CN116802320A - 使用细环病毒(ttv)作为确定t淋巴细胞增殖能力的标志 - Google Patents

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Abstract

本发明的主题是一种用于确定受试者中T淋巴细胞增殖能力的方法，该方法包括以下步骤：a)测量受试者生物样品中的细环(torque teno)病毒载量；和b)基于a)中测量的病毒载量确定T淋巴细胞的增殖能力。

Description

使用细环病毒(TTV)作为确定T淋巴细胞增殖能力的标志
背景技术
免疫系统保护身体免受攻击，例如病原感染、细胞转化和物理或化学损伤。因此，免疫活性个体能够引发针对抗原刺激的保护性免疫反应。
然而，当免疫系统被削弱或完全不存在时，就会显现免疫缺陷。这呈现各种形式，并可能影响先天或适应性免疫系统，或两者都影响，这取决于缺陷的来源。在绝大多数情况下，免疫缺陷是终生获得的。无论是否是感染性的(如HIV感染)，它可能是由病理引起的，也可能是由治疗(如放疗或化疗)诱发的。免疫缺陷状态特别危险，因为患者随后表现出对病原体(如细菌、病毒、寄生虫或真菌)的继发性感染的易感性增加。例如，对移植使用免疫抑制治疗，特别是造血干细胞移植(HSCT)，可能会导致患者复发的或潜在致命的微生物感染。
因此，能够确定受试者免疫系统的功能是很重要的。这使得当识别出免疫缺陷时，尤其有可能调整适当的治疗应答。
各种技术可用于测量免疫活性，但没有一种是完全令人满意的。这些技术除了其他以外还测量对细胞介导的免疫反应，尤其包括淋巴细胞群体的分析，特别是CD4+ T细胞的计数或CD4+/CD8+ T细胞比率的测量，淋巴细胞增殖能力的测量，T细胞细胞毒性活性的测量，抗体反应的测量，四聚体的标记，产生的细胞因子的检测，ELISpot等。
这些技术中的一些，例如T细胞计数，给出的结果不一定反映这些细胞的活性，因此也不一定反映免疫系统的活性。T细胞的绝对数量并不能说明这些细胞的繁殖能力。例如，不能说HSCT后少量的T细胞意味着这些T细胞不能增殖和保护患者免受微生物感染。此外，细胞增殖测试难以常规地实现，并且可能难以标准化。因此，仍然需要一种易于用于确定免疫活性的简单方法。
细环病毒(Torque Teno Virus，TTV)是一种指环病毒科(Anelloviridae)的病毒，最初于1997年在一名患有输血后肝炎的日本患者中鉴定(1-7)。TTV是一种具有小尺寸(约3.8kb)单链环状DNA的病毒，包含具有巨大遗传多样性的编码区和非常保守的非编码区(UTR)。使用引物用来扩增这一非编码区的序列已经证明TTV在全球有很高的患病率(约90％)。TTV引起慢性感染，但没有明显相关的临床表现。它被称为非致病性病毒或孤儿病毒。因此，许多研究涉及了TTV在人类病理学中的参与作用，特别是在某些肝病病理学中的作用，但还没有确定该病毒的明确作用。
然而，已经观察到，免疫缺陷患者的TTV载量更高。例如，在器官移植(Rezahosseini等人,Transplant Rev(Orlando).33(3):137-144,2019)或HSCT(Albert等人,Med Microbiol Immunol.208(2):253-258,2019)的背景下接受免疫抑制剂治疗的患者中发现高水平的TTV。此外，TTV载量和与慢性感染或癌症相关的免疫系统缺陷之间似乎存在关系(Zhong等人,Ann NY Acad Sci.945:84-92,2001；Fogli等人,Clin DevImmunol.2012:829584,2012；Béland等人,J infect Dis.209(2):247-254,2014；等人,J Heart Lung Transplant.33(3):320-323,2014)，而发现TTV与免疫抑制病毒感染(如HIV或HCV感染)相关。
这些观察结果表明，TTV载量可能是免疫活性的一个标志(8-11)。然而，在这些研究中，仅从免疫细胞的数量或从不良临床事件的发生来评估免疫活性(11-14)。现在，已经提出细胞的数量不一定与细胞的质量相关，即T细胞的活性不以它们的数量反映(12)。
因此，仍然需要一种简单、可靠的方法来确定受试者体内的T细胞是否能被激活。
发明内容
本发明涉及一种用于确定受试者中T细胞是否具有功能的方法。更准确地说，本发明人已经表明，T细胞的增殖能力与细环病毒(TTV)的载量呈负相关，特别是在接受移植的患者中，更特别是在HSCT患者中。TTV病毒载量与T细胞的增殖呈负相关：因此，TTV病毒载量越高，T细胞的增殖能力越低。病毒载量与另一个参数没有特别的相关性，无论是T细胞的数量还是临床标准，这强调了确定的所述相关性。TTV载量是T细胞活性的特异性标志，特别是在接受移植的患者中，尤其是HSCT。因此，可以通过简单地测量受试者的TTV载量来追踪其免疫系统功能的发展。因此，有可能快速评估免疫系统的功能状态，而不必实施通常用于评估该参数的繁琐的技术步骤。
