WO2022096834A1 - Utilisation du virus torque teno (ttv) en tant que marqueur pour determiner la capacite de proliferation des lymphocytes t - Google Patents

Utilisation du virus torque teno (ttv) en tant que marqueur pour determiner la capacite de proliferation des lymphocytes t Download PDF

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WO2022096834A1
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ttv
lymphocytes
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patient
load
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PCT/FR2021/051951
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Karen Brengel-Pesce
Sophie ASSANT-TROUILLET
William MOUTON
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Biomerieux
Hospices Civils De Lyon
Universite Claude Bernard Lyon 1
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    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers

Definitions

  • TITLE USE OF TORQUE TENO VIRUS (TTV) AS A MARKER TO DETERMINE THE PROLIFERATIVE CAPACITY OF T LYMPHOCYTES
  • the immune system defends the body against attacks such as pathogenic infections, cell transformation and physical or chemical damage. An immunocompetent individual is thus able to trigger a protective immune response against antigenic stimulation.
  • an immunodeficiency manifests itself. This takes various forms and can affect the innate or adaptive immune system, or both, depending on the source of the deficiency.
  • immunodeficiency is acquired during life. It can result from a pathology, infectious or not (for example an HIV infection), or be produced by a therapy, such as radiotherapy or chemotherapy.
  • the immunodeficiency state is particularly dangerous, because the patient then has an increased susceptibility to secondary infections by pathogens such as bacteria, viruses, parasites or fungi.
  • pathogens such as bacteria, viruses, parasites or fungi.
  • the use of immunosuppressive therapies in transplants including hematopoietic stem cell transplants (HSCTs)
  • HSCTs hematopoietic stem cell transplants
  • a set of techniques is available for measuring immunocompetence, none of which is completely satisfactory. These techniques measure, among other things, the cell-mediated immune response and include in particular the analysis of lymphocyte populations, in particular the count of CD4 + T lymphocytes or the measurement of the ratio of CD4 + /CD8 + T lymphocytes, the measurement of the capacity of lymphocyte proliferation, measurement of the cytotoxic activity of T lymphocytes, measurement of the antibody response, labeling of tetramers, detection of cytokines produced, ELISpot, etc.
  • Some of these techniques such as for example the counting of T lymphocytes, give a result which does not necessarily reflect the activity of these cells and therefore the activity of the immune system. An absolute number of T cells says nothing about the ability of these cells to multiply.
  • TTV Torque Teno Virus
  • UTR well-conserved non-coding region
  • TTV produces chronic infections with no clearly associated clinical manifestation. We speak of an apathogenic or orphan virus. Numerous studies have thus focused on the involvement of TTV in human pathology, in particular in certain hepatic pathologies, without a clear role being identified for this virus.
  • TTV load is higher in subjects with immunodeficiency.
  • significant levels of TTV are found in patients who have received immunosuppressive treatments in the context of organ transplants (Rezahosseini et al., Transplant Rev (Orlando). 33(3): 137-144, 2019) or of GCSH (Albert et al., Med Microbiol Immunol. 208(2):253-258, 2019).
  • GCSH GCSH
  • TTV load may be a marker of immunocompetence (8-11).
  • immunocompetence was only assessed by the number of immune cells or by the occurrence of clinical adverse events (11-14).
  • the quantity of cells is not necessarily associated with the quality of the cells, that is to say that the activity of the T cells is not reflected by their number (12).
  • the present invention relates to a method for determining whether T lymphocytes are functional in a subject. More specifically, the inventors have shown that the proliferative capacity of T lymphocytes is inversely correlated to the load of torque teno virus (TTV for Torque Teno Virus), in particular in a patient having received a transplant, more particularly an HSCT.
  • TTV viral load is inversely correlated to the proliferation of T lymphocytes: thus the greater the TTV load, the less the lymphocytes are able to proliferate.
  • Viral load is not specifically correlated with any other parameter, be it the number of T cells or a clinical criterion, underlining the relevance of the identified correlation.
  • the TTV load is a specific marker of T cell activity, particularly in patients who have received a transplant and in particular an HSCT.
  • the evolution of the functionality of the immune system can therefore be monitored in a subject by a simple measurement of its TTV load. It is thus possible to quickly assess the functional state of the immune system without having to implement the cumbersome technical steps usually used to assess this parameter.
  • the subject of the present description is a method for determining the proliferative capacity of T cells in a subject, said method comprising measuring the TTV load in the patient.
  • the proliferative capacity of T cells is not necessarily correlated with the number of said T cells. Therefore, the known methods of counting T cells are in no way informative about the proliferative capacity of T cells and therefore, on the functionality of the immune system. He It is therefore to the merit of the inventors to have identified a new parameter, easily measured routinely, which is advantageously correlated with the proliferative capacity of the T cells, thus making it possible to evaluate the functionality of the immune system.
  • T lymphocytes or “T cells” are essential cells of the immune system responsible for boosting or slowing down the immune response.
  • T lymphocytes are characterized by the expression of a membrane marker called CD3 and of a specific receptor, the TCR (for “T cell receptor”), which is directly involved in antigenic recognition.
  • the T lymphocytes can express other surface markers, in particular CD4 and CD8, which correspond to specific functional categories of T lymphocytes. residual cells from the recipient or the donor T lymphocytes present in the graft. They can also be na ⁇ ve T lymphocytes resulting from the differentiation of donor stem and progenitor cells in the recipient's thymus.
  • T cell activation or “T cell activation” here refers to the process by which na ⁇ ve T cells become able to participate in the immune response.
  • the activation of T cells leads in particular to their proliferation.
  • the activation of the T cells is thus advantageously evaluated by measuring the proliferation of the T cells.
  • the measurement of the proliferation of the T cells is usually carried out by techniques well known to those skilled in the art but requiring a heavy implementation.
  • a mitogen such as concanavalin A (Con A), pokeweed mitogen (PWM for "pokeweed mitogen” and phytohaemagglutinin ( PHA), independently of the specificity of their TCR.
  • Con A concanavalin A
  • PWM pokeweed mitogen
  • PHA phytohaemagglutinin
  • the methods of the prior art evaluate the proliferative capacity of T lymphocytes by measuring the DNA synthesis of T lymphocytes after their stimulation by a mitogen.
  • these methods require a cumbersome implementation and can therefore hardly be used routinely.
  • the method described here is particularly simple and robust.
  • Assay by flow cytometry for example from culture pellets, in order to determine the proliferation of T lymphocytes.
  • a method for determining the proliferative capacity of T cells in a subject, said method comprising: a) measuring the TTV load from a sample of said subject; and b) determining the proliferative capacity of the subject's T cells in view of the viral load measured in a).
  • a high TTV load indicates that the T cells have a low proliferative capacity. Conversely, a low TTV load indicates that the T cells have a high proliferative capacity.
  • a reference TTV load may be the TTV viral load measured in the same individual.
  • the present method is more particularly suitable for evaluating the proliferative capacities of T cells in a subject likely to present an immunodeficiency state.
  • immunodeficiency refers to the reduction or suppression of immune system function.
  • An “immunodeficiency state” therefore designates here a state in which the immune system of a subject is reduced or absent.
  • the humoral and/or cellular immune response towards infectious pathogens is defective in subjects with an immunodeficiency state. More preferentially, the state of immunodeficiency is manifested at least by a reduction in the cellular response.
  • Immunodeficiency can be primary or secondary.
  • Primary immunodeficiencies include innate deficiencies of the immune system with increased susceptibility to infections.
  • secondary immunodeficiency or acquired immunity is a loss of immune function that occurs throughout life, such as, but not limited to, following exposure to pathogens, disease (eg, lymphoma or leukemia), therapy to treat disease (eg, radiotherapy or chemotherapy), immunosuppression, or aging.
  • Pathogens that can cause immunodeficiency include but are not limited to Human Immunodeficiency Virus (HIV) 1 (HIV-1), HIV-2, Treponema pallidum, Plasmodium falciparum, Plasmodium malariae, Plasmodium ovale, Plasmodium vivax, Plasmodium knowlesi, hepatitis B virus (HBV), hepatitis C virus (HCV), prions, West Nile virus, parvovirus, Trypanosoma cruzi, coronaviruses such as S ⁇ RS-COV-1 and S ⁇ RS- COV-2, and/or vaccinia virus.
  • HIV Human Immunodeficiency Virus
  • HIV-1 HIV-1
  • HIV-2 HIV-2
  • Treponema pallidum Plasmodium falciparum
  • Plasmodium malariae Plasmodium malariae
  • Plasmodium ovale Plasmodium ovale
  • Plasmodium vivax Plasmodium knowlesi
  • HBV
  • Immunodeficiency can also be deliberately induced with drugs, for example in preparation for a transplant, such as an organ transplant (eg, kidney, liver, heart, lung, pancreas, intestine, etc.) or HSCT, to prevent graft rejection.
  • a transplant such as an organ transplant (eg, kidney, liver, heart, lung, pancreas, intestine, etc.) or HSCT, to prevent graft rejection.
  • the immunodeficiency according to the present description is a secondary (or acquired) immunodeficiency.
  • the immunodeficiency described herein can be of any origin such as, for example, but not limited to, immunosuppressive treatment, immunosuppressive side effects of drugs or therapy including radiation therapy, inherited immunosuppressive genetic traits or diseases, acquired immunosuppressive diseases such as AIDS, cancers such as leukemia or lymphoma.
  • immunodeficiency is linked to a transplant, especially an HSCT.
  • the subject likely to present an immunodeficiency state is a subject having received a transplant.
  • this graft is a HSCT.
  • the description relates to a method for determining the proliferative capacity of T cells in a subject, the subject having received a HSCT, the method comprising the steps of: a) measuring the TTV load from a sample from subject ; and b) determining the proliferative capacity of the subject's T cells in view of the viral load measured in a).
  • a high TTV load indicates that the T cells have a low proliferative capacity. Conversely, a low TTV load indicates that the T cells have a high proliferative capacity.
  • stem cell we mean here undifferentiated but specialized cells having two main properties: the ability to self-renew and maintain themselves in place for very long periods, and the ability to generate all types of differentiated cells of a specific tissue, which defines their multipotency.
  • the “hematopoietic stem cells” or “HSCs” designate here more particularly the stem cells which can lead to the various blood cells (in particular red blood cells, platelets, granulocytes, T or B lymphocytes, and monocytes). HSCs can advantageously be obtained from umbilical cord blood. Alternatively, they can be obtained from peripheral blood. It is also possible to obtain them from bone marrow.
  • Hematopoietic stem cells transplant or "GCSH” or “HSCT” (for “hematopoietic stem cells transplant”) as understood herein is a therapeutic procedure in the field of hematology in which HSCs, generally derived from bone marrow, peripheral blood or umbilical cord blood, are transplanted from a donor to a recipient.
  • HSCT is a potentially curative approach for a variety of pathologies. These are in particular haemopathies, in particular malignant haemopathies, such as acute leukaemias, myelodysplasias and lymphomas, and non-malignant haemopathies with a severe prognosis, including constitutional aplastic anemia and haemoglobinopathies, solid tumours, deficiencies immune system and enzymatic deficiencies of hematopoietic tissue, such as Gaucher disease, for example.
  • the pathology is a hemopathy, more preferably, a malignant hemopathy.
  • HSCT can be autologous (the patient's own stem cells are used, i.e. the donor and the recipient are one and the same person) or allogeneic (hereafter “allo-HSCT”: stem cells come from a donor who is not the recipient).
  • the HSCT in the method described here is an allogeneic transplant.
  • the description relates to a method for determining the proliferative capacity of T cells in a subject, the subject having undergone allo-HSCT, the method comprising steps of: a) measuring the TTV load from a sample of the subject; and b) determining the proliferative capacity of the subject's T cells in view of the viral load measured in a).
  • a high TTV load indicates that the T cells have a low proliferative capacity. Conversely, a low TTV load indicates that the T cells have a high proliferative capacity.
  • preparation treatments are administered before the transplant to destroy or reduce the activity of the immune system of the recipient.
  • conditionings aim to prevent graft rejection and reduce tumor burden.
  • Myeloablative conditioning as used herein is conditioning that destroys the bone marrow cells of the recipient.
  • the myeloabalative conditioning also destroys the immune system of the recipient, thus facilitating graft take.
  • the myeloabalative conditioning may in particular comprise one or more stages of chemotherapy and/or radiotherapy.
  • two of the commonly used conditionings are busulfan-cyclophosphamide and cyclophosphamide-total body irradiation (TBI).
  • TBI busulfan-cyclophosphamide and cyclophosphamide-total body irradiation
  • the myeloabalative conditioning is applied to a patient under the age of 55, preferably under the age of 50.
  • the conditioning is non-myeloablative, attenuated, or otherwise referred to as “reduced-intensity” conditioning.
  • “Attenuated conditioning” is conditioning that does not totally destroy the bone marrow of the recipient, but leads to an inhibition of the immune system of the latter, thus facilitating the taking of the graft.
  • Such attenuated conditioning preferably includes administration of an immunosuppressant.
  • an attenuated conditioning protocol may include the combination of fludarabine, cyclophosphamide or another alkylating agent, and an ICT.
  • Another example of an attenuated conditioning protocol may include the combination of fludarabine, anti-lymphocyte serum (ALS), and busulfan.
  • an attenuated conditioning protocol may include the combination of fludarabine, idarubicin, and aracytin.
  • another example of an attenuated conditioning protocol may include the combination of fludarabine with mini full irradiation.
  • the attenuated conditioning is applied to a patient under the age of 75.
  • the term "donor”, as used herein, refers to the subject whose HSCs are transferred to the recipient.
  • the term “recipient” or “patient” means the subject who receives the CSH from the donor.
  • the recipient is affected by a pathology to which the HSCT must provide a therapeutic benefit, whether complete or partial.
  • the term "subject” refers to a vertebrate, preferably a mammal, and most preferably a human.
  • a human can for example be a patient.
  • the subject is a patient.
  • patient refers to a human being who has come into contact with a health professional, such as a doctor, a medical structure or a health establishment such as a hospital for example.
  • a health professional such as a doctor, a medical structure or a health establishment such as a hospital for example.
  • biological sample is understood here to mean any sample which can be taken from a subject. In general, the biological sample must allow the determination of the TTV load.
  • the biological sample includes, but is not limited to, whole blood, serum, plasma, sputum, nasopharyngeal swabs, urine, stool , skin, cerebrospinal fluid, saliva, gastric secretions, semen, seminal fluid, tears, tissue or spinal fluid, cerebral fluid, sample of trigeminal ganglion, sample of sacral ganglion, tissue adipose tissue lymphoid tissue, placental tissue, upper reproductive tract tissue, gastrointestinal tract tissue, genital tissue, and central nervous system tissue.
  • the sample to be tested can be used directly from the biological source or following a pre-treatment to modify the character of the sample.
  • pretreatment may include the preparation of plasma from blood, the dilution of viscous fluids, and so on.
  • Pretreatment processes may also involve filtration, precipitation, dilution, distillation, mixing, concentration, inactivation of interfering components, addition of reagents, lysis, etc.
  • it may be beneficial to modify a solid test sample to form a liquid medium or to release the analyte.
  • the biological sample is blood or a derivative thereof, such as plasma or serum.
  • the biological sample is preferably blood, plasma or serum from the subject being tested.
  • TTV Torque Teno virus
  • TTV genome reference is here made to the genomes of all the Anelloviridae, including the alphatorqueviruses (TTV), the betatorqueviruses (TTMV), the gammatorqueviruses (TTMDV).
  • TTV-1 a the genome of the prototype strain of the Torque Teno virus, TTV-1 a. More specifically, an example of a TTV genome is a sequence such as for example that which is represented by SEQ ID No 1 and whose Genbank accession number is AB017610.
  • the TTV genome has a size of about 3.8 kb.
  • the structure and the genomic organization of the TTVs is well known (cf. for example refer to Biagini, Curr Top Microbiol lmmunol.33 ⁇ : 21 -33, 2009) and is exemplified in [Fig 1].
  • the TTV genome can thus be divided into an untranslated region (UTR) of approximately 1 to 1.2 kb and a potential coding region of approximately 2.6 to 2.8 kb.
  • the coding region contains in particular two large open reading frames: ORF1 and ORF2, coding two proteins of 770 and 202 residues respectively.
  • the open reading frames ORF1 and ORF2 are between nucleotides 589-2901 and 107-715, respectively.
  • the TTV genome may have other open reading frames.
  • the TTV genome may include two additional reading frames, ORF3 and ORF4 [Fig 1].
  • the UTR untranslated region is well conserved. It comprises in particular a GC-rich sequence capable of forming a secondary structure. The amplification of selected sequences in the UTR-5' untranslated region has demonstrated that the prevalence of the virus is very high throughout the entire world population (Hu et al., J Clin Microbiol. 43(8) : 3747-3754, 2005). This region comprises in particular a sequence of 128 bp which can be amplified by the TTV R-GENE® diagnostic kit (bioMérieux, France).
  • “Viral load” as understood here is the number of viral particles present in a biological sample. Viral load reflects the severity of a viral infection.
  • the viral load can be determined by measuring the amount of one of the components of the virus (genomic DNA, mRNA, protein, etc.) in this biological sample.
  • the viral load thus refers to the proportion of nucleic acid sequences belonging to said virus in a biological sample. More preferentially, the viral load represents the number of copies of the genome of said virus in a biological sample.
  • the viral load represents the TTV load.
  • the “TTV load” corresponds here more particularly to the TTV viral load, that is to say the number of TTV viral particles present in a biological sample.
  • TTV load in a subject means the viral load of any TTV harbored by said subject.
  • TTV load can be determined by measuring the amount of a TTV component, such as a nucleic acid or protein, in that biological sample.
  • the TTV load corresponds to the quantity of TTV nucleic acid sequences present in a biological sample.
  • the determination of the TTV load in a subject according to the invention comprises the estimation of the number of sequences of all the TTVs in a biological sample of said subject.
  • the determination of the TTV load comprises the determination of the quantity of active and/or inactive viral copies. It consists of determining the quantity of circulating, integrated or latent viral copies.
  • TTV levels - and therefore TTV load - can be determined by measuring levels of TTV DNA, TTV RNA, or TTV protein.
  • the method according to the invention can thus comprise another preliminary step, between the taking of the sample from the patient and step a) as defined above, corresponding to the transformation of the biological sample into a double-stranded DNA sample, or into an mRNA (or corresponding cDNA) sample, or into a protein sample, which is then ready to be used for the in vitro detection of TTV in step a).
  • the preparation or extraction of viral double-stranded DNA, mRNA (as well as the reverse transcription of this into cDNA) or proteins from a cell sample are only well-known routine procedures of the person in the trade.
  • the double-stranded DNA can correspond either to the entire TTV genome, or only to a part of it.
  • detection of TTVs can be performed, depending on the type of sample or transformation, either by genomic DNA (i.e. based on the presence of at least one sequence consisting of at least part of the TTV genome), or by mRNA (i.e. based on the TTV mRNA content in the sample), or at the protein level (i.e. based on the TTV protein content in the sample).
  • TTV levels are determined by measuring levels of TTV nucleic acid, more preferably TTV DNA.
  • Methods of detecting a nucleic acid in a biological sample include, but are not limited to, amplification, including PCR amplification, sequencing, hybridization with a labeled probe, and any other methods known to the person responsible for job.
  • the TTV load is determined by amplifying the TTV sequences.
  • a preferred approach is to amplify sequences which are known to be specific to the TTV genome.
  • specific sequence of the TTV genome is meant here a sequence which is present in the majority of the known TTVs, but which is absent from the majority of the other viruses, in particular from the majority of the other anelloviruses.
  • a TTV specific sequence is present in at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99% of known TTV genomes. More preferably, it is present in 100% of known TTV genomes.
  • a TTV-specific sequence is present in less than 10%, less than 5%, less than 4%, less than 3%, less than 2%, less than 1% of known non-TTV anellovirus genomes.
  • a TTV-specific sequence is absent from all known anellovirus genomes other than TTVs.
  • Such a sequence is for example a sequence comprised in the untranslated region UTR. More particularly, such a sequence corresponds to the 128 bp sequence of the 5′-UTR untranslated region which is amplified using the TTV R-GENE® diagnostic kit (bioMérieux, France).
  • the method described here comprises the use of primers and probes for the amplification of sequences known to be specific for the TTV genome.
  • these primers are preferably oligonucleotides.
  • these primers can comprise less than 30 nucleotides, at least 25 nucleotides, less than 20 nucleotides, less than 15 nucleotides or less than 12 nucleotides.
  • these primers comprise at least 12, 15, 20.25 or 30 nucleotides.
  • the primers used comprise between 12 and 20 nucleotides, between 12 and 25 nucleotides, between 15 and 20 nucleotides or even between 15 and 25 nucleotides.
  • One skilled in the art will be able to determine the length and sequence of amplification primer to use once the TTV specific sequence has been chosen. It could, for example, use the same primers as those supplied in the TTV R-GENE® diagnostic kit (bioMérieux, France).
  • the amplification techniques include in particular isothermal methods and techniques based on PCR (Polymerase Chain Reaction).
  • Isothermal amplification methods include a large number of methods. The most used to detect pathogens are the LAMP (Loop-Mediated Amplification) and RPA (Recombinase Polymerase Amplification) methods.
  • Isothermal amplification methods also include methods such as for example the NASBA method (nucleic acid sequence-based amplification), HDA (helicasedependent amplification), RCA (rolling circle amplification) and SDA (strand displacement amplification), EXPAR (exponential amplification reaction), ICANs (isothermal and chimeric primer-initiated amplification of nucleic acids), SMART (signal-mediated amplification of RNA technology), etc.
  • the PCR technique used quantitatively measures the initial amounts of DNA, cDNA or RNA.
  • PCR-based techniques that may be used in the methods described herein include, without limitation, techniques such as real-time PCR (Q-PCR), reverse PCR (RT-PCR), multiplex reverse PCR , real-time reverse PCR (QRT-PCR) and digital PCR (or digital PCR). These techniques are technologies well known and readily available to the person skilled in the art. It is not necessary to detail them here.
  • the determination of the TTV load is carried out by real-time quantitative PCR.
  • Numerous methods for the detection and quantification of TTVs have been described in the art (see for example Maggi et al., J Virol. 77(4): 2418-2425, 2003). Reference will be made in particular to the method described by Kulifaj et al. (J Clin Virol. 105:118-127, 2018).
  • This method is particularly advantageous due to its simplicity and robustness. It is based on the amplification of a sequence included in the non-coding region UTR. This sequence is present in all known TTVs, thus conferring a very high specificity to the method. In addition, it is particularly versatile and can be implemented with any type of PCR platform. It is particularly advantageous to use the TTV R-GENE® diagnostic kit (bioMérieux, France) to implement this method.
  • viral load determination is performed by digital PCR.
  • Digital PCR involves multiple PCR runs on extremely dilute nucleic acids such that most positive amplifications reflect the signal from a single template molecule. Digital PCR thus allows the counting of individual model molecules. The proportion of positive amplifications among the total number of PCRs analyzed allows an estimate of the template concentration in the original or undiluted sample. This technique has been proposed to allow the detection of a variety of genetic phenomena (Vogelstein et al., Proc Natl Acad Sci USA 96: 9236-924, 1999). Digital PCR, like real-time PCR, potentially allows the discrimination of fine quantitative differences in target sequences between samples.
  • TTV DNA levels are measured by sequencing.
  • sequencing is taken in its broadest sense and refers to any technique known to those skilled in the art for determining the sequence of a polynucleotide molecule (DNA or RNA), i.e. that is to say, to determine the succession of nucleotides composing this molecule.
  • TTV DNA can thus be sequenced by any technique known in the art. Sequencing as understood herein includes but is not limited to Sanger sequencing, whole genome sequencing, hybridization sequencing, pyrosequencing (including 454 sequencing, Solexa Genome sequencing Analyzer), sequencing with capillary electrophoresis, cycle sequencing, single base extension sequencing, solid phase sequencing, high throughput sequencing, massively parallel signature sequencing (MPSS), terminator sequencing of reversible dye, pairwise sequencing, short term sequencing, sequencing with exonucleases, ligation sequencing, single molecule sequencing, sequencing by synthesis, sequencing by electron microscopy real-time sequencing, sequencing with reverse termination, nanopore sequencing, reversible terminator sequencing, semiconductor sequencing, SOLiD(R) sequencing, Single Molecule Real-Time Analysis (SMRT) sequencing, MS-PET sequencing, mass spectrometry, and their combinations.
