WO2023002120A1 - Utilisation du virus torque teno (ttv) en tant que marqueurs pour determiner le risque de complication chez un patient admis au sein d'un etablissement de sante - Google Patents

Utilisation du virus torque teno (ttv) en tant que marqueurs pour determiner le risque de complication chez un patient admis au sein d'un etablissement de sante Download PDF

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WO2023002120A1
WO2023002120A1 PCT/FR2022/051436 FR2022051436W WO2023002120A1 WO 2023002120 A1 WO2023002120 A1 WO 2023002120A1 FR 2022051436 W FR2022051436 W FR 2022051436W WO 2023002120 A1 WO2023002120 A1 WO 2023002120A1
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WO
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ttv
patient
viral load
risk
biological sample
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Application number
PCT/FR2022/051436
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François Mallet
Original Assignee
Biomerieux
Bioaster
Hospices Civils De Lyon
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C12Q1/705—Specific hybridization probes for herpetoviridae, e.g. herpes simplex, varicella zoster

Definitions

  • TITLE USE OF THE TORQUE TENO VIRUS (TTV) AS MARKERS TO DETERMINE THE RISK OF COMPLICATION IN A PATIENT ADMITTED TO A HEALTHCARE ESTABLISHMENT
  • Hpv herpesvirus
  • TTV torque teno virus
  • a first object of the present invention relates to a method for in vitro or ex vivo evaluation of the risk of complication in a patient admitted to a healthcare establishment, comprising measuring the viral load of at least one torque teno virus (TTV) in a biological sample from said patient, characterized in that said patient is not under immunosuppressive treatment.
  • TTV torque teno virus
  • said method is characterized in that the patient is a patient admitted to a hospital, preferably to the emergency department, the resuscitation department, to an intensive care unit or to a ongoing care.
  • said method is characterized in that said patient is a patient in a septic state, more particularly, in septic shock, a patient suffering from burns, more particularly severe burns, a patient suffering from trauma, more particularly severe trauma, or a patient who has undergone surgery, more particularly major surgery.
  • said method is characterized in that the biological sample comes from a patient in a septic state, suffering from burns, suffering from trauma or having undergone a surgical operation, and admitted to an intensive care unit .
  • said method is characterized in that the complication consists of the occurrence of a healthcare-associated infection (HAI).
  • HAI healthcare-associated infection
  • said method is characterized in that it comprises the implementation of the steps consisting in: a) measuring the viral load of at least one TTV in a biological sample from said patient, b) comparing the viral load determined for said biological sample with a predetermined reference value, and c) establishing a risk of complication when the viral load determined for said sample is higher or lower than the predetermined reference value.
  • said method is characterized in that the predetermined reference value is 10,000 copies/ml.
  • said method is characterized in that it comprises the implementation of the steps consisting in: a) measuring a first viral load of at least one TTV in said biological sample of the patient from a first sample taken at time T1, b) measuring a second viral load of at least one TTV in said biological sample of the patient from a second sample taken at time T2, c) calculating the variation between the viral load at T2 and the viral load at T1, giving an ATTV value, d) establishing a conclusion as to the risk of complication, based on the result of the comparisons.
  • the method is characterized in that it comprises the implementation of the steps consisting in: a) measuring a first viral load of at least one TTV in said biological sample of the patient from a first sample taken at time T1, b) measuring a second viral load of at least one TTV in said biological sample of the patient from a second sample taken at time T2, c) calculating the variation between the viral load at T2 and the load viral at T1 , giving an ATTV value, d) draw a conclusion as to the absence of an increased risk of complication when the ATTV value is within the range from -1.25 to +1.25, preferably -1.20 to +1.20, and more preferably from -1.10 to +1.10.
  • said method is characterized in that it also comprises the detection of the presence of at least one Herpesvirus (HPV).
  • HPV Herpesvirus
  • said method is characterized in that it also comprises measuring the viral load of at least one Herpesvirus (HPV).
  • HPV Herpesvirus
  • said at least one Herpesvirus is selected from the group consisting of: CMV, EBV, HHV6 and HSV-1, and is preferably EBV.
  • said method is characterized in that the viral load is measured by amplification, sequencing or hybridization of at least one sequence of TTV, and of at least one Herpes virus where appropriate, preferably by amplification , more preferably by real-time PCR.
  • said method is characterized in that the biological sample is a biological fluid from the patient, said fluid being selected from the group consisting of: blood or its derivatives such as plasma and/or serum , cerebrospinal fluid, urine, and bronchoalveolar lavages.
  • the subject of the present invention is a method for evaluating a risk of complication, for example a healthcare-associated infection (HAI), in a patient not taking immunosuppressive treatment, admitted to a healthcare establishment.
  • a risk of complication for example a healthcare-associated infection (HAI)
  • HAI healthcare-associated infection
  • TTV torque teno virus
  • the co-detection from the first week following the patient's admission, particularly in the intensive care unit, of a high viral load in TTV associated with the presence of at least one herpesvirus is correlated with a risk of occurrence of a healthcare-associated infection (HAI).
  • HAI healthcare-associated infection
  • the subject of the present description is a method for in vitro or ex vivo evaluation of the risk of complications in a patient not taking immunosuppressive treatment, admitted to a health establishment, based on a measurement of the viral load of at least one TTV in a biological sample from said patient.
  • a method is described here for the in vitro or ex vivo evaluation of the risk of complication in a patient admitted to a health establishment, comprising measuring the viral load of at least one TTV in a biological sample from said patient, characterized in that said patient is not under immunosuppressive treatment.
  • a variation in the viral load in TTV during the first month following admission to the healthcare establishment indicates a risk of developing an HAI.
  • the expression "assessment of the risk of complication in a patient” or “determine a risk of complication in a patient” means here the determination of a probability for a given subject or patient to develop a complication, as defined below, in the future.
  • the methods disclosed here represent tools for assessing said risk, and can be combined with other methods, methods or indicators such as clinical examination, taking a biological sample from said patient and detecting one or more biomarkers and/or of one or more infectious agents, in particular bacteria, viruses, parasites or yeasts and filamentous fungi.
  • plication is meant here the unfavorable evolution of a disease, a state of health or a medical treatment.
  • a “complication”, as it is understood here, can be in particular the unfavorable evolution of a disease which may require the installation of one or more invasive medical devices, such as for example a tracheal intubation, the placement of a urinary catheter, the placement of a catheter or a central line.
  • plication also means the unfavorable evolution of a disease which may have the effect of extending the duration of care in the said health establishment, in particular in the intensive care unit.
  • “Complication” also means the death of said patient.
  • the term "complication” also means the unfavorable evolution of a disease that may require the implementation of a specific medical treatment.
  • An example of such a complication is the development of a secondary infection or opportunistic infection, in particular a "care-associated infection” or "HAI”, such as an infection by one or more of the infectious agents, for example of bacteria, viruses, parasites or yeasts and filamentous fungi.
  • HAI care-associated infection
  • an infection is said to be “associated with care”, if it occurs during the management (diagnostic, therapeutic, palliative, preventive, educational or operative) of a patient by a healthcare professional. health, and if she was not present at the start of treatment.
  • Healthcare-associated infections include infections contracted in a health facility (known as nosocomial infections) but also during care delivered outside this setting. When the infectious state at the start of treatment is not precisely known, a delay of at least 48 hours or a delay longer than the incubation period is commonly accepted to define an HAI.
  • Healthcare-related infection can be of bacterial origin, such as bacteria such as Escherichia coli, Staphylococcus aureus (staphylococcus aureus) or Pseudomonas aeruginosa.
  • the infection can also be of fungal origin, in particular by a yeast of the Candida genus, or a filamentous fungus of the Aspergillus genus, in particular Aspergillus fumigatus.
  • the infection can also be of the viral type, in particular by a virus of the Adenovirus, Herpesvirus, Enterovirus, Rotavirus or HIV type. It can also be the reactivation of potentially pathogenic latent viruses, such as herpes viruses, for example the CMV, EBV, HHV6 and HSV-1 viruses.
  • the description relates to an in vitro or ex vivo method for evaluating a risk of complication in a patient not taking immunosuppressive treatment, said complication being the occurrence of a healthcare-associated infection (HAI).
  • HAI healthcare-associated infection
  • G IAS can be a nosocomial infection.
  • the method described here makes it possible to determine the risk of occurrence of a nosocomial infection in said patient.
  • the process described here makes it possible to determine the risk of occurrence of a secondary infection.
  • the method described here is based in particular on measuring the viral load of at least one TTV in a biological sample from the patient.
  • Bio sample means any sample that can be taken from a subject.
  • the biological sample must allow the determination of the TTV and/or Herpesvirus (HPV) load.
  • the biological sample includes, but is not limited to, whole blood, serum, plasma, sputum, nasopharyngeal swabs, urine, stool, skin, cerebrospinal fluid, saliva, gastric secretions, semen, seminal fluid, tears, tissue or spinal fluid, cerebral fluid, trigeminal ganglion sample, sacral ganglion sample, adipose tissue, lymphoid tissue, placental tissue, upper reproductive tract tissue, gastrointestinal tract tissue, genital tissue and central nervous system tissue.
  • this sample can be a biological fluid, such as a blood sample or a sample derived from blood, which can in particular be chosen from whole blood (as collected from the venous route, that is to say containing the white and red cells, platelets and plasma), plasma, serum, as well as any type(s) of cells extracted from blood, such as peripheral blood mononuclear cells (or PBMC, containing lymphocytes (B, T and NK cells), dendritic cells and monocytes), subpopulations of B cells, purified monocytes, or neutrophils.
  • the sample to be tested can be used directly from the biological source or following a pre-treatment to modify the character of the sample.
  • pretreatment may include the preparation of plasma from blood, the dilution of viscous fluids, and so on.
  • Pretreatment processes may also involve filtration, precipitation, dilution, distillation, mixing, concentration, inactivation of interfering components, addition of reagents, lysis, etc. Additionally, it may be beneficial to modify a solid test sample to form a liquid medium or to release the analyte.
  • the biological sample is a biological fluid from the patient, said fluid being selected from the group consisting of: blood or its derivatives such as plasma and/or serum, cerebrospinal fluid, urine, and bronchoalveolar lavages.
  • the biological sample is a sample of blood or one of its derivatives such as plasma and/or serum.
  • subject herein refers to a vertebrate, preferably a mammal and most preferably a human.
  • a human subject may also be called a “patient”.
  • patient we refer here more particularly to a human subject who has come into contact with a health professional, such as a doctor (for example, a general practitioner) or a medical structure or a health establishment (for example, a hospital, and more particularly the emergency department, the intensive care unit, an intensive care unit or a continuing care unit, or a medical structure for the elderly, of the EHPAD type).
  • a health professional such as a doctor (for example, a general practitioner) or a medical structure or a health establishment (for example, a hospital, and more particularly the emergency department, the intensive care unit, an intensive care unit or a continuing care unit, or a medical structure for the elderly, of the EHPAD type).
  • a health professional such as a doctor (for example, a general practitioner) or a medical structure or a health establishment (for example, a hospital, and more particularly the emergency department, the intensive care unit, an intensive care unit or a continuing care unit, or a medical structure for the elderly, of the EHPAD type).
  • the patient may be an
  • said evaluation method makes it possible to determine the risk of developing a complication in a patient who is not under immunosuppressive treatment.
  • “Patient who is not on immunosuppressive treatment” means that said patient is not taking immunosuppressive drugs, or drugs with immunosuppressive side effects, nor is he undergoing any treatment that may induce immunosuppression.
  • an “immunosuppressive treatment” may in particular be a treatment implementing glucocorticoids, cytostatics, interferons, antiproliferative and antimetabolic drugs (rapamycin, everolimus, mycophenolate mofetil, mycophenolic acid), inhibitors of calcineurin, in particular for their anti-graft rejection action (ciclosporin, tacrolimus (FK506), voclosporin), S1P-R agonists (FTY720), malononitrilamides (FK778), antibodies such as, for example, antithymocyte globulin or certain monoclonal antibodies directed against specific antigens such as muromonab-CD3, daclizumab, basiliximab, rituximab, ale
  • immunosuppressive treatment also means radiotherapy or chemotherapy.
  • the description relates to an in vitro or ex vivo method for evaluating a risk of complication in a patient not taking immunosuppressive treatment admitted to a hospital, in particular to the emergency department, intensive care unit, intensive care unit or continuing care unit.
  • emergency service is meant the service which concerns the reception of the sick and injured who present themselves spontaneously or brought by ambulances or firefighters' rapid-rescue vehicles.
  • the role of the emergency department is to welcome without selection twenty-four hours a day, every day of the year, any person presenting themselves in an emergency situation, including psychiatric, and to take care of them, in particular in case of vital distress and emergency.
  • resuscitation service we mean the specialized service where the most serious patients are hospitalized. They benefit from constant monitoring of vital functions such as ventilation, oxygenation, blood pressure, cardiac and renal functions. If necessary, an assistance of these vital functions can be put in place in order to allow the patient's survival if possible. Patients are admitted to intensive care if they have a failure of a vital function such as, for example, during a serious infection (septic shock), drug intoxication, polytrauma, coma, acute renal failure, acute respiratory failure, after cardiac arrest or postoperatively after major surgery such as cardiac or digestive surgery.
  • a vital function such as, for example, during a serious infection (septic shock), drug intoxication, polytrauma, coma, acute renal failure, acute respiratory failure, after cardiac arrest or postoperatively after major surgery such as cardiac or digestive surgery.
  • intensive care unit or “intensive care service” or “ICU” is meant the service whose mission is to take care of patients in critical condition, that is to say who present a failure of at least least a vital function, or who are at risk of developing a severe complication.
  • the intensive care unit has very specialized technical means. These are implemented on an ongoing basis by a multidisciplinary team in order to detect, prevent and correct acute and presumed reversible imbalances related to the underlying condition (illness, surgery, trauma, intoxication, burns, sepsis).
  • continuous care unit or “continuous monitoring unit” or “USC”
  • continuous monitoring units take care of patients whose condition and treatment raise fears of the occurrence of one or more vital failures patients whose condition, on emerging from one or more vital failures (after a stay in intensive care , for example), is too severe or unstable to allow return to a conventional inpatient unit.
  • Continuous monitoring units constitute an intermediate level between resuscitation services on the one hand and conventional care services on the other.
  • the present in vitro or ex vivo evaluation method makes it possible to evaluate a risk of complication in a patient admitted to an intensive care unit.
  • the present evaluation method is more particularly suited to the evaluation of a risk of complication in a patient who has suffered an immuno-inflammatory attack.
  • immuno-inflammatory attack we mean a trauma or injury that has the effect of inducing a hyper-inflammatory response in the patient’s body.
  • the persistence of the latter leads to acquired immunosuppression, linked to an anti-inflammatory profile, and ultimately the inability to control infections.
  • This phenomenon also known as immunoparalysis, is characterized by the downregulation of the expression of major histocompatibility complex class II molecules on the surface of monocytes, but not B cells. monocyte/macrophage function reduces the release of immune complexes, impairs antigen-presenting abilities, and decreases natural killer cell (NK) cell function.
  • NK natural killer cell
  • An "immuno-inflammatory attack” includes in particular trauma for patients with trauma, burns for patients with burns, surgery for patients who have undergone surgery or sepsis for patients in a septic state.
  • the description relates to an in vitro or ex vivo method for evaluating a risk of complication in a patient not taking immunosuppressive treatment, said patient being in a septic state, more particularly in septic shock, and/or a patient with burn(s), more particularly severe burn(s), and/or a patient with trauma(s), more particularly severe trauma(s), and/or a patient with undergone a surgical operation, more particularly a major surgical operation.
  • sepsis patient or “sepsis patient” is meant a patient with at least one life-threatening organ failure caused by an inappropriate host response to an infection.
  • septic shock is meant a subtype of sepsis, in which hypotension persists, despite adequate vascular filling.
  • “Patient with burn(s)” means that the patient has cellular destruction of the skin and underlying structures caused by a thermal burn and/or an electrical burn and/or a chemical burn and/or a burn by radiation.
  • a burn can be superficial, intermediate, or deeper and have a generalized or particular location such as the neck, face, eyes, hands, feet, joints or other parts of the body.
  • severe burn(s) or "patient suffering from severe burn(s)” is meant a patient whose burnt body surface is greater than 15% of the total body surface, preferably greater than 20%, preferably greater than 25%, and very particularly greater than 30% of the total surface of the body.
  • patient with trauma(s) is meant a patient admitted directly to an intensive care unit.
  • Patient with severe trauma(s) means a patient with an injury severity score (ISS, injury severity score, Baker et al, 1974) greater than 15, preferably greater than 20 and more preferably, greater than 25.
  • ISS injury severity score
  • Surgical patient means a patient who has undergone an invasive surgical procedure intended to treat a medical condition such as disease or injury, to aid or improve bodily function, appearance, or to repair injured areas.
  • Major surgery or “patient who has undergone major surgery” means a surgical procedure presenting a technical difficulty and/or presenting a haemorrhagic risk and/or presenting a risk of death and/or long duration (such as example greater than 3 hours, preferably greater than 4 hours such as for example 5 hours or 6 hours, or even more), and/or requiring significant post-operative care.
  • major surgery means surgery planned for at least one of the following indications: esophago gastrectomy, Bricker's bladder resection (total resection of the bladder with reconstruction from the small intestine) , cephalic pancreaticoduodenectomy (Whipple procedure) and/or abdominal aortic aneurysm surgery by laparotomy.
  • the inventors therefore studied the phenomena of viral reactivation in patients in healthcare establishments. More specifically, they measured the presence and/or the variation of the viral load in TTV in biological samples from said patients at different times during their care in a healthcare establishment.
  • the inventors have in particular observed that the viral load could change over time depending on the patient. In particular, they surprisingly found that this change is an indicator of a risk of occurrence of a healthcare-associated infection and/or a risk of extending the duration of treatment. Thus, the inventors have developed a process for in vitro or ex vivo evaluation of the risk of complications in a patient admitted to a healthcare establishment.
  • TTV Transmission Teno virus
  • a TTV as understood here is a non-enveloped virus, with a circular single-stranded DNA genome of negative polarity.
  • TTV genome it is here referred to all the genomes of all the Anelloviridae, and in particular the genomes of the genera Alphatorquevirus (TTV), Betatorquevirus (TTMV), and Gammatorquevirus (TTMDV) found in humans.
  • TTV Alphatorquevirus
  • TTMV Betatorquevirus
  • TTMDV Gammatorquevirus
  • TTV-1a the genome of the prototype strain of the Torque Teno virus, TTV-1a. More specifically, an example of a TTV genome is a sequence such as for example that which is represented by SEQ ID No 1 and whose Genbank accession number is AB017610.
  • TTV produces chronic infections with no clearly associated clinical manifestation.
  • the TTV genome has a size of about 3.8 kb.
  • the structure and genomic organization of TTVs is well known to those skilled in the art (cf. for example refer to Biagini, Curr Top Microbiol Immunol.ll'l: 21-33, 2009) and is exemplified in [Fig 1 ].
  • the TTV genome can be divided into an untranslated region (UTR) of approximately 1-1.2 kb and a potential coding region of approximately 2.6-2.8 kb.
  • the coding region contains in particular two large open reading frames: ORF1 and ORF2, coding two proteins of 770 and 202 residues respectively.
  • ORF1 and ORF2 are between nucleotides 589-2901 and 107-715, respectively.
  • the TTV genome may have other open reading frames.
  • the TTV genome may include two additional reading frames, ORF3 and ORF4 [Fig 1].
  • the UTR untranslated region is well conserved. It comprises in particular a GC-rich sequence capable of forming a secondary structure.
  • the amplification of selected sequences in the UTR-5' untranslated region has demonstrated that the prevalence of the virus is very high throughout the entire world population (Hu et al., J Clin Microbiol. 43(8) : 3747-3754, 2005).
  • This region comprises in particular a sequence of 128 bp and can be amplified by methods known to those skilled in the art, such as for example the TTV R-GENE® diagnostic kit (bioMérieux, France).
  • viral load we mean the number of viral particles present in a biological sample. Viral load reflects the severity of a viral infection. The viral load can be determined by measuring the amount of one of the components of the virus (genomic DNA, mRNA, protein, etc.) in the biological sample.
  • the viral load thus refers to the proportion of nucleic acid sequences belonging to said virus in a biological sample. More preferentially, the viral load represents the number of copies of the genome of said virus in a biological sample.
  • the viral load represents the TTV load.
  • the “TTV load” corresponds here more particularly to the TTV viral load, that is to say the number of TTV viral particles present in a biological sample.
  • TTV load in a patient means the viral load of any TTV harbored by said patient.
  • the TTV load can be determined by measuring the amount of a TTV component in this biological sample.
  • the TTV load corresponds to the quantity of TTV nucleic acid sequences present in a biological sample.
  • the determination of the TTV load in a patient according to the method of the invention comprises the estimation of the number of sequences of all the TTVs in a biological sample of said patient.
  • the detection of a high viral load in TTV and particularly, the detection of a variation in the load in TTV is associated with an increased risk of complication, in particular of occurrence of an infection associated with care, independently of the strain or strains of Anelloviridae detected.
  • the determination of the TTV load comprises the determination of the quantity of active and/or inactive viral copies. It consists of determining the quantity of circulating, integrated or latent viral copies.
  • limit of detection or “LOD”, is meant the smallest quantity of copy of the genome that can be distinguished from an absence of detection (blank value) using viral standards. Then, by extrapolation from standard curves, it is then possible to determine a viral load in copies of viral DNA per pL in the reaction tube, then in copies of viral DNA per mL in said sample.
