WO2022211006A1 - 架橋ポリマー、物質を分離する方法、物質を分離するためのキット、疾患を検査するためのキット及び物質を分離するための装置 - Google Patents

架橋ポリマー、物質を分離する方法、物質を分離するためのキット、疾患を検査するためのキット及び物質を分離するための装置 Download PDF

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crosslinked polymer
group
physiological saline
substance
lipid bilayer
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浩二 太田
秀斉 安部
浩一 右手
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Sanyo Chemical Industries Ltd
University of Tokushima NUC
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Sanyo Chemical Industries Ltd
University of Tokushima NUC
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    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/544—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being organic

Definitions

  • the present invention relates to crosslinked polymers and uses thereof.
  • Extracellular vesicles secreted from cells are vesicles that are surrounded by a lipid bilayer and contain proteins, nucleic acids, etc., and function as intercellular communication mediators.
  • Examples of extracellular endoplasmic reticulum include exosomes, microvesicles, apoptotic bodies and the like.
  • exosomes membrane vesicles with a particle size of 30 to 100 nm
  • Proteins and nucleic acids contained in exosomes reflect the state of the cells that secreted them in real time, and are useful as biomarkers for evaluating the state of the original organism and intercellular communication.
  • a size fractionation method using an ultracentrifuge is widely used as a method for collecting exosomes from biological samples.
  • This method is a method of separating relatively low-density exosomes from other particles using a sucrose density gradient or the like.
  • the size fractionation method using an ultracentrifuge has the problem that the exosomes recovered are not sufficiently pure and the operation takes a long time.
  • the main object of the present invention is to provide a crosslinked polymer useful for separating substances having a lipid bilayer such as exosomes.
  • a crosslinked polymer containing a monomer unit having an acidic group and / or a neutralizing base thereof, which is selected from the group consisting of a cationic group and a hydroxyl group We have found that cross-linked polymers containing compounds with at least one group are useful for the separation of substances with lipid bilayers, such as exosomes.
  • the present invention has been completed through further studies based on this finding.
  • Section 1 A crosslinked polymer for separating a substance having a lipid bilayer from a biological sample, the crosslinked polymer comprising monomer units having an acidic group and/or its neutralizing base, from the group consisting of a cationic group and a hydroxyl group.
  • Section 2. Item 2. The crosslinked polymer according to item 1, wherein the compound has an optionally substituted hydrocarbon group having 12 to 30 carbon atoms.
  • Item 3. Item 3.
  • the cationic group is —N(R 1 ) 2 (wherein each R 1 independently represents a hydrogen atom or an optionally substituted hydrocarbon group having 1 to 6 carbon atoms); , or -N + (R 2 ) 3 (wherein each R 2 is independently a hydrogen atom or an optionally substituted hydrocarbon group having 1 to 6 carbon atoms),
  • the crosslinked polymer according to any one of Items 1 to 3.
  • Items 1 to 3. 5.
  • Any one of items 1 to 4, wherein the hydrocarbon group having 12 to 30 carbon atoms is an aliphatic hydrocarbon group having 12 to 20 carbon atoms or an alicyclic hydrocarbon group having 20 to 30 carbon atoms.
  • the crosslinked polymer according to Item 5 wherein the aliphatic hydrocarbon group is an alkyl group or an alkenyl group, and the alicyclic hydrocarbon group is a group having a steroid skeleton.
  • Item 7. The crosslinked polymer according to any one of Items 1 to 6, wherein the pH of a physiological saline solution containing 0.5% by weight of the crosslinked polymer based on the weight of the physiological saline is 7 to 8.
  • Item 10 A method for separating a substance having a lipid bilayer from a biological sample, the method comprising the following steps (1) and (2): (1) contacting a biological sample with the crosslinked polymer according to any one of claims 1 to 9 to obtain a polymer gel containing a substance having a lipid bilayer; and recovering material having a lipid bilayer.
  • Item 11 A kit for separating a substance having a lipid bilayer from a biological sample, the kit comprising the crosslinked polymer and salt according to any one of items 1 to 9.
  • kits for examining diseases using extracellular vesicles comprising the crosslinked polymer and salt according to any one of items 1 to 9.
  • Item 13. A device for separating a substance having a lipid bilayer from a biological sample, the device comprising means for carrying out the method according to Item 10.
  • Item 14. Item 10. Use of the crosslinked polymer according to any one of Items 1 to 9 for separating a substance having a lipid bilayer from a biological sample.
  • the crosslinked polymer of the present invention can be suitably used for separating a substance having a lipid bilayer from a biological sample.
  • the separation method of the present invention can increase the purity of the separated substance having a lipid bilayer and shorten the operation time, for example, compared to conventional ultracentrifugation methods.
  • the separation method of the present invention can reduce the number of steps and has excellent reproducibility as compared with conventional ultracentrifugation methods.
  • Materials with separated lipid bilayers can be used for status assessment (eg, testing or diagnostics) of the original organism.
  • Substances having separated lipid bilayers can also be used as carriers for cell-targeted therapeutic drugs and the like.
  • crosslinked Polymers contain monomeric units having acidic groups and/or neutralizing bases thereof.
  • the term "acidic group neutralizing base” refers to a neutralizing base with any cation.
  • Specific examples of cations include metals (such as monovalent or divalent metals) of the formula: NR 4 + (wherein each R is independently a hydrogen atom or an optionally substituted hydrocarbon group, and two or three R's may form a ring together with the adjacent nitrogen atoms), and the like.
  • Examples of the monovalent metal include alkali metals such as lithium, sodium, and potassium.
  • Examples of the divalent metals include alkaline earth metals such as magnesium, calcium and barium; lead; zinc; and tin.
  • the hydrocarbon group is, for example, an alkyl group, a cycloalkyl group, an aryl group, an aralkyl group, or the like.
  • alkyl groups include C groups such as methyl group, ethyl group, propyl group (n-propyl group or isopropyl group), butyl group (n-butyl group, isobutyl group, sec-butyl group or t-butyl group).
  • a 1-6 alkyl group and the like are included.
  • Cycloalkyl groups include, for example, C 5-14 cycloalkyl groups such as cyclopentyl group and cyclohexyl group.
  • the aryl group includes, for example, C 6-14 aryl groups such as phenyl group and naphthyl group.
  • the aralkyl group includes, for example, C 7-14 aralkyl groups such as benzyl group and phenethyl group.
  • substituents that can be substituted on the hydrocarbon group include halogen atoms, hydroxyl groups, and mercapto groups.
  • the ring when two or three R form a ring together with the adjacent nitrogen atoms, the ring may be a monocyclic ring such as a pyridine ring or an imidazole ring, It may be a condensed ring such as a quinoline ring.
  • the ring may have one or more substituents, and examples of the substituents include halogen atoms, hydroxyl groups, amino groups, alkyl groups, haloalkyl groups, hydroxyalkyl groups, N,N-dialkyl An amino group and the like can be mentioned.
  • the number of substituents is, for example, one, two, or three.
  • a typical example of a monomer having an acidic group is an unsaturated carboxylic acid.
  • Unsaturated carboxylic acids include, for example, unsaturated monocarboxylic acids and unsaturated dicarboxylic acids.
  • unsaturated monocarboxylic acids include unsaturated monocarboxylic acids having 3 to 10 carbon atoms such as acrylic acid, methacrylic acid and crotonic acid.
  • unsaturated dicarboxylic acids also including anhydrides herein
  • unsaturated dicarboxylic acids include unsaturated dicarboxylic acids having 4 to 10 carbon atoms such as maleic acid, fumaric acid, citraconic acid and itaconic acid, and anhydrides thereof. be done.
  • monomers having an acidic group include, for example, (meth)acrylic monomers having a sulfonic acid group [for example, sulfoalkyl (meth)acrylates such as 2-sulfoethyl (meth)acrylate, 2-(meth)acrylic acid ) N-sulfoalkyl (meth)acrylic acid amide such as acrylamido-2-methylpropanesulfonic acid], (meth)acrylic monomer having a phosphoric acid group [e.g., 2-((meth)acryloyloxy)ethyl phosphate, etc. (meth)acrylic acid phosphonoxyalkyl ester] and the like.
  • (meth)acryl means acryl and/or methacryl
  • (meth)acryloyloxy means acryloyloxy and/or methacryloyloxy.
  • the monomer having an acidic group may be used singly or in combination of two or more.
  • a typical example of a monomer having a neutralizing base for an acidic group is an unsaturated carboxylate.
  • unsaturated carboxylic acid salts include alkali metal salts of unsaturated carboxylic acids (e.g., sodium salts, potassium salts), alkylamine salts (e.g., trialkylamine salts such as triethylamine salts), alkanolamine salts (e.g., dialkanolamine salts such as diethanolamine salts, trialkanolamine salts such as triethanolamine salts), ammonium salts, or tetraalkylammonium salts (eg, tetramethylammonium salts, tetraethylammonium salts).
  • alkali metal salts of unsaturated carboxylic acids e.g., sodium salts, potassium salts
  • alkylamine salts e.g., trialkylamine salts such as triethylamine salts
  • monomers having a neutralizing base of an acidic group include, for example, neutralized salts of the above-mentioned (meth)acrylic monomers having a sulfonic acid group, neutralized salts of (meth)acrylic monomers having a phosphoric acid group, and the like. are mentioned.
  • neutralized salts include the alkali metal salts described above.
  • the monomer having a neutralizing base for an acidic group may be used singly or in combination of two or more.
  • the crosslinked polymer of the present invention preferably contains both a monomer unit having an acidic group and a monomer unit having a neutralizing base of the acidic group. That is, in the crosslinked polymer containing monomer units having an acidic group, it is preferable that part of the monomer units having an acidic group be neutralized and substituted with monomer units having a neutralizing base of the acidic group.
  • the degree of neutralization [100 x (number of moles of neutralizing base of acidic group)/(total number of moles of acidic group and its neutralizing base)] is not particularly limited, but is, for example, 25 mol% or more, 30 mol% or more. , 35 mol% or more, 40 mol% or more, 45 mol% or more, or 50 mol% or more, and may be 90 mol% or less, 85 mol% or less, or 80 mol% or less.
  • the crosslinked polymer of the present invention may contain further monomeric units in addition to monomeric units having acidic groups and/or neutralizing bases thereof.
  • Other monomers include, for example, the following monofunctional ethylenically unsaturated monomers.
  • Esters of unsaturated carboxylic acids e.g. acrylic acid, methacrylic acid, etc.
  • unsaturated carboxylic acids e.g. acrylic acid, methacrylic acid, etc.
  • esters methyl ester, ethyl ester, propyl ester, butyl ester, pentyl ester, hexyl ester, heptyl ester, octyl ester, 2-ethylhexyl ester Alkyl esters; hydroxyalkyl esters such as 2-hydroxyethyl ester; haloalkyl esters such as 2,2,2-trifluoroethyl ester; aminoalkyl esters such as 2-aminoethyl ester; 2-(N,N-dimethylamino) (mono- or dialkylamino)alkyl esters such as ethyl esters; cycloalkyl esters such as cyclohexyl esters; aryl esters such as phenyl esters and naphthyl esters; aralkyl esters such as benzyl esters and phenethyl esters; glycidyl esters; -
  • ⁇ Olefins e.g., ethylene, propylene, butene, pentene, hexene, etc.
  • ⁇ Aromatic vinyl compounds e.g., styrene, ⁇ -methylstyrene, vinyltoluene, hydroxystyrene, etc.
  • Heterocyclic vinyl compounds e.g., N-vinylpyrrolidone, etc.
  • Other monomers may be used singly or in combination of two or more.
  • the solubility in water at 25°C (g/100 g of water) of the monomer constituting the crosslinked polymer is preferably 1 g or more, more preferably 5 g or more. Also, the monomers that make up the crosslinked polymer may be water-miscible.
  • the crosslinked polymer of the present invention has a crosslinked structure [a plurality of linear macromolecules (a polymer of a monomer having an acidic group and/or a neutralizing base thereof)]. covalently bonded structure].
  • the crosslinked structure may be self-crosslinked when the monomers constituting the crosslinked polymer have a reactive group (for example, a combination of a monomer having a carboxyl group and a monomer having an amino group), but if necessary, any Cross-linking may be performed with a cross-linking agent.
  • cross-linking methods using a cross-linking agent include the following methods. 1) A method using the following internal cross-linking agent: The above-mentioned monomer and the internal cross-linking agent are polymerized to directly obtain a crosslinked polymer having a crosslinked structure [for example, JP-A-2003-225565, JP-A-2005- The method described in 075982, etc.] 2) Method using the following surface cross-linking agent: A polymer having the above-mentioned monomer as an essential constituent monomer is cross-linked using a surface cross-linking agent to obtain a cross-linked polymer -165883, JP-A-2003-225565, JP-A-2005-75982, the method described in JP-A-2005-95759, etc.]
  • the cross-linking agent (including an internal cross-linking agent and a surface cross-linking agent) is not particularly limited, but includes, for example, the following bifunctional or higher ethylenically unsaturated monomers.
  • Dihydric or higher alcohol e.g., alkylene glycol or polyalkylene glycol such as ethylene glycol, polyethylene glycol, propylene glycol, butylene glycol, neopentyl glycol (the preferred number of carbon atoms of the alkylene group is 2 to 4, the preferred number of repetitions of the alkylene oxide 10 to 50
  • alkylene glycol or polyalkylene glycol such as ethylene glycol, polyethylene glycol, propylene glycol, butylene glycol, neopentyl glycol (the preferred number of carbon atoms of the alkylene group is 2 to 4, the preferred number of repetitions of the alkylene oxide 10 to 50
  • alkenyl ethers e.g., vinyl ethers, allyl ether
  • a cross-linking agent having at least two or more functional groups capable of reacting with the substituents (carboxy group, hydroxyl group, etc.) of the above-mentioned monomers can also be used.
  • a polyhydric alcohol glycidyl ether for example, an alkylene glycol diglycidyl ether such as ethylene glycol diglycidyl ether, an alkanetriol di- or triglycidyl ether such as glycerin diglycidyl ether, or the like can be used.
  • the cross-linking agent may be used singly or in combination of two or more.
  • the amount of the cross-linking agent can be appropriately selected according to the desired cross-linking density. well, 0.5 mol % or less, or 0.4 mol % or less.
  • the crosslinked polymer of the present invention contains (or supports) a compound having at least one group selected from the group consisting of cationic groups and hydroxyl groups (hereinafter referred to as "compound X"). That is, the crosslinked polymer of the present invention has a form of coexistence with compound X.
  • Compound X is preferably present on the surface of the crosslinked polymer of the present invention, and compound X is preferably attached or fixed to the surface of the crosslinked polymer of the present invention by non-covalent bonds such as hydrogen bonds and ionic bonds. It is preferable that a part or all of the surface of the crosslinked polymer of the present invention is coated with the compound X.
  • the surface of the crosslinked polymer means the molecular chain of the crosslinked polymer, or when the crosslinked polymer is in the form of particles or pellets, the surface of particles or pellets of the crosslinked polymer.
  • the crosslinked polymer of the present invention contains the compound X, for example, by immersing the crosslinked polymer in an appropriate solvent (e.g., a hydrocarbon solvent such as hexane) to liberate the compound X in the solvent, It can be identified by isolation and subjecting it to NMR and gas chromatography.
  • an appropriate solvent e.g., a hydrocarbon solvent such as hexane
  • Compound X preferably has at least one group selected from the group consisting of a cationic group and a hydroxyl group, and an optionally substituted hydrocarbon group having 2 to 30 carbon atoms, and from the cationic group and the hydroxyl group It is further preferable to have at least one group selected from the group consisting of and an optionally substituted hydrocarbon group having 12 to 30 carbon atoms, and at one end, optionally substituted 12 to 30 carbon atoms More preferably, it has 30 hydrocarbon groups and at least one group selected from the group consisting of cationic groups and hydroxyl groups at the other end.
  • the number of hydrocarbon groups, cationic groups, or hydroxyl groups may be 1 or 2 or more.
  • the hydrocarbon group having 12 to 30 carbon atoms is any of aliphatic hydrocarbon groups such as alkyl groups and alkenyl groups, alicyclic hydrocarbon groups such as cycloalkyl groups and cycloalkenyl groups, and aromatic hydrocarbon groups.
  • the number of substituents on the hydrocarbon group is, for example, 1, 2, 3, 4, or 5.
  • the aliphatic hydrocarbon group having 12 to 30 carbon atoms may be either saturated or unsaturated, such as lauryl, myristyl, palmityl, stearyl, oleyl, linoleyl, arachidyl groups, Examples include aliphatic hydrocarbon groups having 12 to 20 carbon atoms.
  • lecithin has a C 12-30 acyl group as an optionally substituted aliphatic hydrocarbon group having 12 to 30 carbon atoms, specifically an oleyloxy group and a palmitoyloxy group. More specifically, lecithin has a diacylglycerol skeleton having the acyl group.
  • Examples of alicyclic hydrocarbon groups having 12 to 30 carbon atoms include groups having a steroid skeleton.
  • a steroid skeleton is represented, for example, by the following formula (1): (Wherein, the dashed line in ring A indicates that any carbon-carbon single bond may be a carbon-carbon double bond, and the dashed line in ring B indicates that the carbon-carbon single bond is carbon- It indicates that it may be a carbon double bond, and each of rings A to D may be substituted. The numbers on the ring are described for convenience to indicate the substitution position of the substituent. is a thing.)
