WO2023074491A1 - プロテオグリカンの製造方法 - Google Patents
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Definitions
- the present invention relates to, for example, a method for producing plant-derived proteoglycans, including a step of extracting proteoglycans from plants.
- Proteoglycan (hereinafter sometimes referred to as "PG") is a glycoprotein in which several to several tens of glycosaminoglycans such as chondroitin sulfate and keratan sulfate are covalently bound to one core protein. As one of the matrices, it is widely distributed in the body such as skin and cartilage. PG in cartilage forms aggregates with collagen and hyaluronic acid, and a typical cartilage-type PG is called aggrecan. Aggrecan has a large amount of glycosaminoglycan sugar chains bound to its core protein, and has a binding region for hyaluronic acid and link protein on its N-terminal side.
- Glycosaminoglycans have a long straight-chain structure with no branches, and are negatively charged because they have many sulfate groups and carboxyl groups. In addition, due to the water affinity of sugar, it retains a large amount of water and is responsible for functions unique to cartilage such as elasticity and resistance to impact. Furthermore, PG has been found to have many physiological functions such as anti-inflammatory action, promotion of hyaluronic acid synthesis, and epidermal growth factor (EGF)-like action, and is expected to be applied to foods and cosmetics.
- EGF epidermal growth factor
- animal-derived proteoglycans for example, proteoglycans derived from salmon nasal cartilage and squid head cartilage are known.
- the present invention was made under such circumstances, and its purpose is to provide a method for producing plant-derived proteoglycans having excellent physiological effects from plants.
- a plant-derived proteoglycan containing a predetermined amount of arabinogalactan-protein can be produced efficiently and with a predetermined purity from gaddigum, and have completed the present invention. rice field.
- the present invention includes the following embodiments.
- the lower limit of the molecular weight is more preferably 1,000, still more preferably 200,000, and still more preferably 300,000.
- the upper limit of the molecular weight is more preferably 500,000, still more preferably 400,000.
- the method for producing plant-derived proteoglycans of the present invention can produce plant-derived proteoglycans having excellent physiological effects from plants.
- FIG. 2 shows the results of HPLC analysis of the composition of Production Example 1.
- Plant-derived proteoglycan The "plant-derived proteoglycan” in the present invention is obtained through a process such as extraction from a part of a plant belonging to the family Compositae (including sap such as Gadigum).
- the present inventor has devised the present invention based on the idea that a composition containing arabinogalactan-protein (AGP) with high purity and/or high efficiency can be produced by using parts of the plant.
- AGP arabinogalactan-protein
- Plants belonging to the family Quisqualis indica L. are distributed in southern China and Southeast Asia, and are evergreen climbing woody plants that are cultivated for medicinal and ornamental purposes. It is shrub-like in the early stages of growth, but then grows about 10m while entwining with other things.
- Gatinoki is a deciduous tree that grows naturally in the forests of central India and is characterized by its smooth white bark.
- Gum ghatti is a dried and hardened sap secreted from a crack in the trunk of Anogeiissus latifolia Wallich, also known as Indian Gum.
- Gum ghatti is a water-soluble polysaccharide composed mainly of arabinose, galactose, mannose, xylose, and glucuronic acid, and exists mainly as Ca, Mg, and K salts in nature.
- Gaddi gum usually dissolves in water up to about 30% by mass at room temperature or higher.
- Gaddi gum contains about 3% protein and forms a "polysaccharide-protein complex" like gum arabic (Patent Document 2).
- Plant-derived proteoglycan in the present invention also includes arabinogalactan-protein (AGP).
- Arabinogalactan-protein (AGP) is a proteoglycan that is ubiquitously distributed in plant tissues and is mainly localized in the cell wall (extracellular matrix).
- AGP generally consists of a core protein rich in hydroxyproline (Hyp) bound to arabinogalactan (AG) sugar chains rich in galactose (Gal) and L-arabinose (L-Ara).
- Hyp hydroxyproline
- AG arabinogalactan
- Gal galactose
- L-Ara L-arabinose
- the solvent used in the present invention can be appropriately selected from, for example, acetic acid, water, citric acid, alkaline solution, surfactant solution, and the like.
- powdered cellulose includes cellulose fibers (Nippon Paper Industries Co., Ltd.; KC Flock W-50 (S), KC Flock W-50, KC Flock W-100, KC Flock W-100G, KC Flock W-200, KC Flock W-200G, KC Flock W-250, KC Flock W-300G, KC Flock W-400G, NP Fiber W-100F, NP Fiber W-300F, NP Fiber W-10MG2, NP Fiber W-06MG, KC Flock W- 50GK, KC Floc W-100GK, manufactured by Rettenmeyer; VITACEL-L10, VITACEL-L20, VITACEL-L600-30, VITACEL-L90, ARBOCEL-BMW40, VITACEL-L500) and the like
- a fibrous nonwoven fabric mainly made of polypropylene is preferable.
- examples thereof include Maeda Kosen Co., Ltd.; oil adsorption sheet SP-1300N (DX), oil adsorption sheet SP-1100N, Nippon Paper Crecia Co., Ltd.; oil adsorption mat PP-100 series, Tanaka Sangyo Co., Ltd. ); LOOKLIN A-50, LOOKLIN B-50, and other fibrous nonwoven fabrics made from polyolefin and polyester, Nippon Paper Crecia Co., Ltd.; Co., Ltd.;
- the present invention will be described in more detail with reference to Examples, but the present invention is not limited to these Examples.
- the unit % of numerical values indicating the addition amount of various components means % by mass.
- Ultrafiltration Step Purified water was added to the filtrate obtained through a membrane filter with a pore size of 0.45 ⁇ m to prepare a solution used in the ultrafiltration step. Ultrafiltration was performed on the prepared solution to remove the solution with a molecular weight of 50,000 or less, and the solution with a molecular weight of more than 50,000 (39 kg) was recovered.
- Filtration step 2 The solution (39 kg) having a molecular weight of more than 50,000 recovered in the step of (1) was passed through a membrane filter with a pore size of 0.45 ⁇ m, and the filtered solution was recovered.
- a dried product (1.4 kg of a composition containing proteoglycans derived from gaddigum) was obtained by freeze-drying the filtrate obtained from the step of .
- AGP Qualitative Analysis It was confirmed whether the composition of Production Example 1 contained arabinogalactan-protein (AGP). The confirmation was performed by Yarib precipitation using Yarib reagent (Biosupplies Australia Pty Ltd, 100-2) which specifically binds to AGP. The property of precipitating as an AGP-Yaribu reagent complex in an aqueous sodium chloride (NaCl) solution was utilized. The composition of Production Example 1 was dissolved in a 0.15 M sodium chloride (NaCl) aqueous solution. The Yariv reagent was also dissolved in 0.15 M sodium chloride (NaCl) aqueous solution. Equal amounts of the prepared solutions were mixed and allowed to stand overnight at 4°C.
- composition of Production Example 1 contained arabinogalactan-protein (AGP). From this confirmation, it was confirmed that the composition of Production Example 1 contained plant-derived proteoglycan.
- the breakdown of the sugar and protein contents in the composition of Production Example 1 was as follows. ⁇ Arabinose (39.3%), galactose (33.6%), glucuronic acid (4.5%), mannose (2.5%), xylose (1.6%), rhamnose (1%), protein ( 2%), others (15.5%)
- HPLC analysis The composition of Production Example 1 was analyzed by HPLC. About 1 g of the composition (dry product) obtained from Production Example 1 was precisely weighed, and a phosphate buffer (pH 6.8) was added to make exactly 10 mL, which was used as a sample solution. After each sample was passed through a 0.45 ⁇ m membrane filter, HPLC was performed under the following operating conditions, and the molecular weight was determined from the following calibration curve.