  • SOLiD(R) sequencing Single Molecule Real-Time Analysis (SMRT) sequencing
  • MS-PET sequencing mass spectrometry
  • a particular embodiment uses high-throughput DNA sequencing, using for example the MiSeq, NextSeq 500 platforms, and the HiSeq series developed by Illumina (Reuter et al., Mol Cell, 58: 586-597, 2015 Bentley et al. Nature; 456: 53-59, 2008), the Genome Sequencer platform from 454 and Roche (Margulies et al. Nature; 437: 376-380, 2005), the SOLID platform from Applied Biosystems (McKernan et al., Genome Res; 19: 1527-1541, 2009), the Polanator platform (Shendure et al., Science, 309: 1728-1732) or the Hélicos single molecule sequencing platform (Harris et al.
  • High-throughput sequencing also includes methods such as SMRT real-time sequencing (Roads et al., Genomics, Proteomics & Bioinformatics, 13(5): 278-289, 2015), Ion Torrent sequencing (WO 2010/008480; Rothberg et al., Nature, 475: 348-352, 2011) and sequencing using nanopores (Clarke J et al. Nat Nanotechnol: 4: 265-270, 2009).
  • Sequencing is performed on all of the DNA contained in the biological sample or on parts of the DNA contained in the biological sample. It will be immediately clear to the person skilled in the art that said sample contains at least a mixture of TTV DNA and host subject DNA. Additionally, TTV DNA will likely represent only a minor fraction of the total DNA present in the sample.
  • the DNA is randomly fragmented, generally by physical methods, prior to sequencing.
  • a first approach consists in sequencing specific sequences of the genome of a species of TTV.
  • Another approach is to use a method that allows quantitative genotyping of nucleic acids obtained from the biological sample with high precision.
  • the precision is achieved by analyzing large numbers (e.g., millions or billions) of nucleic acid molecules without any amplification using protocols that rely on prior knowledge of the target sequences (i.e. i.e. in this case, the sequences of the TTVs).
  • the method of the invention comprises a step of quantifying the number of readings.
  • a random subset of nucleic acid molecules from the biological sample is subjected to high-throughput sequencing.
  • the TTV sequences are identified in the global sequencing data by comparison with publicly deposited TTV sequences. This comparison is advantageously based on the level of sequence identity with a known TTV sequence and makes it possible to detect even remote variants. Common software such as BLAST can be used to determine the level of identity between sequences.
  • the determination of the TTV load therefore comprises the numbering of the TTV sequences identified by sequencing in the biological sample of the subject.
  • the TTV load is determined by measuring the amount of a viral protein in the biological sample. It is thus possible to use specific antibodies, in particular in well-known technologies such as immunoprecipitation, immunohistology, western blot, dot blot, ELISA or ELISPOT, electrochemiluminescence (ECLIA) , protein arrays, antibody arrays, or tissue arrays coupled with immunohistochemistry.
  • specific antibodies in particular in well-known technologies such as immunoprecipitation, immunohistology, western blot, dot blot, ELISA or ELISPOT, electrochemiluminescence (ECLIA) , protein arrays, antibody arrays, or tissue arrays coupled with immunohistochemistry.
  • FRET or BRET techniques microscopy or histochemistry methods, including in particular confocal microscopy and electron microscopy methods, methods based on the use of one or several excitation wavelengths and a suitable optical method, such as an electrochemical method (the techniques of voltammetry and amperometry), the atomic force microscope, and radiofrequency methods, such as multipolar, confocal resonance spectroscopy and no- confocal, fluorescence detection, luminescence, chemiluminescence, absorbance, reflectance, transmittance, and birefringence or index of refraction (for example, by surface plasmon resonance, by ellipsometry, by resonant mirror method , etc.), flow cytometry, radioisotope or magnetic resonance imaging, analysis by polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE); by mass spectrometry and by liquid chromatography coupled to mass spectrometry (LC-MS/MS). All these techniques are well known to those skilled
  • the method described here includes an additional step of normalizing the amount of nucleic acid or viral protein measured.
  • TTV i.e. the amount of TTV DNA, TTV RNA or TTV proteins present in the biological sample
  • a specific parameter of this sample Normalizing the measured TTV load to a specific parameter reduces the error rate when comparing viral loads from two different biological samples.
  • An example of a parameter that can be useful for this normalization can be a physical parameter, independent of the content of the sample, such as its volume, for example.
  • a particular DNA or RNA sequence or a particular protein as a standardization tool.
  • this sequence or this protein can be a human sequence or protein.
  • the amount of TTV DNA or RNA or TTV protein in a given sample is compared to an internal control.
  • the quantity of nucleic acid or of TTV protein measured in the biological sample can be related to a defined quantity of a nucleic acid or of an appropriate protein which can be identified and quantified, such as an acid nucleic acid or a host or exogenous protein.
  • this identifiable and quantifiable nucleic acid or protein is processed (eg, amplified, sequenced, etc.) as the target nucleic acid or protein.
  • the preparation steps can include means for protecting the viral nucleic acid and destroying the host nucleic acids, for example by using different nucleases. Alternatively, these steps may include means to protect viral proteins and destroy host proteins, for example by using different proteases.
  • the internal control makes it possible to evaluate the quality and the extent of the processing (for example an amplification or a sequencing) of the molecules considered (nucleic acids or proteins) in the sample.
  • said internal control is a nucleic acid molecule of known sequence, this nucleic acid molecule being present in the sample at a known concentration. More preferably, this nucleic acid molecule is the genomic single-stranded circular DNA molecule of a virus of known sequence and concentration in the sample. Such a known virus may for example be a virus from the Circoviridae family. The ratio of the number of sequences of the sample to the control makes it possible to estimate the absolute number of TTV genomes of known sequence and concentration. Alternatively, this internal control is a protein of known sequence, which is present in the sample at a known concentration.
  • TTV load has been determined by measuring the quantity of nucleic acid or TTV protein determined, this being optionally normalized, it may be advantageous to compare it to a reference TTV load.
  • a reference TTV load or “a reference viral load” is meant within the meaning of the present application any TTV load used as a reference.
  • the reference TTV load corresponds to "a reference level of nucleic acid (or protein) of TTV” or "a control level of nucleic acid (or protein) of TTV", i.e. ie at a concentration of a TTV nucleic acid (or protein) used as a reference.
  • a TTV nucleic acid (or protein) reference concentration is a baseline level measured in a control sample comparable to that tested, and which is obtained from a subject or group of subjects with a specific immunocompetent status.
  • It can be for example a subject or a group of healthy subjects or those without disease leading to immunosuppression. It can also be a subject or a group of immunocompromised subjects, for example following an immunosuppressive treatment. Finally, it may be the same individual who underwent the transplant, for example before or just after it.
  • the reference level can be determined by a plurality of methods.
  • the control can be a predetermined value, which can take various forms. It can be a single threshold value, such as a median or mean.
  • the “reference level” can be a single value, also applicable to each patient individually. Alternatively, the baseline may vary based on specific patient subpopulations. So, for example, older men might have a different baseline than younger men for TTV load, and women might have a different baseline than men for this viral load.
  • the "reference level” can be established on the basis of comparative groups, such as groups not having a high level of TTV nucleic acid (or protein) and groups having levels of nucleic acid (or protein) of elevated TTVs.
  • comparison groups would be groups with a particular disease, condition, or symptoms and groups without disease.
  • the predetermined value may be set, for example, when a test population is divided equally (or unequally) into groups, such as a low-risk group, a medium-risk group, and a high-risk group.
  • the baseline level can also be determined by comparing the nucleic acid (or protein) level of TTV in populations of transplant patients or patients with diseases leading to immunosuppression. This can be accomplished, for example, by histogram analysis, in which an entire cohort of subjects is presented graphically, with a first axis representing the level of said TTV nucleic acid (or protein), and a second axis representing the number of patients in the group of patients expressing TTV nucleic acid (or protein) at a given level. Two or more distinct groups of subjects can be determined by identifying subpopulations of the cohort that have the same or similar TTV nucleic acid (or protein) levels. The determination of the reference level can then be made on the basis of a level that best distinguishes these distinct groups. A reference level can also represent the levels of two or more of the present nucleic acids (or proteins) of TTV. Two or more markers can be represented, for example, by a ratio of values for the levels of each marker.
  • an apparently healthy population will have a different 'normal' range than a population known to exhibit a condition associated with a high concentration of said TTV nucleic acid (or protein).
  • the selected predetermined value may take into account the category into which an individual falls. Appropriate ranges and categories can be selected with just routine experimentation by the skilled person. By “high”, “increased”, we mean high relative to a selected control. Generally, control will be based on normal, apparently healthy individuals in an appropriate age range.
  • the reference concentration corresponds to the concentration of TTV nucleic acid (or protein) or combination of TTV nucleic acids (or proteins) in the general population.
  • the controls in the method described here can be, in addition to predetermined values, biological samples measured in parallel with the samples tested.
  • the reference level will be that of the TTV nucleic acid(s) (or proteins) in a sample from a healthy subject.
  • the reference concentration of TTV nucleic acid (or protein) will be the concentration of this TTV nucleic acid (or this protein) in a healthy subject or in a population of healthy subjects.
  • the reference concentration of the nucleic acid (or protein) of TTV will be the concentration of this nucleic acid (or this protein) of TTV in an immunocompromised subject or in a population of immunocompromised subjects (for example, following immunosuppressive therapy).
  • the reference concentration of the TTV nucleic acid (or protein) will be the concentration of this TTV nucleic acid (or this protein) in the same individual having undergone the transplant at a specific time. , for example before or just after this one.
  • the T cells are CD3+ T lymphocytes, T lymphocytes CD4+, CD8+ T lymphocytes or a population of CD3+ and/or CD4+ and/or CD8+ T lymphocytes, preferably CD3+ T lymphocytes.
  • the methods described here make it possible to quickly and easily assess the proliferative capacity of T cells in a subject.
  • Another aspect of the present disclosure therefore relates to a method for monitoring the activity of T lymphocytes in a patient who has received an HSCT, in particular an allo-HSCT.
  • This method comprises steps of: a) measuring the proliferative capacity of the T lymphocytes according to the methods described above at a first instant; b) comparison of the proliferative capacity of the T lymphocytes measured in a) with a proliferative capacity of the reference T lymphocytes; and c) determining the change in the activity of the patient's T lymphocytes in view of the comparison of step b).
  • a “reference T cell proliferation capacity” as understood herein is a T cell proliferation capacity estimated from a reference TTV load as described above. It is understood that the comparison of step b) can be done simply by comparing the load in TTV in the patient sample determined in step a) with a reference TTV load.
  • the proliferative capacity of the lymphocytes in the patient at this first instant with the proliferative capacity of the reference T lymphocytes of an immunocompromised individual, it is possible to estimate, at this first instant, the reconstitution of the patient's immunocompetence after HSCT, especially allo-HSCT.
  • immunocompetence is meant here the acquisition of functionality by immune cells.
  • an increased capacity for T cell proliferation in the patient compared to that of an immunocompromised individual indicates that the reconstitution of the patient's immunocompetence is in progress.
  • such an increased capacity for proliferation of T lymphocytes in the patient compared to the immunocompromised subject corresponds to a lower TTV load.
  • the baseline T cell proliferative capacity may be that of a healthy individual.
  • a diminished T cell proliferative capacity in the patient compared to the baseline T cell proliferative capacity indicates that immunocompetence has not been fully restored in the patient. It will immediately be understood that a decrease in the proliferative capacity of T lymphocytes in the patient compared to the healthy subject corresponds to an increase in the load of TTV.
  • increased means a greater amount, e.g., an amount slightly greater than the original amount, or e.g., an amount in great excess of the original quantity, including all quantities in between.
  • “increase” may refer to an amount or activity that is at least 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11 %, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% or 100% more than the quantity or activity for which the increased quantity or activity is being compared.
  • the terms “increased”, “greater than”, “greater” and “increased” are used interchangeably herein.
  • diminished means a lesser amount, e.g., an amount slightly less than the original amount, or e.g., a greatly deficient amount relative to the original quantity, including all quantities in between.
  • decrease may refer to an amount or activity that is at least 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11 %, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% or 100% less than the quantity or activity for which the reduced quantity or activity is being compared.
  • the terms “diminished”, “less than”, “less significant” and “reduced” are used interchangeably herein.
  • T cell proliferation capacity in the same patient at a second time.
  • the evolution of the activity of these T lymphocytes in this patient after the transplant can thus be followed simply, without implementing a heavy and complicated experimental device, by a simple measurement of the TTV load in the patient at the first and at the second moment.
  • the present method for monitoring the activity of the T lymphocytes in a patient who has received a HSCT comprises steps of: a) measuring the proliferation capacity of the T lymphocytes according to the methods described above at a first moment; b) measurement of the proliferative capacity of the T lymphocytes according to the methods described above at a second instant, this second instant being later than the first instant of step a); c) comparison of the proliferative capacities of the T lymphocytes measured in a) and b); and d) determining the change in the activity of the patient's T lymphocytes in view of the comparison of step c).
  • the method for monitoring the activity of the T lymphocytes in a subject having received a transplant therefore comprises the steps of: a) determining the viral load in TTV from a biological sample of the subject taken at a first instant; b) determination of the TTV viral load from a biological sample of the subject taken at a second instant, this second instant being later than the first instant of step a); c) comparison of viral loads in TTV measured in a) and b); and d) determination of the change in TTV load of the subject in view of the comparison of step c).
  • the viral load in TTV being inversely correlated to the proliferative capacity of T lymphocytes
  • the variation of the load in TTV makes it possible to determine whether the proliferative capacity of T lymphocytes is increased or decreased, thus providing an indication of the activity T lymphocytes and in particular on the reconstitution or not of the subject's immunocompetence.
  • the first instant of step a) is at the time of the graft.
  • the proliferative capacity of the T cells is measured in step b) using a sample taken at least 30 days, 60 days, 90 days, 100 days, 120 days, 150 days, 180 days , 210 days, 240 days, 270 days, 300 days, 330 days, 360 days, 720 days or 1080 days after the GCSH.
  • this sample is taken at 30 days, 60 days, 90 days, 100 days, 120 days, 150 days, 180 days, 210 days, 240 days, 270 days, 300 days, 330 days, 360 days, 720 days or 1080 days after HSCT.
  • T cells have an increased capacity for proliferation at the second instant compared to the first, their activity is itself increased at this instant.
  • an increased proliferative capacity of the T lymphocytes at this second moment means that there are more active T lymphocytes and that the patient is then better able to defend himself, in particular against threats.
  • Such a change in the proliferative capacity of T lymphocytes will result in a change in the opposite direction of the TTV load: a decrease in the latter over time thus reflects an increase in the proliferative capacity of T lymphocytes, i.e. that is, a reconstitution of the patient's immunocompetence.
  • the present method therefore makes it possible to estimate the reconstitution of the immune system of the recipient.
  • the evolution of the proliferative capacity of T cells makes it possible to assess the reappearance of immunocompetence in the patient after the transplant.
  • the method for monitoring the activity of the T lymphocytes described above is implemented in a patient who has undergone conditioning before receiving a HSCT, in particular an allo-HSCT.
  • the conditioning is myeloablative.
  • the conditioning is attenuated.
  • HSCT especially allo-HSCT
  • a patient who has received an HSCT in particular an allo-HSCT, remains susceptible to microbial infections, whether bacterial, viral, parasitic or fungal, as long as his immune system has not been reconstituted.
  • the present description relates to a method for determining the susceptibility to microbial infections in a patient who has received a HSCT, in particular an allo-HSCT.
  • This method comprises steps of: a) measuring the proliferative capacity of the T lymphocytes from a sample of the patient according to the methods described above at a first instant; b) comparison of the proliferative capacity of the T lymphocytes with a proliferative capacity of the reference T lymphocytes; and c) determining the patient's susceptibility to microbial infections from the comparison in step b).
  • the method for monitoring the activity of the T lymphocytes described above is implemented in a patient who has undergone conditioning before receiving a HSCT, in particular an allo-HSCT.
  • the conditioning is myeloablative.
  • the conditioning is attenuated.
  • the methods described herein may further comprise one or more specific diagnostic steps for the presence of one or more of the infectious agents, such as, for example, the bacteria, viruses, parasites or yeasts and filamentous fungi mentioned in more detail below. The detection of these agents is practiced routinely in the clinic, in particular in relation to HSCTs, and the corresponding techniques are well known to those skilled in the art. It is therefore not necessary to detail them here.
  • Viral infections are in particular viral, bacterial, parasitic or fungal infections.
  • Viral infections are in particular infections by viruses of the Herpesviridae family, such as, for example, the HSV, VZV, HHV-6 viruses, the Epstein-Bar virus (EBV) or the human cytomegalovirus (CMVH).
  • viruses of the Herpesviridae family such as, for example, the HSV, VZV, HHV-6 viruses, the Epstein-Bar virus (EBV) or the human cytomegalovirus (CMVH).
  • EBV Epstein-Bar virus
  • CMVH human cytomegalovirus
  • These viral infections can also be caused by adenoviruses, respiratory syncytial virus (RSV), influenza virus (also called influenza virus or Myxovirus influenzae) or BK virus.
  • RSV respiratory syncytial virus
  • influenza virus also called influenza virus or Myxovirus influenzae
  • the bacteria responsible for bacterial infections can be, among others, staphylococci such as Staphylococcus aureus or coagulase-negative staphylococci, encapsulated bacteria such as Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis or Haemophilus influenzae, Legionella sp. or even strict aerobic non-fermentative Gram-negative bacilli such as the genera Pseudomonas, Acinetobacter, Stenotrophomonas, Burkholderia, Alcaligenes... Atypical mycobacterial infections can also be observed.
  • staphylococci such as Staphylococcus aureus or coagulase-negative staphylococci
  • encapsulated bacteria such as Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis or Haemophilus influenzae, Legionella sp.
  • strict aerobic non-fermentative Gram-negative bacilli such as the genera Pseudomonas, A
  • Parasitic infections with high morbidity and mortality can occur, as can toxoplasmosis (caused by Toxoplasma gondii).
  • yeasts such as Candida or Cryptococcus, but also filamentous fungi such as Aspergillus are responsible for invasive fungal infections which are among the major causes of infectious mortality after HSCT.
  • the reference T lymphocyte proliferation capacity corresponds to the proliferation capacity of the T lymphocytes estimated from a reference TTV load as described above.
  • the comparison of step b) can be done simply by comparing the TTV load in the sample from the patient determined in step a) with a reference TTV load.
  • This reference TTV load can for example be that of a healthy, non-immunocompromised individual.
  • the proliferation capacity of the reference T lymphocytes is then that of this healthy, non-immunocompromised individual.
  • the description relates to a method for determining the susceptibility to microbial infections in a patient who has received a HSCT, in particular an allo-HSCT.
  • This method comprises steps of: a) measuring the proliferative capacity of the T lymphocytes from a sample of the patient according to the methods described above at a first instant; b) comparison of the proliferative capacity of T lymphocytes with that of a healthy subject; and c) determining the patient's susceptibility to microbial infections from the comparison in step b).
  • the method for monitoring the activity of the T lymphocytes described above is implemented in a patient who has undergone conditioning before receiving a HSCT, in particular an allo-HSCT.
  • the conditioning is myeloablative.
  • the conditioning is attenuated.
  • a reduced capacity for T cell proliferation in the patient compared to the healthy subject indicates that the patient's immune system is not fully functional.
  • a patient's T lymphocyte proliferation capacity lower than that of a healthy subject corresponds to a viral load measured in the patient's sample greater than the TTV load in the healthy subject.
  • the subject then presents a deficiency of its immune system, which leaves it within the reach of the attack of pathogens.
  • the patient is at risk of being infected with microbial organisms.
  • the patient is less susceptible to microbial infections when his T lymphocytes have substantially the same capacity for proliferation as those of a healthy subject.
  • the method for determining the susceptibility to microbial infections in a patient who has received a HSCT comprises steps of: a) measuring the proliferation capacity of the T lymphocytes according to the methods described higher at first; b) measurement of the proliferative capacity of the T lymphocytes according to the methods described above at a second instant, this second instant being later than the first instant of step a); c) comparison of the proliferative capacities of the T lymphocytes measured in a) and b); and d) determining the patient's susceptibility to microbial infections based on the comparison in step c).
  • the method for monitoring the activity of the T lymphocytes described above is implemented in a patient who has undergone conditioning before receiving a HSCT, in particular an allo-HSCT.
  • the conditioning is myeloablative.
  • the conditioning is attenuated.
  • step b) An increased capacity for proliferation of the T lymphocytes in step b) compared with step a) reflects an increase in their activity and therefore a decrease in the patient's susceptibility to microbial infections between the two instants.
  • the present method makes it possible in particular to verify that the more time passes after the transplant, the less the patient becomes susceptible to microbial infections, that is to say that his immune system becomes increasingly functional.
  • the patient's susceptibility to microbial infections can therefore be determined using the methods described here, allowing specific treatment to be tailored to the patient's needs.
  • the preliminary determination of the immunocompromised state of the patient with the method of the invention thus leads to a safer treatment than the treatments designed on the basis of the methods of the prior art.
  • the proliferative capacity of the T lymphocytes corresponds to the proliferative capacity of the CD3+ T lymphocytes, of the CD4+ T lymphocytes, of the CD8+ T lymphocytes or of a population of CD3+ T and/or CD4+ T and/or CD8+ T lymphocytes, preferably to the proliferative capacity of CD3+ T lymphocytes.
  • the present invention also relates to a method for designing a treatment for microbial infections in a patient who has undergone CSH, in particular allo-GCSH, said method comprising: a) determining the patient's susceptibility to microbial infections according to the methods described above ; b) decide on a treatment based on the result of step a).
  • the method for monitoring the activity of the T lymphocytes described above is implemented in a patient who has undergone conditioning before receiving a HSCT, in particular an allo-HSCT.
  • the conditioning is myeloablative.
  • the conditioning is attenuated.
  • the treatment can be decided on a preventive basis, that is to say that it can be ordered in view of the patient's immunodeficiency state to prevent an infection from breaking out.
  • it may be decided to prescribe the curative or prophylactic treatments commonly used after an HSCT, in particular an allo-HSCT, which are described below.
  • the present methods thus make it possible to be able to decide and to administer a preventive or curative treatment of a viral, bacterial, parasitic or fungal infection if a risk of such an infection is identified.
  • the present description therefore also relates to a method for treating an infection in a patient who has received a GCSH, in particular an allo-GCSH, said method comprising steps of: a) determining the susceptibility of the patient to microbial infections according to the methods described above; and b) administering appropriate treatment to said subject.
  • the present invention thus proposes a treatment intended for use in the treatment of an infection in a subject having received a HSCT, in particular an allo-HSCT, the use comprising the steps of: a) determining the susceptibility of the patient to microbial infections according to the methods described above; and (b) administering appropriate treatment to said subject.
  • the invention relates to the use of a treatment in the preparation of a medicament for treating an infection in a subject having received a HSCT, in particular an allo-HSCT, said use comprising the steps of: a) determination of the patient's susceptibility to microbial infections according to the methods described above; and (b) administering appropriate treatment to said subject.
  • the method for monitoring the activity of the T lymphocytes described above is implemented in a patient who has undergone conditioning before receiving a HSCT, in particular an allo-HSCT.
  • the conditioning is myeloablative.
  • the conditioning is attenuated.
  • the infections encountered after an HSCT are viral, bacterial, parasitic or fungal infections.
  • the treatments for these infections are well known and have been used clinically for many years (see for example Tomblyn et al., Biol Blood Marrow Transplant. 15(10): 1143-1238, 2009).
  • viral infections can be prevented by antiviral compounds such as aciclovir, ganciclovir, cidofovir, entecavir, fludarabine, lamivudine, tenofovir, ribavarin or valaciclovir, or specific monoclonal antibodies such as palivizumab (against RSV).
  • Antibiotics usually treat bacterial infections.
  • broad-spectrum antibiotics are used, such as beta-lactam antibiotics, glycopeptides, fosfomycin, macrolides, tetracyclines, aminoglycosides, chloramphenicol, quinolones, rifampicin and sulfonamides.
  • parasitic infections they are usually treated by administration of antiparasitic compounds such as cotrimoxazole, pyrimethamine and sulfadiazine.
  • antifungal compounds which can be administered are well known and notably include fluconazole and echinocandins.
  • the methods described here also have the advantage of being able to estimate the risk of GvHD appearing in a patient who has undergone CCSH, in particular allo-GCSHD.
  • the present description therefore also relates to a method for determining the susceptibility to GvHD in a patient who has received a HSCT, in particular an allo-HSCT, this method comprising steps of: a) measuring the proliferative capacity of the T lymphocytes from a sample from the patient at a first instant according to the methods described above; and b) determination of the susceptibility to GvHD in the patient from the measurement of step a).
