WO2023022390A1 - 황칠 추출물을 포함하는 눈 손상 방지용 조성물 - Google Patents

황칠 추출물을 포함하는 눈 손상 방지용 조성물 Download PDF

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hwangchil
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장경화
구기방
권한올
정윤선
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    • A23V2200/30—Foods, ingredients or supplements having a functional effect on health

Definitions

  • the present invention relates to a composition comprising hwangchil extract as an active ingredient and its use.
  • Blue light is blue light in the range of 400-500 nm among visible light, and when exposed to blue light for a long time, it stimulates the optic nerve, causing eye fatigue and causing various eye diseases. Since blue light has high energy and high penetrating power, when it enters the eye as it is, it makes the focus on the retina opaque and reduces sharpness, and when it is chronically exposed, it causes aging and degeneration of the retina. It is known that the effects of blue light on the human body include dry eye and eye fatigue, visual acuity and various eye diseases, accelerated retinal aging, macular degeneration, and insomnia due to suppression of melatonin production (Ganka Gakkai Zasshi. 2001 Oct; 105(10 ):687-95; Archives of Ophthalmology 1992; 110:99-104; Review of Ophthalmology Oct 15 2003; 10(10)).
  • A2E N-retinylidene-N-retinyl-ethanolamine
  • the highly reactive epoxide form of A2E causes oxidative stress and inflammatory responses, alters mitochondrial protein activity, and induces apoptosis.
  • loss of function of normal retinal pigment epithelial cells leads to secondary death of photoreceptor cells.
  • macular degeneration is caused by the oxidation of A2E by cellular oxidative stress in the retina caused by blue light and the accumulation of oxidized A2E, it is a diabetic disease caused by the action of glycated products due to high blood sugar and angiogenic factors such as VEGF.
  • the causes of retinopathy are different.
  • Macular degeneration can be divided into two types: dry (non-exudative) macular degeneration and wet (exudative) macular degeneration.
  • Dry macular degeneration accounts for about 90% of all patients with macular degeneration, and in dry macular degeneration, a waste material called drusen is accumulated between the retinal pigment epithelium and Bruch's membrane, resulting in atrophy or thinning of the macular tissue.
  • wet macular degeneration accounts for about 10% of all patients, and normal blood and nutrients are not supplied to the macula, resulting in abnormal new blood vessels being formed and ruptured, causing blood or mucus to leak into the macula, causing serious vision loss.
  • One object of the present invention is to provide a composition for preventing eye damage caused by blue light.
  • Another object of the present invention is to provide a health functional food for preventing or improving eye damage caused by blue light.
  • Another object of the present invention is to provide a composition for preventing or treating eye diseases caused by blue light.
  • One aspect of the present invention in order to achieve the above object provides a composition for preventing eye damage containing hwangchil extract as an active ingredient.
  • Another aspect of the present invention provides a health functional food for preventing or improving eye damage containing hwangchil extract as an active ingredient.
  • Another aspect of the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating eye diseases comprising an extract of Hwangchil as an active ingredient.
  • composition containing the Hwangchil extract of the present invention inhibits the oxidation of A2E by blue light, suppresses the death of retinal pigment epithelial cells by oxidized A2E, and inhibits the accumulation of drusen, it has very excellent activity. It can be used for the purpose of preventing eye damage.
  • the composition containing the hwangchil extract of the present invention can be developed as a therapeutic agent and health functional food for various eye diseases caused by blue light.
  • FIG. 1 is a graph showing that photo-oxidation of A2E, which was increased by blue light treatment in human retinal pigment epithelial cells ARPE-19, was significantly inhibited by treatment with Hwangchil extract.
  • Figure 2 is a graph showing the effect of inhibiting drusen accumulation by treatment with Hwangchil extract in human retinal pigment epithelial cells ARPE-19.
  • Figure 3 is a graph showing that the cell viability reduced by blue light treatment in human retinal pigment epithelial cells ARPE-19 is significantly increased by treatment with hwangchil extract.
  • Figure 4 is a microscopic photograph of the thickness of the outer nuclear layer (ONL) of the retina by administering a test drug to an animal model that induces loss of optic nerve cells similar to dry macular degeneration.
  • ONL outer nuclear layer
  • Figure 5 is a graph showing that the thickness of the outer layer of the retina, reduced by excessive light irradiation in an animal model that causes loss of optic nerve cells similar to dry macular degeneration, is increased by treatment with Hwangchil extract.
  • FIG. 6 is a graph showing that the activity of the photoreceptor cell, which was reduced by excessive light irradiation in an animal model that caused loss of optic nerve cells similar to dry macular degeneration, was increased by treatment with Hwangchil extract.
  • N-methyl-N-nitrosourea MNU
  • ONL outer nuclear layer
  • Figure 8 is a graph showing that the thickness of the outer retinal layer reduced by the administration of N-methyl-N-nitrosourea in an animal model inducing loss of optic nerve cells similar to dry macular degeneration is increased by the treatment of Hwangchil extract. .
  • Figure 9 is a microscopic photograph of the position where the folding deformation of retinal tissue occurred by administering a test drug to an animal model in which morphological deformation was induced in the upper retinal tissue by administration of sodium iodate (NaIO 3 ) am.
  • FIG. 11 is a microscopic view of TUNEL-positive cells in the optic nerve cell nuclear layer by administering a test drug to an animal model in which optic nerve cell loss is similar to dry macular degeneration.
  • FIG. 12 is a graph showing that the increased apoptosis response in an animal model induced loss of optic nerve cells similar to dry macular degeneration is reduced by treatment with Hwangchil extract.
  • Figure 13 shows that the expression of Bax, a pro-apoptotic factor that induces cell death, is reduced by treatment with Hwangchil extract in an animal model that causes loss of optic nerve cells similar to dry macular degeneration, and the anti-apoptotic factor Bcl-2 It is a graph showing that the expression increased and the increased expression of the cleaved form of caspase-3 decreased.
  • FIG. 14 is a photograph of ZO-1, a protein constituting tight junctions, observed under a microscope by administering a test drug to an animal model in which morphological transformation was induced in an upper retinal tissue.
  • 15 is a diagram showing the mechanism of action of hwangchil extract to improve macular degeneration.
  • One aspect of the present invention provides a composition for preventing eye damage comprising an extract of hwangchil ( Dendropanax morbifera ) as an active ingredient.
  • Hwangchil Dendropanax morbifera .
  • hwangchil of the present invention includes cognate herbal medicines that are obvious in the art and can be used for the same or similar purposes as the prevention, improvement, and treatment purposes of the present invention.
  • extract refers to an extract obtained by the extraction treatment of Hwangchil, a diluted or concentrated solution of the extract, a dried product obtained by drying the extract, a crude or purified product of the extract, or a mixture thereof, the extract itself and the extract. It includes extracts of all formulations that can be formed using
  • the extract of the present invention may be prepared and used in the form of a dry powder after extraction.
  • the Hwangchil extract may be extracted from natural, hybrid or mutant plants of Hwangchil tree, and may also be extracted from plant tissue culture. In addition, it can be extracted from the leaves, stems, roots, flowers, and seeds of Hwangchil tree.
  • a method for extracting the hwangchil extract is not particularly limited, and may be extracted according to a method commonly used in the art.
  • Non-limiting examples of the extraction method may include a hot water extraction method, an ultrasonic extraction method, a filtration method, a reflux extraction method, and the like, which may be performed alone or in combination of two or more methods.
  • the type of extraction solvent used to extract the hwangchil extract is not particularly limited, and any solvent known in the art may be used.
  • Non-limiting examples of the extraction solvent include C 1 ⁇ C 4 lower alcohols such as water, methanol, ethanol, propyl alcohol, and butyl alcohol; polyhydric alcohols such as glycerin, butylene glycol, and propylene glycol; and hydrocarbon solvents such as methyl acetate, ethyl acetate, acetone, benzene, hexane, diethyl ether, and dichloromethane; or mixtures thereof may be used.
  • the hwangchil extract of the present invention may be extracted from the leaves and stems of hwangchil with water, C 1 ⁇ C 4 lower alcohol or a mixed solvent thereof.
  • the “eye damage” may be caused by blue light, and may specifically mean eye damage caused by photo-oxidation of A2E and accumulation thereof by blue light. More specifically, the eye damage may mean eye damage caused by oxidative damage of the eye, aging of the eye, eye fatigue, deterioration of eye function, or eye disease, but is not limited thereto.
  • the eye disease may be an eye disease caused by blue light, and may specifically mean a retinal disease associated with photooxidation of A2E and accumulation of drusen by blue light.
  • retinal degeneration macular degeneration, glaucoma, retinitis pigmentosa, Stargardt disease, choroideremia, choroidal atrophy (gyrate- atrophy), retinal detachment, optic neuropathy, and dry eye syndrome, but may mean one or more types selected from the group consisting of, but not limited thereto.
  • retinal pigment epithelial cells were treated with Hwangchil extract together with blue light to measure the degree of photooxidation of A2E, and as a result, the increase by blue light It was confirmed that the photooxidation of A2E was significantly inhibited by the treatment with Hwangchil extract.
  • retinal pigment epithelial cells were treated with Hwangchil extract along with blue light to confirm cell viability. confirmed to increase.
  • treatment with hwangchil extract inhibits retinal cell death induced by light irradiation to improve optic nerve cell damage and maintains tight junctions of retinal pigment epithelial cells to improve retinal pigment epithelial cell damage. .
  • the hwangchil extract prevents damage to retinal pigment epithelial cells by inhibiting the oxidation of A2E, and inhibits the accumulation of drusen, so it is clear that it has the activity of suppressing the atrophy or morphological change of retinal tissue, so the hwangchil extract It can be usefully used as an active ingredient in a composition for preventing eye damage.
  • Another aspect of the present invention provides a health functional food for preventing or improving eye damage comprising Hwangchil extract as an active ingredient.
  • the hwangchil, extract, and eye damage are as described above.
  • hwangchil Since hwangchil has been used for a long time as a natural substance and has been proven to be safe for the human body, it can be prepared and consumed in the form of food that can prevent or improve eye damage while being common sense.
  • the "prevention” means any action to suppress or delay eye damage by ingestion of the health functional food.