- the molecular weight at the peak top was obtained from a calibration curve prepared using Shodex STANDARD P-82 (manufactured by Showa Denko) as a molecular weight marker.
- a calibration curve standard pullulan was prepared in the range of molecular weights from 5,000 to 800,000.
- HPLC analyzer Detector Differential refractive index detector (RID-10A manufactured by Shimadzu Corporation) Column: Gel filtration column (TSKgel G5000PWXL manufactured by Tosoh Corporation) Column temperature: 40°C Sample injection volume: 50 ⁇ L Mobile phase: phosphate buffer (pH 6.8) Flow rate: 0.5mL/min
- Figure 1 shows the results of HPLC.
- the peak top molecular weight calculated from the column retention time was 300,000 to 400,000.
- the medium was replaced with a basal epidermal keratinocyte growth medium excluding FGF and BPE (bovine pituitary gland extract) as a growth additive, and the following samples were administered to each well, under an environment of 37°C and 5% CO2 . and cultured for 3 days.
- the number of human epidermal keratinocytes in each group was measured using Cell Counting Kit-8. The measurement was performed on 5 samples in each group (groups of samples 1 to 5).
- Table 1 shows relative values when the average value of the sample 1 group is set to 100 using the results of calculating the average value of 5 samples in each group. "**" in Table 1 indicates a significant difference (p ⁇ 0.05) by Dunnett's test compared to the sample 1 group values.
- - Group of sample 1 As a control, a predetermined amount of purified water was added. • Sample 2 group: the composition obtained in Production Example 1 was added to a final concentration of 200 ⁇ g/mL. Group of samples 3: Add the composition obtained in Production Example 1 to a final concentration of 400 ⁇ g/mL. - Group of samples 4: Add a commercially available gum arabic-containing composition to a final concentration of 200 ⁇ g/mL. - Group of samples 5: Add a commercially available gum arabic-containing composition to a final concentration of 400 ⁇ g/mL.
- gum arabic As a commercially available composition containing gum arabic, gum arabic (Fuji Film Wako Pure Chemical Industries, Ltd., 016-00025, CAS RN TM : 9000-01-5) was used.
- Test Example 2 Human Fibroblast Proliferation Test The composition obtained in Production Example 1 was evaluated for the ability to proliferate human fibroblasts.
- a 96-well plate was prepared in which each well contained DMEM medium containing 5% FBS (manufactured by Thermo Trace).
- Normal human dermal fibroblasts (Kurabo) were seeded in the prepared 96-well plate so that each well had a cell number of 4 ⁇ 10 3 cells/well. After seeding, the normal human dermal fibroblasts were cultured for 24 hours in an environment of 37° C. and 5% CO 2 .
- the DMEM medium containing 5% FBS manufactured by Thermo Trace
- the normal human dermal fibroblasts were cultured for 3 days under the same conditions. After 3 days of culture, the number of normal human skin fibroblasts in each group (Sample 1 to Sample 5 groups) was measured using Cell Counting Kit-8 (DOJINDO). The measurement was performed on 5 samples in each group (groups of samples 1 to 7). Table 2 below shows the relative values when the average value of the sample 1 group is set to 100 using the results of calculating the average value of 5 samples in each group.
- - Group of sample 1 As a control, a predetermined amount of purified water was added.
- Sample 2 group the composition obtained in Production Example 1 was added to a final concentration of 10 ⁇ g/mL.
- - Group of samples 3 The composition obtained in Production Example 1 was added to a final concentration of 100 ⁇ g/mL.
- Sample 4 group The composition obtained in Production Example 1 was added to a final concentration of 1000 ⁇ g/mL.
- Group of samples 5 Add a commercially available gum arabic-containing composition to a final concentration of 10 ⁇ g/mL.
- - Group of samples 6 Add a commercially available gum arabic-containing composition to a final concentration of 100 ⁇ g/mL.
- • Group of samples 7 Add a commercially available gum arabic-containing composition to a final concentration of 1000 ⁇ g/mL.
- gum arabic As a commercially available composition containing gum arabic, gum arabic (Fuji Film Wako Pure Chemical Industries, Ltd., 016-00025, CAS RN TM : 9000-01-5) was used.
- Type 1 collagen production promoting activity (detection by ELISA) The composition obtained in Production Example 1 was evaluated for type 1 collagen production-promoting activity by ELISA.
- a 24-well plate was prepared in which each well contained DMEM medium containing 5% FBS (manufactured by Thermo Trace).
- Normal human dermal fibroblasts (Kurabo) were seeded in the prepared 24-well plate so that each well had a cell number of 2 ⁇ 10 4 cells/well. After seeding, the normal human skin fibroblasts were cultured at 37° C. and 5% CO 2 for 24 hours until they became confluent.
- Thermo Trace DMEM medium containing 5% FBS (manufactured by Thermo Trace) was replaced with the DMEM medium containing 0.25% FBS .
- the normal human dermal fibroblasts were cultured for 1 day under the following conditions.
- the production amount (ng/mL) of type 1 collagen in each group was evaluated using PIP EIA KIT (Takara Bio) for the cell culture supernatant after the culture. The measurement was performed for three samples in each group (groups of samples 1 to 3).
- Table 4 below shows the results of calculating the average value of 3 samples in each group. "**" in Table 3 indicates a significant difference (p ⁇ 0.05) by Dunnett's test compared to the sample 1 group mean.
- Sample 1 As a control, a predetermined amount of purified water was added. • Sample 2 group: the composition obtained in Production Example 1 was added to a final concentration of 10 ⁇ g/mL. - Group of samples 3: The composition obtained in Production Example 1 was added to a final concentration of 100 ⁇ g/mL.
- Type 1 collagen gene expression (detection by qRT-PCR) Type 1 collagen gene expression for the composition obtained in Production Example 1 was evaluated by qRT-PCR.
- Normal human dermal fibroblasts (Kurabo) were seeded in the prepared 24-well plate so that each well had a cell number of 2 ⁇ 10 4 cells/well. After seeding, the normal human skin fibroblasts were cultured at 37° C. and 5% CO 2 for 24 hours until they became confluent. After that, the DMEM medium was replaced with a test DMEM medium (a serum-free medium unlike Test Example 2), and cultured for an additional 24 hours.
- Table 4 shows relative values when the average value of the sample 1 group is set to 100 using the results of calculating the average value of 3 samples in each group. "**" in Table 4 indicates a significant difference (p ⁇ 0.05) by Dunnett's test compared to the values of the sample 1 group.
- Sample 1 As a control, a predetermined amount of purified water was added. • Sample 2 group: the composition obtained in Production Example 1 was added to a final concentration of 10 ⁇ g/mL. - Group of samples 3: The composition obtained in Production Example 1 was added to a final concentration of 100 ⁇ g/mL.
- the lotion shown in Table 5 (Table 5 lotion) is applied to the left half of the subject's face at predetermined intervals, and the lotion shown in Table 6 (Table 6 lotion) is applied to the right half of the subject's face at predetermined intervals. bottom. This predetermined interval is twice a day (morning and evening) for four weeks. After 4 weeks, an amount of 24 g of Table 5 lotion and 24 g of Table 6 lotion was applied per subject. Measurements (wrinkles, etc.) were performed on day 0 before application of these lotions and on 4 weeks after application of the lotions.
- ANTERA 3D TM Measurement of presence or absence of wrinkles
- ANTERA 3D TM Measurement of nasolabial folds
- the presence or absence of blemishes was determined by measuring the number of blemishes on half of the face (from the lower eyelid to the entire cheek area). The measurement was performed using VISIA TM Evolution (VISIA-Evo, Canfield Scientific). When the value of Table 5 lotion application group and Table 6 lotion application group on day 0 (before the application) was set to 100, the value of Table 6 lotion application group was 103.78 after 4 weeks, but Table 5 lotion The coated group was 97.79.