  • the method for monitoring the activity of the T lymphocytes described above is implemented in a patient who has undergone conditioning before receiving a HSCT, in particular an allo-HSCT.
  • the conditioning is myeloablative.
  • the conditioning is attenuated.
  • GvHD raft versus host disease
  • Acute GvHD refers to the onset of an allogeneic inflammatory response in three organs exclusively: skin, liver, and gastrointestinal tract.
  • chronic GvHD can affect at least one of the following eight organs: skin, mouth, eyes, gastrointestinal tract, liver, lungs, muscles, joints, fascia, and genitals.
  • GvHD is usually diagnosed by a clinical examination which may include histological analysis of a biopsy of the organ concerned (Schoemans et al. Bone Marrow Transplant 53: 1401-1415 2018 ).
  • the present method is particularly useful, for example because it predicts the possibility of weaning patients from immunosuppressive treatment and therefore their survival.
  • the present method offers the possibility of easily differentiating an active GvHD which requires the continuation of an immunosuppressive treatment from a GvHD which is no longer active at all and for which the treatment could be stopped (cf. Magro et al., Bull Cancer. 104S: S145-S168, 2017).
  • acute GvHD occurs within the first month (30 days) after transplantation, while chronic GvHD appears between 100 and 400 days after transplantation. Both are characterized by the activation of donor T lymphocytes present in the graft. The interaction between host antigens and donor T cells results in allogeneic T cell activation, proliferation, and differentiation into effector cells that attack host epithelial cells.
  • the recipient of an HSCT is likely to develop GvHD if the T cells in the patient's sample are able to proliferate.
  • the proliferation of the patient's T lymphocytes at a time when the immune system is not yet reconstituted is a strong indication that the patient is likely to be affected by GvHD.
  • This can be easily assessed by measuring the load in TTV, using the methods described above.
  • the indication given by this test can be supplemented if necessary by a clinical examination of the patient, in particular by the histological analysis of one or more biopsies of one or more organs of the patient.
  • the sample from the subject is taken less than 400 days after the transplant.
  • the sample is taken less than 100 days after the transplant; alternatively, the sample is taken between 100 and 400 days after the transplant.
  • the GvHD is an acute GvHD; in another particular embodiment, the GvHD is chronic GvHD.
  • step b) it may be useful to compare the measurement of step b) with a reference having a known capacity for proliferation of T lymphocytes, that is to say a capacity for proliferation of reference T lymphocytes .
  • the reference T cell proliferation capacity corresponds to the T cell proliferation capacity estimated from a reference TTV load as described above.
  • the comparison in step b) can be done simply by comparing the TTV load in the patient sample determined in step a) with a reference TTV load.
  • This reference TTV load may for example be that of a healthy, non-immunocompromised individual.
  • the proliferation capacity of the reference T lymphocytes is then that of this healthy, non-immunocompromised individual.
  • the baseline TTV load may be that of an immunocompromised individual.
  • the description relates to a method for determining the susceptibility to GvHD in a patient who has received a GCSH, in particular an allo-GCSH.
  • This method comprises steps of: a) measuring the proliferative capacity of the T lymphocytes from a sample of the patient according to the methods described above at a first instant; b) comparison of the proliferative capacity of T lymphocytes with that of an immunocompromised subject; and c) determining the patient's GvHD susceptibility from the comparison in step b).
  • the method for monitoring the activity of the T lymphocytes described above is implemented in a patient who has undergone conditioning before receiving a HSCT, in particular an allo-HSCT.
  • the conditioning is myeloablative.
  • the conditioning is attenuated.
  • an increased capacity for proliferation of T lymphocytes in the patient compared to the immunocompromised subject indicates that the patient's immune system becomes functional again.
  • a patient's T cell proliferation capacity greater than that of an immunocompromised subject corresponds to a viral load measured in the patient's sample lower than the TTV load in the immunocompromised subject.
  • the subject then presents with active T lymphocytes, which can potentially attack the cells of the graft and trigger GvHD.
  • the patient is not likely to develop GvHD when his T lymphocytes have substantially the same capacity for proliferation as those of an immunocompromised subject.
  • T cell proliferation capacity in the same patient at a second time.
  • the person skilled in the art can thus monitor the evolution of the risk of occurrence of GvHD over time after the transplant.
  • an anti-GvHD treatment can be adapted according to the patient's real susceptibility to GvHD, which limits the risk of resistance appearing, while improving the patient's comfort of life.
  • the method for determining the susceptibility to GvHD in a patient who has received a HSCT comprises steps of: a) measuring the proliferative capacity of the T lymphocytes according to the methods described higher at first; b) measurement of the proliferative capacity of the T lymphocytes according to the methods described above at a second instant, this second instant being later than the first instant of step a); c) comparison of the proliferative capacities of the T lymphocytes measured in a) and b); and d) determining the patient's susceptibility to GvHD based on the comparison in step c).
  • the method for monitoring the activity of the T lymphocytes described above is implemented in a patient who has undergone conditioning before receiving a HSCT, in particular an allo-HSCT.
  • the conditioning is myeloablative.
  • the conditioning is attenuated.
  • the patient's susceptibility to GvHD can therefore be determined using the methods described here, allowing the design of a specific treatment to be tailored to the patient's needs.
  • the present invention also relates to a method for designing a treatment for GvHD for a subject having received a CSH, in particular a GCSH, said method comprising: a) determining the patient's susceptibility to GvHD according to the methods described below above ; b) decide on a treatment based on the result of step a).
  • the method for monitoring the activity of the T lymphocytes described above is implemented in a patient who has undergone conditioning before receiving a HSCT, in particular an allo-HSCT.
  • the conditioning is myeloablative.
  • the conditioning is attenuated.
  • the present description also relates to a method for treating GvHD in a patient who has received a GCSH, in particular an allo-GCSH, said method comprising steps of: a) determining the patient's susceptibility to GvHD according to the methods described above; and b) administering appropriate treatment to said subject.
  • the present invention thus proposes a treatment intended to be used in the treatment of GvHD in a subject having received a GCSH, in particular an allo-GCSH, the use comprising the steps of: a) determining the susceptibility of the patient to the GvHD according to the methods described above; and (b) administering appropriate treatment to said subject.
  • the invention relates to the use of a treatment in the preparation of a medicament for treating GvHD in a subject having received a GCSH, in particular an allo-GCSH, said use comprising the steps of: a) determination of the patient's susceptibility to GvHD according to the methods described above; and (b) administering appropriate treatment to said subject.
  • the method for monitoring the activity of the T lymphocytes described above is implemented in a patient who has undergone conditioning before receiving a HSCT, in particular an allo-HSCT.
  • the conditioning is myeloablative.
  • the conditioning is attenuated.
  • Treatments for GvHD are well known and have been recommended by clinicians (see, for example, Magro et al., BullCancer. 104S: S145-S168, 2017; Penack et al., Lancet Haematol. 7 (2): e157-e167; 2020). Treatments for GvHD can be used prophylactically and most often consist of immunosuppressive treatments such as cyclosporine or tacrolimus.
  • GvHD treatments When GvHD treatments are used curatively, they vary depending on the severity of the complication. Nevertheless, these treatments most generally include immunosuppressants, corticosteroids, in particular prednisolone and methylprednisolone. Anti-lymphocyte serum (S ⁇ L) is also used in case of failure of corticosteroids. Finally, other second line drugs can be used such as mycophenolate mofetil (Cellcept®), monoclonal antibodies (anti TNF ⁇ or anti IL2 receptors).
  • Cellcept® mycophenolate mofetil
  • monoclonal antibodies anti TNF ⁇ or anti IL2 receptors
  • the description also relates to the use of the measurement of the variation of the TTV load in a subject to determine the proliferation capacity of the T lymphocytes of said subject.
  • the variation of the load can be determined by comparing the load in TTV measured in a sample taken at a first instant and in a sample taken at a second instant, the second instant being later than the first.
  • a decrease in the TTV load over time reflects, through the increase in the proliferative capacity of the T lymphocytes, an increase in the activity of said T lymphocytes.
  • Embodiment 1 Method for determining the proliferative capacity of T cells in a subject, the method comprising the steps of: a) measuring the TTV load from a biological sample of said subject; and b) determination of the proliferative capacity of the T lymphocytes in view of the viral load measured in a).
  • Embodiment 2 Method according to embodiment 1, characterized in that the TTV load is measured by amplification, sequencing or hybridization of a TTV sequence, preferably by amplification, more preferably by real-time PCR.
  • Embodiment 3 Method according to embodiment 1 or 2, characterized in that the biological sample is a sample of whole blood, plasma or serum.
  • Embodiment 4 Method according to any one of embodiments 1 to 3, characterized in that the determination of step b) comprises the comparison of the TTV load measured in a) with a reference TTV load .
  • Embodiment 5 Method according to any one of embodiments 1 to 4, characterized in that the patient has received a transplant.
  • Embodiment 6 Method according to embodiment 5, characterized in that the patient has received a hematopoietic stem cell transplant (HSCT), preferably an allo-HSCT.
  • HSCT hematopoietic stem cell transplant
  • Embodiment 7 Method according to embodiment 5 or 6, characterized in that the patient has undergone conditioning, preferably myeloablative or attenuated, before the transplant.
  • Embodiment 8 Method for monitoring the activity of T lymphocytes in a patient having received an allo-HSCT, the method comprising the steps of: a) measuring the proliferative capacity of T lymphocytes in the patient at a first instant according to any one of embodiments 1 to 6; b) comparison of the proliferative capacity of the T lymphocytes measured in a) with the proliferative capacity of the reference T lymphocytes; and c) determining the change in the activity of the patient's T lymphocytes in view of the comparison of step b).
  • Embodiment 9 Method for determining the susceptibility to microbial infections in a patient having received an allo-HSCT, the method comprising the steps of: a) measuring the proliferative capacity of the T lymphocytes in the patient at a first instant according to any of Embodiments 1 to 6; b) comparison of the proliferative capacity of the T lymphocytes measured in a) with the proliferative capacity of the reference T lymphocytes; and c) determining the patient's susceptibility to microbial infections based on the comparison in step b).
  • Embodiment 10 Method according to embodiment 9, characterized in that the microbial infection is a viral, bacterial, protozoan or fungal infection.
  • Embodiment 11 Method for determining susceptibility to graft versus host disease (GvHD) in a patient who received allo-HSCG, the method comprising steps of: a) measuring the proliferative capacity of the lymphocytes T in the patient at a first time according to any one of embodiments 1 to 6; b) comparison of the proliferative capacity of the T lymphocytes measured in a) with the proliferative capacity of the reference T lymphocytes; and c) determining the patient's GvHD susceptibility in view of the comparison of step b).
  • GvHD graft versus host disease
  • Embodiment 12 Method according to any one of embodiments 8 to 11, characterized in that the proliferation capacity of the reference T lymphocytes is the proliferation capacity of the T lymphocytes of a healthy individual or the proliferation capacity T cells from an immunocompromised individual.
  • Embodiment 13 Method according to any one of embodiments 8 to 11, characterized in that the reference T cell proliferation capacity is the T cell proliferation capacity measured in the patient at a second instant.
  • FIG 1 Representation of the genome structure of a TTV isolate.
  • TTV-1a isolation TTV-1a
  • the arrows represent the major ORFs (longer than 50 amino acids).
  • the GC-rich region and an N22 region are indicated.
  • the untranslated region UTR corresponds to the region going from the 3' end of ORF4 to the 5' end of ORF2 According to Biagini, Curr Top Microbiol Immunol. 331:21-33, 2009.
  • FIG 2 TTV viral load from plasma samples of allo-GCSH recipients and healthy volunteers.
  • the TTV viral load of 41 allo-GCSH recipients (black) and 54 healthy volunteers (white) was quantified.
  • the TTV viral load was quantified using the TTV R-GENE® kit (available only for research and not for diagnosis, Ref#69-030, bioMérieux. Marcy-l'Etoile , France).
  • the lowest viral load detected was 0.46 Log copy/mL (log cp/mL). Log copy/mL are used to describe the expression of TTV viral load between the two populations.
  • the variance was compared using an F-test (## p ⁇ 0.01).
  • Mean TTV viral load (black line) was compared using an unpaired t-test with Welch's correction (***p ⁇ 0.001).
  • DNA Deoxyribonucleic acid ; Hello, allogenic; GCSH. Hematopoietic stem cell transplant; TTV. torque teno virus
  • the CD3 + T-cell proliferative capacity of 41 allo-GCSH recipients (black) and 20 healthy volunteers (white) was quantified after 3-day stimulation with mitogen (PHA) and measured by flow cytometry using the Click-11® EdU AF488 kit.
  • the variance of the two populations was compared using an F-test (##. p ⁇ 0.01).
  • the comparison of means (black line) was performed using an unpaired t-test with Welch's correction (***. p ⁇ 0.001).
  • FIG 3A [Fig 3B] [Fig 3C] [Fig 3D]: Correlation between the TTV viral load and the number of T cells as well as the proliferation capacity of T-CD3 + lymphocytes.
  • TTV viral load expressed in Log copies/mL of plasma of 41 allo-HSCT recipients according to: (B) the proliferative capacity of T-CD3 + lymphocytes, (C) the absolute lymphocyte count and (D) CD3 + T-cell count. Patients are represented by dots. Extreme patients: "A" (square) and “B” (triangle), as well as linear regression (black line) are shown. Lymphocyte counts were measured by flow cytometry in the immunology laboratory using a large panel of T cell membrane markers. Proliferative capacity of CD3 + T-lymphocytes was determined after 3 days of stimulation with a mitogen (PHA) and measured by flow cytometry using the Click-lt® EdU AF488 kit. The correlation between TTV viral load (x-axis) and lymphocyte count or CD3 + T-cell proliferative capacity (y-axis) was determined using Pearson's correlation coefficient (shown on each graph).
  • TTV plasma viral load expressed in Log cp/mL from 41 allo-HSCT recipient plasmas with T cell immunophenotyping and CD3 + T cell proliferative capacity A.
  • TTV viral load expressed in Log cp/mL of 41 plasmas of allo-GCSH recipients with respect to the proliferative capacity of T-CD3 + lymphocytes (B), the absolute number of lymphocytes (C) and the number of T-CD3 + cells (D). Lymphocyte subtypes and absolute counts were measured by flow cytometry in the immunology laboratory of Edouard Herriot Hospital (Hospices Civils de Lyon) using a large panel of T cell membrane markers.
  • CD3 + proliferation was determined after 3-day stimulation with mitogen (PHA) and measured by flow cytometry using the Click-lt® EdU AF488 flow kit.
  • the correlation of TTV viral load (abscissa) and cell count or CD3 + T-cell proliferative capacity (ordinate) was determined using Pearson's correlation coefficient (shown on each graph).
  • A The values -0.5 and 0.5 represented by black dotted lines correspond to the bounds of the correlation confidence interval.
  • the Pearson rho and the 95% confidence interval (CI) for all parameters are represented by dots and a black line respectively.
  • B, C and D Patients are represented by black dots, extreme patients by a square and a triangle, linear regression is represented by a black line.
  • FIG 4 Chronological descriptive follow-up of patients with extreme values of TTV viral load. Chronological description of the main clinical stages (in black) and infectious episodes (in grey) between HSCT and inclusion for patient "A" and patient "B". Patient "A” had the lowest TTV viral load and conversely patient “B” had the highest TTV viral load.
  • CMV Cytomegalovirus
  • EBV Epstein-Barr virus
  • GCSH Hematopoietic stem cell transplant
  • GvHD Graft versus host disease; Mr. Month.
  • TTV plasma viral load expressed in Log cp/mL of 41 plasmas from allo-HSCT recipients and the time between HSCT and inclusion expressed in months.
  • the correlation of TTV viral load (abscissa) and delays (ordinate) was determined using the Pearson correlation coefficient (shown on each graph). Patients are represented by black dots and linear regression is represented by a black line.
  • HSCT hematopoietic stem cell transplant
  • TTV Torque Teno Virus
  • Heparinized whole blood samples and EDTA-treated plasma samples from patients receiving allo-HSCT were obtained from the previously described prospective Vaccheminf cohort (13).
  • the cohort was approved by a regional review board (Comotti de protection des brought Sud-Est V, Grenoble, France, number 69HCL17_0769) and is registered in ClinicalTrial.gov (NCT03659773).
  • Consecutive adult patients who underwent allo-HSCT in the hematology department of the Lyon University Hospital were prospectively included, once the patient's written consent was obtained.
  • PBMC Peripheral blood mononuclear cells
  • PBMC culture supernatants were collected to perform an IFN ⁇ secretion assay (IGRA, for “IFN ⁇ -release assay”) using Simple Plex cartridges on the ELLA nanofluidic system (ProteinSimple, San Jose, CA , USA) according to the manufacturer's instructions.
  • T cell proliferation was analyzed in pellets with the Click-iTTM Plus EdU Alexa FluorTM 488 Flow Cytometry Assay Kit (C10420; Life Technologies, Carlsbad, CA, USA), which measures the incorporation of 5 -ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU), according to published protocol (16).
  • the percentage of EdU + proliferating cells was obtained by flow cytometry analyzes performed on a BD LSR FortessaTM flow cytometer (BD Biosciences, San Jose, CA, USA). For each experiment, at least 2.5 ⁇ 10 3 CD3 + cells were measured. Data were analyzed using BD FACSDiva software (version 8.0.3, BD Biosciences).
  • CD4 + and CD8 + T lymphocytes were counted in the immunology laboratory of Edouard Herriot Hospital (Hospices Civils de Lyon). In addition, a large panel of T cell membrane markers were measured by whole blood flow cytometry. We thus counted naive CD4 + and CD8 + T cells (CD45 + CCR7 + ), CD4 + and CD8 + T cells with central memory (CD45RA CCR7 + ), CD4 + and CD8 + T cells with effector memory (CD45 CCR7 + ) and CD4 + and CD8 + T cells with differentiated memory (CD45RA + CCR7) as previously described (14). The results were expressed in cells/pL.
  • TTV viral load and T cell proliferative capacity are expressed as mean (range).
  • the TTV load transformed into Log format was used for the analysis (Log copy/mL).
  • Differences between healthy and allo-GCSH recipients were calculated using an unpaired parametric t-test with Welch's correction. Correlations were assessed using a parametric Pearson's rho correlation coefficient.
  • Regression analyzes were performed to assess the association between the dependent variable (TTV viral load) and the independent variables (percentage of proliferating cells, absolute lymphocyte count, and CD3 + T cell count). The analysis of variance has was performed using F-tests. Differences in plasma TTV burden with respect to different clinical characteristics were estimated using the Mann-Whitney test. A value of p ⁇ 0.05 was considered significant.
  • Statistical analyzes were performed using GraphPad Prism® software (version 5; GraphPad software, La Jolla, CA, USA) and R (version 3.5.1).
  • the median duration [El] after transplantation at enrollment was 6 [5-8] months for allo-HSCT recipients.
  • 78% of allo-HSCT recipients received immunosuppressive drugs (corticosteroids, calcineurin inhibitors, others...), and 17% had chronic graft versus host disease [Table 1]. .
  • TTV viral load in TTV was studied in plasma samples from 80 healthy recipients and 41 allo-HSCT recipients. TTV viral load was detected by real-time PCR in 68% of healthy samples (54/80). Regarding allo-HSCT recipients, all patients included in the study had a detectable TTV viral load value. The mean (range) TTV viral load was significantly higher in allo-HSCT recipients compared to healthy subjects (3.9 (0.7-7.7) vs 2.1 (0.5-4. 3) Log copy/ml respectively, p ⁇ 0.0001) [Fig 2].
  • CD3 + T cells (VN, 521 -1772/pL) 915 (175-3406)
  • CD3 + CD4 + T cells VN, 336-1126/pL 273 (38-876)
  • CD4 + memory effectors CD45RA CCR7 (VN, 59-
  • CD45RATCR7 VN, 11 -102/pL
  • CD3 + CD8 + T cells VN, 125-780/pL
  • 602 60-2779
  • CD8 + memory effectors CD45RA CCR7 ) (VN, 15-
  • CD20 + B cells VN, 64-593/pL 287 (14-1299)
  • Patient (A) received a stem cell transplant from a geno-identical donor while patient (B) received a peripheral blood cell transplant from a pheno-identical donor.
  • Patient (A) had a simple post-transplant evolution without any particular clinical facts between transplantation and enrolment, i.e. no infectious episode, no GvHD and no immunosuppressive treatment [Fig 4].
  • patient (B) received heavy immunosuppressive therapy and suffered from acute GvHD and multiple severe bacterial/viral infections [Fig 4].
  • TTV the plasma viral load of TTV was significantly higher for the allo-HSCT recipient (at 6 months after transplantation) compared to healthy subjects, thus confirming observations of Tyagi and al., 2013 (post-transplant delay not specified) or Masouridi et al., 2016 (2-3 months after the transplant) (10,18).
  • T cells the main cells of the immune response against viral infection (19,20)
  • TTV replication 21,22.
  • T cell multiplication is ongoing, as the immune system is rebuilding, providing a large number of cells where the virus can replicate.
  • TTV load peaks around 3–6 months after transplantation before returning to a so-called normal value (23,24).
  • TTVs would use the growth of T cells, which are still naive and non-functional, to replicate before being finally regulated by the immune system and by functional T cells, thus suggesting an important link between the TTV viral load and immune function.
  • TTV viral load has also been associated with the number of CD8 + /CD57 + T cells, a lymphocyte subtype described as a potential marker of immunosenescence and increased during certain pathologies such as acquired immunodeficiency states , transplants or persistent viral infections. All these results suggest that there is therefore a potentially important link between TTVs and the function of the immune system, in particular with regard to its ability to regulate viral load.
  • this study establishes the existence of a correlation between TTV viral load and T cell function, and shows that this correlation is independent of cell number.
  • the number of CD3+ T lymphocytes can be significantly different (Patient 1 vs Patient 2) and conversely, for a significantly different viral load (Patient 3 vs Patient 4), the number of CD3+ T cells may be similar. Therefore, this confirms that the viral load in TTV is not correlated with the number of CD3+ T cells.
  • TTV Torque Teno Virus

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Abstract

L'invention a pour objet une méthode pour déterminer la capacité de prolifération des lymphocytes T chez un sujet, la méthode comprenant des étapes suivantes : a) mesure de la charge en Torque Teno Virus à partir d'un échantillon biologique dudit sujet; et b) détermination de la capacité de prolifération des lymphocytes T au vu de la charge virale mesurée en a).

Description

TITRE : UTILISATION DU VIRUS TORQUE TENO (TTV) EN TANT QUE MARQUEUR POUR DETERMINER LA CAPACITE DE PROLIFERATION DES LYMPHOCYTES T
INTRODUCTION
Le système immunitaire défend l’organisme contre les agressions telles que les infections pathogènes, la transformation cellulaire et les dommages physiques ou chimiques. Un individu immunocompétent est ainsi capable de déclencher une réponse immunitaire protectrice contre une stimulation antigénique.
En revanche, quand le système immunitaire est affaibli ou totalement absent, une immunodéficience se manifeste. Celle-ci prend diverses formes et peut affecter le système immunitaire inné ou adaptatif, ou les deux, selon la source du déficit. Dans la grande majorité des cas, l'immunodéficience est acquise au cours de la vie. Elle peut résulter d’une pathologie, infectieuse ou non (par exemple une infection au VIH), ou être produite par une thérapie, comme une radiothérapie ou une chimiothérapie. L’état d’immunodéficience est particulièrement dangereux, car le patient présente alors une susceptibilité accrue aux infections secondaires par des agents pathogènes tels que les bactéries, les virus, les parasites ou encore les champignons. Par exemple, l’utilisation de traitements immunosuppressifs dans les greffes, notamment les greffes de cellules souches hématopoïétiques (GCSH), peut entraîner des infections microbiennes récurrentes ou potentiellement mortelles chez les patients.
Il est donc important de pouvoir déterminer la fonctionnalité du système immunitaire d’un sujet. Cela permet notamment d’adapter une réponse thérapeutique appropriée quand une immunodéficience est identifiée.