  • a high TTV viral load is considered to be a viral load in the biological sample greater than 7,000 copies per mL of biological sample such as, for example, blood or one of its derivatives. such as plasma and/or serum, preferably greater than 10,000 copies per mL of plasma, preferably greater than 20,000 copies per mL of sample biological, and more preferably, greater than 40,000 copies per mL of biological sample.
  • biological sample such as, for example, blood or one of its derivatives.
  • plasma and/or serum preferably greater than 10,000 copies per mL of plasma, preferably greater than 20,000 copies per mL of sample biological, and more preferably, greater than 40,000 copies per mL of biological sample.
  • TTV levels - and therefore TTV load - can be determined according to methods well known to those skilled in the art by measuring levels of TTV DNA, TTV RNA or TTV proteins.
  • the method according to the invention can thus comprise between the taking of the sample from the patient and step a) as defined below, another preliminary step corresponding to the transformation of the biological sample into a DNA sample. double-stranded, or into a sample of mRNA (or corresponding cDNA), or into a sample of proteins, which is then ready to be used for the in vitro measurement of the viral load in TTV in step a) as as defined below.
  • the double-stranded DNA can correspond either to the entire TTV genome, or only to a part of it.
  • detection of TTVs can be performed, depending on the type of sample or transformation, either by genomic DNA (i.e. based on the presence of at least one sequence consisting of at least part of the TTV genome), or by mRNA (i.e. based on the TTV mRNA content in the sample), or at the protein level (i.e. based on the TTV protein content in the sample).
  • TTV levels are determined by measuring levels of TTV nucleic acid, more preferably TTV DNA.
  • Methods for detecting a nucleic acid in a biological sample include, among others, amplification, preferably PCR amplification, more preferably real-time PCR, sequencing, hybridization with a labeled probe.
  • the description therefore relates to a method for in vitro or ex vivo evaluation of the risk of complications in a patient not taking immunosuppressive treatment admitted to a health establishment, comprising measuring the viral load of at least one torque teno virus (TTV) in a biological sample from said patient, said viral load being measured by amplification, sequencing or hybridization of at least one TTV sequence preferably by amplification, more preferably by real-time PCR.
  • TTV torque teno virus
  • the TTV load is determined by amplifying the TTV sequences.
  • a preferred approach consists in amplifying sequences which are known to be specific for the TTV genome, and in particular preferably at least one sequence of the UTR untranslated region of the TTVs as defined previously.
  • telomere sequence of the TTV genome is meant here a sequence which is present in the majority of the known TTVs, but which is absent from the majority of the other viruses, in particular from the majority of the other anelloviruses.
  • a TTV specific sequence is present in at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99% of known TTV genomes. More preferably, it is present in 100% of known TTV genomes.
  • a TTV-specific sequence is present in less than 10%, less than 5%, less than 4%, less than 3%, less than 2%, less than 1% of known non-TTV anellovirus genomes.
  • a TTV-specific sequence is absent from all known non-TTV anellovirus genomes.
  • a sequence is for example a sequence comprised in the UTR untranslated region which is well conserved from one TTV to another. More particularly, such a sequence can correspond to the 128 bp sequence of the 5'-UTR untranslated region which can be amplified according to methods known to those skilled in the art, for example using the TTV R diagnostic kit - GENE® (bioMérieux, France).
  • the method described here comprises the use of primers and probes for the amplification of sequences known to be specific for the TTV genome.
  • these primers are preferably oligonucleotides.
  • these primers can comprise less than 30 nucleotides, at least 25 nucleotides, less than 20 nucleotides, less than 15 nucleotides or less than 12 nucleotides.
  • these primers comprise at least 12, 15, 20.25 or 30 nucleotides.
  • the primers used comprise between 12 and 20 nucleotides, between 12 and 25 nucleotides, between 15 and 20 nucleotides or even between 15 and 25 nucleotides.
  • the A person skilled in the art knows how to determine the length and the sequence of the primers to be used to amplify the specific sequence(s) of the TTVs. It could, for example, use the same primers as those supplied in the TTV R-GENE® diagnostic kit (ref. 423414 and 69-030B, bioMérieux, France).
  • the amplification techniques include in particular isothermal methods and techniques based on PCR (Polymerase Chain Reaction).
  • Isothermal amplification methods include a large number of methods. The most used to detect pathogens are the LAMP (Loop-Mediated Amplification) and RPA (Recombinase Polymerase Amplification) methods.
  • Isothermal amplification methods also include methods such as, for example, NASBA (nucleic acid sequence-based amplification), HDA (helicase-dependent amplification), RCA (rolling circle amplification) and SDA (strand displacement amplification), EXPAR ( exponential amplification reaction), ICANs (isothermal and chimeric primer-initiated amplification of nucleic acids), SMART (signal-mediated amplification of RNA technology), etc. (see for example Asiallo and Baeumner, Lab Chip 11(8): 1420-1430, 2011).
  • NASBA nucleic acid sequence-based amplification
  • HDA helicase-dependent amplification
  • RCA rolling circle amplification
  • SDA strand displacement amplification
  • EXPAR exponential amplification reaction
  • ICANs isothermal and chimeric primer-initiated amplification of nucleic acids
  • SMART signal-mediated amplification of RNA technology
  • the PCR technique used quantitatively measures the initial amounts of DNA, cDNA or RNA.
  • PCR-based techniques that may be used in the methods described herein include, without limitation, techniques such as real-time PCR (Q-PCR), reverse PCR (RT-PCR), multiplex reverse PCR , real-time reverse PCR (QRT-PCR) and digital PCR (or digital PCR). These techniques are well known technologies and readily available to those skilled in the art.
  • the determination of the TTV load is carried out by real-time quantitative PCR.
  • Numerous methods for the detection and quantification of TTVs have been described in the art (see for example Maggi et al., J Virol. 77(4): 2418-2425, 2003).
  • viral load determination is performed by digital PCR.
  • Digital PCR involves multiple PCR runs on extremely dilute nucleic acids such that most positive amplifications reflect the signal from a single template molecule. Digital PCR thus allows the counting of individual model molecules. The proportion of positive amplifications among the total number of PCRs analyzed allows an estimate of the template concentration in the original or undiluted sample. This technique has been proposed to allow the detection of a variety of genetic phenomena (Vogelstein et al., Proc Natl Acad Sci USA 96: 9236-924, 1999). Digital PCR, like real-time PCR, potentially allows the discrimination of fine quantitative differences in target sequences between samples.
  • TTV DNA levels are measured by sequencing.
  • sequencing is taken in its broadest sense and refers to any technique known to those skilled in the art for determining the sequence of a polynucleotide molecule (DNA or RNA), i.e. that is to say, to determine the succession of nucleotides composing this molecule.
  • TTV DNA can thus be sequenced by any technique known in the art. Sequencing as understood herein includes but is not limited to Sanger sequencing, whole genome sequencing, hybridization sequencing, pyrosequencing (including 454 sequencing, Solexa Genome Analyzer sequencing), sequencing with capillary electrophoresis, cycle sequencing, single base extension sequencing, solid phase sequencing, high throughput sequencing, massively parallel signature sequencing (MPSS), reversible dye terminator sequencing, matched pairs, short-term sequencing, sequencing with exonucleases, sequencing by ligation, single molecule sequencing, sequencing by synthesis, sequencing by electron microscopy real-time sequencing, reverse-termination sequencing, sequencing by nanopores, reversible terminator sequencing, semiconductor sequencing, SOLiD(R) sequencing, Single Molecule Real-Tim (SMRT) sequencing e Analysis), MS-PET sequencing, mass spectrometry, and their combinations.
  • a particular embodiment uses sequencing high throughput of DNA, using for example the MiSeq, NextSeq 500 platforms, and the HiSeq series developed by Illumina (Reuter et al., Mol Cell, 58: 586-597, 2015; Bentley et al. Nature; 456 : 53-59, 2008), the Genome Sequencer platform from 454 and Roche (Margulies et al.
  • High-throughput sequencing also includes methods such as SMRT real-time sequencing (Roads et al., Genomics, Proteomics & Bioinformatics, 13(5): 278-289, 2015), Ion Torrent sequencing (WO 2010/008480; Rothberg et al., Nature, 475: 348-352, 2011) and sequencing using nanopores (Clarke J et al. Nat Nanotechnol: 4: 265-270, 2009).
  • Sequencing is performed on all of the DNA contained in the biological sample or on parts of the DNA contained in the biological sample. It is immediately clear to the person skilled in the art that said sample contains at least a mixture of TTV DNA and host subject DNA. Additionally, TTV DNA will likely represent only a minor fraction of the total DNA present in the sample.
  • the DNA is randomly fragmented, generally by physical methods, prior to sequencing.
  • a first approach consists in sequencing specific sequences of the genome of a TTV species.
  • Another approach is to use a method that allows quantitative genotyping of nucleic acids obtained from the biological sample with high precision.
  • precision is achieved by analyzing large numbers (e.g., millions or billions) of nucleic acid molecules without any amplification using protocols that rely on knowledge beforehand of the target sequences (that is to say in this case, the sequences of the TTVs).
  • the method of the invention comprises a step of quantifying the number of readings.
  • a random subset of nucleic acid molecules from the biological sample is subjected to high-throughput sequencing.
  • the TTV sequences are identified in the global sequencing data by comparison with publicly deposited TTV sequences. That comparison is advantageously based on the level of sequence identity with a known TTV sequence and makes it possible to detect even remote variants.
  • Common software such as BLAST can be used to determine the level of identity between sequences.
  • the determination of the TTV load therefore comprises the numbering of the TTV sequences identified by sequencing in the biological sample of the subject.
  • the TTV load is determined by measuring the amount of a viral protein in the biological sample. It is thus possible to use specific antibodies, in particular in well-known technologies such as immunoprecipitation, immunohistology, western blot, dot blot, ELISA or ELISPOT, electrochemiluminescence (ECLIA) , protein arrays, antibody arrays, or tissue arrays coupled with immunohistochemistry.
  • specific antibodies in particular in well-known technologies such as immunoprecipitation, immunohistology, western blot, dot blot, ELISA or ELISPOT, electrochemiluminescence (ECLIA) , protein arrays, antibody arrays, or tissue arrays coupled with immunohistochemistry.
  • FRET or BRET techniques microscopy or histochemistry methods, including in particular confocal microscopy and electron microscopy methods, methods based on the use of one or several excitation wavelengths and a suitable optical method, such as an electrochemical method (the techniques of voltammetry and amperometry), the atomic force microscope, and radiofrequency methods, such as multipolar, confocal resonance spectroscopy and non-confocal, detection of fluorescence, luminescence, chemiluminescence, absorbance, reflectance, transmittance, and birefringence or index of refraction (for example, by surface plasmon resonance, or "surface plasmon resonance" in English, by ellipsometry, by method resonant mirror, etc.), flow cytometry, radioisotopic or magnetic resonance imaging, analysis by polya gel electrophoresis crylamide (SDS-PAGE); by mass spectrometry and by liquid chromatography coupled to mass spectrometry (LC-MS/
  • TTV i.e. the amount of TTV DNA, TTV RNA or TTV proteins present in the biological sample to a specific parameter of this sample.
  • Normalizing the measured TTV load to a specific parameter reduces the error rate when comparing viral loads from two different biological samples.
  • An example of a parameter that can be useful for this normalization can be a physical parameter, independent of the content of the sample, such as its volume, for example. It is also possible to normalize the amount of TTV DNA, TTV RNA or TTV protein to the total amount of DNA, RNA or protein present in the sample. Alternatively, it is possible to use a particular DNA or RNA sequence or a particular protein as a standardization tool. For example, this sequence or this protein can be a human sequence or protein.
  • the amount of TTV DNA or RNA or TTV protein in a given sample is compared to an internal control.
  • the quantity of nucleic acid or of TTV protein measured in the biological sample can be related to a defined quantity of a nucleic acid or of an appropriate protein which can be identified and quantified, such as an acid nucleic acid or a host or exogenous protein.
  • this identifiable and quantifiable nucleic acid or protein is processed (eg, amplified, sequenced, etc.) as the target nucleic acid or protein.
  • the preparation steps can include means to protect the viral nucleic acid and destroy the host nucleic acids, for example by using different nucleases.
  • these steps may include means to protect viral proteins and destroy host proteins, for example by using different proteases.
  • the internal control makes it possible to evaluate the quality and the extent of the processing (for example an amplification or a sequencing) of the molecules considered (nucleic acids or proteins) in the sample.
  • said internal control is a nucleic acid molecule of known sequence, this nucleic acid molecule being present in the sample at a known concentration. More preferably, this nucleic acid molecule is the genomic single-stranded circular DNA molecule of a virus of known sequence and concentration in the sample. Such a known virus may for example be a virus from the Circoviridae family.
  • the ratio of the number of sequences of the sample to the control makes it possible to estimate the absolute number of TTV genomes of known sequence and concentration.
  • this internal control is a protein of known sequence, which is present in the sample at a known concentration.
  • TTV load has been determined by measuring the quantity of nucleic acid or TTV protein determined, this being optionally normalized, it may be advantageous to compare it with a predetermined reference TTV load.
  • the description relates to an in vitro or ex vivo method for evaluating a risk of complication in a patient not taking immunosuppressive treatment admitted to a healthcare establishment, comprising the implementation of the steps consisting of: a) measuring the viral load of at least one TTV in a biological sample from said patient, b) comparing the viral load determined for said biological sample with a predetermined reference value, and c) establishing a risk of complication when the viral load determined for said sample is higher or lower than the predetermined reference value.
  • a reference TTV load or “a reference viral load” is meant within the meaning of the present application any TTV load used as a reference.
  • the reference TTV load corresponds to “a reference level of nucleic acid (or protein) of TTV” or “a control level of nucleic acid
  • a TTV nucleic acid (or protein) reference concentration is a baseline level measured in a control sample comparable to that tested, and which is obtained from a subject or group of subjects with a particular traumatic and/or infectious state. It may be for example a subject or a group of subjects who are healthy or do not exhibit any particular trauma and/or infection. It may also be a patient or a group of patients admitted to a healthcare establishment, in particular an intensive care unit, in particular a patient or a group of patients who have suffered an immuno-inflammatory attack.
  • the reference level can be determined by a plurality of methods.
  • the control can be a predetermined value, which can take various forms. It can be a single threshold value, such as a median or mean.
  • the “reference level” can be a single value, also applicable to each patient individually.
  • the baseline may vary based on specific patient subpopulations. So, for example, older men might have a different baseline than younger men for TTV load, and women might have a different baseline than men for this viral load.
  • the "reference level" can be established on the basis of comparative groups, such as groups not having a high level of TTV nucleic acid (or protein) and groups having levels of nucleic acid (or protein) of elevated TTVs.
  • comparison groups would be groups with a particular disease, condition, or symptoms and groups without disease.
  • the predetermined value may be set, for example, when a test population is divided equally (or unequally) into groups, such as a low-risk group, a medium-risk group, and a high-risk group.
  • the reference level can also be determined by comparing the level of nucleic acid (or protein) of TTV in populations of patients suffering from diseases or taking a treatment leading to a state of immunosuppression. This can be accomplished, for example, by histogram analysis, in which an entire cohort of subjects is presented graphically, with a first axis representing the level of said TTV nucleic acid (or protein), and a second axis represents the number of patients in the patient group expressing TTV nucleic acid (or protein) at a given level. Two or more distinct groups of subjects can be determined by identifying subpopulations of the cohort that have the same or similar TTV nucleic acid (or protein) levels.
  • a reference level can also represent the levels of two or more of the present TTV nucleic acids (or proteins). Two or more markers can be represented, for example, by a ratio of values for the levels of each marker.
  • an apparently healthy population will have a different 'normal' range than a population known to exhibit a condition associated with a high concentration of said TTV nucleic acid (or protein).
  • the selected predetermined value may take into account the category into which an individual falls. Appropriate ranges and categories can be selected with just routine experimentation by the skilled person. By raised , augmented , we mean raised relative to a selected control. Generally, control will be based on normal, apparently healthy individuals in an appropriate age range.
  • the reference concentration corresponds to the concentration of TTV nucleic acid (or protein) or combination of TTV nucleic acids (or proteins) in the general population.
  • the controls in the method described here can be, in addition to predetermined values, biological samples measured in parallel with the samples tested.
  • the reference level will be that of the TTV nucleic acid(s) (or proteins) in a sample from a healthy subject.
  • the reference concentration of TTV nucleic acid is the concentration of this TTV nucleic acid (or this protein) in a healthy subject or in a population of healthy subjects.
  • the reference concentration of the nucleic acid (or protein) of TTV is the concentration of this nucleic acid (or this protein) of TTV in a patient who has suffered an immuno-inflammatory attack or in a group of patients who suffered an immuno-inflammatory attack.
  • the reference concentration of the nucleic acid (or protein) of TTV will be the concentration of this nucleic acid (or this protein) of TTV in a patient suffering from sepsis or in a group of patients with sepsis.
  • the reference concentration of the TTV nucleic acid (or protein) is the concentration of this TTV nucleic acid (or this protein) in a patient suffering from burn(s) or in a group of patients suffering from burn(s).
  • the reference concentration of the nucleic acid (or protein) of TTV is the concentration of this nucleic acid (or this protein) of TTV in a patient suffering from trauma(s) or in a group of patients suffering from trauma.
  • the reference concentration of the nucleic acid (or protein) of TTV the concentration of this nucleic acid (or this protein) of TTV in a patient having undergone surgery or in a group of patients having undergone surgery.
  • the reference concentration of the nucleic acid (or protein) of TTV the concentration of this nucleic acid (or this protein) of TTV in the same individual having undergone the surgery at a specific time, for example before or just after this one.
  • the predetermined reference value corresponds to a viral load in the patient's biological sample, for example blood or one of its derivatives such as plasma and/or serum, greater than 7,000 copies per ml_ of biological sample, for example greater than 10,000 copies, 20,000 copies or even 40,000 copies per ml_ of biological sample.
  • a higher TTV viral load in the patient than the predetermined reference value is correlated with the severity of the patient's condition and may also be correlated with an increased risk of complication, in particular the occurrence of healthcare-associated infection.
  • the predetermined reference value corresponds to a viral load in TTV of 10,000 copies per ml of biological sample.
  • a higher TTV viral load in the patient compared to that of a healthy individual, or group of individuals, may be an indicator that there is an increased risk of compilation in said patient.
  • greater means a greater amount, e.g., an amount slightly greater than the original or reference amount, or e.g., an amount in great excess relative to the original or reference quantity, including all quantities in between.
  • increase may refer to an amount or activity that is at least 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11 %, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% or 100% more than the quantity or activity for which the increased quantity or activity is compared.
  • lower means a lesser amount, for example, an amount slightly less than the original or reference amount, or for example, a greatly deficient amount. relative to the original or reference quantity, including all quantities in between.
  • decrease may refer to an amount or activity that is at least 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11 %, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% or 100% less than the quantity or activity for which the reduced quantity or activity is being compared.
  • the description relates to an in vitro or ex vivo method for evaluating a risk of complication in a patient not taking immunosuppressive treatment, admitted to a health establishment, comprising the implementation of steps consisting of: a) measuring a first viral load of at least one TTV in said biological sample of the patient taken from a first sample taken at time T1, b) measuring a second viral load of at least one TTV in said sample of the patient from a second sample taken at time T2, c) calculate the variation between the viral load at T2 and the viral load at T1, giving an ATTV value, d) establish a conclusion as to the risk of complication, from of the results of the comparisons.
  • the inventors have determined that a variation in the viral load in TTV in the patient during his stay in a health establishment, namely an increase or a decrease in the viral load of TTV according to the values defined above -after, is correlated with an increased risk of complications in said patient, in particular an increased risk of developing a healthcare-associated infection.
  • the first sample of step a) is taken at a time T1 chosen from: the day of admission, the 1st day, the 2nd day, the 3rd day, the 4th day, the 5th day, the 6th day and the 7th day, it being understood that the first day corresponds to the day after the day of admission and/or the day after the day on which the said patient suffered an immuno-inflammatory attack.
  • the first sample of step a) can be taken at the time of the surgery , that is to say just before, just after or during the surgical act.
  • the second sampling of step b) is carried out at a time T2, this second time being later than the first time T1 of step a).
  • the second sample is taken between the 8th day and the 31st day, and preferably still, between the 14th day and the 31st day.
  • the time T2 is preferably chosen from: the 14th day, the 15th day, the 16th day, the 17th day, the 18th day, the 19th day, the 20th day, the 21st day , 22nd day, 23rd day, 24th day, 25th day, 26th day, 27th day, 28th day, 29th day, 30th day and 31st day .
  • the second sample is taken after the 31st day, such as at least 40 days, 60 days, 90 days, 100 days, 120 days, 150 days, 180 days, 210 days, 240 days , 270 days, 300 days, 330 days, 360 days after admission of said patient to a health facility.
  • the measurement of the viral load in TTV is also carried out on a plurality of samples taken at different times comprised between times T1 and T2.
  • the measurement of the viral load in TTV is also carried out on at least 1 sample, preferably at least 2 samples, preferably at least 3 samples, preferably at least 4 samples, preferably at least 5 samples, such as for example 6, 7, or 8 samples taken at different times between times T1 and T2.
  • the viral load in TTV at time T1 corresponds to the mean or the median of the viral loads measured in a plurality of biological samples from said patient, taken between the day of admission, and/or immuno-inflammatory attack, and on the 7th day.
  • the viral load in TTV at time T1 corresponds to the average or the median of the viral loads measured in at least two, preferably at least three, preferably at least four biological samples from said patient, taken between the day of admission, and/or immuno-inflammatory attack, and on the 7th day.
  • the viral load in TTV at time T1 may correspond to the mean or the median of the viral loads measured in biological samples from said patient taken on days 1 or 2, and on days 3 or 4, and on 5, 6 or 7 days.
