WO2022250027A1 - 家畜の腸管細胞の炎症抑制剤 - Google Patents
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Abstract
Description
家畜の腸内では悪玉菌の分解産物であるLPS(リポ多糖)等により腸管炎症が惹起され、結果として下痢や大腸炎を含む種々の消化管の疾病や、栄養不足による抵抗力、免疫力の低下とそれに伴う疾患への罹患が畜産の現場では大きな問題となっている。
これに対し、整腸効果を目的として、バチルス菌やビフィズス菌などの微生物生菌剤が畜産用途でも用いられている。しかしながら、炎症性サイトカインの分泌抑制効果を確認された天然物製剤はなかった。
ここで、特許文献3には、カシューナッツ殻油及び/又はアナカルド酸類と共に、ビタミンA、ビタミンB、ビタミンC、ビタミンD、及びビタミンEから選ばれる少なくとも1種を含有することを特徴とするコクシジウム症防除剤が開示されているが、ビタミンKとの組み合わせの開示はない。また、上記いずれの文献にも家畜の腸管炎症抑制に関しての開示はない。
[1]カシューナッツ殻油、加熱処理カシューナッツ殻油、アナカルド酸、カルダノールおよび/またはカルドール並びにビタミンKを非ヒト動物に投与することを特徴とする、非ヒト動物の腸管細胞における炎症を抑制する方法。
[2]カシューナッツ殻油、加熱処理カシューナッツ殻油、アナカルド酸、カルダノールおよび/またはカルドール並びにビタミンKを飼料に混和して非ヒト動物に投与することを特徴とする、[1]に記載の方法。
[3]カシューナッツ殻油、加熱処理カシューナッツ殻油、アナカルド酸、カルダノールおよび/またはカルドールを1ppm~1000ppm(重量)並びにビタミンKを1~20ppm(重量)となるよう飼料に混和して非ヒト動物に投与することを特徴とする、[2]に記載の方法。
[4]前記非ヒト動物が哺乳類であることを特徴とする、[1]~[3]のいずれかに記載の腸管細胞の炎症を抑制する方法。
[5]前記非ヒト動物が家禽、ブタ、または反芻動物であることを特徴とする、[1]~[3]のいずれかに記載の腸管細胞の炎症を抑制する方法。
[6]前記非ヒト動物がウシであることを特徴とする、[1]~[3]のいずれかに記載の腸管細胞の炎症を抑制する方法。
[7][1]~[6]のいずれかに記載の非ヒト動物の腸管細胞の炎症を抑制する方法であって、カシューナッツ殻油、加熱処理カシューナッツ殻油、アナカルド酸、カルダノールおよび/またはカルドール並びにビタミンKの投与により、腸管細胞における炎症性サイトカインの産生を抑制することで、非ヒト動物の腸管細胞の炎症を抑制することを特徴とする、前記方法。
[8]前記炎症性サイトカインがTNFα、IL-6、IL-8およびMCP-1のいずれか1つ以上である、[7]に記載の方法。
[9]ビタミンKがビタミンK1である、[1]~[8]のいずれかに記載の方法。
[10]カシューナッツ殻油および/またはアナカルド酸並びにビタミンKを非ヒト動物に投与することを特徴とする、[1]~[9]のいずれかに記載の方法。
[11]カシューナッツ殻油、加熱処理カシューナッツ殻油、アナカルド酸、カルダノールおよび/またはカルドール並びにビタミンKを有効成分として含有する、非ヒト動物の腸管炎症抑制剤。
[12]ビタミンKがビタミンK1である、[10]に記載の腸管炎症抑制剤。
[13]カシューナッツ殻油および/またはアナカルド酸並びにビタミンKを有効成分として含有する、[11]または[12]に記載の腸管炎症抑制剤。
[14]カシューナッツ殻油、加熱処理カシューナッツ殻油、アナカルド酸、カルダノールおよび/またはカルドール並びにビタミンKを有効成分として含有する、非ヒト動物の腸管細胞における炎症性サイトカインの産生抑制剤。
