CN117957333A

CN117957333A - 细环病毒（ttv）作为标志物以确定医疗保健机构收治的患者的并发症的风险的用途

Info

Publication number: CN117957333A
Application number: CN202280062978.3A
Authority: CN
Inventors: 弗朗索瓦·马莱
Original assignee: Biomerieux SA; Bioaster
Current assignee: Biomerieux SA; Bioaster
Priority date: 2021-07-19
Filing date: 2022-07-19
Publication date: 2024-04-30
Also published as: WO2023002120A1; FR3125300A1; JP2024528662A; EP4373977A1

Abstract

本发明涉及一种用于在体外或离体评估医疗保健机构收治的患者的并发症的风险的方法，该方法包括测量所述患者的生物样品中至少一种细环病毒(TTV)的病毒载量，其特征在于所述患者未接受免疫抑制治疗。

Description

细环病毒(TTV)作为标志物以确定医疗保健机构收治的患者的并发症的风险的用途

背景技术

继发感染(或医疗保健相关感染，HAI)是医疗中的主要并发症，特别是在诸如医院的医疗机构中，其中它们被称为院内感染。收治进重症加强护理病房的患者中有20％至40％发生院内感染，导致住院治疗时间延长，通常结合使用侵入性医疗设备和施用大量抗生素。最终，发病率和死亡率也更高。

在过去几年，由于多重耐药病原体的增加，医疗保健相关感染的发生尤其加剧。世界卫生组织(WHO)估计，欧洲医院的院内感染人数约为500万，导致约50000例死亡，每年额外花费130至240亿欧元。特别是美国卫生与公众服务部、欧洲疾病预防和控制中心、WHO和国家机构已经发布了建议，并鼓励建立感染控制计划，因为预防和减少医疗保健相关感染已成为当务之急。根据一些模型，可以减少识别感染医疗保健相关感染的高风险患者所需时间的检测将有可能降低这些患者的死亡率，并且具有良好的成本效益。

因此，重要的是能够识别与HAI风险相关的早期标志物，更普遍的是与医疗期间患并发症的风险相关的标志物，特别是为了在检测到风险时立即提供合适的治疗响应。

许多因素会影响医疗保健相关感染的发生和发展，如与患者的治疗相关的因素以及患者的总体健康状况。多项研究证明，免疫系统受损与继发感染发生率增加之间存在关系(Delano等人的综述，2016年)，然而这些结果仍然存在争议，更近的研究质疑该联系的存在(Venet等人，2021年)。

一些研究还试图建立病毒再激活的现象(尤其是疱疹病毒(Hpv)和细环病毒(TTV))与医疗保健相关并发症的发生之间的联系。病毒再激活的现象尤其存在于未免疫抑制、重病(败血症)或受伤(外伤、烧伤、外科手术)、免疫麻痹(其特征是响应最初的高炎症状态的适应性和先天免疫系统功能障碍)的患者中。

目前，病毒再激活的临床意义尚未明确。特别是，不清楚再激活的病毒是否应被视为反映免疫系统变化的简单标志物，或者相反，应被视为促进继发感染并需要实施预防性治疗的病原体(Limaye等人，2010年)。

最近，Mallet等人(Mallet等人，2019年-Intensive Care Medicine Exp.7:28)发表了一项研究结果，表明EBV(Epstein-Barr病毒)和TTV病毒的共同再激活之间存在联系，并且死亡率没有显著降低。

最近另一项对接受肾移植的患者进行的研究确定测量TTV病毒载量可以识别那些具有继发感染的低风险的患者(Strassl等人，The Journal of Infectious Diseases,2018年；218:1191-9)。尽管如此，这项研究的范围仍然有限，更何况，由于所涉及的患者都接受了免疫抑制治疗，因此患传染病的风险更大。因此，这无法在TTV病毒载量与继发感染(或医疗保健相关感染)的风险之间建立可靠的联系，从而无法识别哪些患者具有患继发感染的高风险。

因此，仍然需要一种简单且可靠的诊断方法，当患者在医疗保健机构接受医疗时，使得能够识别有患并发症、特别是与医疗保健相关感染的风险的患者。

发明内容

本发明的第一主题涉及一种用于在体外或离体评估医疗保健机构收治的患者的并发症的风险的方法，包括测量来自所述患者的生物样品中至少一种细环病毒(TTV)的病毒载量。其特征在于，所述患者未接受免疫抑制治疗。

根据优选的实施方案，所述方法的特征在于，患者是被医院收治的患者，优选被急诊科、复苏科、重症加强护理病房或高依赖病房收治。

根据另一个优选的实施方案，所述方法的特征在于，所述患者是处于败血症状态、更具体地败血性休克的患者，遭受烧伤、更具体地严重烧伤的患者，遭受外伤，更具体地严重外伤的患者，或已经接受外科手术、更具体地大型外科手术的患者

根据另一个优选的实施方案，所述方法的特征在于，所述生物样品源自败血症状态、遭受烧伤、遭受外伤或已经接受外科手术的患者，并且已经收治进重症加强护理病房。

根据另一个优选的实施方案，所述方法的特征在于，并发症由医疗保健相关感染(HAI)的发生组成。

根据另一个优选的实施方案，所述方法的特征在于，其包括执行由以下组成的步骤：

a)测量来自所述患者的生物样品中至少一种TTV的病毒载量，

b)将对所述生物样品测定的病毒载量与预定参考值进行比较，和

c)当对所述生物样品测定的病毒载量大于或小于预定参考值时，确定并发症的风险。

根据另一个优选的实施方案，所述方法的特征在于，预定参考值为10000拷贝/ml。

根据另一个优选的实施方案，所述方法的特征在于，其包括执行由以下组成的步骤步骤：

a)测量来自患者在时间T1时采集的第一样品的所述生物样品中至少一种TTV的第一病毒载量，

b)测量来自患者在时间T2时采集的第二样品的所述生物样品中至少一种TTV的第二病毒载量，

c)计算T2时的病毒载量与T1时的病毒载量之间的变化，给出ΔTTV值，

d)由比较的结果确定有关并发症的风险的结论。

根据另一个优选的实施方案，所述方法的特征在于，其包括执行由以下组成步骤：

d)当ΔTTV值在从-1.25至+1.25、优选从-1.20至+1.20并且还更优选从-1.10至+1.10的范围内时，得出的结论是不存在增加的并发症风险。

根据另一个优选的实施方案，所述方法的特征在于，其还包括检测至少一种疱疹病毒(HPV)的存在。

根据另一个优选的实施方案，所述方法的特征在于，其还包括测量至少一种疱疹病毒(HPV)的病毒载量。

根据另一个优选的实施方案，所述至少一种疱疹病毒(HPV)选自由以下组成的组：CMV、EBV、HHV6和HSV-1，并且优选为EBV。

根据另一个优选的实施方案，所述方法的特征在于，通过至少一种TTV序列和至少一种疱疹病毒(在适当情况下)的扩增、测序或杂交来测量病毒载量，优选通过扩增，更优选通过实时PCR。

根据另一个优选的实施方案，所述方法的特征在于，生物样品是来自患者的生物液体，所述流体选自由血液或其衍生物(如血浆和/或血清)、脑脊液、尿液和支气管肺泡灌洗液组成的组。

具体实施方式

本发明的主题是一种用于评估未接受免疫抑制治疗且已被医疗机构收治的患者的并发症的风险(例如医疗保健相关感染(HAI))的方法。

事实上，本发明人已经表明，细环病毒(TTV)病毒载量是未接受免疫抑制治疗且已被医疗机构收治的患者，特别是正在重症加强护理病房接受治疗的患者的并发症风险的指标。

特别是，令人惊讶的是，收治进重症加强护理病房后的第一周后TTV病毒载量的增加与在该病房的停留时间较长显著相关。

此外，TTV病毒载量的增加和减少与入院后第一个月内HAI的发生显著相关。

最后，从患者入院后第一周，特别是进入重症加强护理病房后，合并检测到与至少一种疱疹病毒的存在相关的高TTV病毒载量，与发生医疗保健相关感染(HAI)的风险相关。因此，可以对未接受免疫抑制治疗的患者的并发症发生的风险，特别是医疗保健相关感染(HAI)发生的风险进行早期评估。

在本说明书中，本领域技术人员可以单独采用实施方案或者适当组合实施方案。

用于评估患者的并发症的风险的方法

本发明的主题是一种基于对来自患者的生物样品中至少一种TTV的病毒载量的测量，在体外或离体评估未接受免疫抑制治疗且已被医疗保健机构收治的所述患者的并发症的风险的方法。

根据第一方面，本文描述了一种用于在体外或离体评估医疗保健机构收治的患者的并发症的风险的方法，包括测量来自所述患者的生物样品中至少一种TTV的病毒载量，其特征在于所述患者未接受免疫抑制治疗。

令人惊讶的是，通过研究医疗保健机构中患者的病毒再激活现象，本发明人已经确定，在未接受免疫抑制治疗的患者中，他们留在医疗保健机构期间的TTV病毒载量的变化与并发症(即其病况的不利变化，)的发生，即特别是医疗保健相关感染的发生的相关性的存在。

根据优选的实施方案，医疗保健机构收治后第一个月期间TTV病毒载量的变化指示发展HAI的风险。

在本文表述“评估患者的并发症的风险”或“确定患者的并发症的风险”表示确定受试者或患者未来患并发症的概率，如下文所定义。

本文公开的方法代表用于评估所述风险的工具，并且可以与其他过程、方法或指标结合，如临床检查，从所述患者采集生物样品并检测一种或多种生物标志物和/或一种或多种感染原，特别是细菌、病毒、寄生虫、酵母菌或丝状真菌。

在本文“并发症”是指疾病、健康状况或医疗的不利变化。在本文“并发症”可以具体指疾病的不利变化，其可能需要实施一种或多种侵入性医疗装置，例如气管插管，插入导尿管、导管或中心管。