- Presence or absence of porphyrin was determined by measuring the number of spots on half of the face (from the lower eyelid to the entire cheek). The measurement was performed using VISIA TM Evolution (VISIA-Evo, Canfield Scientific). When the value of Table 5 lotion application group and Table 6 lotion application group on day 0 (before the application) was 100, the value of Table 6 lotion application group was 100.03 after 4 weeks, but Table 5 lotion The applied group was 83.96 (p ⁇ 0.01 (Wilcoxon test) compared to the value of the Table 5 lotion applied group on day 0).
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Abstract
本発明は、例えば、植物からプロテオグリカンを抽出する工程などを含む植物由来のプロテオグリカンの製造方法、に関する。 溶媒を水としてガディガムを溶解する工程、当該溶解する工程で得られる溶解液の分子量分画を行う工程を含む、分子量が１万より大きく５００万以下の植物由来のプロテオグリカンの製造方法。
Description
本出願は、日本国において、２０２１年１１月１日に出願された特願２０２１－１７８５７７号に基づく優先権を主張するものであり、当該出願に記載された内容はすべて参照によりそのまま本明細書に援用される。
本発明は、例えば、植物からプロテオグリカンを抽出する工程などを含む植物由来のプロテオグリカンの製造方法、に関する。
プロテオグリカン（以下「ＰＧ」と称する場合がある。）は、１本のコアタンパク質にコンドロイチン硫酸、ケラタン硫酸等のグリコサミノグリカンが数本から数十本、共有結合した糖タンパク質であり、細胞外マトリックスの一つとして皮膚や軟骨など体内に広く分布している。軟骨中のＰＧは、コラーゲンやヒアルロン酸と共に凝集体を形成しており、代表的な軟骨型ＰＧは、アグリカンと称される。アグリカンはコアタンパク質に大量のグリコサミノグリカン糖鎖が結合すると共に、そのＮ末端側には、ヒアルロン酸およびリンクタンパク質の結合領域を有する。
グリコサミノグリカンは分岐をもたない長い直鎖構造を持ち、多数の硫酸基とカルボシキル基を持つため負に荷電しており、その電気的反発力のために伸びた形状をとる。また、糖の持つ水親和性により、多量の水を保持し、弾力や衝撃への耐性といった軟骨特有の機能を担っている。さらに、ＰＧには抗炎症作用、ヒアルロン酸合成促進作用、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）様作用等多くの生理機能を有することが明らかとなり、食品や化粧品への応用に期待が寄せられている。動物由来のプロテオグリカンとしては、例えば、サケ鼻軟骨、イカ頭部軟骨を由来としたものが知られている。
しかし、動物由来のプロテオグリカンは軟骨に微量に存在する物質であるため、製造コストが高いという問題があった。また、化粧品市場や食品市場においては、動物由来成分よりも植物由来成分の方がイメージに優れるため、動物性プロテオグリカンも植物由来成分で代替することが求められていた（特許文献１）。
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｊａｐａｎｅｓｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ８９（４）： ４９８－５０７ （２０１７）
本発明は、このような状況下においてなされたものであってその目的とするところは、植物から優れた生理作用を有する植物由来のプロテオグリカンを製造する方法を提供することなど、である。
上記課題を解決するために、本発明者らは、ガディガムから、アラビノガラクタン－プロテインを所定量含む植物由来のプロテオグリカンを効率的及び所定の純度で製造できることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下の実施形態を含む。
（１）溶媒を水としてシクンシ科の植物の部位を溶解する工程、
当該溶解する工程で得られる溶解液の分子量分画を行う工程、を含む分子量が１万より大きく５００万以下の植物由来のプロテオグリカンの製造方法。
（２）分子量が５万より大きく１００万以下の植物由来のプロテオグリカンを製造する、（１）記載の方法。当該分子量の下限は、より好ましくは１０００、更に好ましくは２０万、更に好ましくは３０万、である。当該分子量の上限は、より好ましくは５０万、更に好ましくは４０万、である。
（３）公称孔径０．１～２５０μｍ（より好ましくは０．１～１０μｍ）の精密濾過膜を用いる、（１）又は（２）記載の方法。
（１）溶媒を水としてシクンシ科の植物の部位を溶解する工程、
当該溶解する工程で得られる溶解液の分子量分画を行う工程、を含む分子量が１万より大きく５００万以下の植物由来のプロテオグリカンの製造方法。
（２）分子量が５万より大きく１００万以下の植物由来のプロテオグリカンを製造する、（１）記載の方法。当該分子量の下限は、より好ましくは１０００、更に好ましくは２０万、更に好ましくは３０万、である。当該分子量の上限は、より好ましくは５０万、更に好ましくは４０万、である。
（３）公称孔径０．１～２５０μｍ（より好ましくは０．１～１０μｍ）の精密濾過膜を用いる、（１）又は（２）記載の方法。
本発明の植物由来のプロテオグリカンの製造方法は、植物から優れた生理作用を有する植物由来のプロテオグリカンを製造することができる。
本発明を実施形態に即して説明する。
（由来する）
本願の明細書等中、「由来する」なる語句は、以下（１）から（３）を包含することを意図して用いられる。
（１）精製されていること、
（２）単離されていること、及び／又は
（３）改変［これは、低分子化処理、及び高分子化処理（重合）を包含する］若しくは修飾されていること
本願の明細書等中、「由来する」なる語句は、以下（１）から（３）を包含することを意図して用いられる。
（１）精製されていること、
（２）単離されていること、及び／又は
（３）改変［これは、低分子化処理、及び高分子化処理（重合）を包含する］若しくは修飾されていること
（植物由来のプロテオグリカン）
本発明における「植物由来のプロテオグリカン」は、シクンシ科の植物の部位（ガディガムなどの樹液も含む）から抽出等の工程を経て得られるものである。本発明者は、当該植物の部位を用いることで、高純度及び／又は高効率でアラビノガラクタン－プロテイン（ＡＧＰ）が含有された組成物を製造できると考え、本発明を発明した。
本発明における「植物由来のプロテオグリカン」は、シクンシ科の植物の部位（ガディガムなどの樹液も含む）から抽出等の工程を経て得られるものである。本発明者は、当該植物の部位を用いることで、高純度及び／又は高効率でアラビノガラクタン－プロテイン（ＡＧＰ）が含有された組成物を製造できると考え、本発明を発明した。
シクンシ科（Ｑｕｉｓｑｕａｌｉｓ ｉｎｄｉｃａ Ｌ．）の植物は、中国南部や東南アジアなどに分布し、薬用や観賞用に栽培されている常緑のつる性木本植物である。生育初期には低木状だが、その後、他物に絡みつきながら１０ｍくらい伸長する。
ガティノキは、主にインド中部の森林に自生し、滑らかな白色の樹皮が特徴的な落葉喬木である。