确定T细胞增殖能力的方法
本说明书涉及确定受试者中T细胞增殖能力的方法，所述方法包括测量患者中的TTV载量。
如上所述，T细胞的增殖能力不一定与所述T细胞的数量相关。因此，用于计数T细胞的已知方法无论如何不能提供关于T细胞增殖能力的信息，因此也不能提供关于免疫系统功能的信息。因此，本发明人的优点在于鉴定了一种易于常规测量的新参数，该参数有利地与T细胞的增殖能力相关，从而使得评估免疫系统的功能成为可能。
“T细胞”是免疫系统的基本细胞，其任务是放大或降低免疫反应。优选地，T细胞的特征在于表达称为CD3的膜标志物和特异性受体TCR(代表“T细胞受体”)，其直接参与抗原识别。有利地，T细胞可以表达其他表面标志物，特别是CD4和CD8，它们对应于T细胞的特定功能类别。在HSCT的情况下，涉及的T细胞可能特别是接受者的少量残留T细胞，或移植中存在的供体T细胞。它们也可能是来自接受者胸腺中供体干细胞和祖细胞分化的幼稚T细胞。
术语“T细胞的活化”在本文指的是幼稚T细胞能够参与免疫反应的过程。T细胞的活化尤其导致它们的增殖。因此，通过测量T细胞的增殖可以有利地评估T细胞的活化。T细胞增殖的测量通常通过本领域技术人员熟悉但实施起来繁琐的技术进行。特别是，众所周知，T细胞能够在有丝分裂原存在下增殖，例如伴刀豆球蛋白A(concanavalin A，Con A)、美洲商陆的有丝分裂原(PWM代表“pokeweed mitogen”)和植物血凝素(phytohaemagglutinin，PHA)，而与其TCR的特异性无关。现有技术的方法通过测量有丝分裂原刺激后T细胞DNA的合成来评估T细胞的增殖能力。然而，这些方法实施起来繁琐，因此可能难以常规使用。相比之下，本文描述的方法特别简单和稳健。
因此，T细胞增殖试验可包括以下步骤：
-通过离心从全血中分离外周血单核细胞(PBMC)，
-任选地在补充培养基中，例如在细胞培养板中，孵育所述分离的PBMC，
-用有丝分裂原刺激，优选双重刺激，
-孵育，以及
-通过流式细胞术进行测定，例如从培养小室中进行测定，以确定T细胞的增殖。
在实施方案实例中特别给出了详细的方案。
根据第一方面，本文描述了一种用于确定受试者中T细胞增殖能力的方法，所述方法包括：
a)测量来自所述受试者的样品的TTV载量；和
b)根据a)中测量的病毒载量确定受试者T细胞的增殖能力。
根据一个优选的实施方案，高TTV载量表明T细胞具有低增殖能力。相反，低TTV载量表明细胞具有高增殖能力。
当然，为了确定生物样品中的TTV载量是高还是低，并得出关于T细胞增殖能力的结论，所述TTV载量可以有利地与参考TTV载量或对照载量进行比较，如本说明书后面所定义的。例如，参考TTV载量可以是在同一个个体中测量的TTV病毒载量。
本方法尤其适用于评估可能具有免疫缺陷状态的受试者中T细胞的增殖能力。
本文所用术语“免疫缺陷(immunodeficiency)”(或“抑制免疫反应(immunodepression)”或“免疫抑制(immunosuppression)”)是指免疫系统功能的降低或抑制。在此，“免疫缺陷状态”因此表示受试者的免疫系统降低或缺失的状态。优选地，在免疫缺陷状态的受试者中，对传染性病原体的体液和/或细胞免疫反应是有缺陷的。更优选地，免疫缺陷状态至少表现为细胞反应的降低。
免疫缺陷可能是原发性或继发性的。原发性免疫缺陷包括免疫系统的先天缺陷，其对感染的易感性增加。相反，继发性免疫缺陷(或获得性免疫缺陷)对应于在生命过程中出现的免疫功能丧失，例如但不限于暴露于病原体、疾病(例如淋巴瘤或白血病)、治疗疾病的疗法(例如放疗或化疗)、免疫抑制或衰老之后。可能导致免疫缺陷的病原体包括人类免疫缺陷病毒(HIV)1(HIV-1)、HIV-2、梅毒螺旋体(Treponema pallidum)、恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)、三日疟原虫(Plasmodium malariae)、卵形疟原虫(Plasmodiumovale)、间日疟原虫(Plasmodium vivax)、诺氏疟原虫(Plasmodium knowlesi)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、朊病毒、西尼罗病毒(West Nile virus)、细小病毒、克氏锥虫(Trypanosoma cruzi)、冠状病毒如SARS-CoV-1和SARS-CoV-2、和/或牛痘病毒。也可以用药物故意诱导免疫缺陷，例如在准备移植时，例如器官移植(例如肾、肝、心脏、肺、胰腺、肠等)或HSCT，以防止移植排斥。