Un ensemble de techniques est disponible pour mesurer l'immunocompétence, sans qu’aucune ne soit complètement satisfaisante. Ces techniques mesurent entre autres la réponse immunitaire à médiation cellulaire et comprennent notamment l'analyse des populations de lymphocytes, en particulier la numération des lymphocytes T CD4+ ou la mesure du rapport des lymphocytes T CD4+/CD8+, la mesure de la capacité de prolifération lymphocytaire, la mesure de l’activité cytotoxique des lymphocytes T, la mesure de la réponse anticorps, le marquage des tétramères, la détection des cytokines produites, l’ELISpot, etc. Certaines de ces techniques, comme par exemple la numération des lymphocytes T, donnent un résultat qui ne reflète pas nécessairement l’activité de ces cellules et donc l’activité du système immunitaire. Un nombre absolu de lymphocytes T ne dit rien sur la capacité de ces cellules à se multiplier. Par exemple, il n’est pas possible de dire qu’un faible nombre de lymphocytes T après une GCSH signifie que ces lymphocytes T sont incapables de se multiplier et de défendre le patient contre une infection microbienne. D’autre part, les tests de prolifération cellulaire, sont difficiles à mettre en oeuvre en routine et peuvent difficilement être standardisés. Il existe donc toujours un besoin pour une méthode simple et facile d’utilisation permettant de déterminer l’immunocompétence.
Le Torque Teno Virus (TTV) est un virus de la famille des Anelloviridae initialement identifié en 1997 chez un patient japonais présentant une hépatite post- transfusionnelle (1 -7). Le TTV est un virus à ADN circulaire simple brin de petite taille (environ 3.8 kb), comprenant une région codante présentant une forte diversité génétique et une région non codante (UTR) bien conservée. L’utilisation d’amorces permettant d’amplifier des séquences dans cette région non codante a mis en évidence une prévalence mondiale élevée du TTV (autour de 90%). Le TTV produit des infections chroniques sans manifestation clinique clairement associée. On parle de virus apathogène ou orphelin. De nombreuses études se sont ainsi intéressées à l’implication du TTV en pathologie humaine, notamment dans certaines pathologies hépatiques, sans qu’un rôle clair puisse être identifié pour ce virus.
Il a toutefois été observé que la charge en TTV est plus élevée chez les sujets présentant une immunodéficience. Par exemple, des niveaux importants de TTV sont trouvés chez des patients ayant reçu des traitements immunosuppresseurs dans le cadre de greffes d’organe (Rezahosseini et al., Transplant Rev (Orlando). 33(3) : 137- 144, 2019) ou de GCSH (Albert et al., Med Microbiol Immunol. 208(2) : 253-258, 2019). De même, il semblerait exister une relation entre la charge en TTV et des déficiences du système immunitaire associées à des infections chroniques ou au cancer (Zhong et al., Ann NY Acad Sci. 945 : 84-92, 2001 ; Fogli et al., Clin Dev Immunol. 2012 : 829584, 2012 ; Béland et al., J Infect Dis. 209(2) : 247-254, 2014 ; Gôrzer et al., J Heart Lung Transplant. 33(3) : 320-323, 2014), tandis que le TTV est retrouvé en association avec des infections virales immunosuppressives telles que les infections au HIV ou au HCV. Ces observations ont conduit à la suggestion que la charge en TTV pourrait être un marqueur de l'immunocompétence (8-11 ). Néanmoins, dans ces études, l'immunocompétence n’a été évaluée que par le nombre de cellules immunitaires ou par la survenue d’événements indésirables cliniques (11 -14). Or, il a déjà été suggéré que la quantité de cellules n'est pas nécessairement associée à la qualité des cellules, c'est-à-dire que l’activité des cellules T n’est pas reflétée par leur nombre (12).
Il existe donc toujours un besoin d’une méthode simple et fiable permettant de déterminer si des cellules T peuvent être activées chez un sujet.
DESCRIPTION DETAILLEE
La présente invention a pour objet une méthode pour déterminer si des lymphocytes T sont fonctionnels chez un sujet. Plus précisément, les inventeurs ont montré que la capacité proliférative des lymphocytes T est inversement corrélée à la charge en torque teno virus (TTV pour Torque Teno Virus), notamment chez un patient ayant reçu une greffe, plus particulièrement une GCSH. La charge virale TTV est inversement corrélée à la prolifération des lymphocytes T : ainsi plus la charge TTV est importante et moins les lymphocytes sont aptes à proliférer. La charge virale n’est pas corrélée spécifiquement à un autre paramètre, que ce soit le nombre de cellules T ou un critère clinique, soulignant la pertinence de la corrélation identifiée. La charge en TTV est un marqueur spécifique de l’activité des cellules T, notamment chez les patients ayant reçu une greffe et en particulier une GCSH. L’évolution de la fonctionnalité du système immunitaire peut donc être suivie chez un sujet par une simple mesure de sa charge en TTV. Il est ainsi possible d’évaluer rapidement l’état fonctionnel du système immunitaire sans devoir mettre en oeuvre les étapes techniques lourdes habituellement utilisées pour évaluer ce paramètre.
Méthodes de détermination de la capacité de prolifération des cellules T
La présente description a pour objet une méthode de détermination de la capacité de prolifération des cellules T chez un sujet, ladite méthode comprenant la mesure de la charge en TTV chez le patient.
Comme mentionné précédemment, la capacité proliférative des cellules T n’est pas nécessairement corrélée au nombre desdites cellules T. Par conséquent, les méthodes connues de numération des cellules T ne sont en rien informatives sur la capacité de prolifération des cellules T et donc, sur la fonctionnalité du système immunitaire. Il est donc du mérite des inventeurs d’avoir identifié un nouveau paramètre, facilement mesurable en routine, qui est avantageusement corrélé avec la capacité de prolifération des cellules T permettant ainsi d’évaluer la fonctionnalité du système immunitaire.
Les « lymphocytes T » ou « cellules T » sont des cellules essentielles du système immunitaire chargées d’amplifier ou de freiner la réponse immune. Préférentiellement, les lymphocytes T se caractérisent par l’expression d’un marqueur membranaire appelé CD3 et d’un récepteur spécifique, le TCR (pour « T cell receptor »), lequel est directement impliqué dans la reconnaissance antigènique. Avantageusement, les lymphocytes T peuvent exprimer d’autres marqueurs de surface, notamment CD4 et CD8, qui correspondent à des catégories fonctionnelles spécifiques de lymphocytes T. Dans le cadre d’une GCSH, les lymphocytes T en jeu peuvent notamment être les quelques lymphocytes T résiduels du receveur ou les lymphocytes T du donneur présents dans le greffon. Ils peuvent aussi être des lymphocytes T naïfs issus de la différenciation des cellules souches et progéniteurs du donneur dans le thymus du receveur.
L’expression « activation des lymphocytes T » ou « activation des cellules T » se réfère ici au processus par lequel des cellules T naïves deviennent capables de participer à la réponse immunitaire. L’activation des cellules T conduit notamment à la prolifération de celles-ci. L’activation des cellules T est ainsi avantageusement évaluée en mesurant la prolifération des cellules T. La mesure de la prolifération des cellules T est habituellement réalisée par des techniques bien connues de la personne du métier mais nécessitant une lourde mise en oeuvre. En particulier, il est bien connu que les lymphocytes T sont capables de proliférer en présence d'un mitogène, comme par exemple la concanavaline A (Con A), le mitogène de la phytolaque (PWM pour « pokeweed mitogen ») et la phytohémagglutinine (PHA), indépendamment de la spécificité de leur TCR. Les méthodes de l’art antérieur évaluent la capacité de prolifération des lymphocytes T en mesurant la synthèse de l’ADN des lymphocytes T après leur stimulation par un mitogène. Cependant, ces méthodes nécessitent une mise en oeuvre lourde et peuvent ainsi difficilement être utilisées en routine. En comparaison, la méthode décrite ici est particulièrement simple et robuste.
Ainsi, le test de prolifération des cellules T peut comprendre les étapes suivantes de : Isolation des cellules mononuclées de sang périphérique (PBMC) à partir de sang total par centrifugation,
Incubation desdites PBMC isolées, éventuellement dans un milieu supplémenté, par exemple dans une plaque de culture cellulaire,
Stimulation, de préférence en double, avec un mitogène,
Incubation, et
Dosage par cytométrie en flux, par exemple à partir des culots de culture, afin de déterminer la prolifération des lymphocytes T.
Un protocole détaillé est notamment donné dans les exemples de réalisation.
Selon un premier aspect, il est décrit ici une méthode de détermination de la capacité de prolifération des cellules T chez un sujet, ladite méthode comprenant : a) la mesure de la charge en TTV à partir d’un échantillon dudit sujet ; et b) la détermination de la capacité de prolifération des cellules T du sujet au vu de la charge virale mesurée en a).
Selon un mode préféré de réalisation, une forte charge en TTV indique que les cellules T présentent une capacité proliférative peu importante. Inversement, une faible charge en TTV indique que les cellules T présentent une capacité proliférative importante.
Bien entendu, afin de déterminer si la charge en TTV dans l’échantillon biologique est forte ou faible, et de conclure sur la capacité proliférative des cellules T, ladite charge en TTV peut avantageusement être comparée à une charge en TTV de référence ou charge contrôle telle que définie plus loin dans la présente description. À titre d’exemple, une charge en TTV de référence peut être la charge virale en TTV mesurée chez un même individu.
La présente méthode est plus particulièrement adaptée pour évaluer les capacités de prolifération des cellules T chez un sujet susceptible de présenter un état d’immunodéficience.
Le terme « immunodéficience » (ou « immunodépression » ou « immunosuppression »), tel qu'utilisé ici, fait référence à la réduction ou à la suppression de la fonction du système immunitaire. Un « état d’immunodéficience » désigne donc ici un état dans lequel le système immunitaire d'un sujet est réduit ou absent. Préférentiellement, la réponse immunitaire humorale et/ou cellulaire envers les agents pathogènes infectieux est défectueuse chez les sujets présentant un état d’immunodéficience. Plus préférentiellement, l’état d’immunodéficience se manifeste au moins par une diminution de la réponse cellulaire.
L’immunodéficience peut être primaire ou secondaire. Les immunodéficiences primaires regroupent les déficits innés du système immunitaire avec une susceptibilité accrue à des infections. En revanche, l'immunodéficience secondaire (ou immunité acquise) correspond à une perte de la fonction immunitaire qui apparaît au cours de la vie, comme, par exemple mais sans limitation, à la suite d'une exposition à des agents pathogènes, une maladie (par exemple, un lymphome ou une leucémie), une thérapie visant à traiter une maladie (par exemple, une radiothérapie ou une chimiothérapie), une immunosuppression ou encore le vieillissement. Les agents pathogènes pouvant entraîner une immunodéficience comprennent entre autres le virus de l'immunodéficience humaine (VIH) 1 (VIH-1 ), VIH-2, Treponema pallidum, Plasmodium falciparum, Plasmodium malariae, Plasmodium ovale, Plasmodium vivax, Plasmodium knowlesi, le virus de l'hépatite B (VHB), le virus de l'hépatite C (VHC), les prions , le virus du Nil occidental, le parvovirus, Trypanosoma cruzi, des coronavirus tels que le SÀRS-COV-1 et le SÀRS-COV-2, et/ou le virus de la vaccine. L’immunodéficience peut également être induite délibérément avec des médicaments, par exemple en préparation d'une greffe, comme par exemple une greffe d'organe (par exemple, de rein, de foie, de cœur, de poumon, du pancréas, de l’intestin, etc.) ou une GCSH, pour empêcher le rejet de la greffe.
Préférentiellement, l’immunodéficience selon la présente description est une immunodéficience secondaire (ou acquise). Ainsi, l’immunodéficience décrite ici peut être de toute origine telle que, par exemple, mais sans limitation, un traitement immunosuppresseur, des effets secondaires immunosuppresseurs de médicaments ou d'une thérapie comprenant la radiothérapie, des traits ou maladies génétiques immunosuppresseurs héréditaires, des maladies immunosuppressives acquises telles que le SIDA, des cancers, comme la leucémie ou le lymphome. En particulier, l’immunodéficience est liée à une greffe, notamment une GCSH.
Dans un mode de réalisation particulier, le sujet susceptible de présenter un état d’immunodéficience est un sujet ayant reçu une greffe. Selon un mode de réalisation plus particulier, cette greffe est une GCSH. Plus particulièrement, la description porte sur une méthode pour déterminer la capacité de prolifération de cellules T chez un sujet, le sujet ayant reçu une GCSH, la méthode comprenant des étapes de : a) mesure de la charge en TTV à partir d’un échantillon du sujet ; et b) détermination de la capacité de prolifération des cellules T du sujet au vu de la charge virale mesurée en a).
Selon un mode préféré de réalisation, une forte charge en TTV indique que les cellules T présentent une capacité proliférative peu importante. Inversement, une faible charge en TTV indique que les cellules T présentent une capacité proliférative importante.
Par « cellule souche », on entend désigner ici des cellules non différenciées mais spécialisées ayant deux propriétés principales : l’aptitude à s'auto- renouveler et à se maintenir en place durant de très longues périodes, et la capacité à générer tous les types de cellules différenciées d’un tissu spécifique, ce qui définit leur multipotence. Les « cellules souches hématopoïétiques » ou « CSH » désignent ici plus particulièrement les cellules souches qui peuvent conduire aux différentes cellules du sang (notamment globules rouges, plaquettes, granulocytes, lymphocytes T ou B, et monocytes). Les CSH peuvent avantageusement être obtenues à partir du sang de cordon ombilical. Alternativement, elles peuvent être obtenues à partir du sang périphérique. Il est aussi possible de les obtenir à partir de moelle osseuse.
La « greffe de cellules souches hématopoïétiques » ou « GCSH » ou « HSCT » (pour « hematopoietic stem cells transplant ») telle qu’on l’entend ici est une procédure thérapeutique dans le domaine de l'hématologie dans laquelle des CSH, généralement dérivées de la moelle osseuse, du sang périphérique ou du sang du cordon ombilical, sont transplantées depuis un donneur vers un receveur.
La GCSH est une approche potentiellement curative pour une variété de pathologies. Celles-ci sont en particulier les hémopathies, notamment les hémopathies malignes, comme les leucémies aiguës, les myélodysplasies et les lymphomes, et les hémopathies non malignes de pronostic sévère, y compris des aplasies médullaires constitutionnelles et des hémoglobinopathies, les tumeurs solides, les déficits immunitaires et les déficits enzymatiques du tissu hématopoïétique, comme la maladie de Gaucher, par exemple. Préférablement, la pathologie est une hémopathie, plus préférentiellement, une hémopathie maligne. La GCSH peut être autologue (les propres cellules souches du patient sont utilisées, c’est-à-dire que le donneur et le receveur sont une seule et même personne) ou allogénique (ci-après « allo-GCSH » : les cellules souches proviennent d'un donneur qui n’est pas le receveur). De préférence, la GCSH dans la méthode décrite ici est une greffe allogénique.
Selon ce mode de réalisation particulier, la description porte sur une méthode pour déterminer la capacité de prolifération de cellules T chez un sujet, le sujet ayant subi une allo-GCSH, la méthode comprenant des étapes de : a) mesure de la charge en TTV à partir d’un échantillon du sujet ; et b) détermination de la capacité de prolifération des cellules T du sujet au vu de la charge virale mesurée en a).
Selon un mode préféré de réalisation, une forte charge en TTV indique que les cellules T présentent une capacité proliférative peu importante. Inversement, une faible charge en TTV indique que les cellules T présentent une capacité proliférative importante.
Dans le cas d’une allogreffe, des traitements de préparation (ou traitement de conditionnement) sont administrés avant la greffe pour détruire ou de réduire l’activité du système immunitaire du receveur. Ces conditionnements visent à prévenir le rejet de greffe et réduire la charge tumorale.
Le conditionnement peut être myéloablatif. Un conditionnement « myéloablatif » tel qu’on l’entend ici est un conditionnement qui détruit les cellules de la moelle osseuse du receveur. Avantageusement, le conditionnement myéloabalatif détruit également le système immunitaire du receveur, facilitant ainsi la prise du greffon. Le conditionnement myéloabalatif peut notamment comprendre une ou plusieurs étapes de chimiothérapie et/ou de radiothérapie. Par exemple, deux des conditionnements couramment utilisés sont les associations busulfan-cyclophosphamide et cyclophosphamide-irradiation corporelle totale (ICT). Préférablement, le conditionnement myéloabalatif est appliqué à un patient de moins de 55 ans, préférablement moins de 50 ans.
Alternativement, le conditionnement est un conditionnement non myéloablatif, atténué, ou encore appelé « à intensité réduite ». Un « conditionnement atténué » est un conditionnement qui ne détruit pas totalement la moelle osseuse du receveur, mais entraîne une inhibition du système immunitaire de celui-ci, facilitant ainsi la prise du greffon. Un tel conditionnement atténué comprend préférablement l’administration d’un immunosuppresseur. Par exemple, un protocole de conditionnement atténué peut comprendre l’association de fludarabine, de cyclophosphamide ou d’un autre agent alkylant, et d’une ICT. Un autre exemple de protocole de conditionnement atténué peut comprendre l’association de fludarabine, de sérum antilymphocytaire (SÀL) et de busulfan. Un autre exemple de protocole de conditionnement atténué peut comprendre l’association de fludarabine, d’idarubicine et d’aracytine. Enfin, un autre exemple de protocole de conditionnement atténué peut comprendre l’association de fludarabine avec une mini irradiation complète. Dans un mode de réalisation préféré, le conditionnement atténué est appliqué à un patient ayant moins de 75 ans.
Le terme « donneur », comme utilisé ici, se réfère au sujet dont les CSH sont transférées au receveur. On entend ici par « receveur » ou « patient » le sujet qui reçoit les CSH du donneur. Dans un mode de réalisation particulier, le receveur est affecté par une pathologie à laquelle la GCSH doit apporter un bénéfice thérapeutique, qu’il soit complet ou partiel.
Tel qu'il est utilisé ici, le terme « sujet » fait référence à un vertébré, de préférence un mammifère et, de manière préférée entre toutes, un humain. Un humain peut par exemple être un patient.
De préférence, dans les méthodes telles que décrites ci-après, dans tous leurs modes de réalisation, le sujet est un patient.
Le terme « patient » désigne un être humain qui est entré en contact avec un professionnel de santé, tel qu’un médecin, une structure médicale ou un établissement de santé tel qu’un hôpital par exemple.
On entend ici par « échantillon biologique » tout échantillon qui peut être prélevé à partir d'un sujet. De façon générale, l’échantillon biologique doit permettre la détermination de la charge en TTV. L’échantillon biologique, tel qu’on l’entend ici, comprend entre autres, mais sans s'y limiter, le sang total, le sérum, le plasma, les expectorations, les prélèvements naso-pharyngés, l'urine, les selles, la peau, le liquide céphalorachidien, la salive, les sécrétions gastriques, le sperme, le liquide séminal, les larmes, le tissu ou le liquide rachidien, le liquide cérébral, un échantillon de ganglion trijumeau, un échantillon de ganglion sacré, le tissu adipeux, le tissu lymphoïde, le tissu placentaire, le tissu de l'appareil reproducteur supérieur, le tissu de l'appareil gastro-intestinal, le tissu génital et le tissu du système nerveux central. L'échantillon à tester peut être utilisé directement à partir de la source biologique ou à la suite d'un prétraitement permettant de modifier le caractère de l'échantillon. Par exemple, un tel prétraitement peut inclure la préparation de plasma à partir de sang, la dilution de fluides visqueux et ainsi de suite. Des procédés de prétraitement peuvent aussi impliquer la filtration, la précipitation, la dilution, la distillation, le mélange, la concentration, l'inactivation de composants perturbateurs, l'addition des réactifs, une lyse, etc. En outre, il peut être bénéfique de modifier un échantillon d'essai solide pour former un milieu liquide ou pour libérer l'analyte. De préférence, l'échantillon biologique est du sang ou un dérivé de celui-ci, tel que le plasma ou le sérum. Ainsi, l'échantillon biologique est préférablement du sang, du plasma ou du sérum provenant du sujet testé.
Par « virus torque teno ou Torque Teno Virus ou TTV », on entend ici un virus de la famille des Anelloviridae. Un TTV tel qu’on l’entend ici est un virus non enveloppé, avec un génome d'ADN simple brin circulaire de polarité négative. Par « génome de TTV », il est ici fait référence aux génomes de tous les Anelloviridae, y compris les alphatorquevirus (TTV), les betatorquevirus (TTMV), les gammatorquevirus (TTMDV). A titre d’exemple, il est ici fait référence au génome de la souche prototype du virus Torque Teno, TTV-1 a. Plus spécifiquement, un exemple d'un génome TTV est une séquence telle que par exemple celle qui est représenté par la SEQ ID No 1 et dont le numéro d'accession Genbank est AB017610.
Préférentiellement, le génome des TTV a une taille d’environ 3,8 kb. La structure et l’organisation génomique des TTV est bien connue (cf. par exemple se référer à Biagini, Curr Top Microbiol lmmunol.33ï : 21 -33, 2009) et est exemplifiée sur la [Fig 1 ]. Le génome du TTV peut ainsi être divisé en une région non traduite (UTR) d’environ 1 à 1 ,2 kb et une région codante potentielle d’environ 2,6 à 2.8 kb. La région codante contient notamment deux grandes phases ouvertes de lecture : ORF1 et ORF2, codant deux protéines de 770 et 202 résidus respectivement. Dans le génome de TTV représenté par la SEQ ID No 1 , les phases ouvertes de lecture ORF1 et ORF2 sont comprises entre les nucléotides 589-2901 et 107-715, respectivement. Le génome du TTV peut posséder d’autres phases ouvertes de lecture. Par exemple, le génome des TTV peut comprendre deux phases additionnelles de lecture, ORF3 et ORF4 [Fig 1]. En revanche, la région non traduite UTR est bien conservée. Elle comprend notamment une séquence riche en GC susceptible de former une structure secondaire. L’amplification de séquences choisies dans la région non traduite UTR-5’ a permis de démontrer que la prévalence du virus est très élevée à travers l’ensemble de la population mondiale (Hu et al., J Clin Microbiol. 43(8) : 3747-3754, 2005). Cette région comprend notamment une séquence de 128 bp qui peut être amplifiée par la trousse de diagnostic TTV R-GENE® (bioMérieux, France).
La « charge virale » telle qu’on l’entend ici est le nombre de particules virales présentes dans un échantillon biologique. La charge virale reflète la gravité d'une infection virale. La charge virale peut être déterminée en mesurant la quantité de l’un des composants du virus (ADN génomique, ARNm, protéine...) dans cet échantillon biologique. De préférence, la charge virale se réfère ainsi à la proportion de séquences d'acide nucléique appartenant audit virus dans un échantillon biologique. Plus préférentiellement, la charge virale représente le nombre de copies du génome dudit virus dans un échantillon biologique.
Dans le cas présent, la charge virale représente la charge en TTV. La « charge en TTV » correspond ici plus particulièrement à la charge virale du TTV, c’est-à-dire au nombre de particules virales de TTV présentes dans un échantillon biologique. La charge en TTV chez un sujet signifie la charge virale de tout TTV hébergé par ledit sujet. La charge en TTV peut être déterminée en mesurant la quantité d’un composant de TTV, comme un acide nucléique ou une protéine, dans cet échantillon biologique. De préférence, la charge en TTV correspond à la quantité de séquences d'acide nucléique de TTV présentes dans un échantillon biologique. Ainsi, la détermination de la charge en TTV chez un sujet selon l'invention comprend l'estimation du nombre de séquences de tous les TTV dans un échantillon biologique dudit sujet. En particulier, il n'y a pas de sélection, selon l'invention, de souches spécifiques de TTV à mesurer dans ledit échantillon biologique. De préférence, la détermination de la charge en TTV comprend la détermination de la quantité de copies virales actives et/ou inactives. Elle consiste à déterminer la quantité de copies virales circulantes, intégrées ou latentes.
Les niveaux de TTV - et donc la charge en TTV - peuvent être déterminés en mesurant les niveaux d'ADN de TTV, d'ARN de TTV ou de protéines de TTV. Le procédé selon l'invention peut ainsi comprendre une autre étape préliminaire, entre le prélèvement de l'échantillon du patient et l'étape a) telle que définie ci-dessus, correspondant à la transformation de l'échantillon biologique en un échantillon d'ÀDN double brin, ou en un échantillon d'ARNm (ou d'ÀDNc correspondant), ou en un échantillon de protéines, qui est ensuite prêt à être utilisé pour la détection in vitro de TTV à l'étape a). La préparation ou l’extraction d’ÀDN viral double brin, d’ARNm (ainsi que la rétro- transcription de celui-ci en ÀDNc) ou de protéines à partir d’un échantillon cellulaire ne sont que des procédures de routine bien connues de la personne du métier. L’ÀDN double brin peut correspondre soit à l'ensemble du génome des TTV, soit seulement à une partie de celui-ci. Une fois qu'un ADN double brin, un ARNm (ou un ÀDNc correspondant) ou un échantillon de protéines prêt à l'emploi est disponible, la détection des TTV peut être effectuée, selon le type d'échantillon ou de transformation, soit par l’ADN génomique (c'est-à-dire basé sur la présence d'au moins une séquence constituée d'au moins une partie du génome de TTV), soit par l’ARNm (c'est-à-dire basé sur la teneur en ARNm de TTV dans l'échantillon), soit au niveau protéique (c'est-à-dire basé sur la teneur en protéines de TTV dans l’échantillon).