ガティガムは、シクンシ科ガティノキ（Ａｎｏｇｅｉｓｓｕｓ ｌａｔｉｆｏｌｉａ Ｗａｌｌｉｃｈ）の幹の裂傷から分泌される樹液が乾燥固化したもので、別名Ｉｎｄｉａｎ Ｇｕｍとも呼ばれる。ガティガムの主成分は、アラビノース、ガラクトース、マンノース、キシロース、及びグルクロン酸を構成糖とする水溶性多糖類で、天然には主にＣａ、Ｍｇ、Ｋ塩として存在する。ガディガムは、通常、室温、又はそれ以上の温度条件下で、３０質量％程度まで水に溶解する。ガディガムは、約３％のタンパク質を含み、アラビアガムと同様に「多糖タンパク質複合体」を形成する（特許文献２）。
本発明における「植物由来のプロテオグリカン」は、アラビノガラクタン－プロテイン（ＡＧＰ）も含む。アラビノガラクタン－プロテイン（ＡＧＰ）は植物組織に普遍的に分布しているプロテオグリカンで、主に細胞壁（細胞外マトリックス）に局在している。ＡＧＰは一般的にはヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）に富むコアタンパク質に、ガラクトース（Ｇａｌ）とＬ－アラビノース（Ｌ－Ａｒａ）に富むアラビノガラクタン（ＡＧ）糖鎖が結合している。コアタンパク質の種類も多く、糖鎖の構造も複雑で多様性に富んでいる（非特許文献１）。
本発明で使用する溶媒は、例えば、酢酸、水、クエン酸、アルカリ溶液、界面活性剤溶液などを適宜選択できる。
プロテオグリカン抽出液を粉末セルロース及び／又は吸油マットなどを用いることにより、混入する脂質成分などを簡便に吸着除去することも可能である。例えば、粉末セルロースとしてはセルロースファイバー（日本製紙（株）；ＫＣフロックＷ－５０（Ｓ）、ＫＣフロックＷ－５０、ＫＣフロックＷ－１００、ＫＣフロックＷ－１００Ｇ、ＫＣフロックＷ－２００、ＫＣフロックＷ－２００Ｇ、ＫＣフロックＷ－２５０、ＫＣフロックＷ－３００Ｇ、ＫＣフロックＷ－４００Ｇ、ＮＰファイバーＷ－１００Ｆ、ＮＰファイバーＷ－３００Ｆ、ＮＰファイバーＷ－１０ＭＧ２、ＮＰファイバーＷ－０６ＭＧ、ＫＣフロックＷ－５０ＧＫ、ＫＣフロックＷ－１００ＧＫ、レッテンマイヤー社製；ＶＩＴＡＣＥＬ－Ｌ１０、ＶＩＴＡＣＥＬ－Ｌ２０、ＶＩＴＡＣＥＬ－Ｌ６００－３０、ＶＩＴＡＣＥＬ－Ｌ９０、ＡＲＢＯＣＥＬ－ＢＭＷ４０、ＶＩＴＡＣＥＬ－Ｌ５００）などが挙げられる。吸油マットとしては、主にポリプロピレンを原料とする繊維不織布が好ましい。その例として、例えば前田工繊（株）製；油吸着シートＳＰ－１３００Ｎ（ＤＸ）、油吸着シートＳＰ－１１００Ｎ、日本製紙クレシア（株）製；オイル吸着マットＰＰ－１００シリーズ、田中産業（株）；ルックリンＡ－５０、ルックリンＢ－５０、その他、ポリオレフィンとポリエステルを原料とする繊維不織布として、日本製紙クレシア（株）製；パワフルＥＣＯシリーズ、主にコットンを原料とする吸油マットとして、大王製紙（株）；プロワイプ・コットンオイルマットなどが挙げられる。
次に実施例を挙げ、本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例に何ら制約されるものではない。なお、以下の実施例において、各種成分の添加量を示す数値の単位％は、質量％を意味する。
（製造例１：ガディガム由来のプロテオグリカンを含有する組成物の製造）
以下のように、当該組成物を製造した。
以下のように、当該組成物を製造した。
１．溶解工程
ガティガム（２．５ｋｇ）を、２０倍の精製水（５０ｋｇ）に、溶解させた。
ガティガム（２．５ｋｇ）を、２０倍の精製水（５０ｋｇ）に、溶解させた。
２．限外ろ過工程
孔径０．４５μｍのメンブレンフィルターを通して得られた濾過液に精製水を加えて、限外ろ過工程で用いる溶液を作製した。当該作製した溶液に対して、限外ろ過を行い、分子量５万以下の溶液を除去して、分子量５万超の溶液（３９ｋｇ）を回収した。
孔径０．４５μｍのメンブレンフィルターを通して得られた濾過液に精製水を加えて、限外ろ過工程で用いる溶液を作製した。当該作製した溶液に対して、限外ろ過を行い、分子量５万以下の溶液を除去して、分子量５万超の溶液（３９ｋｇ）を回収した。
３．濾過工程
２．の工程により回収した分子量５万超の溶液（３９ｋｇ）を、孔径０．４５μｍのメンブレンフィルターに通し、当該通った濾過液を回収した。
２．の工程により回収した分子量５万超の溶液（３９ｋｇ）を、孔径０．４５μｍのメンブレンフィルターに通し、当該通った濾過液を回収した。
４．凍結乾燥
３．の工程より得られた濾過液凍結乾燥により、乾燥物（ガディガム由来のプロテオグリカンを含有する組成物１．４ｋｇ）を得た。
３．の工程より得られた濾過液凍結乾燥により、乾燥物（ガディガム由来のプロテオグリカンを含有する組成物１．４ｋｇ）を得た。
なお、この乾燥物だが、２０℃の水１００ｍＬに対して１０ｇ溶解する。この溶解によりできた溶液は透明であった。
（製造例１の組成物の分析）
製造例１の組成物の以下分析等を行った。
（１）ＡＧＰ定性分析
（２）糖組成分析
（３）ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙによるタンパク質含有量の定量
（４）アミノ酸自動分析装置を用いてのアミノ酸の分析
（５）ＨＰＬＣ分析
製造例１の組成物の以下分析等を行った。
（１）ＡＧＰ定性分析
（２）糖組成分析
（３）ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙによるタンパク質含有量の定量
（４）アミノ酸自動分析装置を用いてのアミノ酸の分析
（５）ＨＰＬＣ分析
（１）ＡＧＰ定性分析
製造例１の組成物に、アラビノガラクタン―プロテイン（ＡＧＰ）が含有されているかを確認した。ＡＧＰに特異的に結合するヤリブ試薬（Ｂｉｏｓｕｐｐｌｉｅｓ Ａｕｓｔｒａｌｉａ Ｐｔｙ Ｌｔｄ、１００－２）を用いて、ヤリブ沈殿により当該確認を行った。塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）水溶液ではＡＧＰ－ヤリブ試薬複合体として沈殿する性質を利用した。製造例１の組成物を０．１５Ｍ塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）水溶液に溶解させた。ヤリブ試薬も０．１５Ｍ塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）水溶液に溶解させた。調整した溶液を等量混合し、４℃で一晩静置した。当該静置後、当該溶液の沈殿を見たところ、赤色の沈殿を確認した。当該確認より、製造例１の組成物に、アラビノガラクタン―プロテイン（ＡＧＰ）が含有されていることを確認した。この確認により、製造例１の組成物が植物由来のプロテオグリカンを含有していることを確認した。
製造例１の組成物に、アラビノガラクタン―プロテイン（ＡＧＰ）が含有されているかを確認した。ＡＧＰに特異的に結合するヤリブ試薬（Ｂｉｏｓｕｐｐｌｉｅｓ Ａｕｓｔｒａｌｉａ Ｐｔｙ Ｌｔｄ、１００－２）を用いて、ヤリブ沈殿により当該確認を行った。塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）水溶液ではＡＧＰ－ヤリブ試薬複合体として沈殿する性質を利用した。製造例１の組成物を０．１５Ｍ塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）水溶液に溶解させた。ヤリブ試薬も０．１５Ｍ塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）水溶液に溶解させた。調整した溶液を等量混合し、４℃で一晩静置した。当該静置後、当該溶液の沈殿を見たところ、赤色の沈殿を確認した。当該確認より、製造例１の組成物に、アラビノガラクタン―プロテイン（ＡＧＰ）が含有されていることを確認した。この確認により、製造例１の組成物が植物由来のプロテオグリカンを含有していることを確認した。
（２）糖組成分析
糖組成分析を行ったが、製造例１の組成物には、糖が約８３％含有されていた。
糖組成分析を行ったが、製造例１の組成物には、糖が約８３％含有されていた。
製造例１の組成物における、糖及びタンパク質の含有量の内訳は以下の通りであった。