  • the “improvement” refers to all actions that reduce the parameters related to the condition to be treated by ingestion of the health functional food, for example, the severity of symptoms.
  • the health functional food may include food additives acceptable in food science in addition to hwangchil extract.
  • the food supplement additive means a component that can be added to food supplementally, and can be appropriately selected and used by those skilled in the art as being added to prepare a health functional food of each formulation.
  • food additives include various nutrients, vitamins, minerals (electrolytes), flavors such as synthetic flavors and natural flavors, colorants and fillers, pectic acid and its salts, alginic acid and its salts, organic acids, protective colloidal thickeners , pH adjusters, stabilizers, preservatives, glycerin, alcohol, carbonation agents used in carbonated beverages, and the like, but are not limited thereto.
  • the health functional food refers to food manufactured and processed in the form of tablets, capsules, powders, granules, liquids and pills using raw materials or ingredients having useful functionalities for the human body.
  • functional refers to obtaining useful effects for health purposes such as adjusting nutrients for the structure and function of the human body or physiological functions.
  • the health functional food of the present invention can be prepared by a method commonly used in the art, and can be prepared by adding raw materials and components commonly added in the art during the preparation.
  • the formulation of the health functional food may also be manufactured without limitation as long as the formulation is recognized as a health functional food.
  • the health functional food can be prepared in various types of formulations, and unlike general drugs, it has the advantage of using food as a raw material and free from side effects that can occur when taking drugs for a long time, and is excellent in portability, so the health of the present invention Functional food can be taken as a supplement to enhance the effect of improving eye damage.
  • the health functional food can take, and it can include all foods in a conventional sense, and can be used interchangeably with terms known in the art, such as functional food.
  • the health functional food of the present invention can be prepared by mixing suitable other auxiliary ingredients and known additives that can be included in food according to the selection of those skilled in the art. Examples of food that can be added include meat, sausage, bread, chocolate, candy, snacks, confectionery, pizza, ramen, other noodles, chewing gum, dairy products including ice cream, various soups, beverages, tea, drinks, alcoholic beverages, and There are vitamin complexes, etc., and it can be prepared by adding the extract according to the present invention to juice, tea, jelly, juice, etc. prepared as a main component. It also includes food used as feed for animals.
  • Another aspect of the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating eye diseases comprising an extract of hwangchil as an active ingredient.
  • the hwangchil extract is as described above.
  • prevention refers to any action that inhibits or delays the onset of eye diseases by administering the composition according to the present invention.
  • the “treatment” refers to all activities that improve or beneficially change the symptoms of eye diseases by administering the composition according to the present invention.
  • the “eye disease” may be an eye disease caused by blue light, and may specifically mean a retinal disease caused by photo-oxidation and accumulation of A2E or accumulation and photo-oxidation of drusen by blue light.
  • the eye disease is retinal degeneration, macular degeneration, glaucoma, retinitis pigmentosa, Stargardt disease, choroideremia, choroid It may mean one or more types selected from the group consisting of gyrate-atrophy, retinal detachment, optic neuropathy, and dry eye syndrome, but is not limited thereto.
  • the macular degeneration refers to a phenomenon in which central vision is destroyed by damage to the macula, and the macular degeneration diseases include dry macular degeneration, wet macular degeneration, age-related macular degeneration, myopic macular degeneration and idiopathic macular degeneration. It may include gender, etc., and specifically, it may be age related macular degeneration (AMD).
  • AMD age related macular degeneration
  • A2E is a substance that typically accumulates in retinal epithelial cells. It generates singlet oxygen by blue light and oxidizes carbon-to-carbon double bonds in the retina. May cause damage to pigment epithelial cells.
  • Prevention or treatment of the eye disease can be achieved by suppressing cell death caused by A2E oxidized by blue light or suppressing accumulation of drusen.
  • cell death occurs when blue light is irradiated after A2E accumulation in retinal pigment epithelial cells, but when treated with hwangchil extract, there is an effect of inhibiting cell death.
  • retinal pigment epithelial cells were treated with Hwangchil extract, the accumulation of drusen was inhibited. That is, the hwangchil extract of the present invention can be usefully used for preventing or treating eye diseases by inhibiting the death of retinal pigment epithelial cells caused by exposure to blue light or inhibiting the accumulation of drusen.
  • the pharmaceutical composition includes a therapeutically effective amount of hwangchil extract; and a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the “therapeutically effective amount” means an amount sufficient for the composition of the present invention to achieve treatment or prevention of eye diseases caused by blue light.
  • the pharmaceutically acceptable carrier is one commonly used in formulation, and may include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, acacia gum, calcium phosphate, alginate, gelatin, calcium silicate, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, cellulose, water, syrup, methyl cellulose, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil, and the like.
  • the pharmaceutical composition may be administered orally or parenterally, and in the case of parenteral administration, intravenous injection, subcutaneous injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, or transdermal administration may be used.
  • a suitable dosage of the pharmaceutical composition varies depending on factors such as formulation method, administration method, patient's age, weight, sex, pathological condition, food, administration time, administration route, excretion rate and reaction sensitivity, usually A skilled practitioner can readily determine and prescribe dosages effective for the desired treatment or prophylaxis.
  • the daily dose of the pharmaceutical composition is 0.0001 to 100 mg/kg, preferably 0.001 to 30 mg/kg, which may be administered once or several times a day.
  • the administration period may be 1 day to 2 months, but it may be administered without limitation until the effect of preventing or treating a disease appears.
  • the pharmaceutical composition is prepared in unit dosage form by formulation using a pharmaceutically acceptable carrier and/or excipient according to a method that can be easily performed by those skilled in the art, or It can be prepared by placing it in a multi-dose container.
  • the formulation may be in the form of a solution, suspension or emulsion in an oil or aqueous medium, or may be in the form of an extract, powder, granule, tablet or capsule, and may additionally contain a dispersing agent or stabilizer.
  • the pharmaceutical composition may also be formulated as ophthalmic compositions such as eye drops and ointments.
  • This form may include all ophthalmic preparations for topical administration to the eye used in the field of ophthalmology.
  • Eye drops are prepared by dissolving the active ingredient in a sterile aqueous solution such as saline and buffer. Eye drops may be provided as a powder composition to be dissolved prior to use, or may be provided by combining with a powder composition to be dissolved prior to use. Eye ointments can be prepared by mixing the active ingredient into an ointment base.
  • Hwangchil tree Dendropanax morbifera
  • 30% (v / v) ethanol aqueous solution was added, extracted 1-3 times for 8 hours at 80 ° C, and the extracts obtained from each extraction were mixed.
  • the extract was filtered using a 5 ⁇ m filter.
  • the filtrate was concentrated at 55 °C using a rotary vacuum concentrator (BUCHI, R-220). Sterilized distilled water was added to the concentrate, diluted to 20 brix, and lyophilized to obtain 210 g of Hwangchil extract powder.
  • A2E accumulated in retinal pigment epithelial cells is known to be deposited in retinal pigment epithelial cells as a causative agent of macular degeneration, and photooxidation occurs when irradiated with blue light to induce cytotoxicity.
  • Hwangchil extract has an effect of inhibiting photooxidation of A2E, ARPE-19 cells and A2E, which are human retinal pigment epithelial cell lines, were used.
  • ARPE-19 cells (CRL-2302, ATCC, USA) were treated with 90 ⁇ M of A2E (Gene and cell technologies, USA), and Hwangchil extract prepared in the above Preparation Example 0, 7.8, 15.6, 31.25, 62.5, After treatment with 125 and 250 ⁇ g/mL, blue light (430 nm, intensity: 2.0 to 2.5 mW/cm 2 ) was irradiated for 10 minutes.
  • absorbance at 440 nm was measured using a micro plate leader before and after blue light irradiation.
  • Hwangchil extract has the effect of inhibiting the accumulation of A2E in cells and photo-oxidation of A2E.
  • Hwangchil extract has an effect of preventing eye damage by inhibiting drusen photooxidation and accumulation of MGO-modified adducts, and suppressing the onset and deterioration of macular degeneration.
  • the cell viability of the negative control group irradiated with A2E and irradiated with blue light was significantly reduced compared to the control group, and cell death was induced.
  • the cell viability increased in the group treated with Hwangchil extract compared to the negative control group treated with only A2E which showed that the cell viability increased compared to the positive control group treated with lutein.
  • hwangchil extract prevents or treats macular degeneration by inhibiting cell death caused by accumulation and oxidized A2E in retinal pigment epithelial cells.
  • the cell viability of the negative control group in which A2E was accumulated and blue light was irradiated was significantly decreased compared to the control group, and thus cell death was induced.
  • the cell viability increased in the group treated with Hwangchil extract compared to the negative control group treated with only A2E which showed that the cell viability increased compared to the positive control group treated with lutein.
  • hwangchil extract prevents or treats macular degeneration by inhibiting cell death caused by accumulation and oxidized A2E in retinal pigment epithelial cells.
  • 6-week-old male BALB / c mice (Orient Co., Ltd.) were acclimatized for one week, dark adaptation in a dark place without light for 14 hours from the evening before white LED exposure containing blue light. Then, the pupil was dilated with 1% tropicamide eye drop the next morning. After that, it was exposed for 0.5 hours using a specially manufactured cooled white LED light panel with 5000 lux brightness and placed in a dark room for 24 hours. The test drug was orally administered once daily for 7 days after exposure to light. The concentrations of the administered drugs are shown in Table 1 below.
  • Neochlorogenic acid which is known to help prevent macular degeneration by activating aged retinal nerve cells
  • lutein which is widely known as a component of eye nutrients
  • Hwangchil extract was administered by concentration.
  • an autopsy was performed to extract the eyeball, fix it in 10% neutralized formalin for one day, and then embed it in paraffin to prepare a slide section.
  • the slide sections were stained with hematoxylin & eosin (H&E) and observed under an optical microscope, and damage or deformation of photoreceptor cells was evaluated by measuring changes in the thickness of the outer granule layer of retinal tissue.