De préférence, les niveaux de TTV sont déterminés en mesurant les niveaux d’acide nucléique de TTV, plus préférablement d’ADN de TTV.
Les méthodes de détection d'un acide nucléique dans un échantillon biologique comprennent, entre autres, l'amplification, y compris l'amplification par PCR, le séquençage, l'hybridation avec une sonde marquée et toutes les autres méthodes connues de la personne du métier.
Selon un premier mode de réalisation, la charge en TTV est déterminée par amplification des séquences de TTV.
Une approche préférée consiste à amplifier des séquences qui sont connues pour être spécifiques du génome des TTV. Par « séquence spécifique du génome des TTV », on entend ici une séquence qui est présente dans la majorité des TTV connus, mais qui est absente de la majorité des autres virus, notamment de la majorité des autres anellovirus. Préférablement, une séquence spécifique de TTV est présente dans au moins 90%, au moins 95%, au moins 96>%, au moins 97%, au moins 98% ou au moins 99% des génomes de TTV connus. Plus préférablement, elle est présente dans 100% des génomes de TTV connus. Alternativement, une séquence spécifique des TTV est présente dans moins de 10%, moins de 5%, moins de 4%, moins de 3%, moins de 2%, moins de 1% des génomes d’anellovirus connus autres que les TTV. Préférablement, une séquence spécifique des TTV est absente de tous les génomes d’anellovirus connus autres que les TTV. Une telle séquence est par exemple une séquence comprise dans la région non traduite UTR. Plus particulièrement, une telle séquence correspond à la séquence de 128 bp de la région non traduite 5’-UTR qui est amplifiée à l’aide de la trousse de diagnostic TTV R-GENE® (bioMérieux, France).
Ainsi selon ce mode de réalisation, le procédé décrit ici comprend l'utilisation d’amorces et de sondes pour l’amplification de séquences connues pour être spécifiques du génome des TTV. Comme il est habituel dans ce domaine technique, ces amorces sont préférablement des oligonucléotides. Par exemple, ces amorces peuvent comprendre moins de 30 nucléotides, au moins de 25 nucléotides, moins de 20 nucléotides, moins de 15 nucléotides ou moins de 12 nucléotides. Alternativement, ces amorces comprennent au moins 12, 15, 20,25 ou 30 nucléotides. Préférablement, les amorces utilisées comprennent entre 12 et 20 nucléotides, entre 12 et 25 nucléotides, entre 15 et 20 nucléotides ou encore entre 15 et 25 nucléotides. La personne du métier saura déterminer la longueur et la séquence de l’amorce d’amplification à utiliser une fois choisie la séquence spécifique des TTV. Elle pourra par exemple utiliser les mêmes amorces que celles qui sont fournies dans la trousse de diagnostic TTV R-GENE® (bioMérieux, France).
Les techniques d'amplification comprennent notamment des méthodes isothermes et des techniques basées sur la PCR (Polymerase Chain Reaction). Les méthodes d’amplification isotherme regroupent un grand nombre de méthodes. Les plus utilisées pour détecter les agents pathogènes sont les méthodes LAMP (Loop-Mediated Amplification) et RPA (Recombinase Polymerase Amplification). Les méthodes d’amplification isotherme comprennent aussi des méthodes telles que par exemple la méthode NASBA (nucleic acid sequence-based amplification), HDA (helicasedependent amplification), RCA (rolling circle amplification) et SDA (strand displacement amplification), EXPAR (exponential amplification reaction), ICANs (isothermal and chimeric primer-initiated amplification of nucleic acids), SMART (signal-mediated amplification of RNA technology), etc. (voir par exemple Asiello et Baeumner, Lab Chip 11 (8): 1420-1430, 2011 ). De préférence, la technique de PCR utilisée mesure quantitativement les quantités initiales d'ADN, d'ADNc ou d'ARN. Des exemples de techniques basées sur la PCR qui peuvent être utilisées dans les méthodes décrites ici comprennent, sans limitation, des techniques telles que la PCR en temps réel (Q-PCR), la PCR inverse (RT-PCR), la PCR inverse multiplexe, la PCR inverse en temps réel (QRT-PCR) et la PCR numérique (ou PCR digitale). Ces techniques sont des technologies bien connues et facilement disponibles pour la personne du métier. Il n’est pas nécessaire de les détailler ici.
Préférablement, la détermination de la charge en TTV est effectuée par une PCR quantitative en temps réel. De nombreuses méthodes de détection et de quantification des TTV ont été décrites dans l’art (voir par exemple Maggi et al., J Virol. 77(4) : 2418- 2425, 2003). On se référera en particulier à la méthode décrite par Kulifaj et al. (J Clin Virol. 105 :118-127, 2018). Cette méthode est particulièrement avantageuse de par sa simplicité et sa robustesse. Elle est fondée sur l’amplification d’une séquence comprise dans la région non codante UTR. Cette séquence est présente chez tous les TTV connus, conférant ainsi une très grande spécificité à la méthode. En outre, elle est particulièrement versatile et peut être mise en oeuvre avec n’importe quel type de plateforme de PCR. Il est particulièrement avantageux d’utiliser la trousse de diagnostic TTV R-GENE® (bioMérieux, France) pour mettre en oeuvre cette méthode.
Alternativement, la détermination de la charge virale est effectuée par PCR digitale. La PCR digitale implique plusieurs analyses de PCR sur des acides nucléiques extrêmement dilués de sorte que la plupart des amplifications positives reflètent le signal d'une seule molécule matrice. La PCR digitale permet ainsi le comptage de molécules modèles individuelles. La proportion d'amplifications positives parmi le nombre total de PCR analysées permet une estimation de la concentration de matrice dans l'échantillon d'origine ou non dilué. Cette technique a été proposée pour permettre la détection d'une variété de phénomènes génétiques (Vogelstein et al., Proc Natl Acad Sci USA 96 : 9236-924, 1999). La PCR digitale, tout comme la PCR en temps réel, permet potentiellement la discrimination de différences quantitatives fines de séquences cibles entre des échantillons.
Selon un autre mode de réalisation, les niveaux d'ADN de TTV sont mesurés par séquençage. Tel qu'utilisé ici, le terme « séquençage » est pris dans son acception la plus large et se réfère à toute technique connue de la personne du métier permettant de déterminer la séquence d’une molécule polynucléotidique (ADN ou ARN), c’est-à- dire de déterminer la succession des nucléotides composant cette molécule.
L'ADN de TTV peut ainsi être séquencé par toute technique connue dans l'art. Le séquençage tel qu’on l’entend ici comprend entre autres le séquençage par la méthode de Sanger, le séquençage du génome entier, le séquençage par hybridation, le pyroséquençage (notamment le séquençage 454, le séquençage Solexa Genome Analyzer), le séquençage avec électrophorèse capillaire, le séquençage par cycles, le séquençage d'extension à base unique, le séquençage en phase solide, le séquençage à haut débit, le séquençage de signature massivement parallèle (MPSS), le séquençage par terminateur de colorant réversible, le séquençage à paires appariées, le séquençage à court terme, le séquençage avec exonucléases, le séquençage par ligature, le séquençage de molécule unique, le séquençage par synthèse, le séquençage par microscopie électronique le séquençage en temps réel, le séquençage à terminaison inverse, le séquençage par nanopores, le séquençage par terminateur réversible, le séquençage par semiconducteur, le séquençage SOLiD(R), le séquençage SMRT (Single Molecule Real-Time Analysis), le séquençage MS- PET, la spectrométrie de masse, et leurs combinaisons. Un mode de réalisation particulier utilise le séquençage haut débit d'ADN, à l’aide par exemple des plateformes MiSeq, NextSeq 500, et la série HiSeq développées par Illumina (Reuter et al., Mol Cell, 58 : 586-597, 2015 ; Bentley et al. Nature ; 456 : 53-59, 2008), la plateforme Genome Sequencer de 454 et Roche (Margulies et al. Nature ; 437 : 376-380, 2005), la plateforme SOLID d'Applied Biosystems (McKernan et al., Genome Res ; 19 : 1527-1541 , 2009), la plateforme Polanator (Shendure et al., Science, 309 : 1728-1732) ou encore la plateforme de séquençage de molécules uniques Hélicos (Harris et al. Science ; 320 : 106-109, 2008). Le séquençage haut débit inclut aussi des méthodes telles que le séquençage en temps réel SMRT (Roads et al., Genomics, Proteomics & Bioinformatics, 13(5) : 278-289, 2015), le séquençage Ion Torrent (WO 2010/008480 ; Rothberg et al., Nature, 475 : 348-352, 2011 ) et séquençage à l’aide de nanopores (Clarke J et al. Nat Nanotechnol : 4 : 265-270, 2009).
Le séquençage est effectué sur l'intégralité de l’ADN contenu dans l'échantillon biologique ou sur des parties de l'ADN contenues dans l'échantillon biologique. Il sera immédiatement clair pour la personne du métier que ledit échantillon contient au moins un mélange d'ADN de TTV et d'ADN du sujet hôte. De plus, l'ADN de TTV ne représentera probablement qu'une fraction mineure de l'ADN total présent dans l'échantillon. Avantageusement, l'ADN est fragmenté au hasard, généralement par des méthodes physiques, préalablement au séquençage.
Une première approche consiste à séquencer des séquences spécifiques du génome d’une espèce de TTV. Une autre approche consiste à utiliser une méthode qui permet le génotypage quantitatif des acides nucléiques obtenus à partir de l'échantillon biologique avec une grande précision. Dans un mode de réalisation particulier, la précision est obtenue par l'analyse d'un grand nombre (par exemple, des millions ou des milliards) de molécules d'acide nucléique sans aucune amplification en utilisant des protocoles qui s'appuient sur une connaissance préalable des séquences cibles (c'est-à-dire dans ce cas, les séquences des TTV).
Dans un mode de réalisation préféré, le procédé de l'invention comprend une étape de quantification du nombre de lectures.
Dans un mode de réalisation particulier, un sous-ensemble aléatoire de molécules d'acide nucléique de l'échantillon biologique est soumis au séquençage à haut débit. Préférablement, les séquences de TTV sont identifiées dans les données de séquençage globales par comparaison avec les séquences de TTV déposées publiquement. Cette comparaison est avantageusement fondée sur le niveau d'identité de séquence avec une séquence de TTV connue et permet de détecter des variantes même éloignées. Des logiciels courants tels que BLAST peuvent être utilisés pour déterminer le niveau d’identité entre les séquences.
Ainsi, une séquence présentant au moins 80%, au moins 85%, au moins 90%, au moins 95%, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98%, au moins 99% ou 100% d'identité avec une séquence de TTV connue est identifiée comme une séquence de TTV. Selon ce mode de réalisation, la détermination de la charge en TTV comprend donc la numérotation des séquences de TTV identifiées par séquençage dans l'échantillon biologique du sujet.
Dans un autre mode de réalisation, la charge de TTV est déterminée en mesurant la quantité d’une protéine virale dans l’échantillon biologique. Il est ainsi possible d’employer des anticorps spécifiques, en particulier dans des technologies bien connues telles que l’immunoprécipitation, l’immunohistologie, le western blot, le dot blot, I’ ELISA ou l’ELISPOT, l'électrochimioluminescence (ECLIA), les puces à protéines, les puces à anticorps, ou les puces à tissu couplées à l’immunohistochimie. Parmi les autres techniques qui peuvent être utilisées sont comprises les techniques de FRET ou de BRET, les méthodes de microscopie ou d’histochimie, dont notamment les méthodes de microscopie confocale et de microscopie électronique, les méthodes basées sur l’utilisation d’une ou plusieurs longueurs d’onde d’excitation et d’une méthode optique adaptée, comme une méthode électrochimique (les techniques de voltamétrie et d’ampérometrie), le microscope à force atomique, et les méthodes de radiofréquence, comme la spectroscopie résonance multipolaire, confocale et non- confocale, détection de fluorescence, luminescence, chimioluminescence, absorbance, réflectance, transmittance, and biréfringence ou index de réfraction (par exemple, par résonance des plasmons de surface, ou « surface plasmon resonance » en anglais, par ellipsométrie, par méthode de miroir résonnant, etc.), cytométrie de flux, imagerie par résonance radioisotopique ou magnétique, analyse par électrophorèse en gel de polyacrylamide (SDS-PÀGE); par spectrométrie de masse et par chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse (LC-MS/MS). Toutes ces techniques sont bien connues de la personne du métier et il n’est pas nécessaire de les détailler ici. En outre, des anticorps spécifiques de protéines de TTV sont déjà disponibles.
Dans un mode de réalisation préféré, la méthode décrite ici comprend une étape supplémentaire de normalisation de la quantité d’acide nucléique ou de protéine virale mesurée.
Selon un mode de réalisation préféré, il peut être avantageux de normaliser les niveaux de TTV, c’est-à-dire la quantité d’ÀDN de TTV, d’ÀRN de TTV ou de protéines de TTV présente dans l’échantillon biologique à un paramètre spécifique de cet échantillon. La normalisation de la charge mesurée de TTV à un paramètre spécifique permet de réduire le taux d’erreur lors de la comparaison entre les charges virales de deux échantillons biologiques différents. Un exemple de paramètre pouvant être utile pour cette normalisation peut être un paramètre physique, indépendant du contenu de l’échantillon, comme par exemple le volume de celui-ci. Il est aussi possible de normaliser la quantité d’ÀDN de TTV, d’ÀRN de TTV ou de protéines de TTV à la quantité totale d’ADN, d’ARN ou de protéines présentes dans l’échantillon. Alternativement, il est possible d’utiliser une séquence particulière d’ADN ou d’ARN ou une protéine particulière comme outil de normalisation. Par exemple, cette séquence ou cette protéine peut être une séquence ou une protéine humaine.
Alternativement, la quantité d’ADN ou d’ARN de TTV ou de protéines de TTV dans un échantillon donné est comparée à un contrôle interne. Pour cela, la quantité d’acide nucléique ou de protéine de TTV mesurée dans l’échantillon biologique peut être rapportée à une quantité définie d’un acide nucléique ou d’une protéine appropriée qui peut être identifiée et quantifiée, comme par exemple un acide nucléique ou une protéine hôte ou exogène. Préférablement, cet acide nucléique ou de cette protéine identifiable et quantifiable est traité (par exemple, amplifié, séquencé, etc.) comme l’acide nucléique ou la protéine cible. On peut ainsi ajouter ab initio à l’échantillon une quantité connue de cet acide nucléique ou de cette protéine identifiable et quantifiable, qui sera ensuite traité comme l’acide nucléique ou la protéine cible et passera par toutes les étapes de préparation de l’échantillon avant la mesure de la quantité de cet acide nucléique ou de cette protéine virale. Les étapes de préparation peuvent comprendre des moyens pour protéger l’acide nucléique viral et détruire les acides nucléiques hôtes, par exemple en utilisant différentes nucléases. Alternativement, ces étapes peuvent comprendre des moyens pour protéger les protéines virales et détruire les protéines hôtes, par exemple en utilisant différentes protéases. Le contrôle interne permet d'évaluer la qualité et l'étendue du traitement (par exemple une amplification ou un séquençage) des molécules considérées (acides nucléiques ou protéines) dans l’échantillon. De préférence, ledit contrôle interne est une molécule d'acide nucléique de séquence connue, cette molécule d'acide nucléique étant présente dans l’échantillon à une concentration connue. Plus préférablement, cette molécule d'acide nucléique est la molécule d'ADN circulaire monocaténaire génomique d'un virus de séquence et de concentration connues dans l’échantillon. Un tel virus connu peut être par exemple un virus de la famille des Circoviridae. Le rapport du nombre de séquences de l'échantillon au contrôle permet d'estimer le nombre absolu de génomes de TTV de séquence et de concentration connues. Alternativement, ce contrôle interne est une protéine de séquence connue, qui est présente dans l’échantillon à une concentration connue.
Une fois la charge en TTV déterminée par mesure de la quantité d’acide nucléique ou de protéine de TTV déterminée, celle-ci étant optionnellement normalisée, il peut être avantageux de la comparer à une charge en TTV de référence.
Par « une charge en TTV de référence » ou « une charge virale de référence » on entend au sens de la présente demande toute charge en TTV utilisée à titre de référence. Cela signifie que la charge en TTV de référence correspond à « un niveau de référence d’acide nucléique (ou de protéine) de TTV » ou « un niveau témoin d’acide nucléique (ou de protéine) de TTV », c’est-à-dire à une concentration d’un acide nucléique (ou de protéine) de TTV utilisé à titre de référence. Tel qu'on l’entend ici, « une concentration de référence d’acide nucléique (ou de protéine) de TTV » est un niveau de base mesuré dans un échantillon témoin comparable à celui testé, et qui est obtenu à partir d’un sujet ou d’un groupe de sujets présentant un statut immunocompétent spécifique. Il peut s'agir par exemple d’un sujet ou d’un groupe de sujets sains ou ne présentant pas de maladie entraînant une immunodépression. Il peut aussi s’agir d’un sujet ou d’un groupe de sujets immunodéprimés, par exemple à la suite d’un traitement immunosuppresseur. Enfin, ce peut être le même individu ayant subi la greffe, par exemple avant ou juste après celle-ci.
Le niveau de référence peut être déterminé par une pluralité de méthodes. Par exemple, le contrôle peut être une valeur prédéterminée, qui peut prendre diverses formes. Il peut s'agir d'une valeur seuil unique, telle qu'une médiane ou une moyenne. Le « niveau de référence » peut être une valeur unique, applicable également à chaque patient individuellement. Alternativement, le niveau de référence peut varier en fonction des sous-populations spécifiques de patients. Ainsi, par exemple, les hommes plus âgés pourraient avoir un niveau de référence différent de celui des hommes plus jeunes pour la charge en TTV, et les femmes pourraient avoir un niveau de référence différent de celui des hommes pour cette charge virale. D'autre part, le « niveau de référence » peut être établi sur la base de groupes comparatifs, tels que des groupes n'ayant pas un niveau d’acide nucléique (ou de protéine) de TTV élevé et des groupes ayant des niveaux d’acide nucléique (ou de protéine) de TTV élevés. Un autre exemple de groupes comparatifs serait les groupes ayant une maladie, une condition ou des symptômes particuliers et les groupes sans maladie. La valeur prédéterminée peut être définie, par exemple, lorsqu'une population testée est divisée de manière égale (ou inégale) en groupes, tels qu'un groupe à faible risque, un groupe à risque moyen et un groupe à risque élevé.
Le niveau de référence peut également être déterminé par comparaison du niveau d’acide nucléique (ou de protéine) de TTV dans des populations de patients ayant subi des greffes ou de patients atteints de maladies conduisant à une immunodépression. Cela peut être accompli, par exemple, par une analyse par histogramme, dans laquelle toute une cohorte de sujets est présentée graphiquement, avec un premier axe représentant le niveau dudit acide nucléique (ou protéine) de TTV, et un second axe représente le nombre de patients dans le groupe de patients exprimant l’acide nucléique (ou la protéine) de TTV à un niveau donné. Deux groupes distincts de sujets ou plus peuvent être déterminés en identifiant des sous-populations de la cohorte qui ont des niveaux d’acide nucléique (ou de protéine) de TTV identiques ou similaires. La détermination du niveau de référence peut alors être faite sur la base d'un niveau qui distingue le mieux ces groupes distincts. Un niveau de référence peut également représenter les niveaux de deux ou plus des présents acides nucléiques (ou protéines) de TTV. Deux marqueurs ou plus peuvent être représentés, par exemple, par un rapport de valeurs pour les niveaux de chaque marqueur.
De même, une population apparemment en bonne santé aura une plage ‘normale’ différente de celle d’une population connue pour présenter un état associé à une haute concentration dudit acide nucléique (ou protéine) de TTV. En conséquence, la valeur prédéterminée sélectionnée peut prendre en compte la catégorie dans laquelle un individu tombe. Des gammes et des catégories appropriées peuvent être sélectionnées à l’aide simplement d’une expérimentation de routine par la personne du métier. Par « élevé », « augmenté », on entend élevé par rapport à un contrôle sélectionné. Généralement, le contrôle sera basé sur des individus normaux apparemment en bonne santé dans une tranche d’âge appropriée.
Dans un mode de réalisation préféré, la concentration de référence correspond à la concentration d’acide nucléique (ou de protéine) de TTV ou de la combinaison de d’acides nucléiques (ou de protéines) de TTV dans la population générale.
On comprendra également que les témoins dans la méthode décrite ici peuvent être, outre de valeurs prédéterminées, des échantillons biologiques mesurés en parallèle avec les échantillons testés. Selon ce mode de réalisation, le niveau de référence sera celui du ou des acides nucléiques (ou protéines) de TTV dans un échantillon provenant d’un sujet en bonne santé.
De façon préférée, la concentration de référence d’acide nucléique (ou de protéine) de TTV sera la concentration de cet acide nucléique (ou cette protéine) de TTV dans un sujet en bonne santé ou dans une population de sujets en bonne santé. Selon un autre mode de réalisation préféré, la concentration de référence de l’acide nucléique (ou de protéine) de TTV sera la concentration de cet acide nucléique (ou cette protéine) de TTV dans un sujet immunodéprimé ou dans une population de sujets immunodéprimés (par exemple, suite à un traitement immunosuppresseur). Selon un autre mode de réalisation préféré, la concentration de référence de l’acide nucléique (ou de protéine) de TTV sera la concentration de cet acide nucléique (ou cette protéine) de TTV chez le même individu ayant subi la greffe à un instant spécifique, par exemple avant ou juste après celle-ci.
De préférence, dans les méthodes telles que décrites précédemment, dans tous leurs modes de réalisation, les cellules T sont des lymphocytes T CD3+, des lymphocytes T CD4+, des lymphocytes T CD8+ ou une population de lymphocytes T CD3+ et/ou CD4+ et/ou CD8+, de préférence des lymphocytes T CD3+.
Méthode de suivi de l’activité des lymphocytes T
Les méthodes décrites ici permettent d’évaluer rapidement et aisément la capacité de prolifération des lymphocytes T chez un sujet.
De multiples facteurs contribuent au statut sévère d’immunodépression chez les receveurs de GCSH, en particulier d’allo-GCSH. Le conditionnement altère notamment les tissus lymphoïdes du receveur. La présence de GvHD ainsi que son traitement induisent de nouvelles complications immunologiques. Enfin, le faible contingent de lymphocytes T greffés, comparé à la taille du compartiment cellulaire T chez une personne immunocompétente, ainsi que le nombre extrêmement limité de précurseurs immunitaires du donneur présents dans le greffon contribuent également à la lenteur de la reconstitution immunitaire chez le receveur. Tous ces facteurs rendent le receveur susceptible à des complications post-greffe, comme des infections microbiennes ou la GvHD.
Grâce aux méthodes décrites ici, il est possible d’évaluer aisément l’activité des lymphocytes T dans des situations où le système immunitaire a été compromis, comme par exemple après une GCSH, notamment une allo-GCSH.
Un autre aspect de la présente divulgation porte donc sur une méthode de suivi de l’activité des lymphocytes T chez un patient ayant reçu une GCSH, notamment une allo-GCSH. Cette méthode comprend des étapes de : a) mesure de la capacité de prolifération des lymphocytes T selon les méthodes décrites plus haut à un premier instant ; b) comparaison de la capacité de prolifération des lymphocytes T mesurées en a) avec une capacité de de prolifération des lymphocytes T de référence ; et c) détermination de la variation de l’activité des lymphocytes T du patient au vu de la comparaison de l’étape b).
Une « capacité de prolifération des lymphocytes T de référence » telle qu’on l’entend ici est une capacité de prolifération des lymphocytes T estimée à partir d’une charge en TTV de référence telle que décrite plus haut. Il est bien entendu que la comparaison de l’étape b) peut se faire simplement en comparant la charge en TTV dans l’échantillon du patient déterminée dans l’étape a) avec une charge en TTV de référence.