・アラビノース（３９．３％）、ガラクトース（３３．６％）、グルクロン酸（４．５％）、マンノース（２．５％）、キシロース（１．６％）、ラムノース（１％）、タンパク質（２％）、その他（１５．５％）
・アラビノース（３９．３％）、ガラクトース（３３．６％）、グルクロン酸（４．５％）、マンノース（２．５％）、キシロース（１．６％）、ラムノース（１％）、タンパク質（２％）、その他（１５．５％）
（３）ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙによるタンパク質含有量の定量
ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙによるタンパク質含有量の定量にて、当該組成物に約２％のタンパク質を含有されていることを確認した。
ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙによるタンパク質含有量の定量にて、当該組成物に約２％のタンパク質を含有されていることを確認した。
（４）アミノ酸自動分析装置を用いてのアミノ酸の分析
アミノ酸の分析にて、当該組成物中のタンパク質において、約０．５％のヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）が含まれことを確認した。ヒドロキシプロリンは、植物性プロテオグリカンの糖鎖の結合点である。
アミノ酸の分析にて、当該組成物中のタンパク質において、約０．５％のヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）が含まれことを確認した。ヒドロキシプロリンは、植物性プロテオグリカンの糖鎖の結合点である。
（５）ＨＰＬＣ分析
製造例１の組成物のＨＰＬＣ分析を行った。製造例１の組成物（乾燥物）で得た品約１ｇを精密に量り、リン酸緩衝液（ｐＨ６．８）を加えて正確に１０ｍＬとしたものを試料溶液とした。各試料を０．４５μｍメンブレンフィルターに通した後、以下の操作条件でＨＰＬＣを行い以下検量線から分子量を求めた。
製造例１の組成物のＨＰＬＣ分析を行った。製造例１の組成物（乾燥物）で得た品約１ｇを精密に量り、リン酸緩衝液（ｐＨ６．８）を加えて正確に１０ｍＬとしたものを試料溶液とした。各試料を０．４５μｍメンブレンフィルターに通した後、以下の操作条件でＨＰＬＣを行い以下検量線から分子量を求めた。
また、分子量マーカーとして、Ｓｈｏｄｅｘ ＳＴＡＮＤＡＲＤ Ｐ－８２（昭和電工社製）を用いて作成した検量線からピークトップの分子量を求めた。なお、分子量５０００～８０００００の範囲の検量線（標準プルラン）を作成した。
操作条件
分析計：ＨＰＬＣ分析装置
検出器：示差屈折率検出器（ＲＩＤ－１０Ａ 島津製作所製）
カラム：ゲルろ過カラム（東ソー株式会社製ＴＳＫｇｅｌ Ｇ５０００ＰＷＸＬ）
カラム温度：４０℃
試料注入量：５０μＬ
移動相：リン酸緩衝液（ｐＨ６．８）
流量：０．５ｍＬ／ｍｉｎ
分析計：ＨＰＬＣ分析装置
検出器：示差屈折率検出器（ＲＩＤ－１０Ａ 島津製作所製）
カラム：ゲルろ過カラム（東ソー株式会社製ＴＳＫｇｅｌ Ｇ５０００ＰＷＸＬ）
カラム温度：４０℃
試料注入量：５０μＬ
移動相：リン酸緩衝液（ｐＨ６．８）
流量：０．５ｍＬ／ｍｉｎ
図１に、ＨＰＬＣの結果を示す。図１に示す結果において、カラムの保持時間から計算したピークトップの分子量は、３０万から４０万であった。
［試験例１］ヒト表皮角化細胞増殖試験
ヒト表皮角化細胞ＮＨＥＫ（成人表皮角化細胞、クラボウ、ＫＫ－４１０９）を、３×１０３個／ｗｅｌｌの細胞数となるように、当該準備した９６ウェルプレートに播種し、増殖添加剤を添加した表皮角化細胞増殖基本培地（ＫＢＭ培地、クラボウ）にて、３７℃、５％ＣＯ２の環境下で、２４時間、当該ヒト表皮角化細胞を培養した。その後、増殖添加剤としてＦＧＦ及びＢＰＥ（ウシ脳下垂体抽出物）を除いた表皮角化細胞増殖基本培地へ置換し、以下試料を各ウェルに投与し、３７℃、５％ＣＯ２の環境下で、３日間培養した。３日間の培養後、Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ－８を用いて、各群（試料１から試料５の群）のヒト表皮角化細胞数を測定した。当該測定は、各群（試料１から試料５の群）において５サンプルずつ行った。以下表１では、各群において５サンプルの平均値を算出した結果を用いて、試料１の群の平均値の値を１００としたときの相対値を示す。表１の「＊＊」は、試料１の群の値と比べてのＤｕｎｎｅｔｔ’ｓ ｔｅｓｔによる有意差（ｐ＜０．０５）、を示す。
ヒト表皮角化細胞ＮＨＥＫ（成人表皮角化細胞、クラボウ、ＫＫ－４１０９）を、３×１０３個／ｗｅｌｌの細胞数となるように、当該準備した９６ウェルプレートに播種し、増殖添加剤を添加した表皮角化細胞増殖基本培地（ＫＢＭ培地、クラボウ）にて、３７℃、５％ＣＯ２の環境下で、２４時間、当該ヒト表皮角化細胞を培養した。その後、増殖添加剤としてＦＧＦ及びＢＰＥ（ウシ脳下垂体抽出物）を除いた表皮角化細胞増殖基本培地へ置換し、以下試料を各ウェルに投与し、３７℃、５％ＣＯ２の環境下で、３日間培養した。３日間の培養後、Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ－８を用いて、各群（試料１から試料５の群）のヒト表皮角化細胞数を測定した。当該測定は、各群（試料１から試料５の群）において５サンプルずつ行った。以下表１では、各群において５サンプルの平均値を算出した結果を用いて、試料１の群の平均値の値を１００としたときの相対値を示す。表１の「＊＊」は、試料１の群の値と比べてのＤｕｎｎｅｔｔ’ｓ ｔｅｓｔによる有意差（ｐ＜０．０５）、を示す。
・試料１の群：コントロールとして、所定量の精製水を添加。
・試料２の群：最終濃度２００μｇ／ｍＬとなるように、製造例１で得られた組成物を添加。
・試料３の群：最終濃度４００μｇ／ｍＬとなるように、製造例１で得られた組成物を添加。
・試料４の群：最終濃度２００μｇ／ｍＬとなるように、市販のアラビアゴム含有組成物を添加。
・試料５の群：最終濃度４００μｇ／ｍＬとなるように、市販のアラビアゴム含有組成物を添加。
・試料２の群：最終濃度２００μｇ／ｍＬとなるように、製造例１で得られた組成物を添加。
・試料３の群：最終濃度４００μｇ／ｍＬとなるように、製造例１で得られた組成物を添加。
・試料４の群：最終濃度２００μｇ／ｍＬとなるように、市販のアラビアゴム含有組成物を添加。
・試料５の群：最終濃度４００μｇ／ｍＬとなるように、市販のアラビアゴム含有組成物を添加。
なお、市販のアラビアゴム含有組成物として、アラビアゴム（富士フイルム和光純薬、０１６－０００２５、ＣＡＳ ＲＮＴＭ：９０００－０１－５）を用いた。
表１に示す結果より、製造例１で得られた組成物を添加した群（試料２及び３の群）では、市販のアラビアゴム含有組成物の添加群（試料４及び５の群）と比較して、ヒト表皮角化細胞増殖能が高いことが確認できた。
［試験例２］ヒト線維芽細胞増殖試験
製造例１で得られた組成物についてのヒト線維芽細胞増殖能の有無を評価した。５％ＦＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｔｒａｃｅ製）を含むＤＭＥＭ培地が各ウェルに存在した９６ウェルプレートを準備した。正常ヒト皮膚線維芽細胞（クラボウ）を、各ウェルに４×１０３個／ｗｅｌｌの細胞数となるように、当該準備した９６ウェルプレートに播種した。この播種後、３７℃、５％ＣＯ２の環境下で、２４時間、当該正常ヒト皮膚線維芽細胞を培養した。その後、５％ＦＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｔｒａｃｅ製）を含むＤＭＥＭ培地から０．２５％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地へ置換して、置換後、以下試料を各ウェルに投与し、３７℃、５％ＣＯ２の環境下で、３日間、当該正常ヒト皮膚線維芽細胞を培養した。３日間の培養後、Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ－８（ＤＯＪＩＮＤＯ）を用いて、各群（試料１から試料５の群）の正常ヒト皮膚線維芽細胞数を測定した。当該測定は、各群（試料１から試料７の群）において５サンプルずつ行った。以下表２では、各群において５サンプルの平均値を算出した結果を用いて、試料１の群の平均値の値を１００としたときの相対値を示す。表２の「＊＊」は、試料１の群の値と比べての Ｔｕｋｅｙ－ｋｒａｍｅｒ ｔｅｓｔによる有意差（ｐ＜０．０５）、を示す。表２の「（††）」は、試料７の値と比べてのＴｕｋｅｙ－ｋｒａｍｅｒ ｔｅｓｔによる有意差（ｐ＜０．０５）、を示す。