  • the viral load in TTV at time T2 corresponds to the mean or the median of the viral loads measured in a plurality of biological samples from said patient, taken between the 8th day following admission, and/or from immuno-inflammatory attack, and the 31st day.
  • the viral load in TTV at time T2 corresponds to the average or the median of the viral loads measured in at least two, preferably at least three, preferably at least four biological samples from said patient, taken between the 8th day following admission, and/or the immuno-inflammatory attack, and the 31st day.
  • the viral load in TTV at time T2 may correspond to the average or the median of the viral loads measured in biological samples of said patient taken on the 14th day, or any day between the 13th and on the 18th day, and on the 28th day, or any day between the 26th and 36th day .
  • step c) the ATTV value corresponding to the variation between the viral load in TTV at time T2 and the viral load at time T1, i.e.:
  • ATTV (viral load in TTV at time T2) - (viral load in TTV at time T1)
  • the person skilled in the art is able to calculate the slope of the straight line defined by these two measurements.
  • the ATTV thus corresponds to the value of the slope between times T1 and T2.
  • the viral load in TTV between times T1 and T2 is stable if the ATTV value is included in the range going from -1.25 to +1.25, preferably in the range going from -1.20 to +1.20, preferably in the range from -1.15 to +1.15, preferably in the range from -1.10 to +1.10.
  • viral load stability may correspond to a slope in the range of -1.25 to +1.25 measured between median viral loads for a plurality of samples at T1 and T2.
  • the viral load in TTV between times T1 and T2 is increased if the ATTV value is greater than +1.25, preferably greater than +1.35, preferably greater than +1.40 , preferably greater than +1.45, and more preferably greater than +1.50.
  • the viral load in TTV between times T1 and T2 is reduced if the ATTV value is less than -1.25, preferably less than -1.35, preferably less than -1.40 , preferably less than -1.45, and more preferably less than -1.50.
  • step d) if the viral load change in TTV between time T1 and T2 (ATTV) is in the range from -1.25 to +1.25, it can be concluded in step d) that the patient is not at increased risk of a healthcare-associated infection.
  • step d) the patient is at increased risk of developing a healthcare-associated infection.
  • the method according to the present description comprises the implementation of the steps consisting in: a) measuring a first viral load of at least one TTV in said biological sample of the patient taken from a first sample taken at time T1, b) measuring a second viral load of at least one TTV in said biological sample of the patient taken from a second sample taken at time T2, c) calculating the variation between the viral load at T2 and the viral load at T1 , giving an ATTV value, d) draw a conclusion as to the absence of an increased risk of complication when the ATTV value is in the range from -1.25 to +1.25, preferably - 1.20 to +1.20, and more preferably from ⁇ 1.10 to +1.10.
  • the description relates to an in vitro or ex vivo method for evaluating a risk of complication in a patient not taking immunosuppressive treatment, admitted to a health establishment, comprising measuring the viral load of at least one torque teno virus (TTV) in a biological sample from said patient and further comprising detecting the presence of at least one herpesvirus (HPV) in said biological sample from the patient.
  • TTV torque teno virus
  • HPV herpesvirus
  • the co-detection of a high viral load of TTV and of at least one HPV in the biological sample of the patient, in particular during the first week following his admission to intensive care is an indicator of an increased risk of complications in said patient, in particular an increased risk of developing a healthcare-associated infection.
  • the link between early viremia (from the first week after admission) for TTV/Hpv and the existence of an increased risk of developing HAI during the first month is also particularly surprising.
  • the term "determination of the presence of at least one herpesvirus" or “detection of at least one herpesvirus” as used herein encompasses qualitative and/or quantitative detection.
  • detection of HPV is accomplished by detecting levels of HPV nucleic acid, more preferably HPV DNA.
  • a herpesvirus is determined as present or as detected if at least one protein of at least one strain of HPV, more preferably at least one antigen of at least one strain of HPV is detected in at least one biological sample of said patient.
  • a herpesvirus is determined as present or detected if at least one nucleic acid of at least one strain of HPV, more preferably at least one DNA of at least one strain of HPV is detected in at least one biological sample of said patient.
  • at least one nucleic acid of at least one strain of HPV more preferably at least one DNA of at least one strain of HPV is detected in at least one biological sample of said patient.
  • viremia is meant here the level of viral particles, or the viral load, in a biological sample for a given virus.
  • the viremia is positive when the number of viral particles detected is greater than a predefined threshold (LOD) in said biological sample for a given virus.
  • LOD predefined threshold
  • viremia is negative when said viral particles are not detected in said biological sample.
  • DNAemia means the detection of viral DNA in a biological sample, in particular in a sample of plasma, whole blood and/or leukocytes isolated from peripheral blood and/or in a sample of buffy coat (the fraction of a sample of unclotted blood after centrifugation that contains most of the white blood cells and platelets).
  • Several techniques are available for the detection of DNAemia, including PCR-based techniques, hybrid capture, and branched-chain DNA analysis. When DNA of the virus studied is detected in said biological sample, the DNAemia is positive. On the other hand, the DNAemia is negative when said viral DNA is not detected in said biological sample.
  • viral event is meant that a given virus has been detected at least once during the study, and in particular that a positive DNAemia for a given virus has been detected in at least one biological sample from the patient during the duration of the study.
  • the patient not taking immunosuppressive treatment presents an increased risk of complication when the TTV viral load in a biological sample of said patient, for example blood or one of its derivatives such as plasma and / or serum, is greater than 7,000 copies per ml_ of biological sample, preferably greater than 10,000 copies per ml_ of biological sample, and that the presence of herpesvirus is also detected.
  • the method can thus comprise the implementation of the steps consisting in: a) measuring the viral load of at least one TTV in a biological sample from said patient, b) comparing the viral load determined for said sample biological to a predetermined reference value at 10,000 copies/ml, c) determining the presence of at least one Herpesvirus, preferably by measuring DNAemia, and d) establishing the presence of an increased risk of complication when said load viral determined for said sample is greater than the predetermined reference value and when at least one Herpesvirus is present.
  • the description relates to an in vitro or ex vivo method for evaluating a risk of complication in a patient not taking immunosuppressive treatment, admitted to a health establishment, comprising measuring the viral load of at least one torque teno virus (TTV) in a biological sample from said patient and further comprising measuring the viral load of at least one herpesvirus in said biological sample from the patient.
  • TTV torque teno virus
  • the “viral load of at least one HPV” or “load of at least one HPV” corresponds to the viral load of at least one strain of HPV, that is to say the number of viral particles of at least one strain of HPV present in a biological sample.
  • the load of at least one HPV in a patient means the viral load of at least one strain of HPV harbored by said patient.
  • the HPV load can be determined by measuring the amount of a component of at least one HPV strain, such as a nucleic acid or a protein, in this biological sample.
  • the HPV load corresponds to the quantity of nucleic acid sequences of a given strain of HPV present in a biological sample.
  • determining the HPV load includes determining the amount of active and/or inactive viral copies. It consists of determining the quantity of circulating, integrated or latent viral copies.
  • the methods for detecting and/or measuring the viral load of an HPV nucleic acid in a biological sample are the same as those previously described for TTV and include, among others, amplification, preferably PCR amplification , more preferably by real-time PCR, sequencing, hybridization with a labeled probe and any other methods known to those skilled in the art.
  • Herpesviruses are well known to those skilled in the art. It is a family of DNA viruses affecting various animal species including birds, fish, reptiles, amphibians and mammals, including humans. All members of the HpV family share a common structure: a relatively large, single-partite, double-stranded and linear DNA, encoding 100-200 genes, enclosed in an icosahedral protein cage called the capsid, itself enveloped in a protein coat called integument, containing both viral proteins and viral mRNAs, and a lipid bilayer membrane called the envelope. All HpVs are nuclear replicating, viral DNA is transcribed into mRNA in the nucleus of the infected cell, where it can persist in a latent form indefinitely.
  • HpV-1 and HSV-2 herpes simplex viruses 1 and 2
  • HSV-1 and HSV-2 herpes simplex viruses 1 and 2
  • HHV-1 and HHV-2 herpes simplex viruses 1 and 2
  • varicella-zoster virus or HHV-3 which causes chickenpox and shingles
  • Epstein-Barr virus (EBV or HHV-4) implicated in several diseases, including mononucleosis and certain cancers and the human cytomegalovirus (HCMV or CMV or HHV-5).
  • HHV-6A and HHV-6B human herpesvirus 6A and 6B
  • HHV-7 human herpesvirus 7
  • KSHV Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus
  • herpesvirus or “HPV” or “HHV” (Human Herpes Virus) is meant here a virus of the Herpesviridae family.
  • HPV genome it is herein referred to the genomes of all Herpesviridae, including those of the HSV-1, HSV-2, HHV-3, EBV, CMV, HHV-6, HHV-7 and KSHV type and more particularly those of the CMV, EBV, HHV6 and HSV-1 type.
  • said at least one herpesvirus is selected from the group consisting of: CMV, EBV, HHV6 and HSV-1.
  • the herpesvirus is EBV.
  • CMV AD169 genome may be the one whose sequence referenced under the Genbank accession number X17403.1.
  • EBV B-95 genome may be one whose sequence referenced under the Genbank accession number is V01555.2.
  • An example of an HHV6 Z29 genome may be that whose sequence is referenced under the GenBank accession number X83413.2.
  • the determination of the presence of at least one HPV and/or the measurement of the HPV viral load is carried out by real-time quantitative PCR.
  • Many HPV detection and quantification methods have been described in the art and are known to those skilled in the art (see for example Walton et al., Plos ONE 9(6): e98819, 2014). Reference will be made in particular to the method described by Mallet et al. ( Intensive Care Medicine Exp. (2019) 7:28) and more particularly in table S1 of this article reproduced here in figures 6 and 7. This method is particularly advantageous due to its simplicity and robustness, it can also be implemented implemented with any type of PCR platform.
  • the method described herein includes an additional step of normalizing the amount of HPV nucleic acid measured.
  • the person skilled in the art may refer to the methods and embodiments described above concerning the normalization of the levels of TTV. These methods can easily be adapted to normalize the amount of HPV nucleic acid.
  • the load of at least one HPV has been determined by measuring the quantity of HPV nucleic acid, this being optionally normalized, it may be advantageous to compare it with a reference HPV load.
  • the person skilled in the art may refer to the methods and embodiments described above concerning the comparison with reference levels of TTV. These methods can easily be adapted for comparison with reference levels of HPV.
  • the patient's susceptibility to the risk of complications, including infections, can therefore be determined using the methods described here, allowing the development of a specific treatment to be tailored to the patient's needs.
  • the methods as described above can therefore comprise, in all their embodiments, a healthcare management step, in particular to reduce the risk of complications and in particular the risk of occurrence of an infection associated with healthcare.
  • a patient identified as being at increased risk of occurrence of a healthcare-associated infection may have appropriate health care management with the aim of reducing the risk of occurrence of said healthcare-associated infection and, for example, in order to reduce the risk of developing sepsis, septic shock or the risk of death.
  • the present description also relates to a method for treating a patient suspected of having a risk of complication, characterized in that it comprises the steps consisting in: identifying the patients presenting a risk of complication by implementing any one of the embodiments as described above and, adapt the health care management of said patient identified in the previous step to reduce the risk of aggravation.
  • Examples of care management include an immunomodulatory treatment adapted to the patient or a prophylactic antibiotic treatment, the two treatments can be combined and/or refer to a continuing care or resuscitation service in order to reduce the risk occurrence of a treatment-associated infection, for example reducing the risk of developing sepsis, septic shock or even the risk of death in the days following the measurement of the expression of the biomarker(s).
  • the immunomodulatory treatment is an immunostimulatory treatment, if the individual is determined to have an immunosuppressed status, or an anti-inflammatory treatment, if the individual is determined to have an inflammatory status. .
  • immunostimulating treatments which can be selected, mention may be made by way of examples of the group of interleukins, in particular IL-7, IL-15 or IL-3, growth factors, in particular GM-CSF, interferons , in particular IFN ⁇ , Toll receptor agonists, antibodies, in particular antibodies directed against immune checkpoints (for example anti-PD1, anti-PDL1, anti-LAG3, anti-TIM3, anti-IL-10 or anti-CTLA4), transferrins and molecules that inhibit apoptosis, FLT3L, Thymosin a1, adrenergic antagonists.
  • interleukins in particular IL-7, IL-15 or IL-3
  • growth factors in particular GM-CSF
  • interferons in particular IFN ⁇
  • Toll receptor agonists antibodies, in particular antibodies directed against immune checkpoints (for example anti-PD1, anti-PDL1, anti-LAG3, anti-TIM3, anti-IL-10 or anti-CTLA4)
  • glucocorticoids examples include glucocorticoids, cytostatic agents, molecules acting on immunophilins and cytokines, molecules blocking the IL-1 receptor and anti-TNF treatments.
  • prophylactic antibiotic treatments to prevent pneumonia are described in particular in the Annales conses d'Anesthésie et de Réanimation (30; 2011; 168-190).
  • a patient who does not present a risk of occurrence of a healthcare-associated infection can be quickly referred to a day hospital service, for example an infectiology service, rather than remaining in a service with close monitoring. which he won't need.
  • FIG 1 Representation of the genome structure of a TTV isolate.
  • FIG 2A Characteristics of patients in the cohort at admission and results according to viral titer in TTV, kinetics of viremia and coinfection with herpesviruses ( Figures 2A and 2B). Categorical variables are expressed in n (%) and continuous variables in median [Q1-Q3]. Comparisons between TTV conditions regarding titer or kinetics of viremia or herpesvirus coinfection were made using a Chi-square test for qualitative variables and a Wilcoxon test for variables quantitative, as appropriate. P values in bold with stars indicate significance at p ⁇ 0.05.
  • FIG 4 Characteristics of patients in the cohort at admission and results according to TTV DNAemia greater than 167 copies (cp)/ml (LOD), 7000 copies/ml, 10,000 copies/ml and 40 000 copies/ml, during the first month (D1 to D28) following admission.
  • Inclusion criteria were: patients over 18 years of age, clinical diagnosis of sepsis as defined by the 2016 SEPSIS-3 consensus guidelines (Singer et al., 2016), severe trauma with a severity score (ISS) > 15, severe burn with total burn area greater than 30%, or surgical patients undergoing major surgery such as esophagogastrectomy, bladder resection with Brickers reconstruction, cephalic pancreaticoduodenectomy, and abdominal aortic aneurysm surgery by laparotomy.
  • the exclusion criteria were as follows: presence of a pre-existing condition or of a treatment that could influence the immune status of the patients, in particular, patients on immunosuppressive treatment, pregnancy, institutionalized patients, inability to obtain informed consent are excluded.
  • Patient demographics, comorbidities, diagnosis, severity, and clinical outcomes were manually recorded prospectively. Longitudinal follow-up was carried out for a period of 30 days. Peripheral whole blood collected from each patient and from each healthy volunteer was processed each time within 3 hours of blood collection.
  • PAXgene samples were stabilized for at least 2 hours at room temperature after collection and then frozen at -80°C according to the manufacturer's recommendations.
  • HCA-associated infection secondary infection at 28 days (D28) and mortality at D28.
  • ICU intensive care unit
  • the detection limit of TTV was determined using plasma samples comprising a predetermined amount of TTV.
  • the control plasma sample is serially diluted from 10 1 to 10 4 , and each diluted sample is independently extracted 3 times and then amplified by quantitative PCR, in order to determine an approximate detection limit.
  • the greatest dilution giving a positive signal is diluted again to 1/2, and to 1/4 then each diluted sample is extracted independently 20 times and amplified. The most dilute positive replicates with 100% detection are used as the detection limit.
  • the LOD expressed in copies per ml of plasma, is 167 for TTV, 100 for CMV, 33 for EBV, 166 for HHV6, and 33 for HSV1.
  • Real-time PCR amplifications of viral DNAs were performed on the StepOnePlusTM Real-Time PCR System (ThermoFisher SCIENTIFIC) using R-GENE® assay kits using TaqMan probes for CMV, EBV , HSV1, HHV6 and TTV (bioMérieux SA). All nucleic acid samples, randomly distributed in the plates, were amplified simultaneously with the quantification standards, sensitivity controls and negative controls, according to the manufacturer's instructions.
  • the viremia was evaluated by measuring the DNAemia for each virus, a viremic event, that is to say a positive DNAemia, being characterized by a number of copies of the virus per microliter greater than a predefined threshold (greater than the LOD).
  • a positive DNAemia is considered early if it is detected for at least one of the patient's samples during the first week (day 1/2, day 3/4 or day 5/7) after the patient's admission to intensive care. DNAemia was also assessed on D14 and D28. Data are presented as numbers and percentages (qualitative variables) and medians and 25th/75th percentiles (quantitative variables).
  • the REALISM cohort of 377 critically ill patients consists of: 107 sepsis, 137 severe trauma, 24 severe burns and 109 major surgeries.
  • Quantitative (viral load) rather than qualitative (DNAemia) data may allow better discrimination between (1) insignificant viral load, (2) viral "reactivation" as a putative marker of immunosuppression, and (3) viral loads elevated supporting a true viral infection requiring treatment (Textoris et al., 2017).
  • TTV was detected (positive DNAemia) in 217 (58%) of the patients in the cohort, slightly more than in the healthy controls (51%).
  • each herpesvirus individually during the first week of admission is not significantly associated with a risk of healthcare-associated infection (HAI), unlike the first month.
  • HAI healthcare-associated infection
  • a significant increase in the rate of IAS is observed in patients who have had at least one episode during the first month.
  • viraemic positive DNA for any of the individual herpesviruses, in the absence of positive DNA for TTV.
  • HAIs co-detection, preferably from the first week of admission, of a high viral load in TTV with positive herpes DNAemia is correlated with the risk of more frequent occurrence of HAIs, and (ii) a stable TTV viral load is associated with relatively less occurrence of HAI, in contrast to a variation in the viral load in TTV which is also correlated with the risk of occurrence of IAS in the patient.
  • TTV The course of viremia over time was less discernible for TTV (from 58% in the first week to 60% over the month), and positive viremia for TTV was more common for TTV alone than for TTV co-detection -herpesvirus (42% against 15% measured during the first week, 40% against 20% measured during the first month).
  • TTV and EBV were the most frequently co-detected viruses, 8% to 10% during the first week and first month, respectively.
  • the results demonstrate in patients admitted to the intensive care unit, the existence of a correlation between viral reactivation, in particular TTV in combination or not with HpV, and the risk of development of healthcare-associated infections.

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Abstract

La présente invention porte sur un procédé d'évaluation in vitro ou ex vivo du risque de complication chez un patient admis au sein d'un établissement de santé, comprenant la mesure de la charge virale d'au moins un torque teno virus (TTV) dans un échantillon biologique dudit patient, caractérisé en ce que ledit patient n'est pas sous traitement immunosuppresseur.

Description

DESCRIPTION
TITRE : UTILISATION DU VIRUS TORQUE TENO (TTV) EN TANT QUE MARQUEURS POUR DETERMINER LE RISQUE DE COMPLICATION CHEZ UN PATIENT ADMIS AU SEIN D’UN ETABLISSEMENT DE SANTE
INTRODUCTION
Les infections secondaires (ou infections associées aux soins - IAS) sont des complications majeures de la prise en charge médicale, en particulier dans les structures de soins médicalisées comme les hôpitaux où l’on parlera d’infections nosocomiales. Les infections nosocomiales surviennent chez 20 à 40% des patients admis en unité de soins intensifs et ont pour conséquence un allongement de la prise en charge hospitalière souvent associé à l’utilisation de dispositifs médicaux invasifs, ainsi qu’à l’administration plus importante d’antibiotiques. A terme, la morbidité et la mortalité sont également plus élevées.
L’occurrence des infections associées aux soins est particulièrement exacerbée depuis quelques années, de par l’augmentation des pathogènes multirésistants. L’Organisation Mondiale de la Santé (OMS) estime à environ 5 millions le nombre d’infections nosocomiales dans les hôpitaux en Europe, conduisant à environ 50000 morts et un surcoût annuel de 13 à 24 milliards d’euros. Des recommandations ont été publiées, et la mise en place de programmes de contrôle des infections a été encouragée, en particulier par le U. S. Department of Health and Human Services, le Centre européen pour la prévention et le contrôle des maladies, l’OMS et les agences nationales, pour lesquels la prévention et la réduction des infections associées aux soins sont devenues une priorité majeure. D’après certaines modélisations, un test qui réduirait le temps d’identification des patients à haut risque de contracter des infections associées aux soins permettrait de réduire la mortalité chez ces patients, avec un bon rapport coût/efficacité.
Il est donc important de pouvoir identifier des marqueurs précoces associés à un risque d’IAS et, d’une plus manière générale, à un risque de développer une complication lors d’une prise charge médicale, notamment afin d’apporter une réponse thérapeutique adaptée dès qu’un risque est détecté.
De nombreux facteurs influent sur la survenue et le développement des infections associées aux soins, comme des facteurs liés à la prise en charge du patient mais aussi l’état général de santé du patient. Plusieurs études ont démontré l’existence d’une relation entre les altérations immunitaires et une incidence accrue d'infections secondaires (revue dans (Delano et al., 2016), mais ces résultats restent controversés et une étude plus récente remet en question l’existence d’un lien (Venet et al., 2021 ).
Certaines études ont également tenté d’établir un lien entre le phénomène de réactivation virale (herpèsvirus (Hpv) et torque teno virus (TTV) notamment) et la survenue de complications liées aux soins. Le phénomène de réactivation virale existe notamment chez les patients non immunodéprimés, gravement malades (sepsis) ou blessés (trauma, brûlure, chirurgie), qui présentent une paralysie immunitaire (ou immunoparalysie, caractérisée par un dysfonctionnement des systèmes immunitaires adaptatif et inné, en réponse à un état hyper inflammatoire initial).