  • H&E hematoxylin & eosin
  • the cell nuclei of the outer nuclear layer (ONL) containing the nuclei of optic nerve cells decreased in thickness while decreasing, and when the Hwangchil extract was administered, concentration-dependent
  • the effect of increasing the thickness of the outer grain layer was slightly higher in the experimental group administered with 200 mg/kg than in the experimental group administered with 100 mg/kg of Hwangchil extract. decreased, which is presumed to be a phenomenon in which the absorption of effective substances is competitively suppressed by various phytocompounds contained in the extract as the concentration of Hwangchil extract increases.
  • the thickness of the outer grain layer also increased in the neochlorogenic acid administration group, which was another positive control group, but it was not statistically significant.
  • hwangchil extract has the effect of improving the damage or transformation of photoreceptor cells by increasing the thickness of the outer nuclear layer (ONL) of the retina.
  • An electroretinogram is an electroretinogram of the retinal optic nerve representing an electrical signal generated by a reaction of the optic nerve to light, and is used as an index to determine the presence or absence of retinal damage or disease.
  • the electroretinogram is composed of a and b waves. The a wave is produced by photoreceptors, and the b wave is caused by depolarization of bipolar cells in the inner nuclear layer of the retina by light stimulation.
  • a and b waves were obtained from the scotopic flash response, and the a and b waves were measured by administering the test drug as described in Table 1 above to determine the degree of photoreceptor activity. measured.
  • hwangchil extract has the effect of improving the activity reduction of photoreceptor cells.
  • mice 6-week-old male BALB/c mice (Orient Co., Ltd.) were acclimatized for 1 week, and N-methyl-N-nitrosourea (N-methyl-N -nitrosourea, MNU) (Sigma, USA) was prepared to have a concentration of 1% in 0.05% acetic acid solution and administered intraperitoneally to mice at a concentration of 1%, 60 mg/kg per individual.
  • N-methyl-N-nitrosourea N-methyl-N -nitrosourea, MNU
  • the test drug was orally administered once daily for 7 days from the same day after administration of N-methyl-N-nitrosourea.
  • the concentration of the administered drug is shown in Table 2 below.
  • Neochlorogenic acid which is known to help prevent macular degeneration by activating aged retinal nerve cells
  • lutein which is widely known as a component of eye nutrients
  • Hwangchil extract was administered by concentration.
  • an autopsy was performed to extract the eyeball, fix it in 10% neutralized formalin for one day, and then embed it in paraffin to prepare a slide section.
  • the slide sections were stained with hematoxylin & eosin (H&E) and observed under an optical microscope, and damage or deformation of photoreceptor cells was evaluated by measuring changes in the thickness of the outer granule layer of retinal tissue.
  • H&E hematoxylin & eosin
  • the cell nuclei of the outer nuclear layer (ONL) containing the nuclei of optic nerve cells decreased in thickness while decreasing, and when Hwangchil extract was administered, concentration-dependent It was found that the thickness of the outer grain layer increased, and the efficacy was superior compared to lutein.
  • the thickness of the outer nuclear layer (ONL) of the retina was also increased in the other positive control group, neochlorogenic acid-administered group, but the thickness of the outer granule layer was increased, but it was not statistically significant. It can be seen that there is an improvement effect.
  • 6-week-old male SD rats (Orient Co., Ltd.) were acclimated for 1 week, and sodium iodate (NaIO 3 ) (Sigma, USA) was added to sterile physiological saline to induce damage and degeneration of retinal pigment epithelial cells.
  • NaIO 3 sodium iodate
  • the test drug was orally administered once daily for 14 days from the same day after administration of sodium iodate.
  • the concentrations of the administered drugs are shown in Table 3 below.
  • Neochlorogenic acid which is known to help prevent macular degeneration by activating aged retinal nerve cells
  • lutein which is widely known as an eye nutrient
  • Hwangchil extract was administered by concentration.
  • an autopsy was performed to extract the eyeball, fix it in 10% neutralized formalin for one day, and then embed it in paraffin to prepare a slide section.
  • the slide sections were observed under an optical microscope by performing hematoxylin & eosin (H&E) staining, and damage or deformation of retinal pigment epithelial cells was evaluated by counting the location where folding deformation of retinal tissue occurred.
  • H&E hematoxylin & eosin
  • test group group name administered drug dose concentration (mg/kg/day) number normal control Normal - - 5 negative control NaIO 3 - - 5 Hwangchil extract administration group DM-25 Hwangchil Extract 25 5 Hwangchil extract administration group DM-50 Hwangchil Extract 50 5 Hwangchil extract administration group DM-100 Hwangchil Extract 100 5 positive control NCA Neochlorogenic acid 6.5 5 positive control Lutein lutein 50 5
  • retinal tissue was deformed due to damage to retinal pigment epithelial cells, and a number of folded positions (red arrows) were observed. It was found that the folded position was suppressed due to tissue deformation, and the efficacy was superior compared to lutein. From this, hwangchil extract inhibits the deformation of retinal tissue and has the effect of improving damage or deformation of retinal pigment epithelial cells. can know
  • the degree of death of optic nerve cells was analyzed using retinal tissue slides prepared for analysis of damage and loss of optic nerve cells.
  • an autopsy was performed to extract the eyeball, and then fixed in 10% neutralized formalin for one day and embedded in paraffin to prepare a slide section.
  • the tissue sections were deparaffinized and hydrated, washed with PBS, treated with a proteinase K solution at a concentration of 20 ⁇ g/ml for 15 minutes at 37° C., and then washed again with PBS. After reacting the TUNEL reaction mixture solution (In situ cell death detection kit, AP, Roche, Germany) at 37° C. for 1 hour, it was observed under a microscope.
  • TUNEL reaction mixture solution In situ cell death detection kit, AP, Roche, Germany
  • hwangchil extract improves damage to optic nerve cells by inhibiting retinal cell death induced by light irradiation.
  • the retinal tissue used in Experimental Example 9-1 was rapidly frozen in liquid nitrogen and then stored at -70°C. After protein quantification of samples homogenized with homogenization buffer (pH 7.6), electrophoresis was performed under SDS-PAGE at 30 ⁇ g each. Then, the protein was transferred to a PVDF membrane (Bio-Rad Laboratories, CA, USA) using transfer buffer (0.25 M Tris, 1.92 M Glycine, pH 8.3-8.4).
  • hwangchil extract inhibits apoptosis factors and activates anti-apoptotic factors to improve damage to optic nerve cells.
  • RPE retinal pigment epithelial cell
  • RPE-choroid-sclea complex retinal pigment epithelial cell-choroid-sclea complex
  • PFA paraformaldehyde
  • Blocking solution (10% normal goat serum) for 10 minutes, anti-ZO-1 antibody (1:200, Cat# 61-7300, Invitrogen, Carlsbad, CA) for 1 hour and washed several times.
  • Alexa Fluor 488 goat-anti-rabbit (1:500; Cat# A-11008, Invitrogen) as secondary antibody was treated for 1 hour, and the plated retinal pigment epithelial cell-choroid-sclera complex was examined under a fluorescence microscope (Oylmpus, Tokyo). , Japan).
  • Hwangchil extract improves retinal pigment epithelial cell damage by maintaining proteins constituting the tight junction of retinal pigment epithelial cells.
  • Hwangchil extract inhibits damage to optic nerve cells through inhibition of photooxidation of drusen, a causative agent of macular degeneration, and inhibits cell death of optic nerve cells by suppressing the expression of cell death signaling substances, as well as retinal pigment epithelium. It can be seen that maintaining tight junction proteins in cells exhibits an effect of improving macular degeneration (FIG. 15).

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Abstract

본 발명의 황칠 추출물을 포함하는 조성물은 A2E의 산화를 억제하고, 산화된 A2E에 의한 망막색소상피세포의 사멸을 억제하며 드루젠의 축적을 억제하는 활성이 매우 우수하므로, 눈 손상을 방지하기 위한 용도로 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 황칠 추출물을 포함하는 조성물은 다양한 안질환의 치료제 및 건강기능식품으로도 개발될 수 있다.

Description

황칠 추출물을 포함하는 눈 손상 방지용 조성물
본 발명은 황칠 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물 및 이의 용도에 관한 것이다.
눈은 가장 중요한 감각기관이므로 눈의 기능적 장애 또는 상실은 생활의 질을 떨어뜨리는 가장 큰 요인 중 하나이다. 현대인들은 대부분의 시간을 컴퓨터, 스마트폰 등의 다양한 디지털 스크린 앞에서 보내고 있는데 스마트 기기 화면에 LED가 자주 사용됨으로써 청색광으로 인해 눈 건강이 악화되고 있다.
청색광은 가시광선 중에서 400-500nm 영역의 푸른색을 띄는 빛으로 청색광에 오랜 시간 노출될 경우 시신경을 자극하게 되어 눈의 피로를 유발하고 각종 안질환의 원인이 된다. 청색광은 에너지가 크고 투과력도 높기 때문에 눈에 그대로 들어오게 될 경우 망막에 초점을 불투명하게 맺히게 하여 선명도를 떨어뜨리고, 만성적으로 노출되는 경우에는 망막의 노화와 퇴화의 원인이 된다. 청색광이 인체에 미치는 영향으로는 안구 건조 및 눈 피로, 시력감퇴 및 각종 안질환, 망막 노화 촉진, 황반변성 및 멜라토닌 생성억제로 인한 불면증 등이 있다고 알려져 있다(Ganka Gakkai Zasshi. 2001 Oct; 105(10):687-95; Archives of Ophthalmology 1992; 110:99-104; Review of Ophthalmology Oct 15 2003; 10(10)).