製造例１で得られた組成物についてのヒト線維芽細胞増殖能の有無を評価した。５％ＦＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｔｒａｃｅ製）を含むＤＭＥＭ培地が各ウェルに存在した９６ウェルプレートを準備した。正常ヒト皮膚線維芽細胞（クラボウ）を、各ウェルに４×１０３個／ｗｅｌｌの細胞数となるように、当該準備した９６ウェルプレートに播種した。この播種後、３７℃、５％ＣＯ２の環境下で、２４時間、当該正常ヒト皮膚線維芽細胞を培養した。その後、５％ＦＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｔｒａｃｅ製）を含むＤＭＥＭ培地から０．２５％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地へ置換して、置換後、以下試料を各ウェルに投与し、３７℃、５％ＣＯ２の環境下で、３日間、当該正常ヒト皮膚線維芽細胞を培養した。３日間の培養後、Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ－８（ＤＯＪＩＮＤＯ）を用いて、各群（試料１から試料５の群）の正常ヒト皮膚線維芽細胞数を測定した。当該測定は、各群（試料１から試料７の群）において５サンプルずつ行った。以下表２では、各群において５サンプルの平均値を算出した結果を用いて、試料１の群の平均値の値を１００としたときの相対値を示す。表２の「＊＊」は、試料１の群の値と比べての Ｔｕｋｅｙ－ｋｒａｍｅｒ ｔｅｓｔによる有意差（ｐ＜０．０５）、を示す。表２の「（††）」は、試料７の値と比べてのＴｕｋｅｙ－ｋｒａｍｅｒ ｔｅｓｔによる有意差（ｐ＜０．０５）、を示す。
・試料１の群：コントロールとして、所定量の精製水を添加。
・試料２の群：最終濃度１０μｇ／ｍＬとなるように、製造例１で得られた組成物を添加。
・試料３の群：最終濃度１００μｇ／ｍＬとなるように、製造例１で得られた組成物を添加。
・試料４の群：最終濃度１０００μｇ／ｍＬとなるように、製造例１で得られた組成物を添加。
・試料５の群：最終濃度１０μｇ／ｍＬとなるように、市販のアラビアゴム含有組成物を添加。
・試料６の群：最終濃度１００μｇ／ｍＬとなるように、市販のアラビアゴム含有組成物を添加。
・試料７の群：最終濃度１０００μｇ／ｍＬとなるように、市販のアラビアゴム含有組成物を添加。
・試料２の群：最終濃度１０μｇ／ｍＬとなるように、製造例１で得られた組成物を添加。
・試料３の群：最終濃度１００μｇ／ｍＬとなるように、製造例１で得られた組成物を添加。
・試料４の群：最終濃度１０００μｇ／ｍＬとなるように、製造例１で得られた組成物を添加。
・試料５の群：最終濃度１０μｇ／ｍＬとなるように、市販のアラビアゴム含有組成物を添加。
・試料６の群：最終濃度１００μｇ／ｍＬとなるように、市販のアラビアゴム含有組成物を添加。
・試料７の群：最終濃度１０００μｇ／ｍＬとなるように、市販のアラビアゴム含有組成物を添加。
なお、市販のアラビアゴム含有組成物として、アラビアゴム（富士フイルム和光純薬、０１６－０００２５、ＣＡＳ ＲＮＴＭ：９０００－０１－５）を用いた。
表２に示す結果より、製造例１で得られた組成物を添加した群（試料２及び３の群）では、市販のアラビアゴム含有組成物の添加群（試料４及び５の群）と比較して、ヒト線維芽細胞増殖能が高いことが確認できた。また、試料７の群に比べ、試料４の群では、ヒト線維芽細胞増殖能が有意に高いことが確認できた。
［試験例３］１型コラーゲン産生促進活性（ＥＬＩＳＡによる検出）
製造例１で得られた組成物についての１型コラーゲン産生促進活性の有無をＥＬＩＳＡにより評価した。
５％ＦＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｔｒａｃｅ製）を含むＤＭＥＭ培地が各ウェルに存在した２４ウェルプレートを準備した。正常ヒト皮膚線維芽細胞（クラボウ）を、各ウェルに２×１０４個／ｗｅｌｌの細胞数となるように、当該準備した２４ウェルプレートに播種した。この播種後、３７℃、５％ＣＯ２の環境下で、２４時間、コンフルエントになるまで当該正常ヒト皮膚線維芽細胞を培養した。その後、５％ＦＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｔｒａｃｅ製）を含むＤＭＥＭ培地から０．２５％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地へ置換して、置換後、以下試料を各ウェルに投与し、３７℃、５％ＣＯ２の環境下で、１日間、当該正常ヒト皮膚線維芽細胞を培養した。当該培養後の細胞培養上清に対して、ＰＩＰ ＥＩＡ ＫＩＴ（タカラバイオ）を用いて、各群の１型コラーゲンの産生量（ｎｇ／ｍＬ）を評価した。当該測定は、各群（試料１から試料３の群）において３サンプルずつ行った。以下表４では、各群において３サンプルの平均値を算出した結果を示す。表３の「＊＊」は、試料１の群の平均値と比べてのＤｕｎｎｅｔｔ’ｓ ｔｅｓｔによる有意差（ｐ＜０．０５）、を示す。
製造例１で得られた組成物についての１型コラーゲン産生促進活性の有無をＥＬＩＳＡにより評価した。
５％ＦＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｔｒａｃｅ製）を含むＤＭＥＭ培地が各ウェルに存在した２４ウェルプレートを準備した。正常ヒト皮膚線維芽細胞（クラボウ）を、各ウェルに２×１０４個／ｗｅｌｌの細胞数となるように、当該準備した２４ウェルプレートに播種した。この播種後、３７℃、５％ＣＯ２の環境下で、２４時間、コンフルエントになるまで当該正常ヒト皮膚線維芽細胞を培養した。その後、５％ＦＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｔｒａｃｅ製）を含むＤＭＥＭ培地から０．２５％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地へ置換して、置換後、以下試料を各ウェルに投与し、３７℃、５％ＣＯ２の環境下で、１日間、当該正常ヒト皮膚線維芽細胞を培養した。当該培養後の細胞培養上清に対して、ＰＩＰ ＥＩＡ ＫＩＴ（タカラバイオ）を用いて、各群の１型コラーゲンの産生量（ｎｇ／ｍＬ）を評価した。当該測定は、各群（試料１から試料３の群）において３サンプルずつ行った。以下表４では、各群において３サンプルの平均値を算出した結果を示す。表３の「＊＊」は、試料１の群の平均値と比べてのＤｕｎｎｅｔｔ’ｓ ｔｅｓｔによる有意差（ｐ＜０．０５）、を示す。
・試料１の群：コントロールとして、所定量の精製水を添加。
・試料２の群：最終濃度１０μｇ／ｍＬとなるように、製造例１で得られた組成物を添加。
・試料３の群：最終濃度１００μｇ／ｍＬとなるように、製造例１で得られた組成物を添加。
・試料２の群：最終濃度１０μｇ／ｍＬとなるように、製造例１で得られた組成物を添加。
・試料３の群：最終濃度１００μｇ／ｍＬとなるように、製造例１で得られた組成物を添加。
以下表３で示すように、製造例１で得られた組成物を投与することにより、１型コラーゲン産生促進活性が向上されることが確認できた。
［試験例４］１型コラーゲン遺伝子発現（ｑＲＴ－ＰＣＲによる検出）