Par exemple, en comparant la capacité de prolifération des lymphocytes chez le patient à ce premier instant avec la capacité de prolifération des lymphocytes T de référence d’un individu immunodéprimé, il est possible d’estimer, à ce premier instant, la reconstitution de l’immunocompétence du patient après la GCSH, notamment l’allo-GCSH. Par « immunocompétence » on entend ici l’acquisition de la fonctionnalité par les cellules immunitaires. Ainsi, une capacité de prolifération des lymphocytes T chez le patient augmentée par rapport à celle d’un individu immunodéprimé indique que la reconstitution de l’immunocompétence du patient est en cours. Comme indiqué plus haut, une telle capacité de prolifération des lymphocytes T augmentée chez le patient par rapport au sujet immunodéprimé correspond à une charge en TTV moins importante.
Alternativement, la capacité de prolifération des lymphocytes T de référence peut être celle d’un individu sain. Dans ce cas, une capacité de prolifération des lymphocytes T chez le patient diminuée par rapport à la capacité de prolifération des lymphocytes T de référence indique que l’immunocompétence n’a pas été complètement reconstituée chez le patient. On comprendra immédiatement qu’une diminution de la capacité de prolifération des lymphocytes T chez le patient par rapport au sujet sain correspond à une augmentation de la charge en TTV.
Le terme « augmenté », tel qu'il est utilisé ici dans certains modes de réalisation, signifie une plus grande quantité, par exemple, une quantité légèrement supérieure à la quantité d'origine, ou par exemple une quantité en grand excès par rapport à la quantité d'origine, et notamment toutes les quantités dans l'intervalle. En variante, « augmentation » peut faire référence à une quantité ou une activité qui est au moins 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 100% de plus que la quantité ou de l'activité pour laquelle la quantité ou de l'activité accrue est comparé. Les termes « accru », « plus grand que », « plus important » et « augmenté » sont utilisés ici de manière interchangeable.
Le terme « diminué », tel qu'il est utilisé ici dans certains modes de réalisation, signifie une moins grande quantité, par exemple, une quantité légèrement inférieure à la quantité d'origine, ou par exemple une quantité en grand insuffisance par rapport à la quantité d'origine, et notamment toutes les quantités dans l'intervalle. En variante, « diminution » peut faire référence à une quantité ou une activité qui est au moins 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 100% de moins que la quantité ou de l'activité pour laquelle la quantité ou de l'activité réduite est comparé. Les termes « diminué », « moins grand que », « moins important » et « réduit » sont utilisés ici de manière interchangeable.
Il est aussi possible d’utiliser comme capacité de prolifération des lymphocytes T de référence la capacité de prolifération des lymphocytes T chez le même patient à un second instant. L’évolution de l’activité de ces lymphocytes T chez ce patient après la greffe peut ainsi être suivie simplement, sans mettre en oeuvre de dispositif expérimental lourd et compliqué, par une simple mesure de la charge en TTV chez le patient au premier et au second instant.
Selon ce mode réalisation particulier, la présente méthode de suivi de l’activité des lymphocytes T chez un patient ayant reçu une GCSH, notamment une allo-GCSH, comprend des étapes de : a) mesure de la capacité de prolifération des lymphocytes T selon les méthodes décrites plus haut à un premier instant ; b) mesure de la capacité de prolifération des lymphocytes T selon les méthodes décrites plus haut à un second instant, ce second instant étant plus tardif que le premier instant de l’étape a) ; c) comparaison des capacités de prolifération des lymphocytes T mesurées en a) et b) ; et d) détermination de la variation de l’activité des lymphocytes T du patient au vu de la comparaison de l’étape c).
Selon un autre mode de réalisation particulier, la méthode de suivi de l’activité des lymphocytes T chez un sujet ayant reçu une greffe, de préférence une GCSH, et notamment une allo-GCSH, comprend donc les étapes de : a) détermination de la charge virale en TTV à partir d’un échantillon biologique du sujet prélevé à un premier instant ; b) détermination de la charge virale en TTV à partir d’un échantillon biologique du sujet prélevé à un second instant, ce second instant étant plus tardif que le premier instant de l’étape a) ; c) comparaison des charges virales en TTV mesurées en a) et b) ; et d) détermination de la variation de charge en TTV du sujet au vu de la comparaison de l’étape c).
Comme expliqué précédemment, la charge virale en TTV étant inversement corrélée à la capacité de prolifération des lymphocytes T, la variation de la charge en TTV permet de déterminer si la capacité proliférative des lymphocytes T est accrue ou diminuée fournissant ainsi une indication sur l’activité des lymphocytes T et notamment sur la reconstitution ou non de l’immunocompétence du sujet.
Cette méthode est ainsi particulièrement utile pour suivre au cours du temps l’activité des lymphocytes T chez le patient. Dans un mode de réalisation préféré, le premier instant de l’étape a) se situe au moment de la greffe. Dans un autre mode de réalisation préféré, la capacité de prolifération des lymphocytes T est mesurée à l’étape b) en utilisant un échantillon prélevé au moins 30 jours, 60 jours, 90 jours, 100 jours, 120 jours, 150 jours, 180 jours, 210 jours, 240 jours, 270 jours, 300 jours, 330 jours, 360 jours, 720 jours ou 1080 jours après la GCSH. Alternativement, cet échantillon est prélevé à 30 jours, 60 jours, 90 jours, 100 jours, 120 jours, 150 jours, 180 jours, 210 jours, 240 jours, 270 jours, 300 jours, 330 jours, 360 jours, 720 jours ou 1080 jours après la GCSH.
Il est clair que si les cellules T ont une capacité de prolifération accrue au second instant par rapport au premier, leur activité est elle-même accrue à cet instant. Par exemple, si le premier instant est le moment de la greffe, une capacité de prolifération accrue des lymphocytes T à ce second instant signifie qu’il y a plus de lymphocytes T actifs et que le patient est alors plus à même de se défendre notamment contre les menaces. Une telle évolution de la capacité de prolifération des lymphocytes T se traduira par une évolution en sens inverse de la charge en TTV : une diminution de celle-ci au cours du temps reflète ainsi une augmentation de la capacité de prolifération des lymphocytes T, c’est-à-dire une reconstitution de l’immunocompétence du patient. La présente méthode permet donc d’estimer la reconstitution du système immunitaire du receveur. Autrement dit, l’évolution de la capacité de prolifération des cellules T permet d’évaluer la réapparition de l’immunocompétence chez le patient après la greffe.
En suivant les variations de l’activité des cellules T au cours du temps, il est notamment possible de surveiller la reconstitution de l’immunocompétence après la greffe chez un patient ayant subi un conditionnement. Selon ce mode de réalisation particulier, la méthode de suivi de l’activité des lymphocytes T décrite plus haut est mise en oeuvre chez un patient ayant subi un conditionnement avant de recevoir une GCSH, notamment une allo-GCSH. Dans un mode de réalisation préféré, le conditionnement est myéloablatif. Dans un autre mode de réalisation préféré, le conditionnement est atténué.
Méthodes d’évaluation du risque d’infection microbienne
La GCSH, notamment l’allo-GCSH, peut entraîner des complications précoces ou tardives, qui varient fortement d’un patient à l’autre.
En particulier, un patient ayant reçu une GCSH, notamment une allo-GCSH, reste sensible aux infections microbiennes, qu’elles soient bactériennes, virales, parasitaires ou fongiques, tant que son système immunitaire n’est pas reconstitué. En évaluant la capacité de prolifération de lymphocytes T à un moment donné après une GCSH, notamment une allo-GCSH, il est possible de déterminer la susceptibilité aux infections microbiennes du patient ayant subi la greffe.
Dans cet aspect particulier, la présente description porte sur une méthode pour déterminer la susceptibilité aux infections microbiennes chez un patient ayant reçu une GCSH, notamment une allo-GCSH. Cette méthode comprend des étapes de : a) mesure de la capacité de prolifération des lymphocytes T à partir d’un échantillon du patient selon les méthodes décrites plus haut à un premier instant ; b) comparaison de la capacité de prolifération des lymphocytes T avec une capacité de prolifération des lymphocytes T de référence ; et c) détermination de la susceptibilité aux infections microbiennes chez le patient à partir de la comparaison de l’étape b).
En suivant les variations de l’activité des cellules T au cours du temps, il est notamment possible de surveiller la reconstitution de l’immunocompétence après la greffe chez un patient ayant subi un conditionnement. Selon ce mode de réalisation particulier, la méthode de suivi de l’activité des lymphocytes T décrite plus haut est mise en oeuvre chez un patient ayant subi un conditionnement avant de recevoir une GCSH, notamment une allo-GCSH. Dans un mode de réalisation préféré, le conditionnement est myéloablatif. Dans un autre mode de réalisation préféré, le conditionnement est atténué. Les méthodes décrites ici peuvent comprendre en outre une ou plusieurs étapes de diagnostic spécifique de la présence d’un ou plusieurs des agents infectieux, comme par exemple les bactéries, virus, parasites ou levures et champignons filamenteux mentionnés plus en détail ci-dessous. La détection de ces agents est pratiquée en routine en clinique, notamment en relation avec des GCSH, et les techniques correspondantes sont bien connues de la personne du métier. Il n’est donc pas nécessaire de les détailler ici.
Ces infections microbiennes sont en particulier des infections virales, bactériennes, parasitaires ou fongiques. Les infections virales sont notamment des infections par des virus de la famille des Herpesviridae, comme par exemple, les virus HSV, VZV, HHV-6, le virus d’Epstein-Bar (EBV) ou le cytomégalovirus humain (CMVH). Ces infections virales peuvent aussi être causées par des adénovirus, le virus respiratoire syncytial (VRS), le virus de la grippe (encore appelé influenzavirus ou Myxovirus influenzae) ou le virus BK. Les bactéries responsables des infections bactériennes peuvent être entre autres des staphylocoques comme Staphylococcus aureus ou des staphylocoques à coagulase négatives, des bactéries encapsulées telles que Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis ou Haemophilus influenzae, Legionella sp. ou encore des bacilles à Gram-négatif non fermentaires aérobies stricts tels les genres Pseudomonas, Acinetobacter, Stenotrophomonas, Burkholderia, Alcaligenes... Des infections à mycobactéries atypiques peuvent également être observées. Des infections parasitaires à forte morbidité et mortalité, notamment à Pneumocystis carinii, peuvent survenir, tout comme des toxoplasmoses (causées par Toxoplasma gondii). Enfin, des levures telles que des Candida ou des Cryptococcus, mais aussi des champignons filamenteux comme des Aspergillus sont responsables d’infections fongiques invasives qui font partie des causes majeures de mortalité infectieuse après une GCSH.
La capacité de prolifération des lymphocytes T de référence correspond à la capacité de prolifération des lymphocytes T estimée à partir d’une charge en TTV de référence telle que décrite plus haut. La comparaison de l’étape b) peut se faire simplement en comparant la charge en TTV dans l’échantillon du patient déterminée dans l’étape a) avec une charge en TTV de référence. Cette charge en TTV de référence peut par exemple être celle d’un individu sain, non immunodéprimé. La capacité de prolifération des lymphocytes T de référence est alors celle de cet individu sain, non immunodéprimé.
Dans ce mode de réalisation particulier, la description porte sur une méthode pour déterminer la susceptibilité aux infections microbiennes chez un patient ayant reçu une GCSH, notamment une allo-GCSH. Cette méthode comprend des étapes de : a) mesure de la capacité de prolifération des lymphocytes T à partir d’un échantillon du patient selon les méthodes décrites plus haut à un premier instant ; b) comparaison de la capacité de prolifération des lymphocytes T avec celle d’un sujet sain ; et c) détermination de la susceptibilité aux infections microbiennes chez le patient à partir de la comparaison de l’étape b).
En suivant les variations de l’activité des cellules T au cours du temps, il est notamment possible de surveiller la reconstitution de l’immunocompétence après la greffe chez un patient ayant subi un conditionnement. Selon ce mode de réalisation particulier, la méthode de suivi de l’activité des lymphocytes T décrite plus haut est mise en oeuvre chez un patient ayant subi un conditionnement avant de recevoir une GCSH, notamment une allo-GCSH. Dans un mode de réalisation préféré, le conditionnement est myéloablatif. Dans un autre mode de réalisation préféré, le conditionnement est atténué.
Dans ce cas, une capacité réduite de prolifération des lymphocytes T chez le patient par rapport au sujet sain indique que le système immunitaire du patient n’est pas complètement fonctionnel. Une capacité de prolifération des lymphocytes T du patient moindre que celle d’un sujet sain correspond à une charge virale mesurée dans l’échantillon du patient supérieure à la charge en TTV chez le sujet sain. En d’autres termes, le sujet présente alors une déficience de son système immunitaire, ce qui le laisse à la portée de l’attaque de pathogènes. Ainsi, le patient risque d’être infecté par des organismes microbiens. En revanche, le patient moins sensible aux infections microbiennes quand ses lymphocytes T ont substantiellement la même capacité de prolifération que ceux d’un sujet en bonne santé.
Il est aussi possible d’utiliser comme capacité de prolifération des lymphocytes T de référence la capacité de prolifération des lymphocytes T chez le même patient à un second instant. La personne du métier peut ainsi surveiller l’évolution des risques d’infections microbiennes au cours du temps après la greffe. Ainsi les traitements antiinfectieux peuvent être adaptés en fonction de la susceptibilité réelle du patient aux infections microbiennes, ce qui limite les risques d’apparition de résistance, tout en améliorant le confort de vie du patient.
Dans ce mode réalisation particulier, la méthode de détermination de la susceptibilité aux infections microbiennes chez un patient ayant reçu une GCSH, notamment une allo-GCSH, comprend des étapes de : a) mesure de la capacité de prolifération des lymphocytes T selon les méthodes décrites plus haut à un premier instant ; b) mesure de la capacité de prolifération des lymphocytes T selon les méthodes décrites plus haut à un second instant, ce second instant étant plus tardif que le premier instant de l’étape a) ; c) comparaison des capacités de prolifération des lymphocytes T mesurées en a) et b) ; et d) détermination de la susceptibilité aux infections microbiennes chez le patient au vu de la comparaison de l’étape c).
En suivant les variations de l’activité des cellules T au cours du temps, il est notamment possible de surveiller la reconstitution de l’immunocompétence après la greffe chez un patient ayant subi un conditionnement. Selon ce mode de réalisation particulier, la méthode de suivi de l’activité des lymphocytes T décrite plus haut est mise en oeuvre chez un patient ayant subi un conditionnement avant de recevoir une GCSH, notamment une allo-GCSH. Dans un mode de réalisation préféré, le conditionnement est myéloablatif. Dans un autre mode de réalisation préféré, le conditionnement est atténué.
Il est ainsi possible de suivre au cours du temps l’évolution de la sensibilité aux infections microbiennes chez le patient. Une capacité de prolifération des lymphocytes T dans l’étape b) par rapport à l’étape a) accrue reflète une augmentation de leur activité et donc une diminution de la sensibilité du patient aux infections microbiennes entre les deux instants. La présente méthode permet notamment de vérifier que plus le temps passe après la greffe et moins le patient devient sensible aux infections microbiennes, c’est-à-dire que son système immunitaire devient de plus en plus fonctionnel. La susceptibilité du patient aux infections microbiennes peut donc être déterminée à l’aide des méthodes décrites ici, ce qui permet d'adapter un traitement spécifique aux besoins du patient. La détermination préalable de l'état immunodéprimé du patient avec le procédé de l'invention conduit ainsi à un traitement plus sûr que les traitements conçus sur la base des procédés de l'art antérieur.
De préférence, dans les méthodes telles que décrites précédemment, dans tous leurs modes de réalisation, la capacité de prolifération des lymphocytes T correspond à la capacité de prolifération des lymphocytes T CD3+, des lymphocytes T CD4+, des lymphocytes T CD8+ ou d’une population de lymphocytes T CD3+ et/ou T CD4+ et/ou T CD8+, de préférence à la capacité de prolifération des lymphocytes T CD3+.
Ainsi, la présente invention concerne également un procédé de conception d'un traitement des infections microbiennes chez un patient ayant subi une CSH, notamment une allo-GCSH, ledit procédé comprenant : a) déterminer la susceptibilité du patient aux infections microbiennes selon les méthodes décrites ci-dessus ; b) décider d’un traitement selon le résultat de l’étape a).
En suivant les variations de l’activité des cellules T au cours du temps, il est notamment possible de surveiller la reconstitution de l’immunocompétence après la greffe chez un patient ayant subi un conditionnement. Selon ce mode de réalisation particulier, la méthode de suivi de l’activité des lymphocytes T décrite plus haut est mise en oeuvre chez un patient ayant subi un conditionnement avant de recevoir une GCSH, notamment une allo-GCSH. Dans un mode de réalisation préféré, le conditionnement est myéloablatif. Dans un autre mode de réalisation préféré, le conditionnement est atténué.
Le traitement peut être décidé à titre préventif, c’est-à-dire qu’il peut être ordonné au vu de l’état d’immunodéficience du patient pour empêcher qu’une infection ne se déclare. Dans ce cadre, on pourra décider de prescrire les traitements curatifs ou prophylactiques couramment utilisés après une GCSH, notamment une allo-GCSH, lesquels sont décrits plus bas. Les présentes méthodes permettent ainsi de pouvoir décider et d’administrer un traitement préventif ou curatif d’une infection virale, bactérienne, parasitaire ou fongique si un risque d’une telle infection est identifié. La présente description concerne donc également une méthode de traitement d'une infection chez un patient ayant reçu une GCSH, en particulier une allo-GCSH, ladite méthode comprenant des étapes de : a) détermination de la susceptibilité du patient aux infections microbiennes selon les méthodes décrites ci-dessus ; et b) administration d’un traitement approprié audit sujet.
La présente invention propose ainsi un traitement destiné à être utilisé dans le traitement d'une infection chez un sujet ayant reçu une GCSH, en particulier une allo- GCSH, l'utilisation comprenant les étapes de : a) détermination de la susceptibilité du patient aux infections microbiennes selon les méthodes décrites ci-dessus ; et b) administration d’un traitement approprié audit sujet.
En d'autres termes, l'invention concerne l'utilisation d'un traitement dans la préparation d'un médicament pour traiter une infection chez un sujet ayant reçu une GCSH, en particulier une allo-GCSH, ladite utilisation comprenant des étapes de : a) détermination de la susceptibilité du patient aux infections microbiennes selon les méthodes décrites ci-dessus ; et b) administration d’un traitement approprié audit sujet.
En suivant les variations de l’activité des cellules T au cours du temps, il est notamment possible de surveiller la reconstitution de l’immunocompétence après la greffe chez un patient ayant subi un conditionnement. Selon ce mode de réalisation particulier, la méthode de suivi de l’activité des lymphocytes T décrite plus haut est mise en oeuvre chez un patient ayant subi un conditionnement avant de recevoir une GCSH, notamment une allo-GCSH. Dans un mode de réalisation préféré, le conditionnement est myéloablatif. Dans un autre mode de réalisation préféré, le conditionnement est atténué.
Comme expliqué plus haut, les infections rencontrées après une GCSH, notamment une allo-GCSH, sont des infections virales, bactériennes, parasitaires ou fongiques. Les traitements de ces infections sont bien connus et sont utilisés en clinique depuis de nombreuses années (voir par exemple Tomblyn et al., Biol Blood Marrow Transplant. 15(10) : 1143-1238, 2009). Ainsi, les infections virales peuvent être prévenues par des composés antiviraux tels que l’aciclovir, le ganciclovir, le cidofovir, l’entécavir, la fludarabine la lamivudine, le ténofovir, la ribavarine ou la valaciclovir, ou des anticorps monoclonaux spécifiques comme le palivizumab (contre le VRS). Les antibiotiques permettent habituellement de traiter les infections bactériennes. On utilise notamment des antibiotiques à large spectre comme les beta lactamines, les glycopeptides, la fosfomycine, les macrolides, les tétracyclines, les aminosides, le chloramphénicol, les quinolones, la rifampicine et les sulfamides. Pour ce qui est des infections parasitaires, elles sont habituellement traitées par administration de composés antiparasitaires tels que le cotrimoxazole, la pyriméthamine et la sulfadiazine. Enfin, les composés antifongiques qui peuvent être administrés sont bien connus et comprennent notamment le fluconazole et les échinocandines.
Méthodes d’évaluation du risque la maladie du greffon contre l'hôte (de GvHD)
Les méthodes décrites ici présentent aussi l’avantage de pouvoir estimer le risque que la GvHD apparaisse chez un patient ayant subi une CCSH, notamment une allo-GCSHD.
La présente description porte donc aussi sur une méthode pour déterminer la susceptibilité à la GvHD chez un patient ayant reçu une GCSH, notamment une allo- GCSH, cette méthode comprenant des étapes de : a) mesure de la capacité de prolifération des lymphocytes T à partir d’un échantillon du patient à un premier instant selon les méthodes décrites plus haut ; et b) détermination de la susceptibilité à la GvHD chez le patient à partir de la mesure de l’étape a).
En suivant les variations de l’activité des cellules T au cours du temps, il est notamment possible de surveiller la reconstitution de l’immunocompétence après la greffe chez un patient ayant subi un conditionnement. Selon ce mode de réalisation particulier, la méthode de suivi de l’activité des lymphocytes T décrite plus haut est mise en oeuvre chez un patient ayant subi un conditionnement avant de recevoir une GCSH, notamment une allo-GCSH. Dans un mode de réalisation préféré, le conditionnement est myéloablatif. Dans un autre mode de réalisation préféré, le conditionnement est atténué.
La « maladie du greffon contre l’hôte » ou « GvHD » (pour « graft versus host disease ») telle qu’on l’entend ici est une réaction immunitaire inflammatoire dirigée contre le receveur et mettant en jeu des cellules immunocompétentes présentes dans le greffon. On distingue deux formes cliniques de GvHD : la GvHD aiguë qui se produit habituellement dans les 100 premiers jours environ qui suivent la greffe et la GvHD chronique qui se produit généralement au-delà de cette limite. La GvHD aiguë fait référence à l'apparition d'une réponse inflammatoire allogénique dans trois organes exclusivement : la peau, le foie et le tractus gastro-intestinal. En revanche, la GvHD chronique peut toucher au moins un des huit organes suivants : peau, bouche, yeux, tractus gastro-intestinal, foie, poumons, muscles, articulations, fascia et les organes génitaux. Que ce soit pour la forme aigüe ou la forme chronique, la GvHD est habituellement diagnostiquée par un examen clinique qui peut comprendre une analyse histologique d’une biopsie de l’organe concerné (Schoemans et al. Bone Marrow Transplant 53 : 1401-1415 2018).
À cet égard, il faut noter que la présente méthode est particulièrement utile, par exemple parce qu’elle prédit la possibilité de sevrer les patients du traitement immunosuppresseur et donc leur survie. La présente méthode offre une possibilité de différencier aisément une GvHD active qui nécessite la poursuite d’un traitement immunosuppresseur d'une GvHD qui n'est plus du tout active et pour laquelle le traitement pourrait être arrêté (cf. Magro et al., Bull Cancer. 104S : S145-S168, 2017).
Plus particulièrement, la GvHD aigüe survient dans le premier mois (30 jours) suivant la greffe, tandis que le GvHD chronique apparaît entre 100 et 400 jours après la greffe. Toutes les deux sont caractérisées par l’activation des lymphocytes T du donneur présents dans le greffon. L’interaction entre les antigènes de l’hôte et les lymphocytes T du donneur entraîne l’activation allogénique des lymphocytes T, leur prolifération et leur différenciation en cellules effectrices qui attaquent les cellules épithéliales de l'hôte.
Le receveur d’une GCSH, en particulier, d’une allo-GCSH, est susceptible de développer une GvHD si les lymphocytes T de l’échantillon du patient sont capables de proliférer. En particulier, la prolifération des lymphocytes T du patient à un moment où le système immunitaire n’est pas encore reconstitué est une indication forte que le patient est susceptible d’être atteint par la GvHD. Cela peut être aisément évalué par la mesure de la charge en TTV, à l’aide des méthodes décrites ci-dessus. L’indication donnée par ce test peut être complétée le cas échéant par un examen clinique du patient, notamment par l’analyse histologique d’une ou plusieurs biopsies d’un ou plusieurs organes du patient. Préférablement, l’échantillon du sujet est prélevé moins de 400 jours après la greffe. De façon plus préféré, l’échantillon est prélevé moins de 100 jours après la greffe ; alternativement, l’échantillon est prélevé entre 100 et 400 jours après la greffe. Dans un mode de réalisation particulier, la GvHD est une GvHD aigüe ; dans un autre mode de réalisation particulier, la GvHD est une GvHD chronique.