  • the substitution position of the substituent is not particularly limited, and examples thereof include 3-position, 7-position, 10-position, 11-position, 12-position, 13-position and 17-position.
  • the skeleton represented by formula (1) includes skeletons represented by the following formulas (1-1) to (1-5):
  • the alicyclic hydrocarbon group having 12 to 30 carbon atoms is preferably an alicyclic hydrocarbon group having 20 to 30 carbon atoms, More preferably, a group in which an optionally substituted alkylene group (for example, an alkylene group having 2 to 4 carbon atoms such as an ethylene group and a propylene group) is linked to the 17th position of the skeleton represented by formula (1).
  • an optionally substituted alkylene group for example, an alkylene group having 2 to 4 carbon atoms such as an ethylene group and a propylene group
  • an optionally substituted alkylene group e.g., ethylene group, propylene group, etc. having 2 carbon atoms
  • aromatic hydrocarbon groups having 12 to 30 carbon atoms include fluorene, anthracene, phenanthrene, tetracene, pyrene, triphenylene, chrysene, and tetraphenylene.
  • the optionally substituted hydrocarbon group having 12 to 30 carbon atoms is preferably a group having a di-C 12-30 acylglycerol skeleton or a group having a steroid skeleton.
  • cationic group includes a group that forms a cation by itself, and a group that does not form a cation by itself but can form a cation by proton binding.
  • Examples of cationic groups include -N(R 1 ) 2 (wherein each R 1 is independently a hydrogen atom or an optionally substituted hydrocarbon group having 1 to 6 carbon atoms). ), -N + (R 2 ) 3 (wherein each R 2 is independently a hydrogen atom or an optionally substituted hydrocarbon group having 1 to 6 carbon atoms), etc. mentioned.
  • hydrocarbon groups having 1 to 6 carbon atoms in R 1 and R 2 in the above formula include alkyl groups such as methyl, ethyl, propyl, butyl, pentyl and hexyl groups.
  • substituents that can be substituted on a hydrocarbon group having 1 to 6 carbon atoms include a hydroxyl group, an oxo group, a carboxylic acid group, a sulfonic acid group and the like.
  • the group represented by the formula: -N(R 1 ) 2 is preferably -NH 2 or -N(R 11 ) 2 (wherein R 11 represents a hydroxyalkyl group having 1 to 5 carbon atoms ).
  • R 11 represents a hydroxyalkyl group having 1 to 5 carbon atoms .
  • the hydroxyalkyl group having 1 to 5 carbon atoms include hydroxyethyl group, hydroxypropyl group, hydroxybutyl group, hydroxypentyl group (including pentahydroxypentyl group and the like) and the like.
  • -N + (R 2 ) 3 is preferably -N + (CH 3 ) 3 , -N + (CH 3 ) 2 (C 2 H 5 ), -N + (CH 3 ) 2 (C 3 H 7 ) and the like, and these groups may be substituted with, for example, —CO 2 — , —SO 3 — , and the like.
  • Preferred compounds X include compounds having an aliphatic hydrocarbon group having 12 to 30 carbon atoms and a cationic group (e.g., lecithin, hexadecyltrimethylammonium chloride), a hydrocarbon group having 12 to 30 carbon atoms and a hydroxyl group.
  • compounds having e.g., lauryl alcohol, BIGCHAP
  • alicyclic hydrocarbon groups having 12 to 30 carbon atoms, cationic groups and compounds having a hydroxyl group (e.g., CHAPS)
  • compounds having a cationic group and a hydroxyl group e.g., triethanolamine
  • polymers having cationic groups eg, polylysine, polyethyleneimine
  • the lower limit of the molar concentration of the cationic group per 1 mol of compound X (especially when compound X is a polymer having a cationic group) is preferably 1 mol or more, and the recovery amount of the substance having a lipid bilayer is preferably 5 mol or more, more preferably 10 mol or more, from the viewpoint of improving the Moreover, the upper limit of the molar concentration of the cationic group per 1 mol of the compound X is preferably 100 mol or less.
  • the lower limit of the chemical formula weight or number average molecular weight of compound X is preferably 300 or more, more preferably 500 or more, from the viewpoint of improving the recovery amount of a substance having a lipid bilayer.
  • the upper limit of the chemical formula weight or number average molecular weight of compound X is preferably 10,000 or less.
  • the number average molecular weight of compound X can be measured using gel permeation chromatography (GPC) under the following conditions.
  • the crosslinker polymer of the present invention has a volume average particle size of 50 ⁇ m or more, 60 ⁇ m or more, 70 ⁇ m or more, 80 ⁇ m or more, 90 ⁇ m or more, 100 ⁇ m or more, from the viewpoint of reducing impurities (such as albumin) in the separation of substances having a lipid bilayer.
  • the particles are preferably in the range of 110 ⁇ m or more, 120 ⁇ m or more, 130 ⁇ m or more, 140 ⁇ m or more, or 150 ⁇ m or more.
  • the crosslinker polymer of the present invention has a volume average particle size of 2000 ⁇ m or less, 1500 ⁇ m or less, 1000 ⁇ m or less, 500 ⁇ m or less, or 300 ⁇ m or less. is preferably The volume average particle size can be measured by the method described in Examples below.
  • the pH of the physiological saline solution containing 0.5% by weight of the crosslinked polymer of the present invention based on the weight of the physiological saline (hereinafter abbreviated as "physiological saline solution pH") is not particularly limited.
  • the pH of the physiological saline solution is 6.5 or higher, 7 or higher, or 7.2 or higher in order to reduce negatively charged impurities (such as albumin). is preferably 8.5 or less, 8 or less, 7.9 or less, or 7.5 or less.
  • the physiological saline solution pH can be measured by the method described in Examples below.
  • the saline solution pH can be adjusted by the degree of neutralization, and if the saline solution pH is too low, increasing the degree of neutralization tends to increase the saline solution pH. If is too high, lowering the degree of neutralization tends to lower the pH of the saline solution.
  • the water absorption capacity of the crosslinked polymer of the present invention in physiological saline is preferably 1 g/g or more, and 3 g/g, from the viewpoint of improving the recovery amount of a substance having a lipid bilayer. It is more preferably 5 g/g or more, particularly preferably 5 g/g or more, particularly preferably 10 g/g or more, or most preferably 15 g/g or more.
  • the water absorption capacity of the crosslinked polymer of the present invention in physiological saline is too low, increasing the amount of the cross-linking agent tends to increase the absorption capacity.
  • the upper limit of the water absorption capacity of the crosslinked polymer of the present invention in physiological saline is not particularly limited. is particularly preferred.
  • the absorbency of physiological saline can be measured by the method described in Examples below.
  • the molar concentration of the cationic group is 6 ⁇ 10 based on the weight of the crosslinked polymer after drying from the viewpoint of improving the recovery amount of the substance having a lipid bilayer. ⁇ 6 to 1 ⁇ 10 ⁇ 4 mol/g.
  • the weight of the crosslinked polymer after drying can be measured, for example, by the following method. 1 g of the crosslinked polymer is placed on a petri dish, covered with filter paper, dried by heating at 130° C. for 60 minutes in a circulating air dryer, and the weight of the residue can be used as the weight of the crosslinked polymer after drying.
  • the crosslinked polymer of the present invention is suitable for separating a substance having a lipid bilayer from a biological sample.
  • substances having a lipid bilayer include, for example, extracellular vesicles such as exosomes.
  • the crosslinked polymer of the present invention can be obtained, for example, by polymerizing (solution polymerization, emulsion polymerization, suspension polymerization, etc.) a composition containing a monomer, a crosslinking agent, a solvent, an initiator, and, if necessary, a neutralizing agent. It can be produced by a method including a step of drying and, if necessary, a step of classifying the polymer.
  • a method for separating a substance having a lipid bilayer from a biological sample comprises the following steps (1) and (2): (1) contacting a biological sample with a crosslinked polymer to obtain a polymer gel containing a substance having a lipid bilayer; and (2) mixing the polymer gel with a salt to recover a substance having a lipid bilayer. process.
  • the biological sample used in step (1) is not particularly limited as long as it contains a substance with a lipid bilayer.
  • biological samples include body fluids such as human or animal blood, plasma, serum, tears, saliva, breast milk, pleural fluid, peritoneal fluid, amniotic fluid, cerebrospinal fluid, and urine; organs, hair, nails, skin, muscles , liquefied products of tissues such as nerves or cells (including cell culture media and their supernatants); extracts from plants, and the like.
  • the biological sample may be of one type alone or may be a combination of two or more types.
  • the biological sample is preferably a body fluid, more preferably blood, plasma, serum, or urine.
  • the same one as described in "(A) Crosslinked polymer” can be used.
  • the amount of the crosslinked polymer used is, for example, preferably 1 part by mass or more, 5 parts by mass or more, or 10 parts by mass or more with respect to 100 parts by mass of the biological sample. Alternatively, it is preferably 1000 parts by mass or less.
  • the temperature at which the crosslinked polymer is brought into contact with the biological sample is, for example, within the range of 1 to 35°C, preferably within the range of 5 to 30°C. In addition, it is preferable to leave the contact for a predetermined period of time (for example, 1 hour or more, 2 hours or more, or 5 hours or less, or 4 hours or less).
  • a substance having a lipid bilayer can be separated into a polymer gel by step (1).
  • the salt used in step (2) is not particularly limited as long as it can excrete the substance having a lipid bilayer contained in the polymer gel.
  • Salts include, for example, metal salts (monovalent or divalent metal salts, etc.).
  • Examples of the monovalent metal salt include alkali metal salts such as sodium salts and potassium salts.
  • Examples of the divalent metal salts include alkaline earth metal salts such as magnesium salts, calcium salts and barium salts.
  • Examples of the counter anion of the salt include, but are not limited to, halide ions such as chloride ion and bromide ion.
  • the salt may be used singly or in combination of two or more.
  • the salt is preferably at least one selected from the group consisting of sodium chloride and magnesium chloride.
  • the amount of salt used can be, for example, 1 part by mass or more, 5 parts by mass or more, or 10 parts by mass or more with respect to 100 parts by mass of the polymer gel, and can be 2000 parts by mass or less, 1500 parts by mass or less, or 1000 parts by mass. It can be less than or equal to parts by mass.
  • the mixing temperature of the polymer gel and the salt is, for example, preferably within the range of 1 to 35°C or within the range of 5 to 30°C. After mixing, it is preferable to leave the mixture for a predetermined time (for example, 1 hour or more, 2 hours or more, or 5 hours or less, or 4 hours or less).
  • the mixture of polymer gel and salt may optionally be dialyzed.
  • step (2) the substance having a lipid bilayer contained in the polymer gel can be recovered at a high recovery rate.
  • Substances having a lipid bilayer to be collected include, for example, extracellular vesicles such as exosomes.
  • the method of the present invention can increase the purity of the recovered substance having a lipid bilayer (can reduce the amount of contaminants) and shorten the operation time. can do.
  • kits for separating a substance having a lipid bilayer from a biological sample The present invention provides a kit for separating a substance having a lipid bilayer from a biological sample, the kit comprising a crosslinked polymer and a salt. encompasses The configuration of the kit preferably corresponds to the above "(B) Method for separating a substance having a lipid bilayer from a biological sample".
  • the kit of the present invention may further include an instruction manual including a method for separating a substance having a lipid bilayer from a biological sample, an instrument for the separation, and the like.
  • kits for examining diseases using extracellular vesicles The present invention is a kit for examining (or diagnosing) diseases using extracellular vesicles, the kit comprising a crosslinked polymer and a salt encompasses
  • the test subject may be a healthy person or a patient.
  • Diseases include, for example, lifestyle-related diseases, chronic kidney diseases, neurological diseases, immune diseases, cancers, infectious diseases, and degenerative diseases.
  • the kit separates extracellular vesicles from, for example, samples derived from the test subject (e.g., body fluids such as blood, plasma, serum, tears, saliva, breast milk, pleural fluid, peritoneal fluid, amniotic fluid, cerebrospinal fluid, and urine).
  • samples derived from the test subject e.g., body fluids such as blood, plasma, serum, tears, saliva, breast milk, pleural fluid, peritoneal fluid, amniotic fluid, cerebrospinal fluid, and urine.
  • a disease may be examined based on extracellular vesicle inclusions.
  • the kit is a known kit for testing diseases using extracellular vesicles, which contains a crosslinked polymer and a salt as reagents for separating extracellular vesicles from a sample derived from a test subject, good too.
  • kits As the crosslinked polymer and salt in the kit, the same ones as those described in the above "(B) Method for separating a substance having a lipid bilayer from a biological sample" can be used.
  • the kit may further include an instruction manual including a method for isolating extracellular vesicles from a test subject, an instrument for the isolation, and the like.
  • the present invention provides a device for separating a substance having a lipid bilayer from a biological sample, It includes a device comprising means for carrying out the method of separating a substance having a lipid bilayer from a sample.
  • ⁇ Physiological saline solution pH measurement method> In a cylindrical 100 mL beaker with a diameter of 50 mm, physiological saline (salt concentration 0.9% by weight) was added to 0.5 g of the measurement sample to make the total amount 100 g, and a stirrer tip (length 30 mm) was stirred at 60 rpm at 25 ° C. After stirring for 30 minutes, the mixture was allowed to stand at 25°C for 1 minute. After standing, the pH of the supernatant at 25° C. was measured with a pH meter, and the value was defined as the pH of the physiological saline solution.
  • aqueous monomer solution was added dropwise using a dropping funnel while stirring using a stirrer, and the polymerization temperature was 80 ° C. for reverse phase.
  • Suspension polymerization was carried out, and after the dropwise addition of the aqueous monomer solution was completed, the mixture was further heated for 2 hours to complete the suspension polymerization, and a spherical hydrous gel was obtained in cyclohexane.
  • crosslinked polymer (A-1) was obtained by adjusting the crosslinked polymer (X-1) to a particle size of 150 to 300 ⁇ m using sieves with openings of 150 and 300 ⁇ m.
  • the volume average particle size of the crosslinked polymer (A-1) was measured with a particle analyzer (CAMSIZER XT manufactured by Retsch) and found to be 220 ⁇ m.
  • the absorption capacity of physiological saline was 26 g/g.
  • Crosslinked polymer (A-2)> Crosslinked polymer (X-1) was produced in the same manner as in Production Example 1, except that the amount of ethylene glycol diglycidyl ether was 3.0 g (2.6% by weight/acrylic acid). -2) was obtained.
  • Crosslinked polymer (A-2) was obtained by adjusting the crosslinked polymer (X-2) to a particle size of 150 to 300 ⁇ m using sieves with openings of 150 and 300 ⁇ m.
  • the volume average particle size of the crosslinked polymer (A-2) was measured with a particle analyzer (CAMSIZER XT manufactured by Retsch) and found to be 200 ⁇ m.
  • the absorption capacity of physiological saline was 16 g/g.
  • crosslinked polymer (A-3) Production of crosslinked polymer (A-3)>
  • the crosslinked polymer (X-1) was produced in the same manner as in Production Example 1, except that the amount of ethylene glycol diglycidyl ether was 0.58 g (0.5% by weight/acrylic acid). -3) was obtained.
  • Crosslinked polymer (A-3) was obtained by adjusting the crosslinked polymer (X-3) to a particle size of 300 to 500 ⁇ m using sieves with openings of 300 and 500 ⁇ m.
  • the volume average particle size of the crosslinked polymer (A-3) was measured with a particle analyzer (CAMSIZER XT manufactured by Retsch) and found to be 410 ⁇ m.
  • the absorption capacity of physiological saline was 35 g/g.
  • ⁇ Production Example 4 Production of crosslinked polymer (A-4)> 300 g of acrylic acid, 700 g of ion-exchanged water, and 2.0 g of trimethylolpropane triacrylate (0.66% by weight/acrylic acid) as a cross-linking agent were placed in a 2-liter beaker and mixed with stirring to prepare an aqueous acrylic acid solution. , and cooled to 3°C. The acrylic acid aqueous solution was placed in a 2-liter adiabatic polymerization tank, and nitrogen was passed through the acrylic acid aqueous solution to make the dissolved oxygen content in the acrylic acid aqueous solution 0.1 ppm or less.
  • the block-shaped crosslinked hydrous gel was taken out from the adiabatic polymerization tank, and the gel was chopped into noodles with a thickness of 3 to 10 mm using a small meat chopper (manufactured by Royal Co.), and then mixed with 40% by weight of water.
  • the neutralized shredded gel was dried with a ventilated band dryer ⁇ 150° C., wind speed 2 m/sec ⁇ to obtain a dry product.
  • the dried product was pulverized with a juicer mixer (Osterizer Blender manufactured by Oster) to obtain a crosslinked polymer (X-4).
  • Crosslinked polymer (A-4) was obtained by adjusting the crosslinked polymer (X-4) to a particle size of 150 to 300 ⁇ m using sieves with openings of 150 and 300 ⁇ m.
  • the volume average particle size of the crosslinked polymer (A-4) was measured with a particle analyzer (CAMSIZER XT manufactured by Retsch) and found to be 222 ⁇ m.
  • the absorption capacity of physiological saline was 36 g/g.