청색광의 작용으로 인해 평생 동안 대사성 폐기 부산물들이 망막세포 내에 누적되고, 특히, 간상세포 광수용체가 많이 밀집되어 있는 망막 중심부 아래의 망막색소상피세포에서 축적이 가장 활발하게 일어난다고 알려져 있다. 이러한 대사성 폐기 부산물 중에서 가장 중요한 것 중 하나는 리포푸신 성분인 N-레티닐리덴-N-레티닐-에탄올아민(Nretinylidene-N-retinyl-ethanolamine: A2E)으로서, 높은 농도의 A2E는 망막색소상피세포의 사멸에 관여하는 주요 원인이 된다. 또한, A2E는 낮은 농도에서도 청색광에 의해 광산화 되고 에폭사이드 (epoxide) 형태인 퍼옥시-A2E (peroxy-A2E)와 퓨라노-A2E (furano-A2E)로 변하게 된다. 반응성이 높은 에폭사이드 형태의 A2E는 산화적 스트레스와 염증 반응을 일으키고, 미토콘드리아의 단백질 활성을 변화시켜 세포사멸을 유도한다. 그 결과, 정상적인 망막색소상피세포의 기능이 소실되면 광수용체세포의 2차적 사멸로 이어진다. 특히, 광수용체세포가 많이 밀집되어 있는 황반의 경우 심각한 손상을 받아 황반변성이 일어나게 된다. 즉, 황반변성은 청색광으로 인한 망막의 세포 산화성 스트레스에 의해 A2E가 산화되고, 산화된 A2E의 축적에 의해 발병된다는 점에서 고혈당으로 인한 당화산물 및 VEGF 등과 같은 혈관형성인자들의 작용에 의해 발병하는 당뇨병성 망막병증과는 발병원인이 상이하다.
황반변성은 크게 두 가지 타입으로 나뉠 수 있는데, 건성(비삼출성) 황반변성과 습성(삼출성) 황반변성이다. 건성 황반변성은 전체 황반변성 환자의 약 90%를 차지하며, 건성 황반변성은 망막색소상피(retinal pigment epithelium)와 브루크막(Bruch's membrane) 사이에 드루젠(drusen)이라는 노폐물이 쌓여 황반부 조직이 위축되거나 얇아진 것을 특징으로 한다. 한편, 습성 황반변성은 전체 환자의 약 10%을 차지하며, 황반부에 정상적인 혈액과 영양분이 공급되지 않아, 비정상적으로 신생혈관이 형성되고, 파열되어 황반으로 혈액이나 점액이 누수되어 심각한 시력 상실을 일으키는 것을 말한다. 건성 황반변성의 초기증상은 무증상이거나 증상이 있더라도 노안으로 여기기 때문에 방치하기 쉽다. 하지만, 건성 황반변성의 진행을 억제하거나 치료하지 않으면 지속적인 망막손상으로 인한 시력상실이 올 수 있고, 습성 황반변성으로 진행되어 실명까지 이르게 될 수 있기 때문에 초기에 건성 황반변성을 예방하는 것이 중요하다.
기존에 출시된 눈 건강 관련 제품들은 합성된 치료제들인데 합성 화합물의 장기간 사용으로 인한 부작용을 발생시킨다. 이에, 인위적으로 합성된 특정 화합물이 대신 종래에 식품으로 섭취하고 있는 천연물 유래의 눈 건강 개선 물질의 개발이 필요한 실정이다.
본 발명의 일 목적은 청색광에 의한 눈 손상 방지용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 일 목적은 청색광에 의한 눈 손상 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 일 목적은 청색광에 의한 안질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명의 일 측면은 황칠 추출물을 유효성분으로 포함하는 눈 손상 방지용 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 일 측면은 황칠 추출물을 유효성분으로 포함하는 눈 손상 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.
본 발명의 또 다른 일 측면은 황칠 추출물을 유효성분으로 포함하는 안질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 황칠 추출물을 포함하는 조성물은 청색광에 의한 A2E의 산화를 억제하고, 산화된 A2E에 의한 망막색소상피세포의 사멸을 억제하며 드루젠의 축적을 억제하는 활성이 매우 우수하므로, 청색광에 의한 눈의 손상을 방지하기 위한 용도로 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 황칠 추출물을 포함하는 조성물은 청색광에 의해 유발되는 다양한 안질환의 치료제 및 건강기능식품으로도 개발될 수 있다.
본 발명의 효과는 상기에서 언급한 효과로 제한되지 아니하며, 언급되지 않은 또 다른 효과들은 하기의 기재로부터 당업자에게 명확히 이해될 수 있을 것이다.
도 1은 인간 망막색소상피세포 ARPE-19에서 청색광 처리에 의해 증가된 A2E의 광산화가 황칠 추출물의 처리에 의해 뚜렷하게 억제됨을 보여주는 그래프이다.
도 2는 인간 망막색소상피세포 ARPE-19에서 황칠 추출물의 처리에 의한 드루젠 축적 억제 효과를 보여주는 그래프이다.
도 3은 인간 망막색소상피세포 ARPE-19에서 청색광 처리에 의해 감소된 세포 생존율이 황칠 추출물의 처리에 의해 뚜렷하게 증가함을 보여주는 그래프이다.
도 4는 건성황반변성과 유사한 시신경세포의 소실을 유발한 동물 모델에 시험 약물을 투여하여 망막의 외과립층(outer nuclear layer, ONL) 두께를 현미경으로 관찰한 사진이다.
도 5는 건성황반변성과 유사한 시신경세포의 소실을 유발한 동물 모델에서 과도한 광원조사에 의해 감소된 망막 외과립층의 두께가 황칠 추출물의 처리에 의해 증가함을 보여주는 그래프이다.
도 6은 건성황반변성과 유사한 시신경세포의 소실을 유발한 동물 모델에서 과도한 광원조사에 의해 감소된 시세포의 활성이 황칠 추출물의 처리에 의해 증가함을 보여주는 그래프이다.
도 7은 N-메틸-N-니트로소우레아(N-methyl-N-nitrosourea, MNU)를 투여하여 건성황반변성과 유사한 시신경세포의 소실을 유발한 동물 모델에 시험 약물을 투여하여 망막의 외과립층(outer nuclear layer, ONL) 두께를 현미경으로 관찰한 사진이다.
도 8은 건성황반변성과 유사한 시신경세포의 소실을 유발한 동물 모델에서 N-메틸-N-니트로소우레아의 투여에 의해 감소된 망막 외과립층의 두께가 황칠 추출물의 처리에 의해 증가함을 보여주는 그래프이다.
도 9는 요오드산 나트륨(NaIO3)를 투여하여 상부에 위치한 망막 조직에 형태학적 변형을 유발한 동물 모델에 시험 약물을 투여하여 망막조직의 접힘(folding) 변형이 발생한 위치를 현미경으로 관찰한 사진이다.
도 10은 요오드산 나트륨(NaIO3)을 투여하여 상부에 위치한 망막 조직에 형태학적 변형을 유발한 동물 모델에서 요오드산 나트륨의 투여에 의해 증가한 망막색소상피세포의 손상이 황칠 추출물의 처리에 의해 감소함을 보여주는 그래프이다.
도 11은 건성황반변성과 유사한 시신경세포의 소실을 유발한 동물 모델에 시험 약물을 투여하여 시신경 세포핵 층에서 TUNEL 양성 반응이 일어난 세포를 현미경으로 관찰한 사진이다.
도 12는 건성황반변성과 유사한 시신경세포의 소실을 유발한 동물 모델에서 증가한 세포 사멸 반응이 황칠 추출물의 처리에 의해 감소함을 보여주는 그래프이다.
도 13은 건성황반변성과 유사한 시신경세포의 소실을 유발한 동물 모델에서 황칠 추출물의 처리에 의해 세포 사멸을 유도하는 pro-apoptotic 인자인 Bax의 발현이 감소하고, 항-세포사멸 인자인 Bcl-2은 발현이 증가하였며, 증가한 절단된 형태의 caspase-3 발현이 감소함을 보여주는 그래프이다.
도 14는 상부에 위치한 망막 조직에 형태학적 변형을 유발한 동물 모델에 시험 약물을 투여하여 밀착 연접을 구성하는 단백질인 ZO-1을 현미경으로 관찰한 사진이다.
도 15는 황칠 추출물이 황반 변성을 개선하는 작용 기전을 나타낸 도이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 일 측면은 황칠(Dendropanax morbifera) 추출물을 유효성분으로 포함하는 눈 손상 방지용 조성물을 제공한다.
상기 “황칠(Dendropanax morbifera)”은 두릅나무과에 속하며, 이의 아종, 변종을 포함함은 물론이다. 또한, 본 발명의 황칠은 당업계에서 자명하고 본 발명의 예방, 개선 및 치료 목적과 동일 또는 유사한 용도로 사용할 수 있는 동속생약을 포함한다.
상기 “추출물”은 상기 황칠의 추출처리에 의하여 얻어지는 추출액, 상기 추출액의 희석액이나 농축액, 상기 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 상기 추출액의 조정제물이나 정제물, 또는 이들의 혼합물 등, 추출액 자체 및 추출액을 이용하여 형성 가능한 모든 제형의 추출물을 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 상기 추출물은 추출 후 건조 분말 형태로 제조되어 사용될 수 있다.
상기 황칠 추출물은 황칠나무의 천연, 잡종 또는 변종 식물로부터 추출될 수 있고, 식물 조직 배양물로부터도 추출할 수 있다. 또한, 황칠나무의 잎, 줄기, 뿌리, 꽃, 및 씨앗 등으로부터 추출될 수 있다.
상기 황칠 추출물을 추출하는 방법은 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술분야에서 통상적으로 사용하는 방법에 따라 추출할 수 있다. 상기 추출 방법의 비제한적인 예로는, 열수 추출법, 초음파 추출법, 여과법, 환류 추출법 등일 수 있고, 이들은 단독으로 수행되거나 2종 이상의 방법을 병용하여 수행될 수 있다.
상기 황칠 추출물을 추출하는데 사용되는 추출 용매의 종류는 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 공지된 임의의 용매를 사용할 수 있다. 상기 추출 용매의 비제한적인 예로는 물, 메탄올, 에탄올, 프로필알코올, 부틸알코올 등의 C1~C4의 저급 알코올; 글리세린, 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 등의 다가 알코올; 및 메틸아세테이트, 에틸아세테이트, 아세톤, 벤젠, 헥산, 디에틸에테르, 디클로로메탄 등의 탄화수소계 용매; 또는 이들의 혼합물을 사용할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 상기 황칠 추출물은 황칠의 잎과 줄기를 물, C1~C4의 저급 알코올 또는 이들의 혼합용매로 추출할 수 있다.