“并发症”还指疾病的不利变化，其可能导致在所述医疗保健机构、特别是重症加强护理病房的治疗时间延长。

“并发症”也指所述患者的死亡。

“并发症”优选地指疾病的不利变化，其可能需要实施特定的医学治疗。作为这种并发症的实例，可以提及继发感染或机会性感染的发展，特别是“医疗保健相关感染”或“HAI”，如一种或多种感染原的感染，例如细菌、病毒、寄生虫、酵母菌或丝状真菌。

在本说明书的上下文中，如果感染发生在医疗保健专业人员对患者的治疗(诊断的、治疗的、治标的、预防的、教育的或外科手术的)期间并且如果治疗开始时不存在感染，则其被称为“医疗保健相关感染”。医疗保健相关感染涵盖在医疗保健机构内感染的感染(称为是院内感染)，也涵盖在这种情况以外接受护理期间感染的感染。当治疗开始时无法准确了解感染状态时，为了定义HAI，通常接受至少48小时的延迟或长于潜伏期的延迟。

对于外科手术部位的感染，这些感染发生在外科手术后30天内，或者如果已植入植入物、假体或假体材料，则发生在外科手术后一年内的这些感染被认为是医疗保健相关感染。医疗保健相关感染可以是细菌来源的，例如由诸如大肠杆菌(Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)或铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)之类的细菌引起的。感染也可以是真菌来源的，特别是由假丝酵母菌(Candida)属的酵母，或曲霉菌(Aspergillus)属的丝状真菌，特别是烟曲霉(Aspergillus fumigatus)引起的。感染也可以是病毒性的，特别是腺病毒、疱疹病毒、肠道病毒、轮状病毒或HIV类型的病毒。这也可能是潜在致病性潜伏病毒的再激活，如疱疹病毒，例如病毒CMV、EBV、HHV6和HSV-1。

根据优选的实施方案，本说明书涉及一种用于在体外或离体评估未接受免疫抑制治疗的患者的并发症的风险的方法，所述并发症是医疗保健相关感染(HAI)的发生。

特别地，HAI可能是院内感染。在这种情况下，本文描述的方法使得可以确定所述患者发生院内感染的风险。在处于败血症状态的患者的情况下，该患者因此已经遭受原发感染，本文描述的方法使得可以确定发生继发感染的风险。

本文描述的方法特别基于测量来自所述患者的生物样品中至少一种TTV的病毒载量。

“生物样品”是指可以从受试者采集的任何样品。

一般来说，生物样品必须可以确定TTV和/或疱疹病毒(HPV)载量。本文的生物样品尤其是指但不限于全血、血清、血浆、吐唾液、鼻咽样品、尿液、粪便、皮肤、脑脊液、唾液、胃分泌物、精子、精液、眼泪、脊髓组织或液体、脑液、三叉神经节样品、骶神经节样品、脂肪组织、淋巴组织、胎盘组织、上生殖道组织、胃肠道组织、生殖器组织和神经系统组织。

具体地，该样品可以是生物液体，如血液样品或血液来源样品，其尤其可以选自全血(如从静脉收集的，即含有白细胞和红细胞、血小板和血浆)、血浆、血清以及从血液中提取的所有类型的细胞，如外周血单核细胞(PBMC，包含淋巴细胞(B、T和NK细胞)、树突状细胞和单核细胞)，B细胞亚群、纯化的单核细胞或中性粒细胞。待测样品可以直接从生物来源使用，或经过预处理使用，从而可以改变样品的性质。例如，这样的预处理可以包括从血液中制备血浆、粘性液体的稀释等。

预处理方法还可以包含过滤、沉淀、稀释、蒸馏、混合、浓缩、灭活破坏性成分、添加试剂、细胞溶解等。此外，将固体测试样品改性以形成液态介质或释放分析物可能是有益的。

优选地，生物样品是来自患者的生物液体，所述液体选自由血液或其衍生物组成的组，如血浆和/或血清、脑脊液、尿液和支气管肺泡灌洗液。甚至更优选地，生物样品是血液或其衍生物的样品，如血浆和/或血清。

本文中，术语“受试者”是指脊椎动物，优选哺乳动物，并且最优选所有人类。人类受试者也可以被称为“患者”。

“患者”在本文更具体地指与医疗保健专业人员如医生(例如全科医生)或医疗机构或保健机构(例如医院并且更具体地急诊科、复苏科、重症加强护理病房或高依赖病房，或辅助生活类型的，老年人医疗机构)接触的人类受试者。根据一些实施方案，患者可以是疫苗接种方案(特别是在辅助生活机构中或在全科医生处)中的老年人。

如本文所述，所述评估方法使得可以确定未接受免疫抑制治疗的患者患并发症的风险。

“未接受免疫抑制治疗的患者”是指所述患者未服用任何免疫抑制药物或具有免疫抑制副作用的药物，也未接受任何可能引起免疫抑制的治疗。

“免疫抑制治疗”或“引起免疫抑制”指治疗，特别是药物，其作用是降低、抑制或防止免疫系统的活性。以非限制性实例的方式，“免疫抑制治疗”可以特别是使用以下药物的治疗：糖皮质激素、细胞抑制剂、干扰素、抗增殖和抗代谢药物(雷帕霉素、依维莫司、吗替麦考酚酯、麦考酚酸)、钙调神经磷酸酶抑制剂，特别是其抗移植排斥作用(环孢素、他克莫司(FK506)、沃罗孢素(voclosporine))、S1P-R激动剂(FTY72)、丙二腈酰胺(FK778)、抗体，例如抗胸腺细胞球蛋白，或一些针对特定抗原的单克隆抗体(如莫洛单抗-CD3、达克珠单抗、巴利昔单抗、利妥昔单抗、阿仑单抗、英夫利昔单抗、阿达木单抗、依法珠单抗)。

“免疫抑制治疗”也指放疗或化疗。

根据优选的实施方案，本说明书涉及一种用于在体外或离体评估未接受免疫抑制治疗且已被医疗保健机构收治(特别是被急诊科、复苏科、重症加强护理病房或高依赖病房收治)的患者的并发症的风险的方法。

根据患者的医疗情况，医院内的几个科室之间会有区别。

“急诊科”指接收自行抵达或由救护车或急救服务车带来的生病和受伤人员的科室。紧急服务的作用是不加选择地在昼夜和全年的任何时候接收任何处于紧急情况下的人员，包括精神紧急情况，并且治疗该人员，特别是在遇险和危及生命的紧急情况下。

“复苏科”指病况最严重的患者住院的专业科室。在这个科室，患者受益于对生命功能的持续监测，如通气、氧合、血压、心脏和肾功能。如果需要，可以辅助这些重要功能，以便在可能的情况下使患者存活下来。例如在严重感染(败血性休克)、药物中毒、多处外伤、昏迷、急性肾衰竭、急性呼吸衰竭期间，在心脏骤停后或在大型外科手术(如心脏手术或消化道手术)后的术后阶段，如果患者出现生命功能衰竭，那么患者被收治进复苏科。

“重症加强护理病房”、“重症加强护理科”或“ICU”指负责治疗危重病况患者，即至少一项生命功能衰竭的患者，或有患严重并发症的风险的患者的科室。重症加强护理病房拥有高度专业的技术手段。多学科团队不断使用这些手段来检测、预防和纠正急性失衡，这些失衡被认为是可逆的并且与潜在疾病(疾病、外科手术、外伤、中毒、烧伤、败血症)相关。

“高依赖病房”或“HDU”是指接收和治疗需要密切监测的病人的医院科室。高依赖病房治疗病况和治疗表明可能发生一种或多种生命功能衰竭的患者，以及从一种或多种生命功能衰竭恢复后(例如在复苏科住院后)，病况过于严重或不稳定无法使他们能够回到常规医院病房的患者。高依赖病房是介于复苏科和常规护理科之间的中间水平。

根据优选的实施方案，本发明在体外或离体的评估方法使得可以评估已被重症加强护理病房收治的患者的并发症的风险。

本发明的评估方法更具体地适合于评估遭受免疫炎症发作的患者的并发症的风险。

“免疫炎症发作”指外伤或伤口，其作用是在患者体内诱发高炎症反应。这种高炎症反应的持续存在会导致获得性免疫抑制，并与抗炎特性相关，并最终导致无法阻止感染。这种现象也称为免疫麻痹，其特征是单核细胞而非B细胞表面主要组织相容性复合物II类分子的表达下调。单核细胞/巨噬细胞功能的抑制减少免疫复合物的释放，对抗原呈递能力产生不利影响，并降低自然杀伤(NK)细胞的功能。这种类型的反应在重症加强护理病房的非免疫抑制患者中很常见(Hotchkiss等人，2013年)。

“免疫炎症发作”特别包括外伤(对于遭受外伤的患者)、烧伤(对于遭受烧伤的患者)、外科手术(对于已经接受外科手术的患者)，或败血症(对于处于败血性状态的患者)。

根据优选的实施方案，本说明书涉及用于在体外或离体评估未接受免疫抑制治疗的患者的并发症的风险的方法，所述患者处于败血性状态，更具体地处于败血性休克，和/或遭受烧伤、更具体地严重烧伤的患者，和/或遭受外伤、更具体地严重外伤的患者，和/或接受外科手术、更具体地大型外科手术的患者。

“败血性状态的患者”或“遭受败血症的患者”指由宿主对感染的不适当反应导致出现至少一种危及生命的器官衰竭的患者。

“败血性休克”指败血症的一种亚型，尽管有足够的血管充盈，但低血压仍持续存在。

“遭受烧伤的患者”指由热烧伤和/或电烧伤和/或化学烧伤和/或辐射烧伤导致皮肤细胞和皮下组织遭到破坏的患者。烧伤可以是浅表的、部分厚度的或全厚度的，并且通常或具体位于例如颈部、面部、眼睛、手、脚、关节或身体的其他部位。

“严重烧伤”或“遭受严重烧伤的患者”指遭受烧伤的身体表面积大于身体总表面积的15％、优选大于20％、优选大于25％、最特别地大于身体总表面积的30％。

“遭受外伤的患者”指直接被重症加强护理病房收治的患者。“遭受严重外伤的患者”指具有大于15、优选大于20并且更优选大于25的损伤严重程度评分(ISS，Baker等人，1974年)的患者。