  • ⁇ Production Example 5 Production of crosslinked polymer (A-5)>
  • the crosslinked polymer (X-4) obtained in Production Example 4 was adjusted to a particle size of 90 to 150 ⁇ m using sieves with mesh openings of 90 and 150 ⁇ m to obtain a crosslinked polymer (A-5).
  • the volume average particle size of the crosslinked polymer (A-5) was measured with a particle analyzer (CAMSIZER XT manufactured by Retsch) and found to be 125 ⁇ m.
  • the absorption capacity of physiological saline was 33 g/g.
  • ⁇ Production Example 6 Production of crosslinked polymer (A-6)>
  • the crosslinked polymer (X-4) obtained in Production Example 4 was adjusted to a particle size of 500 to 710 ⁇ m using sieves with openings of 500 and 710 ⁇ m to obtain a crosslinked polymer (A-6).
  • the volume average particle size of the crosslinked polymer (A-6) was measured with a particle analyzer (CAMSIZER XT manufactured by Retsch) and found to be 630 ⁇ m.
  • the absorption capacity of physiological saline was 38 g/g.
  • Crosslinked polymer (A-7) was obtained by adjusting the crosslinked polymer (X-7) to a particle size of 150 to 300 ⁇ m using sieves with openings of 150 and 300 ⁇ m.
  • the volume average particle size of the crosslinked polymer (A-7) was measured with a particle analyzer (CAMSIZER XT manufactured by Retsch) and found to be 220 ⁇ m.
  • the absorption capacity of physiological saline was 3 g/g.
  • Crosslinked polymer (A-8)> Crosslinked polymer (X-1) was produced in the same manner as in Production Example 1 except that the amount of ethylene glycol diglycidyl ether was 0.2 g (0.17% by weight/acrylic acid). -8) was obtained.
  • Crosslinked polymer (A-8) was obtained by adjusting the particle size of crosslinked polymer (X-8) to 150 to 300 ⁇ m using sieves with openings of 150 and 300 ⁇ m.
  • the volume average particle size of the crosslinked polymer (A-8) was measured with a particle analyzer (CAMSIZER XT manufactured by Retsch) and found to be 220 ⁇ m.
  • the absorption capacity of physiological saline was 100 g/g.
  • ⁇ Production Example 9 Production of crosslinked polymer (A-9)>
  • the crosslinked polymer (X-1) obtained in Production Example 1 was adjusted to a particle size of 100 to 200 ⁇ m using sieves with openings of 100 and 200 ⁇ m to obtain a crosslinked polymer (A-9).
  • the volume average particle size of the crosslinked polymer (A-9) was measured with a particle analyzer (CAMSIZER XT manufactured by Retsch) and found to be 150 ⁇ m.
  • the absorption capacity of physiological saline was 21 g/g.
  • Crosslinked polymer (A-10) was obtained by adjusting the crosslinked polymer (X-1) obtained in Production Example 1 to a particle size of 250 to 350 ⁇ m using sieves with mesh openings of 250 and 350 ⁇ m.
  • the volume average particle size of the crosslinked polymer (A-10) was 300 ⁇ m when measured with a particle analyzer (CAMSIZER XT manufactured by Retsch).
  • the absorption capacity of physiological saline was 24 g/g.
  • ⁇ Production Example 11 Production of crosslinked polymer (A-11)>
  • the crosslinked polymer (X-4) obtained in Production Example 4 was adjusted to a particle size of 250 to 350 ⁇ m using sieves with mesh openings of 250 and 350 ⁇ m to obtain a crosslinked polymer (A-11).
  • the volume average particle size of the crosslinked polymer (A-11) was measured with a particle analyzer (CAMSIZER XT manufactured by Retsch) and found to be 288 ⁇ m.
  • the absorption capacity of physiological saline was 34 g/g.
  • Example 1 Production of crosslinked polymer (C-1-1-a)> To 10 g of the crosslinked polymer (B-1-1), 2 g of a cyclohexane solution of 5% by weight lecithin (manufactured by Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd., derived from soybeans) was added dropwise with a dropper, mixed uniformly, and then heated at 130° C. for 30 minutes. and cooled to room temperature to obtain a crosslinked polymer (C-1-1-a). The volume average particle size of the crosslinked polymer (C-1-1-a) was 220 ⁇ m when measured with a particle analyzer (CAMSIZER XT manufactured by Retsch). The absorption capacity of physiological saline was 22 g/g. The physiological saline solution pH measurement result was 7.4.
  • a cyclohexane solution of 5% by weight lecithin manufactured by Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd., derived from soybeans
  • Example 2 Production of crosslinked polymer (C-1-2-a)>
  • the same procedure as in Example 1 was performed except that the crosslinked polymer (B-1-1) was changed to (B-1-2), and the crosslinked polymer (C-1-2-a) was Obtained.
  • the volume average particle size of the crosslinked polymer (C-1-2-a) was measured with a particle analyzer (CAMSIZER XT manufactured by Retsch) and found to be 218 ⁇ m.
  • the absorption capacity of physiological saline was 23 g/g.
  • the physiological saline solution pH measurement result was 7.1.
  • Example 3 Production of crosslinked polymer (C-1-3-a)>
  • the same procedure as in Example 1 was performed except that the crosslinked polymer (B-1-1) was changed to (B-1-3), and the crosslinked polymer (C-1-3-a) was Obtained.
  • the volume average particle size of the crosslinked polymer (C-1-3-a) was measured with a particle analyzer (CAMSIZER XT manufactured by Retsch) and found to be 218 ⁇ m.
  • the absorption capacity of physiological saline was 19 g/g.
  • the physiological saline solution pH measurement result was 7.9.
  • Example 4 Production of crosslinked polymer (C-1-4-a)>
  • the same procedure as in Example 1 was performed except that the crosslinked polymer (B-1-1) was changed to (B-1-4), and the crosslinked polymer (C-1-4-a) was Obtained.
  • the volume average particle size of the crosslinked polymer (C-1-4-a) was measured with a particle analyzer (CAMSIZER XT manufactured by Retsch) and found to be 218 ⁇ m.
  • the absorption capacity of physiological saline was 22 g/g.
  • the physiological saline solution pH measurement result was 7.2.
  • Example 5 Production of crosslinked polymer (C-2-1-a)>
  • the crosslinked polymer was changed from (B-1-1) to (B-2-1), and the drop weight of 5% by weight lecithin (manufactured by Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd., derived from soybean) cyclohexane solution was 3 g.
  • a crosslinked polymer (C-2-1-a) was obtained in the same manner as in Example 1 except that the The volume average particle size of the crosslinked polymer (C-2-1-a) was measured with a particle analyzer (CAMSIZER XT manufactured by Retsch) and found to be 201 ⁇ m.
  • the absorption capacity of physiological saline was 11 g/g.
  • the physiological saline solution pH measurement result was 7.4.
  • Example 6 Production of crosslinked polymer (C-2-1-b)>
  • the crosslinked polymer was changed from (B-1-1) to (B-2-1), and 5% by weight lecithin (manufactured by Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd., derived from soybeans) was replaced with 2 g of cyclohexane solution, 5 wt% BIGCHAP (manufactured by Dojindo Laboratories, N,N-bis(3-D-gluconamidopropyl) cholamide) was carried out in the same manner as in Example 1 except that 1 g of cyclohexane solution was used, and a crosslinked polymer ( C-2-1-b) was obtained.
  • lecithin manufactured by Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd., derived from soybeans
  • 5 wt% BIGCHAP manufactured by Dojindo Laboratories, N,N-bis(3-D-gluconamidopropyl) cholamide
  • the volume average particle size of the crosslinked polymer (C-2-1-b) was measured with a particle analyzer (CAMSIZER XT manufactured by Retsch) and found to be 207 ⁇ m.
  • the absorption capacity of physiological saline was 11 g/g.
  • the physiological saline solution pH measurement result was 7.4.
  • Example 7 Production of crosslinked polymer (C-3-1-c)>
  • the crosslinked polymer was changed from (B-1-1) to (B-3-1), and 5% by weight lecithin (manufactured by Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd., derived from soybeans) was replaced with 2 g of cyclohexane solution, 5% by weight of hexadecyltrimethylammonium chloride (manufactured by Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd., HDTMA-Cl) was carried out in the same manner as in Example 1 except that 1 g of a cyclohexane solution was used, and a crosslinked polymer (C-3-1-c) was obtained.
  • the volume average particle size of the crosslinked polymer (C-3-1-c) was measured with a particle analyzer (CAMSIZER XT manufactured by Retsch) and found to be 420 ⁇ m.
  • the absorption capacity of physiological saline was 32 g/g.
  • the physiological saline solution pH measurement result was 7.0.
  • Example 8 Production of crosslinked polymer (C-4-1-d)>
  • the crosslinked polymer was changed from (B-1-1) to (B-4-1), and 5% by weight lecithin (manufactured by Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd., derived from soybeans) was replaced with 2 g of cyclohexane solution, 5% by weight of CHAPS (manufactured by Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd., 3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]propanesulfonate) was carried out in the same manner as in Example 1 except that 2 g of a cyclohexane solution was used, and a crosslinked polymer was obtained.
  • C-4-1-d The volume average particle size of the crosslinked polymer (C-4-1-d) was measured with a particle analyzer (CAMSIZER XT manufactured by Retsch) and found to be 222 ⁇ m.
  • the absorption capacity of physiological saline was 32 g/g.
  • the physiological saline solution pH measurement result was 7.0.
  • Example 9 Production of crosslinked polymer (C-4-1-e)>
  • the crosslinked polymer was changed from (B-1-1) to (B-4-1), and 5% by weight lecithin (manufactured by Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd., derived from soybeans) was replaced with 2 g of cyclohexane solution
  • a crosslinked polymer (C-4-1-e) was obtained in the same manner as in Example 1, except that 2 g of a cyclohexane solution of 5% by weight lauryl alcohol (manufactured by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) was used.
  • the volume average particle size of the crosslinked polymer (C-4-1-e) was measured with a particle analyzer (CAMSIZER XT manufactured by Retsch) and found to be 228 ⁇ m.
  • the absorption capacity of physiological saline was 28 g/g.
  • the physiological saline solution pH measurement result was 7.4.
  • Example 10 Production of crosslinked polymer (C-5-1-d)>
  • the crosslinked polymer was changed from (B-1-1) to (B-5-1), and 5% by weight lecithin (manufactured by Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd., derived from soybeans) was replaced with 2 g of cyclohexane solution
  • a crosslinked polymer (C-5-1-d) was obtained in the same manner as in Example 1, except that 3 g of a 5% by weight CHAPS (manufactured by Fuji Film Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) cyclohexane solution was used.
  • the volume average particle size of the crosslinked polymer (C-5-1-d) was measured with a particle analyzer (CAMSIZER XT manufactured by Retsch) and found to be 133 ⁇ m.
  • the absorption capacity of physiological saline was 30 g/g.
  • the physiological saline solution pH measurement result was 7.4.
  • Example 11 Production of crosslinked polymer (C-6-1-d)>
  • the crosslinked polymer was changed from (B-1-1) to (B-6-1), and 5% by weight lecithin (manufactured by Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd., derived from soybeans) was replaced with 2 g of cyclohexane solution
  • a crosslinked polymer (C-6-1-d) was obtained in the same manner as in Example 1, except that 2 g of a cyclohexane solution of 5% by weight CHAPS (manufactured by Fuji Film Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was used.
  • the volume average particle size of the crosslinked polymer (C-6-1-d) was measured with a particle analyzer (CAMSIZER XT manufactured by Retsch) and found to be 630 ⁇ m.
  • the absorption capacity of physiological saline was 33 g/g.
  • the physiological saline solution pH measurement result was 7.8.
  • Example 12 Production of crosslinked polymer (C-4-0-a)>
  • the same procedure as in Example 1 was performed except that the crosslinked polymer (B-1-1) was changed to (A-1) to obtain a crosslinked polymer (C-4-0-a).
  • the volume average particle size of the crosslinked polymer (C-4-0-a) was measured with a particle analyzer (CAMSIZER XT manufactured by Retsch) and found to be 230 ⁇ m.
  • the absorption capacity of physiological saline was 25 g/g.
  • the physiological saline solution pH measurement result was 6.1.
  • Example 13 Production of crosslinked polymer (C-7-1-a)>
  • the same procedure as in Example 1 was performed except that the crosslinked polymer (B-1-1) was changed to (B-7-1), and the crosslinked polymer (C-7-1-a) was Obtained.
  • the volume average particle size of the crosslinked polymer (C-7-1-a) was measured with a particle analyzer (CAMSIZER XT manufactured by Retsch) and found to be 220 ⁇ m.
  • the absorption capacity of physiological saline was 3 g/g.
  • the physiological saline solution pH measurement result was 7.4.
  • Example 14 Production of crosslinked polymer (C-8-1-a)>
  • the same procedure as in Example 1 was performed except that the crosslinked polymer (B-1-1) was changed to (B-8-1), and the crosslinked polymer (C-8-1-a) was Obtained.
  • the volume average particle size of the crosslinked polymer (C-8-1-a) was 220 ⁇ m when measured with a particle analyzer (CAMSIZER XT manufactured by Retsch).
  • the absorption capacity of physiological saline was 100 g/g.
  • the physiological saline solution pH measurement result was 7.4.
  • Example 15 Production of crosslinked polymer (C-9-1-a)>
  • the same procedure as in Example 1 was performed except that the crosslinked polymer (B-1-1) was changed to (B-9-1), and the crosslinked polymer (C-9-1-a) was Obtained.
  • the volume average particle size of the crosslinked polymer (C-9-1-a) was 155 ⁇ m when measured with a particle analyzer (CAMSIZER XT manufactured by Retsch).
  • the absorption capacity of physiological saline was 21 g/g.
  • the physiological saline solution pH measurement result was 7.4.
  • Example 16 Production of crosslinked polymer (C-10-1-a)>
  • the same procedure as in Example 1 was performed except that the crosslinked polymer (B-1-1) was changed to (B-10-1), and the crosslinked polymer (C-10-1-a) was Obtained.
  • the volume average particle size of the crosslinked polymer (C-10-1-a) was measured with a particle analyzer (CAMSIZER XT manufactured by Retsch) and found to be 297 ⁇ m.
  • the absorption capacity of physiological saline was 22 g/g.
  • the physiological saline solution pH measurement result was 7.4.
  • Example 17 Production of crosslinked polymer (C-1-1-a2)>
  • 1 g of a 5 wt% lecithin (manufactured by Fuji Film Wako Pure Chemical Industries, Ltd., derived from soybeans) cyclohexane solution was used in place of 2 g of the 5 wt% lecithin (manufactured by Fuji Film Wako Pure Chemical Industries, Ltd., derived from soybeans) cyclohexane solution.
  • a crosslinked polymer (C-10-1-a2) was obtained in the same manner as in Example 1 except for the above.
  • the volume average particle size of the crosslinked polymer (C-10-1-a2) was measured with a particle analyzer (CAMSIZER XT manufactured by Retsch) and found to be 222 ⁇ m.
  • the absorption capacity of physiological saline was 22 g/g.
  • the physiological saline solution pH measurement result was 7.4.
  • Example 18 Production of crosslinked polymer (C-1-1-a3)>
  • 4 g of a 20 wt% lecithin (manufactured by Fuji Film Wako Pure Chemical Industries, Ltd., derived from soybeans) cyclohexane solution was used instead of 2 g of the 5 wt% lecithin (manufactured by Fuji Film Wako Pure Chemical Industries, Ltd., derived from soybeans) cyclohexane solution.
  • a crosslinked polymer (C-1-1-a3) was obtained in the same manner as in Example 1 except for the above.
  • the volume average particle size of the crosslinked polymer (C-1-1-a3) was measured with a particle analyzer (CAMSIZER XT manufactured by Retsch) and found to be 231 ⁇ m.
  • the absorption capacity of physiological saline was 23 g/g.
  • the physiological saline solution pH measurement result was 7.4.
  • Example 19 Production of crosslinked polymer (C-11-1-g)>
  • the crosslinked polymer was changed from (B-1-1) to (B-11-1), and 5% by weight lecithin (manufactured by Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd., derived from soybeans) was replaced with 2 g of cyclohexane solution
  • a crosslinked polymer (C-11-1-g) was obtained in the same manner as in Example 1 except that 2 g of a cyclohexane solution of 5% by weight polylysine (number average molecular weight: 4700) was used.
  • the volume average particle size of the crosslinked polymer (C-11-1-g) was measured with a particle analyzer (CAMSIZER XT manufactured by Retsch) and found to be 302 ⁇ m.
  • the absorption capacity of physiological saline was 30 g/g.
  • the physiological saline solution pH measurement result was 7.9.
  • Example 20 Production of crosslinked polymer (C-11-1-h)>
  • the crosslinked polymer was changed from (B-1-1) to (B-11-1), and 5% by weight lecithin (manufactured by Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd., derived from soybeans) was replaced with 2 g of cyclohexane solution
  • a crosslinked polymer (C-11-1-h) was obtained in the same manner as in Example 1 except that 2 g of a cyclohexane solution of 0.5% by weight polyethyleneimine (number average molecular weight: 600) was used.
  • the volume average particle size of the crosslinked polymer (C-11-1-h) was measured with a particle analyzer (CAMSIZER XT manufactured by Retsch) and found to be 288 ⁇ m.
