로마토그래피로부터 얻어진 획분 A (6.37 g, 클로로포름/메탄올 = 9:1, v/v)를 대상으로 실리카젤 컬럼이 장착된 MPLC를 이용하여 재정제하였다. 즉, 상기와 동일한 방법으로 획분 A를 실리카젤에 흡착시켜 컬럼에 충진한 다음 화합물 분리용 실리카젤 컬럼 (ZIP KP-Sil 120 g, Biotage, Seongnam, Korea)과 연결하였다. 이어 초기 10분은 노멀헥산/에틸아세테이트 = 90:10 (v/v)로, 10분에서 40분까지 분노멀헥산/에틸아세테이트 = 0:100 (v/v)으로 한 그래디언트 용출 방법(50 mL/min)으로 하여 에스타피아틴가 함유된 획분 A7 (1.14 g, 머무름값 23-25 min)을 얻었다.

실험예 1. 비쑥 에탄올 수용액 추출물로부터 분리한 에스타피아틴의 구조 확인

제조예 2에서 분리된 화합물인 에스타피아틴의 구조는 MS 및 NMR 분석을 통하여 확인할 수 있었다. 에스타피아틴의 HR-ESI-MS (positive) 스펙트럼으로부터 분자량 이온 피크인 m/z 269.1254 [M+Na]⁺가 관찰되었고, 이 화합물의 분자량이 246 (C₁₅H₁₈O₃)임을 알 수 있었다.

¹H-NMR 및 ¹³C-NMR 스펙트라로부터 이 화합물은 구아이아올라이드 (guaiadienolide)계 화합물로 시사되었다. 즉, ¹H-NMR (500 MHz, CD₃OD) 스펙트럼에서 2종의 sp² 메틸렌에 귀속되는 4종의 프로톤 시그널들[δ 6.21 (1H, d, J = 3.6 Hz, H-13a), 5.48 (1H, d, J = 3.6 Hz, H-13b), 4.95 (1H, br. s, H-14a), 4.86 (1H, br. s, H-14b)]과 5종의 메틴 프로톤 시그널들 [δ 2.97 (1H, dt, J = 11.0, 8.0 Hz, H-1), 3.37 (1H, s, H-3), 2.31 (1H, dd, J = 11.0, 8.5 Hz, H-5), 4.08 (1H, dd, J = 11.0, 8.5 Hz, H-6), 2.87 (1H, m, H-7)]이 관찰되었다. 또한, 3종의 메틸렌 그룹에 귀속되는 5종의 프로톤 시그널들 [δ 2.06 (1H, dt, J = 11.0, 8.0 Hz, H-2a), 2.06 (1H, dd, J = 14.0, 7.0 Hz, H-2b), 2.26 (2H, m, H-8), 2.21 (1H, m, H-9a), 1.53 (1H, m, H-9b)]과 1종의 메틴 프로톤 시그널들 [δ 1.62 (3H, s, H-15)]이 관찰되었다. ¹³C-NMR (125 MHz) 스펙트럼에서는 1종의 카르보닐 카본 시그널 [δ 169.7 (C-12)] 및 3종의 쿼터너리 시그널 들[δ 65.8 (C-4), 146.1 (C-10), 139.5 (C-11)]를 포함한 총 15종의 카본 시그널들이 관찰되었으며, 이는 ESI-MS 및 ¹H-NMR 스페트럼의 분석 결과와 일치되었다. 이상의 결과로부터 이 화합물은 구아이아놀라이드계 화합물인 에스타피아틴으로 구조해석되었다.

하기 표 1은 에스타피아틴의 ¹H- (500 MHz) 및 ¹³C-NMR (125 MHz) 자료 (CD₃OD)이며, 그 구조는 도 1에 도시된 바와 같다.

