FR3115795A1

FR3115795A1 - Utilisation du virus torque teno (ttv) en tant que marqueur pour determiner la capacite de proliferation des lymphocytes t

Info

Publication number: FR3115795A1
Application number: FR2011328A
Authority: FR
Inventors: Karen BRENGEL-PESCE; Sophie ASSANT-TROUILLET; William MOUTON
Original assignee: Biomerieux SA; Universite Claude Bernard Lyon 1 UCBL; Hospices Civils de Lyon HCL
Current assignee: Biomerieux SA; Universite Claude Bernard Lyon 1 UCBL; Hospices Civils de Lyon HCL
Priority date: 2020-11-04
Filing date: 2020-11-04
Publication date: 2022-05-06
Also published as: EP4240873A1; CN116802320A; US20240011092A1; JP2023547961A; WO2022096834A1

Abstract

L’invention a pour objet une méthode pour déterminer la capacité de prolifération des lymphocytes T chez un sujet, la méthode comprenant des étapes suivantes : a) mesure de la charge en Torque Teno Virus à partir d’un échantillon biologique dudit sujet ; et b) détermination de la capacité de prolifération des lymphocytes T au vu de la charge virale mesurée en a).

Description

UTILISATION DU VIRUS TORQUE TENO (TTV) EN TANT QUE MARQUEUR POUR DETERMINER LA CAPACITE DE PROLIFERATION DES LYMPHOCYTES T

INTRODUCTION

Le système immunitaire défend l’organisme contre les agressions telles que les infections pathogènes, la transformation cellulaire et les dommages physiques ou chimiques. Un individu immunocompétent est ainsi capable de déclencher une réponse immunitaire protectrice contre une stimulation antigénique.

En revanche, quand le système immunitaire est affaibli ou totalement absent, une immunodéficience se manifeste. Celle-ci prend diverses formes et peut affecter le système immunitaire inné ou adaptatif, ou les deux, selon la source du déficit. Dans la grande majorité des cas, l'immunodéficience est acquise au cours de la vie. Elle peut résulter d’une pathologie, infectieuse ou non (par exemple une infection au VIH), ou être produite par une thérapie, comme une radiothérapie ou une chimiothérapie. L’état d’immunodéficience est particulièrement dangereux, car le patient présente alors une susceptibilité accrue aux infections secondaires par des agents pathogènes tels que les bactéries, les virus, les parasites ou encore les champignons. Par exemple, l’utilisation de traitements immunosuppressifs dans les greffes, notamment les greffes de cellules souches hématopoïétiques (GCSH), peut entraîner des infections microbiennes récurrentes ou potentiellement mortelles chez les patients.

Il est donc important de pouvoir déterminer la fonctionnalité du système immunitaire d’un sujet. Cela permet notamment d’adapter une réponse thérapeutique appropriée quand une immunodéficience est identifiée.

Un ensemble de techniques est disponible pour mesurer l'immunocompétence, sans qu’aucune ne soit complétement satisfaisante. Ces techniques mesurent entre autres la réponse immunitaire à médiation cellulaire et comprennent notamment l'analyse des populations de lymphocytes, en particulier la numération des lymphocytes T CD4⁺ou la mesure du rapport des lymphocytes T CD4⁺/CD8⁺, la mesure de la capacité de prolifération lymphocytaire, la mesure de l’activité cytotoxique des lymphocytes T, la mesure de la réponse anticorps, le marquage des tétramères, la détection des cytokines produites, l’ELISpot, etc.

Certaines de ces techniques, comme par exemple la numération des lymphocytes T, donnent un résultat qui ne reflète pas nécessairement l’activité de ces cellules et donc l’activité du système immunitaire. Un nombre absolu de lymphocytes T ne dit rien sur la capacité de ces cellules à se multiplier. Par exemple, il n’est pas possible de dire qu’un faible nombre de lymphocytes T après une GCSH signifie que ces lymphocytes T sont incapables de se multiplier et de défendre le patient contre une infection microbienne. D’autre part, les tests de prolifération cellulaire, sont difficiles à mettre en œuvre en routine et peuvent difficilement être standardisés. Il existe donc toujours un besoin pour une méthode simple et facile d’utilisation permettant de déterminer l’immunocompétence.

Le Torque Teno Virus (TTV) est un virus de la famille desAnelloviridaeinitialement identifié en 1997 chez un patient japonais présentant une hépatite post-transfusionnelle (1-7). Le TTV est un virus à ADN circulaire simple brin de petite taille (environ 3.8 kb), comprenant une région codante présentant une forte diversité génétique et une région non codante (UTR) bien conservée. L’utilisation d’amorces permettant d’amplifier des séquences dans cette région non codante a mis en évidence une prévalence mondiale élevée du TTV (autour de 90%). Le TTV produit des infections chroniques sans manifestation clinique clairement associée. On parle de virus apathogène ou orphelin. De nombreuses études se sont ainsi intéressées à l’implication du TTV en pathologie humaine, notamment dans certaines pathologies hépatiques, sans qu’un rôle clair puisse être identifié pour ce virus.

Il a toutefois été observé que la charge en TTV est plus élevée chez les sujets présentant une immunodéficience. Par exemple, des niveaux importants de TTV sont trouvés chez des patients ayant reçu des traitements immunosuppresseurs dans le cadre de greffes d’organe (Rezahosseini et al.,Transplant Rev (Orlando). 33(3) : 137-144, 2019) ou de GCSH (Albert et al.,Med Microbiol Immunol. 208(2) : 253-258, 2019). De même, il semblerait exister une relation entre la charge en TTV et des déficiences du système immunitaire associées à des infections chroniques ou au cancer (Zhong et al.,Ann NY Acad Sci. 945 : 84-92, 2001 ; Fogli et al.,Clin Dev Immunol. 2012 : 829584, 2012 ; Béland et al.,J Infect Dis. 209(2) : 247-254, 2014 ; Görzer et al.,J Heart Lung Transplant. 33(3) : 320-323, 2014), tandis que le TTV est retrouvé en association avec des infections virales immunosuppressives telles que les infections au HIV ou au HCV.

Ces observations ont conduit à la suggestion que la charge en TTV pourrait être un marqueur de l'immunocompétence (8–11). Néanmoins, dans ces études, l'immunocompétence n’a été évaluée que par le nombre de cellules immunitaires ou par la survenue d’événements indésirables cliniques (11-14). Or, il a déjà été suggéré que la quantité de cellules n'est pas nécessairement associée à la qualité des cellules, c'est-à-dire que l’activité des cellules T n’est pas reflétée par leur nombre (12).

Il existe donc toujours un besoin d’une méthode simple et fiable permettant de déterminer si des cellules T peuvent être activées chez un sujet.

DESCRIPTION DETAILLEE

La présente invention a pour objet une méthode pour déterminer si des lymphocytes T sont fonctionnels chez un sujet. Plus précisément, les inventeurs ont montré que la capacité proliférative des lymphocytes T est inversement corrélée à la charge en torque teno virus (TTV pour Torque Teno Virus), notamment chez un patient ayant reçu une greffe, plus particulièrement une GCSH. La charge virale TTV est inversement corrélée à la prolifération des lymphocytes T : ainsi plus la charge TTV est importante et moins les lymphocytes sont aptes à proliférer. La charge virale n’est pas corrélée spécifiquement à un autre paramètre, que ce soit le nombre de cellules T ou un critère clinique, soulignant la pertinence de la corrélation identifiée. La charge en TTV est un marqueur spécifique de l’activité des cellules T, notamment chez les patients ayant reçu une greffe et en particulier une GCSH. L’évolution de la fonctionnalité du système immunitaire peut donc être suivie chez un sujet par une simple mesure de sa charge en TTV. Il est ainsi possible d’évaluer rapidement l’état fonctionnel du système immunitaire sans devoir mettre en œuvre les étapes techniques lourdes habituellement utilisées pour évaluer ce paramètre.

Méthodes de détermination de la capacité de prolifération des cellules T

La présente description a pour objet une méthode de détermination de la capacité de prolifération des cellules T chez un sujet, ladite méthode comprenant la mesure de la charge en TTV chez le patient.

Les « lymphocytes T » ou « cellules T » sont des cellules essentielles du système immunitaire chargées d’amplifier ou de freiner la réponse immune. Préférentiellement, les lymphocytes T se caractérisent par l’expression d’un marqueur membranaire appelé CD3 et d’un récepteur spécifique, le TCR (pour «T cell receptor»), lequel est directement impliqué dans la reconnaissance antigénique. Avantageusement, les lymphocytes T peuvent exprimer d’autres marqueurs de surface, notamment CD4 et CD8, qui correspondent à des catégories fonctionnelles spécifiques de lymphocytes T. Dans le cadre d’une GCSH, les lymphocytes T en jeu peuvent notamment être les quelques lymphocytes T résiduels du receveur ou les lymphocytes T du donneur présents dans le greffon. Ils peuvent aussi être des lymphocytes T naïfs issus de la différenciation des cellules souches et progéniteurs du donneur dans le thymus du receveur.

L’expression « activation des lymphocytes T » ou « activation des cellules T » se réfère ici au processus par lequel des cellules T naïves deviennent capables de participer à la réponse immunitaire. L’activation des cellules T conduit notamment à la prolifération de celles-ci. L’activation des cellules T est ainsi avantageusement évaluée en mesurant la prolifération des cellules T. La mesure de la prolifération des cellules T est habituellement réalisée par des techniques bien connues de la personne du métier mais nécessitant une lourde mise en œuvre. En particulier, il est bien connu que les lymphocytes T sont capables de proliférer en présence d'un mitogène, comme par exemple la concanavaline A (Con A), le mitogène de la phytolaque (PWM pour « pokeweed mitogen ») et la phytohémagglutinine (PHA), indépendamment de la spécificité de leur TCR. Les méthodes de l’art antérieur évaluent la capacité de prolifération des lymphocytes T en mesurant la synthèse de l’ADN des lymphocytes T après leur stimulation par un mitogène. Cependant, ces méthodes nécessitent une mise en œuvre lourde et peuvent ainsi difficilement être utilisées en routine. En comparaison, la méthode décrite ici est particulièrement simple et robuste.

Selon un premier aspect, il est décrit ici une méthode de détermination de la capacité de prolifération des cellules T chez un sujet, ladite méthode comprenant :
a) la mesure de la charge en TTV à partir d’un échantillon dudit sujet ; et
b) la détermination de la capacité de prolifération des cellules T du sujet au vu de la charge virale mesurée en a).

Selon un mode préféré de réalisation, une forte charge en TTV indique que les cellules T présentent une capacité proliférative peu importante. Inversement, une faible charge en TTV indique que les cellules T présentent une capacité proliférative importante.

La présente méthode est plus particulièrement adaptée pour évaluer les capacités de prolifération des cellules T chez un sujet susceptible de présenter un état d’immunodéficience.

Le terme « immunodéficience » (ou « immunodépression » ou « immunosuppression »), tel qu'utilisé ici, fait référence à la réduction ou à la suppression de la fonction du système immunitaire. Un « état d’immunodéficience » désigne donc ici un état dans lequel le système immunitaire d'un sujet est réduit ou absent. Préférentiellement, la réponse immunitaire humorale et/ou cellulaire envers les agents pathogènes infectieux est défectueuse chez les sujets présentant un état d’immunodéficience. Plus préférentiellement, l’état d’immunodéficience se manifeste au moins par une diminution de la réponse cellulaire.

L’immunodéficience peut être primaire ou secondaire. Les immunodéficiences primaires regroupent les déficits innés du système immunitaire avec une susceptibilité accrue à des infections. En revanche, l'immunodéficience secondaire (ou immunité acquise) correspond à une perte de la fonction immunitaire qui apparaît au cours de la vie, comme, par exemple mais sans limitation, à la suite d'une exposition à des agents pathogènes, une maladie (par exemple, un lymphome ou une leucémie), une thérapie visant à traiter une maladie (par exemple, une radiothérapie ou une chimiothérapie), une immunosuppression ou encore le vieillissement. Les agents pathogènes pouvant entraîner une immunodéficience comprennent entre autres le virus de l'immunodéficience humaine (VIH) 1 (VIH-1), VIH-2,Treponema pallidum,Plasmodium falciparum,Plasmodium malariae,Plasmodium ovale,Plasmodium vivax,Plasmodium knowlesi, le virus de l'hépatite B (VHB), le virus de l'hépatite C (VHC), les prions, le virus du Nil occidental, le parvovirus,T r ypanosoma cruzi, des coronavirus tels que le SARS-COV-1 et le SARS-COV-2, et/ou le virus de la vaccine. L’immunodéficience peut également être induite délibérément avec des médicaments, par exemple en préparation d'une greffe, comme par exemple une greffe d'organe (par exemple, de rein, de foie, de cœur, de poumon, du pancréas, de l’intestin, etc.) ou une GCSH, pour empêcher le rejet de la greffe.

Préférentiellement, l’immunodéficience selon la présente description est une immunodéficience secondaire (ou acquise). Ainsi, l’immunodéficience décrite ici peut être de toute origine telle que, par exemple, mais sans limitation, un traitement immunosuppresseur, des effets secondaires immunosuppresseurs de médicaments ou d'une thérapie comprenant la radiothérapie, des traits ou maladies génétiques immunosuppresseurs héréditaires, des maladies immunosuppressives acquises telles que le SIDA, des cancers, comme la leucémie ou le lymphome. En particulier, l’immunodéficience est liée à une greffe, notamment une GCSH.

Dans un mode de réalisation particulier, le sujet susceptible de présenter un état d’immunodéficience est un sujet ayant reçu une greffe. Selon un mode de réalisation plus particulier, cette greffe est une GCSH.

Plus particulièrement, la description porte sur une méthode pour déterminer la capacité de prolifération de cellules T chez un sujet, le sujet ayant reçu une GCSH, la méthode comprenant des étapes de :
a) mesure de la charge en TTV à partir d’un échantillon du sujet ; et
b) détermination de la capacité de prolifération des cellules T du sujet au vu de la charge virale mesurée en a).