  • the absorption capacity of physiological saline was 28 g/g.
  • the physiological saline solution pH measurement result was 7.8.
  • Example 21 Production of crosslinked polymer (C-4-1-f)>
  • the crosslinked polymer was changed from (B-1-1) to (B-4-1), and 5% by weight lecithin (manufactured by Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd., derived from soybeans) was replaced with 2 g of cyclohexane solution
  • a crosslinked polymer (C-4-1-f) was obtained in the same manner as in Example 1, except that 2 g of an ethanol solution of 5% by weight triethanolamine (manufactured by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) was used.
  • the volume average particle size of the crosslinked polymer (C-4-1-f) was measured with a particle analyzer (CAMSIZER XT manufactured by Retsch) and found to be 241 ⁇ m.
  • the absorption capacity of physiological saline was 27 g/g.
  • the physiological saline solution pH measurement result was 7.5.
  • the free liquid is collected with a pipette, the collected liquid is sealed in a dialysis tube (manufactured by Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Dialysis Membrane Size 20, MWCO: 14000), and desalting is performed at 25 ° C. for 2 hours. Outer vesicles were collected. The weight of the recovered liquid, the amount of exosomes recovered per 1 mL of the specimen, and the recovered amount of albumin per 1 mL of the specimen were as described in Tables 1-4. In addition, the degree of purification was calculated by the following method.
  • [Purity] [Amount of exosomes recovered per 1 mL of specimen] / [Amount of albumin recovered per 1 mL of specimen]
  • the amount of recovered exosomes was measured using an ELISA kit [manufactured by Cosmo Bio Co., Ltd., CD9/CD63 Exosome ELISA KIt, Human].
  • the amount of recovered albumin was measured using an ELISA kit [Human Albumin ELISA Kit manufactured by proteintech].
  • the conventional method of ultracentrifugation was performed, and the weight of the recovered liquid, the amount of exosomes recovered per 1 mL of the specimen, the recovered amount of albumin per 1 mL of the specimen, and the degree of purity were the same as above. evaluated.
  • 30 mL of human urine specimen was subjected to ultracentrifugation to isolate and collect exosomes. Specifically, centrifugation was continuously performed as follows under conditions of 4°C. A 30 mL human urine specimen was centrifuged at 1200 ⁇ g for 10 minutes, and the supernatant was collected and centrifuged at 10000 ⁇ g for 30 minutes.
  • the supernatant was then collected, centrifuged at 70000 ⁇ g for 1 hour, and the supernatant was discarded.
  • the sedimented pellet was resuspended in 5 mL of 0.25 M sucrose solution (20 mM HEPES pH 7.2) and the resulting suspension was added to 40 PA containing 30 mL of 0.25 M to 2 M sucrose gradient solution (20 mM HEPES pH 7.2). It was added to the tube and centrifuged at 100,000 xg for 20 hours.
  • the liquid in the 40PA tube was sucked up from the bottom, and each 2 mL of the 8 mL to 12 mL fraction was collected into a 5PA tube containing 3 mL of PBS(-).
  • the separated liquid was centrifuged at 200,000 ⁇ g for 1 hour, and the sedimented pellet was resuspended in 150 ⁇ L of PBS( ⁇ ) to collect extracellular vesicles.
  • the crosslinked polymer of the present invention can be suitably used for separating a substance having a lipid bilayer from a biological sample.
  • the separation method of the present invention can increase the purity of the separated substance having a lipid bilayer and shorten the operation time, for example, compared to conventional ultracentrifugation methods.
  • the separation method of the present invention can reduce the number of steps and has excellent reproducibility as compared with conventional ultracentrifugation methods.
  • Materials with separated lipid bilayers can be used for status assessment (eg, testing or diagnostics) of the original organism.
  • Substances having separated lipid bilayers can also be used as carriers for cell-targeted therapeutic drugs and the like.

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Abstract

脂質二重層を有する物質の分離に有用な架橋ポリマーを提供する。　酸性基及び／又はその中和塩基を有するモノマー単位を含む架橋ポリマーであり、カチオン性基及び水酸基からなる群から選ばれる少なくとも１種の基を有する化合物を含有する架橋ポリマーは、生体由来試料から脂質二重層を有する物質を分離する用途に好適に利用することができる。

Description

架橋ポリマー、物質を分離する方法、物質を分離するためのキット、疾患を検査するためのキット及び物質を分離するための装置
　本発明は、架橋ポリマー及びその用途に関する。
　細胞から分泌される細胞外小胞は、脂質二重層で囲まれ、その内部にタンパク質、核酸などを含有する小胞体であり、細胞間情報伝達体として機能する。細胞外小胞体としては、例えば、エクソソーム、マイクロベジクル、アポトーシス小体などが挙げられる。これらのうち、エクソソーム（粒子径３０～１００ｎｍの膜小胞）は、様々な細胞から分泌され、全身のあらゆる体液中でその存在が確認されており、体液中を循環して遠隔の細胞まで情報を伝達する可能性が示唆されている。エクソソームに内包されるタンパク質、核酸などは、それを分泌した細胞の状態をリアルタイムに反映したものであり、元の生物の状態、細胞間情報伝達などを評価するためのバイオマーカーとして有用である。
　生体由来試料からエクソソームを回収する方法としては、超遠心機を用いたサイズ分画法が汎用されている。この方法は、ショ糖密度勾配などを利用して、比較的低密度のエクソソームを他の粒子から分離する方法である。
　しかし、超遠心機を用いたサイズ分画法では、回収されるエクソソームの純度が十分ではなく、操作に長時間要するという問題がある。
　本発明は、エクソソームなどの脂質二重層を有する物質の分離に有用な架橋ポリマーを提供することを主たる課題とする。
　本発明者らは、上記の課題を解決すべく鋭意検討した結果、酸性基及び／又はその中和塩基を有するモノマー単位を含む架橋ポリマーであって、カチオン性基及び水酸基からなる群から選ばれる少なくとも１種の基を有する化合物を含有する架橋ポリマーが、エクソソームなどの脂質二重層を有する物質の分離に有用であることを見出した。本発明は、当該知見を基にさらに検討を重ねて完成したものである。
　本発明は、以下の態様を包含する。
項１．
　生体由来試料から脂質二重層を有する物質を分離するための架橋ポリマーであって、酸性基及び／又はその中和塩基を有するモノマー単位を含む架橋ポリマーであり、カチオン性基及び水酸基からなる群から選ばれる少なくとも１種の基とを有する化合物を含有する架橋ポリマー。
項２．
　前記化合物が、置換されていてもよい炭素数１２～３０の炭化水素基を有する、項１に記載の架橋ポリマー。
項３．
　前記化合物が、カチオン性基を有する、項１又は２に記載の架橋ポリマー。
項４．
　前記カチオン性基が、－Ｎ(Ｒ１)２（式中、各Ｒ１は、それぞれ独立して、水素原子、又は、置換されていてもよい炭素数１～６の炭化水素基を示す）、又は－Ｎ＋(Ｒ２)３（式中、各Ｒ２は、それぞれ独立して、水素原子、又は、置換されていてもよい炭素数１～６の炭化水素基を示す）である、項１～３のいずれか１項に記載の架橋ポリマー。
項５．
　前記炭素数１２～３０の炭化水素基が、炭素数１２～２０の脂肪族炭化水素基、又は、炭素数２０～３０の脂環式炭化水素基である、項１～４のいずれか１項に記載の架橋ポリマー。
項６．
　前記脂肪族炭化水素基がアルキル基又はアルケニル基であり、前記脂環式炭化水素基がステロイド骨格を有する基である、項５に記載の架橋ポリマー。
項７．
　前記架橋ポリマーを生理食塩水の重量に基づいて０．５重量％含有する生理食塩水溶液のｐＨが、７～８である、項１～６のいずれか１項に記載の架橋ポリマー。
項８．
　体積平均粒子径が１００～１０００μｍである、項１～７のいずれか１項に記載の架橋ポリマー。
項９．
　前記脂質二重層を有する物質が細胞外小胞である、項１～８のいずれか１項に記載の架橋ポリマー。
項１０．
　生体由来試料から脂質二重層を有する物質を分離する方法であって、下記の工程（１）及び（２）を含む方法：
（１）生体由来試料を請求項１～９のいずれか１項に記載の架橋ポリマーと接触させ、脂質二重層を有する物質を含有するポリマーゲルを得る工程、及び
（２）前記ポリマーゲルを塩と混合し、脂質二重層を有する物質を回収する工程。
項１１．
　生体由来試料から脂質二重層を有する物質を分離するためのキットであって、項１～９のいずれか１項に記載の架橋ポリマー及び塩を含むキット。
項１２．
　細胞外小胞を用いて疾患を検査するためのキットであって、項１～９のいずれか１項に記載の架橋ポリマー及び塩を含むキット。
項１３．
　生体由来試料から脂質二重層を有する物質を分離するための装置であって、項１０に記載の方法を実行する手段を備える装置。
項１４．
　生体由来試料から脂質二重層を有する物質を分離するための、項１～９のいずれかに記載の架橋ポリマーの使用。
　本発明の架橋ポリマーは、生体由来試料から脂質二重層を有する物質を分離する用途に好適に利用することができる。本発明の分離方法は、例えば、従来の超遠心法などと比較して、分離される脂質二重層を有する物質の純度を高くすることができ、操作時間を短縮することができる。また、本発明の分離方法は、従来の超遠心法などと比較して、工程数を低減することができ、再現性にも優れる。分離された脂質二重層を有する物質は、元の生物の状態評価（例えば、検査又は診断）に用いることができる。また、分離された脂質二重層を有する物質は、それを担体として細胞標的治療薬などに用いることができる。
（Ａ）架橋ポリマー
　本発明の架橋ポリマーは、酸性基及び／又はその中和塩基を有するモノマー単位を含む。
　本明細書において、「酸性基」とは、解離性のプロトンを有する基であり、例えば、カルボン酸基（－ＣＯＯＨ）、スルホン酸基［－Ｓ(＝Ｏ)２(ＯＨ)］、硫酸基［－Ｏ－Ｓ(＝Ｏ)２(ＯＨ)］、ホスホン酸基［－Ｐ(＝Ｏ)(ＯＨ)２］、リン酸基［－Ｏ－Ｐ(＝Ｏ)(ＯＨ)２］などが挙げられるが、これらに限定されない。
　本明細書において、「酸性基の中和塩基」とは、任意のカチオンとの中和塩基をいう。カチオンの具体例としては、金属（１価又は２価の金属など）、式：ＮＲ４ ＋（式中、各々のＲは、独立して、水素原子、又は、置換されていてもよい炭化水素基を示し、２つ又は３つのＲは隣接する窒素原子と共に環を形成していてもよい）で表されるカチオンなどが挙げられる。
　前記１価の金属としては、例えば、リチウム、ナトリウム、カリウムなどのアルカリ金属などが挙げられる。前記２価の金属としては、例えば、マグネシウム、カルシウム、バリウムなどのアルカリ土類金属；鉛；亜鉛；錫などが挙げられる。