위치	δH (rel. Int., Multi., J in Hz)	δC
1	2.97 (1H, td, 11.0, 8.0)	44.8
2a	2.06 (1H, dd, 14.0, 7.0)	33.1
2b	1.81 (1H, dd, 3.5, 1.0)	33.1
3	3.37 (1H, s)	63.3
4	-	65.8
5	2.31 (1H, dd, 11.0, 8.5)	50.8
6	4.08 (1H, dd, 11.0, 8.5)	80.5
7	2.87 (1H, m)	44.1
8	2.26 (2H, m)	28.6
9a	2.21 (1H, m)	29.2
9b	1.53 (1H, m)	29.2
10	-	146.1
11	-	139.5
12	-	169.7
13a	6.21 (1H, d, 3.5)	120.2
13b	5.48 (1H, d, 3.5)	120.2
14a	4.95 (1H, br. s)	115.3
14b	4.86 (1H, br. d, 2)	115.3
15	1.62 (3H, s)	18.6

실험예 2: 에스타피아틴의 염증반응 억제 효과

8 내지 12주령 C57BL/6J 마우스의 넙다리뼈 및 정강뼈에서 26g 주사기를 이용하여 골수를 분리하였다. 분리한 골수는 150ð 세포배양 플레이트에서 IMDM 배지, 30% L929 세포 상청액 (cell supernatnant), 10% 우태아 혈청 (fetal bovine serum), 1% 페니실린/스트렙토마이신 (pencillin/streptomycin), 1% 비필수 아미노산 (non-essential amino acid) 및 1% 피루브산나트륨 (sodium pyruvate)으로 조성된 배지로 6일 동안 대식세포로 분화시킨 후 실험에 사용하였다.

2-1. 세포 독성 평가

분화된 대식세포를 1x10⁶셀/ml 농도로 48 웰플레이트에 200μL씩 시딩하였다. 그 후, 37°C, 5% CO₂ 조건에서 12 시간 동안 안정화하였다. 배양한 세포의 상층액을 제거한 후 무혈청 (Serum free) 배지에 에스타피아틴 0.5, 1, 2, 4, 8 또는 16 μM 농도로 희석하여 200μl씩 처리하고 37°C, 5% CO₂ 조건에서 24 시간 동안 배양하였다. 이후 배양한 세포의 상층액을 제거하고 400μg/m 농도의 MTT 용액을 200 μL 처리한 후, 7°C, 5% CO₂ 조건에서 4 시간 반응시켰다. 이후 반응액을 제거하고 DMSO를 200μl 첨가하여 570㎚에서 흡광도를 측정하였다. 아무것도 처리하지 않은 세포의 세포 생존율을 기준으로 하여 (100%), 시료를 처리한 세포의 생존율을 계산하여 도 2 및 표 2에 나타내었다.

세포 독성 평가
에스타피아틴 (μM)	-	0.5	1	2	4	8	16
세포생존률 (%)	100	98.27	97.61	101.3	93.5	79.84	76.2

도 2 및 표 2에서 확인할 수 있듯이, 마우스 골수유래 대식세포에 4μM 이하 농도의 에스타피아틴을 처리하는 경우 세포 생존률은 93% 이상으로 유지됨을 확인하였다. 즉, 4μM 이하 농도의 에스타피아틴 처리시 세포 독성을 나타내지 않는 것을 알 수 있었다.

2-2. 유전자 발현량 측정

분화된 대식세포를 1x10⁶셀/mL 농도로 12 웰플레이트에 1ml씩 시딩하였다. 그 후, 37°C, 5% CO₂ 조건에서 12 시간 동안 안정화하였다. 배양한 세포의 상층액을 제거한 후 무혈청 (Serum free) 배지에 에스타피아틴을 4μM 농도로 희석하여 900ul씩 처리하였다. 2시간 후 LPS를 1μg/ml농도로 100 ul 첨가한 후 0, 3, 6 또는 12 시간 동안 37℃, 5% CO₂ 조건에서 배양하였다. 배양한 세포의 상층액을 제거한 후 플레이트에 부착된 세포는 트리졸 (trizol)로 균질화 하였다. 각각의 시료에서 RNA를 추출한 후 qPCR 기법을 통해 염증성 사이토카인 및 iNOS 유전자 발현량을 정량화 하여 도 3a 내지 3c 및 표 3에 나타내었다.