Par « cellule souche », on entend désigner ici des cellules non différenciées mais spécialisées ayant deux propriétés principales : l’aptitude à s'auto-renouveler et à se maintenir en place durant de très longues périodes, et la capacité à générer tous les types de cellules différenciées d’un tissu spécifique, ce qui définit leur multipotence. Les « cellules souches hématopoïétiques » ou « CSH » désignent ici plus particulièrement les cellules souches qui peuvent conduire aux différentes cellules du sang (notamment globules rouges, plaquettes, granulocytes, lymphocytes T ou B, et monocytes). Les CSH telles qu’on les entend ici ne sont pas obtenues à partir d’embryons humains ou animaux. Les CSH peuvent avantageusement être obtenues à partir du sang de cordon ombilical. Alternativement, elles peuvent être obtenues à partir du sang périphérique. Il est aussi possible de les obtenir à partir de moelle osseuse.

La « greffe de cellules souches hématopoïétiques » ou « GCSH » ou « HSCT » (pour « hematopoietic stem cells transplant ») telle qu’on l’entend ici est une procédure thérapeutique dans le domaine de l'hématologie dans laquelle des CSH, généralement dérivées de la moelle osseuse, du sang périphérique ou du sang du cordon ombilical, sont transplantées depuis un donneur vers un receveur.

La GCSH est une approche potentiellement curative pour une variété de pathologies. Celles-ci sont en particulier les hémopathies, notamment les hémopathies malignes, comme les leucémies aiguës, les myélodysplasies et les lymphomes, et les hémopathies non malignes de pronostic sévère, y compris des aplasies médullaires constitutionnelles et des hémoglobinopathies, les tumeurs solides, les déficits immunitaires et les déficits enzymatiques du tissu hématopoïétique, comme la maladie de Gaucher, par exemple. Préférablement, la pathologie est une hémopathie, plus préférentiellement, une hémopathie maligne.

La GCSH peut être autologue (les propres cellules souches du patient sont utilisées, c’est-à-dire que le donneur et le receveur sont une seule et même personne) ou allogénique (ci-après « allo-GCSH » : les cellules souches proviennent d'un donneur qui n’est pas le receveur). De préférence, la GCSH dans la méthode décrite ici est une greffe allogénique.

Selon ce mode de réalisation particulier, la description porte sur une méthode pour déterminer la capacité de prolifération de cellules T chez un sujet, le sujet ayant subi une allo-GCSH, la méthode comprenant des étapes de :
a) mesure de la charge en TTV à partir d’un échantillon du sujet ; et
b) détermination de la capacité de prolifération des cellules T du sujet au vu de la charge virale mesurée en a).

Dans le cas d’une greffe, notamment d’une allogreffe, des traitements de préparation (ou traitement de conditionnement) sont administrés avant la greffe pour détruire ou de réduire l’activité du système immunitaire du receveur. Ces conditionnements visent à prévenir le rejet de greffe et réduire la charge tumorale.

Le conditionnement peut être myéloablatif. Un conditionnement « myéloablatif » tel qu’on l’entend ici est un conditionnement qui détruit les cellules de la moelle osseuse du receveur. Avantageusement, le conditionnement myéloabalatif détruit également le système immunitaire du receveur, facilitant ainsi la prise du greffon. Le conditionnement myéloabalatif peut notamment comprendre une ou plusieurs étapes de chimiothérapie et/ou de radiothérapie. Par exemple, deux des conditionnements couramment utilisés sont les associations busulfan-cyclophosphamide et cyclophosphamide-irradiation corporelle totale (ICT). Préférablement, le conditionnement myéloabalatif est appliqué à un patient de moins de 55 ans, préférablement moins de 50 ans.

Alternativement, le conditionnement est un conditionnement non myéloablatif, atténué, ou encore appelé « à intensité réduite ». Un « conditionnement atténué » est un conditionnement qui ne détruit pas totalement la moelle osseuse du receveur, mais entraîne une inhibition du système immunitaire de celui-ci, facilitant ainsi la prise du greffon. Un tel conditionnement atténué comprend préférablement l’administration d’un immunosuppresseur. Par exemple, un protocole de conditionnement atténué peut comprendre l’association de fludarabine, de cyclophosphamide ou d’un autre agent alkylant, et d’une ICT. Un autre exemple de protocole de conditionnement atténué peut comprendre l’association de fludarabine, de sérum antilymphocytaire (SAL) et de busulfan. Un autre exemple de protocole de conditionnement atténué peut comprendre l’association de fludarabine, d’idarubicine et d’aracytine. Enfin, un autre exemple de protocole de conditionnement atténué peut comprendre l’association de fludarabine avec une mini irradiation complète. Dans un mode de réalisation préféré, le conditionnement atténué est appliqué à un patient ayant moins de 75 ans.

Le terme « donneur », comme utilisé ici, se réfère au sujet dont les CSH sont transférées au receveur. On entend ici par « receveur » ou « patient » le sujet qui reçoit les CSH du donneur. Dans un mode de réalisation particulier, le receveur est affecté par une pathologie à laquelle la GCSH doit apporter un bénéfice thérapeutique, qu’il soit complet ou partiel.

Tel qu'il est utilisé ici, le terme « sujet » fait référence à un vertébré, de préférence un mammifère et, de manière préférée entre toutes, un humain.

On entend ici par « échantillon biologique » tout échantillon qui peut être prélevé à partir d'un sujet. De façon générale, l’échantillon biologique doit permettre la détermination de la charge en TTV. L’échantillon biologique, tel qu’on l’entend ici, comprend entre autres, mais sans s'y limiter, le sang total, le sérum, le plasma, les expectorations, les prélèvements naso-pharyngés, l'urine, les selles, la peau, le liquide céphalorachidien, la salive, les sécrétions gastriques, le sperme, le liquide séminal, les larmes, le tissu ou le liquide rachidien, le liquide cérébral, un échantillon de ganglion trijumeau, un échantillon de ganglion sacré, le tissu adipeux, le tissu lymphoïde, le tissu placentaire, le tissu de l'appareil reproducteur supérieur, le tissu de l'appareil gastro-intestinal, le tissu génital et le tissu du système nerveux central. L'échantillon à tester peut être utilisé directement à partir de la source biologique ou à la suite d'un prétraitement permettant de modifier le caractère de l'échantillon. Par exemple, un tel prétraitement peut inclure la préparation de plasma à partir de sang, la dilution de fluides visqueux et ainsi de suite. Des procédés de prétraitement peuvent aussi impliquer la filtration, la précipitation, la dilution, la distillation, le mélange, la concentration, l'inactivation de composants perturbateurs, l'addition des réactifs, une lyse, etc. En outre, il peut être bénéfique de modifier un échantillon d'essai solide pour former un milieu liquide ou pour libérer l'analyte. De préférence, l'échantillon biologique est du sang ou un dérivé de celui-ci, tel que le plasma ou le sérum. Ainsi, l'échantillon biologique est préférablement du sang, du plasma ou du sérum provenant du sujet testé.

Par « virus torque teno ou Torque Teno Virus ou TTV », on entend ici un virus de la famille desAnelloviridae. Un TTV tel qu’on l’entend ici est un virus non enveloppé, avec un génome d'ADN simple brin circulaire de polarité négative. Par « génome de TTV », il est ici fait référence aux génomes de tous lesAnelloviridae, y compris les alphatorquevirus (TTV), les betatorquevirus (TTMV), les gammatorquevirus (TTMDV). A titre d’exemple, il est ici fait référence au génome de la souche prototype du virus Torque Teno, TTV-1a. Plus spécifiquement, un exemple d'un génome TTV est une séquence telle que par exemple celle qui est représenté par la SEQ ID No 1 et dont le numéro d'accession Genbank est AB017610.

Préférentiellement, le génome des TTV a une taille d’environ 3,8 kb. La structure et l’organisation génomique des TTV est bien connue (cf. par exemple se référer à Biagini,Curr Top Microbiol Immunol.331 : 21-33, 2009) et est exemplifiée sur la . Le génome du TTV peut ainsi être divisé en une région non traduite (UTR) d’environ 1 à 1,2 kb et une région codante potentielle d’environ 2,6 à 2.8 kb. La région codante contient notamment deux grandes phases ouvertes de lecture : ORF1 et ORF2, codant deux protéines de 770 et 202 résidus respectivement. Dans le génome de TTV représenté par la SEQ ID No 1, les phases ouvertes de lecture ORF1 et ORF2 sont comprises entre les nucléotides 589-2901 et 107-715, respectivement. Le génome du TTV peut posséder d’autres phases ouvertes de lecture. Par exemple, le génome des TTV peut comprendre deux phases additionnelles de lecture, ORF3 et ORF4 .

En revanche, la région non traduite UTR est bien conservée. Elle comprend notamment une séquence riche en GC susceptible de former une structure secondaire. L’amplification de séquences choisies dans la région non traduite UTR-5’ a permis de démontrer que la prévalence du virus est très élevée à travers l’ensemble de la population mondiale (Hu et al.,J Clin Microbiol .43(8) : 3747–3754, 2005). Cette région comprend notamment une séquence de 128 bp qui peut être amplifiée par la trousse de diagnostic TTV R-GENE® (bioMérieux, France).

La « charge virale » telle qu’on l’entend ici est le nombre de particules virales présentes dans un échantillon biologique. La charge virale reflète la gravité d'une infection virale. La charge virale peut être déterminée en mesurant la quantité de l’un des composants du virus (ADN génomique, ARNm, protéine...) dans cet échantillon biologique. De préférence, la charge virale se réfère ainsi à la proportion de séquences d'acide nucléique appartenant audit virus dans un échantillon biologique. Plus préférentiellement, la charge virale représente le nombre de copies du génome dudit virus dans un échantillon biologique.

Dans le cas présent, la charge virale représente la charge en TTV. La « charge en TTV » correspond ici plus particulièrement à la charge virale du TTV, c’est-à-dire au nombre de particules virales de TTV présentes dans un échantillon biologique. La charge en TTV chez un sujet signifie la charge virale de tout TTV hébergé par ledit sujet. La charge en TTV peut être déterminée en mesurant la quantité d’un composant de TTV, comme un acide nucléique ou une protéine, dans cet échantillon biologique. De préférence, la charge en TTV correspond à la quantité de séquences d'acide nucléique de TTV présentes dans un échantillon biologique. Ainsi, la détermination de la charge en TTV chez un sujet selon l'invention comprend l'estimation du nombre de séquences de tous les TTV dans un échantillon biologique dudit sujet. En particulier, il n'y a pas de sélection, selon l'invention, de souches spécifiques de TTV à mesurer dans ledit échantillon biologique. De préférence, la détermination de la charge en TTV comprend la détermination de la quantité de copies virales actives et/ou inactives. Elle consiste à déterminer la quantité de copies virales circulantes, intégrées ou latentes.

Les niveaux de TTV – et donc la charge en TTV - peuvent être déterminés en mesurant les niveaux d'ADN de TTV, d'ARN de TTV ou de protéines de TTV. Le procédé selon l'invention peut ainsi comprendre une autre étape préliminaire, entre le prélèvement de l'échantillon du patient et l'étape a) telle que définie ci-dessus, correspondant à la transformation de l'échantillon biologique en un échantillon d'ADN double brin, ou en un échantillon d'ARNm (ou d'ADNc correspondant), ou en un échantillon de protéines, qui est ensuite prêt à être utilisé pour la détectionin vitrode TTV à l'étape a). La préparation ou l’extraction d’ADN viral double brin, d’ARNm (ainsi que la rétro-transcription de celui-ci en ADNc) ou de protéines à partir d’un échantillon cellulaire ne sont que des procédures de routine bien connues de la personne du métier. L’ADN double brin peut correspondre soit à l'ensemble du génome des TTV, soit seulement à une partie de celui-ci. Une fois qu'un ADN double brin, un ARNm (ou un ADNc correspondant) ou un échantillon de protéines prêt à l'emploi est disponible, la détection des TTV peut être effectuée, selon le type d'échantillon ou de transformation, soit par l’ADN génomique (c'est-à-dire basé sur la présence d'au moins une séquence constituée d'au moins une partie du génome de TTV), soit par l’ARNm (c'est-à-dire basé sur la teneur en ARNm de TTV dans l'échantillon), soit au niveau protéique (c'est-à-dire basé sur la teneur en protéines de TTV dans l’échantillon).

De préférence, les niveaux de TTV sont déterminés en mesurant les niveaux d’acide nucléique de TTV, plus préférablement d’ADN de TTV.

Les méthodes de détection d'un acide nucléique dans un échantillon biologique comprennent, entre autres, l'amplification, y compris l'amplification par PCR, le séquençage, l'hybridation avec une sonde marquée et toutes les autres méthodes connues de la personne du métier.

Selon un premier mode de réalisation, la charge en TTV est déterminée par amplification des séquences de TTV.

Une approche préférée consiste à amplifier des séquences qui sont connues pour être spécifiques du génome des TTV. Par « séquence spécifique du génome des TTV », on entend ici une séquence qui est présente dans la majorité des TTV connus, mais qui est absente de la majorité des autres virus, notamment de la majorité des autres anellovirus. Préférablement, une séquence spécifique de TTV est présente dans au moins 90%, au moins 95%, au moins 96>%, au moins 97%, au moins 98% ou au moins 99% des génomes de TTV connus. Plus préférablement, elle est présente dans 100% des génomes de TTV connus. Alternativement, une séquence spécifique des TTV est présente dans moins de 10%, moins de 5%, moins de 4%, moins de 3%, moins de 2%, moins de 1% des génomes d’anellovirus connus autres que les TTV. Préférablement, une séquence spécifique des TTV est absente de tous les génomes d’anellovirus connus autres que les TTV. Une telle séquence est par exemple une séquence comprise dans la région non traduite UTR. Plus particulièrement, une telle séquence correspond à la séquence de 128 bp de la région non traduite 5’-UTR qui est amplifiée à l’aide de la trousse de diagnostic TTV R-GENE® (bioMérieux, France).