“接受外科手术的患者”指为了治疗疾病状态(如疾病或伤口)，以帮助或改善身体功能、外观或修复受伤部位而接受侵入性外科手术的患者。

“大型外科手术”或“接受大型外科手术的患者”指技术上困难和/或有出血风险和/或有死亡风险和/或时间长(例如超过3小时，优选超过4小时，例如5小时或6小时，或甚至更长)和/或需要大量的术后护理的外科手术。以非限制性实例的方式，大型外科手术指至少有以下适应症中的一种的外科手术：食管胃切除术、Bricker膀胱切除术(小肠重建的全膀胱切除术)、头侧胰十二指肠切除术(Whipple手术)和/或腹主动脉瘤剖腹手术。

下面描述一些优选实施方案。本说明书不限于这些实施方案，并且可以通过组合上述特征中的一个或多个来实现其他特定实施方案。

因此，本发明人研究了医疗保健机构中患者中的病毒再激活的现象。更具体地，他们测量了来自所述患者在医疗保健机构在他们治疗的不同时间的生物样品中TTV病毒载量的存在和/或变化。

本发明人特别观察到，取决于患者，病毒载量可以随时间变化。特别是，他们令人惊讶地观察到，这种变化表明发生医疗保健相关感染的风险和/或延长治疗持续时间的风险。因此，本发明人开发了一种在体外或离体评估医疗保健机构收治的患者的并发症的风险的方法。

本文描述的方法基于TTV病毒载量的测量。“细环病毒”或“TTV”在本文中是指指环病毒(Anelloviridae)科的病毒。本文所说的TTV是一种无包膜病毒，具有负极性的环状单链DNA基因组。

“TTV基因组”在本文中指所有指环病毒科的所有基因组，特别是在人类中发现的Alphatorquevirus(TTV)、Betatorquevirus(TTMV)和Gammatorquevirus(TTMDV)属的基因组。以实例的方式，本文参考细环病毒原型株TTV-1a的基因组。更具体地，TTV基因组的实例是例如由SEQ ID No 1表示且其Genbank登录号为AB017610的序列。

1997年，使用基因消减方法，在一名患有病因不明的输血后肝炎的日本患者的血清中发现了大约500个碱基对(bp)的病毒序列片段(1-7)。最初被命名为N22的该克隆，当时并未列入病毒序列数据库，以在其中发现该克隆的患者名字的首字母缩写命名为TT病毒(TTV)(Nishizawa等人，1997年)。随后的其他研究表明，TTV基因组由负极性的环状单链DNA组成。这是第一个在人类中分离出的具有环状单链DNA的病毒。使用引物可以扩增该非编码区中的序列，这表明TTV在全球人群中的高流行(约90％)。

TTV产生没有明显相关的临床症状慢性感染。它被称为无致病性病毒或孤儿病毒。因此，许多研究都集中在人类疾病中TTV的参与上，特别是没有确定该病毒的明确作用的某些肝脏疾病。

优选地，TTV基因组具有约3.8kb的大小。TTV的基因组结构和组织是本领域技术人员众所周知的(参见例如Biagini，Curr Top MicrobiolImmunol.331:21-33，2009年)并且以实例的方式在[图1]中示出。

因此，TTV基因组可分为约1至1.2kb的非翻译区(UTR)和约2.6至2.8kb的潜在编码区。编码区特别包含两个大的开放阅读框：ORF1和ORF2，分别编码770和202个残基的两种蛋白质。在SEQ ID No 1代表的TTV基因组中，开放阅读框ORF1和ORF2分别在核苷酸589-2901和107-715之间。TTV基因组可能还有其他开放阅读框。例如，TTV的基因组可能包含两个额外的开放阅读框ORF3和ORF4[图1]。

非翻译区UTR高度保守。它特别包含易于形成二级结构的富含GC的序列。在UTR-5'非翻译区中选择的序列进行扩增可以证明该病毒在整个全球人群中的非常高的流行(Hu等人，J Clin Microbiol.43(8):3747-3754，2005年)。该区域特别包含128bp的序列并且可以使用本领域技术人员已知的方法进行扩增，例如TTV R-诊断试剂盒(bioMérieux，法国)。

“病毒载量”是指生物样品中存在的病毒颗粒的数量。病毒载量反映了病毒感染的严重程度。病毒载量可以通过测量生物样品中病毒成分之一(基因组DNA、mRNA、蛋白质等)的量来确定。

因此，优选地，病毒载量是指生物样品中属于所述病毒的核酸序列的比例。更优选地，病毒载量代表生物样品中所述病毒的基因组的拷贝。

在本文情况中，病毒载量代表TTV载量。“TTV载量”在本文中更具体地对应于TTV病毒载量，即生物样品中存在的TTV病毒颗粒的数量。患者中的TTV载量指所述患者所承载的任何TTV的病毒载量。TTV载量可以通过测量该生物样品中TTV成分的量来确定。

优选地，TTV载量对应于生物样品中存在的TTV核酸序列的量。因此，根据本发明的方案确定患者中的TTV载量包括估计来自所述患者的生物样品中所有TTV的序列数。具体地，根据本发明的方法，没有对所述生物样品中待测量的特定TTV毒株的选择。事实上，高TTV病毒载量的检测，特别是TTV载量变化的检测与并发症增加的风险、特别是与医疗保健相关感染发生的风险，独立地与指环病毒科毒株或检测的毒株相关。

优选地，TTV载量的测定包括活性和/或非活性病毒拷贝的测定。它由测定循环的量、整合或潜伏病毒的拷贝组成。

特别地，可以通过预先测定TTV检测限来测定TTV病毒拷贝。

“检测限”或“LOD”指使用病毒标准品可以与未检测到(空白值)基因组区分开的基因组的最小拷贝。接下来，通过从标准曲线外推，可以确定按照在反应管中每μl的病毒DNA拷贝的病毒载量，然后确定按照所述样品中每ml的病毒DNA拷贝的病毒载量。

在本说明书的上下文中，生物样品中的病毒载量大于每ml生物样品7000拷贝，例如血液或其衍生物(如血浆和/或血清)，优选大于每ml血浆10000拷贝，优选大于每ml生物样品20000拷贝，更优选大于每ml生物样品40000拷贝，这被认为是高TTV病毒载量。

因此，TTV水平以及TTV载量可以使用本领域技术人员众所周知的方法通过测量TTV DNA、TTV RNA或TTV蛋白质的水平来确定。因此，根据本发明的方法可以包括，在从患者中获取样品和如下定义的步骤a)之间的另一个预备步骤，其对应于将生物样品转化成双链DNA样品，或转化成mRNA(或相应的cDNA)样品，或转化成蛋白质样品，然后准备用于如下文定义的步骤a)中TTV病毒载量的体外测量。

从细胞样品中制备或提取病毒双链DNA、mRNA(以及其反转录得到cDNA)或蛋白质，仅仅是本领域技术人员已知的常规程序。

双链DNA可以对应于TTV的整个基因组，或仅对应于其一部分。一旦获得双链DNA、mRNA(或相应的cDNA)或随时可用的蛋白质样品，就可以根据样品或转化的类型，使用基因组DNA(即基于由至少一部分TTV基因组组成的至少一种序列的存在)或使用mRNA(即基于样品中TTV mRNA的含量)或使用蛋白质(即基于样品中TTV蛋白质的含量)，进行TTV的检测。

TTV水平优选通过测量TTV核酸、更优选TTV DNA的水平来测定。

检测生物样品中核酸的方法是本领域技术人员众所周知的，尤其包括扩增、优选通过PCR扩增、更优选通过实时PCR扩增，测序和与标记探针杂交。

因此，本说明书有利地涉及用于在体外或离体评估未接受免疫抑制治疗且已被医疗保健机构收治的患者的并发症的风险的方法，包括测量来自所述患者的生物样品中至少一种细环病毒(TTV)的病毒载量，所述病毒载量通过至少一种TTV序列的扩增、测序或杂交来测量，优选通过扩增、更优选通过实时PCR来测量。

根据第一个实施方案，TTV载量通过TTV序列的扩增来测定。

根据该实施方案，优选的方法在于扩增已知对TTV基因组特异的序列，并且特别优选地扩增如先前所定义的TTV的非翻译区UTR的至少一种序列。

“对TTV基因组特异的序列”在本文中指在大多数已知TTV中存在，但在大多数其他病毒中、特别是在大多数其他指环病毒中不存在的序列。优选地，TTV特异性序列在至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的已知TTV基因组中存在。更优选地，它在100％的已知TTV基因组中存在。或者，TTV特异性序列在小于10％、小于5％、小于4％、小于3％、小于2％、小于1％的除TTV之外的指环病毒已知基因组中存在。优选地，TTV特异性序列在除TTV之外的所有已知指环病毒基因组中不存在。特别优选地，这样的序列是例如包含在非翻译区UTR中的序列，其从一个TTV到另一个TTV是高度保守的。更具体地，这样的序列可以对应于5'-UTR非翻译区的128bp序列，其可以根据本领域技术人员已知的方法进行扩增，例如使用TTV R-诊断试剂盒(bioMérieux，法国)。

因此，根据该实施方案，本文描述的方法包括使用引物和探针来扩增已知TTV基因组的特异的序列。按照本技术领域的惯例，这些引物优选是寡核苷酸。例如，这些引物可以包含少于30个核苷酸、少于25个核苷酸、少于20个核苷酸、少于15个核苷酸、少于12个核苷酸。或者，这些引物包含至少12、15、20、25或30个核苷酸。优选地，所使用的引物包含12至20个核苷酸、12至25个核苷酸、15至20个核苷酸或15至25个核苷酸。本领域技术人员知道如何确定用于扩增TTV特异性序列的引物的长度和序列。例如，他们可以使用与TTV R-诊断试剂盒(参考423414和69-030B，bioMérieux,法国)中提供的相同的引物。

扩增技术特别包括等温技术和基于PCR(聚合酶链式反应)的技术。等温扩增方法涵盖了大量的方法。最常用于检测病原体的是LAMP(环介导扩增)和RPA(重组酶聚合酶扩增)方法。等温扩增方法还包括例如NASBA(依赖核酸序列的扩增)、HAD(解旋酶依赖性扩增)、RCA(滚环扩增)和SDA(链置换扩增)、EXPAR(指数扩增反应)、ICAN(等温和嵌合引物起始的核酸扩增)、SMART(信号介导的RNA扩增技术)等(参见例如Asiello et Baeumner,LabChip11(8):1420-1430,2011年)。