염증성 사이토카인 및 iNOS 유전자 발현량
배양시간 (시간)	0	3	3	6	6	12	12
LPS (ng/ml)	-	100	100	100	100	100	100
에스타피아틴 (μM)	-	-	4	-	4	-	4
IL-6 발현량	1	8899	1809	13692	1073	7501	692.8
TNF-α 발현량	1	173.9	160.9	147.4	97.59	111	60.91
iNOS 발현량	1	421.6	23.67	1006	123.5	848.3	59.82

도 3a 내지 3c 및 표 3에서 확인할 수 있듯이, 마우스 골수유래 대식세포에 LPS를 처리하는 경우 시간이 지남에 따라 IL-6, TNF-α, iNOS의 유전자 발현이 억제됨을 확인할 수 있었다. LPS와 에스타피아틴을 함께 처리하는 경우 LPS에 의한 IL-6, TNF-α, iNOS의 유전자 발현은 더욱 억제되었다. 즉, 에스타피아틴이 항염증용 조성물로 유용하게 사용할 수 있음을 알 수 있었다.

2-3. 단백질 발현량 측정

분화된 대식세포를 1x10⁶셀/mL 농도로 48 웰플레이트에 200ul씩 시딩하였다. 그 후, 37℃, 5% CO₂ 조건에서 12 시간 동안 안정화하였다. 배양한 세포의 상층액을 제거한 후 무혈청 배지에 에스타피아틴을 1, 2 또는 4μM 농도로 희석하여 180 ul씩 처리하였다. 2시간 후 LPS를 1 μg/ml 농도로 20 ul 첨가한 후 24시간 동안 37℃, 5% CO₂ 조건에서 배양하였다. 배양한 세포의 상층액 샘플을 채취한 후 효소 면역 분석법 (enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA) 기법을 통해 염증성 사이토카인의 양을 측정하여 도 4a, 4b 및 표 4에 나타내었다.

염증성 사이토카인 (IL-6 TNF-α) 생성량
LPS (ng/ml)	-	100	100	100	100
에스타피아틴 (μM)	-	-	1	2	4
IL-6(pg/ml)		6682	4693	1875	0
TNF-α(pg/ml)		7259	5607	2732	0

도 4a, 4b 및 표 4에서 확인할 수 있듯이, 마우스 골수유래 대식세포에 에스타피아틴을 처리하는 경우 LPS에 의한 IL-6, TNF-α의 단백질 생성이 농도 의존적으로 억제됨을 확인할 수 있었다. 특히, 4μM의 에스타피아틴을 처리하는 경우 IL-6, TNF-α의 단백질 생성이 완전히 억제되었다. 즉, 에스타피아틴이 항염증용 조성물로 유용하게 사용할 수 있음을 알 수 있었다.

2-4. iNOS 및 β-actin 단백질 생성량 측정

분화된 대식세포를 1x10⁶셀/ml 농도로 12 웰플레이트에 1ml씩 시딩하였다. 그 후, 37℃, 5% CO₂ 조건에서 12 시간 동안 안정화하였다. 배양한 세포의 상층액을 제거한 후 무혈청 배지에 에스타피아틴을 2.5, 5 또는 10μM 농도로 희석하여 900 ul씩 처리하였다. 2시간 후 LPS를 1μg/ml 농도로 100 ul 첨가한 후 24 시간 동안 37℃, 5% CO₂ 조건에서 배양하였다. 배양한 세포의 상층액을 제거한 후 플레이트에 부착된 세포는 NP40 세포 용해 (cell lysis) 버퍼를 통해 균질화 하였다. 각각의 시료에서 단백질을 추출하였다. 웨스턴 블롯 (western blot)으로 iNOS 및 β-actin 단백질 생성량을 측정하여 도 5에 나타내었다.

도 5에서 확인할 수 있듯이, 마우스 골수유래 대식세포에 에스타피아틴을 처리하는 경우 LPS에 의한 iNOS 단백질 생성을 농도 의존적으로 억제하는 것을 확인할 수 있었다. 즉, 에스타피아틴이 항염증용 조성물로 유용하게 사용할 수 있음을 알 수 있었다.