[15]ビタミンKがビタミンK1である、[14]に記載の炎症性サイトカインの産生抑制剤。
[16]カシューナッツ殻油および/またはアナカルド酸並びにビタミンKを有効成分として含有する、[14]または[15]に記載の炎症性サイトカインの産生抑制剤。
[17]カシューナッツ殻油、加熱処理カシューナッツ殻油、アナカルド酸、カルダノールおよび/またはカルドール並びにビタミンKを含有する、非ヒト動物の腸管炎症抑制用の飼料。
[18]カシューナッツ殻油、加熱処理カシューナッツ殻油、アナカルド酸、カルダノールおよび/またはカルドールを1ppm~1000ppm(重量)並びにビタミンKを1~20ppm(重量)含有する、[17]に記載の飼料。
[19]カシューナッツ殻油、加熱処理カシューナッツ殻油、アナカルド酸、カルダノールおよび/またはカルドールを5ppm~100ppm(重量)並びにビタミンKを1~10ppm(重量)含有する、[17]に記載の飼料。
[20]カシューナッツ殻油、加熱処理カシューナッツ殻油、アナカルド酸、カルダノールおよび/またはカルドールと、ビタミンKの重量比が30:1~30:10である、[17]に記載の飼料。
[21]カシューナッツ殻油および/またはアナカルド酸並びにビタミンKを有効成分として含有する、[17]~[20]のいずれかに記載の飼料。
カシューナッツ殻油は加熱処理カシューナッツ殻油と区別して記載する場合、非加熱カシューナッツ殻油を意味する。
カシューナッツ殻油(非加熱)、加熱処理カシューナッツ殻油、アナカルド酸およびカルダノールのうち、カシューナッツ殻油(非加熱)またはアナカルド酸が好ましく、カシューナッツ殻油(非加熱)が特に好ましい。
腸管細胞としては、腸管上皮細胞が好ましい。
炎症性サイトカインの産生抑制としては、炎症性刺激負荷時に誘発される炎症性サイトカインの産生を抑制することが好ましい。ここで、炎症性刺激としては、LPS(リポ多糖)などの細菌由来の刺激が挙げられる。これにより、細菌感染などによる炎症を効率よく抑制できる。
本発明の腸管細胞の炎症抑制剤や腸管細胞の炎症性サイトカイン産生抑制剤は、腸管細胞の炎症に起因する疾患の予防や治療に好適に使用できる。このような疾患としては細菌感染症、炎症性腸疾患などが挙げられる。
非加熱カシューナッツ殻油を加熱処理(例えば、70℃以上、好ましくは130℃以上)した加熱カシューナッツ殻油は、非加熱カシューナッツ殻油の主成分のアナカルド酸が脱炭酸しカルダノールに変換され、アナカルド酸を0~10質量%、カルダノールを55~80質量%、カルドールを5~30質量%含むものとなる。
ビタミンKの腸管細胞炎症抑制剤および炎症性サイトカインの産生抑制剤におけるビタミンKの含有量は、剤の全量基準で、例えば、0.0001質量%~20質量%、0.001質量%~20質量%または0.01質量%~20質量%である。
本発明の腸管細胞炎症抑制剤および炎症性サイトカインの産生抑制剤の一態様において、吸油剤と、カシューナッツ殻油、加熱処理カシューナッツ殻油、アナカルド酸、カルダノールおよび/またはカルドール並びにビタミンKと、の好ましい質量比は、100:20~100:180である。
液剤としては、カシューナッツ殻油、加熱処理カシューナッツ殻油、アナカルド酸、カルダノールおよび/またはカルドールをそのまま、または、エタノールなどの溶媒に溶かしたうえで、ビタミンKと配合してもよいし、さらに、上記賦形剤または任意成分を添加して用いることもできる。また、以下の粉剤、カプセル剤、ペレット剤、タブレット剤を液中に懸濁・浮遊させてもよい。