优选地，所使用的PCR技术定量测量DNA、cDNA或RNA的初始量。可用于本文描述的方法中的基于PCR的技术的实例包括但不限于诸如实时PCR(Q-PCR)、逆转录PCR(RT-PCR)、多重逆转录PCR、实时逆转录PCR(QRT-PCR)和数字PCR。这些技术对于本领域技术人员来说是众所周知的并且容易获得的技术。

优选地，使用实时定量PCR测定TTV载量。本领域已经描述了多种用于检测和定量TTV的方法(参见例如Maggi等人，J Virol.77(4):2418-2425,2003年)。

将特别参考Kulifaj等人描述的方法(J Clin Virol.105:118-127,2018年)。该方法由于其简单性和耐用性而特别有利。它基于非编码UTR区中包含的序列的扩增。该序列存在于所有已知的TTV中，从而使该方法具有非常高的特异性。此外，它特别的通用，可以使用任何类型的PCR平台来实施。使用TTVR-诊断试剂盒(参考423414和69-030B bioMérieux，法国)来实施此方法是特别有利的。

或者，使用数字PCR测定病毒载量。数字PCR涉及对极度稀释的核酸进行多次PCR分析，因此大多数阳性扩增反应来自单个模板分子的信号。因此，数字PCR能够对单个模型分子进行计数。分析的PCR总数中阳性扩增的比例，能够估计原始或未稀释样品中的模板浓度。提出该技术是为了能够检测多种遗传现象(Vogelstein等人，Proc Natl Acad Sci USA96:9236-924，1999年)。数字PCR与实时PCR一样，有可能区分样品之间靶序列中非常小的定量差异。

根据另一个实施方案，TTV DNA水平通过测序来测量。本文所用的术语“测序”具有其最广泛接受的含义，并且是指本领域技术人员已知的能够测定多核苷酸分子(DNA或RNA)的序列，即测定组成该分子的核苷酸序列的任何技术。

因此可以通过本领域已知的任何技术对TTV DNA进行测序。本文中所指的测序尤其包括桑格测序、全基因组测序、杂交测序、焦磷酸测序(特别是454测序、Solexa基因组分析仪测序)、使用毛细管电泳测序、循环测序、单碱基延伸测序、固相测序、高通量测序、大规模平行测序(MPSS)、可逆染料终止子测序、配对测序、短读测序、核酸外切酶测序、连接法测序、单分子测序、合成测序、电子显微镜测序、实时测序、反向终止测序、纳米孔测序、可逆终止子测序、半导体测序、SOLiD(R)测序、SMRT(单分子实时分析)测序、MS-PET测序、质谱分析及其组合。特定实施方案使用高通量DNA测序，例如通过Ilumina开发的平台MiSeq、NextSeq500和HiSeq系列(Reuter等人，Mol Cell,58:586-597,2015年；Bentley等人Nature:456:53-59,2008年)、454基因组测序仪和Roche(Margulies等人Nature；437:376-380,2005年)、Applied Biosystems的SOLiD平台(McKernan等人，Genome Res；19:1527-1541,2009年)、Polanator平台(Shendure等人，Science,309:1728-1732)或Helicos单分子测序平台(Harris等人，Science；320:106-109,2008年)。高通量测序还包括诸如SMRT实时测序(Roads等人，Genomics,Proteomics&Bioinformatics,13(5):278-289,2015年)、IonTorrent测序(WO 2010/008480；Rothberg等人，Nature,475；348-352,2011年)和纳米孔测序(Clarke J等人Nat Nanotechnol:4:265-270,2009年)的方法。

对生物样品中包含的全部DNA或生物样品中包含的部分DNA进行测序。对于本领域技术人员来说立即显而易见的是，所述样品包含至少TTV DNA和宿主受试者DNA的混合物。此外，TTV DNA可能仅代表样品中总DNA的一小部分。有利地，在测序之前通常使用物理方法将DNA随机片段化。

第一种方法在于对TTV物种基因组的特定序列进行测序。另一种方法在于使用能够以高精度对从生物样品获得的核酸进行定量基因分型的方法。在特定实施方案中，使用基于靶序列(即，在这种情况下，TTV序列)的先验知识的方案，通过分析大量(例如，数百万或数十亿)核酸分子而不进行任何扩增，来获得精度。

在一个优选的实施方案中，本发明的方法包括量化读数的步骤。

在一个具体实施方案中，对来自生物样品的核酸分子的随机子集进行高通量测序。优选地，通过与公开保藏的TTV序列比较，在全部测序数据中识别TTV序列。这种比较有利地基于与已知TTV序列的序列同一性水平，并且使得可以检测甚至相差很大的变体。目前可用的软件如BLAST可用于确定序列之间的同一性水平。

因此，与已知TTV序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的序列被识别为TTV序列。根据该实施方案，因此，TTV载量的测定包括对通过来自受试者的生物样品中的测序识别出的TTV序列进行编号。

在另一个实施方案中，TTV载量通过测量生物样品中病毒蛋白的量来测定。因此可以使用特异性抗体，特别是众所周知的技术，如免疫沉淀、免疫组织学、蛋白质印迹、斑点印迹、ELISA或ELISPOR、电化学发光(ECLIA)、蛋白质芯片、抗体芯片或与免疫组织化学联用的组织芯片。可以使用的其他技术包括FRET或BRET技术、显微术或组织化学法，特别包括共焦显微术和电子显微术、基于使用一种或多种激发波长的方法和合适的光学方法，如电化学方法(伏安法和安培滴定法技术)、原子力显微镜和射频方法如多极共振光谱、共焦和非共焦，检测荧光、发冷光、化学发光、吸光度、反射率、透射率和双折射或折射率(例如表面等离子体共振、椭圆光度法、共振镜法等)，流式细胞术、放射性同位素或磁共振成像、聚丙烯酰胺凝胶电泳分析(SDS-PAGE)、质谱和液相色谱与质谱联用(LC-MS/MS)。所有这些技术对于本领域技术人员来说都是众所周知的，并且在本文中没有必要对其进行详细描述。此外，TTV蛋白特异性抗体已经是可获得的。

在一个优选的实施方案中，本文描述的方法包括标准化所测量的病毒核酸或蛋白质的量的附加步骤。

根据优选的实施方案，将TTV水平，即生物样品中存在的TTV DNA、TTV RNA或TTV蛋白质的量标准化为该样品特定参数可能是有利的。

将测量的TTV载量标准化为特定参数可以降低比较两种不同生物样品的病毒载量期间的错误率。可用于该标准化的参数的实例可以是与样品的含量无关的物理参数，例如所述样品的体积。还可以将TTV DNA、TTV RNA或TTV蛋白质的量标准化为样品中存在的DNA、RNA或蛋白质的总量。或者，可以使用特定的DNA或RNA序列或特定的蛋白质作为标准化工具。例如，该序列或该蛋白质可以是人类序列或蛋白质。

或者，将给定样品中TTV DNA或RNA或TTV蛋白质的量与内部对照进行比较。

为此，可以将生物样品中测量的TTV核酸或蛋白质的量与可以识别和定量的合适核酸或蛋白质的确定的量相关联，例如宿主或外源核酸或蛋白质。优选地，这种可识别和可定量的核酸或蛋白质像靶核酸或蛋白质一样被处理(例如扩增、测序等)。

因此，可以从一开始将这种可识别和可定量的核酸或蛋白质的已知量添加到样品中，随后将像靶核酸或蛋白质一样进行处理，并在测量该病毒核酸或蛋白质的量之前进行所有样品制备步骤。制备步骤可以包括保护病毒核酸和破坏宿主核酸的方法，例如使用不同的核酸酶。

或者，这些步骤可以包括保护病毒蛋白和破坏宿主蛋白的方法，例如使用不同的蛋白酶。内部对照可以评估样品中相关分子(核酸或蛋白质)的处理(例如扩增或测序)的质量和程度。优选地，所述内部对照是具有已知序列的核酸分子，该核酸分子以已知浓度存在于样品中。更优选地，该核酸分子是样品中序列和浓度已知的病毒的环状单链基因组DNA分子。这种已知的病毒可以是例如圆环病毒科的病毒。样品中序列的量与对照的比率使得可以估计已知序列和浓度的TTV基因组的绝对数。或者，该内部对照是已知序列的蛋白质，其以已知浓度存在于样品中。

一旦通过测量所测定的TTV核酸或蛋白质的量来确定TTV载量，后者任选地被标准化，则将其与预定参考TTV载量进行比较可能是有利的。

根据该优选的实施方案，本说明书涉及一种用于在体外或离体评估未接受免疫抑制治疗且已被医疗保健机构收治的患者的并发症风险的方法，该方法包括执行由以下组成的步骤：

a)测量来自所述患者的生物样品中至少一种TTV的病毒载量，

出于本申请的目的，“参考TTV载量”或“参考病毒载量”指用作参考的任何TTV载量。

这意味着参考TTV载量对应于“TTV核酸(或蛋白质)的参考水平”或“TTV核酸(或蛋白质)的对照水平”，即对应于用作参考的TTV核酸(或蛋白质)的浓度。

“TTV核酸(或蛋白质)的参考浓度”在本文中意指在对照样品中测量的基础水平，该对照样品与测试样品相当并且从出现特定外伤和/或传染性病况的受试者或一组受试者获得。这可以例如是健康的或未出现特定外伤和/或感染的受试者或一组受试者。这也可以是被医疗保健机构、特别是重症加强护理病房收治的患者或一组患者，特别是遭受免疫炎症发作的患者或一组患者，例如患有以下疾病的患者或一组患者：患有败血症、遭受烧伤、外伤和/或已经接受外科手术的人。最后，这可以是已经接受外科手术的同一个人，例如在所述外科手术之前或之后。参考水平可以通过多种方法来确定。例如，对照可以是可以是各种形式的预定值。它可以是单个阈值，例如中值或平均值。“参考水平”可以是也适用于每个患者的单个值。或者，参考水平可以根据患者的特定亚群而变化。因此，例如，老年男性的TTV载量可能与年轻男性有不同的参考水平，以及女性的病毒载量可能与男性有不同的参考水平。此外，“参考水平”可以基于比较组来建立，如不具有高水平TTV核酸(或蛋白质)的组和具有高水平TTV核酸(或蛋白质)的组。比较组的另一个实例是患有特定疾病、病况或症状的组以及无病组。例如，当测试人群被均匀地(或不均匀地)分成组，如低风险组、中风险组和高风险组时，可以定义预定值。