2-5. 염증성 전사인자의 인산화 측정

분화된 대식세포를 1x10⁶셀/ml 농도로 12 웰플레이트에 1ml씩 시딩하였다. 그 후, 37°C, 5% CO₂ 조건에서 12 시간 동안 안정화하였다. 배양한 세포의 상층액을 제거한 후 무혈청 배지에 에스타피아틴을 4 μM 농도로 희석하여 900 ul씩 처리하였다. 2시간 후 LPS를 1μg/ml 농도로 100 ul 첨가한 후 각각 0, 15, 30 또는 60 분 동안 37°C, 5% CO₂ 조건에서 배양하였다. 배양한 세포의 상층액을 제거한 후 플레이트에 부착된 세포는 포스파타제 억제제 (phosphatase inhibitor) 가 포함된 NP40 세포 용해 버퍼를 통해 균질화 하였다. 각각의 시료에서 단백질을 추출한 후 웨스턴 블롯으로 각각의 단백질 생성량을 측정하여 도 6에 나타내었다.

도 6에서 확인할 수 있듯이, 마우스 골수유래 대식세포에 에스타피아틴을 처리하는 경우 LPS에 의한 염증성 전사인자의 인산화가 억제되는 것을 확인할 수 있었다. 즉, 에스타피아틴이 항염증용 조성물로 유용하게 사용할 수 있음을 알 수 있었다.

실험예 3: 에스타피아틴의 NLRP3 인플라마좀 억제 효과 측정

3-1. IL-1β의 방출량 측정

분화된 대식세포를 1x10⁶셀/ml 농도로 48 웰플레이트에 200μL씩 시딩하였다. 그 후, 37°C, 5% CO₂ 조건에서 12 시간 동안 안정화하였다. 배양한 세포의 상층액을 제거한 후 무혈청 (Serum free) 배지에 LPS를 100 ng/ml 농도로 180 ul 처리하여 5시간 동안 프라이밍하였다. 그 다음, 에스타피아틴을 10, 20 또는 40μM 농도로 희석하여 20 ul씩 첨가하였다(1, 2 또는 4 μM 농도로 작용). 1 시간 후, ATP (10 mM 농도로 20 ul 첨가 후 30분 배양), 나이제리신 (Nigericin, 25μM 농도로 20ul 첨가 후 30분 배양), MSU (2 mg/ml 농도로 20ul 첨가 후 4시간 배양)를 각각 처리하였다. 배양한 세포 상층액 샘플을 채취한 후 엘라이자 (ELISA) 기법으로 염증성 사이토카인의 양을 측정하여 도 7a 내지 7c 및 표 5 내지 표 7에 나타내었다.

ATP에 의한 IL-1β 방출량
LPS (ng/ml)	-	100	100	100	100	100
ATP (mM)	-	-	1	1	1	1
에스타피아틴 (μM)	-	-	-	1	2	4
IL-1β (pg/ml)	0	0	3328	1394	307	0

Nigericin에 의한 IL-1β 방출량
LPS (ng/ml)	-	100	100	100	100	100
나이제리신 (μM)	-	-	2.5	2.5	2.5	2.5
에스타피아틴 (μM)	-	-	-	1	2	4
IL-1β (pg/ml)	0	0	8153	4758	2928	888.5

MSU에 의한 IL-1β 방출량
LPS (ng/ml)	-	100	100	100	100	100
MSU (μg/ml)	-	-	200	200	200	200
에스타피아틴 (μM)	-	-	-	1	2	4
IL-1β (pg/ml)	0	0	7906	5948	1397	0

도 7a 내지 7c 및 표 5 내지 표 7에서 확인할 수 있듯이, 에스타피아틴은 ATP, 나이제리신, MSU에 의해 증가된 카스파제 1 (caspase1)의 분열 (cleavage) 및 IL-1β 성숙 (maturation)을 농도 의존적으로 억제함을 확인할 수 있었다. 특히 에스타피아틴을 4μM 처리하는 경우 카스파제 1의 분열 및 IL-1β 성숙을 효과적으로 억제하는 것을 알 수 있었다.