製造例１で得られた組成物についての１型コラーゲン遺伝子発現をｑＲＴ－ＰＣＲにより評価した。
正常ヒト皮膚線維芽細胞（クラボウ）を、各ウェルに２×１０４個／ｗｅｌｌの細胞数となるように、当該準備した２４ウェルプレートに播種した。この播種後、３７℃、５％ＣＯ２の環境下で、２４時間、コンフルエントになるまで当該正常ヒト皮膚線維芽細胞を培養した。その後、ＤＭＥＭ培地から試験用ＤＭＥＭ培地（試験例２と異なり血清を含有しない培地）へ置換してさらに２４時間培養した。培養後、以下試料を各ウェルに投与し、３７℃、５％ＣＯ２の環境下で、２４時間、当該正常ヒト皮膚線維芽細胞を培養した。ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ （ＱＩＡＧＥＮ）のプロトコルに従って、当該培養した細胞を回収し、ｍＲＮＡを精製した。精製したｍＲＮＡはＰｒｉｍｅ Ｓｃｒｉｐｔ ＲＴ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ （ＴａＫａＲａ Ｂｉｏ）のプロトコルに従って逆転写反応を行い、反応生成物に対してＴＢ Ｇｒｅｅｎ Ｐｒｅｍｉｘ ＥＸ Ｔａｑ ＩＩ （ＴａＫａＲａ Ｂｉｏ）を使用してＲＴ－ＰＣＲ反応を行った。ＲＴ－ＰＣＲはＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ９６システム（Ｒｏｃｈｅ）を用いて行い、付属のソフトウェアを用いて目的遺伝子の発現量を定量化した。当該測定は、各群（試料１から試料３の群）において３サンプルずつ行った。以下表４では、各群において３サンプルの平均値を算出した結果を用いて、試料１の群の平均値の値を１００としたときの相対値を示す。表４の「＊＊」は、試料１の群の値と比べてのＤｕｎｎｅｔｔ’ｓ ｔｅｓｔによる有意差（ｐ＜０．０５）、を示す。
製造例１で得られた組成物についての１型コラーゲン遺伝子発現をｑＲＴ－ＰＣＲにより評価した。
正常ヒト皮膚線維芽細胞（クラボウ）を、各ウェルに２×１０４個／ｗｅｌｌの細胞数となるように、当該準備した２４ウェルプレートに播種した。この播種後、３７℃、５％ＣＯ２の環境下で、２４時間、コンフルエントになるまで当該正常ヒト皮膚線維芽細胞を培養した。その後、ＤＭＥＭ培地から試験用ＤＭＥＭ培地（試験例２と異なり血清を含有しない培地）へ置換してさらに２４時間培養した。培養後、以下試料を各ウェルに投与し、３７℃、５％ＣＯ２の環境下で、２４時間、当該正常ヒト皮膚線維芽細胞を培養した。ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ （ＱＩＡＧＥＮ）のプロトコルに従って、当該培養した細胞を回収し、ｍＲＮＡを精製した。精製したｍＲＮＡはＰｒｉｍｅ Ｓｃｒｉｐｔ ＲＴ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ （ＴａＫａＲａ Ｂｉｏ）のプロトコルに従って逆転写反応を行い、反応生成物に対してＴＢ Ｇｒｅｅｎ Ｐｒｅｍｉｘ ＥＸ Ｔａｑ ＩＩ （ＴａＫａＲａ Ｂｉｏ）を使用してＲＴ－ＰＣＲ反応を行った。ＲＴ－ＰＣＲはＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ９６システム（Ｒｏｃｈｅ）を用いて行い、付属のソフトウェアを用いて目的遺伝子の発現量を定量化した。当該測定は、各群（試料１から試料３の群）において３サンプルずつ行った。以下表４では、各群において３サンプルの平均値を算出した結果を用いて、試料１の群の平均値の値を１００としたときの相対値を示す。表４の「＊＊」は、試料１の群の値と比べてのＤｕｎｎｅｔｔ’ｓ ｔｅｓｔによる有意差（ｐ＜０．０５）、を示す。
・試料１の群：コントロールとして、所定量の精製水を添加。
・試料２の群：最終濃度１０μｇ／ｍＬとなるように、製造例１で得られた組成物を添加。
・試料３の群：最終濃度１００μｇ／ｍＬとなるように、製造例１で得られた組成物を添加。
・試料２の群：最終濃度１０μｇ／ｍＬとなるように、製造例１で得られた組成物を添加。
・試料３の群：最終濃度１００μｇ／ｍＬとなるように、製造例１で得られた組成物を添加。
以下表４で示すように、製造例１で得られた組成物を投与することにより、試験例３だけでなくこの試験例４でも１型コラーゲン産生促進活性が向上されることが確認できた。
［実験５］ヒトモニター試験による肌状態改善作用の評価
２０２１年１２月から２０２２年１月の期間で、３０歳以上の健康な男女１２名（平均年齢４９．８歳）を被験者として、このモニター試験を行った。なお、以下表５で示すローションでは、製造例１で得られた組成物を最終濃度１質量％となるように、３０％１，３－ブチレングリコールに溶解した溶液（表５では、製造例１で得られた組成物の溶液と記載）を用いた。
２０２１年１２月から２０２２年１月の期間で、３０歳以上の健康な男女１２名（平均年齢４９．８歳）を被験者として、このモニター試験を行った。なお、以下表５で示すローションでは、製造例１で得られた組成物を最終濃度１質量％となるように、３０％１，３－ブチレングリコールに溶解した溶液（表５では、製造例１で得られた組成物の溶液と記載）を用いた。
（試験方法）
表５で示す組成のローション（表５ローション）を被験者の顔の左半分に所定間隔にて塗布し、表６に示すローション（表６ローション）を被験者の顔の右半分に所定間隔にて塗布した。この所定間隔は、１日２回ずつ（朝晩）４週間である。４週間後には、被験者１人あたり、表５ローションが２４ｇ及び表６ローションが２４ｇの量が塗布された。そして、これらのローションの塗布前の０日と、ローションを塗布してから４週間目に、測定（シワの有無の測定など）を行った。
表５で示す組成のローション（表５ローション）を被験者の顔の左半分に所定間隔にて塗布し、表６に示すローション（表６ローション）を被験者の顔の右半分に所定間隔にて塗布した。この所定間隔は、１日２回ずつ（朝晩）４週間である。４週間後には、被験者１人あたり、表５ローションが２４ｇ及び表６ローションが２４ｇの量が塗布された。そして、これらのローションの塗布前の０日と、ローションを塗布してから４週間目に、測定（シワの有無の測定など）を行った。
（シワの有無の測定）
ＡＮＴＥＲＡ ３ＤＴＭ（ミラベックス）を用いて、被験者１２名の目尻のシワの有無の測定及びほうれい線の有無の測定を行った。以下、「目尻のシワの測定」及び「ほうれい線のシワの測定」において、当該１２名の平均値（当該水分分布の測定の平均値）を記載する。
ＡＮＴＥＲＡ ３ＤＴＭ（ミラベックス）を用いて、被験者１２名の目尻のシワの有無の測定及びほうれい線の有無の測定を行った。以下、「目尻のシワの測定」及び「ほうれい線のシワの測定」において、当該１２名の平均値（当該水分分布の測定の平均値）を記載する。
（目尻のシワの測定）
表５ローション塗布群及び表６ローション塗布群の０日（当該塗布前）の値を１００とした場合、当該４週間後において、表６ローション塗布群は１０３．９９であったが、表５ローション塗布群は９６．５９（０日の表５ローション塗布群の値と比べｐ＜０．０５（Ｗｉｌｃｏｘｏｎ検定））であった。
表５ローション塗布群及び表６ローション塗布群の０日（当該塗布前）の値を１００とした場合、当該４週間後において、表６ローション塗布群は１０３．９９であったが、表５ローション塗布群は９６．５９（０日の表５ローション塗布群の値と比べｐ＜０．０５（Ｗｉｌｃｏｘｏｎ検定））であった。
（ほうれい線のシワの測定）
表５ローション塗布群及び表６ローション塗布群の０日（当該塗布前）の値を１００とした場合、当該４週間後において、表６ローション塗布群は９９．６９であったが、表５ローション塗布群は９８．１０（０日の表５ローション塗布群の値と比べｐ＜０．０５（Ｗｉｌｃｏｘｏｎ検定））であった。
表５ローション塗布群及び表６ローション塗布群の０日（当該塗布前）の値を１００とした場合、当該４週間後において、表６ローション塗布群は９９．６９であったが、表５ローション塗布群は９８．１０（０日の表５ローション塗布群の値と比べｐ＜０．０５（Ｗｉｌｃｏｘｏｎ検定））であった。