　前記式：ＮＲ４ ＋で表されるカチオンにおいて、Ｒが置換されていてもよい炭化水素基である場合、当該炭化水素基は、例えば、アルキル基、シクロアルキル基、アリール基、又はアラルキル基などであってもよい。アルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基（ｎ－プロピル基又はイソプロピル基）、ブチル基（ｎ－ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ－ブチル基、又はｔ－ブチル基）などのＣ１－６アルキル基などが挙げられる。シクロアルキル基としては、例えば、シクロペンチル基、シクロヘキシル基などのＣ５－１４シクロアルキル基などが挙げられる。アリール基としては、例えば、フェニル基、ナフチル基などのＣ６－１４アリール基などが挙げられる。アラルキル基としては、例えば、ベンジル基、フェネチル基などのＣ７－１４アラルキル基などが挙げられる。
　前記炭化水素基に置換し得る置換基としては、例えば、ハロゲン原子、ヒドロキシル基、メルカプト基などが挙げられる。
　前記式：ＮＲ４ ＋で表されるカチオンにおいて、２つ又は３つのＲが隣接する窒素原子と共に環を形成する場合、当該環は、ピリジン環、イミダゾール環などの単環であってもよく、キノリン環などの縮合環であってもよい。前記環は、１個以上の置換基を有していてもよく、当該置換基としては、例えば、ハロゲン原子、ヒドロキシル基、アミノ基、アルキル基、ハロアルキル基、ヒドロキシアルキル基、Ｎ，Ｎ－ジアルキルアミノ基などが挙げられる。当該置換基の数は、例えば、１個、２個、又は３個である。
　酸性基を有するモノマーの代表例として、不飽和カルボン酸が挙げられる。不飽和カルボン酸は、例えば、不飽和モノカルボン酸及び不飽和ジカルボン酸を包含する。不飽和モノカルボン酸としては、例えば、アクリル酸、メタクリル酸、クロトン酸などの炭素数３～１０の不飽和モノカルボン酸が挙げられる。不飽和ジカルボン酸（本明細書では無水物も含む）としては、例えば、マレイン酸、フマル酸、シトラコン酸、イタコン酸などの炭素数４～１０の不飽和ジカルボン酸、これらの無水物などが挙げられる。
　また、その他の酸性基を有するモノマーとしては、例えば、スルホン酸基を有する（メタ）アクリルモノマー［例えば、（メタ）アクリル酸２－スルホエチルなどの（メタ）アクリル酸スルホアルキルエステル、２－（メタ）アクリルアミド－２－メチルプロパンスルホン酸などのＮ－スルホアルキル（メタ）アクリル酸アミド］、リン酸基を有する（メタ）アクリルモノマー［例えば、リン酸２－（（メタ）アクリロイルオキシ）エチルなどの（メタ）アクリル酸ホスホノオキシアルキルエステル］などが挙げられる。なお、本明細書において、（メタ）アクリルは、アクリル及び／又はメタクリルを意味し、（メタ）アクリロイルオキシは、アクリロイルオキシ及び／又はメタクリロイルオキシを意味する。
　酸性基を有するモノマーは、１種単独であってもよく、２種以上の組合せであってもよい。
　酸性基の中和塩基を有するモノマーの代表例として、不飽和カルボン酸塩が挙げられる。不飽和カルボン酸塩としては、例えば、不飽和カルボン酸のアルカリ金属塩（例えば、ナトリウム塩、カリウム塩）、アルキルアミン塩（例えば、トリエチルアミン塩などのトリアルキルアミン塩）、アルカノールアミン塩（例えば、ジエタノールアミン塩などのジアルカノールアミン塩、トリエタノールアミン塩などのトリアルカノールアミン塩）、アンモニウム塩、又はテトラアルキルアンモニウム塩（例えば、テトラメチルアンモニウム塩、テトラエチルアンモニウム塩）が挙げられる。
　また、その他の酸性基の中和塩基を有するモノマーとしては、例えば、前記のスルホン酸基を有する（メタ）アクリルモノマーの中和塩、リン酸基を有する（メタ）アクリルモノマーの中和塩などが挙げられる。これらの中和塩としては、例えば、前記のアルカリ金属塩などが挙げられる。
　酸性基の中和塩基を有するモノマーは、１種単独であってもよく、２種以上の組合せであってもよい。
　本発明の架橋ポリマーは、酸性基を有するモノマー単位、及び、酸性基の中和塩基を有するモノマー単位の両方を含むことが好ましい。すなわち、酸性基を有するモノマー単位を含む架橋ポリマーにおいて、酸性基を有するモノマー単位の一部は、中和されて、酸性基の中和塩基を有するモノマー単位に置換されていることが好ましい。中和度［１００×（酸性基の中和塩基のモル数）／（酸性基及びその中和塩基の合計モル数）］は、特に限定されないが、例えば、２５モル％以上、３０モル％以上、３５モル％以上、４０モル％以上、４５モル％以上、又は５０モル％以上であってもよく、９０モル％以下、８５モル％以下、又は８０モル％以下であってもよい。
　本発明の架橋ポリマーは、酸性基及び／又はその中和塩基を有するモノマー単位に加えて、さらに他のモノマー単位を含んでもよい。他のモノマーとしては、例えば、下記の単官能エチレン性不飽和モノマーが挙げられる。
・不飽和カルボン酸（例えば、アクリル酸、メタクリル酸など）のエステル（例えば、メチルエステル、エチルエステル、プロピルエステル、ブチルエステル、ペンチルエステル、ヘキシルエステル、ヘプチルエステル、オクチルエステル、２－エチルヘキシルエステルなどのアルキルエステル；２－ヒドロキシエチルエステルなどのヒドロキシアルキルエステル；２，２，２－トリフルオロエチルエステルなどのハロアルキルエステル；２－アミノエチルエステルなどのアミノアルキルエステル；２－（Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノ）エチルエステルなどの（モノ又はジアルキルアミノ）アルキルエステル；シクロヘキシルエステルなどのシクロアルキルエステル：フェニルエステル、ナフチルエステルなどのアリールエステル；ベンジルエステル、フェネチルエステルなどのアラルキルエステル；グリシジルエステル；ポリエチレングリコールエステルなど）
・不飽和カルボン酸アミド（例えば、遊離アミド；Ｎ－モノアルキルアミド、Ｎ，Ｎ－ジアルキルアミドなどのＮ－置換アミドなど）
・不飽和ジカルボン酸イミド（例えば、マレイミド、シトラコンイミド、イタコンイミド、これらのＮ－アルキル置換体、Ｎ－シクロアルキル置換体、又はＮ－アリール置換体など）
・飽和カルボン酸（例えば、酢酸、プロピオン酸など）のアルケニルエステル（例えば、ビニルエステル、アリルエステルなど）
・不飽和スルホン酸のエステル又はアミド（例えば、上記で例示した不飽和カルボン酸のエステル又はアミドに対応する不飽和スルホン酸のエステル又はアミドなど）
・不飽和アルコール（例えば、アリルアルコール、プロペニルアルコールなど）
・不飽和エーテル（例えば、メチルビニルエーテル、エチルビニルエーテルなどのアルキルビニルエーテル；メチルアリルエーテル、エチルアリルエーテルなどのアルキルアリルエーテル；シクロヘキシルビニルエーテルなどのシクロアルキルビニルエーテル；グリシジルビニルエーテルなど）
・不飽和ニトリル（例えば、アクリロニトリル、メタクリロニトリルなど）
・オレフィン（例えば、エチレン、プロピレン、ブテン、ペンテン、ヘキセンなど）
・芳香族ビニル化合物（例えば、スチレン、α－メチルスチレン、ビニルトルエン、ヒドロキシスチレンなど）
・複素環式ビニル化合物（例えば、Ｎ－ビニルピロリドンなど）
　他のモノマーは、１種単独であってもよく、２種以上の組合せであってもよい。
　なお、架橋ポリマーを構成するモノマーは、２５℃の水への溶解度（ｇ／水１００ｇ）が１ｇ以上であることが好ましく、５ｇ以上であることが更に好ましい。また、架橋ポリマーを構成するモノマーは、水混和性であってもよい。
　本発明の架橋ポリマーは、架橋構造［複数の線状の高分子（酸性基及び／又はその中和塩基を有するモノマーの重合物）のそれぞれの構成原子同士が、直接又は他の原子を介して共有結合している構造］を有するポリマーである。架橋構造は、架橋ポリマーを構成するモノマーが、反応性基を有する場合（例えば、カルボキシル基を有するモノマーとアミノ基を有するモノマーの併用等）は、自己架橋させてもよいが、必要により任意の架橋剤で架橋してもよい。
　架橋剤を用いた架橋の方法としては、例えば、下記の方法が挙げられる。
１）下記の内部架橋剤を用いる方法：前記のモノマーと内部架橋剤とを重合反応させて、直接、架橋構造を有する架橋ポリマーを得る［例えば、特開２００３－２２５５６５号公報、特開２００５－０７５９８２号公報に記載の方法等］
２）下記の表面架橋剤を用いる方法：前記のモノマーを必須構成単量体とするポリマーを、表面架橋剤を用いて架橋し、架橋ポリマーを得る［例えば、特許第３６４８５５３号公報、特開２００３－１６５８８３号公報、特開２００３－２２５５６５号公報、特開２００５－７５９８２号公報、特開２００５－９５７５９号公報に記載の方法等］
　前記の架橋剤（内部架橋剤及び表面架橋剤を含む）としては、特に限定されないが、例えば、下記の２官能以上のエチレン性不飽和モノマーが挙げられる。
・２価以上のアルコール（例えば、エチレングリコール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、ブチレングリコール、ネオペンチルグリコールなどのアルキレングリコール又はポリアルキレングリコール（アルキレン基の好ましい炭素数は２～４、アルキレンオキサイドの好ましい繰り返し数は１０～５０）、グリセリン、ポリグリセリン、トリメチロールエタン、トリメチロールプロパン、ペンタエリスリトール、ジペンタエリスリトール、ソルビタン）のアルケニルエーテル（例えば、ビニルエーテル、アリルエーテルなど）
・不飽和カルボン酸（例えば、アクリル酸、メタクリル酸など）と２価以上のアルコール（例えば、前記エーテルで例示したものなど）とのエステル
・不飽和カルボン酸（例えば、アクリル酸、メタクリル酸など）のアルケニルエステル（例えば、ビニルエステル、アリルエステルなど）
・ポリカルボン酸（例えば、酒石酸、クエン酸、アジピン酸など）のアルケニルエステル（例えば、ビニルエステル、アリルエステルなど）
・イソシアヌル酸のアルケニルエステル（例えば、トリアリルイソシアネートなど）
・アルキレンビスアクリルアミド（例えば、メチレンビスアクリルアミドなど）
・アルキレンビスメタクリルアミド（例えば、メチレンビスメタクリルアミドなど）
・ジ又はトリアルケニルアミン（例えば、ジアリルアミン、トリアリルアミンなど）
・芳香族ポリビニル化合物（例えば、ジビニルベンゼンなど）
　前記の架橋剤としては、前記のモノマーが有する置換基（カルボキシ基、水酸基等）と反応し得る官能基を少なくとも２個以上有する架橋剤を用いることもできる。このような架橋剤としては、多価アルコールグリシジルエーテル（例えば、エチレングリコールジグリシジルエーテルなどのアルキレングリコールジグリシジルエーテル、グリセリンジグリシジルエーテルなどのアルカントリオールジ又はトリグリシジルエーテル）等を用いることができる。
　架橋剤は、１種単独であってもよく、２種以上の組合せであってもよい。
　架橋剤の量は、所望の架橋密度に応じて適宜選択することができ、例えば、架橋ポリマーを構成するモノマーに対して、０．００５モル％以上、又は０．０１モル％以上であってもよく、０．５モル％以下、又は０．４モル％以下であってもよい。
　本発明の架橋ポリマーは、カチオン性基及び水酸基からなる群から選ばれる少なくとも１種の基を有する化合物（以下、「化合物Ｘ」という）を含有（又は担持）する。すなわち、本発明の架橋ポリマーは、化合物Ｘとの共存物の形態を有する。本発明の架橋ポリマーの表面に化合物Ｘが存在することが好ましく、本発明の架橋ポリマーの表面に、水素結合、イオン結合などの非共有結合により、化合物Ｘが付着又は固定されていることが好ましく、本発明の架橋ポリマーの表面の一部又は全部が化合物Ｘで被覆されていることが好ましい。なお、架橋ポリマーの表面とは、架橋ポリマーの分子鎖上、或いは、架橋ポリマーが粒子状、ペレット状などの場合、架橋ポリマーの粒子、ペレットなどの表面を意味する。
　本発明の架橋ポリマーが化合物Ｘを含有することは、例えば、架橋ポリマーを適当な溶媒（例えば、ヘキサンなどの炭化水素系溶媒）に浸漬し、当該溶媒中に化合物Ｘを遊離させ、化合物Ｘを単離してＮＭＲ及びガスクロマトグラフィーに供することで同定することができる。
　化合物Ｘは、カチオン性基及び水酸基からなる群から選ばれる少なくとも１種の基と、置換されていてもよい炭素数２～３０の炭化水素基とを有することが好ましく、カチオン性基及び水酸基からなる群から選ばれる少なくとも１種の基と、置換されていてもよい炭素数１２～３０の炭化水素基とを有することが更に好ましく、一方の末端に、置換されていてもよい炭素数１２～３０の炭化水素基を有し、他方の末端に、カチオン性基及び水酸基からなる群から選ばれる少なくとも１種の基を有することが更に好ましい。化合物Ｘにおいて、前記炭化水素基、カチオン性基、又は水酸基の数は、１個であっても２個以上であってもよい。なお、本明細書において、化合物Ｘがカチオン性基を有し、カチオン性基中に水酸基が含まれる場合も、化合物Ｘはカチオン性基及び水酸基を有するという。同様に、化合物Ｘが、置換されていてもよい炭素数２～３０（又は炭素数１２～３０）の炭化水素基を有し、当該炭化水素基中に置換基として水酸基が含まれる場合も、化合物Ｘは当該炭化水素基及び水酸基を有する、という。
　炭素数１２～３０の炭化水素基は、アルキル基、アルケニル基などの脂肪族炭化水素基、シクロアルキル基、シクロアルケニル基などの脂環式炭化水素基、及び芳香族炭化水素基のいずれであってもよい。前記炭化水素基の置換基としては、例えば、ヒドロキシル基、オキソ基（＝Ｏ）、アルコキシ基、アルケニルオキシ基、これらの組合せなどが挙げられる。前記炭化水素基の置換基の数は、例えば、１個、２個、３個、４個、又は５個である。
　炭素数１２～３０の脂肪族炭化水素基としては、飽和及び不飽和のいずれであってもよく、例えば、ラウリル基、ミリスチル基、パルミチル基、ステアリル基、オレイル基、リノレイル基、アラキジル基などの炭素数１２～２０の脂肪族炭化水素基などが挙げられる。
　例えば、レシチンは、置換されていてもよい炭素数１２～３０の脂肪族炭化水素基として、Ｃ１２－３０アシル基を有し、具体的には、オレイロイルオキシ基及びパルミトイルオキシ基を有する。さらに詳しくは、レシチンは、前記アシル基を有するジアシルグリセロール骨格を有する。
　炭素数１２～３０の脂環式炭化水素基としては、例えば、ステロイド骨格を有する基などが挙げられる。ステロイド骨格は、例えば、下記式（１）で表される：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
 （式中、環Ａの破線は、任意の炭素－炭素単結合が、炭素－炭素二重結合であってもよいことを示し、環Ｂの破線は、当該炭素－炭素単結合が、炭素－炭素二重結合であってもよいことを示し、環Ａ～Ｄは、それぞれ、置換されていてもよい。なお、環上の数字は、置換基の置換位置を示すために便宜的に記載したものである。）
　環Ａ～Ｄに置換し得る置換基としては、例えば、ヒドロキシル基、オキソ基（＝Ｏ）、アルキル基（例えば、メチル基などの炭素数１～４のアルキル基）、これらの組合せ（例えば、ヒドロキシアルキル基）などが挙げられる。置換基の置換位置は、特に限定されないが、例えば、３位、７位、１０位、１１位、１２位、１３位、１７位などが挙げられる。
　式（１）で表される骨格は、下記式（１－１）～（１－５）で表される骨格を包含する：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
　炭素数１２～３０の脂環式炭化水素基は、
　好ましくは、炭素数２０～３０の脂環式炭化水素基であり、
　より好ましくは、式（１）で表される骨格の１７位に、置換されていてもよいアルキレン基（例えば、エチレン基、プロピレン基などの炭素数２～４のアルキレン基）が連結した基であり、
　さらに好ましくは、式（１－１）～（１－５）のいずれかで表される骨格の１７位に、置換されていてもよいアルキレン基（例えば、エチレン基、プロピレン基などの炭素数２～４のアルキレン基）が連結した基である。