A ce jour, les implications cliniques de la réactivation virale ne sont pas clairement établies. En particulier, il n’est pas clair si les virus qui se réactivent doivent être considérés comme de simples marqueurs reflétant une altération du système immunitaire, ou au contraire, comme des agents pathogènes favorisant les infections secondaires et nécessitant la mise en place d’un traitement préventif (Limaye et al, 2010).
Récemment, Mallet et collaborateurs (Mallet et al., 2019 - Intensive Care Medicine Exp. 7 :28) ont publié les résultats d’une étude suggérant l’existence d’un lien entre la co- réactivation des virus EBV (virus d'Epstein-Barr) et TTV, et une diminution non significative de la mortalité.
Une autre étude récente, menée chez des patients ayant subi une greffe de rein, a établi qu’une mesure de la charge virale en TTV permettait d’identifier les patients présentant un faible risque d'infection secondaire (Strassl et al., The Journal of Infectious Deseases, 2018 ;218 :1191-9). La portée de cette étude reste toutefois limitée, d’autant plus que les patients impliqués ont tous reçu un traitement immunosuppresseur et sont donc plus à risque de développer des maladies infectieuses. Cela ne permet donc pas d’établir un lien crédible entre la charge virale en TTV et le risque d’une infection secondaire (ou infection associée aux soins), et donc d’identifier quels sont les patients à haut risque de développer une infection secondaire. Il y a donc toujours besoin d’une méthode de diagnostic simple et fiable permettant d’identifier les patients à risque de développer une complication, en particulier une infection associée aux soins, lors de leur prise charge médicale au sein d’un établissement de santé.
RESUME DE L’INVENTION
Un premier objet de la présente invention porte sur un procédé d’évaluation in vitro ou ex vivo du risque de complication chez un patient admis au sein d’un établissement de santé, comprenant la mesure de la charge virale d’au moins un torque teno virus (TTV) dans un échantillon biologique dudit patient, caractérisé en ce que ledit patient n’est pas sous traitement immunosuppresseur.
Selon un mode de réalisation préféré, ledit procédé se caractérise en ce que le patient est un patient admis au sein d’un hôpital, de préférence au sein du service des urgences, du service de réanimation, en unité de soins intensifs ou en unité de soins continus.
Selon un autre mode de réalisation préféré, ledit procédé se caractérise en ce que ledit patient est un patient en état septique, plus particulièrement, en choc septique, un patient atteint de brûlures, plus particulièrement de brûlures graves, un patient atteint de traumatismes, plus particulièrement de traumatismes graves, ou un patient ayant subi une opération chirurgicale, plus particulièrement une opération chirurgicale lourde.
Selon un autre mode de réalisation préféré, ledit procédé se caractérise en ce que l’échantillon biologique est issu d’un patient en état septique, atteint de brûlures, atteint de traumatismes ou ayant subi une opération chirurgicale, et admis en unité de soins intensifs.
Selon un autre mode de réalisation préféré, ledit procédé se caractérise en ce que la complication consiste en la survenue d’une d’infection associée aux soins (IAS).
Selon un autre mode de réalisation préféré, ledit procédé se caractérise en ce qu’il comprend la mise en oeuvre des étapes consistant à : a) mesurer la charge virale d’au moins un TTV dans un échantillon biologique dudit patient, b) comparer la charge virale déterminée pour ledit échantillon biologique à une valeur de référence prédéterminée, et c) établir un risque de complication lorsque la charge virale déterminée pour ledit échantillon est supérieure ou inférieure à la valeur de référence prédéterminée.
Selon un autre mode de réalisation préféré, ledit procédé se caractérise en ce que la valeur de référence prédéterminée est de 10,000 copies/ml.
Selon un autre mode de réalisation préféré, ledit procédé se caractérise en ce qu’il comprend la mise en oeuvre des étapes consistant à : a) mesurer une première charge virale d’au moins un TTV dans ledit échantillon biologique du patient issu d’un premier prélèvement effectué au temps T1 , b) mesurer une deuxième charge virale d’au moins un TTV dans ledit échantillon biologique du patient issu d’un second prélèvement effectué au temps T2, c) calculer la variation entre la charge virale à T2 et la charge virale à T1 , donnant une valeur ATTV, d) établir une conclusion quant au risque de complication, à partir du résultat des comparaisons.
Selon un mode de réalisation préféré, le procédé se caractérise en ce qu’il comprend la mise en oeuvre des étapes consistant à : a) mesurer une première charge virale d’au moins un TTV dans ledit échantillon biologique du patient issu d’un premier prélèvement effectué au temps T1, b) mesurer une deuxième charge virale d’au moins un TTV dans ledit échantillon biologique du patient issu d’un second prélèvement effectué au temps T2, c) calculer la variation entre la charge virale à T2 et la charge virale à T1 , donnant une valeur ATTV, d) établir une conclusion quant à l’absence d’un risque accru de complication lorsque la valeur ATTV est comprise dans la gamme allant de -1,25 à +1,25, de préférence de -1 ,20 à +1 ,20, et de préférence encore de -1 ,10 à +1 ,10. Selon un autre mode de réalisation préféré, ledit procédé se caractérise en ce qu’il comprend également la détection de la présence d’au moins un Herpèsvirus (HPV).
Selon un autre mode de réalisation préféré, ledit procédé se caractérise en ce qu’il comprend également la mesure de la charge virale d’au moins un Herpèsvirus (HPV).
Selon un autre mode de réalisation préféré, ledit au moins un Herpèsvirus (HPV) est sélectionné dans le groupe constitué par : CMV, EBV, HHV6 et HSV-1, et est de préférence EBV.
Selon un autre mode de réalisation préféré, ledit procédé se caractérise en ce que la charge virale est mesurée par amplification, séquençage ou hybridation d’au moins une séquence de TTV, et d’au moins un Herpès virus le cas échéant, préférablement par amplification, plus préférentiellement par PCR en temps réel.
Selon un autre mode de réalisation préféré, ledit procédé se caractérise en ce que l’échantillon biologique est un fluide biologique provenant du patient, ledit fluide étant sélectionné dans le groupe constitué par : le sang ou ses dérivés tels que plasma et/ou le sérum, le liquide céphalorachidien, l’urine, et les lavages broncho alvéolaires.
DESCRIPTION DETAILLEE
La présente invention a pour objet un procédé pour évaluer un risque de complication, par exemple une infection associée aux soins (IAS), chez un patient ne prenant pas de traitement immunosuppresseur, admis au sein d’un établissement de santé.
En effet, les inventeurs ont montré que la charge virale en torque teno virus (TTV) est un indicateur du risque de complication chez les patients ne prenant pas de traitement immunosuppresseur, admis au sein d’un établissement de santé et plus particulièrement chez des patients pris en charge en unité de soins intensifs.
En particulier, il apparaît de façon surprenante que l’augmentation de la charge virale en TTV après la première semaine suivant l’admission en soins intensifs est significativement corrélée à une durée de séjour plus longue dans ce service. Par ailleurs, l’augmentation comme la diminution de la charge virale en TTV sont significativement associées à la survenue d'une IAS au cours du premier mois suivant l’admission.
Finalement, la co-détection dès la première semaine suivant l’admission du patient, notamment en service de soins intensifs, d’une charge virale élevée en TTV associée à la présence d’au moins un herpèsvirus, est corrélée à un risque de survenue d'une infections associées aux soins (IAS). Il est ainsi possible d’évaluer précocement le risque de survenue d’une complication, et en particulier le risque de survenue d’une IAS, chez des patients non soumis à un traitement immunosuppresseur. Dans la présente description, les modes de réalisation peuvent être pris seuls ou combinés de manière appropriée par la personne du métier.
Procédés d’évaluation du risque de complication chez un patient
La présente description a pour objet un procédé d’évaluation in vitro ou ex vivo du risque de complication chez un patient ne prenant pas de traitement immunosuppresseur, admis au sein d’un établissement de santé, se basant sur une mesure de la charge virale d’au moins un TTV dans un échantillon biologique dudit patient. Selon un premier aspect, il est décrit ici un procédé d’évaluation in vitro ou ex vivo du risque de complication chez un patient admis au sein d’un établissement de santé, comprenant la mesure de la charge virale d’au moins un TTV dans un échantillon biologique dudit patient, caractérisé en ce que ledit patient n’est pas sous traitement immunosuppresseur. De manière surprenante, en étudiant les phénomènes de réactivation virale chez les patients d’un établissement de santé, les inventeurs ont identifié chez les patients n’étant pas sous traitement immunosuppresseur l’existence d’une corrélation entre l’évolution de la charge virale en TTV pendant son séjour dans l’établissement de santé et la survenue de complications, i.e., l'évolution défavorable de son état, à savoir notamment la survenue d’infection associées aux soins.
Selon un mode préféré de réalisation, une variation de la charge virale en TTV au cours du premier mois suivant l’admission dans l’établissement de santé indique un risque de développer une IAS. L'expression « évaluation du risque de complication chez un patient » ou « déterminer un risque de complication chez un patient » désigne ici la détermination d'une probabilité pour un sujet ou patient donné de développer une complication, telle que définie ci-dessous, dans le futur.
Les procédés divulgués ici représentent des outils d'évaluation dudit risque, et peuvent être combinés avec d'autres procédés, méthodes ou indicateurs tels que l'examen clinique, un prélèvement d’un échantillon biologique dudit patient et la détection d’un ou plusieurs biomarqueurs et/ou d'un ou plusieurs agents infectieux, notamment des bactéries, virus, parasites ou levures et champignons filamenteux.
Par « complication », on entend ici l'évolution défavorable d'une maladie, d'un état de santé ou d'un traitement médical. Une « complication », telle qu’on l’entend ici, peut être notamment l’évolution défavorable d’une maladie pouvant nécessiter la mise en place d’un ou plusieurs dispositifs médicaux invasifs, comme par exemple une intubation trachéale, la mise en place d’une sonde urinaire, la mise en place de cathéter ou d’une voie centrale.
On entend également par « complication » l’évolution défavorable d’une maladie pouvant avoir pour effet un allongement de la durée de prise en charge dans ledit établissement de santé, en particulier en service de soins intensifs.
On entend également par « complication » la mort dudit patient.
De manière préférée, on entend également par « complication » l’évolution défavorable d’une maladie pouvant nécessiter la mise en place d’un traitement médical spécifique. Comme exemple d’une telle complication, on peut citer le développement d’une infection secondaire ou infection opportuniste, en particulier d’une « infection associée aux soins » ou « IAS », comme une infection par un ou plusieurs des agents infectieux, par exemple des bactéries, virus, parasites ou levures et champignons filamenteux.
Dans le contexte de la présente description, une infection est dite « associée aux soins », si elle survient au cours d’une prise en charge (diagnostique, thérapeutique, palliative, préventive, éducative ou opératoire) d’un patient par un professionnel de santé, et si elle n’était pas présente au début de la prise en charge. Les infections associées aux soins comprennent les infections contractées dans un établissement de santé (dites infections nosocomiales) mais aussi lors de soins délivrés hors de ce cadre. Lorsque l’état infectieux au début de la prise en charge n’est pas connu précisément, un délai d’au moins 48 heures ou un délai supérieur à la période d’incubation est couramment accepté pour définir une IAS.
Pour les infections du site opératoire, on considère habituellement comme associées aux soins les infections survenant dans les 30 jours suivant l’intervention ou, s’il y a mise en place d’un implant, d'une prothèse ou d’un matériel prothétique dans l’année qui suit l’intervention. L’infection liée aux soins peut être d’origine bactérienne, comme par exemple par une bactérie telle qu ’Escherichia coli, Staphylococcus aureus (staphylocoque doré) ou Pseudomonas aeruginosa. L’infection peut aussi être d’origine fongique, notamment par une levure du genre Candida, ou un champignon filamenteux du genre Aspergillus, en particulier Aspergillus fumigatus. L’infection peut aussi être de type viral, notamment par un virus du type Adénovirus, Herpèsvirus, Entérovirus, Rotavirus ou le VIH. Il peut s’agir également de la réactivation de virus latents potentiellement pathogènes, tels les virus d’herpès, par exemple les virus CMV, EBV, HHV6 et HSV-1. Selon un mode de réalisation préféré, la description porte sur un procédé in vitro ou ex vivo pour évaluer un risque de complication chez un patient ne prenant pas de traitement immunosuppresseur, ladite complication étant la survenue d’une infection associée aux soins (IAS).
En particulier, G IAS peut être une infection nosocomiale. Dans ce cas, le procédé ici décrit permet de déterminer le risque de survenue d’une infection nosocomiale chez ledit patient. Dans le cas d’un patient en état septique, qui est donc déjà atteint d’une première infection, le procédé ici décrit permet de déterminer le risque de survenue d’une infection secondaire. Le procédé décrit ici se fonde notamment sur une mesure de la charge virale d’au moins un TTV dans un échantillon biologique du patient.
On entend par « échantillon biologique » tout échantillon qui peut être prélevé à partir d'un sujet.
De façon générale, l’échantillon biologique doit permettre la détermination de la charge en TTV et/ou en Herpèsvirus (HPV). L’échantillon biologique, tel qu’on l’entend ici, comprend entre autres, mais sans s'y limiter, le sang total, le sérum, le plasma, les expectorations, les prélèvements nasopharyngés, l'urine, les selles, la peau, le liquide céphalorachidien, la salive, les sécrétions gastriques, le sperme, le liquide séminal, les larmes, le tissu ou le liquide rachidien, le liquide cérébral, un échantillon de ganglion trijumeau, un échantillon de ganglion sacré, le tissu adipeux, le tissu lymphoïde, le tissu placentaire, le tissu de l'appareil reproducteur supérieur, le tissu de l'appareil gastro-intestinal, le tissu génital et le tissu du système nerveux central.
En particulier, cet échantillon peut être un fluide biologique, comme un échantillon de sang ou un échantillon dérivé du sang, qui peut notamment être choisi parmi le sang total (tel que collecté de la voie veineuse, c'est-à-dire contenant les cellules blanches et rouges, les plaquettes et le plasma), le plasma, le sérum, ainsi que tout(tous) type(s) de cellules extraites à partir du sang, telles que les cellules mononuclées sanguines périphériques (ou PBMC, contenant les lymphocytes (B, T et cellules NK), les cellules dendritiques et les monocytes), des sous-populations de cellules B, des monocytes purifiés, ou des neutrophiles. L'échantillon à tester peut être utilisé directement à partir de la source biologique ou à la suite d'un prétraitement permettant de modifier le caractère de l'échantillon. Par exemple, un tel prétraitement peut inclure la préparation de plasma à partir de sang, la dilution de fluides visqueux et ainsi de suite.
Des procédés de prétraitement peuvent aussi impliquer la filtration, la précipitation, la dilution, la distillation, le mélange, la concentration, l'inactivation de composants perturbateurs, l'addition des réactifs, une lyse, etc. En outre, il peut être bénéfique de modifier un échantillon d'essai solide pour former un milieu liquide ou pour libérer l'analyte.
De préférence, l'échantillon biologique est un fluide biologique provenant du patient, ledit fluide étant sélectionné dans le groupe constitué par : le sang ou ses dérivés tels que le plasma et/ou le sérum, le liquide céphalorachidien, l’urine, et les lavages broncho-alvéolaires. De manière encore préférée, l'échantillon biologique est un échantillon de sang ou l’un de ses dérivés tels que le plasma et/ou le sérum.
Le terme « sujet » fait ici référence à un vertébré, de préférence un mammifère et, de manière préférée entre toutes, un humain. Un sujet humain peut être aussi appelé un « patient ».
Par « patient », on se réfère ici plus particulièrement à un sujet humain qui est entré en contact avec un professionnel de santé, tel qu’un médecin (par exemple, un médecin généraliste) ou une structure médicale ou un établissement de santé (par exemple, un hôpital, et plus particulièrement le service des urgences, le service de réanimation, une unité de soins intensifs ou une unité de soins continus, ou une structure médicalisée pour personnes âgées, de type EHPAD). Selon certains modes de réalisation, le patient peut être une personne âgée, dans le cadre d’un protocole de vaccination (notamment en EHPAD ou encore chez un médecin généraliste).
Tel qu’il est décrit ici, ledit procédé d’évaluation permet de déterminer du risque de développer une complication chez un patient qui n’est pas sous traitement immunosuppresseur.
Par « patient qui n’est pas sous traitement immunosuppresseur », on entend que ledit patient ne prend pas de médicaments immunosuppresseurs, ou de médicaments présentant des effets secondaires immunosuppresseurs, et qu’il ne suit pas non plus de traitement pouvant induire une immunosuppression.
Par « traitement immunosuppresseur » ou « induisant une immunosuppression » on entend des traitements, notamment des médicaments, ayant pour effet de réduire, inhiber ou prévenir l'activité du système immunitaire. A titre d’exemple non limitatif, un « traitement immunosuppresseur » peut être notamment un traitement mettant en oeuvre des glucocorticoïdes, des cytostatiques, des interférons, des médicaments antiprolifératifs et antimétaboliques (rapamycine, everolimus, mycophénolate mofétil, acide mycophénolique), des inhibiteurs de la calcineurine notamment pour leur action anti-rejet de greffe (ciclosporine, tacrolimus (FK506), voclosporine), des agonistes S1P-R (FTY720), des malononitrilamides (FK778), des anticorps comme par exemple, la globuline antithymocytaire ou certains anticorps monoclonaux dirigés contre des antigènes spécifiques tels que muromonab-CD3, daclizumab, basiliximab, rituximab, alemtuzumab, infliximab, adalimumab, efalizumab.
On entend également par « traitement immunosuppresseur » la radiothérapie ou la chimiothérapie.
Selon un mode de réalisation préféré, la description porte sur un procédé in vitro ou ex vivo pour évaluer un risque de complication chez un patient ne prenant pas de traitement immunosuppresseur admis au sein d’un hôpital, en particulier au sein du service des urgences, du service de réanimation, en unité de soins intensifs ou en unité de soins continus.
On distingue plusieurs services au sein d’un hôpital en fonction de la situation médicale du patient. Par « service des urgences » on entend le service qui concerne l'accueil des malades et de blessés se présentant spontanément ou amenés par des ambulances ou véhicules de prompt-secours des sapeurs-pompiers. Le rôle du service des urgences est d’accueillir sans sélection vingt-quatre heures sur vingt-quatre, tous les jours de l'année, toute personne se présentant en situation d'urgence, y compris psychiatrique, et la prendre en charge, notamment en cas de détresse et d'urgence vitales.
Par « service de réanimation » on entend le service spécialisé où sont hospitalisés les patients les plus graves. Ils y bénéficient d’une surveillance constante des fonctions vitales comme la ventilation, l’oxygénation, la pression artérielle, les fonctions cardiaque et rénale. Si besoin, une assistance de ces fonctions vitales peut être mise en place afin de permettre si possible la survie du patient. Les patients sont admis en réanimation s’ils présentent une défaillance d’une fonction vitale comme par exemple lors d’une infection grave (choc septique), d’une intoxication médicamenteuse, d’un polytraumatisme, d’un coma, d’une insuffisance rénale aiguë, d’une insuffisance respiratoire aiguë, après un arrêt cardiaque ou encore en post-opératoire d’une chirurgie majeure comme la chirurgie cardiaque ou digestive.
Par « unité de soins intensifs » ou « service des soins intensifs » ou « USI » on entend le service qui a pour mission de prendre en charge les patients en état critique, c'est- à-dire qui présentent une défaillance d’au moins une fonction vitale, ou qui sont à risque de développer une complication sévère. Le service des soins intensifs dispose de moyens techniques très spécialisés. Ceux-ci sont mis en oeuvre de façon continue par une équipe multidisciplinaire afin de déceler, prévenir et corriger les déséquilibres aigus et présumés réversibles liés à l’affection sous-jacente (maladie, chirurgie, traumatisme, intoxication, brûlure, sepsis).
Par « unité de soins continus » ou « unité de surveillance continue » ou « USC », on entend un service de l'hôpital destiné à accueillir et prendre en charge des malades nécessitant une surveillance rapprochée. Les unités de surveillance continue prennent en charge les patients dont l'état et le traitement font craindre la survenue d'une ou plusieurs défaillances vitales les patients dont l'état, au sortir d'une ou plusieurs défaillances vitales (après un séjour en réanimation, par exemple), est trop sévère ou instable pour permettre un retour dans une unité d'hospitalisation classique. Les unités de surveillance continue constituent un niveau intermédiaire entre d’une part les services de réanimation et d’autre part les services de soins classiques. Selon un mode de réalisation préféré, le présent procédé d’évaluation in vitro ou ex vivo permet d’évaluer un risque de complication chez un patient admis en unité de soins intensifs.
Le présent procédé d’évaluation est plus particulièrement adapté à l’évaluation d’un risque de complication chez un patient ayant subi une agression immuno- inflammatoire.
Par « agression immuno-inflammatoire » on entend un trauma ou une blessure ayant pour effet d’induire dans l’organisme du patient une réponse hyper-inflammatoire. La persistance de ce dernier entraîne une immunodépression acquise, liée à un profil anti inflammatoire, et in fine l’incapacité à juguler les infections. Ce phénomène, aussi connu sous le nom d’immunoparalysie, se caractérise par la régulation à la baisse de l'expression des molécules du complexe majeur d'histocompatibilité de classe II à la surface des monocytes, mais pas des cellules B. La suppression de la fonction monocyte/macrophage réduit la libération des complexes immunitaires, altère les capacités de présentation des antigènes et diminue la fonction des cellules tueuses naturelles (cellules NK). Ce type de réaction est fréquent chez les patients non immunodéprimés des unités de soins intensifs (Hotchkiss et al., 2013).