Ainsi selon ce mode de réalisation, le procédé décrit ici comprend l'utilisation d’amorces et de sondes pour l’amplification de séquences connues pour être spécifiques du génome des TTV. Comme il est habituel dans ce domaine technique, ces amorces sont préférablement des oligonucléotides. Par exemple, ces amorces peuvent comprendre moins de 30 nucléotides, au moins de 25 nucléotides, moins de 20 nucléotides, moins de 15 nucléotides ou moins de 12 nucléotides. Alternativement, ces amorces comprennent au moins 12, 15, 20,25 ou 30 nucléotides. Préférablement, les amorces utilisées comprennent entre 12 et 20 nucléotides, entre 12 et 25 nucléotides, entre 15 et 20 nucléotides ou encore entre 15 et 25 nucléotides. La personne du métier saura déterminer la longueur et la séquence de l’amorce d’amplification à utiliser une fois choisie la séquence spécifique des TTV. Elle pourra par exemple utiliser les mêmes amorces que celles qui sont fournies dans la trousse de diagnostic TTV R-GENE® (bioMérieux, France).

Les techniques d'amplification comprennent notamment des méthodes isothermes et des techniques basées sur la PCR (Polymerase Chain Reaction). Les méthodes d’amplification isotherme regroupent un grand nombre de méthodes. Les plus utilisées pour détecter les agents pathogènes sont les méthodes LAMP (Loop-Mediated Amplification) et RPA (Recombinase Polymerase Amplification). Les méthodes d’amplification isotherme comprennent aussi des méthodes telles que par exemple la méthode NASBA (nucleic acid sequence-based amplification), HDA (helicase-dependent amplification), RCA (rolling circle amplification) et SDA (strand displacement amplification), EXPAR (exponential amplification reaction), ICANs (isothermal and chimeric primer-initiated amplification of nucleic acids), SMART (signal-mediated amplification of RNA technology), etc. (voir par exemple Asiello et Baeumner,Lab Chip11(8): 1420-1430, 2011). De préférence, la technique de PCR utilisée mesure quantitativement les quantités initiales d'ADN, d'ADNc ou d'ARN. Des exemples de techniques basées sur la PCR qui peuvent être utilisées dans les méthodes décrites ici comprennent, sans limitation, des techniques telles que la PCR en temps réel (Q-PCR), la PCR inverse (RT-PCR), la PCR inverse multiplexe, la PCR inverse en temps réel (QRT-PCR) et la PCR numérique (ou PCR digitale). Ces techniques sont des technologies bien connues et facilement disponibles pour la personne du métier. Il n’est pas nécessaire de les détailler ici.

Préférablement, la détermination de la charge en TTV est effectuée par une PCR quantitative en temps réel. De nombreuses méthodes de détection et de quantification des TTV ont été décrites dans l’art (voir par exemple Maggi et al.,J Virol. 77(4) : 2418-2425, 2003). On se réfèrera en particulier à la méthode décrite par Kulifaj et al. (J Clin Virol. 105 :118-127, 2018). Cette méthode est particulièrement avantageuse de par sa simplicité et sa robustesse. Elle est fondée sur l’amplification d’une séquence comprise dans la région non codante UTR. Cette séquence est présente chez tous les TTV connus, conférant ainsi une très grande spécificité à la méthode. En outre, elle est particulièrement versatile et peut être mise en œuvre avec n’importe quel type de plateforme de PCR. Il est particulièrement avantageux d’utiliser la trousse de diagnostic TTV R-GENE® (bioMérieux, France) pour mettre en œuvre cette méthode.

Alternativement, la détermination de la charge virale est effectuée par PCR digitale. La PCR digitale implique plusieurs analyses de PCR sur des acides nucléiques extrêmement dilués de sorte que la plupart des amplifications positives reflètent le signal d'une seule molécule matrice. La PCR digitale permet ainsi le comptage de molécules modèles individuelles. La proportion d'amplifications positives parmi le nombre total de PCR analysées permet une estimation de la concentration de matrice dans l'échantillon d'origine ou non dilué. Cette technique a été proposée pour permettre la détection d'une variété de phénomènes génétiques (Vogelstein et al.,Proc Natl Acad Sci USA96 : 9236-924, 1999). La PCR digitale, tout comme la PCR en temps réel, permet potentiellement la discrimination de différences quantitatives fines de séquences cibles entre des échantillons.

Selon un autre mode de réalisation, les niveaux d'ADN de TTV sont mesurés par séquençage. Tel qu'utilisé ici, le terme « séquençage » est pris dans son acception la plus large et se réfère à toute technique connue de la personne du métier permettant de déterminer la séquence d’une molécule polynucléotidique (ADN ou ARN), c’est-à-dire de déterminer la succession des nucléotides composant cette molécule.

L'ADN de TTV peut ainsi être séquencé par toute technique connue dans l'art. Le séquençage tel qu’on l’entend ici comprend entre autres le séquençage par la méthode de Sanger, le séquençage du génome entier, le séquençage par hybridation, le pyroséquençage (notamment le séquençage 454, le séquençage Solexa Genome Analyzer), le séquençage avec électrophorèse capillaire, le séquençage par cycles, le séquençage d'extension à base unique, le séquençage en phase solide, le séquençage à haut débit, le séquençage de signature massivement parallèle (MPSS), le séquençage par terminateur de colorant réversible, le séquençage à paires appariées, le séquençage à court terme, le séquençage avec exonucléases, le séquençage par ligature, le séquençage de molécule unique, le séquençage par synthèse, le séquençage par microscopie électronique le séquençage en temps réel, le séquençage à terminaison inverse, le séquençage par nanopores, le séquençage par terminateur réversible, le séquençage par semiconducteur, le séquençage SOLiD(R), le séquençage SMRT (Single Molecule Real-Time Analysis), le séquençage MS-PET, la spectrométrie de masse, et leurs combinaisons. Un mode de réalisation particulier utilise le séquençage haut débit d'ADN, à l’aide par exemple des plateformes MiSeq, NextSeq 500, et la série HiSeq développées par Illumina (Reuter et al., Mol Cell, 58 : 586-597, 2015 ; Bentley et al. Nature ; 456 : 53-59, 2008), la plateforme Genome Sequencer de 454 et Roche (Margulies et al. Nature ; 437 : 376-380, 2005), la plateforme SOLiD d'Applied Biosystems (McKernan et al., Genome Res ; 19 : 1527-1541, 2009), la plateforme Polanator (Shendure et al., Science, 309 : 1728-1732) ou encore la plateforme de séquençage de molécules uniques Helicos (Harris et al. Science ; 320 : 106-109, 2008). Le séquençage haut débit inclut aussi des méthodes telles que le séquençage en temps réel SMRT (Roads et al., Genomics, Proteomics & Bioinformatics, 13(5) : 278-289, 2015), le séquençage Ion Torrent (WO 2010/008480 ; Rothberg et al., Nature, 475 : 348-352, 2011) et séquençage à l’aide de nanopores (Clarke J et al. Nat Nanotechnol : 4 : 265-270, 2009).

Le séquençage est effectué sur l'intégralité de l’ADN contenu dans l'échantillon biologique ou sur des parties de l'ADN contenues dans l'échantillon biologique. Il sera immédiatement clair pour la personne du métier que ledit échantillon contient au moins un mélange d'ADN de TTV et d'ADN du sujet hôte. De plus, l'ADN de TTV ne représentera probablement qu'une fraction mineure de l'ADN total présent dans l'échantillon. Avantageusement, l'ADN est fragmenté au hasard, généralement par des méthodes physiques, préalablement au séquençage.

Une première approche consiste à séquencer des séquences spécifiques du génome d’une espèce de TTV. Une autre approche consiste à utiliser une méthode qui permet le génotypage quantitatif des acides nucléiques obtenus à partir de l'échantillon biologique avec une grande précision. Dans un mode de réalisation particulier, la précision est obtenue par l'analyse d'un grand nombre (par exemple, des millions ou des milliards) de molécules d'acide nucléique sans aucune amplification en utilisant des protocoles qui s'appuient sur une connaissance préalable des séquences cibles (c'est-à-dire dans ce cas, les séquences des TTV).

Dans un mode de réalisation préféré, le procédé de l'invention comprend une étape de quantification du nombre de lectures.

Dans un mode de réalisation particulier, un sous-ensemble aléatoire de molécules d'acide nucléique de l'échantillon biologique est soumis au séquençage à haut débit. Préférablement, les séquences de TTV sont identifiées dans les données de séquençage globales par comparaison avec les séquences de TTV déposées publiquement. Cette comparaison est avantageusement fondée sur le niveau d'identité de séquence avec une séquence de TTV connue et permet de détecter des variantes même éloignées. Des logiciels courants tels que BLAST peuvent être utilisés pour déterminer le niveau d’identité entre les séquences.

Ainsi, une séquence présentant au moins 80%, au moins 85%, au moins 90%, au moins 95%, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98%, au moins 99% ou 100% d'identité avec une séquence de TTV connue est identifiée comme une séquence de TTV. Selon ce mode de réalisation, la détermination de la charge en TTV comprend donc la numérotation des séquences de TTV identifiées par séquençage dans l'échantillon biologique du sujet.

Dans un autre mode de réalisation, la charge de TTV est déterminée en mesurant la quantité d’une protéine virale dans l’échantillon biologique. Il est ainsi possible d’employer des anticorps spécifiques, en particulier dans des technologies bien connues telles que l’immunoprécipitation, l’immunohistologie, le western blot, le dot blot, l’ELISA ou l’ELISPOT, l'électrochimioluminescence (ECLIA), les puces à protéines, les puces à anticorps, ou les puces à tissu couplées à l’immunohistochimie. Parmi les autres techniques qui peuvent être utilisées sont comprises les techniques de FRET ou de BRET, les méthodes de microscopie ou d’histochimie, dont notamment les méthodes de microscopie confocale et de microscopie électronique, les méthodes basées sur l’utilisation d’une ou plusieurs longueurs d’onde d’excitation et d’une méthode optique adaptée, comme une méthode électrochimique (les techniques de voltamétrie et d’ampérometrie), le microscope à force atomique, et les méthodes de radiofréquence, comme la spectroscopie résonance multipolaire, confocale et non-confocale, détection de fluorescence, luminescence, chimioluminescence, absorbance, réflectance, transmittance, and biréfringence ou index de réfraction (par exemple, par résonance des plasmons de surface, ou « surface plasmon resonance » en anglais, par ellipsométrie, par méthode de miroir résonnant, etc.), cytométrie de flux, imagerie par résonance radioisotopique ou magnétique, analyse par électrophorèse en gel de polyacrylamide (SDS-PAGE); par spectrométrie de masse et par chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse (LC-MS/MS). Toutes ces techniques sont bien connues de la personne du métier et il n’est pas nécessaire de les détailler ici. En outre, des anticorps spécifiques de protéines de TTV sont déjà disponibles.

Dans un mode de réalisation préféré, la méthode décrite ici comprend une étape supplémentaire de normalisation de la quantité d’acide nucléique ou de protéine virale mesurée.

Selon un mode de réalisation préféré, il peut être avantageux de normaliser les niveaux de TTV, c’est-à-dire la quantité d’ADN de TTV, d’ARN de TTV ou de protéines de TTV présente dans l’échantillon biologique à un paramètre spécifique de cet échantillon. La normalisation de la charge mesurée de TTV à un paramètre spécifique permet de réduire le taux d’erreur lors de la comparaison entre les charges virales de deux échantillons biologiques différents. Un exemple de paramètre pouvant être utile pour cette normalisation peut être un paramètre physique, indépendant du contenu de l’échantillon, comme par exemple le volume de celui-ci. Il est aussi possible de normaliser la quantité d’ADN de TTV, d’ARN de TTV ou de protéines de TTV à la quantité totale d’ADN, d’ARN ou de protéines présentes dans l’échantillon. Alternativement, il est possible d’utiliser une séquence particulière d’ADN ou d’ARN ou une protéine particulière comme outil de normalisation. Par exemple, cette séquence ou cette protéine peut être une séquence ou une protéine humaine.

Alternativement, la quantité d’ADN ou d’ARN de TTV ou de protéines de TTV dans un échantillon donné est comparée à un contrôle interne. Pour cela, la quantité d’acide nucléique ou de protéine de TTV mesurée dans l’échantillon biologique peut être rapportée à une quantité définie d’un acide nucléique ou d’une protéine appropriée qui peut être identifiée et quantifiée, comme par exemple un acide nucléique ou une protéine hôte ou exogène. Préférablement, cet acide nucléique ou de cette protéine identifiable et quantifiable est traité (par exemple, amplifié, séquencé, etc.) comme l’acide nucléique ou la protéine cible. On peut ainsi ajouterab initioà l’échantillon une quantité connue de cet acide nucléique ou de cette protéine identifiable et quantifiable, qui sera ensuite traité comme l’acide nucléique ou la protéine cible et passera par toutes les étapes de préparation de l’échantillon avant la mesure de la quantité de cet acide nucléique ou de cette protéine virale. Les étapes de préparation peuvent comprendre des moyens pour protéger l’acide nucléique viral et détruire les acides nucléiques hôtes, par exemple en utilisant différentes nucléases. Alternativement, ces étapes peuvent comprendre des moyens pour protéger les protéines virales et détruire les protéines hôtes, par exemple en utilisant différentes protéases. Le contrôle interne permet d'évaluer la qualité et l'étendue du traitement (par exemple une amplification ou un séquençage) des molécules considérées (acides nucléiques ou protéines) dans l’échantillon. De préférence, ledit contrôle interne est une molécule d'acide nucléique de séquence connue, cette molécule d'acide nucléique étant présente dans l’échantillon à une concentration connue. Plus préférablement, cette molécule d'acide nucléique est la molécule d'ADN circulaire monocaténaire génomique d'un virus de séquence et de concentration connues dans l’échantillon. Un tel virus connu peut être par exemple un virus de la famille desCircoviridae. Le rapport du nombre de séquences de l'échantillon au contrôle permet d'estimer le nombre absolu de génomes de TTV de séquence et de concentration connues. Alternativement, ce contrôle interne est une protéine de séquence connue, qui est présente dans l’échantillon à une concentration connue.