粉剤としては、カシューナッツ殻油、加熱処理カシューナッツ殻油、アナカルド酸、カルダノールおよび/またはカルドール並びにビタミンKに上記賦形剤を添加し、粉末化することもできる。
カプセル剤としては、カシューナッツ殻油、加熱処理カシューナッツ殻油、アナカルド酸、カルダノールおよび/またはカルドール並びにビタミンKをそのままカプセルに詰めてもよいし、あるいは上記賦形剤または任意成分を添加してもよい。
ペレット剤としては、カシューナッツ殻油、加熱処理カシューナッツ殻油、アナカルド酸、カルダノールおよび/またはカルドール並びにビタミンKに上記賦形剤を添加し、造粒し、ペレット化することもできる。
錠剤としては、カシューナッツ殻油、加熱処理カシューナッツ殻油、アナカルド酸、カルダノールおよび/またはカルドール並びにビタミンKに上記賦形剤を添加し、造粒し、錠剤化することもできる。
なお、シリカなどの吸油剤を含有する場合には、粉剤や錠剤やペレット剤として製剤化することが好ましい。
したがって、本発明においては、カシューナッツ殻油、加熱処理カシューナッツ殻油、アナカルド酸、カルダノールおよび/またはカルドール並びにビタミンKを有効成分として含有する、非ヒト動物の腸管炎症抑制用の飼料が提供される。
本発明の飼料はカシューナッツ殻油、加熱処理カシューナッツ殻油、アナカルド酸、カルダノールおよび/またはカルドール並びにビタミンKを含有することを特徴とする。
本発明の飼料におけるカシューナッツ殻油、加熱処理カシューナッツ殻油、アナカルド酸、カルダノールおよび/またはカルドールの含有量(2以上を含む場合は合計量)は、飼料の乾物質量当たり、全量基準で1~1000重量ppmが好ましく、1~500重量ppmがより好ましく、1~300重量ppmがさらに好ましく、5~300重量ppmがよりさらに好ましく、5~100重量ppmが特に好ましい。
本発明の飼料におけるビタミンKの含有量は、飼料の乾物質量当たり、全量基準で1~20重量ppmが好ましく、1~10重量ppmがより好ましく、1~5重量ppmがさらに好ましい。
本発明の飼料において、カシューナッツ殻油、加熱処理カシューナッツ殻油、アナカルド酸、カルダノールおよび/またはカルドールの含有量(2以上を含む場合は合計量)は、飼料の乾物質量当たり、全量基準で5~100重量ppmであり、ビタミンKの含有量は、飼料の乾物質量当たり、全量基準で1~10重量ppmであることが好ましい。
本発明の飼料において、カシューナッツ殻油、加熱処理カシューナッツ殻油、アナカルド酸、カルダノールおよび/またはカルドール(2以上を含む場合は合計量)と、ビタミンKとの重量比は、30:1~30:10の範囲であることが好ましい。
この際、粉末状、固形状の剤を用いる場合は、混合を容易にするために液体担体を用いて、剤を液状またはゲル状の形態にしてもよい。この場合は、水、植物油、液体動物油、鉱物油、合成油、水溶性高分子化合物等の流動性液体を液体担体として用いることができる。また、飼料中におけるカシューナッツ殻油、加熱処理カシューナッツ殻油、アナカルド酸、カルダノールおよび/またはカルドール並びにビタミンKの均一性を保つために、アルギン酸、アルギン酸ナトリウム、キサンタンガム、カルボキシメチルセルロース、αデンプン、カゼインナトリウム、アラビアゴム、グアーガム、タマリンド種子多糖類などの水溶性多糖類を配合することも好ましい。
カシューナッツ殻油、加熱処理カシューナッツ殻油、アナカルド酸、カルダノールおよび/またはカルドール並びにビタミンKは飼料に混和して非ヒト動物に投与されることが好ましく、飼料への配合量の好ましい範囲は上述の通りである。