3-2. 카스파제 1, IL-1β 및 β-actin 단백질 생성량을 측정

분화된 대식세포를 1x10⁶셀/ml 농도로 12 웰플레이트에 1 ml씩 시딩하였다. 그 후, 37°C, 5% CO₂ 조건에서 12 시간 동안 안정화하였다. 배양한 세포의 상층액을 제거한 후 무혈청 배지에 LPS를 100 ng/ml 농도로 450ul 처리하여 5시간 동안 프라이밍하였다. 에스타피아틴을 10, 20 또는 40 μM 농도로 희석하여 50 ul씩 첨가하였다 (1. 2 또는 4μM 농도로 작용). 1 시간 후, ATP (10 mM 농도로 50 ul 첨가 후 30분 배양), 나이제리신 (25μM 농도로 50ul 첨가 후 30분 배양), MSU (2 mg/ml 농도로 50ul 첨가 후 4시간 배양)를 각각 처리하였다. 부착된 세포와 배양액을 함께 트리톤 X-100 세포 용해 버퍼로 균질화 하였다. 각각의 시료에서 단백질을 추출한 후 웨스턴 블롯 (western blot)으로 카스파제 1, IL-1β 및 β-actin 단백질 생성량을 측정하여 도 8a 내지 8c에 나타내었다.

도 8a 내지 8c에서 확인할 수 있듯이, 에스타피아틴이 ATP, 나이제리신, MSU에 의해 증가된 카스파제 1 의 분열 및 IL-1β 성숙을 농도 의존적으로 억제하였다.

실험예 4: 에스타피아틴의 항염증 효능 검증

4-1. 염증성 사이토카인 생성 억제효과 측정

LPS (2.5 mg/kg) 200μl를 8주령의 암컷 C57BL/6 마우스의 복강에 투여하여 패혈성 쇼크 (septic shock)를 유도하였다. 그 직후, 1.25 또는 2.5 mg/kg의 에스타피아틴 200ul를 각각 복강에 투여하였다. 대조군에는 동일한 용량의 식염을 복강에 투여하였다. 투여 4시간 후 안와정맥총에서 혈액을 채취하였다. 안락사 후 1 ml의 PBS를 복강 내로 투여하한 후, 복강 내 삼출액을 채취하였다. 복강 내 삼출액과 응고된 혈액을 15000 RPM에서 10분간 원심분리하여 상층액만을 분리하였다. 엘라이자 (ELISA)로 각 시료의 염증성 사이토카인 양을 측정하여 도 9a 내지 10e 및 표 8 내지 표 9에 나타냈다.

혈청 (Serum) 내 염증성 사이토카인
LPS (mg/kg)	-	2.5	2.5	2.5
에스타피아틴 (mg/kg)	-	-	1.25	2.5
IL-6 (pg/ml)	0	88663	67310	47245
TNF-α (pg/ml)	0	742.8	589.8	204.7
IL-1β (pg/ml)	459.5	772.1	609.4	543.6
CXCL1 (pg/ml)	0	97143	64244	38472
CXCL2 (pg/ml)	232.4	24146	23708	11805

복강액 (Peritoneal fluid) 내 염증성 사이토카인
LPS (mg/kg)	-	2.5	2.5	2.5
에스타피아틴 (mg/kg)	-	-	1.25	2.5
IL-6 (pg/ml)	0	29848	6521	6527
TNF-α (pg/ml)	0	0	0	0
IL-1β (pg/ml)	0	91.72	2.808	36.1
CXCL1 (pg/ml)	0	74303	70685	51835
CXCL2 (pg/ml)	10.84	3162	2804	1408

도 9a 내지 10e 및 표 8 내지 표 9에서 확인할 수 있듯이, 에스타피아틴을 투여한 마우스에서는 LPS에 의한 염증성 사이토 카인의 생성이 농도의존적으로 억제됨을 확인하였다. 즉, 에스타피아틴이 항염증용 조성물로 유용하게 사용할 수 있음을 알 수 있었다.

4-2. 치사율 (Lethality) 개선효과 측정

LPS (25 mg/kg) 200μl를 8주령의 암컷 C57BL/6 마우스의 복강에 투여하여 패혈성 쇼크를 유도하였다. 그 직후, 1.25 또는, 2.5 mg/kg의 에스타피아틴 200ul를 각각 복강에 투여하였다. 대조군에는 동일한 용량의 식염을 복강에 투여하였다. 그리고 4시간마다 마우스의 생존률을 확인하여 도 11에 나타냈다.