　炭素数１２～３０の芳香族炭化水素基としては、例えば、フルオレン、アントラセン、フェナントレン、テトラセン、ピレン、トリフェニレン、クリセン、テトラフェニレンなどが挙げられる。
　置換されていてもよい炭素数１２～３０の炭化水素基は、ジＣ１２－３０アシルグリセロール骨格を有する基、又はステロイド骨格を有する基であることが好ましい。
　本明細書において、「カチオン性基」とは、それ自体カチオンを形成している基、及びそれ自体カチオンを形成していないが、プロトンの結合によりカチオンを形成しうる基を包含する。カチオン性基としては、例えば、－Ｎ(Ｒ１)２（式中、各Ｒ１は、それぞれ独立して、水素原子、又は、置換されていてもよい炭素数１～６の炭化水素基を示す）、－Ｎ＋(Ｒ２)３（式中、各Ｒ２は、それぞれ独立して、水素原子、又は、置換されていてもよい炭素数１～６の炭化水素基を示す）などが挙げられる。
　前記式のＲ１及びＲ２において、炭素数１～６の炭化水素基としては、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基などのアルキル基が挙げられる。炭素数１～６の炭化水素基に置換し得る置換基としては、例えば、ヒドロキシル基、オキソ基、カルボン酸基、スルホン酸基などが挙げられる。
　前記式：－Ｎ(Ｒ１)２で表される基は、好ましくは、－ＮＨ２又は－Ｎ(Ｒ１１)２（式中、Ｒ１１は、炭素数１～５のヒドロキシアルキル基を示す）である。前記炭素数１～５のヒドロキシアルキル基としては、例えば、ヒドロキシエチル基、ヒドロキシプロピル基、ヒドロキシブチル基、ヒドロキシペンチル基（ペンタヒドロキシペンチル基などを含む）などが挙げられる。
　前記式：－Ｎ＋(Ｒ２)３で表される基は、好ましくは、－Ｎ＋(ＣＨ３)３、－Ｎ＋(ＣＨ３)２(Ｃ２Ｈ５)、－Ｎ＋(ＣＨ３)２(Ｃ３Ｈ７)などであり、これらの基は、例えば、－ＣＯ２ －、－ＳＯ３ －などで置換されていてもよい。
　化合物Ｘの好ましいものとしては、炭素数１２～３０の脂肪族炭化水素基及びカチオン性基を有する化合物（例えば、レシチン、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムクロリド）、炭素数１２～３０の炭化水素基及び水酸基を有する化合物（例えば、ラウリルアルコール、ＢＩＧＣＨＡＰ）、炭素数１２～３０の脂環式炭化水素基、カチオン性基、及び水酸基を有する化合物（例えば、ＣＨＡＰＳ）、カチオン性基及び水酸基を有する化合物（例えば、トリエタノールアミン）、カチオン性基を有するポリマー（例えば、ポリリジン、ポリエチレンイミン）等が挙げられる。
　化合物Ｘ（特に、化合物Ｘがカチオン性基を有するポリマーである場合）１モルあたりのカチオン性基のモル濃度の下限は、１モル以上であることが好ましく、脂質二重層を有する物質の回収量を向上させる観点から、５モル以上であることが好ましく、１０モル以上であることが更に好ましい。また、化合物Ｘ１モルあたりのカチオン性基のモル濃度の上限は、１００モル以下であることが好ましい。
　化合物Ｘの化学式量又は数平均分子量の下限は、脂質二重層を有する物質の回収量を向上させる観点から、３００以上であることが好ましく、５００以上であることが更に好ましい。化合物Ｘの化学式量又は数平均分子量の上限は、１００００以下であることが好ましい。
　なお、化合物Ｘの数平均分子量は、ゲルパーミエイションクロマトグラフィー（ＧＰＣ）を用いて、以下の条件等で測定することができる。
＜ＧＰＣ測定条件＞
　［１］装置：ゲルパーミエイションクロマトグラフィー
　　　　　　　［型番「ＨＬＣ－８１２０ＧＰＣ」、東ソー（株）製］
　［２］カラム：「ＴＳＫｇｅｌＧ６０００ＰＷｘｌ」、「ＴＳＫｇｅｌ
　　　　　　　　Ｇ３０００ＰＷｘｌ」［いずれも東ソー（株）製］を直列
　　　　　　　　に連結。
　［３］溶離液：メタノール／水＝３０／７０（容量比）に
　　　　　　　　０．５重量％の酢酸ナトリウムを溶解させたもの。
　［４］基準物質：ポリエチレングリコール（以下ＰＥＧと略記）
　［５］注入条件：サンプル濃度０．２５重量％、カラム温度４０℃
　本発明の架橋剤ポリマーは、脂質二重層を有する物質の分離において、不純物（アルブミンなど）を低減する点から、体積平均粒子径が５０μｍ以上、６０μｍ以上、７０μｍ以上、８０μｍ以上、９０μｍ以上、１００μｍ以上、１１０μｍ以上、１２０μｍ以上、１３０μｍ以上、１４０μｍ以上、又は１５０μｍ以上の範囲にある粒子であることが好ましい。
　また、本発明の架橋剤ポリマーは、脂質二重層を有する物質の回収量を向上させる観点から、体積平均粒子径が２０００μｍ以下、１５００μｍ以下、１０００μｍ以下、５００μｍ以下、又は３００μｍ以下の範囲にある粒子であることが好ましい。体積平均粒子径は、後述の実施例に記載の方法により測定することができる。
　本発明の架橋ポリマーを生理食塩水の重量に基づいて０．５重量％含有する生理食塩水溶液のｐＨ（以下、「生理食塩水溶液ｐＨ」と略記する）は、特に限定されない。生体由来試料からの脂質二重層を有する物質の分離において、負に帯電する不純物（アルブミンなど）を低減する点から、当該生理食塩水溶液ｐＨは、６．５以上、７以上、又は７．２以上であることが好ましく、８．５以下、８以下、７．９以下、又は７．５以下であることが好ましい。生理食塩水溶液ｐＨは、後述の実施例に記載の方法により測定することができる。
　生理食塩水溶液ｐＨは、中和度によって調整することができ、生理食塩水溶液ｐＨが低すぎる場合は、中和度を上昇させることで、生理食塩水溶液ｐＨが上昇する傾向があり、生理食塩水溶液ｐＨが高すぎる場合は、中和度を低下させることで、生理食塩水溶液ｐＨが低下する傾向がある。
　本発明の架橋ポリマーの生理食塩水中の吸水倍率（生理食塩水の吸収倍率）は、脂質二重層を有する物質の回収量を向上させる観点から、１ｇ／ｇ以上であることが好ましく、３ｇ／ｇ以上であることが更に好ましく、５ｇ／ｇ以上であることが特に好ましく、１０ｇ／ｇ以上であることがとりわけ好ましく、又は１５ｇ／ｇ以上が最も好ましい。
　本発明の架橋ポリマーの生理食塩水中の吸水倍率（生理食塩水の吸収倍率）が低すぎる場合は、前記の架橋剤の量を増やすことで、倍率が上昇する傾向がある。
　本発明の架橋ポリマーの生理食塩水中の吸水倍率（生理食塩水の吸収倍率）の上限は、特に限定されないが、例えば、１２０ｇ／ｇ以下が好ましく、１００ｇ／ｇ以下が更に好ましく、５０ｇ／ｇ以下が特に好ましい。生理食塩水の吸収倍率は、後述の実施例の記載の方法により測定することができる。
　本発明の架橋ポリマーがカチオン性基を有する場合、カチオン性基のモル濃度は、脂質二重層を有する物質の回収量を向上させる観点から、乾燥後の架橋ポリマーの重量を基準として、６×１０－６～１×１０－４ｍｏｌ／ｇであることが好ましい。
　乾燥後の架橋ポリマーの重量は、例えば以下の方法で測定できる。
　架橋ポリマー１ｇを、シャーレに乗せ、濾紙で蓋をし、１３０℃で６０分間、循風乾燥機で加熱乾燥した後の残渣の重量を乾燥後の架橋ポリマーの重量とすることができる。
　本発明の架橋ポリマーに含有される化合物Ｘは、脂質二重層を有する物質との親和性に優れるため、本発明の架橋ポリマーは、生体由来試料から脂質二重層を有する物質を分離する用途に好適に利用することができる。脂質二重層を有する物質としては、例えば、エクソソームなどの細胞外小胞などが挙げられる。
　本発明の架橋ポリマーは、例えば、モノマー、架橋剤、溶媒、開始剤、及び必要により中和剤を含有する組成物を重合（溶液重合、乳化重合、懸濁重合など）する工程、重合物を乾燥する工程、及び必要により重合物を分級する工程を含む方法により製造することができる。
（Ｂ）生体由来試料から脂質二重層を有する物質を分離する方法
　生体由来試料から脂質二重層を有する物質を分離する方法は、下記の工程（１）及び（２）を含む：
（１）生体由来試料を架橋ポリマーと接触させ、脂質二重層を有する物質を含有するポリマーゲルを得る工程、及び
（２）前記ポリマーゲルを塩と混合し、脂質二重層を有する物質を回収する工程。
　工程（１）で使用する生体由来試料は、脂質二重層を有する物質を含有する限り、特に制限されない。生体由来試料としては、例えば、ヒト又は動物の血液、血漿、血清、涙液、唾液、母乳、胸水、腹腔液、羊水、脳脊髄液、尿などの体液；臓器、毛髪、爪、皮膚、筋肉、神経などの組織又は細胞の液状化物（細胞培養液及びその上清も包含する）；植物からの抽出液などが挙げられる。生体由来試料は、１種単独であってもよく、２種以上の組合せであってもよい。生体由来試料としては、体液であることが好ましく、血液、血漿、血清、又は尿であることがより好ましい。
　工程（１）で使用する架橋ポリマーとしては、前記「（Ａ）架橋ポリマー」に記載したものと同じものを使用することができる。架橋ポリマーの使用量は、例えば、生体由来試料１００質量部に対して、１質量部以上、５質量部以上、又は１０質量部以上であることが好ましく、２０００質量部以下、１５００質量部以下、又は１０００質量部以下であることが好ましい。
　架橋ポリマーを生体由来試料に接触させる温度は、例えば、１～３５℃の範囲内であり、５～３０℃の範囲内であることが好ましい。また、接触後、所定時間（例えば、１時間以上又は２時間以上、或いは、５時間以下又は４時間以下）静置することが好ましい。
　工程（１）により、脂質二重層を有する物質をポリマーゲル内に分離することができる。
　工程（２）で使用する塩は、ポリマーゲルに含まれる脂質二重層を有する物質を排出できる限り、特に制限されない。塩としては、例えば、金属塩（１価又は２価の金属塩など）が挙げられる。
　前記１価の金属塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩などが挙げられる。前記２価の金属塩としては、例えば、マグネシウム塩、カルシウム塩、バリウム塩などのアルカリ土類金属塩が挙げられる。
　塩の対アニオンとしては、例えば、塩化物イオン、臭化物イオンなどのハロゲン化物イオンなどが挙げられるが、これらに限定されない。
　塩は、１種単独であってもよく、２種以上の組合せであってもよい。塩は、好ましくは、塩化ナトリウム及び塩化マグネシウムからなる群より選択される少なくとも一種である。
　塩の使用量は、例えば、ポリマーゲル１００質量部に対して、１質量部以上、５質量部以上、又は１０質量部以上であることができ、２０００質量部以下、１５００質量部以下、又は１０００質量部以下であることができる。
　ポリマーゲルと塩の混合温度は、例えば、１～３５℃の範囲内、又は５～３０℃の範囲内であることが好ましい。また、混合後、所定時間（例えば、１時間以上又は２時間以上、或いは、５時間以下又は４時間以下）静置することが好ましい。ポリマーゲルと塩との混合物は、必要により透析してもよい。
　工程（２）により、ポリマーゲルに含まれる脂質二重層を有する物質を高い回収率で回収することができる。回収される脂質二重層を有する物質としては、例えば、エクソソームなどの細胞外小胞が挙げられる。
　本発明の方法では、従来の超遠心法に比べて、回収される脂質二重層を有する物質の純度を高くすることができ（夾雑物の量を低減することができ）、また操作時間を短縮することができる。
（Ｃ）生体由来試料から脂質二重層を有する物質を分離するためのキット
　本発明は、生体由来試料から脂質二重層を有する物質を分離するためのキットであって、架橋ポリマー及び塩を含むキットを包含する。当該キットの構成は、前記「（Ｂ）生体由来試料から脂質二重層を有する物質を分離する方法」に対応するものであることが好ましい。本発明のキットは、さらに、生体由来試料から脂質二重層を有する物質を分離する方法に関する説明を含む説明書、前記分離のための器具などを含んでいてもよい。
（Ｄ）細胞外小胞を用いて疾患を検査するためのキット
　本発明は、細胞外小胞を用いて疾患を検査（又は診断）するためのキットであって、架橋ポリマー及び塩を含むキットを包含する。
　検査対象は健常者であっても患者であってもよい。疾患としては、例えば、生活習慣病、慢性腎臓病、神経疾患、免疫疾患、癌、感染症、変性疾患などが挙げられる。
　前記キットは、例えば、検査対象由来の試料（例えば、血液、血漿、血清、涙液、唾液、母乳、胸水、腹腔液、羊水、脳脊髄液、尿などの体液）から細胞外小胞を分離し、細胞外小胞の内包物に基づいて疾患を検査するものであってもよい。前記キットは、細胞外小胞を用いて疾患を検査するための公知のキットにおいて、検査対象由来の試料から細胞外小胞を分離するための試薬として、架橋ポリマー及び塩を含むキットであってもよい。
　前記キット中の架橋ポリマー及び塩としては、それぞれ、前記「（Ｂ）生体由来試料から脂質二重層を有する物質を分離する方法」に記載したものと同じものを使用することができる。前記キットは、さらに、検査対象から細胞外小胞を分離する方法に関する説明を含む説明書、前記分離のための器具などを含んでいてもよい。
（Ｅ）生体由来試料から脂質二重層を有する物質を分離するための装置
　本発明は、生体由来試料から脂質二重層を有する物質を分離するための装置であって、前記「（Ｂ）生体由来試料から脂質二重層を有する物質を分離する方法」を実行する手段を備える装置を包含する。
　以下、実施例によって本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
＜生理食塩水溶液ｐＨ測定方法＞
　直径５０ｍｍの円柱状の１００ｍＬビーカーに、測定試料０．５ｇに生理食塩水（食塩濃度０．９重量％）を加えて全量を１００ｇとし、２５℃にてスターラーチップ（長さ３０ｍｍ）を６０ｒｐｍで３０分攪拌後、２５℃で１分間静置した。静置後、ｐＨメーターにて上清の２５℃でのｐＨを測定した値を生理食塩水溶液ｐＨとした。
＜生理食塩水の吸収倍率の測定方法＞
　目開き６３μｍ（ＪＩＳ　Ｚ８８０１－１：２００６）のナイロン網で作製したティーバッグ（縦２０ｃｍ、横１０ｃｍ）に測定試料１ｇを入れ、生理食塩水（食塩濃度０．９重量％）１０００ｍｌ中に無撹拌下、１時間浸漬した後、１５分間吊るして水切りした。その後、ティーバッグの重量（ｈ１）を測定し次式から生理食塩水の吸収倍率を求めた。
　生理食塩水の吸収倍率（ｇ／ｇ）＝（ｈ１）－（ｈ２）
　使用した生理食塩水及び測定雰囲気の温度は２５℃±２℃とした。測定試料を用いない以外は上記と同様にして、ティーバッグの重量を測定し（ｈ２）とした。
＜製造例１：架橋ポリマー（Ａ－１）の製造＞
　１リットルのビーカーにアクリル酸１１６．５ｇ、イオン交換水２７２．２ｇ、及び架橋剤としてエチレングリコールジグリシジルエーテル１．５ｇ（１．３重量％／アクリル酸）を入れ混合し架橋剤を溶解させた。ビーカーを氷浴で冷却しながら、４８．５重量％水酸化ナトリウム水溶液９６．１ｇを添加し、アクリル酸の一部（７２モル％）を中和した。中和したモノマー溶液を５℃に冷却した後、重合開始剤として２重量％過硫酸カリウム水溶液９．３ｇを添加してモノマー水溶液とした。
　攪拌機とコンデンサー（冷却器）を備えた２リットルのセパラブルフラスコに、シクロヘキサン１４３４ｇ及び分散剤としてレオドールＳＰ－Ｓ１０Ｖ（花王株式会社製、モノステアリン酸ソルビタン）７．１ｇを入れ、湯浴を用いて内温６０℃に加熱し攪拌して、シクロヘキサンに分散剤を溶解させた。
　セパラブルフラスコ中の溶液中に窒素を通じてシクロヘキサンの溶存酸素を０．１ｐｐｍ以下とした後、攪拌機を用いて攪拌しながら、滴下ロートを用いてモノマー水溶液３５０ｇを滴下し、重合温度８０℃で逆相懸濁重合を行い、更にモノマー水溶液の滴下終了後、更に２時間加熱し、懸濁重合を完結させ、シクロヘキサン中で球状の含水ゲルを得た。　攪拌機の回転を停止し、生成した含水ゲルを沈降させた後、デカンテーションによりシクロヘキサンを除去し、残った含水ゲルを数回シクロヘキサンで洗浄し、含水ゲルに付着した分散剤を除去した。得られた球状の含水ゲルを、離型紙の上に広げ、１３０℃の減圧乾燥機（減圧度：１００００～２００００Ｐａ）で１時間乾燥させ架橋ポリマー（Ｘ－１）を得た。
　この架橋ポリマー（Ｘ－１）を、目開き１５０及び３００μｍのふるいを用いて１５０～３００μｍの粒度に調整することにより、架橋ポリマー（Ａ－１）を得た。