还可以通过比较患有疾病或接受治疗导致免疫抑制状态的患者群体中的TTV核酸(或蛋白质)水平来确定参考水平。这可以例如通过直方图分析来完成，其中以图表的形式呈现整个受试者群组，其中第一轴代表所述TTV核酸(或蛋白质)的水平，第二轴代表以给定水平表达TTV核酸(或蛋白质)的患者组中的患者的数量。可以通过鉴定具有相同或相似TTV核酸(或蛋白质)水平的群体亚群来确定两个或多个离散的受试者组。然后可以基于最能区分这些离散组之间的水平来确定参考水平。参考水平还可以代表存在的两种或更多种TTV核酸(或蛋白质)的水平。两个或更多个标志物可以例如通过每个标志物的水平的值的比率来表示。

类似地，看起来健康状况良好的群体将具有与已知患有与高浓度的所述TTV核酸(或蛋白质)相关的病况的群体不同的“正常”范围。因此，所选择的预定值可以考虑个体所属的类别。本领域技术人员可以通过常规实验简单地选择合适的范围和类别。“高”和“增加”意味着高于所选对照。一般来说，对照将基于看起来健康状况良好且在适当年龄范围内的正常个体。

在一个优选的实施方案中，参考浓度对应于一般群体中TTV核酸(或蛋白质)或TTV核酸(或蛋白质)的组合的浓度。

还应当理解，除了预定值之外，本文描述的方法中的对照可以是与测试样品平行测量的生物样品。根据该实施方案，参考水平将是来自健康状况良好的受试者的样品中的TTV核酸(或蛋白质)的水平。

优选地，TTV核酸(或蛋白质)的参考浓度是该TTV核酸(或蛋白质)在健康状况良好的受试者中或在健康状况良好的受试者群体中的浓度。

根据另一个优选的实施方案，TTV核酸(或蛋白质)的参考浓度是遭受免疫炎症发作的患者或遭受免疫炎症发作的一组患者中的该TTV核酸(或蛋白质)的浓度。

根据另一个优选的实施方案，TTV核酸(或蛋白质)的参考浓度是患有败血症的患者或患有败血症的一组患者中该TTV核酸(或蛋白质)的浓度。

根据另一个优选的实施方案，TTV核酸(或蛋白质)的参考浓度是遭受烧伤的患者或遭受烧伤的一组患者中该TTV核酸(或蛋白质)的浓度。

根据另一个优选的实施方案，TTV核酸(或蛋白质)的参考浓度是遭受外伤的患者或遭受外伤的一组患者中该TTV核酸(或蛋白质)的浓度。

根据另一个优选的实施方案，TTV核酸(或蛋白质)的参考浓度是已经接受外科手术的患者或已经接受外科手术的一组患者中该TTV核酸(或蛋白质)的浓度。

根据另一个优选的实施方案，TTV核酸(或蛋白质)的参考浓度是在特定时间点(例如所述外科手术之前或之后)已经接受所述外科手术的同一个体中该TTV核酸(或蛋白质)的浓度。

通过将来自所述患者的生物样品中的TTV病毒载量与预定参考值进行比较，则可以确定所述患者的并发症的风险。

根据具体实施方案，预定参考值对应于来自患者的生物样品(例如血液或其衍生物，如血浆和/或血清)中大于每ml生物样品7000拷贝的病毒载量，例如大于每ml生物样品10000拷贝、20000拷贝或者40000拷贝。根据该特定实施方案，患者中大于预定参考值的TTV病毒载量与患者病况的严重程度相关，并且还可以与并发症风险增加相关，特别是与医疗保健相关感染发生风险增加相关。

根据该特定实施方案的变型，预定参考值对应于每ml生物样品10000拷贝的TTV病毒载量。因此，根据该变型，当在来自患者的生物样品中测定的TTV病毒载量大于所述预定参考值时，确定存在并发症增加的风险。相反，当在来自患者的生物样品中测定的TTV病毒载量小于所述预定参考值时，确定不存在并发症增加的风险。

与健康状况良好的个体或一组个体相比，患者中更大的TTV载量可能是所述患者中并发症风险增加的指示。

本文在一些实施方案中使用的术语“大于”是指更大的量，例如稍微大于原始或参考量的量，或例如大大超过原始或参考量的量，并且特别是范围中的所有量。作为变体，“增加”可以指比增加的量或活性进行比较的量或活性多至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的量或活性。

本文在一些实施方案中使用的术语“小于”是指更小的量，例如稍微小于原始或参考量的量，或例如比原始或参考量小得多的量，并且特别是范围中的所有量。作为变体，“减少”可以指比减少的量或活性进行比较的量或活性少至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的量或活性。

有利地，还可以使用同一患者在第二时间点的至少一种TTV的病毒载量作为参考TTV病毒载量。

根据一个优选的实施方案，本说明书涉及一种用于在体外或离体评估未接受免疫抑制治疗且已被医疗保健机构收治的患者的并发症的风险的方法，该方法包括执行由以下组成的步骤：

a)测量来自所述患者在时间T1时采集的第一样品的所述生物样品中至少一种TTV的第一病毒载量，

b)测量来自所述患者在时间T2时采集的第二样品的所述生物样品中至少一种TTV的第二病毒载量，

d)由比较的结果确定有关并发症的风险的结论。

令人惊讶的是，本发明人已经确定，患者留在医疗机构期间TTV病毒载量的变化，即TTV病毒载量根据下面定义的值的增加或减少，与所述患者的并发症风险的增加相关，特别是医疗保健相关感染发生风险的增加。

因此，该方法对于随着时间的推移，评估和监测医疗保健机构收治的患者的并发症的风险特别有用。在一个优选的实施方案中，步骤a)中的第一样品在选自以下的时间Tl采集：入院当天、第1天、第2天、第3天、第4天、第5天、第6天和第7天，应当理解，第1天对应于入院之后的一天和/或对应于所述患者遭受免疫炎症发作之后的一天。

在一个具体的实施方案中，当所述患者是被医疗保健机构收治进行外科手术、更具体地进行大型外科手术时，步骤a)中的第一样品可以在外科手术时采集，即就在外科手术之前、之后和/或过程中。

在一个优选的实施方案中，步骤b)中的第二样品在时间T2采集，该第二时间晚于步骤a)的第一时间T1。优选地，第二样品在第8天和第31天之间、更优选在第14天和第31天之间采集。因此，时间T2优选选自：第14天、第15天、第16天、第17天、第18天、第19天、第20天、第21天、第22天、第23天、第24天、第25天、第26天、第27天、第28天、第29天、第30天和第31天。

在另一个实施方案中，第二样品在第31天之后采集，例如在所述患者收治进医疗保健机构后至少40天、60天、90天、100天、120天、150天、180天、210天、240天、270天、300天、330天、360天。

在一些实施方案中，还测量在时间T1和T2之间的不同时间采集的多个样品的TTV病毒载量。具体地，还测量在时间T1和T2之间的不同时间的至少1个样品、优选至少2个样品、优选至少3个样品，优选至少4个样品，优选至少5个样品，例如6、7或8个样品的TTV病毒载量。

根据一些实施方案，时间T1时的TTV病毒载量对应于在来自所述患者的多个生物样品中测量的病毒载量的平均值或中值，该生物样品在入院当天和/或免疫炎症发作当天和第7天之间采集。优选地，时间T1时的TTV病毒载量对应于在来自所述患者的至少两个、优选至少三个、优选至少四个生物样品中测量的病毒载量的平均值或中值，该生物样品在入院当天和/或免疫炎症发作当天和第7天之间采集。以非限制性实例的方式，时间Tl时的TTV病毒载量可以对应于在来自所述患者的生物样品中测量的病毒载量的平均值或中值，该生物样品在第1天或第2天以及第3天或第4天和第5、6或7天采集。

根据一些实施方案，时间T2时的TTV病毒载量对应于在来自所述患者的多个生物样品中测量的病毒载量的平均值或中值，该生物样品在入院后和/或免疫炎症发作后第8天和第31天之间采集。优选地，时间T2时的TTV病毒载量对应于在来自所述患者的至少两个、优选至少三个、优选至少四个生物样品中测量的病毒载量的平均值或中值，该生物样品在入院后和/或免疫炎症发作后第8天和第31天之间采集。以非限制性实例的方式，时间T2时的TTV病毒载量可以对应于在来自所述患者的生物样品中测量的病毒载量的平均值或中值，该生物样品在第14天、或第13天和第18天之间的任何一天、和第28天、或第26天和第36天之间的任何一天采集的。

有利地，然后可以在步骤c)中计算对应于在时间T2时的TTV病毒载量和时间T1时的病毒载量之间的变化ΔTTV值，即：

ΔTTV＝(时间T2时的TTV病毒载量)–(时间T1时的TTV病毒载量)

基于时间T1时的TTV病毒载量和时间T2时的TTV病毒载量，本领域技术人员能够计算由这两个测量值限定的线的梯度。因此ΔTTV对应于时间T1和T2之间的梯度值。

根据本说明书，如果ΔTTV值在从-1.25至+1.25的范围内、优选在从-1.20至+1.20的范围内、优选在从-1.15至+1.15的范围内、优选在从-1.10至+1.10的范围内，则时间T1和T2之间的TTV病毒载量将优选地被认为是稳定的。例如，病毒载量的稳定性可对应于在T1和T2时多个样品的病毒载量的中值之间测量的从-1.25至+1.25范围内的梯度。