Une fois la charge en TTV déterminée par mesure de la quantité d’acide nucléique ou de protéine de TTV déterminée, celle-ci étant optionnellement normalisée, il peut être avantageux de la comparer à une charge en TTV de référence.

Par « une charge en TTV de référence » ou « une charge virale de référence » on entend au sens de la présente demande toute charge en TTV utilisée à titre de référence. Cela signifie que la charge en TTV de référence correspond à « un niveau de référence d’acide nucléique (ou de protéine) de TTV » ou « un niveau témoin d’acide nucléique (ou de protéine) de TTV », c’est-à-dire à une concentration d’un acide nucléique (ou de protéine) de TTV utilisé à titre de référence. Tel qu'on l’entend ici, « une concentration de référence d’acide nucléique (ou de protéine) de TTV » est un niveau de base mesuré dans un échantillon témoin comparable à celui testé, et qui est obtenu à partir d’un sujet ou d’un groupe de sujets présentant un statut immunocompétent spécifique. Il peut s'agir par exemple d’un sujet ou d’un groupe de sujets sains ou ne présentant pas de maladie entraînant une immunodépression. Il peut aussi s’agir d’un sujet ou d’un groupe de sujets immunodéprimés, par exemple à la suite d’un traitement immunosuppresseur. Enfin, ce peut être le même individu ayant subi la greffe, par exemple avant ou juste après celle-ci.

Le niveau de référence peut être déterminé par une pluralité de méthodes. Par exemple, le contrôle peut être une valeur prédéterminée, qui peut prendre diverses formes. Il peut s'agir d'une valeur seuil unique, telle qu'une médiane ou une moyenne. Le « niveau de référence » peut être une valeur unique, applicable également à chaque patient individuellement. Alternativement, le niveau de référence peut varier en fonction des sous-populations spécifiques de patients. Ainsi, par exemple, les hommes plus âgés pourraient avoir un niveau de référence différent de celui des hommes plus jeunes pour la charge en TTV, et les femmes pourraient avoir un niveau de référence différent de celui des hommes pour cette charge virale. D'autre part, le « niveau de référence » peut être établi sur la base de groupes comparatifs, tels que des groupes n'ayant pas un niveau d’acide nucléique (ou de protéine) de TTV élevé et des groupes ayant des niveaux d’acide nucléique (ou de protéine) de TTV élevés. Un autre exemple de groupes comparatifs serait les groupes ayant une maladie, une condition ou des symptômes particuliers et les groupes sans maladie. La valeur prédéterminée peut être définie, par exemple, lorsqu'une population testée est divisée de manière égale (ou inégale) en groupes, tels qu'un groupe à faible risque, un groupe à risque moyen et un groupe à risque élevé.

Le niveau de référence peut également être déterminé par comparaison du niveau d’acide nucléique (ou de protéine) de TTV dans des populations de patients ayant subi des greffes ou de patients atteints de maladies conduisant à une immunodépression. Cela peut être accompli, par exemple, par une analyse par histogramme, dans laquelle toute une cohorte de sujets est présentée graphiquement, avec un premier axe représentant le niveau dudit acide nucléique (ou protéine) de TTV, et un second axe représente le nombre de patients dans le groupe de patients exprimant l’acide nucléique (ou la protéine) de TTV à un niveau donné. Deux groupes distincts de sujets ou plus peuvent être déterminés en identifiant des sous-populations de la cohorte qui ont des niveaux d’acide nucléique (ou de protéine) de TTV identiques ou similaires. La détermination du niveau de référence peut alors être faite sur la base d'un niveau qui distingue le mieux ces groupes distincts. Un niveau de référence peut également représenter les niveaux de deux ou plus des présents acides nucléiques (ou protéines) de TTV. Deux marqueurs ou plus peuvent être représentés, par exemple, par un rapport de valeurs pour les niveaux de chaque marqueur.

De même, une population apparemment en bonne santé aura une plage ‘normale’ différente de celle d’une population connue pour présenter un état associé à une haute concentration dudit acide nucléique (ou protéine) de TTV. En conséquence, la valeur prédéterminée sélectionnée peut prendre en compte la catégorie dans laquelle un individu tombe. Des gammes et des catégories appropriées peuvent être sélectionnées à l’aide simplement d’une expérimentation de routine par la personne du métier. Par « élevé », « augmenté », on entend élevé par rapport à un contrôle sélectionné. Généralement, le contrôle sera basé sur des individus normaux apparemment en bonne santé dans une tranche d’âge appropriée.

Dans un mode de réalisation préféré, la concentration de référence correspond à la concentration d’acide nucléique (ou de protéine) de TTV ou de la combinaison de d’acides nucléiques (ou de protéines) de TTV dans la population générale.

On comprendra également que les témoins dans la méthode décrite ici peuvent être, outre de valeurs prédéterminées, des échantillons biologiques mesurés en parallèle avec les échantillons testés. Selon ce mode de réalisation, le niveau de référence sera celui du ou des acides nucléiques (ou protéines) de TTV dans un échantillon provenant d’un sujet en bonne santé.

De façon préférée, la concentration de référence d’acide nucléique (ou de protéine) de TTV sera la concentration de cet acide nucléique (ou cette protéine) de TTV dans un sujet en bonne santé ou dans une population de sujets en bonne santé. Selon un autre mode de réalisation préféré, la concentration de référence de l’acide nucléique (ou de protéine) de TTV sera la concentration de cet acide nucléique (ou cette protéine) de TTV dans un sujet immunodéprimé ou dans une population de sujets immunodéprimés (par exemple, suite à un traitement immunosuppresseur). Selon un autre mode de réalisation préféré, la concentration de référence de l’acide nucléique (ou de protéine) de TTV sera la concentration de cet acide nucléique (ou cette protéine) de TTV chez le même individu ayant subi la greffe à un instant spécifique, par exemple avant ou juste après celle-ci.

Méthode de suivi de l’activité des lymphocytes T

Les méthodes décrites ici permettent d’évaluer rapidement et aisément la capacité de prolifération des lymphocytes T chez un sujet.

De multiples facteurs contribuent au statut sévère d’immunodépression chez les receveurs de GCSH, en particulier d’allo-GCSH. Le conditionnement altère notamment les tissus lymphoïdes du receveur. La présence de GvHD ainsi que son traitement induisent de nouvelles complications immunologiques. Enfin, le faible contingent de lymphocytes T greffés, comparé à la taille du compartiment cellulaire T chez une personne immunocompétente, ainsi que le nombre extrêmement limité de précurseurs immunitaires du donneur présents dans le greffon contribuent également à la lenteur de la reconstitution immunitaire chez le receveur. Tous ces facteurs rendent le receveur susceptible à des complications post-greffe, comme des infections microbiennes ou la GvHD.

Grâce aux méthodes décrites ici, il est possible d’évaluer aisément l’activité des lymphocytes T dans des situations où le système immunitaire a été compromis, comme par exemple après une GCSH, notamment une allo-GCSH.

Un autre aspect de la présente divulgation porte donc sur une méthode de suivi de l’activité des lymphocytes T chez un patient ayant reçu une GCSH, notamment une allo-GCSH. Cette méthode comprend des étapes de :
a) mesure de la capacité de prolifération des lymphocytes T selon les méthodes décrites plus haut à un premier instant ;
b) comparaison de la capacité de prolifération des lymphocytes T mesurées en a) avec une capacité de de prolifération des lymphocytes T de référence ; et
c) détermination de la variation de l’activité des lymphocytes T du patient au vu de la comparaison de l’étape b).

Une « capacité de prolifération des lymphocytes T de référence » telle qu’on l’entend ici est une capacité de prolifération des lymphocytes T estimée à partir d’une charge en TTV de référence telle que décrite plus haut. Il est bien entendu que la comparaison de l’étape b) peut se faire simplement en comparant la charge en TTV dans l’échantillon du patient déterminée dans l’étape a) avec une charge en TTV de référence.

Par exemple, en comparant la capacité de prolifération des lymphocytes chez le patient à ce premier instant avec la capacité de prolifération des lymphocytes T de référence d’un individu immunodéprimé, il est possible d’estimer, à ce premier instant, la reconstitution de l’immunocompétence du patient après la GCSH, notamment l’allo-GCSH. Par « immunocompétence » on entend ici l’acquisition de la fonctionnalité par les cellules immunitaires. Ainsi, une capacité de prolifération des lymphocytes T chez le patient augmentée par rapport à celle d’un individu immunodéprimé indique que la reconstitution de l’immunocompétence du patient est en cours. Comme indiqué plus haut, une telle capacité de prolifération des lymphocytes T augmentée chez le patient par rapport au sujet immunodéprimé correspond à une charge en TTV moins importante.

Alternativement, la capacité de prolifération des lymphocytes T de référence peut être celle d’un individu sain. Dans ce cas, une capacité de prolifération des lymphocytes T chez le patient diminuée par rapport à la capacité de prolifération des lymphocytes T de référence indique que l’immunocompétence n’a pas été complètement reconstituée chez le patient. On comprendra immédiatement qu’une diminution de la capacité de prolifération des lymphocytes T chez le patient par rapport au sujet sain correspond à une augmentation de la charge en TTV.

Le terme « augmenté », tel qu'il est utilisé ici dans certains modes de réalisation, signifie une plus grande quantité, par exemple, une quantité légèrement supérieure à la quantité d'origine, ou par exemple une quantité en grand excès par rapport à la quantité d'origine, et notamment toutes les quantités dans l'intervalle. En variante, « augmentation » peut faire référence à une quantité ou une activité qui est au moins 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 100% de plus que la quantité ou de l'activité pour laquelle la quantité ou de l'activité accrue est comparé. Les termes « accru », « plus grand que », « plus important » et « augmenté » sont utilisés ici de manière interchangeable.

Le terme « diminué », tel qu'il est utilisé ici dans certains modes de réalisation, signifie une moins grande quantité, par exemple, une quantité légèrement inférieure à la quantité d'origine, ou par exemple une quantité en grand insuffisance par rapport à la quantité d'origine, et notamment toutes les quantités dans l'intervalle. En variante, « diminution » peut faire référence à une quantité ou une activité qui est au moins 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 100% de moins que la quantité ou de l'activité pour laquelle la quantité ou de l'activité réduite est comparé. Les termes « diminué », « moins grand que », « moins important » et « réduit » sont utilisés ici de manière interchangeable.

Il est aussi possible d’utiliser comme capacité de prolifération des lymphocytes T de référence la capacité de prolifération des lymphocytes T chez le même patient à un second instant. L’évolution de l’activité de ces lymphocytes T chez ce patient après la greffe peut ainsi être suivie simplement, sans mettre en œuvre de dispositif expérimental lourd et compliqué, par une simple mesure de la charge en TTV chez le patient au premier et au second instant.

Selon ce mode réalisation particulier, la présente méthode de suivi de l’activité des lymphocytes T chez un patient ayant reçu une GCSH, notamment une allo-GCSH, comprend des étapes de :
a) mesure de la capacité de prolifération des lymphocytes T selon les méthodes décrites plus haut à un premier instant ;
b) mesure de la capacité de prolifération des lymphocytes T selon les méthodes décrites plus haut à un second instant, ce second instant étant plus tardif que le premier instant de l’étape a) ;
c) comparaison des capacités de prolifération des lymphocytes T mesurées en a) et b) ; et
d) détermination de la variation de l’activité des lymphocytes T du patient au vu de la comparaison de l’étape c).

Cette méthode est ainsi particulièrement utile pour suivre au cours du temps l’activité des lymphocytes T chez le patient. Dans un mode de réalisation préféré, le premier instant de l’étape a) se situe au moment de la greffe. Dans un autre mode de réalisation préféré, la capacité de prolifération des lymphocytes T est mesurée à l’étape b) en utilisant un échantillon prélevé au moins 30 jours, 60 jours, 90 jours, 100 jours, 120 jours, 150 jours, 180 jours, 210 jours, 240 jours, 270 jours, 300 jours, 330 jours, 360 jours, 720 jours ou 1080 jours après la GCSH. Alternativement, cet échantillon est prélevé à 30 jours, 60 jours, 90 jours, 100 jours, 120 jours, 150 jours, 180 jours, 210 jours, 240 jours, 270 jours, 300 jours, 330 jours, 360 jours, 720 jours ou 1080 jours après la GCSH.

Il est clair que si les cellules T ont une capacité de prolifération accrue au second instant par rapport au premier, leur activité est elle-même accrue à cet instant. Par exemple, si le premier instant est le moment de la greffe, une capacité de prolifération accrue des lymphocytes T à ce second instant signifie qu’il y a plus de lymphocytes T actifs et que le patient est alors plus à même de se défendre notamment contre les menaces. Une telle évolution de la capacité de prolifération des lymphocytes T se traduira par une évolution en sens inverse de la charge en TTV : une diminution de celle-ci au cours du temps reflète ainsi une augmentation de la capacité de prolifération des lymphocytes T, c’est-à-dire une reconstitution de l’immunocompétence du patient. La présente méthode permet donc d’estimer la reconstitution du système immunitaire du receveur. Autrement dit, l’évolution de la capacité de prolifération des cellules T permet d’évaluer la réapparition de l’immunocompétence chez le patient après la greffe.

En suivant les variations de l’activité des cellules T au cours du temps, il est notamment possible de surveiller la reconstitution de l’immunocompétence après la greffe chez un patient ayant subi un conditionnement. Selon ce mode de réalisation particulier, la méthode de suivi de l’activité des lymphocytes T décrite plus haut est mise en œuvre chez un patient ayant subi un conditionnement avant de recevoir une GCSH, notamment une allo-GCSH. Dans un mode de réalisation préféré, le conditionnement est myéloablatif. Dans un autre mode de réalisation préféré, le conditionnement est atténué.