　架橋ポリマー（Ａ－１）の体積平均粒子径をパーティクルアナライザー（Ｒｅｔｓｃｈ社製、ＣＡＭＳＩＺＥＲ　ＸＴ）で測定したところ２２０μｍであった。生理食塩水の吸収倍率は２６ｇ／ｇであった。
＜製造例２：架橋ポリマー（Ａ－２）の製造＞
　エチレングリコールジグリシジルエーテルの量を３．０ｇ（２．６重量％／アクリル酸）にしたこと以外は製造例１における架橋ポリマー（Ｘ－１）の製造方法と同様に実施し、架橋ポリマー（Ｘ－２）を得た。
　この架橋ポリマー（Ｘ－２）を、目開き１５０及び３００μｍのふるいを用いて１５０～３００μｍの粒度に調整することにより、架橋ポリマー（Ａ－２）を得た。
　架橋ポリマー（Ａ－２）の体積平均粒子径をパーティクルアナライザー（Ｒｅｔｓｃｈ社製、ＣＡＭＳＩＺＥＲ　ＸＴ）で測定したところ２００μｍであった。生理食塩水の吸収倍率は１６ｇ／ｇであった。
＜製造例３：架橋ポリマー（Ａ－３）の製造＞
　エチレングリコールジグリシジルエーテルの量を０．５８ｇ（０．５重量％／アクリル酸）にしたこと以外は製造例１における架橋ポリマー（Ｘ－１）の製造方法と同様に実施し、架橋ポリマー（Ｘ－３）を得た。
　この架橋ポリマー（Ｘ－３）を、目開き３００及び５００μｍのふるいを用いて３００～５００μｍの粒度に調整することにより、架橋ポリマー（Ａ－３）を得た。
　架橋ポリマー（Ａ－３）の体積平均粒子径をパーティクルアナライザー（Ｒｅｔｓｃｈ社製、ＣＡＭＳＩＺＥＲ　ＸＴ）で測定したところ４１０μｍであった。生理食塩水の吸収倍率は３５ｇ／ｇであった。
＜製造例４：架橋ポリマー（Ａ－４）の製造＞
　２リットルのビーカーに、アクリル酸３００ｇ、イオン交換水７００ｇ、及び架橋剤としてトリメチロールプロパントリアクリレート２．０ｇ（０．６６重量％／アクリル酸）を入れて撹拌混合してアクリル酸水溶液を調製し、３℃に冷却した。
　アクリル酸水溶液を２リットルの断熱重合槽に入れ、アクリル酸水溶液に窒素を通じてアクリル酸水溶液中の溶存酸素量を０．１ｐｐｍ以下とした。この断熱重合層に、１重量％過酸化水素水溶液１．２ｇ、２重量％Ｌ－アスコルビン酸水溶液２．３ｇ、及び２重量％２，２’－アゾビス［２－メチル－Ｎ－（２－ハイドロキシエチル）－プロピオンアミド］水溶液（和光純薬工業株式会社製、商品名：ＶＡ－０８６）４．５ｇを添加し、重合が開始するまでアクリル酸水溶液中への窒素通気を継続した。重合が開始し、アクリル酸水溶液の粘度が上昇し始めたのを確認後、窒素通気を停止して６時間重合した。打点温度計でアクリル酸水溶液の温度を測定したところ、最高到達温度は、９４℃であった。
　ブロック状の架橋された含水ゲルを断熱重合槽から取り出し、小型ミートチョッパー（ローヤル社製）を用いてゲルを３～１０ｍｍの太さのヌードル状になるように細断した後、４０重量％水酸化ナトリウム（試薬特級）水溶液２９２ｇ（アクリル酸の中和度７０モル％相当）を加え含水ゲルを中和し、次に１０重量％亜硫酸ナトリウム水溶液４５ｇを加え、前記小型ミートチョッパーで含水ゲルに均一混練した。
　中和後の細断ゲルを通気型バンド乾燥機｛１５０℃、風速２ｍ／秒｝で乾燥し、乾燥体を得た。乾燥体をジューサーミキサー（Ｏｓｔｅｒ社製ＯＳＴＥＲＩＺＥＲ　ＢＬＥＮＤＥＲ）にて粉砕し、架橋ポリマー（Ｘ－４）を得た。
　この架橋ポリマー（Ｘ－４）を、目開き１５０及び３００μｍのふるいを用いて１５０～３００μｍの粒度に調整することにより、架橋ポリマー（Ａ－４）を得た。
　架橋ポリマー（Ａ－４）の体積平均粒子径をパーティクルアナライザー（Ｒｅｔｓｃｈ社製、ＣＡＭＳＩＺＥＲ　ＸＴ）で測定したところ２２２μｍであった。生理食塩水の吸収倍率は３６ｇ／ｇであった。
＜製造例５：架橋ポリマー（Ａ－５）の製造＞
　製造例４で得た架橋ポリマー（Ｘ－４）を、目開き９０及び１５０μｍのふるいを用いて９０～１５０μｍの粒度に調整することにより、架橋ポリマー（Ａ－５）を得た。
　架橋ポリマー（Ａ－５）の体積平均粒子径をパーティクルアナライザー（Ｒｅｔｓｃｈ社製、ＣＡＭＳＩＺＥＲ　ＸＴ）で測定したところ１２５μｍであった。生理食塩水の吸収倍率は３３ｇ／ｇであった。
＜製造例６：架橋ポリマー（Ａ－６）の製造＞
　製造例４で得た架橋ポリマー（Ｘ－４）を、目開き５００及び７１０μｍのふるいを用いて５００～７１０μｍの粒度に調整することにより、架橋ポリマー（Ａ－６）を得た。　架橋ポリマー（Ａ－６）の体積平均粒子径をパーティクルアナライザー（Ｒｅｔｓｃｈ社製、ＣＡＭＳＩＺＥＲ　ＸＴ）で測定したところ６３０μｍであった。生理食塩水の吸収倍率は３８ｇ／ｇであった。
＜製造例７：架橋ポリマー（Ａ－７）の製造＞
　エチレングリコールジグリシジルエーテルの量を６ｇ（５．２重量％／アクリル酸）にしたこと以外は製造例１における架橋ポリマー（Ｘ－１）の製造方法と同様に実施し、架橋ポリマー（Ｘ－７）を得た。
　この架橋ポリマー（Ｘ－７）を、目開き１５０及び３００μｍのふるいを用いて１５０～３００μｍの粒度に調整することにより、架橋ポリマー（Ａ－７）を得た。
　架橋ポリマー（Ａ－７）の体積平均粒子径をパーティクルアナライザー（Ｒｅｔｓｃｈ社製、ＣＡＭＳＩＺＥＲ　ＸＴ）で測定したところ２２０μｍであった。生理食塩水の吸収倍率は３ｇ／ｇであった。
＜製造例８：架橋ポリマー（Ａ－８）の製造＞
　エチレングリコールジグリシジルエーテルの量を０．２ｇ（０．１７重量％／アクリル酸）にしたこと以外は製造例１における架橋ポリマー（Ｘ－１）の製造方法と同様に実施し、架橋ポリマー（Ｘ－８）を得た。
　この架橋ポリマー（Ｘ－８）を、目開き１５０及び３００μｍのふるいを用いて１５０～３００μｍの粒度に調整することにより、架橋ポリマー（Ａ－８）を得た。
　架橋ポリマー（Ａ－８）の体積平均粒子径をパーティクルアナライザー（Ｒｅｔｓｃｈ社製、ＣＡＭＳＩＺＥＲ　ＸＴ）で測定したところ２２０μｍであった。生理食塩水の吸収倍率は１００ｇ／ｇであった。
＜製造例９：架橋ポリマー（Ａ－９）の製造＞
　製造例１で得た架橋ポリマー（Ｘ－１）を、目開き１００及び２００μｍのふるいを用いて１００～２００μｍの粒度に調整することにより、架橋ポリマー（Ａ－９）を得た。　架橋ポリマー（Ａ－９）の体積平均粒子径をパーティクルアナライザー（Ｒｅｔｓｃｈ社製、ＣＡＭＳＩＺＥＲ　ＸＴ）で測定したところ１５０μｍであった。生理食塩水の吸収倍率は２１ｇ／ｇであった。
＜製造例１０：架橋ポリマー（Ａ－１０）の製造＞
　製造例１で得た架橋ポリマー（Ｘ－１）を、目開き２５０及び３５０μｍのふるいを用いて２５０～３５０μｍの粒度に調整することにより、架橋ポリマー（Ａ－１０）を得た。
　架橋ポリマー（Ａ－１０）の体積平均粒子径をパーティクルアナライザー（Ｒｅｔｓｃｈ社製、ＣＡＭＳＩＺＥＲ　ＸＴ）で測定したところ３００μｍであった。生理食塩水の吸収倍率は２４ｇ／ｇであった。
＜製造例１１：架橋ポリマー（Ａ－１１）の製造＞
　製造例４で得た架橋ポリマー（Ｘ－４）を、目開き２５０及び３５０μｍのふるいを用いて２５０～３５０μｍの粒度に調整することにより、架橋ポリマー（Ａ－１１）を得た。
　架橋ポリマー（Ａ－１１）の体積平均粒子径をパーティクルアナライザー（Ｒｅｔｓｃｈ社製、ＣＡＭＳＩＺＥＲ　ＸＴ）で測定したところ２８８μｍであった。生理食塩水の吸収倍率は３４ｇ／ｇであった。
＜製造例１２：架橋ポリマー（Ｂ－１－１）の製造＞
　架橋ポリマー（Ａ－１）５０ｇに５０重量％炭酸カリウム水溶液２８ｇをスプレーノズルから噴霧添加し、均一混合した後、１３０℃で３０分間加熱し、室温まで冷却して架橋ポリマー（Ｂ－１－１）を得た。架橋ポリマー（Ｂ－１－１）の生理食塩水溶液ｐＨ測定結果は７．５であった。
＜製造例１３：架橋ポリマー（Ｂ－１－２）の製造＞
　製造例１２において、５０重量％炭酸カリウム水溶液の量を２０ｇに変更したこと以外は製造例１２と同様に実施し、架橋ポリマー（Ｂ－１－２）を得た。架橋ポリマー（Ｂ－１－２）の生理食塩水溶液ｐＨ測定結果は７．２であった。
＜製造例１４：架橋ポリマー（Ｂ－１－３）の製造＞
　製造例１２において、５０重量％炭酸カリウム水溶液の量を３２ｇに変更したこと以外は製造例１２と同様に実施し、架橋ポリマー（Ｂ－１－３）を得た。架橋ポリマー（Ｂ－１－３）の生理食塩水溶液ｐＨ測定結果は７．９であった。
＜製造例１５：架橋ポリマー（Ｂ－１－４）の製造＞
　製造例１２において、５０重量％炭酸カリウム水溶液の量を２５ｇに変更したこと以外は製造例１２と同様に実施し、架橋ポリマー（Ｂ－１－４）を得た。架橋ポリマー（Ｂ－１－４）の生理食塩水溶液ｐＨ測定結果は７．３であった。
＜製造例１６：架橋ポリマー（Ｂ－２－１）の製造＞
　製造例１２において、架橋ポリマーを（Ａ－１）から（Ａ－２）に変更したこと以外は製造例１２と同様に実施し、架橋ポリマー（Ｂ－２－１）を得た。架橋ポリマー（Ｂ－２－１）の生理食塩水溶液ｐＨ測定結果は７．４であった。
＜製造例１７：架橋ポリマー（Ｂ－３－１）の製造＞
　製造例１３において、架橋ポリマーを（Ａ－１）から（Ａ－３）に変更したこと以外は製造例１３と同様に実施し、架橋ポリマー（Ｂ－３－１）を得た。架橋ポリマー（Ｂ－３－１）の生理食塩水溶液ｐＨ測定結果は７．１であった。
＜製造例１８：架橋ポリマー（Ｂ－３－２）の製造＞
　製造例１２において、架橋ポリマーを（Ａ－１）から（Ａ－４）に変更し、５０重量％炭酸カリウム水溶液２８ｇに代えて、４８重量％水酸化ナトリウム１２．５ｇを用いたこと以外は製造例１２と同様に実施し、架橋ポリマー（Ｂ－４－１）を得た。架橋ポリマー（Ｂ－４－１）の生理食塩水溶液ｐＨ測定結果は７．５であった。
＜製造例１９：架橋ポリマー（Ｂ－５－１）の製造＞
　製造例１２において、架橋ポリマーを（Ａ－１）から（Ａ－５）に変更し、５０重量％炭酸カリウム水溶液２８ｇに代えて、４８重量％水酸化ナトリウム１２．５ｇを用いたこと以外は製造例１２と同様に実施し、架橋ポリマー（Ｂ－５－１）を得た。架橋ポリマー（Ｂ－５－１）の生理食塩水溶液ｐＨ測定結果は７．４であった。
＜製造例２０：架橋ポリマー（Ｂ－６－１）の製造＞
　製造例１２において、架橋ポリマーを（Ａ－１）から（Ａ－６）に変更し、５０重量％炭酸カリウム水溶液２８ｇに代えて、４８重量％水酸化ナトリウム１５．６ｇを用いたこと以外は製造例１２と同様に実施し、架橋ポリマー（Ｂ－６－１）を得た。架橋ポリマー（Ｂ－６－１）の生理食塩水溶液ｐＨ測定結果は７．９であった。
＜製造例２１：架橋ポリマー（Ｂ－７－１）の製造＞
　製造例１２において、架橋ポリマーを（Ａ－１）から（Ａ－７）に変更したこと以外は製造例１２と同様に実施し、架橋ポリマー（Ｂ－７－１）を得た。架橋ポリマー（Ｂ－７－１）の生理食塩水溶液ｐＨ測定結果は７．４であった。
＜製造例２２：架橋ポリマー（Ｂ－８－１）の製造＞
　製造例１２において、架橋ポリマーを（Ａ－１）から（Ａ－８）に変更したこと以外は製造例１２と同様に実施し、架橋ポリマー（Ｂ－８－１）を得た。架橋ポリマー（Ｂ－８－１）の生理食塩水溶液ｐＨ測定結果は７．４であった。
＜製造例２３：架橋ポリマー（Ｂ－９－１）の製造＞
　製造例１２において、架橋ポリマーを（Ａ－１）から（Ａ－９）に変更したこと以外は製造例１２と同様に実施し、架橋ポリマー（Ｂ－９－１）を得た。架橋ポリマー（Ｂ－９－１）の生理食塩水溶液ｐＨ測定結果は７．４であった。
＜製造例２４：架橋ポリマー（Ｂ－１０－１）の製造＞
　製造例１２において、架橋ポリマーを（Ａ－１）から（Ａ－１０）に変更したこと以外は製造例１２と同様に実施し、架橋ポリマー（Ｂ－１０－１）を得た。架橋ポリマー（Ｂ－１０－１）の生理食塩水溶液ｐＨ測定結果は７．４であった。
＜製造例２５：架橋ポリマー（Ｂ－１１－１）の製造＞
　製造例１２において、架橋ポリマーを（Ａ－１）から（Ａ－１１）に変更したこと以外は製造例１２と同様に実施し、架橋ポリマー（Ｂ－１１－１）を得た。架橋ポリマー（Ｂ－１１－１）の生理食塩水溶液ｐＨ測定結果は７．４であった。
＜実施例１：架橋ポリマー（Ｃ－１－１－ａ）の製造＞
　架橋ポリマー（Ｂ－１－１）１０ｇに５重量％レシチン（富士フイルム和光純薬社製、大豆由来）シクロヘキサン溶液２ｇをスポイトで滴下して添加し、均一混合した後、１３０℃で３０分間加熱し、室温まで冷却して架橋ポリマー（Ｃ－１－１－ａ）を得た。
　架橋ポリマー（Ｃ－１－１－ａ）の体積平均粒子径をパーティクルアナライザー（Ｒｅｔｓｃｈ社製、ＣＡＭＳＩＺＥＲ　ＸＴ）で測定したところ２２０μｍであった。生理食塩水の吸収倍率は２２ｇ／ｇであった。生理食塩水溶液ｐＨ測定結果は７．４であった。
＜実施例２：架橋ポリマー（Ｃ－１－２－ａ）の製造＞
　実施例１において、架橋ポリマーを（Ｂ－１－１）から（Ｂ－１－２）に変更したこと以外は実施例１と同様に実施し、架橋ポリマー（Ｃ－１－２－ａ）を得た。
　架橋ポリマー（Ｃ－１－２－ａ）の体積平均粒子径をパーティクルアナライザー（Ｒｅｔｓｃｈ社製、ＣＡＭＳＩＺＥＲ　ＸＴ）で測定したところ２１８μｍであった。生理食塩水の吸収倍率は２３ｇ／ｇであった。生理食塩水溶液ｐＨ測定結果は７．１であった。
＜実施例３：架橋ポリマー（Ｃ－１－３－ａ）の製造＞
　実施例１において、架橋ポリマーを（Ｂ－１－１）から（Ｂ－１－３）に変更したこと以外は実施例１と同様に実施し、架橋ポリマー（Ｃ－１－３－ａ）を得た。
　架橋ポリマー（Ｃ－１－３－ａ）の体積平均粒子径をパーティクルアナライザー（Ｒｅｔｓｃｈ社製、ＣＡＭＳＩＺＥＲ　ＸＴ）で測定したところ２１８μｍであった。生理食塩水の吸収倍率は１９ｇ／ｇであった。生理食塩水溶液ｐＨ測定結果は７．９であった。
＜実施例４：架橋ポリマー（Ｃ－１－４－ａ）の製造＞
　実施例１において、架橋ポリマーを（Ｂ－１－１）から（Ｂ－１－４）に変更したこと以外は実施例１と同様に実施し、架橋ポリマー（Ｃ－１－４－ａ）を得た。
　架橋ポリマー（Ｃ－１－４－ａ）の体積平均粒子径をパーティクルアナライザー（Ｒｅｔｓｃｈ社製、ＣＡＭＳＩＺＥＲ　ＸＴ）で測定したところ２１８μｍであった。生理食塩水の吸収倍率は２２ｇ／ｇであった。生理食塩水溶液ｐＨ測定結果は７．２であった。
＜実施例５：架橋ポリマー（Ｃ－２－１－ａ）の製造＞
　実施例１において、架橋ポリマーを（Ｂ－１－１）から（Ｂ－２－１）に変更し、５重量％レシチン（富士フイルム和光純薬社製、大豆由来）シクロヘキサン溶液の滴下重量を３ｇに変更したこと以外は実施例１と同様に実施し、架橋ポリマー（Ｃ－２－１－ａ）を得た。
　架橋ポリマー（Ｃ－２－１－ａ）の体積平均粒子径をパーティクルアナライザー（Ｒｅｔｓｃｈ社製、ＣＡＭＳＩＺＥＲ　ＸＴ）で測定したところ２０１μｍであった。生理食塩水の吸収倍率は１１ｇ／ｇであった。生理食塩水溶液ｐＨ測定結果は７．４であった。
＜実施例６：架橋ポリマー（Ｃ－２－１－ｂ）の製造＞
　実施例１において、架橋ポリマーを（Ｂ－１－１）から（Ｂ－２－１）に変更し、５重量％レシチン（富士フイルム和光純薬社製、大豆由来）シクロヘキサン溶液２ｇに代えて、５重量％ＢＩＧＣＨＡＰ（同仁化学研究所社製、Ｎ，Ｎ－ビス（３－Ｄ－グルコナミドプロピル）コラミド）シクロヘキサン溶液１ｇを用いたこと以外は実施例１と同様に実施し、架橋ポリマー（Ｃ－２－１－ｂ）を得た。
　架橋ポリマー（Ｃ－２－１－ｂ）の体積平均粒子径をパーティクルアナライザー（Ｒｅｔｓｃｈ社製、ＣＡＭＳＩＺＥＲ　ＸＴ）で測定したところ２０７μｍであった。生理食塩水の吸収倍率は１１ｇ／ｇであった。生理食塩水溶液ｐＨ測定結果は７．４であった。
＜実施例７：架橋ポリマー（Ｃ－３－１－ｃ）の製造＞
　実施例１において、架橋ポリマーを（Ｂ－１－１）から（Ｂ－３－１）に変更し、５重量％レシチン（富士フイルム和光純薬社製、大豆由来）シクロヘキサン溶液２ｇに代えて、５重量％ヘキサデシルトリメチルアンモニウムクロリド（富士フイルム和光純薬社製、ＨＤＴＭＡ－Ｃｌ）シクロヘキサン溶液１ｇを用いたこと以外は実施例１と同様に実施し、架橋ポリマー（Ｃ－３－１－ｃ）を得た。
　架橋ポリマー（Ｃ－３－１－ｃ）の体積平均粒子径をパーティクルアナライザー（Ｒｅｔｓｃｈ社製、ＣＡＭＳＩＺＥＲ　ＸＴ）で測定したところ４２０μｍであった。生理食塩水の吸収倍率は３２ｇ／ｇであった。生理食塩水溶液ｐＨ測定結果は７．０であった。
＜実施例８：架橋ポリマー（Ｃ－４－１－ｄ）の製造＞