상기 “눈 손상”은 청색광(blue light)에 의해 유발되는 것일 수 있고, 구체적으로 청색광에 의한 A2E의 광산화 및 이의 축적에 의한 눈 손상을 의미할 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 눈 손상은 눈의 산화적 손상, 눈의 노화, 눈의 피로, 눈의 기능 저하 또는 안질환에 의해 발생되는 눈 손상을 의미 할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 안질환은 청색광에 의해 유발되는 안질환일 수 있고, 구체적으로 청색광에 의한 A2E의 광산화, 드루젠의 축적과 관련된 망막질환을 의미할 수 있다. 구체적으로, 망막 변성(retinal degeneration), 황반변성(macular degeneration), 녹내장(glaucoma), 망막색소변성증(retinitis pigmentosa), 스타가트병(Stargardt disease), 맥락막 결손(choroideremia), 맥락망막 위축(gyrate-atrophy), 망막박리(retinal detachment), 시신경병증 (optic neuropathy) 및 안구 건조증(dry eye syndrome)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 의미할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 구체적인 실시예에서는 상기 황칠 추출물이 가지는 청색광에 의한 눈 손상 방지 효과를 확인하기 위하여, 망막색소상피세포에 청색광과 함께 황칠 추출물을 처리하여 A2E의 광산화 정도를 측정한 결과, 청색광에 의해 증가된 A2E의 광산화가 황칠 추출물의 처리에 의해 뚜렷하게 억제되는 것을 확인하였다.
또한, 산화된 A2E에 의한 세포 손상 방지 효과를 확인하기 위하여, 망막색소상피세포에 청색광과 함께 황칠 추출물을 처리하여 세포 생존율을 확인한 결과, 청색광에 의해 감소된 세포 생존율이 황칠 추출물의 처리에 의해 뚜렷하게 증가하는 것을 확인하였다.
또한, 청색광을 조사하여 드루젠의 축적 정도를 확인한 결과, 황칠 추출물의 처리에 의해 드루젠의 축적이 감소하는 것을 확인하였다.
또한, 황칠 추출물의 처리에 의해 광조사로 감소한 망막 외과립층의 두꼐를 증가시키고, 시세포의 활성 감소를 개선하는 것을 확인하였다.
또한, 약물로 황반 변성을 유발한 동물 모델에서 황칠 추출물의 처리에 의해 망막 조직의 변형을 억제하여 망막색소상피세포의 손상 또는 변형을 개선하는 것을 확인하였다.
나아가, 황칠 추출물의 처리는 광조사에 의해 유발된 망막의 세포 사멸을 억제하여 시신경 세포의 손상을 개선하고, 망막색소상피세포의 밀착 연접을 유지시켜 망막색소상피세포의 손상을 개선하는 것을 확인하였다.
따라서, 상기 황칠 추출물은 A2E의 산화를 억제함으로써 망막색소상피세포의 손상을 방지하고, 드루젠의 축적을 억제함으로써 망막 조직의 위축이나 형태 변화를 억제하는 활성을 가짐이 분명하므로, 상기 황칠 추출물을 눈 손상 방지용 조성물의 유효성분으로 유용하게 사용할 수 있다.
본 발명의 다른 일 측면은 황칠 추출물을 유효성분으로 포함하는 눈 손상의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.
상기 황칠, 추출물, 눈 손상은 전술한 바와 같다.
상기 황칠은 천연 물질로서 오랫동안 사용되어 인체에 안전한 물질임이 입증되었으므로, 상식할 수 있으면서도 눈 손상의 예방 또는 개선을 도모할 수 있는 식품의 형태로 제조되어 섭취할 수 있다.
상기 “예방”은 상기 건강기능식품의 섭취에 의해 눈 손상을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
상기 “개선”은 상기 건강기능식품의 섭취로 치료되는 상태와 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 감소시키는 모든 행위를 의미한다.
상기 건강기능식품은 황칠 추출물 이외에 식품학적으로 허용 가능한 식품보조첨가제를 포함할 수 있다.
상기 식품보조첨가제는 식품에 보조적으로 첨가될 수 있는 구성요소를 의미하며, 각 제형의 건강기능식품을 제조하는데 첨가되는 것으로서 통상의 기술자가 적절히 선택하여 사용할 수 있다. 식품보조첨가제의 예로는 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 충진제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다.
상기 건강기능식품이란 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상 및 환 등의 형태로 제조 및 가공한 식품을 의미한다. 여기서 기능성이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건용도에 유용한 효과를 얻는 것을 의미한다. 본 발명의 건강기능식품은 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조 가능하며, 상기 제조시에는 당업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한 상기 건강기능식품의 제형 또한 건강기능식품으로 인정되는 제형이면 제한 없이 제조될 수 있다.
상기 건강기능식품은 다양한 형태의 제형으로 제조될 수 있으며, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있고, 휴대성이 뛰어나, 본 발명의 건강기능식품은 눈 손상 개선 효과를 증진시키기 위한 보조제로 섭취가 가능하다.
상기 건강기능식품이 취할 수 있는 형태에는 제한이 없으며, 통상적인 의미의 식품을 모두 포함할 수 있고, 기능성 식품 등 당업계에 알려진 용어와 혼용 가능하다. 아울러 본 발명의 건강기능식품은 당업자의 선택에 따라 식품에 포함될 수 있는 적절한 기타 보조성분과 공지의 첨가제를 혼합하여 제조할 수 있다. 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 본 발명에 따른 추출물을 주성분으로 하여 제조한 즙, 차, 젤리 및 주스 등에 첨가하여 제조할 수 있다. 또한 동물을 위한 사료로 이용되는 식품도 포함한다.
본 발명의 또 다른 일 측면은, 황칠 추출물을 유효성분으로 포함하는 안질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 황칠 추출물은 전술한 바와 같다.
상기 “예방”은 본 발명에 따른 조성물의 투여로 안질환의 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
상기 “치료”는 본 발명에 따른 조성물의 투여로 안질환의 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
상기 “안질환”은 청색광(blue light)에 의해 유발되는 안질환일 수 있고, 구체적으로 청색광에 의한 A2E의 광산화 및 이의 축적 또는 드루젠의 축적 및 광산화에 의한 망막 질환을 의미할 수 있다. 구체적으로, 상기 안질환은 망막 변성(retinal degeneration), 황반변성(macular degeneration), 녹내장(glaucoma), 망막색소변성증(retinitis pigmentosa), 스타가트병(Stargardt disease), 맥락막 결손(choroideremia), 맥락망막 위축(gyrate-atrophy), 망막박리(retinal detachment), 시신경병증 (optic neuropathy) 및 안구 건조증(dry eye syndrome)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 의미할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 황반변성(macular degeneration: MD)은 황반의 손상에 의해 중심 시력이 파괴되는 현상을 의미하며, 상기 황반변성 질환은 건성 황반변성, 습성 황반변성, 연령관련 황반변성, 근시성 황반변성 및 특발성 황반변성 등을 포함할 수 있고, 구체적으로 노인성 황반변성(age related macular degeneration: AMD)일 수 있다
노인성 황반변성에 대한 정확한 병인은 아직 확실하게 알 수 없지만, 일반적으로 노화에 따른 망막색소상피세포에 과도한 색소물질의 축적이 노인성 황반변성의 초기 진행 단계에 나타나는 것으로 알려져 있으며, 올 트랜스 레티날(all-trans-retinal)과 에탄올아민(ethanolamine)의 합성에 의해 생성되는 A2E은 대표적으로 망막상피세포에 축적되는 물질로 청색광에 의해 1중항산소(singlet oxygen)를 생성하고, 탄소간 이중결합부위가 산화되면서 망막색소상피세포에 손상을 일으킬 수 있다.
상기 안질환의 예방 또는 치료는 청색광에 의해 산화된 A2E에 의한 세포 사멸을 억제하거나, 드루젠의 축적을 억제함으로써 달성할 수 있다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는 망막색소상피세포 내 A2E 축적 후 청색광 조사 시 세포 사멸이 발생하지만, 황칠 추출물을 처리할 경우 세포 사멸이 억제되는 효과가 있음을 확인하였다. 또한, 망막색소상피세포에 황칠 추출물을 처리할 경우 드루젠의 축적이 억제되는 효과가 있음을 확인하였다. 즉, 본 발명의 황칠 추출물은 청색광에 노출됨으로써 나타나는 망막색소상피세포의 사멸을 저해하거나, 드루젠의 축적을 억제함으로써 안질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
상기 약학적 조성물은 황칠 추출물의 치료학적 유효량(therapeutically effective amount); 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함한다.
상기 "치료학적 유효량"은 본 발명의 조성물이 청색광에 의해 유발되는 안질환의 치료 또는 예방 효능을 달성하는 데 충분한 양을 의미한다.
상기 약학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 약학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육내 주입, 복강내 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다.
상기 약학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다.
상기 약학적 조성물의 일일 투여량은 0.0001~100 mg/kg으로, 바람직하게는 0.001~30 mg/kg의 양을 1일 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있다. 아울러, 투여 기간은 1일 내지 2개월일 수 있으나, 질환의 예방 또는 치료 효과가 나타날 때까지 제한 없이 투여될 수 있다.
상기 약학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이 때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
상기 약학적 조성물은 또한, 점안액 및 안 연고와 같은 안과용 조성물로서 제제화될 수 있다. 상기 형태는 안과 분야에서 사용되는 안구 국소 투여용의 모든 안과용 제제를 포함할 수 있다. 점안액은 활성 성분을 식염수 및 완충액과 같은 멸균 수용액에 용해시킴으로써 제조된다. 점안액은 사용 전에 용해되도록 분말 조성물로서 제공될 수 있거나, 또는 사용 전에 용해되도록 분말 조성물과 배합함으로써 제공될 수 있다. 안 연고는 활성 성분을 연고 기제에 혼합함으로써 제조될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.
[제조예]
황칠 추출물의 제조
황칠나무(Dendropanax morbifera)의 잎과 가지 2kg에 중량 대비 15배수의 30%(v/v) 에탄올 수용액을 가하고, 80 ℃에서 8시간 동안 1-3회 추출하고, 각 추출에서 얻어진 추출물들을 혼합한 추출액을 5 μm 필터를 이용하여 여과하였다. 여액은 회전감압농축기(BUCHI, R-220)를 이용하여 55 ℃에서 농축하였다. 농축액에 멸균된 증류수를 가해 20 brix가 되도록 희석한 후 동결건조 하여 황칠추출물 분말 210 g을 수득하였다.