도 11에서 확인할 수 있듯이, 에스타피아틴을 투여한 마우스에서는 LPS에 의한 치사율이 농도의존적으로 개선됨을 확인하였다. 즉, 에스타피아틴이 항염증용 조성물로 유용하게 사용할 수 있음을 알 수 있었다.

Claims

하기 구조식 I로 표시되는 에스타피아틴을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 예방 또는 치료용 약제학적 조성물:

[구조식 I]

.
제1항에 있어서, 상기 염증성 질환은 감염성 염증질환, 자가면역질환, 염증성 장질환 및 통풍으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것인, 염증성 질환 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
제2항에 있어서, 상기 감염성 염증질환은 폐렴, 위염, 뇌수막염, 치주염, 간염, 패혈증, 기관지염, 중이염, 부비동염, 인후염 및 골수염으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것인, 염증성 질환 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
제2항에 있어서, 상기 자가면역질환은 류마티스 관절염, 전신 홍반성 루푸스, 쇼그렌 증후군, 전신 경화증, 혈관염, 피부근염 및 다발근염으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것인, 염증성 질환 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
제2항에 있어서, 상기 염증성 장질환은 궤양성 대장염, 궤양성 십이지장염, 크론병, 장염 및 허혈성 대장염으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것인, 염증성 질환 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 에스타피아틴은 비쑥 (Artemisia scoparia) 추출물 유래인 것인, 염증성 질환 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
제6항에 있어서, 상기 비쑥 추출물은 물, 메탄올, 에탄올 또는 이들의 조합으로 이루어진 용매로 추출한 조추출물인 것인, 염증성 질환 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
제7항에 있어서, 상기 비쑥 추출물은 상기 조추출물을 노멀헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트 및 수포화부탄올로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 용매로 분획한 것인, 염증성 질환 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
제6항에 있어서, 상기 비쑥은 비쑥의 잎, 줄기, 열매, 뿌리 및 꽃으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것인, 염증성 질환 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
하기 구조식 I로 표시되는 에스타피아틴을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 예방 또는 개선용 식품 조성물:

[구조식 I]

.
제10항에 있어서, 상기 염증성 질환은 감염성 염증질환, 자가면역질환, 염증성 장질환 및 통풍으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것인, 염증성 질환 예방 또는 개선용 식품 조성물.
제11항에 있어서, 상기 감염성 염증질환은 폐렴, 위염, 뇌수막염, 치주염, 간염, 패혈증, 기관지염, 중이염, 부비동염, 인후염 및 골수염으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것인, 염증성 질환 예방 또는 개선용 식품 조성물.
제11항에 있어서, 상기 자가면역질환은 류마티스 관절염, 전신 홍반성 루푸스, 쇼그렌 증후군, 전신 경화증, 혈관염, 피부근염 및 다발근염으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것인, 염증성 질환 예방 또는 개선용 식품 조성물.
제11항에 있어서, 상기 염증성 장질환은 궤양성 대장염, 궤양성 십이지장염, 크론병, 장염 및 허혈성 대장염으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것인, 염증성 질환 예방 또는 개선용 식품 조성물.
제10항에 있어서, 상기 에스타피아틴은 비쑥 (Artemisia scoparia) 추출물 유래인 것인, 염증성 질환 예방 또는 개선용 식품 조성물.
제15항에 있어서, 상기 비쑥 추출물은 물, 메탄올, 에탄올 또는 이들의 조합으로 이루어진 용매로 추출한 조추출물인 것인, 염증성 질환 예방 또는 개선용 식품 조성물.
제16항에 있어서, 상기 비쑥 추출물은 상기 조추출물을 노멀헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트 및 수포화부탄올로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 용매로 분획한 것인, 염증성 질환 예방 또는 개선용 식품 조성물.
제15항에 있어서, 상기 비쑥은 비쑥의 잎, 줄기, 열매, 뿌리 및 꽃으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것인, 염증성 질환 예방 또는 개선용 식품 조성물.