Dans un mode de réalisation particulier, il peut être utile de comparer la mesure de l’étape b) avec une référence possédant une capacité connue de prolifération des lymphocytes T, c’est-à-dire une capacité de prolifération des lymphocytes T de référence. La capacité de prolifération des lymphocytes T de référence correspond à la capacité de prolifération des lymphocytes T estimée à partir d’une charge en TTV de référence telle que décrite plus haut. La comparaison de l’étape b) peut se faire simplement en comparant la charge en TTV dans l’échantillon du patient déterminée dans l’étape a) avec une charge en TTV de référence.
Cette charge en TTV de référence peut par exemple être celle d’un individu sain, non immunodéprimé. La capacité de prolifération des lymphocytes T de référence est alors celle de cet individu sain, non immunodéprimé.
Alternativement, la charge en TTV de référence peut être celle d’un individu immunodéprimé. Dans ce mode de réalisation particulier, la description porte sur une méthode pour déterminer la susceptibilité à la GvHD chez un patient ayant reçu une GCSH, notamment une allo-GCSH. Cette méthode comprend des étapes de : a) mesure de la capacité de prolifération des lymphocytes T à partir d’un échantillon du patient selon les méthodes décrites plus haut à un premier instant ; b) comparaison de la capacité de prolifération des lymphocytes T avec celle d’un sujet immunodéprimé ; et c) détermination de la susceptibilité à la GvHD chez le patient à partir de la comparaison de l’étape b).
En suivant les variations de l’activité des cellules T au cours du temps, il est notamment possible de surveiller la reconstitution de l’immunocompétence après la greffe chez un patient ayant subi un conditionnement. Selon ce mode de réalisation particulier, la méthode de suivi de l’activité des lymphocytes T décrite plus haut est mise en oeuvre chez un patient ayant subi un conditionnement avant de recevoir une GCSH, notamment une allo-GCSH. Dans un mode de réalisation préféré, le conditionnement est myéloablatif. Dans un autre mode de réalisation préféré, le conditionnement est atténué.
Dans ce cas, une capacité accrue de prolifération des lymphocytes T chez le patient par rapport au sujet immunodéprimé indique que le système immunitaire du patient redevient fonctionnel. Une capacité de prolifération des lymphocytes T du patient plus importante que celle d’un sujet immunodéprimé correspond à une charge virale mesurée dans l’échantillon du patient inférieure à la charge en TTV chez le sujet immunodéprimé. En d’autres termes, le sujet présente alors des lymphocytes T actifs, qui peuvent potentiellement attaquer les cellules du greffon et déclencher une GvHD. En revanche, le patient n’est pas susceptible de développer une GvHD quand ses lymphocytes T ont substantiellement la même capacité de prolifération que ceux d’un sujet immunodéprimé.
Il est aussi possible d’utiliser comme capacité de prolifération des lymphocytes T de référence la capacité de prolifération des lymphocytes T chez le même patient à un second instant. La personne du métier peut ainsi surveiller l’évolution du risque de survenue de la GvHD au cours du temps après la greffe. Ainsi un traitement anti-GvHD peut être adapté en fonction de la susceptibilité réelle du patient à la GvHD, ce qui limite les risques d’apparition de résistance, tout en améliorant le confort de vie du patient.
Dans ce mode réalisation particulier, la méthode de détermination de la susceptibilité à la GvHD chez un patient ayant reçu une GCSH, notamment une allo-GCSH, comprend des étapes de : a) mesure de la capacité de prolifération des lymphocytes T selon les méthodes décrites plus haut à un premier instant ; b) mesure de la capacité de prolifération des lymphocytes T selon les méthodes décrites plus haut à un second instant, ce second instant étant plus tardif que le premier instant de l’étape a) ; c) comparaison des capacités de prolifération des lymphocytes T mesurées en a) et b) ; et d) détermination de la susceptibilité à la GvHD chez le patient au vu de la comparaison de l’étape c).
En suivant les variations de l’activité des cellules T au cours du temps, il est notamment possible de surveiller la reconstitution de l’immunocompétence après la greffe chez un patient ayant subi un conditionnement. Selon ce mode de réalisation particulier, la méthode de suivi de l’activité des lymphocytes T décrite plus haut est mise en oeuvre chez un patient ayant subi un conditionnement avant de recevoir une GCSH, notamment une allo-GCSH. Dans un mode de réalisation préféré, le conditionnement est myéloablatif. Dans un autre mode de réalisation préféré, le conditionnement est atténué.
Il est ainsi possible de suivre au cours du temps l’évolution de la susceptibilité à la GvHD chez le patient. Une capacité accrue de prolifération des lymphocytes T dans l’étape b) par rapport à l’étape a) reflète une augmentation de leur activité et donc une augmentation de la susceptibilité du patient à développer la GvHD entre les deux instants. Ce risque est d’autant plus important qu’il survient tôt après la greffe, c’est- à-dire à un moment où les seuls lymphocytes T actifs sont ceux du donneur et où il existe donc un risque qu’ils s’attaquent aux organes de l’hôte.
La susceptibilité du patient à la GvHD peut donc être déterminée à l’aide des méthodes décrites ici, ce qui permet de mettre au point d'adapter un traitement spécifique aux besoins du patient.
Ainsi, la présente invention concerne également un procédé de conception d'un traitement de la GvHD pour un sujet ayant reçu une CSH, notamment une GCSH, ledit procédé comprenant : a) déterminer la susceptibilité du patient à la GvHD selon les méthodes décrites ci- dessus ; b) décider d’un traitement selon le résultat de l’étape a).
En suivant les variations de l’activité des cellules T au cours du temps, il est notamment possible de surveiller la reconstitution de l’immunocompétence après la greffe chez un patient ayant subi un conditionnement. Selon ce mode de réalisation particulier, la méthode de suivi de l’activité des lymphocytes T décrite plus haut est mise en oeuvre chez un patient ayant subi un conditionnement avant de recevoir une GCSH, notamment une allo-GCSH. Dans un mode de réalisation préféré, le conditionnement est myéloablatif. Dans un autre mode de réalisation préféré, le conditionnement est atténué.
La présente description concerne également une méthode de traitement de la GvHD chez un patient ayant reçu une GCSH, en particulier une allo-GCSH, ladite méthode comprenant des étapes de : a) détermination de la susceptibilité du patient à la GvHD selon les méthodes décrites ci-dessus ; et b) administration d’un traitement approprié audit sujet.
La présente invention propose ainsi un traitement destiné à être utilisé dans le traitement de la GvHD chez un sujet ayant reçu une GCSH, en particulier une allo- GCSH, l'utilisation comprenant les étapes de : a) détermination de la susceptibilité du patient à la GvHD selon les méthodes décrites ci-dessus ; et b) administration d’un traitement approprié audit sujet.
En d'autres termes, l'invention concerne l'utilisation d'un traitement dans la préparation d'un médicament pour traiter la GvHD chez un sujet ayant reçu une GCSH, en particulier une allo-GCSH, ladite utilisation comprenant des étapes de : a) détermination de la susceptibilité du patient à la GvHD selon les méthodes décrites ci-dessus ; et b) administration d’un traitement approprié audit sujet.
En suivant les variations de l’activité des cellules T au cours du temps, il est notamment possible de surveiller la reconstitution de l’immunocompétence après la greffe chez un patient ayant subi un conditionnement. Selon ce mode de réalisation particulier, la méthode de suivi de l’activité des lymphocytes T décrite plus haut est mise en oeuvre chez un patient ayant subi un conditionnement avant de recevoir une GCSH, notamment une allo-GCSH. Dans un mode de réalisation préféré, le conditionnement est myéloablatif. Dans un autre mode de réalisation préféré, le conditionnement est atténué.
Les traitements de la GvHD sont bien connus et ont fait l’objet de recommandations de la part des cliniciens (voir par exemple, Magro et al., BullCancer. 104S : S145-S168, 2017 ; Penack et al., Lancet Haematol. 7(2): e157-e167; 2020). Les traitements de la GvHD peuvent être employés à titre prophylactique et consistent le plus souvent en traitements immunosuppresseurs tels que la cyclosporine ou le tacrolimus.
Quand les traitements de la GvHD sont employés à titre curatif, ils varient en fonction de la sévérité de la complication. Néanmoins, ces traitements comprennent le plus généralement des immunosuppresseurs, des corticoïdes, notamment la prednisolone et la méthylprednisolone. Le sérum anti- lymphocytaire (SÀL) est également utilisé en cas d’échec aux corticoïdes. Enfin, d’autres médicaments de seconde ligne peuvent être utilisés tels que le mycophénolate mofétil (Cellcept®), des anticorps monoclonaux (anti TNFa ou antirécepteurs à l’IL2).
La description porte également sur l’utilisation de la mesure de la variation de la charge en TTV chez un sujet pour déterminer la capacité de prolifération des lymphocytes T dudit sujet.
La variation de la charge peut être déterminée en comparant la charge en TTV mesurée dans un échantillon prélevé à un premier instant et dans un échantillon prélevé à un second instant, le second instant étant plus tardif que le premier.
Comme expliqué précédemment, si la charge en TTV augmente au cours du temps, cela traduit, au travers d’une diminution de la capacité proliférative des lymphocytes T, une diminution de l’activité desdits lymphocytes T. À l’inverse, une diminution de la charge en TTV au cours du temps reflète, au travers de l’augmentation de la capacité proliférative des lymphocytes T, une augmentation de l’activité desdits lymphocytes T.
La présente description concerne également les modes de réalisations ci-après :
Mode de réalisation 1 : Méthode pour déterminer la capacité de prolifération des lymphocytes T chez un sujet, la méthode comprenant des étapes de : a) mesure de la charge en TTV à partir d’un échantillon biologique dudit sujet ; et b) détermination de la capacité de prolifération des lymphocytes T au vu de la charge virale mesurée en a).
Mode de réalisation 2 : Méthode selon le mode de réalisation 1 , caractérisée en ce que la charge en TTV est mesurée par amplification, séquençage ou hybridation d’une séquence de TTV, préférablement par amplification, plus préférablement par PCR en temps réel.
Mode de réalisation 3 : Méthode selon le mode de réalisation 1 ou 2, caractérisée en ce que l’échantillon biologique est un échantillon de sang total, de plasma ou de sérum. Mode de réalisation 4 : Méthode selon l’un quelconque des modes de réalisation 1 à 3, caractérisée en ce que la détermination de l’étape b) comprend la comparaison de la charge en TTV mesurée en a) avec une charge en TTV de référence.
Mode de réalisation 5 : Méthode selon l’un quelconque des modes de réalisation 1 à 4, caractérisée en ce que le patient a reçu une greffe.
Mode de réalisation 6 : Méthode selon le mode de réalisation 5, caractérisée en ce que le patient a subi une reçu une greffe de cellules souches hématopoïétiques (GCSH), préférentiellement une allo-GCSH.
Mode de réalisation 7 : Méthode selon le mode de réalisation 5 ou 6, caractérisée en ce que le patient a subi un conditionnement, préférablement myéloablatif ou atténué, avant la greffe.
Mode de réalisation 8 : Méthode de suivi de l’activité des lymphocytes T chez un patient ayant reçu une allo-GCSH, la méthode comprenant des étapes de : a) mesure de la capacité de prolifération des lymphocytes T chez le patient à un premier instant selon l’un quelconque des modes de réalisation 1 à 6 ; b) comparaison de la capacité de prolifération des lymphocytes T mesurée en a) avec une la capacité de prolifération des lymphocytes T de référence ; et c) détermination de la variation de l’activité des lymphocytes T du patient au vu de la comparaison de l’étape b).
Mode de réalisation 9 : Méthode de détermination de la susceptibilité aux infections microbiennes chez un patient ayant reçu une allo-GCSH, la méthode comprenant des étapes de : a) mesure de la capacité de prolifération des lymphocytes T chez le patient à un premier instant selon l’un quelconque des modes de réalisation 1 à 6 ; b) comparaison de la capacité de prolifération des lymphocytes T mesurée en a) avec une la capacité de prolifération des lymphocytes T de référence ; et c) détermination de la susceptibilité aux infections microbiennes du patient au vu de la comparaison de l’étape b).
Mode de réalisation 10 : Méthode selon le mode de réalisation 9, caractérisée en ce que l’infection microbienne est une infection virale, bactérienne, protozoaire ou fongique. Mode de réalisation 11 : Méthode de détermination de la susceptibilité à la maladie du greffon contre l'hôte (GvHD) chez un patient ayant reçu une allo-GCSH, la méthode comprenant des étapes de : a) mesure de la capacité de prolifération des lymphocytes T chez le patient à un premier instant selon l’un quelconque des modes de réalisation 1 à 6 ; b) comparaison de la capacité de prolifération des lymphocytes T mesurée en a) avec une la capacité de prolifération des lymphocytes T de référence ; et c) détermination de la susceptibilité à la GvHD du patient au vu de la comparaison de l’étape b).
Mode de réalisation 12 : Méthode selon l’un quelconque des modes de réalisation 8 à 11 , caractérisée en ce que la capacité de prolifération des lymphocytes T de référence est la capacité de prolifération des lymphocytes T d’un individu sain ou la capacité de prolifération des lymphocytes T d’un individu immunodéprimé.
Mode de réalisation 13 : Méthode selon l’un quelconque des modes de réalisation 8 à 11 , caractérisée en ce que la capacité de prolifération des lymphocytes T de référence est la capacité de prolifération des lymphocytes T mesurée chez le patient à un second instant.
L’invention sera décrite plus précisément au moyen des exemples ci-dessous.
LEGENDES DES FIGURES
[Fig 1] : Représentation de la structure du génome d’un isolat de TTV.
Organisation du génome d’un TTV prototype (isolat TTV-1 a). Les flèches représentent les ORFs majeures (d’une longueur supérieure à 50 acides aminés). La région riche en GC et une région N22 (à partir de laquelle le TTV a été originellement isolé) sont indiquées. La région non-traduite UTR correspond à la région allant de l’extrémité 3’ de l’ORF4 jusqu’à l’extrémité 5’ de l’ORF2 D’après Biagini, Curr Top Microbiol Immunol. 331 :21 -33, 2009.
[Fig 2] : Charge virale TTV à partir d’échantillons de plasma de receveurs d’allo-GCSH et de volontaires sains. La charge virale TTV de 41 receveurs d'allo-GCSH (noir) et de 54 volontaires sains (blanc) a été quantifiée. Après extraction de l'ADN, la charge virale TTV a été quantifiée à l'aide du kit TTV R-GENE® (disponible uniquement pour la recherche et non pour le diagnostic, Ref#69-030, bioMérieux. Marcy-l'Etoile, France). La plus faible charge virale détectée était de 0,46 Log copy/mL (log cp/mL). Les log copy/mL sont utilisés pour décrire l'expression de la charge virale du TTV entre les deux populations. La variance a été comparée à l'aide d’un F-test (## p<0,01 ). La charge virale TTV moyenne (ligne noire) a été comparée en utilisant un t-test non apparié avec la correction de Welch (*** p<0,001 ).
Abréviations : ADN. Acide désoxyribonucléique ; Allô, allogénique ; GCSH. Greffe de cellules souches hématopoïétiques ; TTV. torque teno virus
La capacité de prolifération des lymphocytes T-CD3+ de 41 receveurs d'allo-GCSH (noir) et de 20 volontaires sains (blanc) a été quantifiée après une stimulation de 3 jours avec un mitogène (PHA) et mesurée par cytométrie en flux à l'aide du kit Click- 11® EdU AF488. La variance des deux populations a été comparée à l'aide d’un F-test (##. p<0,01 ). La comparaison des moyennes (ligne noire) a été réalisée en utilisant un t- test non apparié avec correction de Welch (***. p<0,001 ).
Abréviations : Allô, allogénique ; GCSH, Greffe de cellules souches hématopoïétiques ; PHA, Phytohémagglutinine.
[Fig 3A] [Fig 3B] [Fig 3C] [Fig 3D] : Corrélation entre la charge virale TTV et le nombre de cellule T ainsi que la capacité de prolifération des lymphocytes T-CD3+.
Corrélation globale de la charge virale TTV de plasma de 41 receveurs d'allo-GCSH par rapport à la numération de plusieurs sous-types de cellules T et par rapport à la capacité de prolifération des lymphocytes T-CD3+ (A). Le rho de Pearson et l'intervalle de confiance à 95 % (IC95) pour l’ensemble des paramètres évalués sont représentés respectivement par un point et une ligne noire.
Corrélation détaillée de la charge virale TTV exprimée en Log copies/mL de plasma de 41 receveurs d'allo-GCSH en fonction de : (B) la capacité de prolifération des lymphocytes T-CD3+, (C) le compte absolu de lymphocytes et (D) le compte de lymphocytes T-CD3+. Les patients sont représentés par des points. Les patients extrêmes : "A" (carré) et "B" (triangle), ainsi que la régression linéaire (ligne noire) sont représentés. Le nombre de lymphocytes a été mesuré par cytométrie en flux dans le laboratoire d'immunologie en utilisant un large panel de marqueurs de membrane de cellules T. La capacité de prolifération des lymphocytes T-CD3+ a été déterminée après 3 jours de stimulation avec un mitogène (PHÀ) et mesurée par cytométrie en flux à l'aide du kit Click-lt® EdU AF488. La corrélation entre la charge virale du TTV (axe x) et le nombre de lymphocytes ou la capacité de prolifération des lymphocytes T-CD3+ (axe y) a été déterminée en utilisant le coefficient de corrélation de Pearson (indiqué sur chaque graphique).
Abréviations : Allô. Allogénique ; GCSH. Greffe de cellules souches hématopoïétiques ; NK. Natural killer ; PHA. Phytohémagglutinine ; TTV. Torque teno virus
Corrélation globale de la charge virale plasmatique du TTV exprimée en Log cp/mL provenant de 41 plasmas de receveurs allo-GCSH par rapport à lïmmunophénotypage des lymphocytes T et à la capacité de prolifération des lymphocytes T-CD3+ (A). Corrélation détaillée de la charge virale TTV exprimée en Log cp/mL de 41 plasmas de receveurs allo-GCSH par rapport à la capacité de prolifération des lymphocytes T-CD3+ (B), le nombre absolu de lymphocytes (C) et le nombre de lymphocytes T-CD3+ (D). Les sous-types et le nombre absolu de lymphocytes ont été mesurés par cytométrie en flux dans le laboratoire d'immunologie de l'hôpital Edouard Herriot (Hospices Civils de Lyon) en utilisant un large panel de marqueurs membranaires des lymphocytes T. La capacité de prolifération des CD3+ a été déterminée après une stimulation de 3 jours avec un mitogène (PHA) et mesurée par cytométrie en flux à l'aide du kit de flux Click-lt® EdU AF488. La corrélation de la charge virale TTV (abscisses) et du nombre de cellules ou de la capacité de prolifération de lymphocytes T-CD3+ (ordonnées) a été déterminée en utilisant le coefficient de corrélation de Pearson (indiqué sur chaque graphique). (A) Les valeurs -0,5 et 0,5 représentées par des lignes pointillées noires correspondent aux bornes de l’intervalle de confiance de corrélation. Le rho de Pearson et l'intervalle de confiance (IC) à 95% pour tous les paramètres sont représentés respectivement par des points et une ligne noire. (B, C et D) Les patients sont représentés par des points noirs, les patients extrêmes par un carré et un triangle, la régression linéaire est représentée par une ligne noire.
[Fig 4] : Suivi descriptif chronologique des patients présentant des valeurs extrêmes de charge virale TTV. Description chronologique des principales étapes cliniques (en noir) et des épisodes infectieux (en gris) entre la GCSH et l'inclusion pour le patient "À" et le patient "B". Le patient "À" avait la charge virale TTV la plus faible et inversement le patient "B" avait la charge virale TTV la plus élevée.
Abréviations : CMV. Cytomégalovirus ; EBV. Virus d'Epstein-Barr ; GCSH. Greffe de cellules souches hématopoïétiques ; GvHD. Maladie du greffon contre l'hôte ; M. Mois.
[Fig 5] : Corrélation entre la charge virale TTV et les délais de GCSH.
Corrélation détaillée entre la charge virale plasmatique du TTV exprimée en Log cp/mL de 41 plasmas de receveurs allo-GCSH et les délais entre la GCSH et l'inclusion exprimés en mois. La corrélation de la charge virale TTV (abscisses) et des retards (ordonnées) a été déterminée en utilisant le coefficient de corrélation de Pearson (indiqué sur chaque graphique). Les patients sont représentés par des points noirs et la régression linéaire est représentée par une ligne noire.
Abréviations : HSCT, greffe de cellules souches hématopoïétiques ; TTV, Torque Teno Virus.
EXEMPLES
Exemple 1
Dans notre étude, nous avons évalué et comparé la corrélation entre la charge virale du TTV avec le nombre de cellules immunitaires et la fonction des cellules immunitaires dans la période de reconstitution immunitaire post-transplantation des receveurs allogéniques-GCSH (allo-GCSH).
Matériel et Méthodes
Population de l’étude
Des échantillons de sang total hépariné et des échantillons de plasma traités à l’EDTA provenant de patients recevant une allo-GCSH ont été obtenus de la cohorte prospective Vaccheminf, précédemment décrite (13). La cohorte a été approuvée par un comité d'examen régional (Comité de protection des personnes Sud-Est V, Grenoble, France, numéro 69HCL17_0769) et est enregistrée dans ClinicalTrial.gov (NCT03659773). Des patients adultes consécutifs ayant subi une allo-GCSH au service d'hématologie du CHU de Lyon ont été inclus prospectivement, une fois le consentement écrit du patient obtenu.
Lors de l'admission, les données collectées telles que les caractéristiques démographiques (âge, sexe) et les données cliniques (type de greffe, immunophénotypage, traitement immunosuppresseur, statut GvHD et traitement GvHD) ont été enregistrées à l'aide d'un formulaire électronique de rapport de cas (eCRF).
Parallèlement, 80 individus sains (HV) ont été recrutés parmi les donneurs de la banque de sang de Lyon (Etablissement Français du Sang, EFS). Selon les procédures normalisées de l'EFS pour le don de sang et les dispositions des articles R.1243-49 et suivants du code de la santé publique, une non-opposition écrite à l'utilisation du sang donné à des fins de recherche a été obtenue auprès de personnes en bonne santé. L'âge et le sexe des donneurs de sang ont été transférés de manière anonyme au laboratoire de recherche. Les autorisations réglementaires pour la manipulation et la conservation de ces échantillons ont été obtenues auprès du comité régional d'éthique (Comité de protection des personnes Sud-Est II, Bron, France) et du ministère français de la recherche (Ministère de l'Enseignement supérieur, de la Recherche et de l'innovation, Paris, France).
Quantification de la charge virale TTV
50 pL de volume d'élution d'ÀDN viral ont été extraits à partir de 200 pl des échantillons de plasma à l'aide d'un extracteur easyMag (bioMérieux, France) en suivant les instructions du fabricant. La présence et la charge de TTV ont ensuite été déterminées à l’aide du kit TTV R-GENE® (bioMérieux, Marcy-l’Etoile, France) comme précédemment décrit (14,15).
Test de prolifération des cellules T
Des cellules mononucléées de sang périphérique (PBMC) ont été isolées à partir des échantillons de sang frais héparinés (sang total héparinés) par centrifugation en gradient de densité Ficoll (U-04 ; Eurobio, Les Ulis, France). Ensuite, 105 cellules / puits ont été incubées 24 heures dans un milieu de culture supplémenté dans une plaque de culture cellulaire à 96 puits à 37° C sous 5% de CO2 (RPMI 1640 ; Eurobio). Les PBMC ont ensuite été stimulées en double avec un mitogène, la phytohémagglutinine (PHÀ) à 4 pg / mL (R30852801 ; Remel, Oxoid, Thermo Fisher Scientific, USA) et incubées pendant 72 heures. Les surnageants de culture des PBMC ont été récupérés pour réaliser un test de sécrétion de l’IFNy (IGRA, pour « IFNy- release assay ») à l’aide de cartouches Simple Plex sur le système nanofluidique ELLA (ProteinSimple, San José, CA, USA) selon les indications du fabricant. La prolifération des cellules T a été analysée dans les culots avec le kit de dosage par cytométrie en flux Click-iT™ Plus EdU Alexa Fluor™ 488 (C10420 ; Life Technologies, Carlsbad, CA, USA), qui mesure l'incorporation de 5-éthynyl-2'-désoxyuridine (EdU), selon le protocole publié (16). En bref, le pourcentage de cellules proliférantes EdU+ (parmi les cellules CD3+) a été obtenu par des analyses de cytométrie en flux effectuées sur un cytomètre en flux BD LSR Fortessa ™ (BD Biosciences, San José, CA, USA). Pour chaque expérience, on a mesuré au moins 2,5 x 103 cellules CD3+. Les données ont été analysées à l'aide du logiciel BD FACSDiva (version 8.0.3, BD Biosciences).