Une « agression immuno-inflammatoire » comprend notamment le traumatisme pour les patients atteints de traumatismes, la brûlure pour les patients atteints de brûlures, la chirurgie pour les patients ayant subi une chirurgie ou le sepsis pour les patients en état septique.
Selon un mode de réalisation préféré, la description porte sur un procédé in vitro ou ex vivo pour évaluer un risque de complication chez un patient ne prenant pas de traitement immunosuppresseur ledit patient étant en état septique, plus particulièrement en choc septique, et/ou un patient atteint de brûlure(s), plus particulièrement de brûlure(s) grave(s), et/ou un patient atteint de traumatisme(s), plus particulièrement de traumatisme(s) grave(s), et/ou un patient ayant subi une opération chirurgicale, plus particulièrement une opération chirurgicale lourde.
Par « patient en état septique » ou « patient atteint de sepsis » on entend un patient présentant au moins une défaillance d’organe menaçant le pronostic vital et causé par une réponse inappropriée de l’hôte à une infection.
Par « choc septique », on entend un sous-type de sepsis, dans lequel une hypotension persiste, malgré un remplissage vasculaire adéquat. Par « patient atteint de brûlure(s) » on entend que le patient présente une destruction cellulaire de la peau et des structures sous-jacentes causées une brûlure thermique et/ou une brûlure électrique et/ou une brûlure chimique et/ou une brûlure par radiation. Une brûlure peut être superficielle, intermédiaire, ou plus profonde et avoir une localisation généralisée ou particulière comme par exemple le cou, la face, les yeux, les mains, les pieds, les articulations ou d’autres parties du corps.
Par « brûlure(s) grave(s) » ou « patient atteint de brûlure(s) grave(s) » on entend un patient dont la surface de corps ayant brûlé est supérieure à 15% de la surface totale du corps, de préférence supérieure à 20%, de préférence supérieure à 25%, et tout particulièrement supérieure à 30% de la surface totale du corps.
Par « patient atteint de traumatisme(s) » on entend un patient admis directement dans une unité de soins intensifs. Par « patient atteint de traumatisme(s) grave(s) » on entend, un patient ayant un score de sévérité des blessures (ISS, injury severity score, Baker et al, 1974) supérieur à 15, de préférence supérieur à 20 et de préférence encore, supérieur à 25.
Par « patient ayant subi une opération chirurgicale », on entend un patient ayant subi un acte opératoire invasif visant à traiter un état pathologique tel qu'une maladie ou une blessure, pour aider ou améliorer les fonctions corporelles, l'apparence, ou pour réparer des zones lésées.
Par « chirurgie lourde » ou « patient ayant subi une opération chirurgicale lourde », on entend un acte de chirurgie présentant une difficulté technique et/ou présentant un risque hémorragique et/ou présentant un risque de décès et/ou de durée longue (comme par exemple supérieure à 3 heures, de préférence supérieure à 4 heures comme par exemple 5 heures ou 6 heures, voire plus), et/ou nécessitant des soins post-opératoires importants. A titre d’exemple non limitatif on entend par chirurgie lourde une chirurgie prévue pour au moins l'une des indications suivantes : œsophago gastrectomie, résection de la vessie de Bricker (résection totale de la vessie avec reconstruction à partir de l'intestin grêle), pancréaticoduodénectomie céphalique (procédure de Whipple) et/ou chirurgie de l'anévrisme de l'aorte abdominale par laparotomie.
Certains modes de réalisation préférés sont décrits ci-dessous. La présente de description ne se limite pas à ces modes de réalisation et d’autres modes particuliers pourront être mis en oeuvre en combinant une ou plusieurs des caractéristiques décrites précédemment.
Les inventeurs ont donc étudié les phénomènes de réactivation virale chez les patients d’établissement de santé. Plus particulièrement, ils ont mesuré la présence et/ou la variation de la charge virale en TTV dans des échantillons biologiques desdits patients à différents moments de leur prise en charge en établissement de santé.
Les inventeurs ont notamment constaté que la charge virale pouvait évoluer au cours du temps selon les patients. En particulier, ils ont constaté de manière surprenante que cette évolution est l’indicateur d’un risque de survenue d’une infection associée aux soins et/ou d’un risque d’allongement de la durée de prise en charge. Ainsi, les inventeurs ont mis au point un procédé d’évaluation in vitro ou ex vivo du risque de complication chez un patient admis au sein d’un établissement de santé.
Le procédé décrit ici se base sur une mesure de la charge virale en TTV. Par « virus torque teno » ou « Torque Teno Virus » ou « TTV », on entend ici un virus de la famille des Anelloviridae. Un TTV tel qu’on l’entend ici est un virus non enveloppé, avec un génome dADN simple brin circulaire de polarité négative.
Par « génome de TTV », il est ici fait référence à tous les génomes de tous les Anelloviridae, et notamment les génomes des genres Alphatorquevirus (TTV), Betatorquevirus (TTMV), et Gammatorquevirus (TTMDV) retrouvés chez l’Homme. A titre d’exemple, il est ici fait référence au génome de la souche prototype du virus Torque Teno, TTV-1a. Plus spécifiquement, un exemple d'un génome TTV est une séquence telle que par exemple celle qui est représentée par la SEQ ID No 1 et dont le numéro d'accession Genbank est AB017610.
En 1997, par méthode de soustraction génique, un fragment de séquence virale d’environ 500 paires de bases (pb) a été découvert dans le sérum d’un patient japonais présentant une hépatite post-transfusionnelle d’étiologie indéterminée (1-7). Ce clone, initialement nommé N22 et non répertorié dans les bases de données de séquences virales de l’époque, a été renommé TT virus (TTV), d’après les initiales du patient chez lequel il a été découvert (Nishizawa et al., 1997). Des travaux supplémentaires ont par la suite montré que le génome du TTV est constitué d’un ADN circulaire simple brin de polarité négative. Il s’agit du premier virus à ADN circulaire simple brin isolé chez l’homme. L’utilisation d’amorces permettant d’amplifier des séquences dans cette région non codante a mis en évidence une prévalence élevée du TTV dans la population mondiale (autour de 90%).
Le TTV produit des infections chroniques sans manifestation clinique clairement associée. On parle de virus apathogène ou orphelin. De nombreuses études se sont ainsi intéressées à l’implication du TTV en pathologie humaine, notamment dans certaines pathologies hépatiques, sans qu’un rôle clair puisse être identifié pour ce virus.
Préférentiellement, le génome des TTV a une taille d’environ 3,8 kb. La structure et l’organisation génomique des TTV est bien connue de la personne du métier (cf. par exemple se référer à Biagini, Curr Top Microbiol Immunol.ll'l : 21-33, 2009) et est exemplifiée sur la [Fig 1].
Ainsi, le génome du TTV peut être divisé en une région non traduite (UTR) d’environ 1 à 1,2 kb et une région codante potentielle d’environ 2,6 à 2,8 kb. La région codante contient notamment deux grandes phases ouvertes de lecture : ORF1 et ORF2, codant deux protéines de 770 et 202 résidus respectivement. Dans le génome de TTV représenté par la SEQ ID No 1, les phases ouvertes de lecture ORF1 et ORF2 sont comprises entre les nucléotides 589-2901 et 107-715, respectivement. Le génome du TTV peut posséder d’autres phases ouvertes de lecture. Par exemple, le génome des TTV peut comprendre deux phases additionnelles de lecture, ORF3 et ORF4 [Fig 1].
La région non traduite UTR est bien conservée. Elle comprend notamment une séquence riche en GC susceptible de former une structure secondaire. L’amplification de séquences choisies dans la région non traduite UTR-5’ a permis de démontrer que la prévalence du virus est très élevée à travers l’ensemble de la population mondiale (Hu et al., J Clin Microbiol. 43(8) : 3747-3754, 2005). Cette région comprend notamment une séquence de 128 bp et peut être amplifiée par les méthodes connues de la personne du métier, comme par exemple la trousse de diagnostic TTV R-GENE® (bioMérieux, France).
Par « charge virale », on l’entend le nombre de particules virales présentes dans un échantillon biologique. La charge virale reflète la gravité d'une infection virale. La charge virale peut être déterminée en mesurant la quantité de l’un des composants du virus (ADN génomique, ARNm, protéine...) dans l’échantillon biologique.
De préférence, la charge virale se réfère ainsi à la proportion de séquences d'acide nucléique appartenant audit virus dans un échantillon biologique. Plus préférentiellement, la charge virale représente le nombre de copies du génome dudit virus dans un échantillon biologique.
Dans le cas présent, la charge virale représente la charge en TTV. La « charge en TTV » correspond ici plus particulièrement à la charge virale du TTV, c’est-à-dire au nombre de particules virales de TTV présentes dans un échantillon biologique. La charge en TTV chez un patient signifie la charge virale de tout TTV hébergé par ledit patient. La charge en TTV peut être déterminée en mesurant la quantité d’un composant de TTV dans cet échantillon biologique.
De préférence, la charge en TTV correspond à la quantité de séquences d'acide nucléique de TTV présentes dans un échantillon biologique. Ainsi, la détermination de la charge en TTV chez un patient selon le procédé de l'invention comprend l'estimation du nombre de séquences de tous les TTV dans un échantillon biologique dudit patient. En particulier, il n'y a pas de sélection, selon le procédé de l'invention, de souches spécifiques de TTV à mesurer dans ledit échantillon biologique. En effet, la détection d’une charge virale en TTV élevée et particulièrement, la détection d’une variation de la charge en TTV, est associée à un risque accru de complication, notamment de survenue d’une infection associé aux soins, indépendamment de la ou des souches d ’Anelloviridae détectées.
De préférence, la détermination de la charge en TTV comprend la détermination de la quantité de copies virales actives et/ou inactives. Elle consiste à déterminer la quantité de copies virales circulantes, intégrées ou latentes.
En particulier, il est possible de déterminer le nombre de copies virales de TTV, en déterminant préalablement la limite de détection du TTV.
Par « limite de détection » ou « LOD », on entend la plus petite quantité de copie du génome pouvant être distinguée d'une absence de détection (valeur à blanc) en utilisant des standards viraux. Ensuite, par extrapolation à partir de courbes standards, il est alors possible de déterminer une charge virale en copies d'ADN viral par pL dans le tube de réaction, puis en copies d'ADN viral par mL dans ledit échantillon.
Dans le contexte de la présente description, on considère comme étant une charge virale en TTV élevée, une charge virale dans l’échantillon biologique supérieure à 7,000 copies par mL d’échantillon biologique tel que par exemple le sang ou l’un de ses dérivés tels que le plasma et/ou le sérum, de préférence supérieure à 10,000 copies par mL de plasma, de préférence supérieure à 20,000 copies par mL d’échantillon biologique, et de préférence encore, supérieure à 40,000 copies par mL d’échantillon biologique.
Les niveaux de TTV - et donc la charge en TTV - peuvent être déterminés selon les méthodes bien connues de la personne du métier en mesurant les niveaux d'ADN de TTV, d'ARN de TTV ou de protéines de TTV. Le procédé selon l'invention peut ainsi comprendre entre le prélèvement de l'échantillon du patient et l'étape a) telle que définie ci-dessous, une autre étape préliminaire correspondant à la transformation de l'échantillon biologique en un échantillon d'ADN double brin, ou en un échantillon d'ARNm (ou d'ADNc correspondant), ou en un échantillon de protéines, qui est ensuite prêt à être utilisé pour la mesure in vitro de la charge virale en TTV à l'étape a) telle que définie ci-après.
La préparation ou l’extraction d’ADN viral double brin, d’ARNm (ainsi que la rétro- transcription de celui-ci en ADNc) ou de protéines à partir d’un échantillon cellulaire ne sont que des procédures de routine bien connues de la personne du métier.
L’ADN double brin peut correspondre soit à l'ensemble du génome des TTV, soit seulement à une partie de celui-ci. Une fois qu'un ADN double brin, un ARNm (ou un ADNc correspondant) ou un échantillon de protéines prêt à l'emploi est disponible, la détection des TTV peut être effectuée, selon le type d'échantillon ou de transformation, soit par l’ADN génomique (c'est-à-dire basé sur la présence d'au moins une séquence constituée d'au moins une partie du génome de TTV), soit par l’ARNm (c'est-à-dire basé sur la teneur en ARNm de TTV dans l'échantillon), soit au niveau protéique (c'est-à-dire basé sur la teneur en protéines de TTV dans l’échantillon).
De préférence, les niveaux de TTV sont déterminés en mesurant les niveaux d’acide nucléique de TTV, plus préférablement d’ADN de TTV.
Les méthodes de détection d'un acide nucléique dans un échantillon biologique sont bien connues de la personne du métier et comprennent, entre autres, l'amplification, préférablement l'amplification par PCR, plus préférablement par PCR en temps réel, le séquençage, l'hybridation avec une sonde marquée.
De manière avantageuse, la description porte donc sur un procédé d’évaluation in vitro ou ex vivo du risque de complication chez un patient ne prenant pas de traitement immunosuppresseur admis au sein d’un établissement de santé, comprenant la mesure de la charge virale d’au moins un torque teno virus (TTV) dans un échantillon biologique dudit patient, ladite charge virale étant mesurée par amplification, séquençage ou hybridation d’au moins une séquence de TTV de préférence par amplification, plus préférentiellement par PCR en temps réel.
Selon un premier mode de réalisation, la charge en TTV est déterminée par amplification des séquences de TTV.
Selon ce mode de réalisation, une approche préférée consiste à amplifier des séquences qui sont connues pour être spécifiques du génome des TTV, et notamment de préférence au moins une séquence de la région non traduite UTR des TTV telle que définie précédemment.
Par « séquence spécifique du génome des TTV », on entend ici une séquence qui est présente dans la majorité des TTV connus, mais qui est absente de la majorité des autres virus, notamment de la majorité des autres anellovirus. Préférablement, une séquence spécifique de TTV est présente dans au moins 90%, au moins 95%, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% ou au moins 99% des génomes de TTV connus. Plus préférablement, elle est présente dans 100% des génomes de TTV connus. Alternativement, une séquence spécifique des TTV est présente dans moins de 10%, moins de 5%, moins de 4%, moins de 3%, moins de 2%, moins de 1% des génomes d’anellovirus connus autres que les TTV. Préférablement, une séquence spécifique des TTV est absente de tous les génomes d’anellovirus connus autres que les TTV. De manière particulièrement préférée, une telle séquence est par exemple une séquence comprise dans la région non traduite UTR qui est bien conservée d’un TTV à l’autre. Plus particulièrement, une telle séquence peut correspondre à la séquence de 128 bp de la région non traduite 5’-UTR qui peut être amplifiée selon les méthodes connues de la personne du métier, par exemple à l’aide de la trousse de diagnostic TTV R- GENE® (bioMérieux, France).
Ainsi selon ce mode de réalisation, le procédé décrit ici comprend l'utilisation d’amorces et de sondes pour l’amplification de séquences connues pour être spécifiques du génome des TTV. Comme il est habituel dans ce domaine technique, ces amorces sont préférablement des oligonucléotides. Par exemple, ces amorces peuvent comprendre moins de 30 nucléotides, au moins de 25 nucléotides, moins de 20 nucléotides, moins de 15 nucléotides ou moins de 12 nucléotides. Alternativement, ces amorces comprennent au moins 12, 15, 20,25 ou 30 nucléotides. Préférablement, les amorces utilisées comprennent entre 12 et 20 nucléotides, entre 12 et 25 nucléotides, entre 15 et 20 nucléotides ou encore entre 15 et 25 nucléotides. La personne du métier sait déterminer la longueur et la séquence des amorces à utiliser pour amplifier la ou les séquences spécifiques des TTV. Elle pourra par exemple utiliser les mêmes amorces que celles qui sont fournies dans la trousse de diagnostic TTV R- GENE® (ref. 423414 et 69-030B, bioMérieux, France).
Les techniques d'amplification comprennent notamment des méthodes isothermes et des techniques basées sur la PCR (Polymerase Chain Reaction). Les méthodes d’amplification isotherme regroupent un grand nombre de méthodes. Les plus utilisées pour détecter les agents pathogènes sont les méthodes LAMP (Loop-Mediated Amplification) et RPA (Recombinase Polymerase Amplification). Les méthodes d’amplification isotherme comprennent aussi des méthodes telles que par exemple la méthode NASBA (nucleic acid sequence-based amplification), HDA (helicase- dependent amplification), RCA (rolling circle amplification) et SDA (strand displacement amplification), EXPAR (exponential amplification reaction), ICANs (isothermal and chimeric primer-initiated amplification of nucleic acids), SMART (signal-mediated amplification of RNA technology), etc. (voir par exemple Asiello et Baeumner, Lab Chip 11(8): 1420-1430, 2011).
De préférence, la technique de PCR utilisée mesure quantitativement les quantités initiales d'ADN, d'ADNc ou d'ARN. Des exemples de techniques basées sur la PCR qui peuvent être utilisées dans les méthodes décrites ici comprennent, sans limitation, des techniques telles que la PCR en temps réel (Q-PCR), la PCR inverse (RT-PCR), la PCR inverse multiplexe, la PCR inverse en temps réel (QRT-PCR) et la PCR numérique (ou PCR digitale). Ces techniques sont des technologies bien connues et facilement disponibles pour la personne du métier.
Préférablement, la détermination de la charge en TTV est effectuée par une PCR quantitative en temps réel. De nombreuses méthodes de détection et de quantification des TTV ont été décrites dans l’art (voir par exemple Maggi et al., J Virol. 77(4) : 2418- 2425, 2003).
On se référera en particulier à la méthode décrite par Kulifaj et al. (J Clin Virol. 105 :118-127, 2018). Cette méthode est particulièrement avantageuse de par sa simplicité et sa robustesse. Elle est fondée sur l’amplification d’une séquence comprise dans la région non codante UTR. Cette séquence est présente chez tous les TTV connus, conférant ainsi une très grande spécificité à la méthode. En outre, elle est particulièrement versatile et peut être mise en oeuvre avec n’importe quel type de plateforme de PCR. Il est particulièrement avantageux d’utiliser la trousse de diagnostic TTV R-GENE® (ref. 423414 et 69-030B bioMérieux, France) pour mettre en oeuvre cette méthode.
Alternativement, la détermination de la charge virale est effectuée par PCR digitale. La PCR digitale implique plusieurs analyses de PCR sur des acides nucléiques extrêmement dilués de sorte que la plupart des amplifications positives reflètent le signal d'une seule molécule matrice. La PCR digitale permet ainsi le comptage de molécules modèles individuelles. La proportion d'amplifications positives parmi le nombre total de PCR analysées permet une estimation de la concentration de matrice dans l'échantillon d'origine ou non dilué. Cette technique a été proposée pour permettre la détection d'une variété de phénomènes génétiques (Vogelstein et al., Proc Natl Acad Sci USA 96 : 9236-924, 1999). La PCR digitale, tout comme la PCR en temps réel, permet potentiellement la discrimination de différences quantitatives fines de séquences cibles entre des échantillons.
Selon un autre mode de réalisation, les niveaux d'ADN de TTV sont mesurés par séquençage. Tel qu'utilisé ici, le terme « séquençage » est pris dans son acception la plus large et se réfère à toute technique connue de la personne du métier permettant de déterminer la séquence d’une molécule polynucléotidique (ADN ou ARN), c’est-à- dire de déterminer la succession des nucléotides composant cette molécule.
L'ADN de TTV peut ainsi être séquencé par toute technique connue dans l'art. Le séquençage tel qu’on l’entend ici comprend entre autres le séquençage par la méthode de Sanger, le séquençage du génome entier, le séquençage par hybridation, le pyroséquençage (notamment le séquençage 454, le séquençage Solexa Genome Analyzer), le séquençage avec électrophorèse capillaire, le séquençage par cycles, le séquençage d'extension à base unique, le séquençage en phase solide, le séquençage à haut débit, le séquençage de signature massivement parallèle (MPSS), le séquençage par terminateur de colorant réversible, le séquençage à paires appariées, le séquençage à court terme, le séquençage avec exonucléases, le séquençage par ligature, le séquençage de molécule unique, le séquençage par synthèse, le séquençage par microscopie électronique le séquençage en temps réel, le séquençage à terminaison inverse, le séquençage par nanopores, le séquençage par terminateur réversible, le séquençage par semiconducteur, le séquençage SOLiD(R), le séquençage SMRT (Single Molécule Real-Time Analysis), le séquençage MS- PET, la spectrométrie de masse, et leurs combinaisons. Un mode de réalisation particulier utilise le séquençage haut débit d'ADN, à l’aide par exemple des plateformes MiSeq, NextSeq 500, et la série HiSeq développées par Illumina (Reuter et al., Mol Cell, 58 : 586-597, 2015 ; Bentley et al. Nature ; 456 : 53-59, 2008), la plateforme Genome Sequencer de 454 et Roche (Margulies et al. Nature ; 437 : 376-380, 2005), la plateforme SOLiD d'Applied Biosystems (McKernan et al., Genome Res ; 19 : 1527-1541, 2009), la plateforme Polanator (Shendure et al., Science, 309 : 1728-1732) ou encore la plateforme de séquençage de molécules uniques Hélicos (Harris et al. Science ; 320 : 106-109, 2008). Le séquençage haut débit inclut aussi des méthodes telles que le séquençage en temps réel SMRT (Roads et al., Genomics, Proteomics & Bioinformatics, 13(5) : 278-289, 2015), le séquençage Ion Torrent (WO 2010/008480 ; Rothberg et al., Nature, 475 : 348-352, 2011) et séquençage à l’aide de nanopores (Clarke J et al. Nat Nanotechnol : 4 : 265-270, 2009).