[실험예 1]
황칠 추출물에 의한 A2E의 광산화 억제 효과
망막색소상피세포에 축적된 A2E는 황반변성의 원인물질로 망막색소상피세포에 침착하며 청색광 조사 시 광산화가 일어나 세포독성을 유발하는 것으로 알려져 있다. 황칠 추출물이 A2E의 광산화를 억제하는 효과가 있는지 확인하기 위하여 인간 망막색소상피세포주인 ARPE-19 세포 및 A2E를 이용하였다.
구체적으로, ARPE-19 세포(CRL-2302, ATCC, USA)에 A2E(Gene and cell technologies, USA) 90 μM을 처리하고, 상기 제조예에서 제조한 황칠 추출물 0, 7.8, 15.6, 31.25, 62.5, 125, 250 μg/mL를 처리한 다음 청색광(430 nm, intensity: 2.0~2.5mW/cm2)을 10분 동안 조사하였다. A2E가 광산화된 정도를 측정하기 위해 청색광의 조사 전과 후에 micro plate leader 를 사용하여 440 nm에서의 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 도 1에 나타난 바와 같이 황칠 추출물 처리군에서는 황칠 추출물을 처리하지 않은 음성대조군에 비하여 산화된 A2E의 축적이 40~75% 억제되는 것으로 나타났다.
이로부터 황칠 추출물은 세포 내 A2E 축적을 억제하고 A2E의 광산화를 억제하는 효과가 있음을 알 수 있다.
[실험예 2]
황칠 추출물에 의한 드루젠의 광산화 및 축적 억제 효과
드루젠(drusen)이 망막상피세포에 축적되면 황반부 조직이 얇아지거나 위축되어 시기능 손상과 시력저하가 발생하고 황반변성을 유발하는 것으로 알려져 있다. 드루젠은 광산화 이후 peroxy-A2E에 의해 망막 세포에서 세포독성 물질인 글리옥살(glyoxal), 메틸글리옥살(methylglyoxal, MGO)와 같은 활성 디카보닐 종이 생성되고, 이들은 다시 세포내 단백질들과 비특이적으로 결합하여 MGO-변형 부가물(MGO-modified adducts)를 형성하여 망막 세포내 축적된다. 이들 MGO-변형 부가물들 또한 드루젠의 한 성분으로 작용하여 건성망막병증을 악화시키는 것으로 알려져 있는바, 황칠 추출물이 드루젠의 광산화 및 MGO-변형 부가물의 축적을 억제하는 효과가 있는지 확인하였다.
구체적으로, 50mM phosphate buffer (pH 7.4)에 용해시킨 10 mg/mL의 bovine serum albumin (Sigma, St, Louis, MO, USA), 0.7 ml, 0.22 M methylglyoxal 0.1 ml를 넣고 상기 제조예에서 제조한 황칠 추출물 0, 7.8, 15.6, 31.25, 62.5, 125, 250 μg/mL를 총 volume 1mL 가 되도록 처리하였다. 이를 37℃에서 7일간 방치하여 당화 생성물(glycation product)의 생성을 유도하였다. 일주일 후 micro plate leader 를 사용하여 450 nm에서의 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이 황칠 추출물 처리군에서는 황칠 추출물을 처리하지 않은 음성대조군에 비하여 MGO-modified adducts의 축적이 억제되는 것으로 나타났다.
이로부터 황칠 추출물은 드루젠의 광산화 및 MGO-modified adducts의 축적을 억제함으로써 눈 손상을 방지하고, 황반변성의 발병 및 악화를 억제하는 효과가 있음을 알 수 있다.
[실험예 3]
황칠 추출물의 청색광 유도 광산화에 대한 망막색소상피세포 보호 효과
망막색소상피세포에 축적된 A2E는 청색광 조사 시 광산화가 일어나 세포독성을 유발하여 세포사멸을 유도하는바, 황칠 추출물이 청색광에 의해 유도되는 세포독성 및 세포사멸을 억제할 수 있는지 확인하였다.
구체적으로, ARPE-19세포에 상기 제조예에서 수득한 황칠 추출물 0, 50 μg/mL 클로로겐산 50 μg/mL, 네오클로로겐산 50 μg/mL, 스티그마스테롤 50 μg/mL 또는 루테인 50 μg /mL를 24시간 동안 처리한 다음, A2E 20 μM을 24시간 동안 처리하고, 청색광을 10분 동안 조사하였다. 이후, ARPE-19세포의 세포생존율을 셀 카운팅 키트(cell counting kit, Dojindo Labs, 일본)로 측정하였으며, A2E를 축적시키고, 청색광을 조사하지 않은 대조군에 대한 각 처리군의 세포생존율을 백분율(%)로 나타내었다.
그 결과, A2E를 축적시키고, 청색광을 조사한 음성대조군의 세포생존율이 대조군 대비 유의하게 감소하여 세포 사멸이 유도되었다. 반면, 황칠추출물 처리군에서는 A2E만 처리한 음성대조군에 비해 세포 생존율이 증가한 것으로 확인되었으며, 이는 루테인을 처리한 양성대조군에 비해서도 세포 생존율이 증가한 것으로 나타났다.
이로부터, 황칠 추출물은 망막색소상피세포에 축적 및 산화된 A2E에 의한 세포 사멸을 억제함으로써 황반변성을 예방 또는 치료하는 것을 알 수 있다.
[실험예 4]
황칠 추출물의 청색광 유도 광산화에 대한 망막색소상피세포 보호 효과
망막색소상피세포에 축적된 A2E는 청색광 조사 시 광산화가 일어나 세포독성을 유발하여 세포사멸을 유도하는바, 황칠 추출물이 청색광에 의해 유도되는 세포독성 및 세포사멸을 억제할 수 있는지 확인하였다.
구체적으로, ARPE-19세포에 상기 제조예에서 수득한 황칠 추출물 0, 50 μg/mL 클로로겐산 50 μg/mL, 네오클로로겐산 50 μg/mL, 스티그마스테롤 50 μg/mL 또는 루테인 50 μg /mL를 24시간 동안 처리한 다음, A2E 20 μM을 24시간 동안 처리하고, 청색광을 10분 동안 조사하였다. 이후, ARPE-19세포의 세포생존율을 셀 카운팅 키트(cell counting kit, Dojindo Labs, 일본)로 측정하였으며, A2E를 축적시키고, 청색광을 조사하지 않은 대조군에 대한 각 처리군의 세포생존율을 백분율(%)로 나타내었다.
그 결과, 도 3에 나타난바와 같이, A2E를 축적시키고, 청색광을 조사한 음성대조군의 세포생존율이 대조군 대비 유의하게 감소하여 세포 사멸이 유도되었다. 반면, 황칠추출물 처리군에서는 A2E만 처리한 음성대조군에 비해 세포 생존율이 증가한 것으로 확인되었으며, 이는 루테인을 처리한 양성대조군에 비해서도 세포 생존율이 증가한 것으로 나타났다.
이로부터, 황칠 추출물은 망막색소상피세포에 축적 및 산화된 A2E에 의한 세포 사멸을 억제함으로써 황반변성을 예방 또는 치료하는 것을 알 수 있다.
[실험예 5]
황반 변성 동물 모델에서 황칠 추출물의 광수용체 세포 손상 또는 변형 개선 효과
건성황반변성에 의해 황반부위에 드루젠이 축적되면 광산화 되어 주변 조직 및 시신경세포에 손상을 유발하여 시력을 떨어뜨리고, 심할 경우 시신경 세포가 소실되어 망막 세포의 사멸이 유발된 상태인 지도모양위축(geographic atrophy)이 나타난다. 청색광을 포함하는 과도한 광원조사로 시신경세포의 손상을 유발하여 건성황반변성과 유사한 시신경세포의 소실을 유발한 동물 모델에서, 황칠 추출물이 광수용체 세포의 손상 또는 변형을 개선하는 효과가 있는지 확인하기 위하여 망막의 외과립층(outer nuclear layer, ONL) 두께 변화를 측정하였다.
구체적으로, 6주령의 수컷 BALB/c 마우스((주)오리엔트)를 1주일 동안 순화시키고, 청색광을 포함하는 백색 LED 노출 전날 저녁부터 14시간 동안 빛이 없는 어두운 곳에서 암적응(dark adaptation) 시킨 후, 다음날 아침 1% 트로피카마이드 안약(tropicamide eye drop)으로 동공을 확장시켰다. 그 후, 특수 제작한 5000 lux 밝기의 cooled white LED light 판넬을 이용하여 0.5시간 동안 노출시키고, 24시간 동안 암실에 두었다. 시험 약물은 광원 노출 후 7일 동안 매일 1회 경구투여 하였다. 투여한 약물의 농도는 아래 표 1과 같으며, 노화된 망막신경세포를 활성화해 황반변성 예방에 도움을 준다고 알려진 네오클로로겐산과 눈 영양제의 성분으로 널리 알려진 루테인을 양성 대조군으로 설정하고, 상기 제조예의 황칠 추출물을 농도별로 투여하였다. 약물 투여 종료 후 부검을 실시하여 안구를 적출하고, 10% 중성화 포르말린에 하루 동안 고정한 후 파라핀으로 포매하여 슬라이드 절편을 제작하였다. 슬라이드 절편은 헤마톡실린&에오신(H&E) 염색을 수행하여 광학현미경 하에서 관찰하였고, 광수용체 세포의 손상 또는 변형은 망막조직의 외과립층의 두께 변화를 측정하여 평가하였다.