Méthodes d’évaluation du risque d’infection microbienne

La GCSH, notamment l’allo-GCSH, peut entraîner des complications précoces ou tardives, qui varient fortement d’un patient à l’autre.

En particulier, un patient ayant reçu une GCSH, notamment une allo-GCSH, reste sensible aux infections microbiennes, qu’elles soient bactériennes, virales, parasitaires ou fongiques, tant que son système immunitaire n’est pas reconstitué. En évaluant la capacité de prolifération de lymphocytes T à un moment donné après une GCSH, notamment une allo-GCSH, il est possible de déterminer la susceptibilité aux infections microbiennes du patient ayant subi la greffe.

Dans cet aspect particulier, la présente description porte sur une méthode pour déterminer la susceptibilité aux infections microbiennes chez un patient ayant reçu une GCSH, notamment une allo-GCSH. Cette méthode comprend des étapes de :
a) mesure de la capacité de prolifération des lymphocytes T à partir d’un échantillon du patient selon les méthodes décrites plus haut à un premier instant ;
b) comparaison de la capacité de prolifération des lymphocytes T avec une capacité de prolifération des lymphocytes T de référence ; et
c) détermination de la susceptibilité aux infections microbiennes chez le patient à partir de la comparaison de l’étape b).

Les méthodes décrites ici peuvent comprendre en outre une ou plusieurs étapes de diagnostic spécifique de la présence d’un ou plusieurs des agents infectieux, comme par exemple les bactéries, virus, parasites ou levures et champignons filamenteux mentionnés plus en détail ci-dessous. La détection de ces agents est pratiquée en routine en clinique, notamment en relation avec des GCSH, et les techniques correspondantes sont bien connues de la personne du métier. Il n’est donc pas nécessaire de les détailler ici.

Ces infections microbiennes sont en particulier des infections virales, bactériennes, parasitaires ou fongiques. Les infections virales sont notamment des infections par des virus de la famille des Herpesviridae, comme par exemple, les virus HSV, VZV, HHV-6, le virus d’Epstein-Bar (EBV) ou le cytomégalovirus humain (CMVH). Ces infections virales peuvent aussi être causées par des adénovirus, le virus respiratoire syncytial (VRS), le virus de la grippe (encore appelé influenzavirus ouMyxovirus influenzae) ou le virus BK. Les bactéries responsables des infections bactériennes peuvent être entre autres des staphylocoques commeStaphylococcus aureusou des staphylocoques à coagulase négatives, des bactéries encapsulées telles queStreptococcus pneumoniae,Neisseria meningitidisouHaemophilus influenzae,Legionella sp. ou encore des bacilles à Gram-négatif non fermentaires aérobies stricts tels les genresPseudomonas,Acinetobacter,Stenotrophomonas,Burkholderia,Alcaligenes… Des infections à mycobactéries atypiques peuvent également être observées. Des infections parasitaires à forte morbidité et mortalité, notamment àPneumocystis carinii, peuvent survenir, tout comme des toxoplasmoses (causées parToxoplasma gondii). Enfin, des levures telles que desCandidaou desCryptococcus, mais aussi des champignons filamenteux comme desAspergillussont responsables d’infections fongiques invasives qui font partie des causes majeures de mortalité infectieuse après une GCSH.

La capacité de prolifération des lymphocytes T de référence correspond à la capacité de prolifération des lymphocytes T estimée à partir d’une charge en TTV de référence telle que décrite plus haut. La comparaison de l’étape b) peut se faire simplement en comparant la charge en TTV dans l’échantillon du patient déterminée dans l’étape a) avec une charge en TTV de référence.

Cette charge en TTV de référence peut par exemple être celle d’un individu sain, non immunodéprimé. La capacité de prolifération des lymphocytes T de référence est alors celle de cet individu sain, non immunodéprimé.

Dans ce mode de réalisation particulier, la description porte sur une méthode pour déterminer la susceptibilité aux infections microbiennes chez un patient ayant reçu une GCSH, notamment une allo-GCSH. Cette méthode comprend des étapes de :
a) mesure de la capacité de prolifération des lymphocytes T à partir d’un échantillon du patient selon les méthodes décrites plus haut à un premier instant ;
b) comparaison de la capacité de prolifération des lymphocytes T avec celle d’un sujet sain ; et
c) détermination de la susceptibilité aux infections microbiennes chez le patient à partir de la comparaison de l’étape b).

Dans ce cas, une capacité réduite de prolifération des lymphocytes T chez le patient par rapport au sujet sain indique que le système immunitaire du patient n’est pas complètement fonctionnel. Une capacité de prolifération des lymphocytes T du patient moindre que celle d’un sujet sain correspond à une charge virale mesurée dans l’échantillon du patient supérieure à la charge en TTV chez le sujet sain. En d’autres termes, le sujet présente alors une déficience de son système immunitaire, ce qui le laisse à la portée de l’attaque de pathogènes. Ainsi, le patient risque d’être infecté par des organismes microbiens. En revanche, le patient moins sensible aux infections microbiennes quand ses lymphocytes T ont substantiellement la même capacité de prolifération que ceux d’un sujet en bonne santé.

Il est aussi possible d’utiliser comme capacité de prolifération des lymphocytes T de référence la capacité de prolifération des lymphocytes T chez le même patient à un second instant. La personne du métier peut ainsi surveiller l’évolution des risques d’infections microbiennes au cours du temps après la greffe. Ainsi les traitements anti-infectieux peuvent être adaptés en fonction de la susceptibilité réelle du patient aux infections microbiennes, ce qui limite les risques d’apparition de résistance, tout en améliorant le confort de vie du patient.

Dans ce mode réalisation particulier, la méthode de détermination de la susceptibilité aux infections microbiennes chez un patient ayant reçu une GCSH, notamment une allo-GCSH, comprend des étapes de :
a) mesure de la capacité de prolifération des lymphocytes T selon les méthodes décrites plus haut à un premier instant ;
b) mesure de la capacité de prolifération des lymphocytes T selon les méthodes décrites plus haut à un second instant, ce second instant étant plus tardif que le premier instant de l’étape a) ;
c) comparaison des capacités de prolifération des lymphocytes T mesurées en a) et b) ; et
d) détermination de la susceptibilité aux infections microbiennes chez le patient au vu de la comparaison de l’étape c).

Il est ainsi possible de suivre au cours du temps l’évolution de la sensibilité aux infections microbiennes chez le patient. Une capacité de prolifération des lymphocytes T dans l’étape b) par rapport à l’étape a) accrue reflète une augmentation de leur activité et donc une diminution de la sensibilité du patient aux infections microbiennes entre les deux instants. La présente méthode permet notamment de vérifier que plus le temps passe après la greffe et moins le patient devient sensible aux infections microbiennes, c’est-à-dire que son système immunitaire devient de plus en plus fonctionnel.

La susceptibilité du patient aux infections microbiennes peut donc être déterminée à l’aide des méthodes décrites ici, ce qui permet de mettre au point d'adapter un traitement spécifique aux besoins du patient. La détermination préalable de l'état immunodéprimé du patient avec le procédé de l'invention conduit ainsi à un traitement plus sûr que les traitements conçus sur la base des procédés de l'art antérieur.

Ainsi, la présente invention concerne également un procédé de conception d'un traitement des infections microbiennes chez un patient ayant subi une CSH, notamment une allo-GCSH, ledit procédé comprenant :
a) déterminer la susceptibilité du patient aux infections microbiennes selon les méthodes décrites ci-dessus ;
b) décider d’un traitement selon le résultat de l’étape a).

Le traitement peut être décidé à titre préventif, c’est-à-dire qu’il peut être ordonné au vu de l’état d’immunodéficience du patient pour empêcher qu’une infection ne se déclare. Dans ce cadre, on pourra décider de prescrire les traitements curatifs ou prophylactiques couramment utilisés après une GCSH, notamment une allo-GCSH, lesquels sont décrits plus bas. Les présentes méthodes permettent ainsi de pouvoir décider et d’administrer un traitement préventif ou curatif d’une infection virale, bactérienne, parasitaire ou fongique si un risque d’une telle infection est identifié.

La présente description concerne donc également une méthode de traitement d'une infection chez un patient ayant reçu une GCSH, en particulier une allo-GCSH, ladite méthode comprenant des étapes de :
a) détermination de la susceptibilité du patient aux infections microbiennes selon les méthodes décrites ci-dessus ; et
b) administration d’un traitement approprié audit sujet.

La présente invention propose ainsi un traitement destiné à être utilisé dans le traitement d'une infection chez un sujet ayant reçu une GCSH, en particulier une allo-GCSH, l'utilisation comprenant les étapes de :
a) détermination de la susceptibilité du patient aux infections microbiennes selon les méthodes décrites ci-dessus ; et
b) administration d’un traitement approprié audit sujet.

En d'autres termes, l'invention concerne l'utilisation d'un traitement dans la préparation d'un médicament pour traiter une infection chez un sujet ayant reçu une GCSH, en particulier une allo-GCSH, ladite utilisation comprenant des étapes de :
a) détermination de la susceptibilité du patient aux infections microbiennes selon les méthodes décrites ci-dessus ; et
b) administration d’un traitement approprié audit sujet.

Comme expliqué plus haut, les infections rencontrées après une GCSH, notamment une allo-GCSH, sont des infections virales, bactériennes, parasitaires ou fongiques. Les traitements de ces infections sont bien connus et sont utilisés en clinique depuis de nombreuses années (voir par exemple Tomblyn et al.,Biol Blood Marrow Transplant. 15(10) : 1143-1238, 2009). Ainsi, les infections virales peuvent être prévenues par des composés antiviraux tels que l’aciclovir, le ganciclovir, le cidofovir, l’entécavir, la fludarabine la lamivudine, le ténofovir, la ribavarine ou la valaciclovir, ou des anticorps monoclonaux spécifiques comme le palivizumab (contre le VRS). Les antibiotiques permettent habituellement de traiter les infections bactériennes. On utilise notamment des antibiotiques à large spectre comme les beta lactamines, les glycopeptides, la fosfomycine, les macrolides, les tétracyclines, les aminosides, le chloramphénicol, les quinolones, la rifampicine et les sulfamides. Pour ce qui est des infections parasitaires, elles sont habituellement traitées par administration de composés antiparasitaires tels que le cotrimoxazole, la pyriméthamine et la sulfadiazine. Enfin, les composés antifongiques qui peuvent être administrés sont bien connus et comprennent notamment le fluconazole et les échinocandines.

Méthodes d’évaluation du risque la maladie du greffon contre l'hôte (de GvHD)

Les méthodes décrites ici présentent aussi l’avantage de pouvoir estimer le risque que la GvHD apparaisse chez un patient ayant subi une CCSH, notamment une allo-GCSHD.

La présente description porte donc aussi sur une méthode pour déterminer la susceptibilité à la GvHD chez un patient ayant reçu une GCSH, notamment une allo-GCSH, cette méthode comprenant des étapes de :
a) mesure de la capacité de prolifération des lymphocytes T à partir d’un échantillon du patient à un premier instant selon les méthodes décrites plus haut ; et
b) détermination de la susceptibilité à la GvHD chez le patient à partir de la mesure de l’étape a).

La « maladie du greffon contre l’hôte » ou « GvHD » (pour « graft versus host disease ») telle qu’on l’entend ici est une réaction immunitaire inflammatoire dirigée contre le receveur et mettant en jeu des cellules immunocompétentes présentes dans le greffon. On distingue deux formes cliniques de GvHD : la GvHD aiguë qui se produit habituellement dans les 100 premiers jours environ qui suivent la greffe et la GvHD chronique qui se produit généralement au-delà de cette limite. La GvHD aiguë fait référence à l'apparition d'une réponse inflammatoire allogénique dans trois organes exclusivement : la peau, le foie et le tractus gastro-intestinal. En revanche, la GvHD chronique peut toucher au moins un des huit organes suivants : peau, bouche, yeux, tractus gastro-intestinal, foie, poumons, muscles, articulations, fascia et les organes génitaux. Que ce soit pour la forme aigüe ou la forme chronique, la GvHD est habituellement diagnostiquée par un examen clinique qui peut comprendre une analyse histologique d’une biopsie de l’organe concerné (Schoemanset al. Bone Marrow Transplant53 : 1401–1415 2018).

A cet égard, il faut noter que la présente méthode est particulièrement utile, par exemple parce qu’elle prédit la possibilité de sevrer les patients du traitement immunosuppresseur et donc leur survie. La présente méthode offre une possibilité de différencier aisément une GvHD active qui nécessite la poursuite d’un traitement immunosuppresseur d'une GvHD qui n'est plus du tout active et pour laquelle le traitement pourrait être arrêté (cf. Magro et al.,Bull Cancer. 104S : S145–S168, 2017).

Plus particulièrement, la GvHD aigüe survient dans le premier mois (30 jours) suivant la greffe, tandis que le GvHD chronique apparaît entre 100 et 400 jours après la greffe. Toutes les deux sont caractérisées par l’activation des lymphocytes T du donneur présents dans le greffon. L’interaction entre les antigènes de l’hôte et les lymphocytes T du donneur entraîne l’activation allogénique des lymphocytes T, leur prolifération et leur différenciation en cellules effectrices qui attaquent les cellules épithéliales de l'hôte.

Le receveur d’une GCSH, en particulier, d’une allo-GCSH, est susceptible de développer une GvHD si les lymphocytes T de l’échantillon du patient sont capables de proliférer. En particulier, la prolifération des lymphocytes T du patient à un moment où le système immunitaire n’est pas encore reconstitué est une indication forte que le patient est susceptible d’être atteint par la GvHD. Cela peut être aisément évalué par la mesure de la charge en TTV, à l’aide des méthodes décrites ci-dessus. L’indication donnée par ce test peut être complétée le cas échéant par un examen clinique du patient, notamment par l’analyse histologique d’une ou plusieurs biopsies d’un ou plusieurs organes du patient.