　実施例１において、架橋ポリマーを（Ｂ－１－１）から（Ｂ－４－１）に変更し、５重量％レシチン（富士フイルム和光純薬社製、大豆由来）シクロヘキサン溶液２ｇに代えて、５重量％ＣＨＡＰＳ（富士フイルム和光純薬社製、３－［（３－コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］プロパンスルホネート）シクロヘキサン溶液２ｇを用いたこと以外は実施例１と同様に実施し、架橋ポリマー（Ｃ－４－１－ｄ）を得た。
　架橋ポリマー（Ｃ－４－１－ｄ）の体積平均粒子径をパーティクルアナライザー（Ｒｅｔｓｃｈ社製、ＣＡＭＳＩＺＥＲ　ＸＴ）で測定したところ２２２μｍであった。生理食塩水の吸収倍率は３２ｇ／ｇであった。生理食塩水溶液ｐＨ測定結果は７．０であった。
＜実施例９：架橋ポリマー（Ｃ－４－１－ｅ）の製造＞
　実施例１において、架橋ポリマーを（Ｂ－１－１）から（Ｂ－４－１）に変更し、５重量％レシチン（富士フイルム和光純薬社製、大豆由来）シクロヘキサン溶液２ｇに代えて、５重量％ラウリルアルコール（東京化成工業社製）シクロヘキサン溶液２ｇを用いたこと以外は実施例１と同様に実施し、架橋ポリマー（Ｃ－４－１－ｅ）を得た。
　架橋ポリマー（Ｃ－４－１－ｅ）の体積平均粒子径をパーティクルアナライザー（Ｒｅｔｓｃｈ社製、ＣＡＭＳＩＺＥＲ　ＸＴ）で測定したところ２２８μｍであった。生理食塩水の吸収倍率は２８ｇ／ｇであった。生理食塩水溶液ｐＨ測定結果は７．４であった。
＜実施例１０：架橋ポリマー（Ｃ－５－１－ｄ）の製造＞
　実施例１において、架橋ポリマーを（Ｂ－１－１）から（Ｂ－５－１）に変更し、５重量％レシチン（富士フイルム和光純薬社製、大豆由来）シクロヘキサン溶液２ｇに代えて、５重量％ＣＨＡＰＳ（富士フイルム和光純薬社製）シクロヘキサン溶液３ｇを用いたこと以外は実施例１と同様に実施し、架橋ポリマー（Ｃ－５－１－ｄ）を得た。
　架橋ポリマー（Ｃ－５－１－ｄ）の体積平均粒子径をパーティクルアナライザー（Ｒｅｔｓｃｈ社製、ＣＡＭＳＩＺＥＲ　ＸＴ）で測定したところ１３３μｍであった。生理食塩水の吸収倍率は３０ｇ／ｇであった。生理食塩水溶液ｐＨ測定結果は７．４であった。
＜実施例１１：架橋ポリマー（Ｃ－６－１－ｄ）の製造＞
　実施例１において、架橋ポリマーを（Ｂ－１－１）から（Ｂ－６－１）に変更し、５重量％レシチン（富士フイルム和光純薬社製、大豆由来）シクロヘキサン溶液２ｇに代えて、５重量％ＣＨＡＰＳ（富士フイルム和光純薬社製）シクロヘキサン溶液２ｇを用いたこと以外は実施例１と同様に実施し、架橋ポリマー（Ｃ－６－１－ｄ）を得た。
　架橋ポリマー（Ｃ－６－１－ｄ）の体積平均粒子径をパーティクルアナライザー（Ｒｅｔｓｃｈ社製、ＣＡＭＳＩＺＥＲ　ＸＴ）で測定したところ６３０μｍであった。生理食塩水の吸収倍率は３３ｇ／ｇであった。生理食塩水溶液ｐＨ測定結果は７．８であった。
＜実施例１２：架橋ポリマー（Ｃ－４－０－ａ）の製造＞
　実施例１において、架橋ポリマーを（Ｂ－１－１）から（Ａ－１）に変更したこと以外は実施例１と同様に実施し、架橋ポリマー（Ｃ－４－０－ａ）を得た。
　架橋ポリマー（Ｃ－４－０－ａ）の体積平均粒子径をパーティクルアナライザー（Ｒｅｔｓｃｈ社製、ＣＡＭＳＩＺＥＲ　ＸＴ）で測定したところ２３０μｍであった。生理食塩水の吸収倍率は２５ｇ／ｇであった。生理食塩水溶液ｐＨ測定結果は６．１であった。
＜実施例１３：架橋ポリマー（Ｃ－７－１－ａ）の製造＞
　実施例１において、架橋ポリマーを（Ｂ－１－１）から（Ｂ－７－１）に変更したこと以外は実施例１と同様に実施し、架橋ポリマー（Ｃ－７－１－ａ）を得た。
　架橋ポリマー（Ｃ－７－１－ａ）の体積平均粒子径をパーティクルアナライザー（Ｒｅｔｓｃｈ社製、ＣＡＭＳＩＺＥＲ　ＸＴ）で測定したところ２２０μｍであった。生理食塩水の吸収倍率は３ｇ／ｇであった。生理食塩水溶液ｐＨ測定結果は７．４であった。
＜実施例１４：架橋ポリマー（Ｃ－８－１－ａ）の製造＞
　実施例１において、架橋ポリマーを（Ｂ－１－１）から（Ｂ－８－１）に変更したこと以外は実施例１と同様に実施し、架橋ポリマー（Ｃ－８－１－ａ）を得た。
　架橋ポリマー（Ｃ－８－１－ａ）の体積平均粒子径をパーティクルアナライザー（Ｒｅｔｓｃｈ社製、ＣＡＭＳＩＺＥＲ　ＸＴ）で測定したところ２２０μｍであった。生理食塩水の吸収倍率は１００ｇ／ｇであった。生理食塩水溶液ｐＨ測定結果は７．４であった。
＜実施例１５：架橋ポリマー（Ｃ－９－１－ａ）の製造＞
　実施例１において、架橋ポリマーを（Ｂ－１－１）から（Ｂ－９－１）に変更したこと以外は実施例１と同様に実施し、架橋ポリマー（Ｃ－９－１－ａ）を得た。
　架橋ポリマー（Ｃ－９－１－ａ）の体積平均粒子径をパーティクルアナライザー（Ｒｅｔｓｃｈ社製、ＣＡＭＳＩＺＥＲ　ＸＴ）で測定したところ１５５μｍであった。生理食塩水の吸収倍率は２１ｇ／ｇであった。生理食塩水溶液ｐＨ測定結果は７．４であった。
＜実施例１６：架橋ポリマー（Ｃ－１０－１－ａ）の製造＞
　実施例１において、架橋ポリマーを（Ｂ－１－１）から（Ｂ－１０－１）に変更したこと以外は実施例１と同様に実施し、架橋ポリマー（Ｃ－１０－１－ａ）を得た。
　架橋ポリマー（Ｃ－１０－１－ａ）の体積平均粒子径をパーティクルアナライザー（Ｒｅｔｓｃｈ社製、ＣＡＭＳＩＺＥＲ　ＸＴ）で測定したところ２９７μｍであった。生理食塩水の吸収倍率は２２ｇ／ｇであった。生理食塩水溶液ｐＨ測定結果は７．４であった。
＜実施例１７：架橋ポリマー（Ｃ－１－１－ａ２）の製造＞
　実施例１において、５重量％レシチン（富士フイルム和光純薬社製、大豆由来）シクロヘキサン溶液２ｇに代えて、５重量％レシチン（富士フイルム和光純薬社製、大豆由来）シクロヘキサン溶液１ｇを用いたこと以外は実施例１と同様に実施し、架橋ポリマー（Ｃ－１０－１－ａ２）を得た。
　架橋ポリマー（Ｃ－１０－１－ａ２）の体積平均粒子径をパーティクルアナライザー（Ｒｅｔｓｃｈ社製、ＣＡＭＳＩＺＥＲ　ＸＴ）で測定したところ２２２μｍであった。生理食塩水の吸収倍率は２２ｇ／ｇであった。生理食塩水溶液ｐＨ測定結果は７．４であった。
＜実施例１８：架橋ポリマー（Ｃ－１－１－ａ３）の製造＞
　実施例１において、５重量％レシチン（富士フイルム和光純薬社製、大豆由来）シクロヘキサン溶液２ｇに代えて、２０重量％レシチン（富士フイルム和光純薬社製、大豆由来）シクロヘキサン溶液４ｇを用いたこと以外は実施例１と同様に実施し、架橋ポリマー（Ｃ－１－１－ａ３）を得た。
　架橋ポリマー（Ｃ－１－１－ａ３）の体積平均粒子径をパーティクルアナライザー（Ｒｅｔｓｃｈ社製、ＣＡＭＳＩＺＥＲ　ＸＴ）で測定したところ２３１μｍであった。生理食塩水の吸収倍率は２３ｇ／ｇであった。生理食塩水溶液ｐＨ測定結果は７．４であった。
＜実施例１９：架橋ポリマー（Ｃ－１１－１－ｇ）の製造＞
　実施例１において、架橋ポリマーを（Ｂ－１－１）から（Ｂ－１１－１）に変更し、５重量％レシチン（富士フイルム和光純薬社製、大豆由来）シクロヘキサン溶液２ｇに代えて、５重量％ポリリジン（数平均分子量：４７００）シクロヘキサン溶液２ｇを用いたこと以外は実施例１と同様に実施し、架橋ポリマー（Ｃ－１１－１－ｇ）を得た。
　架橋ポリマー（Ｃ－１１－１－ｇ）の体積平均粒子径をパーティクルアナライザー（Ｒｅｔｓｃｈ社製、ＣＡＭＳＩＺＥＲ　ＸＴ）で測定したところ３０２μｍであった。生理食塩水の吸収倍率は３０ｇ／ｇであった。生理食塩水溶液ｐＨ測定結果は７．９であった。
＜実施例２０：架橋ポリマー（Ｃ－１１－１－ｈ）の製造＞
　実施例１において、架橋ポリマーを（Ｂ－１－１）から（Ｂ－１１－１）に変更し、５重量％レシチン（富士フイルム和光純薬社製、大豆由来）シクロヘキサン溶液２ｇに代えて、０．５重量％ポリエチレンイミン（数平均分子量：６００）シクロヘキサン溶液２ｇを用いたこと以外は実施例１と同様に実施し、架橋ポリマー（Ｃ－１１－１－ｈ）を得た。
　架橋ポリマー（Ｃ－１１－１－ｈ）の体積平均粒子径をパーティクルアナライザー（Ｒｅｔｓｃｈ社製、ＣＡＭＳＩＺＥＲ　ＸＴ）で測定したところ２８８μｍであった。生理食塩水の吸収倍率は２８ｇ／ｇであった。生理食塩水溶液ｐＨ測定結果は７．８であった。
＜実施例２１：架橋ポリマー（Ｃ－４－１－ｆ）の製造＞
　実施例１において、架橋ポリマーを（Ｂ－１－１）から（Ｂ－４－１）に変更し、５重量％レシチン（富士フイルム和光純薬社製、大豆由来）シクロヘキサン溶液２ｇに代えて、５重量％トリエタノールアミン（東京化成工業社製）エタノール溶液２ｇを用いたこと以外は実施例１と同様に実施し、架橋ポリマー（Ｃ－４－１－ｆ）を得た。
　架橋ポリマー（Ｃ－４－１－ｆ）の体積平均粒子径をパーティクルアナライザー（Ｒｅｔｓｃｈ社製、ＣＡＭＳＩＺＥＲ　ＸＴ）で測定したところ２４１μｍであった。生理食塩水の吸収倍率は２７ｇ／ｇであった。生理食塩水溶液ｐＨ測定結果は７．５であった。
　各実施例で製造した架橋ポリマー（Ｃ）について、その内の１ｇを、シャーレに乗せ、濾紙で蓋をし、１３０℃で６０分間、循風乾燥機で加熱乾燥した後の残渣の重量を測定した。加熱乾燥前の架橋ポリマー（Ｃ）の重量に対する加熱乾燥後の重量割合（１００－乾燥減量（％）、ここで、乾燥減量（％）は、加熱乾燥前のポリマー（Ｃ）の重量に対する、加熱乾燥した際の減少重量割合を意味する）を表１～４に記載する。
＜試験例：架橋ポリマーを用いた細胞外小胞の回収＞
　実施例１～２１で製造した架橋ポリマー並びに以下の比較用の架橋ポリマーを用いて、以下の方法で、細胞外小胞（エクソソーム）の分離回収を実施し、細胞外小胞の回収量及び精製度等を評価した。
　なお、比較例１では、比較用の架橋ポリマーとして、製造例１で得た架橋ポリマー（Ａ－１）を用いた。
　また、比較例２では、比較用の架橋ポリマーとして、製造例１２で得た架橋ポリマー（Ｂ－１－１）を用いた。
　また、比較例３では、架橋ポリマーを添加せず、実施した。
　各検体１ｍＬを１２００×ｇで１０分間の遠心分離処理し、デブリスを除去した上清を回収する。１．５ｍＬマイクロチューブに架橋ポリマーを４０ｍｇ加えて、次いでデブリスを除去した上清１ｍＬを加えて２５℃で３０分間静置した。その後、上澄みを廃棄し、得られたゲルに０．５ｍＬの生理食塩水（食塩濃度０．９重量％）を加えて、ピペッティングで攪拌した後に上澄みを廃棄する洗浄操作を３回繰り返した。
　次いで、７０ｍｇの食塩を添加し２５℃で３０分静置した。その後、ピペットで遊離液を回収し、回収液を透析チューブ（富士フイルム和光純薬社製、ダイアライシスメンブレン　サイズ２０　ＭＷＣＯ：１４０００）に封入して、２５℃で２時間脱塩を実施して細胞外小胞を回収した。
　回収した液の重量、検体１ｍＬあたりのエクソソームの回収量、及び、検体１ｍＬあたりのアルブミンの回収量は、表１～４に記載の通りであった。
　また、以下の方法で、精製度を算出した。
［精製度］＝［検体１ｍＬあたりのエクソソーム回収量］／［検体１ｍＬあたりのアルブミン回収量］
　なお、エクソソームの回収量は、ＥＬＩＳＡキット［コスモ・バイオ（株）製、ＣＤ９／ＣＤ６３　Ｅｘｏｓｏｍｅ　ＥＬＩＳＡ　ＫＩｔ，Ｈｕｍａｎ］を用いて測定した。また、アルブミンの回収量は、ＥＬＩＳＡキット［ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ社製、Ｈｕｍａｎ　Ａｌｂｕｍｉｎ　ＥＬＩＳＡ　Ｋｉｔ］を用いて測定した。
　また、更に比較のため、従来の方法である超遠心分離法を実施し、上記と同じく、回収した液の重量、検体１ｍＬあたりのエクソソームの回収量、検体１ｍＬあたりのアルブミンの回収量及び精製度を評価した。
　ヒト尿検体３０ｍＬを超遠心分離に供し、エクソソームを単離、回収した。具体的には、いずれも４℃条件下、以下のとおり連続的に遠心分離を行った。
　ヒト尿検体３０ｍＬを１２００×ｇで１０分間の遠心分離処理し、上清を回収し、１００００×ｇで３０分間遠心分離処理した。次いで上清を回収し、７００００×ｇで１時間遠心分離処理し、上清を廃棄した。沈降したペレットを５ｍＬの０．２５Ｍスクロース溶液（２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ　ｐＨ７．２）で再懸濁し、得られた懸濁液を０．２５Ｍ～２Ｍスクロースグラジエント溶液（２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ　ｐＨ７．２）３０ｍＬが入った４０ＰＡチューブに添加して、１０００００×ｇで２０時間の遠心分離処理をした。４０ＰＡチューブの液を下部より吸い上げて、８ｍＬ～１２ｍＬの分画を２ｍＬずつ、３ｍＬのＰＢＳ（－）が入った５ＰＡチューブへ分取した。
　分取した液を２０００００×ｇで１時間遠心処理し、沈降したペレットを１５０μＬのＰＢＳ（－）で再懸濁し、細胞外小胞を回収した。
　結果を表１～４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　本発明の架橋ポリマーは、生体由来試料から脂質二重層を有する物質を分離する用途に好適に利用することができる。本発明の分離方法は、例えば、従来の超遠心法などと比較して、分離される脂質二重層を有する物質の純度を高くすることができ、操作時間を短縮することができる。また、本発明の分離方法は、従来の超遠心法などと比較して、工程数を低減することができ、再現性にも優れる。分離された脂質二重層を有する物質は、元の生物の状態評価（例えば、検査又は診断）に用いることができる。また、分離された脂質二重層を有する物質は、それを担体として細胞標的治療薬などに用いることができる。

Claims (13)

  1. 　生体由来試料から脂質二重層を有する物質を分離するための架橋ポリマーであって、酸性基及び／又はその中和塩基を有するモノマー単位を含む架橋ポリマーであり、カチオン性基及び水酸基からなる群から選ばれる少なくとも１種の基を有する化合物を含有する架橋ポリマー。
  2. 　前記化合物が、置換されていてもよい炭素数１２～３０の炭化水素基を有する、請求項１に記載の架橋ポリマー。
  3. 　前記化合物が、カチオン性基を有する、請求項１又は２に記載の架橋ポリマー。
  4. 　前記カチオン性基が、－Ｎ(Ｒ１)２（式中、各Ｒ１は、それぞれ独立して、水素原子、又は、置換されていてもよい炭素数１～６の炭化水素基を示す）、又は－Ｎ＋(Ｒ２)３（式中、各Ｒ２は、それぞれ独立して、水素原子、又は、置換されていてもよい炭素数１～６の炭化水素基を示す）である、請求項１～３のいずれか１項に記載の架橋ポリマー。
  5. 　前記炭素数１２～３０の炭化水素基が、炭素数１２～２０の脂肪族炭化水素基、又は、炭素数２０～３０の脂環式炭化水素基である、請求項１～４のいずれか１項に記載の架橋ポリマー。
  6. 　前記脂肪族炭化水素基がアルキル基又はアルケニル基であり、前記脂環式炭化水素基がステロイド骨格を有する基である、請求項５に記載の架橋ポリマー。
  7. 　前記架橋ポリマーを生理食塩水の重量に基づいて０．５重量％含有する生理食塩水溶液のｐＨが、７～８である、請求項１～６のいずれか１項に記載の架橋ポリマー。
  8. 　体積平均粒子径が１００～１０００μｍである、請求項１～７のいずれか１項に記載の架橋ポリマー。
  9. 　前記脂質二重層を有する物質が細胞外小胞である、請求項１～８のいずれか１項に記載の架橋ポリマー。
  10. 　生体由来試料から脂質二重層を有する物質を分離する方法であって、下記の工程（１）及び（２）を含む方法：
    （１）生体由来試料を請求項１～９のいずれか１項に記載の架橋ポリマーと接触させ、脂質二重層を有する物質を含有するポリマーゲルを得る工程、及び
    （２）前記ポリマーゲルを塩と混合し、脂質二重層を有する物質を回収する工程。
  11. 　生体由来試料から脂質二重層を有する物質を分離するためのキットであって、請求項１～９のいずれか１項に記載の架橋ポリマー及び塩を含むキット。
  12. 　細胞外小胞を用いて疾患を検査するためのキットであって、請求項１～９のいずれか１項に記載の架橋ポリマー及び塩を含むキット。
  13. 　生体由来試料から脂質二重層を有する物質を分離するための装置であって、請求項１０に記載の方法を実行する手段を備える装置。
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