Le séquençage est effectué sur l'intégralité de l’ADN contenu dans l'échantillon biologique ou sur des parties de l'ADN contenues dans l'échantillon biologique. Il est immédiatement clair pour la personne du métier que ledit échantillon contient au moins un mélange d'ADN de TTV et d'ADN du sujet hôte. De plus, l'ADN de TTV ne représentera probablement qu'une fraction mineure de l'ADN total présent dans l'échantillon. Avantageusement, l'ADN est fragmenté au hasard, généralement par des méthodes physiques, préalablement au séquençage.
Une première approche consiste à séquencer des séquences spécifiques du génome d’une espèce de TTV. Une autre approche consiste à utiliser une méthode qui permet le génotypage quantitatif des acides nucléiques obtenus à partir de l'échantillon biologique avec une grande précision. Dans un mode de réalisation particulier, la précision est obtenue par l'analyse d'un grand nombre (par exemple, des millions ou des milliards) de molécules d'acide nucléique sans aucune amplification en utilisant des protocoles qui s'appuient sur une connaissance préalable des séquences cibles (c'est-à-dire dans ce cas, les séquences des TTV).
Dans un mode de réalisation préféré, le procédé de l'invention comprend une étape de quantification du nombre de lectures.
Dans un mode de réalisation particulier, un sous-ensemble aléatoire de molécules d'acide nucléique de l'échantillon biologique est soumis au séquençage à haut débit. Préférablement, les séquences de TTV sont identifiées dans les données de séquençage globales par comparaison avec les séquences de TTV déposées publiquement. Cette comparaison est avantageusement fondée sur le niveau d'identité de séquence avec une séquence de TTV connue et permet de détecter des variantes même éloignées. Des logiciels courants tels que BLAST peuvent être utilisés pour déterminer le niveau d’identité entre les séquences.
Ainsi, une séquence présentant au moins 80%, au moins 85%, au moins 90%, au moins 95%, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98%, au moins 99% ou 100% d'identité avec une séquence de TTV connue est identifiée comme une séquence de TTV. Selon ce mode de réalisation, la détermination de la charge en TTV comprend donc la numérotation des séquences de TTV identifiées par séquençage dans l'échantillon biologique du sujet.
Dans un autre mode de réalisation, la charge en TTV est déterminée en mesurant la quantité d’une protéine virale dans l’échantillon biologique. Il est ainsi possible d’employer des anticorps spécifiques, en particulier dans des technologies bien connues telles que l’immunoprécipitation, l’immunohistologie, le western blot, le dot blot, l’ELISA ou l’ELISPOT, l'électrochimioluminescence (ECLIA), les puces à protéines, les puces à anticorps, ou les puces à tissu couplées à l’immunohistochimie. Parmi les autres techniques qui peuvent être utilisées sont comprises les techniques de FRET ou de BRET, les méthodes de microscopie ou d’histochimie, dont notamment les méthodes de microscopie confocale et de microscopie électronique, les méthodes basées sur l’utilisation d’une ou plusieurs longueurs d’onde d’excitation et d’une méthode optique adaptée, comme une méthode électrochimique (les techniques de voltamétrie et d’ampérometrie), le microscope à force atomique, et les méthodes de radiofréquence, comme la spectroscopie résonance multipolaire, confocale et non- confocale, détection de fluorescence, luminescence, chimioluminescence, absorbance, réflectance, transmittance, and biréfringence ou index de réfraction (par exemple, par résonance des plasmons de surface, ou « surface plasmon résonance » en anglais, par ellipsométrie, par méthode de miroir résonnant, etc.), cytométrie de flux, imagerie par résonance radioisotopique ou magnétique, analyse par électrophorèse en gel de polyacrylamide (SDS-PAGE); par spectrométrie de masse et par chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse (LC -MS/MS). Toutes ces techniques sont bien connues de la personne du métier et il n’est pas nécessaire de les détailler ici. En outre, des anticorps spécifiques de protéines de TTV sont déjà disponibles. Dans un mode de réalisation préféré, la méthode décrite ici comprend une étape supplémentaire de normalisation de la quantité d’acide nucléique ou de protéine virale mesurée.
Selon un mode de réalisation préféré, il peut être avantageux de normaliser les niveaux de TTV, c’est-à-dire la quantité d’ADN de TTV, d’ARN de TTV ou de protéines de TTV présente dans l’échantillon biologique à un paramètre spécifique de cet échantillon.
La normalisation de la charge mesurée de TTV à un paramètre spécifique permet de réduire le taux d’erreur lors de la comparaison entre les charges virales de deux échantillons biologiques différents. Un exemple de paramètre pouvant être utile pour cette normalisation peut être un paramètre physique, indépendant du contenu de l’échantillon, comme par exemple le volume de celui-ci. Il est aussi possible de normaliser la quantité d’ADN de TTV, d’ARN de TTV ou de protéines de TTV à la quantité totale d’ADN, d’ARN ou de protéines présentes dans l’échantillon. Alternativement, il est possible d’utiliser une séquence particulière d’ADN ou d’ARN ou une protéine particulière comme outil de normalisation. Par exemple, cette séquence ou cette protéine peut être une séquence ou une protéine humaine.
Alternativement, la quantité d’ADN ou d’ARN de TTV ou de protéines de TTV dans un échantillon donné est comparée à un contrôle interne.
Pour cela, la quantité d’acide nucléique ou de protéine de TTV mesurée dans l’échantillon biologique peut être rapportée à une quantité définie d’un acide nucléique ou d’une protéine appropriée qui peut être identifiée et quantifiée, comme par exemple un acide nucléique ou une protéine hôte ou exogène. Préférablement, cet acide nucléique ou de cette protéine identifiable et quantifiable est traité (par exemple, amplifié, séquencé, etc.) comme l’acide nucléique ou la protéine cible.
On peut ainsi ajouter ab initio à l’échantillon une quantité connue de cet acide nucléique ou de cette protéine identifiable et quantifiable, qui sera ensuite traité comme l’acide nucléique ou la protéine cible et passera par toutes les étapes de préparation de l’échantillon avant la mesure de la quantité de cet acide nucléique ou de cette protéine virale. Les étapes de préparation peuvent comprendre des moyens pour protéger l’acide nucléique viral et détruire les acides nucléiques hôtes, par exemple en utilisant différentes nucléases.
Alternativement, ces étapes peuvent comprendre des moyens pour protéger les protéines virales et détruire les protéines hôtes, par exemple en utilisant différentes protéases. Le contrôle interne permet d'évaluer la qualité et l'étendue du traitement (par exemple une amplification ou un séquençage) des molécules considérées (acides nucléiques ou protéines) dans l’échantillon. De préférence, ledit contrôle interne est une molécule d'acide nucléique de séquence connue, cette molécule d'acide nucléique étant présente dans l’échantillon à une concentration connue. Plus préférablement, cette molécule d'acide nucléique est la molécule d'ADN circulaire monocaténaire génomique d'un virus de séquence et de concentration connues dans l’échantillon. Un tel virus connu peut être par exemple un virus de la famille des Circoviridae. Le rapport du nombre de séquences de l'échantillon au contrôle permet d'estimer le nombre absolu de génomes de TTV de séquence et de concentration connues. Alternativement, ce contrôle interne est une protéine de séquence connue, qui est présente dans l’échantillon à une concentration connue.
Une fois la charge en TTV déterminée par mesure de la quantité d’acide nucléique ou de protéine de TTV déterminée, celle-ci étant optionnellement normalisée, il peut être avantageux de la comparer à une charge en TTV de référence prédéterminée.
Selon ce mode de réalisation préféré, la description porte sur un procédé in vitro ou ex vivo pour évaluer un risque de complication chez un patient ne prenant pas de traitement immunosuppresseur admis au sein d’un établissement de santé, comprenant la mise en oeuvre des étapes consistant à : a) mesurer la charge virale d’au moins un TTV dans un échantillon biologique dudit patient, b) comparer la charge virale déterminée pour ledit échantillon biologique à une valeur de référence prédéterminée, et c) établir un risque de complication lorsque la charge virale déterminée pour ledit échantillon est supérieure ou inférieure à la valeur de référence prédéterminée.
Par « une charge en TTV de référence » ou « une charge virale de référence » on entend au sens de la présente demande toute charge en TTV utilisée à titre de référence.
Cela signifie que la charge en TTV de référence correspond à « un niveau de référence d’acide nucléique (ou de protéine) de TTV » ou « un niveau témoin d’acide nucléique
(ou de protéine) de TTV », c’est-à-dire à une concentration d’un acide nucléique (ou de protéine) de TTV utilisé à titre de référence. Tel qu'on l’entend ici, « une concentration de référence d’acide nucléique (ou de protéine) de TTV » est un niveau de base mesuré dans un échantillon témoin comparable à celui testé, et qui est obtenu à partir d’un sujet ou d’un groupe de sujets présentant un état traumatique et/ou infectieux particulier. Il peut s'agir par exemple d’un sujet ou d’un groupe de sujets sains ou ne présentant pas de traumatisme et/ou infection particulière. Il peut aussi s’agir d’un patient ou d’un groupe de patients admis au sein d’un établissement de santé, en particulier en unité de soins intensifs, notamment un patient ou un groupe de patients ayant subi une agression immuno- inflammatoire comme par exemple un patient ou un groupe de patients atteints de sepsis, souffrant de brûlure(s), de traumatisme(s) et/ou ayant subi une chirurgie. Enfin, ce peut être le même individu ayant subi une chirurgie, par exemple avant ou juste après celle-ci. Le niveau de référence peut être déterminé par une pluralité de méthodes. Par exemple, le contrôle peut être une valeur prédéterminée, qui peut prendre diverses formes. Il peut s'agir d'une valeur seuil unique, telle qu'une médiane ou une moyenne. Le « niveau de référence » peut être une valeur unique, applicable également à chaque patient individuellement. Alternativement, le niveau de référence peut varier en fonction des sous-populations spécifiques de patients. Ainsi, par exemple, les hommes plus âgés pourraient avoir un niveau de référence différent de celui des hommes plus jeunes pour la charge en TTV, et les femmes pourraient avoir un niveau de référence différent de celui des hommes pour cette charge virale. D'autre part, le « niveau de référence » peut être établi sur la base de groupes comparatifs, tels que des groupes n'ayant pas un niveau d’acide nucléique (ou de protéine) de TTV élevé et des groupes ayant des niveaux d’acide nucléique (ou de protéine) de TTV élevés. Un autre exemple de groupes comparatifs serait les groupes ayant une maladie, une condition ou des symptômes particuliers et les groupes sans maladie. La valeur prédéterminée peut être définie, par exemple, lorsqu'une population testée est divisée de manière égale (ou inégale) en groupes, tels qu'un groupe à faible risque, un groupe à risque moyen et un groupe à risque élevé.
Le niveau de référence peut également être déterminé par comparaison du niveau d’acide nucléique (ou de protéine) de TTV dans des populations de patients atteints de maladies ou prenant un traitement conduisant à un état d’immunodépression. Cela peut être accompli, par exemple, par une analyse par histogramme, dans laquelle toute une cohorte de sujets est présentée graphiquement, avec un premier axe représentant le niveau dudit acide nucléique (ou protéine) de TTV, et un second axe représente le nombre de patients dans le groupe de patients exprimant l’acide nucléique (ou la protéine) de TTV à un niveau donné. Deux groupes distincts de sujets ou plus peuvent être déterminés en identifiant des sous-populations de la cohorte qui ont des niveaux d’acide nucléique (ou de protéine) de TTV identiques ou similaires. La détermination du niveau de référence peut alors être faite sur la base d'un niveau qui distingue le mieux ces groupes distincts. Un niveau de référence peut également représenter les niveaux de deux ou plus des présents acides nucléiques (ou protéines) de TTV. Deux marqueurs ou plus peuvent être représentés, par exemple, par un rapport de valeurs pour les niveaux de chaque marqueur.
De même, une population apparemment en bonne santé aura une plage ‘normale’ différente de celle d’une population connue pour présenter un état associé à une haute concentration dudit acide nucléique (ou protéine) de TTV. En conséquence, la valeur prédéterminée sélectionnée peut prendre en compte la catégorie dans laquelle un individu tombe. Des gammes et des catégories appropriées peuvent être sélectionnées à l’aide simplement d’une expérimentation de routine par la personne du métier. Par élevé , augmenté , on entend élevé par rapport à un contrôle sélectionné. Généralement, le contrôle sera basé sur des individus normaux apparemment en bonne santé dans une tranche d’âge appropriée.
Dans un mode de réalisation préféré, la concentration de référence correspond à la concentration d’acide nucléique (ou de protéine) de TTV ou de la combinaison de d’acides nucléiques (ou de protéines) de TTV dans la population générale.
On comprendra également que les témoins dans la méthode décrite ici peuvent être, outre de valeurs prédéterminées, des échantillons biologiques mesurés en parallèle avec les échantillons testés. Selon ce mode de réalisation, le niveau de référence sera celui du ou des acides nucléiques (ou protéines) de TTV dans un échantillon provenant d’un sujet en bonne santé.
De façon préférée, la concentration de référence d’acide nucléique (ou de protéine) de TTV est la concentration de cet acide nucléique (ou cette protéine) de TTV dans un sujet en bonne santé ou dans une population de sujets en bonne santé.
Selon un autre mode de réalisation préféré, la concentration de référence de l’acide nucléique (ou de protéine) de TTV est la concentration de cet acide nucléique (ou cette protéine) de TTV dans un patient ayant subi une agression immuno-inflammatoire ou dans un groupe de patients ayant subi une agression immuno-inflammatoire. Selon un autre mode de réalisation préféré, la concentration de référence de l’acide nucléique (ou de protéine) de TTV sera la concentration de cet acide nucléique (ou cette protéine) de TTV dans un patient atteint de sepsis ou dans un groupe de patients atteints de sepsis.
Selon un autre mode de réalisation préféré, la concentration de référence de l’acide nucléique (ou de protéine) de TTV est la concentration de cet acide nucléique (ou cette protéine) de TTV dans un patient souffrant de brûlure(s) ou dans un groupe de patients souffrant de brûlure(s).
Selon un autre mode de réalisation préféré, la concentration de référence de l’acide nucléique (ou de protéine) de TTV est la concentration de cet acide nucléique (ou cette protéine) de TTV dans un patient souffrant de traumatisme(s) ou dans un groupe de patients souffrant de traumatisme(s).
Selon un autre mode de réalisation préféré, la concentration de référence de l’acide nucléique (ou de protéine) de TTV la concentration de cet acide nucléique (ou cette protéine) de TTV dans un patient ayant subi une chirurgie ou dans un groupe de patients ayant subi une chirurgie.
Selon un autre mode de réalisation préféré, la concentration de référence de l’acide nucléique (ou de protéine) de TTV la concentration de cet acide nucléique (ou cette protéine) de TTV chez le même individu ayant subi la chirurgie à un instant spécifique, par exemple avant ou juste après celle-ci.
En comparant la charge virale de TTV dans l’échantillon biologique dudit patient avec une valeur de référence prédéterminée, il est alors possible d’établir le risque de complication chez ledit patient.
Selon un mode de réalisation particulier, la valeur de référence prédéterminée correspond à une charge virale dans l’échantillon biologique du patient, par exemple le sang ou l’un de ses dérivés tels que le plasma et/ou le sérum, supérieure à 7,000 copies par ml_ d’échantillon biologique, par exemple supérieure à 10,000 copies, 20,000 copies ou encore 40,000 copies par ml_ d’échantillon biologique. Selon ce mode de réalisation particulier, une charge virale de TTV supérieure chez le patient à la valeur de référence prédéterminée est corrélée à la sévérité de l’état du patient et peut également être corrélée à un risque accru de complication, notamment de survenue d’une infection associée aux soins. Selon une variante de ce mode de réalisation particulier, la valeur de référence prédéterminée correspond à une charge virale en TTV de 10,000 copies par ml d’échantillon biologique. Ainsi, selon cette variante, il est établi à la présence d’un risque accru de complication lorsque la charge virale en TTV déterminée dans l’échantillon biologique du patient est supérieure à ladite valeur de référence prédéterminée. A l’inverse, il est établi à l’absence d’un risque accru de complication lorsque la charge virale en TTV déterminée dans l’échantillon biologique du patient est inférieure à ladite valeur de référence prédéterminée.
Une charge virale de TTV supérieure chez le patient par rapport à celle d’un individu, ou d’un groupe d’individus, en bonne santé peut être un indicateur qu’il existe un risque de compilation accru chez ledit patient.
Le terme « supérieur », tel qu'il est utilisé ici dans certains modes de réalisation, signifie une plus grande quantité, par exemple, une quantité légèrement supérieure à la quantité d'origine ou de référence, ou par exemple une quantité en grand excès par rapport à la quantité d'origine ou de référence, et notamment toutes les quantités dans l'intervalle. En variante, « augmentation » peut faire référence à une quantité ou une activité qui est au moins 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 100% de plus que la quantité ou de l'activité pour laquelle la quantité ou de l'activité accrue est comparée.
Le terme « inférieur », tel qu'il est utilisé ici dans certains modes de réalisation, signifie une moins grande quantité, par exemple, une quantité légèrement inférieure à la quantité d'origine ou de référence, ou par exemple une quantité en grande insuffisance par rapport à la quantité d'origine ou de référence, et notamment toutes les quantités dans l'intervalle. En variante, « diminution » peut faire référence à une quantité ou une activité qui est au moins 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 100% de moins que la quantité ou de l'activité pour laquelle la quantité ou de l'activité réduite est comparée.
Avantageusement, il est aussi possible d’utiliser comme charge virale de TTV de référence, la charge virale d’au moins un TTV chez le même patient à un second instant. Selon un mode de réalisation préféré, la description porte sur un procédé in vitro ou ex vivo pour évaluer un risque de complication chez un patient ne prenant pas de traitement immunosuppresseur, admis au sein d’un établissement de santé, comprenant la mise en oeuvre des étapes consistant à : a) mesurer une première charge virale d’au moins un TTV dans ledit échantillon biologique du patient issu d’un premier prélèvement effectué au temps T1, b) mesurer une deuxième charge virale d’au moins un TTV dans ledit échantillon biologique du patient issu d’un second prélèvement effectué au temps T2, c) calculer la variation entre la charge virale à T2 et la charge virale à T1 , donnant une valeur ATTV, d) établir une conclusion quant au risque de complication, à partir du résultat des comparaisons.
De manière surprenante, les inventeurs ont déterminé qu’une variation de la charge virale en TTV chez le patient au cours de son séjour dans un établissement de santé, à savoir une augmentation ou une diminution de la charge virale de TTV selon les valeurs définies ci-après, est corrélée à un risque de complication accru chez ledit patient, en particulier un risque accru de développer une infection associée aux soins.
Ce procédé est ainsi particulièrement utile pour évaluer et suivre au cours du temps le risque de complication chez un patient admis au sein d’un établissement de santé. Dans un mode de réalisation préféré, le premier prélèvement de l’étape a) est effectué à un temps T1 choisi parmi : le jour de l’admission, le 1er jour, le 2ème jour, le 3ème jour, le 4ème jour, le 5ème jour, le 6ème jour et le 7ème jour, étant entendu que le premier jour correspond au lendemain du jour de l’admission et/ou au lendemain du jour où ledit patient a subi une agression immuno-inflammatoire.
Dans un mode de réalisation particulier, lorsque ledit patient est un patient admis au sein d’un établissement de santé pour une chirurgie, plus particulièrement pour une chirurgie lourde, le premier prélèvement de l’étape a) peut être effectué au moment de la chirurgie, c’est dire juste avant, juste après ou pendant l’acte chirurgical.
Dans un mode de réalisation préféré, le second prélèvement de l’étape b) est effectué à un temps T2, ce second temps étant plus tardif que le premier temps T1 de l’étape a). De manière préférée, le second prélèvement est effectué entre le 8ème jour et le 31ème jour, et de préférence encore, entre le 14ème jour et le 31ème jour. Ainsi, le temps T2 est de préférence choisi parmi : le 14ème jour, le 15ème jour, le 16ème jour, le 17ème jour, le 18ème jour, le 19ème jour, le 20ème jour, le 21ème jour, le 22ème jour, le 23ème jour, le 24ème jour, le 25ème jour, le 26ème jour, le 27ème jour, le 28ème jour, le 29ème jour, le 30ème jour et le 31ème jour.
Dans un autre mode de réalisation, le second prélèvement est effectué après le 31ème jour, comme par exemple à au moins 40 jours, 60 jours, 90 jours, 100 jours, 120 jours, 150 jours, 180 jours, 210 jours, 240 jours, 270 jours, 300 jours, 330 jours, 360 jours après l’admission dudit patient au sein d’un établissement de santé.
Dans certains modes de réalisation, la mesure de la charge virale en TTV est en outre effectuée sur une pluralité d’échantillons prélevés à des temps différents compris entre les temps T1 et T2. En particulier, la mesure de la charge virale en TTV est en outre effectuée sur au moins 1 échantillon, de préférence au moins 2 échantillons, de préférence au moins 3 échantillons, de préférence au moins 4 échantillons, de préférence au moins 5 échantillons, comme par exemple 6, 7, ou 8 échantillons prélevés à des temps différents compris entre les temps T1 et T2.
Selon certains modes de réalisation, la charge virale en TTV au temps T1 correspond à la moyenne ou la médiane des charges virales mesurées dans une pluralité d’échantillons biologiques dudit patient, prélevés entre le jour de l’admission, et/ou de l’agression immuno-inflammatoire, et le 7ème jour. De préférence, la charge virale en TTV au temps T1 correspond à la moyenne ou la médiane des charges virales mesurées dans au moins deux, de préférence au moins trois, de préférence au moins quatre échantillons biologiques dudit patient, prélevés entre le jour de l’admission, et/ou de l’agression immuno-inflammatoire, et le 7ème jour. A titre d’exemple non limitatif, la charge virale en TTV au temps T1 pourra correspondre à la moyenne ou la médiane des charges virales mesurées dans des échantillons biologiques dudit patient prélevés aux jours 1 ou 2, et aux jours 3 ou 4, et aux jours 5, 6 ou 7.