Préférablement, l’échantillon du sujet est prélevé moins de 400 jours après la greffe. De façon plus préféré, l’échantillon est prélevé moins de 100 jours après la greffe ; alternativement, l’échantillon est prélevé entre 100 et 400 jours après la greffe. Dans un mode de réalisation particulier, la GvHD est une GvHD aigüe ; dans un autre mode de réalisation particulier, la GvHD est une GvHD chronique.

Dans un mode de réalisation particulier, il peut être utile de comparer la mesure de l’étape b) avec une référence possédant une capacité connue de prolifération des lymphocytes T, c’est-à-dire une capacité de prolifération des lymphocytes T de référence. La capacité de prolifération des lymphocytes T de référence correspond à la capacité de prolifération des lymphocytes T estimée à partir d’une charge en TTV de référence telle que décrite plus haut. La comparaison de l’étape b) peut se faire simplement en comparant la charge en TTV dans l’échantillon du patient déterminée dans l’étape a) avec une charge en TTV de référence.

Alternativement, la charge en TTV de référence peut être celle d’un individu immunodéprimé. Dans ce mode de réalisation particulier, la description porte sur une méthode pour déterminer la susceptibilité à la GvHD chez un patient ayant reçu une GCSH, notamment une allo-GCSH. Cette méthode comprend des étapes de :
a) mesure de la capacité de prolifération des lymphocytes T à partir d’un échantillon du patient selon les méthodes décrites plus haut à un premier instant ;
b) comparaison de la capacité de prolifération des lymphocytes T avec celle d’un sujet immunodéprimé ; et
c) détermination de la susceptibilité à la GvHD chez le patient à partir de la comparaison de l’étape b).

Dans ce cas, une capacité accrue de prolifération des lymphocytes T chez le patient par rapport au sujet immunodéprimé indique que le système immunitaire du patient redevient fonctionnel. Une capacité de prolifération des lymphocytes T du patient plus importante que celle d’un sujet immunodéprimé correspond à une charge virale mesurée dans l’échantillon du patient inférieure à la charge en TTV chez le sujet immunodéprimé. En d’autres termes, le sujet présente alors des lymphocytes T actifs, qui peuvent potentiellement attaquer les cellules du greffon et déclencher une GvHD. En revanche, le patient n’est pas susceptible de développer une GvHD quand ses lymphocytes T ont substantiellement la même capacité de prolifération que ceux d’un sujet immunodéprimé.

Il est aussi possible d’utiliser comme capacité de prolifération des lymphocytes T de référence la capacité de prolifération des lymphocytes T chez le même patient à un second instant. La personne du métier peut ainsi surveiller l’évolution du risque de survenue de la GvHD au cours du temps après la greffe. Ainsi un traitement anti-GvHD peut être adapté en fonction de la susceptibilité réelle du patient à la GvHD, ce qui limite les risques d’apparition de résistance, tout en améliorant le confort de vie du patient.

Dans ce mode réalisation particulier, la méthode de détermination de la susceptibilité à la GvHD chez un patient ayant reçu une GCSH, notamment une allo-GCSH, comprend des étapes de :
a) mesure de la capacité de prolifération des lymphocytes T selon les méthodes décrites plus haut à un premier instant ;
b) mesure de la capacité de prolifération des lymphocytes T selon les méthodes décrites plus haut à un second instant, ce second instant étant plus tardif que le premier instant de l’étape a) ;
c) comparaison des capacités de prolifération des lymphocytes T mesurées en a) et b) ; et
d) détermination de la susceptibilité à la GvHD chez le patient au vu de la comparaison de l’étape c).

Il est ainsi possible de suivre au cours du temps l’évolution de la susceptibilité à la GvHD chez le patient. Une capacité accrue de prolifération des lymphocytes T dans l’étape b) par rapport à l’étape a) reflète une augmentation de leur activité et donc une augmentation de la susceptibilité du patient à développer la GvHD entre les deux instants. Ce risque est d’autant plus important qu’il survient tôt après la greffe, c’est-à-dire à un moment où les seuls lymphocytes T actifs sont ceux du donneur et où il existe donc un risque qu’ils s’attaquent aux organes de l’hôte.

La susceptibilité du patient à la GvHD peut donc être déterminée à l’aide des méthodes décrites ici, ce qui permet de mettre au point d'adapter un traitement spécifique aux besoins du patient.

Ainsi, la présente invention concerne également un procédé de conception d'un traitement de la GvHD pour un sujet ayant reçu une CSH, notamment une GCSH, ledit procédé comprenant :
a) déterminer la susceptibilité du patient à la GvHD selon les méthodes décrites ci-dessus ;
b) décider d’un traitement selon le résultat de l’étape a).

La présente description concerne également une méthode de traitement de la GvHD chez un patient ayant reçu une GCSH, en particulier une allo-GCSH, ladite méthode comprenant des étapes de :
a) détermination de la susceptibilité du patient à la GvHD selon les méthodes décrites ci-dessus ; et
b) administration d’un traitement approprié audit sujet.

La présente invention propose ainsi un traitement destiné à être utilisé dans le traitement de la GvHD chez un sujet ayant reçu une GCSH, en particulier une allo-GCSH, l'utilisation comprenant les étapes de :
a) détermination de la susceptibilité du patient à la GvHD selon les méthodes décrites ci-dessus ; et
b) administration d’un traitement approprié audit sujet.

En d'autres termes, l'invention concerne l'utilisation d'un traitement dans la préparation d'un médicament pour traiter la GvHD chez un sujet ayant reçu une GCSH, en particulier une allo-GCSH, ladite utilisation comprenant des étapes de :
a) détermination de la susceptibilité du patient à la GvHD selon les méthodes décrites ci-dessus ; et
b) administration d’un traitement approprié audit sujet.

Les traitements de la GvHD sont bien connus et ont fait l’objet de recommandations de la part des cliniciens (voir par exemple, Magro et al.,BullCancer. 104S : S145–S168, 2017 ; Penack et al.,Lancet Haematol. 7(2): e157-e167; 2020). Les traitements de la GvHD peuvent être employés à titre prophylactique et consistent le plus souvent en traitements immunosuppresseurs tels que la cyclosporine ou le tacrolimus.

Quand les traitements de la GvHD sont employés à titre curatif, ils varient en fonction de la sévérité de la complication. Néanmoins, ces traitements comprennent le plus généralement des immunosuppresseurs, des corticoïdes, notamment la prednisolone et la méthylprednisolone. Le sérum anti-lymphocytaire (SAL) est également utilisé en cas d’échec aux corticoïdes. Enfin, d’autres médicaments de seconde ligne peuvent être utilisés tels que le mycophénolate mofétil (Cellcept®), des anticorps monoclonaux (anti TNFα ou antirécepteurs à l’IL2).

L’invention sera décrite plus précisément au moyen des exemples ci-dessous.

LEGENDES DES FIGURES

: Représentation de la structure du génome d’un isolat de TTV.

Organisation du génome d’un TTV prototype (isolat TTV-1a). Les flèches représentent les ORFs majeures (d’une longueur supérieure à 50 acides aminés). La région riche en GC et une région N22 (à partir de laquelle le TTV a été originellement isolé) sont indiquées. La région non-traduite UTR correspond à la région allant de l’extrémité 3’ de l’ORF4 jusqu’à l’extrémité 5’ de l’ORF2 D’après Biagini,Curr Top Microbiol Immunol. 331 :21-33, 2009.

: Charge virale TTV à partir d’échantillons de plasma de receveurs d’allo-GCSH et de volontaires sains.

La charge virale TTV de 41 receveurs d'allo-GCSH (noir) et de 54 volontaires sains (blanc) a été quantifiée. Après extraction de l'ADN, la charge virale TTV a été quantifiée à l'aide du kit TTV R-GENE® (disponible uniquement pour la recherche et non pour le diagnostic, Ref#69-030, bioMérieux. Marcy-l'Etoile, France). La plus faible charge virale détectée était de 0,46 Log copy/mL (log cp/mL). Les log copy/mL sont utilisés pour décrire l'expression de la charge virale du TTV entre les deux populations. La variance a été comparée à l'aide d’un F-test (## p<0,01). La charge virale TTV moyenne (ligne noire) a été comparée en utilisant un t-test non apparié avec la correction de Welch (*** p<0,001).

Abréviations : ADN. Acide désoxyribonucléique ; Allo. allogénique ; GCSH. Greffe de cellules souches hématopoïétiques ; TTV. torque teno virus

La capacité de prolifération des lymphocytes T-CD3⁺de 41 receveurs d'allo-GCSH (noir) et de 20 volontaires sains (blanc) a été quantifiée après une stimulation de 3 jours avec un mitogène (PHA) et mesurée par cytométrie en flux à l'aide du kit Click-It® EdU AF488. La variance des deux populations a été comparée à l'aide d’un F-test (##. p<0,01). La comparaison des moyennes (ligne noire) a été réalisée en utilisant un t-test non apparié avec correction de Welch (***. p<0,001).

Abréviations : Allo, allogénique ; GCSH, Greffe de cellules souches hématopoïétiques ; PHA, Phytohémagglutinine.

: Corrélation entre la charge virale TTV et le nombre de cellule T ainsi que la capacité de prolifération des lymphocytes T-CD3⁺.

Corrélation globale de la charge virale TTV de plasma de 41 receveurs d'allo-GCSH par rapport à la numération de plusieurs sous-types de cellules T et par rapport à la capacité de prolifération des lymphocytes T-CD3⁺(A). Le rho de Pearson et l'intervalle de confiance à 95 % (IC95) pour l’ensemble des paramètres évalués sont représentés respectivement par un point et une ligne noire.

Corrélation détaillée de la charge virale TTV exprimée en Log copies/mL de plasma de 41 receveurs d'allo-GCSH en fonction de : (B) la capacité de prolifération des lymphocytes T-CD3⁺, (C) le compte absolu de lymphocytes et (D) le compte de lymphocytes T-CD3⁺. Les patients sont représentés par des points. Les patients extrêmes : "A" (carré) et "B" (triangle), ainsi que la régression linéaire (ligne noire) sont représentés.

Le nombre de lymphocytes a été mesuré par cytométrie en flux dans le laboratoire d'immunologie en utilisant un large panel de marqueurs de membrane de cellules T. La capacité de prolifération des lymphocytes T-CD3⁺a été déterminée après 3 jours de stimulation avec un mitogène (PHA) et mesurée par cytométrie en flux à l'aide du kit Click-It® EdU AF488. La corrélation entre la charge virale du TTV (axe x) et le nombre de lymphocytes ou la capacité de prolifération des lymphocytes T-CD3⁺(axe y) a été déterminée en utilisant le coefficient de corrélation de Pearson (indiqué sur chaque graphique).

Abréviations : Allo. Allogénique ; GCSH. Greffe de cellules souches hématopoïétiques ; NK. Natural killer ; PHA. Phytohémagglutinine ; TTV. Torque teno virus

Corrélation globale de la charge virale plasmatique du TTV exprimée en Log cp/mL provenant de 41 plasmas de receveurs allo-GCSH par rapport à l'immunophénotypage des lymphocytes T et à la capacité de prolifération des lymphocytes T-CD3⁺(A). Corrélation détaillée de la charge virale TTV exprimée en Log cp/mL de 41 plasmas de receveurs allo-GCSH par rapport à la capacité de prolifération des lymphocytes T-CD3⁺(B), le nombre absolu de lymphocytes (C) et le nombre de lymphocytes T-CD3⁺(D). Les sous-types et le nombre absolu de lymphocytes ont été mesurés par cytométrie en flux dans le laboratoire d'immunologie de l'hôpital Edouard Herriot (Hospices Civils de Lyon) en utilisant un large panel de marqueurs membranaires des lymphocytes T. La capacité de prolifération des CD3⁺a été déterminée après une stimulation de 3 jours avec un mitogène (PHA) et mesurée par cytométrie en flux à l'aide du kit de flux Click-It® EdU AF488. La corrélation de la charge virale TTV (abscisses) et du nombre de cellules ou de la capacité de prolifération de lymphocytes T-CD3⁺(ordonnées) a été déterminée en utilisant le coefficient de corrélation de Pearson (indiqué sur chaque graphique). (A) Les valeurs -0,5 et 0,5 représentées par des lignes pointillées noires correspondent aux bornes de l’intervalle de confiance de corrélation. Le rho de Pearson et l'intervalle de confiance (IC) à 95% pour tous les paramètres sont représentés respectivement par des points et une ligne noire. (B, C et D) Les patients sont représentés par des points noirs, les patients extrêmes par un carré et un triangle, la régression linéaire est représentée par une ligne noire.

: Suivi descriptif chronologique des patients présentant des valeurs extrêmes de charge virale TTV.

Description chronologique des principales étapes cliniques (en noir) et des épisodes infectieux (en gris) entre la GCSH et l'inclusion pour le patient "A" et le patient "B". Le patient "A" avait la charge virale TTV la plus faible et inversement le patient "B" avait la charge virale TTV la plus élevée.

Abréviations : CMV. Cytomégalovirus ; EBV. Virus d'Epstein-Barr ; GCSH. Greffe de cellules souches hématopoïétiques ; GvHD. Maladie du greffon contre l'hôte ; M. Mois.

: Corrélation entre la charge virale TTV et les délais de GCSH.

Corrélation détaillée entre la charge virale plasmatique du TTV exprimée en Log cp/mL de 41 plasmas de receveurs allo-GCSH et les délais entre la GCSH et l'inclusion exprimés en mois. La corrélation de la charge virale TTV (abscisses) et des retards (ordonnées) a été déterminée en utilisant le coefficient de corrélation de Pearson (indiqué sur chaque graphique). Les patients sont représentés par des points noirs et la régression linéaire est représentée par une ligne noire.

Abréviations : HSCT, greffe de cellules souches hématopoïétiques ; TTV, Torque Teno Virus.