摂取させる飼料の量は、動物の種類、体重、年齢、性別、健康状態、飼料の成分などにより適宜調節することができ、このとき飼料に含まれるカシューナッツ殻油、加熱処理カシューナッツ殻油、アナカルド酸、カルダノールおよび/またはカルドール(2以上を含む場合は合計量)が例えば0.1~50g/頭/日、好ましくは0.5~5g/頭/日であり、ビタミンKの量が例えば0.01~5g/頭/日、好ましくは0.05~0.5g/頭/日である。
細胞培養とLPS刺激、抗炎症物質の評価
1.BIE細胞の播種
12穴プレート(COSTAR社製)にBIE(Bovine Intestinal Epithelial:ウシ腸管上皮)細胞を3.0×104cells / wellで播種し、CO2インキュベーター内で培養する。(day0)
・NC(陰性コントロール) 培地(DMEM ダルベッコ改変MEM培地)
・アセチルサリチル酸 (アスピリン)
アスピリン(BAYER薬品社製)を乳鉢で粉砕したのち、10mg/mlのPBS(リン酸緩衝生理食塩水)溶液を作製し、0.45μm(ADVANTEC TOYO社製)のフィルターで滅菌する。滅菌PBSで500μg/mlに希釈し、1/50容量で培地に添加する。(終濃度 10ppm)
・ビタミンK1
ビタミンK1の50mg/mlのエタノール溶液を作製し、PBSで希釈して0.25mg/mlにしたのち、0.45μm(ADVANTEC TOYO社製)のフィルターで滅菌する。これを1/50容量で培地に添加する。(終濃度 5ppm)
・CNSL(カシュ―ナッツ殻油)
→50mg/ml(CNSL)のエタノール溶液(ストック溶液)を作製し、PBSで希釈して1.5mg/mlの溶液を作製後、フィルター(0.45μm)滅菌する。1.5mg/ml→1/50容量で培地に添加する。(終濃度 30ppm)
上記サンプルを1mlのDMEMに20μl添加し、交換用培地を作製する。
12穴プレートの培地を吸引し、交換用培地で置き換える(day3 朝9時)
LPS刺激
終濃度1μg/mlとなるよう、LPS(リポ多糖)溶液を培地に添加する(day5朝9時)。
ハーベスト
培養上清を回収したのち、滅菌PBSでWELLを洗浄し、TRIZOLで付着細胞を可溶化し、回収する(day5 夜9時、day6 朝9時)(12時間または24時間)
TRIZOL(INVITROGEN社製)溶解サンプルをフェノール-クロロホルム抽出、エタノール沈殿にて粗精製したのち、RNase-free水10μlに溶解し、ナノドロップ(サーモフィッシャー社製)にてO.D.(吸光度)を測定する。
Real Time PCR(IL-6、IL-8、MCP-1およびTNF-α)は TAKARABIOのPrime Script RT reagent Kit with g DNA Eraserのマニュアルに従った。
RT-PCRの結果を図1~7に示す。その結果、CNSLとビタミンKを組み合わせることで、LPSに誘発されるIL-6、IL-8、MCP-1およびTNF-αの発現上昇が効率よく抑制された。
BIE細胞(ウシ腸管上皮細胞)へのエンドトキシン(LPS)刺激に対して、CNSLとアスピリン(アセチルサリチル酸)は炎症メディエイターの働きを抑制することが示唆された。また、ビタミンKとの併用により効果が相乗的に増加することが分かった。
Claims (21)
- カシューナッツ殻油、加熱処理カシューナッツ殻油、アナカルド酸、カルダノールおよび/またはカルドール並びにビタミンKを非ヒト動物に投与することを特徴とする、非ヒト動物の腸管細胞における炎症を抑制する方法。