另外，如果ΔTTV值大于+1.25、优选大于+1.35、优选大于+1.40、优选大于+1.45和更优选还大于+1.50，则时间T1和T2之间的TTV病毒载量将被认为已经增加。

另外，如果ΔTTV值小于-1.25、优选小于-1.35、优选小于-1.40、优选小于-1.45和更优选还小于-1.50，则时间T1和T2之间的TTV病毒载量将被认为已经减少。

因此，如果时间T1和T2之间的TTV病毒载量变化(ΔTTV)在从-1.25至+1.25的范围内，则可以在步骤d)中得出结论，患者发生医疗保健相关感染的风险并未增加。

相反，如果时间T1和T2之间的TTV病毒载量变化(ΔTTV)不在从-1.25至+1.25的范围内，则可以在步骤d)中得出结论，患者发生医疗保健相关的感染的风险增加。

因此，在一个优选的实施方案中，根据本说明书的方法包括执行由以下组成的步骤：

根据一个特别有利的实施方案，本说明书涉及一种用于在体外或离体评估未接受免疫抑制治疗且已被医疗保健机构收治的患者的并发症的风险的方法，包括测量来自所述患者的生物样品中至少一种细环病毒(TTV)的病毒载量，并且进一步包括检测来自所述患者的所述生物样品中至少一种疱疹病毒(HPV)的存在。

事实上，发明人的功劳是确定在来自患者的生物样品中合并检测到TTV的高病毒载量和至少一种HPV，特别是在患者被重症加强护理病房收治后的第一周内，表明所述患者患并发症的风险增加，特别是患医疗保健相关感染的风险增加。TTV/HPV的早期病毒血症(早在入院后第一周)与第一个月内患HAI的风险增加之间的联系也特别令人惊讶。

本文使用的术语“确定至少一种疱疹病毒的存在”或“检测至少一种疱疹病毒”涵盖定性和/或定量检测。在各种实施方案中，通过检测HPV核酸、更优选HPV DNA水平来检测HPV。

根据本说明书，如果在来自所述患者的至少一种生物样品中检测到来自至少一种HPV毒株的至少一种蛋白质、更优选来自至少一种HPV毒株的至少一种抗原，则确定疱疹病毒存在或被检测到。

优选地，如果在来自所述患者的至少一份生物样品中检测到来自至少一种HPV毒株的至少一种核酸，更优选来自至少一种HPV毒株的至少一种DNA，则确定疱疹病毒存在或被检测到。在这种情况下，参考阳性病毒血症或阳性DNAemia。

在本文中“病毒血症”是指生物样品中给定病毒的病毒颗粒含量或病毒载量。当在所述生物样品中检测到的给定病毒的病毒颗粒数量大于预定阈值(LOD)时，病毒血症为阳性。相反，当在所述生物样品中未检测到所述病毒颗粒时，病毒血症为阴性。

“DNAemia”是指在生物样品中，特别是在血浆、全血和/或从外周血中分离的白细胞和/或血沉棕黄层样品(离心后血液样品中未凝固的级分，其中含有大部分白细胞和血小板)中检测到病毒DNA。有多种技术可用于检测DNAemia，特别是基于PCR、杂交捕获和支链DNA分析的技术。当在所述生物样品中检测到来自所研究的病毒的DNA时，DNAemia呈阳性。相反，当在所述生物样品中未检测到所述病毒DNA时，DNAemia为阴性。“病毒血症事件”是指在研究期间至少一次检测到给定病毒，特别是在研究期间在来自患者的至少一份生物样品中检测到给定病毒的阳性DNAemia。

根据该优选实施方案，当来自所述患者的生物样品(例如血液或其衍生物，如血浆和/或血清)中的TTV病毒载量大于每ml生物样品7000拷贝，优选大于每ml生物样品10000拷贝时，并且当还检测到疱疹病毒的存在时，未接受免疫抑制治疗的患者患并发症的风险增加。

因此，根据该优选的实施方案，该方法可包括执行由以下组成的步骤：

a)测量来自所述患者的生物样品中至少一种TTV的病毒载量，

b)将测定的所述生物样品的病毒载量与10000拷贝/ml的预定参考值进行比较，

c)测定至少一种疱疹病毒的存在，优选通过测量DNAemia，和

d)当对所述样品测定的所述病毒载量大于预定参考值并且当至少一种疱疹病毒存在时，确定存在增加的并发症风险。

根据另一个优选的实施方案，本说明书涉及一种用于在体外或离体评估未接受免疫抑制治疗且已被医疗保健机构收治的患者的并发症的风险的方法，包括测量来自所述患者的生物样品中至少一种细环病毒(TTV)的病毒载量，并且进一步包括测量来自患者的所述生物样品中的至少一种疱疹病毒的病毒载量。

在目前的情况下，“至少一种HPV的病毒载量”或“至少一种HPV的载量”对应于至少一种HPV毒株的病毒载量，即生物样品中存在的至少一种HPV毒株的病毒颗粒的数量。

患者中至少一种HPV的载量指所述患者所携带的至少一种HPV毒株的病毒载量。HPV载量可以通过测量该生物样品中至少一种HPV毒株的组分(如核酸或蛋白质)的量来确定。优选地，HPV载量对应于生物样品中存在的给定HPV毒株的核酸序列的量。

因此，根据本发明，可以区分所述生物样品中待测量的不同特定HPV毒株。优选地，HPV载量的测定包括活性和/或非活性病毒拷贝数的测定。它包括测定循环、整合或潜伏病毒的拷贝数。

用于检测和/或测量生物样品中HPV核酸的病毒载量的方法与先前对TTV描述的方法相同，并且尤其包括扩增、优选通过PCR扩增、更优选通过实时PCR扩增，测序，与标记探针杂交以及本领域技术人员已知的所有其他方法。

疱疹病毒(Herpesviridae或HpV)是本领域技术人员众所周知的。它们是DNA病毒科，影响各种动物物种，包括鸟类、鱼类、爬行动物、两栖动物和哺乳动物，包括人类。HpV科的所有成员有一个共同的结构：相对较大的、单组分的、双链、线性DNA，编码100至200个基因，包裹在称为衣壳的二十面体蛋白质笼内，其本身包裹在称为被膜的蛋白质层中，含有病毒蛋白质和病毒mRNA以及称为包膜的脂质双层膜。所有HpV都可以进行核复制；病毒DNA在被感染细胞的细胞核内转录为mRNA，并可以无限期地以潜伏形式保留。

已知有九种类型的HpV主要感染人类。至少有五种在人类中极其普遍：单纯疱疹1型和2型(HSV-1和HSV-2，也称为HHV-1和HHV-2)，两者均可引起口唇和生殖器疱疹；水痘带状疱疹(或HHV-3)，水痘和带状疱疹的病因；Epstein-Barr病毒(EBV或HHV-4)与多种疾病有关，包括单核细胞增多症和一些癌症；和人巨细胞病毒(HCMV或CMV或HHV-5)。

超过90％的成年人感染过至少其中一种病毒，并且几乎所有被感染的人体内都残留有该病毒的潜伏形式。不太常见的人类疱疹病毒是人类疱疹病毒6A和6B型(HHV-6A和HHV-6B，统称为HHV-6)、人类疱疹病毒7型(HHV-7)和Kaposi肉瘤相关疱疹病毒(KSHV，也称为HHV-8)。

在本文中“疱疹病毒”或“HPV”或“HHV”(人类疱疹病毒)是指疱疹病毒科的病毒。“HPV基因组”在此指所有疱疹病毒科的基因组，包括HSV-1、HSV-2、HHV-3、EBV、CMV、HHV-6、HHV-7和KSHV型的基因组，并且更具体地包括CMV、EBV、HHV6和HSV-1型的基因组。

根据优选的实施方案，所述至少一种疱疹病毒选自由以下组成的组：CMV、EBV、HHV6和HSV-1。优选地，疱疹病毒是EBV。以实例的方式，此处参考CMV AD169、EBV B-95、HSV195和HHV6 Z29型疱疹病毒株的基因组。以非限制性实例的方式，CMV AD169的基因组可以是其序列在Genbank登录号X17403.1下引用的基因组。类似地，EBV B-95的基因组可以是其序列在Genbank登录号V01555.2下引用的基因组。HHV6 Z29的示例基因组可以是其序列在Genbank登录号X83413.2下引用的基因组。

优选地，使用实时定量PCR确定至少一种HPV的存在，和/或测量HPV病毒载量。本领域已经描述了多种用于检测和定量HPV的方法(参见例如Walton等人，Plos ONE 9(6):e98819,2014年)。将特别参考Mallet等人描述的方法(Intensive Care Medicine Exp.(2019年)7:28)，更具体地在该文的表S1中，在本文图6和图7中再现。该方法由于其简单性和耐用性而特别有利；也可以使用任何类型的PCR平台来实施。它基于特定于每种疱疹病毒的基因的扩增，即编码CMV结构蛋白的ppUL83、编码EBV胸苷激酶的基因BXLF1、编码HSV-1糖蛋白的基因US7和编码HHV6衣壳蛋白的基因U57。使用R-诊断试剂盒(CMV R-Ref.69-003B、EBV R-/>Ref.：69-002B、HSV1 HSV2VZV R-/>Ref.：69-004B和HVV6R-/>Ref.：69-100B，bioMérieux，法国)来实施该方法是特别有利的。

在一个优选的实施方案中，本文描述的方法包括标准化所测量的HPV核酸的量的附加步骤。为此，本领域技术人员可以参考上述关于标准化TTV水平的方法和实施方案。这些方法可以很容易地适应于HPV核酸的量的标准化。

一旦通过测量HPV核酸的量确定了至少一种HPV的载量，前者任选地被标准化，将其与参考HPV载量进行比较可能是有利的。为此，本领域技术人员可以参考上述关于与TTV参考水平比较的方法和实施方案。这些方法可以很容易地适应于与参考HPV水平的比较。

治疗疑似有并发症风险的患者的方法

因此，可以使用本文描述的方法来确定患者对并发症、特别是感染的风险的易感性，这使得可以开发和调整针对患者需求的特定治疗。

有利地，特别是为了降低并发症的风险并且特别是发生医疗保健相关感染的风险，如上所述的方法因此在其所有实施方案中可以包括管理式医疗保健的步骤。

被识别为具有发生医疗保健相关感染的增加的风险的患者可以接受适当的管理式医疗保健，其目的是降低发生所述医疗保健相关感染的风险，并且例如降低发生败血症、败血性休克的风险或甚至死亡的风险。