Selon certains modes de réalisation, la charge virale en TTV au temps T2 correspond à la moyenne ou la médiane des charges virales mesurées dans une pluralité d’échantillons biologiques dudit patient, prélevés entre le 8ème jour suivant l’admission, et/ou de l’agression immuno-inflammatoire, et le 31ème jour. De préférence, la charge virale en TTV au temps T2 correspond à la moyenne ou la médiane des charges virales mesurées dans au moins deux, de préférence au moins trois, de préférence au moins quatre échantillons biologiques dudit patient, prélevés entre le 8ème jour suivant l’admission, et/ou de l’agression immuno-inflammatoire, et le 31ème jour. A titre d’exemple non limitatif, la charge virale en TTV au temps T2 pourra correspondre à la moyenne ou la médiane des charges virales mesurées dans des échantillons biologiques dudit patient prélevés au 14ème jour, ou n’importe quel jour entre le 13ème et le I8ème jour, et au 28ème jour, ou n’importe quel jour entre le 26ème et le 36ème jour.
De manière avantageuse, il est alors possible de calculer à l’étape c) la valeur ATTV correspondant à la variation entre la charge virale en TTV au temps T2 et la charge virale au temps T1, c’est-à-dire que :
ATTV = (charge virale en TTV au temps T2) - (charge virale en TTV au temps T1 )
En fonction de la charge virale en TTV au temps T1 et de la charge virale en TTV au temps T2, la personne du métier est en mesure de calculer la pente de la droite définie par ces deux mesures. Le ATTV correspond ainsi à la valeur de la pente entre les temps T1 et T2.
Selon la présente description, on considérera de préférence que la charge virale en TTV entre les temps T1 et T2 est stable si la valeur ATTV est comprise dans la gamme allant de -1,25 à +1,25, de préférence dans la gamme allant de -1,20 à +1,20, de préférence dans la gamme allant de -1 ,15 à +1 ,15, de préférence dans la gamme allant de -1 ,10 à +1 ,10. Par exemple, la stabilité de la charge virale peut correspondre à une pente comprise dans l’intervalle compris de -1,25 à +1,25 mesurée entre les médianes des charges virales pour une pluralité d’échantillon à T1 et T2.
En outre, on considérera de préférence que la charge virale en TTV entre les temps T1 et T2 est augmentée si la valeur ATTV est supérieure à +1 ,25, de préférence supérieure à +1,35, de préférence supérieure à +1,40, de préférence supérieure à +1,45, et de préférence encore supérieure à +1 ,50.
En outre, on considérera de préférence que la charge virale en TTV entre les temps T1 et T2 est diminuée si la valeur ATTV est inférieure à -1 ,25, de préférence inférieure à -1,35, de préférence inférieure à -1,40, de préférence inférieure à -1,45, et de préférence encore inférieure à -1,50.
Par conséquent, si la variation de charge virale en TTV entre les temps T1 et T2 (ATTV) est comprise dans la gamme allant de -1,25 à +1,25, il peut être conclu à l’étape d) que le patient ne présente pas de risque accru de survenue d’une infection associée aux soins.
A l’inverse, si la variation de charge virale en TTV entre les temps T1 et T2 (ATTV) n’est pas comprise dans la gamme allant de -1 ,25 à +1 ,25, il peut être conclu à l’étape d) que le patient présente un risque accru de survenue d’une infection associée aux soins.
Ainsi, dans un mode de réalisation préféré, le procédé selon la présente description comprend la mise en oeuvre des étapes consistant à : a) mesurer une première charge virale d’au moins un TTV dans ledit échantillon biologique du patient issu d’un premier prélèvement effectué au temps T1, b) mesurer une deuxième charge virale d’au moins un TTV dans ledit échantillon biologique du patient issu d’un second prélèvement effectué au temps T2, c) calculer la variation entre la charge virale à T2 et la charge virale à T1 , donnant une valeur ATTV, d) établir une conclusion quant à l’absence d’un risque accru de complication lorsque la valeur ATTV est comprise dans la gamme allant de -1,25 à +1,25, de préférence de -1 ,20 à +1 ,20, et de préférence encore de -1 ,10 à +1 ,10.
Selon un mode de réalisation particulièrement avantageux, la description porte sur un procédé in vitro ou ex vivo pour évaluer un risque de complication chez un patient ne prenant pas de traitement immunosuppresseur, admis au sein d’un établissement de santé, comprenant la mesure de la charge virale d’au moins un torque teno virus (TTV) dans un échantillon biologique dudit patient et comprenant en outre la détection de la présence d’au moins un herpèsvirus (HPV) dans ledit échantillon biologique du patient.
En effet, il est du mérite des inventeurs d’avoir déterminé que la co-détection d’une charge virale élevée de TTV et d’au moins un HPV dans l’échantillon biologique du patient, notamment au cours de la première semaine suivant son admission en service de soins intensifs, est l’indicateur d’un risque de complication accru chez ledit patient, en particulier d’un risque accru de développer une infection associée aux soins. Le lien entre une virémie précoce (dès la première semaine suivant l’admission) pourTTV/Hpv et l’existence d’un risque accru de développer une IAS au cours du premier mois est également particulièrement surprenant. Le terme « détermination de la présence d’au moins un herpèsvirus » ou « détection d’au moins un herpèsvirus » tel qu'il est utilisé ici englobe la détection qualitative et/ou quantitative. Dans divers modes de réalisation, la détection de HPV est réalisée par détection des niveaux d’acide nucléique de HPV, plus préférablement d’ADN de HPV.
Selon la présente description, un herpèsvirus est déterminé comme présent ou comme détecté si au moins une protéine d’au moins une souche de HPV, plus préférablement au moins un antigène d’au moins une souche de HPV est détecté dans au moins un échantillon biologique dudit patient.
De manière préférée, un herpèsvirus est déterminé comme présent ou détecté si au moins un acide nucléique d’au moins une souche de HPV, plus préférablement au moins un ADN d’au moins une souche de HPV est détecté dans au moins un échantillon biologique dudit patient. On parle dans ce cas d’une virémie positive ou d’une ADNémie positive.
Par « virémie » on entend ici le taux de particules virales, ou la charge virale, dans un échantillon biologique pour un virus donné. La virémie est positive lorsque le nombre de particules virales détectées est supérieur par rapport à un seuil prédéfini (LOD) dans ledit échantillon biologique pour un virus donné. A l’inverse, la virémie est négative quand lesdites particules virales ne sont pas détectées dans ledit échantillon biologique.
Par « ADNémie » on entend la détection d'ADN viral dans un échantillon biologique, notamment dans un échantillon de plasma, de sang total et/ou de leucocytes isolés du sang périphérique et/ou dans un échantillon de couche leucocytaire (la fraction d'un échantillon de sang non coagulé après centrifugation qui contient la plupart des globules blancs et des plaquettes). Plusieurs techniques sont disponibles pour la détection de l’ADNémie, notamment les techniques basées sur la PCR, la capture hybride et l'analyse de l'ADN à chaîne ramifiée. Quand de l’ADN du virus étudié est détecté dans ledit échantillon biologique, l’ADNémie est positive. En revanche, l’ADNémie est négative quand ledit ADN viral n’est pas détecté dans ledit échantillon biologique. Par « évènement virémique » on entend qu’un virus donné a été détecté au moins une fois pendant la durée de l’étude, et notamment qu’une ADNémie positive pour un virus donné a été détectée dans au moins un échantillon biologique du patient pendant la durée de l’étude. Selon ce mode de réalisation préférée, le patient ne prenant pas de traitement immunosuppresseur présente un risque de complication accru lorsque la charge virale en TTV dans un échantillon biologique dudit patient, par exemple le sang ou l’un de ses dérivés tels que le plasma et/ou le sérum, est supérieure à 7,000 copies par ml_ d’échantillon biologique, de préférence supérieure à 10,000 copies par ml_ d’échantillon biologique, et que la présence de herpèsvirus est également détectée. Selon ce mode de réalisation préféré, le procédé peut ainsi comprendre la mise en oeuvre des étapes consistant à : a) mesurer la charge virale d’au moins un TTV dans un échantillon biologique dudit patient, b) comparer la charge virale déterminée pour ledit échantillon biologique à une valeur de référence prédéterminée à 10,000 copies/ml, c) déterminer la présence d’au moins un Herpèsvirus, de préférence par mesure de l’ADNémie, et d) établir la présence d’un risque accru de complication lorsque ladite charge virale déterminée pour ledit échantillon est supérieure à la valeur de référence prédéterminée et lorsque au moins un Herpèsvirus est présent.
Selon un autre mode de réalisation préféré, la description porte sur un procédé in vitro ou ex vivo pour évaluer un risque de complication chez un patient ne prenant pas de traitement immunosuppresseur, admis au sein d’un établissement de santé, comprenant la mesure de la charge virale d’au moins un torque teno virus (TTV) dans un échantillon biologique dudit patient et comprenant en outre la mesure de la charge virale d’au moins un herpèsvirus dans ledit échantillon biologique du patient.
Dans le cas présent, la « charge virale d’au moins un HPV » ou « charge d’au moins un HPV » correspond à la charge virale d’au moins une souche de HPV, c’est-à-dire au nombre de particules virales d’au moins une souche de HPV présentes dans un échantillon biologique.
La charge d’au moins un HPV chez un patient signifie la charge virale d’au moins une souche de HPV hébergée par ledit patient. La charge en HPV peut être déterminée en mesurant la quantité d’un composant d’au moins une souche de HPV, comme un acide nucléique ou une protéine, dans cet échantillon biologique. De préférence, la charge en HPV correspond à la quantité de séquences d'acide nucléique d’une souche donnée de HPV présentes dans un échantillon biologique. Ainsi, on pourra, selon l'invention, différencier les différentes souches spécifiques de HPV à mesurer dans ledit échantillon biologique. De préférence, la détermination de la charge en HPV comprend la détermination de la quantité de copies virales actives et/ou inactives. Elle consiste à déterminer la quantité de copies virales circulantes, intégrées ou latentes.
Les méthodes de détection et/ou de mesure de la charge virale d'un acide nucléique de HPV dans un échantillon biologique sont les mêmes que celles décrites précédemment pour le TTV et comprennent, entre autres, l'amplification, préférablement l'amplification par PCR, plus préférablement par PCR en temps réel, le séquençage, l'hybridation avec une sonde marquée et toutes les autres méthodes connues de la personne du métier.
Les Herpèsvirus ( Herpesviridae ou HpV) sont bien connus de la personne du métier. Il s’agit d’une famille de virus à ADN affectant diverses espèces animales y compris les oiseaux, les poissons, les reptiles, les amphibiens et les mammifères, dont l’Homme. Tous les membres de la famille des HpV partagent une structure commune : un ADN relativement grand, monopartite, double brin et linéaire, codant pour 100 à 200 gènes, enfermé dans une cage protéique icosaédrique appelée capside, elle-même enveloppée dans une couche protéique appelée tégument, contenant à la fois des protéines virales et des ARNm viraux, et une membrane bicouche lipidique appelée enveloppe. Tous les HpV sont à réplication nucléaire, l'ADN viral est transcrit en ARNm dans le noyau de la cellule infectée, où il peut persister sous une forme latente de manière indéfinie.
Neuf types de HpV sont connus pour infecter principalement les humains. Au moins cinq sont extrêmement répandus chez les humains : les virus herpès simplex 1 et 2 (HSV-1 et HSV-2, ou HHV-1 et HHV-2) tous deux peuvent causer l'herpès orolabial et l'herpès génital ; le virus varicelle-zona (ou HHV-3) qui cause la varicelle et le zona ; le virus d'Epstein-Barr (EBV ou HHV-4) impliqué dans plusieurs maladies, dont la mononucléose et certains cancers et le cytomégalovirus humain (HCMV ou CMV ou HHV- 5).
Chez l’Homme, plus de 90 % des adultes ont été infectés par au moins un de ces virus et une forme latente du virus subsiste chez presque tous les humains qui ont été infectés. Les herpèsvirus humains moins courants sont les herpèsvirus humains 6A et 6B (HHV-6A et HHV-6B, désignés ensemble HHV-6), l'herpèsvirus humain 7 (HHV-7) et l'herpèsvirus associé au sarcome de Kaposi (KSHV, également connu sous le nom de HHV-8).
Par « herpèsvirus » ou « HPV » ou « HHV » (Human Herpes Virus), on entend ici un virus de la famille des Herpesviridae. Par « génome de HPV », il est ici fait référence aux génomes de tous les Herpesviridae, y compris ceux du type HSV-1, HSV-2, HHV-3, EBV, CMV, HHV-6, HHV-7 et KSHV et plus particulièrement ceux du type CMV, EBV, HHV6 et HSV-1.
Selon un mode de réalisation préféré, ledit au moins un herpèsvirus est sélectionné dans le groupe constitué par : CMV, EBV, HHV6 et HSV-1. De préférence, l’herpèsvirus est EBV. A titre d’exemple, il est ici fait référence au génome des souches herpèsvirus du type CMV AD169, EBV B-95, HSV1 95 et HHV6 Z29. A titre d’exemple non limitatif, un génome de CMV AD169 peut être celui dont la séquence référencée sous le numéro d'accession Genbank X17403.1. De même, un génome de EBV B-95 peut être celui dont la séquence référencée sous le numéro d'accession Genbank est V01555.2. Un exemple de génome de HHV6 Z29 peut être celui dont la séquence référencée sous le numéro d'accession GenBank X83413.2.
Préférentiellement, la détermination de la présence d’au moins un HPV et/ou la mesure de la charge virale en HPV est effectuée par une PCR quantitative en temps réel. De nombreuses méthodes de détection et de quantification des HPV ont été décrites dans l’art et sont connues de la personne du métier (voir par exemple Walton et al., Plos ONE 9(6) : e98819, 2014). On se référera en particulier à la méthode décrite par Mallet et al. ( Intensive Care Medicine Exp. (2019) 7 :28) et plus particulièrement au tableau S1 de cet article reproduit ici dans les figures 6 et 7. Cette méthode est particulièrement avantageuse de par sa simplicité et sa robustesse, elle peut en outre être mise en oeuvre avec n’importe quel type de plateforme de PCR. Elle est fondée sur l’amplification de gènes spécifiques de chacun de ces Herpèsvirus, à savoir ppUL83 codant pour une protéine structurelle du CM V, le gène BXLF1 codant pour une thymidine kinase du EBV, le gène US7 codant pour une glycoprotéine de HSV-1 et le gène U57 codant pour une protéine de la capside de HHV6. Il est notamment particulièrement avantageux d’utiliser les trousses de diagnostic R-GENE® (CM V R- GENE® Ref. 69-003B, EBV R-GENE® Ref. : 69-002B, HSV1 HSV2 VZV R-GENE® Ref. : 69- 004B et HW6 R-GENE® Ref. : 69-100B, bioMérieux, France) pour mettre en oeuvre cette méthode. Dans un mode de réalisation préféré, la méthode décrite ici comprend une étape supplémentaire de normalisation de la quantité d’acide nucléique de HPV mesurée. A cet égard, la personne du métier pourra se référer aux méthodes et modes de réalisation décrits ci-dessus concernant de la normalisation des niveaux de TTV. Ces méthodes peuvent aisément être adaptées à la normalisation de la quantité d’acide nucléique de HPV.
Une fois la charge d’au moins un HPV déterminée par mesure de la quantité d’acide nucléique de HPV, celle-ci étant optionnellement normalisée, il peut être avantageux de la comparer à une charge de HPV de référence. A cet égard, la personne du métier pourra se référer aux méthodes et modes de réalisation décrits ci-dessus concernant la comparaison à des niveaux de référence de TTV. Ces méthodes peuvent aisément être adaptées à la comparaison avec des niveaux de référence de HPV.
Procédés de traitement d’un patient suspecté d’avoir un risque de complication
La susceptibilité du patient aux risques de complications, notamment d’infections, peut donc être déterminée à l’aide des procédés décrits ici, ce qui permet de mettre au point d'adapter un traitement spécifique aux besoins du patient.
Avantageusement, les procédés tels que décrits précédemment peuvent donc comprendre, dans tous leurs modes de réalisation, une étape de gestion des soins de santé, notamment pour réduire le risque de complication et en particulier le risque de survenue d’une infection associée aux soins.
Un patient identifié comme étant à risque accru de survenue d’une infection associée aux soins peut avoir une gestion des soins de santé adaptée dans le but de réduire le risque de survenue de ladite infection associée aux soins et, par exemple, afin de réduire le risque de développer un sepsis, un choc septique ou encore le risque de décès.
Ainsi, selon un autre aspect, la présente description porte également sur un procédé de traitement d’un patient suspecté d’avoir un risque de complication, caractérisé en ce qu’il comprend les étapes consistant à : identifier les patients présentant un risque de complication en mettant en oeuvre l’un quelconque des modes de réalisations tels que décrit ci-dessus et, adapter la gestion des soins de santé dudit patient identifié à l'étape précédente pour réduire le risque d’aggravation.
A titre d’exemples de gestion des soins, on peut citer un traitement immunomodulateur adapté au patient ou encore un traitement antibiotique prophylactique, les deux traitements pouvant être associés et/ou orienter vers un service de soins continus ou de réanimation afin de réduire le risque de survenue d’une infection associée aux soins, par exemple réduire le risque de développer un sepsis, un choc septique ou même le risque de décès dans les jours qui suivent la mesure de l’expression du ou des biomarqueur(s). De manière préférée, le traitement immunomodulateur est un traitement immunostimulant, s’il est déterminé que l’individu a un statut d’immunosuppression, ou un traitement anti-inflammatoire, s’il est déterminé que l’individu a un statut d’inflammation.
Parmi les traitements immunostimulants qui peuvent être sélectionnés, on peut citer à titre d’exemples le groupe des interleukines, en particulier IL-7, IL-15 ou IL-3, des facteurs de croissance, en particulier le GM-CSF, des interférons, en particulier IFNy, des agonistes des récepteurs Toll, des anticorps, en particulier des anticorps dirigés contre des checkpoints immunitaires (par exemple des anticorps anti-PD1, anti-PDL1, anti-LAG3, anti-TIM3, anti-IL-10 ou anti-CTLA4), des transferrines et des molécules inhibitrices de l’apoptose, FLT3L, Thymosin a1, des antagonistes adrénergiques.
Parmi les traitements anti-inflammatoires, on peut citer notamment le groupe des glucocorticoïdes, des agents cytostatiques, des molécules agissant sur les immunophilines et les cytokines, des molécules bloquant le récepteur à l’IL-1 et des traitements anti-TNF. Des exemples de traitements antibiotiques prophylactiques appropriés pour prévenir la pneumonie sont décrits en particulier dans les Annales Françaises d'Anesthésie et de Réanimation (30 ; 2011 ; 168-190). Inversement, un patient ne présentant pas de risque de survenue d’une infection associée aux soins pourra être orienté rapidement vers un service d’hospitalisation de jour, par exemple un service d’infectiologie, plutôt que de rester dans un service avec un monitoring rapproché dont il n’aura pas besoin.
L’invention sera décrite plus précisément au moyen des exemples ci-dessous. LEGENDES DES FIGURES
[Fig 1]: Représentation de la structure du génome d’un isolat de TTV.
[Fig 2A] [Fig 2B] : Caractéristiques des patients de la cohorte à l'admission et résultats en fonction du titre viral en TTV, de la cinétique de la virémie et de la coinfection par des herpèsvirus (Figures 2A et 2B). Les variables catégorielles sont exprimées en n (%) et les variables continues en médiane [Q1-Q3]. Les comparaisons entre les conditions de TTV concernant le titre ou la cinétique de la virémie ou la coinfection par des herpèsvirus ont été effectuées à l’aide d’un test du Chi carré pour les variables qualitatives et d’un test de Wilcoxon pour les variables quantitatives, selon le cas. Les valeurs P en caractères gras avec indication des étoiles représentent la significativité à p < 0,05. USI unité de soins intensifs, IAI infection acquise en USI, HpV herpèsvirus, SOFA évaluation séquentielle de la défaillance d’un organe, SAPS Simplified Acute Physiology Score, a ADNémie TTV inférieure à 10 000 copies/ml, b ADNémie TTV supérieure à 10 000 copies/ml, c Stabilité du titre TTV correspondant à une pente comprise dans l’intervalle -1 ,25/+1 ,25 (mesurée entre les médianes des titres viraux à (J1 à J7) et (J14 à J28)), d Augmentation du titre TTV correspondant à une pente de >+1 ,5, e Diminution du titre TTV correspondant à une pente de <-1 ,5, f ADNémie TTV supérieure à 10000 copies/ml et au moins un herpèsvirus, g ADNémie TTV exclusive supérieure à 10000 copies/mL, h herpèsvirus (HpV) exclusif. [Fig 3] : Association entre la survenue d'une IAS au cours du mois d'hospitalisation et la présence de virémie.
[Fig 4] : Caractéristiques des patients de la cohorte à l'admission et résultats en fonction de l’ADNémie du TTV supérieure à 167 copies (cp)/ml (LOD), 7000 copies/ml, 10 000 copies/ml et 40 000 copies/ml, au cours du premier mois (J1 à J28) suivant l’admission.
[Fig 5] : Association entre le résultat clinique binaire et la cinétique d'expression du TTV.
[Fig 6] : Référence des souches de virus HpV.