（シミの有無の測定）
半顔（下眼瞼部から頬全体の部位）のシミの個数を測定することによってシミの有無の測定を行った。当該測定は、ＶＩＳＩＡＴＭＥｖｏｌｕｔｉｏｎ（ＶＩＳＩＡ－Ｅｖｏ、Ｃａｎｆｉｅｌｄ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて行った。表５ローション塗布群及び表６ローション塗布群の０日（当該塗布前）の値を１００とした場合、当該４週間後において、表６ローション塗布群は１０３．７８であったが、表５ローション塗布群は９７．７９であった。
半顔（下眼瞼部から頬全体の部位）のシミの個数を測定することによってシミの有無の測定を行った。当該測定は、ＶＩＳＩＡＴＭＥｖｏｌｕｔｉｏｎ（ＶＩＳＩＡ－Ｅｖｏ、Ｃａｎｆｉｅｌｄ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて行った。表５ローション塗布群及び表６ローション塗布群の０日（当該塗布前）の値を１００とした場合、当該４週間後において、表６ローション塗布群は１０３．７８であったが、表５ローション塗布群は９７．７９であった。
（ポルフィリンの有無の測定）
半顔（下眼瞼部から頬全体の部位）のシミの個数を測定することによって、ポルフィリンの有無の促成行った。当該測定は、ＶＩＳＩＡＴＭＥｖｏｌｕｔｉｏｎ（ＶＩＳＩＡ－Ｅｖｏ、Ｃａｎｆｉｅｌｄ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて行った。表５ローション塗布群及び表６ローション塗布群の０日（当該塗布前）の値を１００とした場合、当該４週間後において、表６ローション塗布群は１００．０３であったが、表５ローション塗布群は８３．９６（０日の表５ローション塗布群の値と比べｐ＜０．０１（Ｗｉｌｃｏｘｏｎ検定））であった。
半顔（下眼瞼部から頬全体の部位）のシミの個数を測定することによって、ポルフィリンの有無の促成行った。当該測定は、ＶＩＳＩＡＴＭＥｖｏｌｕｔｉｏｎ（ＶＩＳＩＡ－Ｅｖｏ、Ｃａｎｆｉｅｌｄ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて行った。表５ローション塗布群及び表６ローション塗布群の０日（当該塗布前）の値を１００とした場合、当該４週間後において、表６ローション塗布群は１００．０３であったが、表５ローション塗布群は８３．９６（０日の表５ローション塗布群の値と比べｐ＜０．０１（Ｗｉｌｃｏｘｏｎ検定））であった。
（真皮コラーゲン密度の測定）
鼻翼側部においてのＤｅｒｍａＬａｂ（登録商標）Ｃｏｍｂｏを用いて、真皮コラーゲン密度の測定を行った。表５ローション塗布群及び表６ローション塗布群の０日（当該塗布前）の値を１００とした場合、当該４週間後において、表６ローション塗布群は９４．０７であったが、表５ローション塗布群は９７．２２（０日の表５ローション塗布群の値と比べｐ＜０．０１（Ｗｉｌｃｏｘｏｎ検定））であった。
鼻翼側部においてのＤｅｒｍａＬａｂ（登録商標）Ｃｏｍｂｏを用いて、真皮コラーゲン密度の測定を行った。表５ローション塗布群及び表６ローション塗布群の０日（当該塗布前）の値を１００とした場合、当該４週間後において、表６ローション塗布群は９４．０７であったが、表５ローション塗布群は９７．２２（０日の表５ローション塗布群の値と比べｐ＜０．０１（Ｗｉｌｃｏｘｏｎ検定））であった。
Claims (3)
- 溶媒を水としてシクンシ科の植物の部位を溶解する工程、
当該溶解する工程で得られる溶解液の分子量分画を行う工程、
を含む、分子量が１万より大きく５００万以下の植物由来のプロテオグリカンの製造方法。 - 分子量が５万より大きく１００万以下の植物由来のプロテオグリカンを製造する、請求項１記載の方法。
- 分子量が２０万から５０万の植物由来のプロテオグリカンを製造する、請求項２記載の方法。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2023556358A JPWO2023074491A1 (ja) | 2021-11-01 | 2022-10-19 | |
| CN202280068613.1A CN118103408A (zh) | 2021-11-01 | 2022-10-19 | 蛋白多糖的制造方法 |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2021178577 | 2021-11-01 | ||
| JP2021-178577 | 2021-11-01 |
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|---|---|---|---|
| PCT/JP2022/038901 WO2023074491A1 (ja) | 2021-11-01 | 2022-10-19 | プロテオグリカンの製造方法 |
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Citations (5)
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|---|---|---|---|---|
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| JP2019172718A (ja) * | 2018-03-26 | 2019-10-10 | 日油株式会社 | 植物性プロテオグリカン及びその用途 |
| JP2020110147A (ja) * | 2019-01-11 | 2020-07-27 | 三栄源エフ・エフ・アイ株式会社 | 起泡性飲料並びにその泡質向上剤及び泡質向上方法、並びに増粘多糖類組成物 |
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| JP2021016331A (ja) * | 2019-07-18 | 2021-02-15 | 日油株式会社 | アラビアガムまたはガティガムを含有する植物抽出物の精製方法 |
-
2022
- 2022-10-19 WO PCT/JP2022/038901 patent/WO2023074491A1/ja unknown
- 2022-10-19 CN CN202280068613.1A patent/CN118103408A/zh active Pending
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Patent Citations (5)
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Non-Patent Citations (1)
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|---|
| GHOSH KANIKA; RAY SAYANI; GHOSH DEBJANI; RAY BIMALENDU: "Chemical structure of the arabinogalactan protein from gum ghatti and its interaction with bovine serum albumin", CARBOHYDRATE POLYMERS, vol. 117, 7 October 2014 (2014-10-07), GB , pages 370 - 376, XP029113675, ISSN: 0144-8617, DOI: 10.1016/j.carbpol.2014.09.084 * |
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|---|---|
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