시험군 그룹명 투여약물 투여 농도
(mg/kg/day) 		마릿수
정상 대조군 Normal - - 8
음성 대조군 LRD - - 8
황칠 추출물 투여군 DM-25 황칠 추출물 25 8
황칠 추출물 투여군 DM-50 황칠 추출물 50 8
황칠 추출물 투여군 DM-100 황칠 추출물 100 8
황칠 추출물 투여군 DM-200 황칠 추출물 200 8
양성 대조군 NCA-6.5 네오클로로겐산 6.5 8
양성 대조군 Lutein-20 루테인 20 8
그 결과, 도 4 및 도 5에 나타난 바와 같이 음성 대조군에서는 시신경세포의 핵이 포함된 외과립층(outer nuclear layer, ONL)의 세포핵이 감소하면서 두께가 감소해 있었으며, 황칠 추출물을 투여할 경우 농도 의존적으로 외과립층의 두께가 증가하는 것으로 나타났고, 루테인과 대비하여 효능이 더 우수하였다.그러나, 황칠 추출물을 100mg/kg로 투여한 실험군보다 200mg/kg로 투여한 실험군에서 외과립층 두께 증가 효과가 다소 감소하였으며, 이는 황칠 추출물의 투여 농도가 높아지면서 추출물에 포함되어 있는 다양한 파이토화합물(phytocompound) 들에 의해 오히려 유효물질의 흡수가 경쟁적으로 억제되어 나타난 현상으로 추측된다. 다른 양성 대조군인 네오클로로겐산 투여군도 외과립층의 두께는 증가하였으나 통계적으로 유의적이지 않았다.
이로부터 황칠 추출물은 망막의 외과립층(outer nuclear layer, ONL) 두께 를 증가시켜 광수용체 세포의 손상 또는 변형을 개선하는 효과가 있음을 알 수 있다.
[실험예 6]
황반 변성 동물 모델에서 황칠 추출물의 시세포 활성 감소 개선 효과 확인
망막전위도(ERG, electroretinogram)는 빛에 대한 시신경의 반응으로 생긴 전기적인 신호를 나타내는 망막시신경의 전위도로, 망막 손상이나 질병의 유무를 확인하는 지표로 이용된다. 망막전위도는 a 파 및 b 파로 구성되어 있으며, a 파는 광수용체에 의해서 나타나고, b 파는 망막이 광자극에 의해 내핵층(inner nuclear layer)에 있는 양극성 세포(bipolar cell)가 탈분극(depolarization)되어 생기게 된다. 과도한 광원조사로 시신경세포의 손상을 유발하여 건성황반변성과 유사한 시신경세포의 소실을 유발한 동물 모델에서, 황칠 추출물이 시세포의 활성 감소를 개선하는 효과가 있는지 확인하기 위하여 망막전위도를 측정하였다.
구체적으로, 상기 실험예 5에서 사용한 동물 모델을 부검 하루 전 16시간 이상 암순응시킨 후에, 이소플루란(포란, 중외제약)으로 호흡마취시킨 후, 0.5% 트로피카마이드(tropicamide)를 이용하여 동공을 확장시켰다. 전신마취하에 체온을 유지시킨채 안구에 1% 메틸셀룰로스를 적당량 도포하고 Gold wire loops 관전극(recording electrode)을 각막에 접지시킨 후 불관전극(reference electrode)을 뺨부위에, 접지전극 (ground eletrode)는 꼬리에 접지시킨 후, Retiport (Roland consult, Germany)를 이용하여 망막전위도를 측정하였다. white LED light를 조사하여 자극시킨 후, 암순응 섬광반응 (scotopic flash response)으로부터 a 파와 b 파를 구하였고, 상기 표 1에 개시된 대로 시험 약물을 투여하여 a 파와 b 파를 측정하여 시세포의 활성 정도를 측정하였다.
그 결과, 도 6에 나타난바와 같이, 황칠 추출물의 투여가 a 파 및 b 파의 신경전도를 개선하며 시세포의 활성 감소를 개선함을 확인하였으며, 그 효능은 루테인 대비 우수하였다. 다만, 황칠 추출물을 100mg/kg로 투여한 실험군보다 200mg/kg로 투여한 실험군에서 신경전도를 개선 효과가 다소 감소하였으나, 그 차이는 크지 않았다. 다른 양성 대조군인 네오클로로겐산 투여군도 망막의 신경전도가 개선되었으나, 통계적으로 유의적이지 않았다.
이로부터 황칠 추출물은 시세포의 활성 감소를 개선하는 효과가 있음을 알 수 있다.
[실험예 7]
황반 변성 동물 모델에서 황칠 추출물의 광수용체 세포 손상 또는 변형 개선 효과
황칠 추출물이 광수용체 세포의 손상 또는 변형을 개선하는 효과가 있는지 확인하기 위하여, 광수용체 세포에 독성이 있는 N-메틸-N-니트로소우레아(N-methyl-N-nitrosourea, MNU)를 투여하여 건성황반변성과 유사한 시신경세포의 소실을 유발한 동물 모델에서 망막의 외과립층(outer nuclear layer, ONL) 두께 변화를 측정하였다.
구체적으로, 6주령의 수컷 BALB/c 마우스((주)오리엔트)를 1주일 동안 순화시키고, 광수용체 세포의 손상 및 변성을 유발하기 위하여 N-메틸-N-니트로소우레아(N-methyl-N-nitrosourea, MNU)(Sigma, USA)을 0.05% 아세트산 용액에 1% 농도가 되도록 준비하여 마우스의 복강에 1% 농도로, 각 개체당 60mg/kg 만큼 복강으로 투여하였으며, 음성 대조군에서는 동량의 0.05% 아세트산만 복강 투여하였다. 시험 약물은 N-메틸-N-니트로소우레아 투여 후 같은 날부터 7일 동안 매일 1회 경구투여 하였다. 투여한 약물의 농도는 아래 표 2와 같으며, 노화된 망막신경세포를 활성화해 황반변성 예방에 도움을 준다고 알려진 네오클로로겐산과 눈 영양제의 성분으로 널리 알려진 루테인을 양성 대조군으로 설정하고, 상기 제조예의 황칠 추출물을 농도별로 투여하였다. 약물 투여 종료 후 부검을 실시하여 안구를 적출하고, 10% 중성화 포르말린에 하루 동안 고정한 후 파라핀으로 포매하여 슬라이드 절편을 제작하였다. 슬라이드 절편은 헤마톡실린&에오신(H&E) 염색을 수행하여 광학현미경 하에서 관찰하였고, 광수용체 세포의 손상 또는 변형은 망막조직의 외과립층의 두께 변화를 측정하여 평가하였다.
시험군 그룹명 투여약물 투여 농도
(mg/kg/day) 		마릿수
정상 대조군 Normal - - 5
음성 대조군 MNU - - 5
황칠 추출물 투여군 DM-10 황칠 추출물 10 5
황칠 추출물 투여군 DM-25 황칠 추출물 25 5
황칠 추출물 투여군 DM-50 황칠 추출물 50 5
황칠 추출물 투여군 DM-100 황칠 추출물 100 5
양성 대조군 NCA-6.5 네오클로로겐산 6.5 5
양성 대조군 NCA-13 네오클로로겐산 13 5
양성 대조군 Lutein 루테인 20 5
그 결과, 도 7 및 도 8에 나타난 바와 같이 음성 대조군에서는 시신경세포의 핵이 포함된 외과립층(outer nuclear layer, ONL)의 세포핵이 감소하면서 두께가 감소해 있었으며, 황칠 추출물을 투여할 경우 농도 의존적으로 외과립층의 두께가 증가하는 것으로 나타났고, 루테인과 대비하여 효능이 더 우수하였다. 다른 양성 대조군인 네오클로로겐산 투여군도 외과립층의 두께는 증가하였으나 통계적으로 유의적이지 않았다.이로부터 황칠 추출물은 망막의 외과립층(outer nuclear layer, ONL) 두께 를 증가시켜 광수용체 세포의 손상 또는 변형을 개선하는 효과가 있음을 알 수 있다.
[실험예 8]
황반 변성 동물 모델에서 황칠 추출물의 망막색소상피세포 손상 개선 효과
황칠 추출물이 망막색소상피세포의 손상을 개선하는 효과가 있는지 확인하기 위하여 망막색소상피세포에 독성이 있는 요오드산 나트륨(NaIO3)를 투여하여 상부에 위치한 망막 조직에 형태학적 변형을 유발한 동물 모델에서 망막조직의 접힘(folding) 변형이 발생한 위치를 계수하여 평가하였다.
구체적으로, 6주령의 수컷 SD 랫트((주)오리엔트)를 1주일 동안 순화시키고, 망막색소상피세포의 손상 및 변성을 유발하기 위하여 요오드산 나트륨(NaIO3) (Sigma, USA)을 멸균 생리식염수에 3.5% 농도가 되도록 준비하여 마우스의 복강에 각 개체당 60mg/kg 만큼 복강으로 투여하였으며, 음성 대조군에서는 동량의 생리 식염수만 복강투여하였다. 시험 약물은 요오드산 나트륨 투여 후 같은 날부터 14일 동안 매일 1회 경구투여 하였다. 투여한 약물의 농도는 아래 표 3과 같으며, 노화된 망막신경세포를 활성화해 황반변성 예방에 도움을 준다고 알려진 네오클로로겐산과 눈 영양제의 성분으로 널리 알려진 루테인을 양성 대조군으로 설정하고, 상기 제조예의 황칠 추출물을 농도별로 투여하였다. 약물 투여 종료 후 부검을 실시하여 안구를 적출하고, 10% 중성화 포르말린에 하루 동안 고정한 후 파라핀으로 포매하여 슬라이드 절편을 제작하였다. 슬라이드 절편은 헤마톡실린&에오신(H&E) 염색을 수행하여 광학현미경 하에서 관찰하였고, 망막색소상피세포의 손상 또는 변형은 망막조직의 접힘(folding) 변형이 발생한 위치를 계수하여 평가하였다.
시험군 그룹명 투여약물 투여 농도
(mg/kg/day) 		마릿수
정상 대조군 Normal - - 5
음성 대조군 NaIO3 - - 5
황칠 추출물 투여군 DM-25 황칠 추출물 25 5
황칠 추출물 투여군 DM-50 황칠 추출물 50 5
황칠 추출물 투여군 DM-100 황칠 추출물 100 5
양성 대조군 NCA 네오클로로겐산 6.5 5
양성 대조군 Lutein 루테인 50 5
그 결과, 도 9 및 도 10에 나타난 바와 같이 음성 대조군에서는 망막색소상피세포의 손상으로 인해 망막 조직에 변형이 생겨 접혀진 위치(붉은 화살표)가 다수 관찰되었으며, 황칠 추출물을 투여할 경우 농도 의존적으로 망막 조직에 변형이 생겨 접혀진 위치가 억제된 것으로 나타났고, 루테인과 대비하여 효능이 더 우수하였다.이로부터 황칠 추출물은 망막 조직의 변형을 억제하여 망막색소상피세포의 손상 또는 변형을 개선하는 효과가 있음을 알 수 있다.