Immunophénotypage des cellules T post-transplantation
Les leucocytes et les lymphocytes T CD4+ et CD8+ ont été dénombrés au laboratoire d'immunologie de l'hôpital Edouard Herriot (Hospices Civils de Lyon). En outre, on a mesuré un large panel de marqueurs membranaires des lymphocytes T par cytométrie en flux sur sang total. On a ainsi compté les cellules T CD4+ et CD8+ naïves (CD45+ CCR7+), les cellules T CD4+ et CD8+ à mémoire centrale (CD45RA CCR7+), les cellules T CD4+ et CD8+ à mémoire effectrice (CD45 CCR7+) et les cellules T CD4+ et CD8+ à mémoire différenciée (CD45RA+ CCR7 ) comme décrit précédemment (14). Les résultats ont été exprimés en cellules/pL.
Analyse statistique
Les données dïmmunophénotypage, la charge virale TTV et la capacité de prolifération des cellules T sont exprimées en moyenne (plage). La charge TTV transformée au format Log a été utilisée pour l'analyse (Log copie/mL). Les différences entre les receveurs sains et allo-GCSH ont été calculées en utilisant un test t paramétrique non apparié avec la correction de Welch. Les corrélations ont été évaluées à l'aide d'un coefficient de corrélation rho de Pearson paramétrique. Des analyses de régression ont été effectuées pour évaluer l'association entre la variable dépendante (charge virale TTV) et les variables indépendantes (pourcentage de cellules proliférantes, nombre absolu de lymphocytes et nombre de lymphocytes T CD3+). L'analyse de la variance a été réalisée à l'aide de tests F. Les différences de charge en TTV plasmatique par rapport à différentes caractéristiques cliniques ont été estimées à l'aide du test de Mann-Whitney. Une valeur de p <0,05 a été considérée comme significative. Les analyses statistiques ont été réalisées à l'aide du logiciel GraphPad Prism® (version 5 ; logiciel GraphPad, La Jolla, CÀ, USA) et R (version 3.5.1 ).
Résultats
Caractéristiques de la cohorte
Des volontaires sains (n=80) et des receveurs d'allo-GCSH (n=41 ) ont été enrôlés entre mai 2018 et avril 2020. Les individus en bonne santé et les receveurs d'allo-GCSH ne différaient pas significativement en termes d'âge (médiane [El] : 56 [40-64] vs 46 [31 - 53] ans, respectivement) et de sexe (sex-ratio : 1 ,6 vs 1 ,4, respectivement). La durée médiane [El] après transplantation à l’enrôlement était de 6 [5-8] mois pour les receveurs d'allo-GCSH. À l'inclusion, 78% des receveurs d'allo-GCSH ont reçu des médicaments immunosuppresseurs (corticoïdes, inhibiteurs de la calcineurine, autres...), et 17% avaient une maladie chronique du greffon contre l'hôte [Table 1 ].
Charge virale de TTV dans les échantillons plasmatiques de volontaires sains et d'allo- GCSH
La charge virale en TTV a été étudiée dans des échantillons de plasma provenant de 80 receveurs sains et 41 receveurs allo-GCSH. La charge virale TTV a été détectée par PCR en temps réel dans 68% des échantillons sains (54/80). Concernant les receveurs allo-GCSH, tous les patients inclus dans l’étude avaient une valeur détectable de charge virale TTV. La charge virale moyenne (plage) du TTV était significativement plus élevée chez les receveurs d'allo-GCSH par rapport aux sujets sains (3,9 (0,7-7, 7) vs 2,1 (0,5-4, 3) Log copie/ml respectivement, p <0,0001 ) [Fig 2].
Corrélation entre la charge virale en TTV, les nombres de cellules T et capacité de prolifération de celles-ci.
Quand les receveurs d'allo-GCSH inclus 6 mois après la transplantation ont été pris en considération, la plupart de la population de sous-types de lymphocytes se situait dans des plages de valeurs normales (VN). Néanmoins, les quantités de lymphocytes T CD4+, CD4+ naïf, CD4+ mémoire centrale, CD4+ effecteurs mémoire en différenciation terminale, CD8+ naïf et CD8+ mémoire centrale, ainsi que le rapport CD4+/CD8+, étaient inférieures aux valeurs normales (voir le [Table 1]).
[Table 1] Caractéristiques de base des receveurs d’allo-GCSH.
Toutes les données de laboratoire ont été enregistrées à l’enrôlement des receveurs.
Figure imgf000047_0001
utilisant un large panel de marqueurs membranaires des lymphocytes T. Les valeurs normales indiquées sont fournies par le laboratoire de l'hôpital Edouard Herriot (Hospices Civils de Lyon).
Composition
Figure imgf000047_0002
Age, médiane [El] 56 [40-64]
Hommes, n (%) 24 (59)
Caractéristiques hématologiques et de transplantation, n (%)
* Maladies hématologiques sous- jacentes
Tumeurs myéloïdes et leucémies aiguës 37 (90)
Leucémie myéloïde aiguë et tumeurs 22 (54) associées
Lymphome/ leucémie lymphoblastique à
Figure imgf000047_0003
précurseurs B
Lymphome/ leucémie lymphoblastique précurseurs T
Figure imgf000047_0004
Tumeurs myélodysplasiques / 1 (2) myéloprolifératives
Syndromes myélodysplasiques 7 (17)
Tumeur à cellules dendritiques 1 (2) plasmacytoides blastiques
Tumeurs lymphoïdes, histiocytaires et dendritiques matures
Maladie de Hodgkin 1
Figure imgf000047_0005
Figure imgf000048_0001
RC avant la greffe, n (%) 39 (95)
Types de donneurs
Géno-identique 17 (41 )
Haplo-identique 6 (15)
Phéno-identique 18 (44)
Compatibilité totale 15 (37)
Incompatibilité HLA 3 (7)
Sources de cellules souches
Cellules du sang périphérique 28 (68)
Moelle osseuse 13 (32)
Conditionnement
MAC 17 (41 )
RIC 24 (59)
ICT 11 (27)
Complications post-greffe, n (%)
GvHD aigüe 30 (73)
Grade l/ll 21 /9
GvHD chronique 7 (17)
Limitée/Etendue 5/2
Durée depuis la greffe en mois (médiane [El]) 6 [5-8]
Immunophénotypage, médiane [El]
1659 (410-
Lymphocytes totaux (VN, 1000-2800/pL) 5350)
Lymphocytes T CD3+ (VN, 521 -1772/pL) 915 (175-3406)
Lymphocytes T CD3+ CD4+ (VN, 336-1126/pL) 273 (38-876)
CD4+ naïfs (CD45+CCR7+) (VN, 121 -456/pL) 45 (0-445)
CD4+ à mémoire centrale (CD45RA CCR7+) (VN, 92-
60 (1 -168)
341 /pL)
CD4+ effecteurs mémoire (CD45RA CCR7 ) (VN, 59-
163 (4-522)
321 /pL)
CD4+ effecteurs mémoire en différenciation terminale
19 (0-147)
(CD45RATCR7 ) (VN, 11 -102/pL) Lymphocytes T CD3+ CD8+ (VN, 125-780/pL) 602 (60-2779)
CD8+ naïfs (CD45+CCR7+) (VN, 86-257pL) 40 (0-241 )
CD8+ à mémoire centrale (CD45RA CCR7+) (VN, 19-93/pL)17 (0-127)
CD8+ effecteurs mémoire (CD45RA CCR7 ) (VN, 15-
286 (0-1517)
162/pL)
CD8+ effecteurs mémoire en différenciation terminale
257 (0-1474) (CD45RA+CCR7 ) (VN, 39-212/pL)
0,84 (0,13-
Rapport CD4+/CD8+ (VN, 0.9-6)
8,88)
Lymphocytes B CD20+ (VN, 64-593/pL) 287 (14-1299)
Traitement immunomodulateur post-greffe à l’enrôlement, n (%)
"traitement IS 32 (78)
Corticostéroïdes 5 (12)
Administration IVIG 23 (56)
Temps depuis la dernière administration IVIG, en mois 4 [2-5]
(médiane [El])
DLI 7 (17)
PCE 2 (5)
Abréviations: Allô, allogénique ; DLI, perfusion de lymphocytes du donneur ; GvHD, maladie du greffon contre l'hôte ; HLA, antigène leucocytaire humain; GSCH, greffe de cellules souches hématopoïétiques ; El, écart interquartile ; ICT, irradiation corporelle totale ; IS, immunosuppresseur ; IVIG, immunoglobulines polyclonales intraveineuses ; M4C, conditionnement myéloablatif ; NK, Natural Killer ; PCE, photochimiothérapie extracorporelle ; RC, rémission complète ; RIC, conditionnement d'intensité réduite ; VN, valeurs normales.
Par rapport aux sujets sains, outre une capacité de prolifération significativement plus faible parmi les cellules CD3+ chez les receveurs allo-GCSH (40,5% vs 21 ,3% respectivement, p <0,0001 ), on peut également remarquer une distribution hétérogène plus importante et significative (de [2,9% à 42,3 %] et [29,7% à 55,3%] pour allo-GCSH et sujets sains respectivement ; test F p = 0,0040), sous-tendant la variabilité interindividuelle dans la reconstitution immunitaire des receveurs d'allo- GCSH (non représenté graphiquement). En utilisant le test de corrélation de Pearson (rho [IC95] ), la corrélation la plus élevée a été observée entre la charge virale TTV et la capacité de prolifération des cellules T [Fig 3À] et [Fig 3B]. Il convient de noter qu'aucune corrélation significative n'a été observée avec le nombre total de lymphocytes ou un sous-ensemble particulier de cellules (par exemple CD3+) (rho de Pearson p = -0,39 [IC95% -0,62 à -0,09]), vs (p = 0,13 [-0,19 à 0,42]) et (p = 0,09 [-0,23 à 0,38]) respectivement) [Fig 3C] et [Fig 3D].
Caractéristiques cliniques des patients ayant des valeurs extrêmes de charge en TTV
En analysant au niveau individuel la corrélation entre la charge en TTV et la capacité de prolifération des cellules T en réponse à la stimulation PHÀ, nous avons remarqué que le patient (À, représenté par un carré) avec la charge virale la plus faible (0,65 Log copie/ml) avait un pourcentage élevé de cellules proliférantes (41 ,6%) et inversement le patient (B, représenté par un triangle) avec la charge virale la plus élevée (7,72 Log copie/ml) avait un faible pourcentage de cellules proliférantes (2,9%) [Fig 3B]. Ces deux patients (un homme et une femme) étaient dans la même tranche d'âge (50<âge<60) et étaient en rémission complète avant leur transplantation. Le patient (À) a reçu une greffe de cellules souches d'un donneur géno-identique tandis que le patient (B) a reçu une greffe de cellules sanguines périphériques d'un donneur phéno-identique. Le patient (À) a eu une évolution post-greffe simple sans faits cliniques particuliers entre la transplantation et l’enrôlement, c'est-à-dire aucun épisode infectieux, aucun GvHD et aucun traitement immunosuppresseur [Fig 4]. Inversement, le patient (B) a reçu un traitement immunosuppresseur lourd et a souffert de GvHD aiguë et de multiples infections bactériennes/vi raies sévères [Fig 4].
Discussion
Nous avons d'abord comparé la prévalence du TTV et les charges virales dans le plasma de deux populations distinctes, 80 sujets sains immunocompétents et 41 greffés allo- GCSH immunodéprimées de la cohorte prospective monocentrique VaccHemlnf (13).
Conformément à une étude récente (18), une prévalence de 68% du TTV a été observée dans les échantillons de sujets sains. En comparaison, le TTV a été trouvé dans 100% des échantillons de patients immunodéprimés. Nous avons également confirmé que la charge virale plasmatique du TTV était significativement plus élevée chez les receveurs d'allo-GCSH par rapport aux HV (10,19). Six mois après la greffe d'allo-CSH, certains patients sont donc incapables de réguler la charge virale TTV malgré un nombre suffisant de lymphocytes T. Aucune corrélation n'a été trouvée entre le délai posttransplantation [5-8 mois] et la charge virale plasmatique TTV. L'un des principaux résultats de cette étude est que la charge virale plasmatique du TTV était significativement plus élevée pour le receveur d'allo-GCSH (à 6 mois après la transplantation) par rapport aux sujets sains, confirmant ainsi des observations de Tyagi et al., 2013 (délai post-transplantation non précisé) ou Masouridi et al., 2016 (2- 3 mois après la greffe) (10,18). Ce résultat pourrait s'expliquer par le fait que les cellules T, principales cellules de la réponse immunitaire contre l'infection virale (19,20), sont l'un des principaux sites de réplication des TTV (21 ,22). Chez les receveurs allo-GCSH à 6 mois après la greffe, la multiplication des lymphocytes T est en cours, puisque le système immunitaire est en train de se reconstituer, ce qui fournit un grand nombre de cellules où le virus peut se répliquer. Il a également été décrit que la charge de TTV est maximale environ 3 à 6 mois après la transplantation avant de revenir à une valeur dite normale (23,24). On pourrait donc faire l'hypothèse que les TTV utiliseraient la croissance des cellules T, encore naïves et non fonctionnelles, pour se répliquer avant d'être finalement régulées par le système immunitaire et par les cellules T fonctionnelles, suggérant ainsi un lien important entre la charge virale TTV et la fonction immunitaire. Dans cette étude, on a évalué la corrélation entre la charge plasmatique du TTV et un marqueur quantitatif, la numération des cellules immunitaires, déjà évaluée dans plusieurs études mais avec des résultats contradictoires (17,23-25), et un marqueur qualitatif de la reconstitution immunitaire, la mesure de prolifération des cellules T après une stimulation non spécifique. Aucun impact de la période entre la transplantation allo-GCSH et l’enrôlement n'a été observé [Fig 5]. Malgré l’hétérogénéité de la distribution de valeur de prolifération des cellules T hétérogène, qui souligne la variabilité interindividuelle d'une population immunodéprimée, nous avons observé une corrélation plus élevée entre la charge virale TTV et la prolifération des cellules T qu'avec la numération des cellules immunes [Fig 3A]. Plus précisément, il s’agit de manière intéressante d’une corrélation inverse, suggérant que plus il y a de cellules immunitaires fonctionnelles et plus la charge en TTV est faible. Ce résultat est cohérent avec ceux décrits en 2013 par De Vlaminck et al. (11 ) en greffe d'organes solides où la diminution du niveau d'immunosuppression était corrélée à la diminution de la charge virale TTV. Cela correspond également aux nombreuses descriptions de la cinétique de charge virale du TTV après transplantation (23,26), dans lesquelles une phase de diminution liée aux traitements immunosuppresseurs est tout d’abord observée, suivie d’une phase de croissance associée à l'expansion des cellules immunitaires compétentes pour la réplication du TTV, puis d’une phase de stabilisation et enfin d’une diminution de la charge virale à un niveau basal, reflétant une reconstitution immunitaire fonctionnelle. On peut penser que, 6 mois après la greffe allo-GCSH, il y aurait un nombre suffisant de cellules immunitaires en expansion pour permettre une réplication significative des TTV, mais elles ne seraient pas suffisamment fonctionnelles pour réguler la charge virale du TTV. Les patients immunodéprimés seraient donc incapables de réguler la charge virale TTV malgré un nombre suffisant de lymphocytes T. C'est également le cas avec d'autres virus classiquement décrits chez les receveurs d'allo-GCSH tels que le cytomégalovirus (CMV) ou le virus d'Epstein-Barr (EBV) (24,27,28). Dans notre cohorte, 24% et 37% de nos patients ont été infectés respectivement par ces deux virus. Ceci est également cohérent avec les observations faites pour nos patients avec des valeurs de charge virale TTV extrêmes.
La charge virale du TTV a également été associée au nombre de cellules T CD8+/CD57+, un sous-type de lymphocyte décrit comme un marqueur potentiel de l'immunosénescence et augmentant au cours de certaines pathologies telles que les états d'immunodéficience acquise, les transplantations ou les infections virales persistantes. Tous ces résultats suggèrent qu'il existe donc un lien potentiellement important entre les TTV et la fonction du système immunitaire, notamment en ce qui concerne sa capacité à réguler la charge virale.
Dans notre étude, aucun impact de diverses caractéristiques cliniques (par exemple état, maladie sous-jacente, traitement immunosuppresseur ou GvHD) sur la charge en TTV n'a été observé ([Table 2]).
[Table 2] Comparaison de la charge plasmatique en TTV avec les caractéristiques cliniques of 41 receveurs d’allo-GCSH.
Toutes les données ont été enregistrées au moment de l’enrôlement du receveur. * D'après la révision de 2016 de la classification de ['Organisation mondiale de la santé des néoplasmes myéloïdes et lymphoïdes. # Traitements immunosuppresseurs inclus : globulines anti -thymocytes, cyclosporine, tacrolimus, méthotrexate, mycophénolate mofétil, cyclophosphamide, corticostéroïdes > 1 mg / kg> 21 jours. La charge plasmatique en TTV médiane [El] TTV a été comparée avec les données cliniques en utilisant le test de Mann-Whitney (***, p< 0,001). TTV Log cp/m Loll (%) median [El] value
Figure imgf000053_0001
Oui 23 (56) 3,9 [3, 0-4, 5]
0,59
Non 18 (44) 4,1 [3, 2-4, 7] Abréviations : GvHD, maladie du greffon contre l’hôte ; El, écart interquartile ; immunoglobulines polyclonales intraveineuses ; MAC, conditionnement myéloablatif ; RIC, conditionnement d'intensité réduite ; ICT, irradiation corporelle totale ; TTV, Torque Teno Virus.
En résumé, cette étude établit l’existence d’une corrélation entre la charge virale TTV et la fonction des cellules T, et montre que cette corrélation est indépendante du nombre de cellules.
Exemple 2
Comparaison entre le nombre de lymphocytes T, la capacité proliférative desdits lymphocytes T et la charge virale plasmatique en TTV entre plusieurs patients receveurs allogéniques-GCSH (allo-GCSH) de l’exemple 1.
La quantification de la charge virale en TTV, le test de prolifération et le dénombrement des lymphocytes T CD3+ ont été réalisés selon les mêmes protocoles que l’exemple 1. Les résultats sont présentés dans le tableau 3 ci-dessous.
Charge virale en TTV Nombre de lymphocyte Capacité
(log copies/mL) T CD3+ (cellules/pL) proliférative (%)
Figure imgf000054_0001
Patient 1 3,26 832 21 ,14
Patient 2 3,94 2011 21 ,32
Patient 3 0,65 222 41 ,60
Patient 4 7,70 262 4,08
[Table 3] Comparaison de la charge virale plasmatique en TTV, du nombre de lymphocytes T CD3+ et de la capacité proliférative desdits lymphocytes.
En comparant la charge virale en TTV et le nombre de lymphocytes T CD3+ on constate que pour une charge virale similaire chez les patients, le nombre de lymphocytes T CD3+ peut être significativement différent (Patient 1 vs Patient 2) et à l’inverse, pour une charge virale significativement différente (Patient 3 vs Patient 4), le nombre de lymphocytes T CD3+ peut être similaire. Par conséquent, cela confirme que la charge virale en TTV n’est pas corrélée au nombre de lymphocytes T CD3+.
Par contre, en comparant le nombre de lymphocytes T CD3+ et la capacité proliférative, on constate que chez des patients présentant une capacité proliférative des lymphocytes TCD3+ similaire, le nombre desdits lymphocytes peut être significativement différent (Patient 1 vs Patient 2). À l’inverse, lorsque le nombre de lymphocytes T CD3+ est similaire, la capacité proliférative peut être significativement différente (Patient 3 vs Patient 4).
Par conséquent, cela confirme que le nombre de lymphocytes T CD3+ n’est pas exclusivement corrélé à leur capacité proliférative, et qu’un nombre important de lymphocytes T CD3+ ne préjuge en rien de la capacité proliférative post stimulation desdits lymphocytes et donc de la fonctionnalité du système immunitaire, à l’inverse de la charge virale en TTV.
En effet, en regardant la charge virale en TTV, on constate qu’elle est inversement corrélée à la capacité proliférative des lymphocytes T CD3+ (Patient 3 vs Patient 4).
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Claims

Revendications
1. Méthode pour déterminer la capacité de prolifération des lymphocytes T chez un sujet, la méthode comprenant des étapes de : a) mesure de la charge en TTV à partir d’un échantillon biologique dudit sujet ; et b) détermination de la capacité de prolifération des lymphocytes T au vu de la charge virale mesurée en a).
2. Méthode selon la revendication 1 , caractérisée en ce que la charge en TTV est mesurée par amplification, séquençage ou hybridation d’une séquence de TTV, préférablement par amplification, plus préférablement par PCR en temps réel.
3. Méthode selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que l’échantillon biologique est un échantillon de sang total, de plasma ou de sérum.
4. Méthode selon l’une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que la détermination de l’étape b) comprend la comparaison de la charge en TTV mesurée en a) avec une charge en TTV de référence.
5. Méthode selon l’une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que le sujet a reçu une greffe.
6. Méthode selon la revendication 5, caractérisée en ce que le sujet a reçu une greffe de cellules souches hématopoïétiques (GCSH), préférentiellement une allo-GCSH.
7. Méthode selon l’une quelconque des revendications 5 ou 6, caractérisée en ce que le sujet a subi un conditionnement, préférablement myéloablatif ou atténué, avant la greffe.
8. Méthode de suivi de l’activité des lymphocytes T chez un sujet ayant reçu une allo- GCSH, la méthode comprenant des étapes de : a) mesure de la capacité de prolifération des lymphocytes T chez le sujet à un premier instant selon l’une quelconque des revendications 1 à 6 ; b) comparaison de la capacité de prolifération des lymphocytes T mesurée en a) avec la capacité de prolifération des lymphocytes T de référence ; et c) détermination de la variation de l’activité des lymphocytes T du sujet au vu de la comparaison de l’étape b).
9. Méthode de suivi de l’activité des lymphocytes T chez un sujet ayant reçu une greffe, de préférence une GCSH, de préférence encore une allo-GCSH, la méthode comprenant les étapes de : a) détermination de la charge virale en TTV à partir d’un échantillon biologique du patient prélevé à un premier instant ; b) détermination de la charge virale en TTV à partir d’un échantillon biologique du patient prélevé à un second instant, ce second instant étant plus tardif que le premier instant de l’étape a) ; c) comparaison des charges virales en TTV mesurées en a) et b) ; et d) détermination de la variation de charge en TTV du patient au vu de la comparaison de l’étape c).
10. Méthode de détermination de la susceptibilité aux infections microbiennes chez un sujet ayant reçu une allo-GCSH, la méthode comprenant des étapes de : a) mesure de la capacité de prolifération des lymphocytes T chez le sujet à un premier instant selon l’une quelconque des revendications 1 à 6 ; b) comparaison de la capacité de prolifération des lymphocytes T mesurée en a) avec une la capacité de prolifération des lymphocytes T de référence ; et c) détermination de la susceptibilité aux infections microbiennes du sujet au vu de la comparaison de l’étape b).
11. Méthode selon la revendication 10, caractérisée en ce que l’infection microbienne est une infection virale, bactérienne, protozoaire ou fongique.
12. Méthode de détermination de la susceptibilité à la maladie du greffon contre l'hôte (GvHD) chez un sujet ayant reçu une allo-GCSH, la méthode comprenant des étapes de : a) mesure de la capacité de prolifération des lymphocytes T chez le sujet à un premier instant selon l’une quelconque des revendications 1 à 6 ; b) comparaison de la capacité de prolifération des lymphocytes T mesurée en a) avec une la capacité de prolifération des lymphocytes T de référence ; et c) détermination de la susceptibilité à la GvHD du sujet au vu de la comparaison de l’étape b).
13. Méthode selon l’une quelconque des revendications 8 à 12, caractérisée en ce que la capacité de prolifération des lymphocytes T de référence est la capacité de prolifération des lymphocytes T d’un individu sain ou la capacité de prolifération des lymphocytes T d’un individu immunodéprimé.
14. Méthode selon l’une quelconque des revendications 8 à 12, caractérisée en ce que la capacité de prolifération des lymphocytes T de référence est la capacité de prolifération des lymphocytes T mesurée chez le sujet à un second instant.
15. Utilisation de la mesure de la variation de la charge en TTV chez un sujet pour déterminer la capacité de prolifération des lymphocytes T dudit sujet.
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