EXEMPLES

Dans notre étude, nous avons évalué et comparé la corrélation entre la charge virale du TTV avec le nombre de cellules immunitaires et la fonction des cellules immunitaires dans la période de reconstitution immunitaire post-transplantation des receveurs allogéniques-GCSH (allo-GCSH).

Matériel et Méthodes

Population de l’étude

Des échantillons de sang total hépariné et de plasma traité à l’EDTA provenant de patients recevant une allo-GCSH ont été obtenus de la cohorte prospective Vaccheminf, précédemment décrite (13). La cohorte a été approuvée par un comité d'examen régional (Comité de protection des personnes Sud-Est V, Grenoble, France, numéro 69HCL17_0769) et est enregistrée dans ClinicalTrial.gov (NCT03659773). Des patients adultes consécutifs ayant subi une allo-GCSH au service d'hématologie du CHU de Lyon ont été inclus prospectivement, une fois le consentement écrit du patient obtenu.

Lors de l'admission, les données collectées telles que les caractéristiques démographiques (âge, sexe) et les données cliniques (type de greffe, immunophénotypage, traitement immunosuppresseur, statut GvHD et traitement GvHD) ont été enregistrées à l'aide d'un formulaire électronique de rapport de cas (eCRF).

Parallèlement, 80 individus sains (HV) ont été recrutés parmi les donneurs de la banque de sang de Lyon (Etablissement Français du Sang, EFS). Selon les procédures normalisées de l'EFS pour le don de sang et les dispositions des articles R.1243–49 et suivants du code de la santé publique, une non-opposition écrite à l'utilisation du sang donné à des fins de recherche a été obtenue auprès de personnes en bonne santé. L'âge et le sexe des donneurs de sang ont été transférés de manière anonyme au laboratoire de recherche. Les autorisations réglementaires pour la manipulation et la conservation de ces échantillons ont été obtenues auprès du comité régional d'éthique (Comité de protection des personnes Sud-Est II, Bron, France) et du ministère français de la recherche (Ministère de l'Enseignement supérieur, de la Recherche et de l'Innovation, Paris, France).

Quantification de la charge virale TTV

50 μL de volume d'élution d'ADN viral ont été extraits de 200 μl de plasma à l'aide d'un extracteur easyMag (bioMérieux, France) en suivant les instructions du fabricant. La présence et la charge de TTV ont ensuite été déterminées à l’aide du kit TTV R-GENE® (bioMérieux, Marcy-l’Etoile, France) comme précédemment décrit (14,15).

Test de prolifération des cellules T

Des cellules mononucléées de sang périphérique (PBMC) ont été isolées à partir d'échantillons de sang frais héparinés par centrifugation en gradient de densité Ficoll (U-04 ; Eurobio, Les Ulis, France). Ensuite, 10⁵cellules / puits ont été incubées 24 heures dans un milieu de culture supplémenté dans une plaque de culture cellulaire à 96 puits à 37°C sous 5% de CO₂(RPMI 1640 ; Eurobio). Les PBMC ont ensuite été stimulées en double avec un mitogène, la phytohémagglutinine (PHA) à 4 µg / mL (R30852801 ; Remel, Oxoid, Thermo Fisher Scientific, USA) et incubées pendant 72 heures. Les surnageants de culture des PBMC ont été récupérés pour réaliser un test de sécrétion de l’IFNγ (IGRA, pour « IFNγ-release assay ») à l’aide de cartouches Simple Plex sur le système nanofluidique ELLA (ProteinSimple, San Jose, CA, USA) selon les indications du fabricant. La prolifération des cellules T a été analysée dans les culots avec le kit de dosage par cytométrie en flux Click-iT™ Plus EdU Alexa Fluor™ 488 (C10420 ; Life Technologies, Carlsbad, CA, USA), qui mesure l'incorporation de 5-éthynyl-2'-désoxyuridine (EdU), selon le protocole publié (16). En bref, le pourcentage de cellules proliférantes EdU⁺(parmi les cellules CD3⁺) a été obtenu par des analyses de cytométrie en flux effectuées sur un cytomètre en flux BD LSR Fortessa ™ (BD Biosciences, San Jose, CA, USA). Pour chaque expérience, on a mesuré au moins 2,5 x 10³cellules CD3⁺. Les données ont été analysées à l'aide du logiciel BD FACSDiva (version 8.0.3, BD Biosciences).

Immunophénotypage des cellules T post-transplantation

Les leucocytes et les lymphocytes T CD4⁺et CD8⁺ont été dénombrés au laboratoire d'immunologie de l'hôpital Edouard Herriot (Hospices Civils de Lyon). En outre, on a mesuré un large panel de marqueurs membranaires des lymphocytes T par cytométrie en flux sur sang total. On a ainsi compté les cellules T CD4⁺et CD8⁺naïves (CD45⁺CCR7⁺), les cellules T CD4⁺et CD8⁺à mémoire centrale (CD45RA^-CCR7⁺), les cellules T CD4⁺et CD8⁺à mémoire effectrice (CD45^-CCR7⁺) et les cellules T CD4⁺et CD8⁺à mémoire différenciée (CD45RA⁺CCR7^-) comme décrit précédemment (14). Les résultats ont été exprimés en cellules/µL.

Analyse statistique

Les données d'immunophénotypage, la charge virale TTV et la capacité de prolifération des cellules T sont exprimées en moyenne (plage). La charge TTV transformée au format Log a été utilisée pour l'analyse (Log copie/mL). Les différences entre les receveurs sains et allo-GCSH ont été calculées en utilisant un test t paramétrique non apparié avec la correction de Welch. Les corrélations ont été évaluées à l'aide d'un coefficient de corrélation rho de Pearson paramétrique. Des analyses de régression ont été effectuées pour évaluer l'association entre la variable dépendante (charge virale TTV) et les variables indépendantes (pourcentage de cellules proliférantes, nombre absolu de lymphocytes et nombre de lymphocytes T CD3⁺). L'analyse de la variance a été réalisée à l'aide de tests F. Les différences de charge en TTV plasmatique par rapport à différentes caractéristiques cliniques ont été estimées à l'aide du test de Mann-Whitney. Une valeur de p <0,05 a été considérée comme significative. Les analyses statistiques ont été réalisées à l'aide du logiciel GraphPad Prism® (version 5 ; logiciel GraphPad, La Jolla, CA, USA) et R (version 3.5.1).

Résultats

Caractéristiques de la cohorte

Des volontaires sains (n=80) et des receveurs d'allo-GCSH (n=41) ont été enrôlés entre mai 2018 et avril 2020. Les individus en bonne santé et les receveurs d'allo-GCSH ne différaient pas significativement en termes d'âge (médiane [EI] : 56 [40-64] vs 46 [31-53] ans, respectivement) et de sexe (sex-ratio : 1,6 vs 1,4, respectivement). La durée médiane [EI] après transplantation à l’enrôlement était de 6 [5-8] mois pour les receveurs d'allo-GCSH. À l'inclusion, 78% des receveurs d'allo-GCSH ont reçu des médicaments immunosuppresseurs (corticoïdes, inhibiteurs de la calcineurine, autres…), et 17% avaient une maladie chronique du greffon contre l'hôte [Table 1].

Charge virale de TTV dans les échantillons plasmatiques de volontaires sains et d'allo-GCSH

La charge virale en TTV a été étudiée dans des échantillons de plasma provenant de 80 receveurs sains et 41 receveurs allo-GCSH. La charge virale TTV a été détectée par PCR en temps réel dans 68% des échantillons sains (54/80). Concernant les receveurs allo-GCSH, tous les patients inclus dans l’étude avaient une valeur détectable de charge virale TTV. La charge virale moyenne (plage) du TTV était significativement plus élevée chez les receveurs d'allo-GCSH par rapport aux sujets sains (3,9 (0,7-7,7) vs 2,1 (0,5-4,3) Log copie/ml respectivement, p <0,0001) .

Corrélation entre la charge virale en TTV, les nombres de cellules T et capacité de prolifération de celles-ci.

Quand les receveurs d'allo-GCSH inclus 6 mois après la transplantation ont été pris en considération, la plupart de la population de sous-types de lymphocytes se situait dans des plages de valeurs normales (VN). Néanmoins, les quantités de lymphocytes T CD4⁺, CD4⁺naïf, CD4⁺mémoire centrale, CD4⁺effecteurs mémoire en différenciation terminale, CD8⁺naïf et CD8⁺mémoire centrale, ainsi que le rapport CD4⁺/CD8⁺, étaient inférieures aux valeurs normales (voir le [Table 1]).

[Table 1] Caractéristiques de base des receveurs d’allo-GCSH.

Toutes les données de laboratoire ont été enregistrées à l’enrôlement des receveurs. * D'après la révision de 2016 de la classification de l'Organisation mondiale de la santé des néoplasmes myéloïdes et lymphoïdes. # Traitements immunosuppresseurs inclus : globulines anti-thymocytes, cyclosporine, tacrolimus, méthotrexate, mycophénolate mofétil , cyclophosphamide, corticostéroïdes ≥ 1 mg / kg> 21 jours. Les sous-types et le nombre total de lymphocytes ont été mesurés par cytométrie en flux dans le laboratoire d'immunologie de l'hôpital Edouard Herriot (Hospices Civils de Lyon) en utilisant un large panel de marqueurs membranaires des lymphocytes T. Les valeurs normales indiquées sont fournies par le laboratoire de l'hôpital Edouard Herriot (Hospices Civils de Lyon).

Composition	AL n=41
	Age, médiane [EI]	56 [40-64]
	Hommes, n (%)	24 (59)
Caractéristiques hématologiques et de transplantation, n (%)
	* Maladies hématologiques sous-jacentes
		Tumeurs myéloïdes et leucémies aiguës	37 (90)
			Leucémie myéloïde aiguë et tumeurs associées	22 (54)
			Lymphome/leucémie lymphoblastique à précurseurs B	5 (12)
			Lymphome/leucémie lymphoblastique à précurseurs T	1 (2)
			Tumeurs myélodysplasiques / myéloprolifératives	1 (2)
			Syndromes myélodysplasiques	7 (17)
			Tumeur à cellules dendritiques plasmacytoïdes blastiques	1 (2)
		Tumeurs lymphoïdes, histiocytaires et dendritiques matures	4 (10)
			Maladie de Hodgkin	1 (2)
			Tumeurs à cellules B matures, T matures ou NK	3 (7)
	RC avant la greffe, n (%)	39 (95)
	Types de donneurs
		Géno-identique	17 (41)
		Haplo-identique	6 (15)
		Phéno-identique	18 (44)
			Compatibilité totale	15 (37)
			Incompatibilité HLA	3 (7)
	Sources de cellules souches
		Cellules du sang périphérique	28 (68)
		Moelle osseuse	13 (32)
	Conditionnement
		MAC	17 (41)
		RIC	24 (59)
		ICT	11 (27)
Complications post-greffe, n (%)
	GvHD aigüe	30 (73)
		Grade I/II	21/9
	GvHD chronique	7 (17)
		Limitée/Etendue	5/2
Durée depuis la greffe en mois (médiane [EI])	6 [5-8]
Immunophénotypage, médiane [EI]
	Lymphocytes totaux (VN, 1000-2800/µL)	1659 (410-5350)
	Lymphocytes T CD3⁺(VN, 521-1772/µL)	915 (175-3406)
	Lymphocytes T CD3⁺CD4⁺(VN, 336-1126/µL)	273 (38-876)
		CD4⁺naïfs (CD45⁺CCR7⁺) (VN, 121-456/µL)	45 (0-445)
		CD4⁺à mémoire centrale (CD45RA^-CCR7⁺) (VN, 92-341/µL)	60 (1-168)
		CD4⁺effecteurs mémoire (CD45RA^-CCR7^-) (VN, 59-321/µL)	163 (4-522)
		CD4⁺effecteurs mémoire en différenciation terminale (CD45RA⁺CCR7^-) (VN, 11-102/µL)	19 (0-147)
	Lymphocytes T CD3⁺CD8⁺(VN, 125-780/µL)	602 (60-2779)
		CD8⁺naïfs (CD45⁺CCR7⁺) (VN, 86-257µL)	40 (0-241)
		CD8⁺à mémoire centrale (CD45RA^-CCR7⁺) (VN, 19-93/µL)	17 (0-127)
		CD8⁺effecteurs mémoire (CD45RA^-CCR7^-) (VN, 15-162/µL)	286 (0-1517)
		CD8⁺effecteurs mémoire en différenciation terminale (CD45RA⁺CCR7^-) (VN, 39-212/µL)	257 (0-1474)
	Rapport CD4⁺/CD8⁺(VN, 0.9-6)	0,84 (0,13- 8,88)
	Lymphocytes B CD20⁺(VN, 64-593/µL)	287 (14-1299)
Traitement immunomodulateur post-greffe à l’enrôlement, n (%)
		^#traitement IS	32 (78)
		Corticostéroïdes	5 (12)
		Administration IVIG	23 (56)
		Temps depuis la dernière administration IVIG, en mois (médiane [EI])	4 [2-5]
		DLI	7 (17)
		PCE	2 (5)

Abréviations: Allo, allogénique ; DLI, perfusion de lymphocytes du donneur ; GvHD , maladie du greffon contre l'hôte ; HLA, antigène leucocytaire humain; GSCH , greffe de cellules souches hématopoïétiques ; EI, écart interquartile ; ICT, irradiation corporelle totale ; IS, immunosuppresseur ; IVIG, immunoglobulines polyclonales intraveineuses ; MAC, conditionnement myéloablatif ; NK, Natural Killer ; PCE, photochimiothérapie extracorporelle ; RC, rémission complète ; RIC, conditionnement d'intensité réduite ; VN, valeurs normales.