[실험예 9]
황칠 추출물의 황반 변성 개선 효과의 작용 기전 확인
[9-1] 황칠 추출물의 광조사에 의한 시신경세포 손상 개선의 작용 기전 확인
상기 실험예 5에서 확인한 광조사에 의한 시신경세포 손상 개선 효과의 작용 기전을 확인하기 위하여, 과도한 광원조사에 의한 시신경세포의 손상 및 소실이 세포 사멸에 의한 것이며, 황반 변성 동물 모델에서 황칠 추출물의 광수용체 세포 손상 또는 변형 개선 효과가 항-세포 사멸 효과에 의한 것인지 확인하였다.
구체적으로, 상기 실험예 5의 동물 모델에서 시신경 세포 손상 및 소실분석을 위해 제작한 망막 조직 슬라이드를 이용하여 시신경 세포의 사멸 정도를 분석하였다. 시험약물 투여 종료 후 부검을 실시하여 안구를 적출한 후, 10% 중성화 포르말린에 하루 동안 고정하고 파라핀으로 포매하여 슬라이드 절편을 제작하였다. 조직절편을 탈 파라핀 하여 수화시킨 후 PBS로 세척한 20ug/ml 농도의 proteinase K 용액에 15분간 37℃에서 처리한 다음 다시 PBS로 세척하였다. TUNEL 반응 혼합 용액 (In situ cell death detection kit, AP, Roche, Germany)을 1시간 동안 37℃에서 반응시킨 후 현미경 하에서 관찰하였다.
그 결과, 도 11 및 도 12에 나타난바와 같이, 광조사를 통해 황반 변성을 유발한 망막에서는 강글리온 세포 층(Ganglion cell layer, GCL), 내과립층(Inner nuclear layer, INL), 외과립층(Outer nuclear layer, ONL) 3개 층의 모든 세포에서 세포 사멸이 유발되었으며, 특히, 외과립층의 시신경세포 핵에서 강한 TUNEL 양성반응이 확인되어 외과립층에서 세포 사멸이 가장 많이 발생하는 것을 확인하였다. 그러나, 황칠 추출물을 처리하는 경우 농도 의존적으로 시신경 세포핵 층에서 TUNEL 양성반응이 감소하여 세포 사멸이 억제되는 것을 확인하였으며, 루테인에 비해 효능이 우수하였다.
이로부터 황칠 추출물은 광조사를 통해 유발된 망막의 세포 사멸을 억제하여 시신경 세포의 손상을 개선함을 알 수 있다.
[9-2] 황칠 추출물의 세포 사멸 억제 작용 기전 확인
상기 실험예 9-1에서 확인한 결과를 검증하기 위하여, 망막 조직에서 세포 사멸과 연관된 단백질의 발현을 확인하였다.
구체적으로, 상기 실험예 9-1에서 사용한 망막조직을 액체 질소에서 급속 냉동시킨 뒤 -70℃에 보관하였다. 균질화 버퍼(pH 7.6)로 균질화한 시료를 단백 정량한 뒤, 30ug씩 SDS-PAGE 하에서 전기영동을 수행하였다. 이후 transfer buffer (0.25 M Tris, 1.92 M Glycine, pH 8.3-8.4)를 사용하여 PVDF 막 (Bio-Rad Laboratories, CA, USA)으로 단백질을 이동시켰다. TBST (200 mM Tris, 1.37 M NaCl, 0.05% Tween 20) 용액에 5% 무지방 우유를 녹여 30분간 블록킹한 후, 일차 항체를 4°C에서 배양하고, TBST로 10분씩 3회 세척한 다음 HRP-결합된 이차 항체를 반응시켜 다시 TBST로 10분씩 3회 세척하였다. 그 후, enhanced chemiliuminescence (ECL) 용액으로 반응 시켜 LAS-3000 (Fuji film, Japan)으로 세포 사멸과 연관된 신호전달 물질인 Bax, Bcl-2, caspase-3의 발현 정도를 확인하였다.
그 결과, 도 13에 나타난바와 같이, 세포 사멸을 유도하는 pro-apoptotic 인자인 Bax의 경우 황칠 추출물 처리로 인해 현저하게 발현이 감소하였고, 항-세포사멸 인자인 Bcl-2은 황칠 추출물 처리시 발현이 증가하였다. 더불어 황반 변성을 유발한 경우에 세포 사멸시 발현되는 절단된 형태의 caspase-3 발현이 현저하게 증가하였지만, 황칠 추출물 처리로 인해 발현이 감소하는 것이 확인되었다.
이로부터 황칠 추출물은 세포 사멸 인자를 억제하고, 항 세포 사멸 인자는 활성화하여 시신경 세포의 손상을 개선함을 알 수 있다.
[9-3] 황칠 추출물의 망막색소상피세포 손상 개선 효과의 작용 기전 확인
황반변성 발생시 망막색소상피세포(RPE)의 손상 및 투과성에 문제가 발생하게 되는데, 이러한 망막색소상피세포의 손상 억제 및 투과성 변화를 검증하기 위해 세포-세포 밀착 연접 단백질인 ZO-1의 변화를 확인하였다.
구체적으로, 부검시 안구를 적출한 후 망막색소상피층이 포함된 망막색소상피세포-맥락막-공막 복합체(RPE-choroid-sclea complex)를 분리하기 위해, 실체현미경으로 관찰하며 안구로부터 수정체, 전안부(anterior chamber), 망막을 제거하고 안구의 뒤쪽 eyecup을 4% 파라포름알데히드(PFA)에 담가 4°C에서 하룻동안 고정하였다. 하루 뒤 고정액을 제거하기 위해 PBS로 수회 세척한 후, eyecup의 4군데 모서리를 잘라 슬라이드 글라스 위에 평평하게 펼쳤다. 블록킹 용액(10% normal goat serum)을 10분간, 항-ZO-1 항체(1:200, Cat# 61-7300, Invitrogen, Carlsbad, CA)에서 1시간 동안 처치하여 수 회 세척하였다. 2차 항체로 Alexa Fluor 488 goat-anti-rabbit (1:500; Cat# A-11008, Invitrogen)을 1시간 동안 처리하고 평판화된 망막색소상피세포-맥락막-공막 복합체는 형광 현미경(Oylmpus, Tokyo, Japan)으로 관찰하였다.
그 결과, 도 14에 나타난바와 같이, 정상군의 경우 망막색소상피세포막에 전혀 변화가 관찰되지 않은 반면에, 요오드산 나트륨(NaIO3)를 투여하여 망막 조직에 형태학적 변형을 일으킨 군(dAMD)에서는 망막색소상피세포의 크기가 변화하고, 세포막이 무너지는 것을 확인하였다. 그러나 황칠 추출물을 처리한 군에서 망막색소상피세포의 변화가 농도의존적으로 억제되는 것을 확인할 수 있었다.
이로부터 황칠 추출물은 망막색소상피세포의 밀착 연접을 구성하는 단백질을 유지하여, 망막색소상피세포 손상을 개선함을 알 수 있다.
정리하자면, 황칠 추출물은 황반변성의 원인물질인 드루젠의 광산화 억제를 통해 시신경세포의 손상을 억제하고, 세포 사멸 신호전달 물질의 발현을 억제하여 시신경세포의 세포 사멸을 억제할뿐 아니라, 망막색소상피세포에서 밀착 연접 단백질을 유지하여 황반 변성을 개선하는 효과를 나타냄을 알 수 있다(도 15).

Claims (10)

  1. 황칠 추출물을 유효성분으로 포함하는 눈 손상 방지용 조성물.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 추출물은 물, C1~C4의 알코올 또는 이들의 혼합용매로 추출된 것인 눈 손상 방지용 조성물.
  3. 청구항 1에 있어서,
    상기 눈 손상은 청색광(blue light)에 의해 유발되는 것인, 눈 손상 방지용 조성물.
  4. 청구항 1에 있어서,
    상기 눈 손상은 눈의 산화적 손상, 눈의 노화, 눈의 피로, 눈의 기능 저하 또는 안질환에 의해 발생되는 눈 손상인 것인, 눈 손상 방지용 조성물.
  5. 청구항 4에 있어서,
    상기 안질환은 망막 변성(retinal degeneration), 황반변성(macular degeneration), 녹내장(glaucoma), 망막색소변성증(retinitis pigmentosa), 스타가트병(Stargardt disease), 맥락막 결손(choroideremia), 맥락망막 위축(gyrate-atrophy), 망막박리(retinal detachment), 시신경병증 (optic neuropathy) 및 안구 건조증(dry eye syndrome)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인, 눈 손상 방지용 조성물.
  6. 청구항 1에 있어서,
    상기 조성물은 청색광에 의한 N-레티닐리덴-N-레티닐-에탄올아민(N-retinylidene-Nretinyl-ethanolamine: A2E)의 산화를 억제하고, 산화된 A2E에 의한 세포 사멸을 억제하고, 드루젠(drusen)의 축적을 억제하고, 망막의 외과립층(outer nuclear layer, ONL) 두께를 증가시키고, 시세포의 활성 감소를 개선하고, 망막 조직의 변형을 억제하는 것인, 눈 손상 방지용 조성물.
  7. 황칠 추출물을 유효성분으로 포함하는 눈 손상 예방 또는 개선용 건강기능식품.
  8. 황칠 추출물을 유효성분으로 포함하는 안질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  9. 청구항 8에 있어서,
    상기 안질환은 청색광(blue light)에 의해 유발되는 것인, 안질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  10. 청구항 8에 있어서,
    상기 안질환은 망막 변성(retinal degeneration), 황반변성(macular degeneration), 녹내장(glaucoma), 망막색소변성증(retinitis pigmentosa), 스타가트병(Stargardt disease), 맥락막 결손(choroideremia), 맥락망막 위축(gyrate-atrophy), 망막박리(retinal detachment), 시신경병증 (optic neuropathy) 및 안구 건조증(dry eye syndrome)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인, 안질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
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