[Fig 7] : Tableau de référence des conditions PCR pour déterminer la LOD des virus. EXEMPLES
Aux fins de mieux comprendre la physiopathologie sous-jacente des phénomènes de réactivation virale chez les patients admis en unité de soins intensifs, une étude a été menée sur la cohorte de patients impliqués dans l'étude clinique REALISM (NCT01931956). Pour chacun de ces patients, l'ADNémie sanguine de l'anellovirus TTV et des herpèsvirus CMV, EBV, HHV6, HSV-1 a été mesurée sur une période d'un mois suivant leur admission en soins intensifs. Les résultats attendus visaient à permettre d’identifier les complications communes liées aux phénomènes de réactivation virale chez ces patients et à identifier si un ou plusieurs virus peuvent être associés à la survenue de complications particulières.
Matériel et Méthodes
Population de l’étude
Une étude observationnelle a été réalisée sur de cohorte prospective de patients gravement malades s’étant présentés soit pour un sepsis, un traumatisme grave, des brûlures graves ou ayant subi une chirurgie planifiée au service d'anesthésiologie et de médecine intensive de l'hôpital Edouard Herriot (Hospices Civils de Lyon, France). La période d'inclusion a été de 28 mois (décembre 2015 - mars 2018). Le protocole de l'étude a été approuvé par le comité d'éthique institutionnel (Comité de Protection des Personnes Sud-Est II) sous le numéro 2015-42-2. Cette étude clinique a également été enregistrée sur clinicaltrials.gov (NCT02638779). Au moment de l’inclusion, le consentement éclairé écrit a été obtenu de chaque volontaire sain et de chaque patient. Lorsqu’un patient n'était pas en mesure de consentir directement, le consentement éclairé a été obtenu auprès du représentant légal du patient et reconfirmé auprès du patient à la première occasion.
Les critères d'inclusion étaient les suivants : patients âgés de plus de 18 ans, diagnostic clinique de septicémie tel que défini par les directives de consensus SEPSIS-3 de 2016 (Singer et al., 2016), traumatisme grave avec un score de gravité des blessures (ISS) > 15, brûlure grave avec une surface totale de brûlure supérieure à 30 % ou patients chirurgicaux devant subir une intervention majeure telle qu'une œsophago gastrectomie, une résection de la vessie avec reconstruction de Brickers, une pancréaticoduodénectomie céphalique et une chirurgie de l'anévrisme de l'aorte abdominale par laparotomie. Les critères d'exclusion étaient les suivants : présence d'une affection préexistante ou d'un traitement pouvant influencer le statut immunitaire des patients, en particulier sont exclus les patients sous traitement immunosuppresseur, grossesse, patients institutionnalisés, incapacité à obtenir un consentement éclairé.
Parallèlement, une cohorte de 175 volontaires sains âgés de 18 à 82 ans (81 hommes et 94 femmes) a été recrutée de manière prospective. Pour tenir compte de l'influence possible de l'âge et du sexe sur les paramètres immunitaires, la répartition des volontaires sains a été basée sur les données démographiques d'âge et de sexe de la population française en 2016.
Echantillonnage et collecte de données
Pour chaque patient, les échantillons et les données cliniques ont été collectés trois fois au cours de la première semaine après l'admission : (1) au jour 1 ou 2 (J1-2), (2) à J3 ou 4 (J3-4) et (3) à J5, J6 ou J7 (J5-7) puis encore deux fois au cours du mois suivant l’admission, (4) à J14 et (5) à J28. Pour les volontaires sains, un échantillon a été prélevé pendant la visite d'étude et les données cliniques ont été enregistrées. La collecte des données est détaillée ailleurs (Venet et al., 2021 ).
Les données démographiques des patients, les comorbidités, le diagnostic, la gravité et les résultats cliniques ont été enregistrés manuellement de manière prospective. Un suivi longitudinal a été effectué pendant une période de 30 jours. Le sang total périphérique prélevé sur chaque patient et sur chaque volontaire sain a été traité à chaque fois dans les 3 heures suivant le prélèvement sanguin.
Le sang a été collecté dans un tube EDTA pour la détermination de l’ADNémie virale plasmatique, le phénotypage immunitaire par cytométrie en flux et les mesures des niveaux de cytokines plasmatiques, dans deux tubes héparine pour les tests fonctionnels (prolifération, expériences de production de cytokines), et enfin dans un tube PAXgene d'ARN sanguin (PreAnalytix, Hilden, Allemagne) pour les mesures de la concentration en ARNm des biomarqueurs du sang total par PCR en temps réel utilisant les méthodologies de sonde Eva-Green ou Taqman.
Les échantillons PAXgene ont été stabilisés pendant au moins 2h à température ambiante après le prélèvement puis congelés à -80° C selon les recommandations du fabricant. Définitions des complications
Les principales complications évaluées dans le cadre de cette étude étaient l'infection secondaire (infection associée aux soins - IAS) à 28 jours (J28) et la mortalité à J28. Les autres complications évaluées comprenaient la durée de séjour en unité de soins intensifs (USI) et la durée totale de séjour à l'hôpital, l'utilisation quotidienne d'un dispositif médical invasif (intubation trachéale, sonde urinaire à demeure et voie veineuse centrale). Les informations recueillies sur les infections ont été examinées par un comité de décision indépendant composé de trois cliniciens n'ayant pas participé au recrutement ou aux soins des patients de l'étude.
La confirmation du diagnostic d'infection secondaire (infection associée aux soins - IAS) par ce comité s’est basée sur les directives de la Société européenne de microbiologie clinique et des maladies infectieuses et de la Société américaine des maladies infectieuses. Seul le premier épisode d'infection secondaire a été pris en compte dans les analyses.
Détermination de l'ADNémie virale
Le processus semi-automatique de détermination de l'ADNémie virale du TTV et de quatre herpèsvirus, intégrant le traitement de l'échantillon et les procédures standardisées de PCR quantitative en temps réel, a été précédemment décrit en détail (Mallet et al., 2019 - Intensive Care Medicine Exp. 7 :28).
Brièvement, les extractions d'ADN viral dans les échantillons de plasma ont été réalisées à l'aide du kit Maxwell® HT Viral TNA chemistry (Promega) composé de particules de silice paramagnétiques et du robot de manipulation de liquides Freedom EVO® (TECAN) en suivant les instructions du fabricant. Des contrôles PCR ont été ajoutés à chaque échantillon de plasma avant l'extraction. La limite de détection (LOD - « Limit Of Détection ») a été déterminée précédemment pour le processus semi- automatique comme la plus petite quantité pouvant être distinguée d'une absence de détection (valeur à blanc) en utilisant des standards viraux (Mallet, 2019 - Intensive Care Medicine Exp. 7 :28).
La limite de détection du TTV a été déterminée en utilisant des échantillons de plasma comprenant une quantité prédéterminée de TTV. Dans un premier temps, l’échantillon de plasma témoin est dilué en série de 101 à 104, et chaque échantillon dilué est extrait indépendamment 3 fois puis amplifié par PCR quantitative, afin de déterminer une limite de détection approximative. Dans un deuxième temps, la plus grande dilution donnant un signal positif est diluée à nouveau à 1/2, et à 1/4 puis chaque échantillon dilué est extrait indépendamment 20 fois et amplifié. Les répliques positives les plus diluées avec 100 % de détection sont utilisées comme limite de détection.
La LOD, exprimée en copies par ml de plasma, est de 167 pour le TTV, 100 pour le CMV, 33 pour l'EBV, 166 pour le HHV6, et de 33 pour le HSV1. Les amplifications par PCR en temps réel des ADN viraux ont été réalisées sur le système StepOnePlus™ Real- Time PCR (ThermoFisher SCIENTIFIC) à l'aide de kits de dosage R-GENE® en utilisant des sondes TaqMan pour le CMV, l'EBV, le HSV1 , le HHV6 et le TTV (bioMérieux SA). Tous les échantillons d'acides nucléiques, répartis au hasard dans les plaques, ont été amplifiés simultanément avec les standards de quantification, contrôles de sensibilité et contrôles négatifs, conformément aux instructions du fabricant.
Enfin, à l'aide de courbes standards, les valeurs de Ct (« cycle threshold », seuil de cycle) pour chaque échantillon ont été converties en copies/pL d'ADN viral dans le tube de réaction PCR, puis en copies/mL d'ADN viral dans les échantillons de plasma.
Analyse statistique
La virémie a été évaluée par mesure de l’ADNémie pour chaque virus, un évènement virémique, c’est-à-dire une ADNémie positive, étant caractérisée par un nombre de copies du virus par microlitre supérieur à un seuil prédéfini (supérieur à la LOD). On considère qu’une ADNémie positive est précoce si elle est détectée pour au moins un des échantillons du patient au cours de la première semaine (jour 1/2, jour 3/4 ou jour 5/7) après l'admission du patient en soins intensifs. L’ADNémie a également été évaluée à J14 et J28. Les données sont présentées sous forme de nombres et de pourcentages (variables qualitatives) et de médianes et de 25e/75e percentiles (variables quantitatives).
L'association entre un événement virémique et les complications cliniques (survie ou infection bactérienne acquise en soins intensifs comme décrit précédemment (Mallet et al., 2019 - Intensive Care Medicine Exp. 7 :28) a été évaluée à l'aide du test x2 (khi- deux ou khi carré) ou du test exact de Fisher, le cas échéant.
L'association binaire entre l’ADNémie/événement virémique et les marqueurs immunitaires quantitatifs (cellules, cytokines, ARNm) a été évaluée à l'aide du test de la somme des rangs de Wilcoxon. Enfin, les analyses ont été réalisées avec le logiciel R version 3.4.4 et la signification statistique a été définie par un risque alpha de rejeter à tort l'hypothèse nulle de 5 % (p < 0,05 indique une association significative).
Résultats
Description de la cohorte
La cohorte REALISM de 377 patients gravement malades se compose de : 107 septicémies, 137 traumatismes graves, 24 brûlures graves et 109 chirurgies majeures.
Les données quantitatives (charge virale) plutôt que qualitatives (ADNémie) peuvent permettre une meilleure discrimination entre (1) une charge virale non significative, (2) une "réactivation" virale comme marqueur putatif d'immunosuppression, et (3) des charges virales élevées soutenant une véritable infection virale nécessitant un traitement (Textoris et al., 2017).
Les patients présentant une ADNémie TTV élevée (charge virale supérieure à 10 000 copies/mL) étaient plus gravement malades, avec des scores de gravité plus élevés et un besoin accru de traitements (Figure 3).
Alors que l’augmentation de la charge virale en TTV (p=0,025) était significativement corrélée à une durée de séjour plus longue en soins intensifs, aussi bien l’augmentation (p=0,048) que la diminution (p=0,048) de la charge virale en TTV, autrement dit une variation de la charge virale en TTV, étaient significativement associées à la survenue d'une infection acquise aux soins intensifs au cours du premier mois (Figures 2A et 2B).
De plus, il est surprenant de constater que les cas d'IAS tendent à être plus fréquents chez les patients présentant une ADNémie positive pour le TTV et au moins un herpèsvirus que chez les patients présentant uniquement une ADNémie herpétique positive (Figures 2A et 2B).
ADNémie chez les patients de l'unité de soins intensifs au cours de la première semaine et du premier mois d'hospitalisation - Au cours de la première semaine
Le TTV a été détecté (ADNémie positive) chez 217 (58 %) des patients de la cohorte, soit un peu plus que chez les témoins sains (51 %). Le TTV a été détecté seul chez 160 (42 %) patients, et codétecté chez les patients avec 1 (n=48, 13 %) ou 2 (n=6, 2 %), ou 3 et plus (n=3, 1 %) herpèsvirus. L'herpèsvirus le plus fréquemment codétecté avec le TVT était l'EBV (n=29, 8 %), suivi par le HHV6 (n=18, 5 %), le HSV1 (n=12, 3 %) et le CM V (n=12, 3 %).
Globalement, le nombre de patients présentant une ADNémie positive pour un seul virus (n=189), qu'il s'agisse d'un herpèsvirus ou d'un TTV, était similaire au nombre de patients présentant une ADNémie positive pour à la présence d'au moins deux virus (n=188).
- Au cours du premier mois
Le TTV a été détecté chez 228 (60 %) patients de la cohorte. 151 (40 %) patients présentaient une ADNémie positive pour le TTV uniquement, tandis que le TTV a été codétecté (ADNémies positives) chez les patients avec 1 (n=59, 16 %), 2 (n=11, 3 %) ou 3 ou plus (n=7, 2 %) herpèsvirus. Tous les herpèsvirus ont été codétectés avec le TTV, la codétection la plus fréquente étant avec EBV (n=36, 10%), puis avec HSV1 (n=28, 7%), avec CMV (n=23, 6%) et avec HHV6 (n=19, 5%). Globalement, la cohorte comprenait autant de patients avec une infection (ADNémie positive) pour un virus unique (n=187) que de patients présentant une co-infection (n=190).
Le pourcentage de patients présentant un TTV était similaire chez les patients atteints de septicémie, de traumatisme grave et de chirurgie majeure (56 à 64%) et légèrement inférieur chez les brûlés (46 %), par rapport aux 51 % observés chez les volontaires sains.
En tendance, le pourcentage de patients présentant un titre élevé de TTV semblait plus important dans le groupe des patients ayant subi une chirurgie et les critères de gravité sont corrélés avec une charge virale élevée en TTV (notamment supérieure à 7000 copies/mL) (Figure 4).
Association de ADNémie avec les complications cliniques
Considérant à l’issue de la période d’observation de 28 jours, la survenue d’au moins un épisode d’infection secondaire liée aux soins.
La détection de chaque herpèsvirus individuellement au cours de la première semaine d’admission n’est pas significativement associée à un risque d'infection associée aux soins (IAS), contrairement au premier mois. On observe une augmentation significative du taux d’IAS chez les patients ayant eu, au cours du premier mois, au moins un épisode virémique (ADNémie positive) pour n’importe lequel des herpèsvirus pris individuellement, en l’absence d’ADNémie positive pourTTV.
En outre, une ADNémie positive pour TTV seul (sans détection d’un herpèsvirus) est associée à une occurrence réduite d'IAS (Figure 3).
Il a également été observé qu’une charge virale en TTV stable au cours du premier mois est associée à une occurrence réduite d'IAS (Figure 5).
Si l’on considère l’ADNémie virale des patients de la cohorte au cours du premier mois, on observe chez les patients présentant plusieurs événements virémiques (ADNémie positive pour 2 herpèsvirus ou plus, ou pour un TTV et au moins un herpèsvirus) un taux d’IAS plus élevé (44%) par rapport aux patients ayant une ADNémie positive pour un seul virus (22%) ou aux patients sans ADNémie détectée (19%) (test x2. p <0,001).
Si l’on considère les évènements d’ADNémie virale positive au cours de la première semaine, les patients qui ont eu plusieurs événements virémiques ont eu un taux d’IAS similaire (11%) par rapport à ceux ayant une ADNémie positive pour un seul virus (9%) ou aucune ADNémie détectée (9%) (test x2. P = 0,8).
De manière surprenante, les résultats montrent que de manière précoce, dès la première semaine suivant l’admission du patient, la co-détection d’une charge virale de TTV élevée (notamment supérieure à 10000 copies/ml d’échantillon) et d’une ADNémie positive pour un herpèsvirus est associée de manière significative au risque de survenue d'une infection associée aux soins (Figure 3).
Pour résumer, en ce qui concerne la virémie, le groupe de pathologie et les critères d'admission, (i) la proportion de patients présentant une charge virale en TTV variable (croissante ou décroissante) au fil du temps a tendance à être plus élevée chez les patients atteints de septicémie que pour les autres groupes, et (ii) l’ADNémie herpétique positive ainsi qu'une charge virale en TTV élevée semblent être associées à la gravité de l’état du patient à l'admission.
En ce qui concerne les IAS, (i) la co-détection, de préférence dès la première semaine d'admission, d'une charge virale élevée en TTV avec une ADNémie herpétique positive est corrélée au risque de survenue plus fréquent d’IAS, et (ii) une charge virale en TTV stable est associée à une occurrence relativement moindre d'IAS, au contraire d’une variation de la charge virale en TTV qui est également corrélée au risque de survenue d’IAS chez le patient.
Discussion
Les résultats ont démontré qu’il était possible de distinguer une charge de TTV non significative d’une charge de TTV élevée. Ainsi, il est du mérite des inventeurs d’avoir notamment identifier un seuil d'expression de TTV associé à des caractéristiques physiopathologiques chez les patients en soins intensifs.
En bref, les résultats présentés précédemment (i) ont démontré que la détection chez le patient dès la première semaine d'admission aux soins intensifs d'une charge élevée de TTV associée à une réactivation virale de l'herpès était associée à un risque accru d’IAS, et que (ii) une virémie TTV précoce élevée était associée à une altération immunitaire.
L’évolution de la virémie au cours du temps était moins discernable pour le TTV (de 58% la première semaine à 60% au cours du mois), et la virémie positive pour TTV était plus fréquente pour le TTV seul que pour une codétection TTV-herpèsvirus (42% contre 15% mesuré au cours de la première semaine, 40% contre 20% mesure au cours du premier mois).
Bien que la prévalence de TTV soit plus élevée chez les hommes dans les cohortes d'individus en bonne santé (Focosi et al., 2020) et de patients transplantés (Bal et al., 2018), aucun biais de genre n'a été observé dans la population de cette étude à l'exception d'une prédominance masculine dans le sous-groupe présentant des charges virales en TTV supérieures à 10000 copies / mL.
TTV et EBV étaient les virus les plus fréquemment co-détectés, de 8% à 10% au cours de la première semaine et du premier mois, respectivement.
Au cours de la même période, seules les variations de la charge en TTV sont significativement associées à un risque accru de survenue d'IAS. La seule présence de TTV, y compris avec une charge élevée, n’est en effet pas suffisante à elle seule pour déterminer le risque accru d’IAS.
Néanmoins, au cours du premier mois suivant l’admission, les patients avec des événements virémiques multiples, y compris ceux avec une ADNémie positive pour TTV, ont une fréquence d’IAS plus élevée (44%) que ceux avec ayant eu un événement virémique unique ou aucun évènement virémique (22% et 19%, respectivement). Ainsi, de manière tout à fait surprenante et inattendu, la co-détection d’une charge élevée de TTV et d’un herpèsvirus au cours de la première semaine d’admission est significativement associée à la survenue d'un événement IAS au cours du premier mois.
En conclusion, les résultats démontrent chez des patients admis en unité de soins intensifs, l’existence d’une corrélation entre la réactivation virale, en particulier TTV en combinaison ou non avec HpV, et le risque de développement d’infections associées aux soins.
REFERENCES
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7. Hino S, Miyata H. Torque teno virus (TTV): current status. Rev Med Virol. févr 2007;17(1 ):45-57.

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé d’évaluation in vitro ou ex vivo du risque de complication chez un patient admis au sein d’un établissement de santé et qui n’est pas sous traitement immunosuppresseur, caractérisé en ce qu’il comprend la mise en oeuvre des étapes consistant à : a) mesurer la charge virale d’au moins un TTV dans un échantillon biologique dudit patient, b) comparer la charge virale déterminée pour ledit échantillon biologique à une valeur de référence prédéterminée, et c) établir un risque de complication lorsque la charge virale déterminée pour ledit échantillon est supérieure ou inférieure à la valeur de référence prédéterminée.
2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en que la valeur de référence prédéterminée est de 10,000 copies/ml.
3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que qu’il est établi à la présence d’un risque accru de complication lorsque ladite charge virale déterminée pour ledit échantillon est supérieure à ladite valeur de référence.
4. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce qu’il comprend également la détection de la présence d’au moins un Herpèsvirus, de préférence par mesure de l’ADNémie.
5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce qu’il est établi à la présence d’un risque accru de complication lorsque la charge virale d’au moins un TTV déterminée pour ledit échantillon est supérieure à 10,000 copies/ml et lorsque au moins un Herpèsvirus est présent.
6. Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu’il comprend la mise en oeuvre des étapes consistant à : a) mesurer une première charge virale d’au moins un TTV dans ledit échantillon biologique du patient issu d’un premier prélèvement effectué au temps T1, b) mesurer une deuxième charge virale d’au moins un TTV dans ledit échantillon biologique du patient issu d’un second prélèvement effectué au temps T2, c) calculer la variation entre la charge virale à T2 et la charge virale à T1, donnant une valeur ATTV, d) établir une conclusion quant au risque de complication, à partir du résultat des comparaisons.
7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce qu’il est conclu à l’absence d’un risque accru de complication lorsque la valeur ATTV est comprise dans la gamme allant de -1,25 à +1,25, de préférence de -1,20 à +1,20, et de préférence encore de -1,10 à +1,10.
8. Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que le risque de complication est le risque de survenue d’une d’infection associée aux soins (IAS).
9. Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que l’échantillon biologique est issu d’un patient admis au sein d’un hôpital, de préférence au sein du service des urgences, du service de réanimation, en unité de soins intensifs ou en unité de soins continus.
10. Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que l’échantillon biologique est issu d’un patient en état septique, plus particulièrement, en choc septique, d’un patient atteint de brûlures, plus particulièrement de brûlures graves, d’un patient atteint de traumatismes, plus particulièrement de traumatismes graves, ou d’un patient ayant subi une opération chirurgicale, plus particulièrement une opération chirurgicale lourde.
11. Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que l’échantillon biologique est issu d’un patient en état septique, atteint de brûlures, atteint de traumatismes ou ayant subi une opération chirurgicale, et admis en unité de soins intensifs.
12. Procédé selon la revendication 4 ou 5, caractérisé en ce que ledit au moins un Herpèsvirus est sélectionné dans le groupe constitué par : CMV, EBV, HHV6 et HSV-1, et est de préférence EBV.
13. Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 12, caractérisé en ce que l’échantillon biologique est un fluide biologique provenant du patient sélectionné dans le groupe constitué par le sang ou ses dérivés tels que plasma et/ou le sérum, le liquide céphalorachidien, l’urine, et les lavages broncho-alvéolaires.
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