Par rapport aux sujets sains, outre une capacité de prolifération significativement plus faible parmi les cellules CD3⁺chez les receveurs allo-GCSH (40,5% vs 21,3% respectivement, p <0,0001), on peut également remarquer une distribution hétérogène plus importante et significative (de [2,9% à 42,3 %] et [29,7% à 55,3%] pour allo-GCSH et sujets sains respectivement ; test F p = 0,0040), sous-tendant la variabilité interindividuelle dans la reconstitution immunitaire des receveurs d'allo-GCSH (non représenté graphiquement).

En utilisant le test de corrélation de Pearson (rho [IC95]), la corrélation la plus élevée a été observée entre la charge virale TTV et la capacité de prolifération des cellules T et . Il convient de noter qu'aucune corrélation significative n'a été observée avec le nombre total de lymphocytes ou un sous-ensemble particulier de cellules (par exemple CD3⁺) (rho de Pearson ρ = -0,39 [IC95% -0,62 à -0,09]), vs (ρ = 0,13 [-0,19 à 0,42]) et (ρ = 0,09 [-0,23 à 0,38]) respectivement) et .

Caractéristiques cliniques des patients ayant des valeurs extrêmes de charge en TTV

En analysant au niveau individuel la corrélation entre la charge en TTV et la capacité de prolifération des cellules T en réponse à la stimulation PHA, nous avons remarqué que le patient (A, représenté par un carré) avec la charge virale la plus faible (0,65 Log copie/ml) avait un pourcentage élevé de cellules proliférantes (41,6%) et inversement le patient (B, représenté par un triangle) avec la charge virale la plus élevée (7,72 Log copie/ml) avait un faible pourcentage de cellules proliférantes (2,9%) . Ces deux patients (un homme et une femme) étaient dans la même tranche d'âge (50<âge<60) et étaient en rémission complète avant leur transplantation. Le patient (A) a reçu une greffe de cellules souches d'un donneur géno-identique tandis que le patient (B) a reçu une greffe de cellules sanguines périphériques d'un donneur phéno-identique. Le patient (A) a eu une évolution post-greffe simple sans faits cliniques particuliers entre la transplantation et l’enrôlement, c'est-à-dire aucun épisode infectieux, aucun GvHD et aucun traitement immunosuppresseur . Inversement, le patient (B) a reçu un traitement immunosuppresseur lourd et a souffert de GvHD aiguë et de multiples infections bactériennes/virales sévères .

Discussion

Nous avons d'abord comparé la prévalence du TTV et les charges virales dans le plasma de deux populations distinctes, 80 sujets sains immunocompétents et 41 greffés allo-GCSH immunodéprimées de la cohorte prospective monocentrique VaccHemInf (13).

Conformément à une étude récente (18), une prévalence de 68% du TTV a été observée dans les échantillons de sujets sains. En comparaison, le TTV a été trouvé dans 100% des échantillons de patients immunodéprimés. Nous avons également confirmé que la charge virale plasmatique du TTV était significativement plus élevée chez les receveurs d'allo-GCSH par rapport aux HV (10,19). Six mois après la greffe d'allo-CSH, certains patients sont donc incapables de réguler la charge virale TTV malgré un nombre suffisant de lymphocytes T. Aucune corrélation n'a été trouvée entre le délai post-transplantation [5-8 mois] et la charge virale plasmatique TTV. L'un des principaux résultats de cette étude est que la charge virale plasmatique du TTV était significativement plus élevée pour le receveur d'allo-GCSH (à 6 mois après la transplantation) par rapport aux sujets sains, confirmant ainsi des observations de Tyagi et al., 2013 (délai post-transplantation non précisé) ou Masouridi et al., 2016 (2-3 mois après la greffe) (10,18). Ce résultat pourrait s'expliquer par le fait que les cellules T, principales cellules de la réponse immunitaire contre l'infection virale (19,20), sont l'un des principaux sites de réplication des TTV (21,22). Chez les receveurs allo-GCSH à 6 mois après la greffe, la multiplication des lymphocytes T est en cours, puisque le système immunitaire est en train de se reconstituer, ce qui fournit un grand nombre de cellules où le virus peut se répliquer. Il a également été décrit que la charge de TTV est maximale environ 3 à 6 mois après la transplantation avant de revenir à une valeur dite normale (23,24). On pourrait donc faire l'hypothèse que les TTV utiliseraient la croissance des cellules T, encore naïves et non fonctionnelles, pour se répliquer avant d'être finalement régulées par le système immunitaire et par les cellules T fonctionnelles, suggérant ainsi un lien important entre la charge virale TTV et la fonction immunitaire. Dans cette étude, on a évalué la corrélation entre la charge plasmatique du TTV et un marqueur quantitatif, la numération des cellules immunitaires, déjà évaluée dans plusieurs études mais avec des résultats contradictoires (17,23-25), et un marqueur qualitatif de la reconstitution immunitaire, la mesure de prolifération des cellules T après une stimulation non spécifique. Aucun impact de la période entre la transplantation allo-GCSH et l’enrôlement n'a été observé . Malgré l’hétérogénéité de la distribution de valeur de prolifération des cellules T hétérogène, qui souligne la variabilité interindividuelle d'une population immunodéprimée, nous avons observé une corrélation plus élevée entre la charge virale TTV et la prolifération des cellules T qu'avec la numération des cellules immunes . Plus précisément, il s’agit de manière intéressante d’une corrélation inverse, suggérant que plus il y a de cellules immunitaires fonctionnelles et plus la charge en TTV est faible. Ce résultat est cohérent avec ceux décrits en 2013 par De Vlamincket al.(11) en greffe d'organes solides où la diminution du niveau d'immunosuppression était corrélée à la diminution de la charge virale TTV. Cela correspond également aux nombreuses descriptions de la cinétique de charge virale du TTV après transplantation (23,26), dans lesquelles une phase de diminution liée aux traitements immunosuppresseurs est tout d’abord observée, suivie d’une phase de croissance associée à l'expansion des cellules immunitaires compétentes pour la réplication du TTV, puis d’une phase de stabilisation et enfin d’une diminution de la charge virale à un niveau basal, reflétant une reconstitution immunitaire fonctionnelle. On peut penser que, 6 mois après la greffe allo-GCSH, il y aurait un nombre suffisant de cellules immunitaires en expansion pour permettre une réplication significative des TTV, mais elles ne seraient pas suffisamment fonctionnelles pour réguler la charge virale du TTV. Les patients immunodéprimés seraient donc incapables de réguler la charge virale TTV malgré un nombre suffisant de lymphocytes T. C'est également le cas avec d'autres virus classiquement décrits chez les receveurs d'allo-GCSH tels que le cytomégalovirus (CMV) ou le virus d'Epstein-Barr (EBV) (24,27,28). Dans notre cohorte, 24% et 37% de nos patients ont été infectés respectivement par ces deux virus. Ceci est également cohérent avec les observations faites pour nos patients avec des valeurs de charge virale TTV extrêmes.

La charge virale du TTV a également été associée au nombre de cellules T CD8⁺/CD57⁺, un sous-type de lymphocyte décrit comme un marqueur potentiel de l'immunosénescence et augmentant au cours de certaines pathologies telles que les états d'immunodéficience acquise, les transplantations ou les infections virales persistantes. Tous ces résultats suggèrent qu'il existe donc un lien potentiellement important entre les TTV et la fonction du système immunitaire, notamment en ce qui concerne sa capacité à réguler la charge virale.

Dans notre étude, aucun impact de diverses caractéristiques cliniques (par exemple état, maladie sous-jacente, traitement immunosuppresseur ou GvHD) sur la charge en TTV n'a été observé ([Table 2]).

[Table 2] Comparaison de la charge plasmatique en TTV avec les caractéristiques cliniques of 41 receveurs d’allo-GCSH.

Toutes les données ont été enregistrées au moment de l’enrôlement du receveur. * D'après la révision de 2016 de la classification de l'Organisation mondiale de la santé des néoplasmes myéloïdes et lymphoïdes. # Traitements immunosuppresseurs inclus : globulines anti-thymocytes, cyclosporine, tacrolimus, méthotrexate, mycophénolate mofétil , cyclophosphamide, corticostéroïdes ≥ 1 mg / kg> 21 jours. La charge plasmatique en TTV médiane [ EI ] TTV a été comparée avec les données cliniques en utilisant le test de Mann-Whitney (***, p< 0,001).

		n (%)	TTV Log cp/mL median [EI]	p -value
Sexe
	Hommes	24 (59)	3,7 [2,9-4,8]	0,38
	Femmes	17 (41)	4,1 [3,5-4,4]	0,38
Maladies hématologiques
	Tumeurs myéloïdes et leucémies aiguës	37 (90)	3,9 [3,1-4,4]	0,28
	Tumeurs lymphoïdes, histiocytaires et dendritiques matures	4 (10)	5,0 [3,8-5,8]	0,28
Types de donneur
	Géno-identique	17 (41)	3,7 [3,2-4,3]	0,52
	Haplo-identique	6 (15)	4,4 [3,3-5,1]
	Phéno-identique	18 (44)	4,1 [3,2-4,7]
Sources de cellules souches
	Cellules du sang périphérique	28 (68)	4,0 [3,1-4,8]	0,43
	Moelle osseuse	13 (32)	3,7 [3,2-4,1]	0,43
Conditionnement
	MAC	17 (41)	3,6 [2,9-4,2]	0,22
	RIC	24 (59)	4,1 [3,1-4,9]	0,22
ICT
	Oui	11 (27)	3,7 [2,9-4,5]	0,46
	Non	30 (73)	4,1 [3,1-4,6]	0,46
GVHD
	Oui	31 (76)	3,7 [3,0-4,8]	0,4
	Non	10 (24)	4,1 [3,8-4,3]	0,4
Statut de la GVHD
	Aigüe	30 (73)	3,9[2,9-4,8]	0,65
	Chronique	7 (17)	3,6 [3,0-4,2]	0,65
Traitement immunosuppresseur
	Oui	32 (78)	3,9 [3,0-4,4]	0,54
	Non	9 (22)	4,0 [3,2-4,9]	0,54
Administration IVIG
	Oui	23 (56)	3,9 [3,0-4,5]	0,59
	Non	18 (44)	4,1 [3,2-4,7]	0,59

Abréviations : GvHD , maladie du greffon contre l’hôte ; EI, écart interquartile ; immunoglobulines polyclonales intraveineuses ; MAC, conditionnement myéloablatif ; RIC, conditionnement d'intensité réduite ; ICT, irradiation corporelle totale ; TTV, Torque Teno Virus.

En résumé, cette étude établit l’existence d’une corrélation entre la charge virale TTV et la fonction des cellules T, et montre que cette corrélation est indépendante du nombre de cellules.

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Claims

Méthode pour déterminer la capacité de prolifération des lymphocytes T chez un sujet, la méthode comprenant des étapes de :
a) mesure de la charge en TTV à partir d’un échantillon biologique dudit sujet ; et
b) détermination de la capacité de prolifération des lymphocytes T au vu de la charge virale mesurée en a).
Méthode selon la revendication 1, caractérisée en ce que la charge en TTV est mesurée par amplification, séquençage ou hybridation d’une séquence de TTV, préférablement par amplification, plus préférablement par PCR en temps réel.
Méthode selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que l’échantillon biologique est un échantillon de sang total, de plasma ou de sérum.
Méthode selon l’une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que la détermination de l’étape b) comprend la comparaison de la charge en TTV mesurée en a) avec une charge en TTV de référence.
Méthode selon l’une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que l’échantillon biologique provient d’un sujet qui a reçu une greffe.
Méthode selon la revendication 5, caractérisée en ce que l’échantillon biologique provient d’un sujet qui a reçu une greffe de cellules souches hématopoïétiques (GCSH), préférentiellement une allo-GCSH.
Méthode selon l’une quelconque des revendications 5 ou 6, caractérisée en ce que l’échantillon biologique provient d’un sujet qui a subi un conditionnement, préférablement myéloablatif ou atténué, avant la greffe.
Méthode de suivi de l’activité des lymphocytes T chez un patient ayant reçu une allo-GCSH, la méthode comprenant des étapes de :
a) mesure de la capacité de prolifération des lymphocytes T chez le patient à un premier instant selon l’une quelconque des revendications 1 à 6 ;
b) comparaison de la capacité de prolifération des lymphocytes T mesurée en a) avec une la capacité de prolifération des lymphocytes T de référence ; et
c) détermination de la variation de l’activité des lymphocytes T du patient au vu de la comparaison de l’étape b).
Méthode de détermination de la susceptibilité aux infections microbiennes chez un patient ayant reçu une allo-GCSH, la méthode comprenant des étapes de :
a) mesure de la capacité de prolifération des lymphocytes T chez le patient à un premier instant selon l’une quelconque des revendications 1à 6 ;
b) comparaison de la capacité de prolifération des lymphocytes T mesurée en a) avec une la capacité de prolifération des lymphocytes T de référence ; et
c) détermination de la susceptibilité aux infections microbiennes du patient au vu de la comparaison de l’étape b).
Méthode selon la revendication 9, caractérisée en ce que l’infection microbienne est une infection virale, bactérienne, parasitaire ou fongique.
Méthode de détermination de la susceptibilité à la maladie du greffon contre l'hôte (GvHD) chez un patient ayant reçu une allo-GCSH, la méthode comprenant des étapes de :
a) mesure de la capacité de prolifération des lymphocytes T chez le patient à un premier instant selon l’une quelconque des revendications 1 à 6 ;
b) comparaison de la capacité de prolifération des lymphocytes T mesurée en a) avec une la capacité de prolifération des lymphocytes T de référence ; et
c) détermination de la susceptibilité à la GvHD du patient au vu de la comparaison de l’étape b).
Méthode selon l’une quelconque des revendications 8 à 11, caractérisée en ce que la capacité de prolifération des lymphocytes T de référence est la capacité de prolifération des lymphocytes T d’un individu sain ou la capacité de prolifération des lymphocytes T d’un individu immunodéprimé.
Méthode selon l’une quelconque des revendications 8 à 11, caractérisée en ce que la capacité de prolifération des lymphocytes T de référence est la capacité de prolifération des lymphocytes T mesurée chez le patient à un second instant.