- カシューナッツ殻油、加熱処理カシューナッツ殻油、アナカルド酸、カルダノールおよび/またはカルドール並びにビタミンKを飼料に混和して非ヒト動物に投与することを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- カシューナッツ殻油、加熱処理カシューナッツ殻油、アナカルド酸、カルダノールおよび/またはカルドールを1ppm~1000ppm(重量)並びにビタミンKを1~20ppm(重量)となるよう飼料に混和して非ヒト動物に投与することを特徴とする、請求項2に記載の方法。
- 前記非ヒト動物が哺乳類であることを特徴とする、請求項1~3のいずれか一項に記載の腸管細胞の炎症を抑制する方法。
- 前記非ヒト動物が家禽、ブタ、または反芻動物であることを特徴とする、請求項1~3のいずれか一項に記載の腸管細胞の炎症を抑制する方法。
- 前記非ヒト動物がウシであることを特徴とする、請求項1~3のいずれか一項に記載の腸管細胞の炎症を抑制する方法。
- 請求項1~6のいずれか一項に記載の非ヒト動物の腸管細胞の炎症を抑制する方法であって、カシューナッツ殻油、加熱処理カシューナッツ殻油、アナカルド酸、カルダノールおよび/またはカルドール並びにビタミンKの投与により、腸管細胞における炎症性サイトカインの産生を抑制することで、非ヒト動物の腸管細胞の炎症を抑制することを特徴とする、前記方法。
- 前記炎症性サイトカインがTNFα、IL-6、IL-8およびMCP-1のいずれか1つ以上である、請求項7に記載の方法。
- ビタミンKがビタミンK1である、請求項1~8のいずれか一項に記載の方法。
- カシューナッツ殻油および/またはアナカルド酸並びにビタミンKを非ヒト動物に投与することを特徴とする、請求項1~9のいずれか一項に記載の方法。
- カシューナッツ殻油、加熱処理カシューナッツ殻油、アナカルド酸、カルダノールおよび/またはカルドール並びにビタミンKを有効成分として含有する、非ヒト動物の腸管炎症抑制剤。
- ビタミンKがビタミンK1である、請求項11に記載の腸管炎症抑制剤。
- カシューナッツ殻油および/またはアナカルド酸並びにビタミンKを有効成分として含有する、請求項11または12に記載の腸管炎症抑制剤。
- カシューナッツ殻油、加熱処理カシューナッツ殻油、アナカルド酸、カルダノールおよび/またはカルドール並びにビタミンKを有効成分として含有する、非ヒト動物の腸管細胞における炎症性サイトカインの産生抑制剤。
- ビタミンKがビタミンK1である、請求項14に記載の炎症性サイトカインの産生抑制剤。
- カシューナッツ殻油および/またはアナカルド酸並びにビタミンKを有効成分として含有する、請求項14または15に記載の炎症性サイトカインの産生抑制剤。
- カシューナッツ殻油、加熱処理カシューナッツ殻油、アナカルド酸、カルダノールおよび/またはカルドール並びにビタミンKを有効成分として含有する、非ヒト動物の腸管炎症抑制用の飼料。
- カシューナッツ殻油、加熱処理カシューナッツ殻油、アナカルド酸、カルダノールおよび/またはカルドールを1ppm~1000ppm(重量)並びにビタミンKを1~20ppm(重量)含有する、請求項17に記載の飼料。
- カシューナッツ殻油、加熱処理カシューナッツ殻油、アナカルド酸、カルダノールおよび/またはカルドールを5ppm~100ppm(重量)並びにビタミンKを1~10ppm(重量)含有する、請求項17に記載の飼料。
- カシューナッツ殻油、加熱処理カシューナッツ殻油、アナカルド酸、カルダノールおよび/またはカルドールと、ビタミンKの重量比が30:1~30:10である、請求項17に記載の飼料。
- カシューナッツ殻油および/またはアナカルド酸並びにビタミンKを有効成分として含有する、請求項17~20のいずれか一項に記載の飼料。
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