因此，根据另一方面，本发明还涉及一种用于治疗疑似有并发症风险的患者的方法，其特征在于，包括由以下组成的步骤：

-通过实施上述实施方案中的任一个来识别具有并发症的风险的患者，和

-调整在前述步骤中识别的所述患者的医疗保健管理，以降低恶化的风险。

以管理医疗保健的实例的方式，可以提及适合于患者的免疫调节治疗或预防性抗生素治疗，这两种治疗可以结合，和/或转入高依赖性病房或复苏科，以便在测量生物标志物表达后的几天内降低发生医疗保健相关感染的风险，例如降低患败血症、败血性休克的风险或甚至死亡的风险。优选地，如果确定个体具有免疫抑制状态，则免疫调节治疗是免疫刺激治疗，或者如果确定个体具有炎症状态，则是抗炎治疗。

在可选择的免疫刺激治疗中，可以提及的实例有白细胞介素组，特别是IL-7、IL-15或IL-3、生长因子，特别是GM-CSF、干扰素，特别是IFNγ、Toll样受体激动剂，特别是针对免疫检查点的抗体(例如抗PD1、抗PDL1、抗LAG3、抗TIM3、抗IL-10或抗CTLA4抗体)、转铁蛋白和细胞凋亡抑制剂分子、FLT3L、胸腺素α1和肾上腺素能拮抗剂。

在抗炎治疗中，可特别提及糖皮质激素组、细胞抑制剂、作用于免疫亲和素和细胞因子的分子、阻断IL-1受体的分子和抗TNF治疗。用于预防肺炎的合适的预防性抗生素治疗的实例具体描述于Annalesd'Anesthésie et de Réanimation(30；2011；168-190)中。相反，可以将患者快速送往门诊部，例如传染病科，而不是留在具有他们不需要的密切监测的科室中，从而避免发生医疗保健相关感染的风险。

将通过以下实施例更精确地描述本发明。

附图说明

[图1]：TTV分离株基因组结构的示意图。

[图2A]、[图2B]：入院患者队列的特征以及基于TTV病毒滴度、病毒血症动力学和疱疹病毒合并感染的结果(图2A和图2B)。分类变量表示为n(％)，连续变量表示为中值[Q1-Q3]。根据具体情况，定性变量使用卡方检验和定量变量使用Wilcoxon检验，对有关滴度或病毒血症动力学或疱疹病毒合并感染的TTV条件进行比较。带星号的粗体P值表示显著性p<0.05。ICU＝重症加强护理病房，HAI＝ICU内获得的感染，HpV＝疱疹病毒，SOFA＝序贯器官衰竭评估，SAPS＝简化急性生理学评分。a TTV DNAemia低于10000拷贝/ml，b TTV DNAemia大于10000拷贝/ml，c对应于在-1.25/+1.25范围内的梯度(在(D1至D7)和(D14至D28)的病毒滴度中值之间测量)的TTV滴度稳定性，d对应于梯度>+1.5的TTV滴度的增加，e对应于梯度<-1.5的TTV滴度的降低f TTV DNAemia大于10000拷贝/ml且至少一种疱疹病毒，g仅TTVDNAemia大于10000拷贝/ml，h仅疱疹病毒(HpV)。

[图3]：住院的月份期间HAI的发生与病毒血症的存在之间的关联。

[图4]：患者队列入院时的特征和入院后第一个月期间(D1至D28)基于TTVDNAemia大于167拷贝(cp)/ml(LOD)、7000拷贝/ml、10000拷贝/ml和40000拷贝/ml的结果。

[图5]：二元临床结果与TTV表达动力学之间的关联。

[图6]：HpV病毒株参考。

[图7]：测定病毒LOD的PCR条件参考表。

实施例

为了更好地了解被重症加强护理病房收治的患者的病毒再激活现象下潜在的病理生理学，在参与REALISM临床研究(NCT01931956)的患者队列中进行了一项研究。对于这些患者中的每一位，在他们进入重症加强护理病房后的一个月内测量了TTV指环病毒和疱疹病毒CMV、EBV、HHV6、HSV-1的血液DNAemia。预期结果的目的是能够识别这些患者中与病毒再激活现象相关的常见并发症，并确定一种或多种病毒是否可能与特定并发症的发生有关。

材料和方法

研究的群体

对在Edouard Herriot医院(Hospices Civils de Lyon，法国)麻醉科和重症医学科的表现有败血症、严重外伤、严重烧伤或已经接受计划外科手术的重病患者的前瞻性列队进行了一项观察性研究。包含周期为28个月(2015年12月-2018年3月)。该研究方案得到了机构伦理委员会(Comitéde Protection des Personnes Sud-Est II)的批准，编号2015-42-2。该临床研究也在clinicaltrials.gov上注册(NCT02638779)。在加入时，从每位健康志愿者和每位患者处获得了书面知情同意书。当患者无法直接同意时，会从患者的法定代表人处获得知情同意，并尽早与患者再次确认。

加入标准如下：年龄超过18岁的患者，临床诊断出根据2016年SEPSIS-3共识定义(Singer等人，2016年)所定义的败血症、伤害严重程度评分(ISS)>15的严重外伤、总烧伤面积大于30％的严重烧伤，或必须接受大型外科手术(如食管胃切除术、Bricker膀胱切除术、头侧胰十二指肠切除术和/或腹主动脉瘤剖腹手术等)的外科患者。

排除标准如下：存在可能影响患者免疫状态的现存病症或治疗；特别是，接受免疫抑制治疗的患者、怀孕患者、住院患者以及无法获得知情同意的患者被排除在外。

与此同时，前瞻性招募了175名年龄在18至82岁之间的健康志愿者(81名男性和94名女性)。为了考虑年龄和性别对免疫参数可能产生的影响，健康志愿者的分布基于2016年法国关于人口年龄和性别的人口统计数据。

采样和数据收集

对于每位患者，入院后第一周内收集三次样品和临床数据：(1)在第1或第2天(D1-2)、(2)在第3或第4天(D3-4)，和(3)在第5、第6或第7天(D5-7)，然后在入院后的一个月内再采集两次，(4)在第14天和(5)在第28天。对于健康志愿者，在研究访问期间采集样品并记录临床数据。数据收集在其他地方有详细描述(Venet等人，2021年)。

前瞻性地手动记录患者人口统计学数据、合并症、诊断、严重程度和临床结果。进行为期30天的纵向监测。在每种情况下，从每个患者和每个健康志愿者采集的外周全血在采样后3小时内进行处理。

将血液收集在EDTA管中，用于通过流式细胞术确定血浆病毒DNAemia、免疫表型并测量血浆细胞因子水平，收集在两个肝素管中用于功能测试(增殖、细胞因子产生实验)，最后收集在血液RNA PAXgene管(PreAnalytix，Hilden，德国)中，用于使用EvaGreen或TaqMan探针方法通过实时PCR测量全血中的生物标志物mRNA浓度。

采样后，PAXgene样品在环境温度下稳定至少2小时，然后根据制造商的建议在-80℃下冷冻。

并发症的定义

本研究的上下文中评估的主要并发症是第28天(D28)时的继发感染(医疗保健相关感染-HAI)和D28时的死亡率。评估的其他并发症包括在入住重症加强护理病房(ICU)的时间和住院总时间、每天侵入性医疗设备(气管插管、留置导尿管和中心静脉管)的使用。收集到的有关感染的信息由独立决策委员会进行了检查，其由三名在研究中未参与招募或护理患者的临床医生组成。

该委员会对继发感染(医疗保健相关感染，HAI)诊断的确认是基于欧洲临床微生物学和传染病学会以及美国传染病学会的指南。分析中仅考虑继发感染的第一次发作。

病毒DNAemia的测定

先前已详细描述了用于测定TTV和四种疱疹病毒的病毒DNAemia的半自动过程，集成样品处理和实时定量PCR的标准化程序(Mallet等人，2019年-Intensive Care MedicineExp.7:28)。

简而言之，按照制造商的说明，使用由顺磁性二氧化硅颗粒组成的HTViral TNA化学试剂盒(Promega)和Freedom/>液体处理机器人(TECAN)，从血浆样品中提取病毒DNA。在提取前将PCR对照添加到每个血浆样品中。用于半自动过程的检测限(LOD)预先确定为可以使用病毒标准品与未测出(空白值)区分开的最小量(Mallet,2019年-Intensive Care Medicine Exp.7:28)。

使用包含TTV预定量的血浆样品测定TTV的检测限。首先，将对照血浆样品从10^-1连续稀释至10^-4，每个稀释样品独立提取3次，然后使用定量PCR进行扩增，以测定大致的检测限。其次，将给出阳性信号的最大稀释度再次稀释至1/2和1/4，然后将每个稀释的样品独立提取20次并扩增。使用100％检测的最大稀释的阳性重复作为检测限。

以每ml血浆的拷贝表示的LOD，TTV为167，CMV为100，EBV为33，HHV为166，HSV1为33。在StepOnePlus^TM Real-Time PCR系统(ThermoFisher SCIENTIFIC)上通过R-检测试剂盒，使用用于CMV、EBV、HSV1、HHV6和TTV的TaqMan探针(bioMérieux SA)使用实时PCR扩增病毒DNA。

根据制造商的说明，随机分布在板中的所有核酸样品与定量标准品、灵敏度对照和阴性对照同时扩增。

最后，使用标准曲线，将每个样品的Ct(“循环阈值”)值转换为PCR反应管中病毒DNA的拷贝/μl，然后转换为血浆样品中病毒DNA的拷贝/ml。

统计分析

病毒血症是通过测量每种病毒的DNAemia来测量的，病毒血症事件即DNAemia阳性，其特征是每微升病毒的拷贝数大于预定阈值(大于LOD)。如果在患者被重症加强护理收治后的第一周(第1/2天、第3/4天或第5/7天)检测到患者的至少一个样品，则认为是早期DNAemia阳性。也在D14和D28评估了DNA emia。数据以数字和百分比(定性变量)、中值和25th/75th百分位数(定量变量)的形式呈现。

在适当的情况下，使用卡方检验或Fisher精确检验评估病毒血症事件与临床并发症之间的关联(存活或重症加强护理中获得的细菌感染，如前所述(Mallet等人，2019年-Intensive Care Medicine Exp.7:28))。

使用Wilcoxon符号秩检验评估DNAemia/病毒血症事件与定量免疫标志物(细胞、细胞因子、mRNA)之间的二元关联。最后，使用R软件(版本3.4.4)进行分析，统计显著性定义为错误拒绝5％的零假设的α风险(p<0.05表示显著相关)。

结果

队列的描述

377例重病患者的REALISM队列由以下组成：败血症107例，严重外伤137例，严重烧伤24例，大型外科手术109例。

定量数据(病毒载量)而不是定性数据(DNAemia)可以更好地区分(1)不显著的病毒载量，(2)作为免疫抑制的推定标志物的病毒“再激活”，以及(3)支持需要治疗的真正病毒感染的存在的高病毒载量(Textoris等人，2017年)。

高TTV DNAemia(病毒载量大于10000拷贝/ml)的患者病情更严重，具有更高的严重程度评分和更高的治疗需求(图3)。

虽然TTV病毒载量的增加(p＝0.025)与留在重症加强护理更长的时间显著相关，但TTV病毒载量的增加(p＝0.048)和减少(p＝0.048)，换句话说，TTV病毒载量的变化，与第一个月内在重症加强护理中获得的医疗保健相关感染的发生显著相关(图2A和2B)。

此外，令人惊讶的是，HAI病例在患有TTV的DNAemia阳性和至少一种疱疹病毒的患者中，往往比在仅患有疱疹DNAemia阳性的患者中更常见(图2A和2B)。

重症加强护理病房中的患者住院治疗的第一周和第一个月期间的DNAemia

-第一周期间

在队列中217名患者(58％)中检测到TTV(阳性DNAemia)，略高于健康对照(51％)。在160名(42％)患者中单独检测到TTV，以及在患者中与1种(n＝48，13％)或2种(n＝6，2％)或3种及以上(n＝3，1％)的疱疹病毒合并检测到。

与TTV一起检测到的最常见疱疹病毒是EBV(n＝29，8％)，其次是HHV6(n＝18，5％)、HSV1(n＝12，3％)和CMV(n＝12，3％)。

总体而言，单一病毒(无论是疱疹病毒还是TTV)的DNAemia阳性的患者人数(n＝189)与至少存在两种病毒的DNAemia阳性的患者人数(n＝188)相似。

-第一个月期间

在队列的228名患者(60％)中检测到TTV。151名(40％)患者仅有TTV的DNAemia阳性，而在患有1种(n＝59，16％)或2种(n＝11，3％)或3种及以上(n＝7，2％)疱疹病毒的患者中合并检测到TTV(DNAemia阳性)。所有疱疹病毒均与TTV合并检测到，最常见的合并检测到的是EBV(n＝36，10％)，然后是HSV1(n＝28，7％)、CMV(n＝23，6％)和HHV6(n＝19％,5％)。总体而言，该队列包括的单一病毒感染(DNAemia阳性)患者(n＝187)与合并感染的患者(n＝190)一样多。

患有TTV的患者的比例与遭受败血症、严重外伤和大型外科手术的患者的比例(56％至64％)相似，与在健康志愿者中观察到的51％相比，烧伤患者中的比例(46％)略低。

作为一种趋势，在已经接受外科手术的患者的组中，具有高TTV滴度的患者比例似乎更大，并且严重程度标准与高TTV病毒载量(特别是大于7000拷贝/ml)相关(图4)。

DNAemia与临床并发症的关联

考虑到在28天观察期结束时，至少发生过一次继发性、医疗保健相关感染。

与第一个月不同，入院第一周内每种疱疹病毒的单独检测与医疗相关感染(HAI)的风险没有显著相关性。在第一个月期间，在没有TTV的DNAemia阳性的情况下，单独考虑任何疱疹病毒至少有一次病毒血症发作(DNAemia阳性)的患者中，观察到HAI发生率显著增加。

此外，单独TTV的DNAemia阳性(未检测到疱疹病毒)与HAI发生减少相关(图3)。

还观察到，第一个月内稳定的TTV病毒载量与HAI发生减少有关(图5)。

如果考虑队列的患者在第一个月内的病毒DNAemia，则在那些发生多次病毒血症事件(2种或多种疱疹病毒DNAemia阳性，或TTV和至少一种疱疹病毒DNAemia阳性)的患者中，观察到HAI发生率(44％)高于具有单一病毒DNAemia阳性的患者(22％)或未检测到DNAemia的患者(19％)(卡方检验，p<0.001)。

如果考虑第一周内的病毒DNAemia阳性事件，那些有多次病毒血症事件的患者的HAI发生率(11％)与那些单一病毒DNAemia阳性(9％)或未检测到任何DNAemia的患者的HAI发生率相似(9％)(卡方检验，P＝0.8)。

令人惊讶的是，结果表明，尽早，早在患者入院后第一周，合并检测到高TTV病毒载量(特别是大于10000拷贝/ml样品)和疱疹病毒的DNAemia阳性与发生医疗保健相关感染的风险显著相关(图3)

总之，就病毒血症、疾病组和入院标准而言，(i)遭受败血症的患者中TTV病毒载量随时间变化(增加或降低)的患者比例往往高于其他组，(ii)疱疹病毒DNAemia阳性以及高TTV病毒载量似乎与患者入院时病况的严重程度有关。

就HAI而言，(i)合并检测，优选早在入院第一周，检测到高TTV病毒载量和疱疹病毒DNAemia阳性与HAI更频繁发生的风险相关，并且(ii)稳定的TTV病毒载量与相对较低的HAI发生率相关，这与TTV病毒载量的变化不同，TTV病毒载量的变化也与患者发生HAI的风险相关。

讨论

结果表明可以从高TTV载量中区分不显著的TTV载量。因此，本发明人的功劳特别是，已经鉴定出与重症加强护理的患者的病理生理学特征相关的TTV表达阈值。

简而言之，之前提出的结果，(i)表明早在被重症加强管理收治的第一周，在患者中检测到与疱疹病毒再激活相关的高TTV载量，其与增加的HAI风险相关，并且(ii)早期和高TTV病毒血症与免疫系统受损有关。

TTV的病毒血症随时间的变化不太明显(从第一周的58％到一个月的60％)，TTV病毒血症阳性在单独TTV出现的频率高于在合并检测到TTV和疱疹病毒中的频率(在第一周内测量的42％对15％，在第一个月内测量的40％对20％)。

虽然队列中健康状况良好的男性(Focosi等人，2020年)和移植接受者(Bal等人，2018年)中TTV的流行率较高，但在本研究的群体中没有观察到性别偏差，除了该亚组中大部分男性的TTV病毒载量超过10000拷贝/ml。

TTV和EBV是最常合并检测到的病毒，第一周和第一个月期间分别为8％到10％。

在同一时期，只有TTV载量的变化与发生HAI风险增加显著相关。事实上，即使在高载量下，单独TTV的存在也不足以确定HAI风险的增加。

然而，在入院后第一个月内，有多次病毒血症事件的患者，包括有TTV的DNAemia阳性的患者，HAI发生率(44％)高于有单一病毒血症事件或无病毒血症事件的患者(分别为22％和19％)。因此，完全令人惊讶且出乎意料的是，在入院第一周期间合并检测到高TTV载量和疱疹病毒与第一个月期间HAI事件的发生显著相关。

总之，结果表明，在重症加强护理病房收治的患者中，与HpV联合或不联合的病毒再激活(特别是TTV)，与发生医疗保健相关感染的风险之间存在相关性。

参考文献

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Claims

1.一种用于在体外或离体评估医疗保健机构收治且未接受免疫抑制治疗的患者的并发症的风险的方法，其特征在于，其包括执行由以下组成的步骤：

a)测量来自所述患者的生物样品中至少一种细环病毒(TTV)的病毒载量，

b)将对所述生物样品测定的所述病毒载量与预定参考值进行比较，和

c)当对所述生物样品测定的所述病毒载量大于或小于所述预定参考值时，确定并发症的风险。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述预定参考值为10000拷贝/ml。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，当对所述样品测定的所述病毒载量大于所述参考值时，确定存在增加的并发症风险。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，其还包括检测至少一种疱疹病毒的存在，优选通过测量DNAemia。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，当对所述样品测定的至少一种TTV的所述病毒载量大于10000拷贝/ml并且当存在至少一种疱疹病毒时，确定存在增加的并发症风险。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其特征在于，其包括执行由以下组成的步骤：

c)计算T2时的所述病毒载量与T1时的所述病毒载量之间的变化，给出ΔTTV值，

d)由比较的结果确定有关所述并发症的风险的结论。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，当所述ΔTTV值在从-1.25至+1.25、优选从-1.20至+1.20并且还更优选从-1.10至+1.10的范围内时，得出的结论是不存在增加的并发症风险。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其特征在于，所述并发症的风险是发生医疗保健相关感染(HAI)的风险。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其特征在于，所述生物样品源自被医院收治的患者，优选被急诊科、复苏科、重症加强护理病房或高依赖病房收治。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其特征在于，所述生物样品源自败血症状态、更具体地败血性休克的患者，遭受烧伤、更具体地严重烧伤的患者，遭受外伤，更具体地严重外伤的患者，或已经接受外科手术、更具体地大型外科手术的患者。

11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其特征在于，所述生物样品源自败血症状态、遭受烧伤、遭受外伤或已经接受外科手术的患者，并且已经收治进重症加强护理病房。

12.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于，所述至少一种疱疹病毒选自由以下组成的组：CMV、EBV、HHV6和HSV-1，并且优选为EBV。

13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其特征在于，所述生物样品是来自患者的生物液体，选自由血液或其衍生物，如血浆和/或血清，脑脊液、尿液和支气管肺泡灌洗液组成的组。