优选地，根据本说明书的免疫缺陷是继发性(或获得性)免疫缺陷。因此，本文所述的免疫缺陷可以是任何起因引起的，例如但不限于免疫抑制剂治疗、药物治疗或包括放射治疗的疗法的免疫抑制剂副作用、遗传性免疫抑制剂遗传性状或疾病、获得性免疫抑制疾病(如AIDS)、癌症(如白血病或淋巴瘤)。特别地，免疫缺陷与移植有关，特别是HSCT。
在一个特定的实施方案中，可能患有免疫缺陷状态的受试者是已经接受移植的受试者。根据一个更具体的实施方案，该移植是HSCT。
更具体地，本说明书涉及一种用于确定受试者中T细胞增殖能力的方法，该受试者已经接受了HSCT，该方法包括以下步骤：
a)测量来自受试者的样品的TTV载量；和
b)根据a)中测量的病毒载量确定受试者T细胞的增殖能力。
根据一个优选的实施方案，高TTV载量表明细胞具有低增殖能力。相反，低TTV载量表明细胞具有高增殖能力。
本文，“干细胞”是指未分化但具有两种主要特性的特化细胞，两种主要特性：自我更新和长时间保持原位的能力，以及产生特定组织的所有类型分化细胞的能力，这定义了它们的多能性。在此，“造血干细胞”或“HSC”更具体地表示可以产生不同血液细胞(特别是红细胞、血小板、粒细胞、T或B细胞和单核细胞)的干细胞。HSC可以有利地从脐带血中获得。或者，它们可以从外周血中获得。也可能从骨髓中获得它们。
本文理解的“造血干细胞移植”或“HSCT”是血液学领域中的一种治疗程序，其中通常来源于骨髓、外周血或脐带血的HSC被从供体移植到接受者。
HSCT是多种疾病的潜在治疗方法。这些疾病尤其是血液病，尤其是恶性血液病，例如急性白血病、骨髓增生异常和淋巴瘤，以及具有严重预后的非恶性血液病，包括原发性骨髓发育异常和血红蛋白病、实体瘤、免疫缺陷和造血组织的酶缺陷，例如戈谢病。优选地，病理是血液病，更优选地是恶性血液病。
HSCT可以是自体的(使用患者自身的干细胞，即供体和接受者是同一个人)或同种异体的(下文称为“同种异体HSCT(allo-HSCT)”：干细胞来自非接受者的供体)。优选地，本文所述方法中的HSCT是同种异体移植。
根据该具体实施方案，本说明书涉及一种测定受试者T细胞增殖能力的方法，该受试者已经接受了allo-HSCT，该方法包括以下步骤：
a)测量来自受试者的样品的TTV载量；和
b)根据a)中测量的病毒载量确定受试者T细胞的增殖能力。
根据一个优选的实施方案，高TTV载量表明细胞具有低增殖能力。相反，低TTV载量表明细胞具有高增殖能力。
在同种异体移植的情况下，在移植前进行准备处理(或预处理(conditioning))，以破坏或降低接受者免疫系统的活性。这种预处理的目的是防止移植排斥和减少肿瘤负荷。
该预处理可以是清髓性的。本文理解的“清髓性”预处理是破坏接受者骨髓细胞的预处理。有利的是，清髓性预处理也破坏了接受者的免疫系统，从而促进了移植物的接受。清髓性预处理可以特别包括一个或多个化疗和/或放疗步骤。例如，两种常用的预处理是白消安-环磷酰胺和环磷酰胺-全身照射(TBI)。优选地，清髓性预处理适用于55岁以下，优选50岁以下的患者。
或者，这种预处理是非清髓性预处理，减毒的，也称为“降低强度的”。“减毒预处理”是一种不完全破坏接受者骨髓，但导致其免疫系统抑制，从而促进移植物接受的预处理。这种减毒的预处理优选包括施用免疫抑制剂。例如，减毒预处理方案可以包括氟达拉滨、环磷酰胺或另一种烷化剂和TBI的组合物。减毒预处理方案的另一个实例可以包括氟达拉滨、抗淋巴细胞血清(ALS)和白消安的组合物。减毒预处理方案的另一个实例可以包括氟达拉滨、伊达比星和阿糖胞苷的组合物。最后，减毒预处理方案的另一个实例可以包括氟达拉滨与完全迷你照射的组合物。在一个优选实施方案中，减毒预处理适用于75岁以下的患者。
本文使用的术语“供体”是指其HSC被转移到接受者的受试者。在此，“接受者”或“患者”是指从供体接受造血干细胞的受试者。在一个具体的实施方案中，接受者受到HSCT应该提供治疗益处(无论是完全的还是部分的)的病理影响。
如本文所用，术语“受试者”指脊椎动物，优选哺乳动物，最优选人类。例如，人可以是患者。
优选地，在如下所述的方法中，在其所有实施方案中，受试者是患者。
术语“患者”表示已经接触医疗专业人员(例如医生)、医疗机构或医疗保健机构(例如医院)的人。
本文，“生物样品”是指可以取自受试者的任何样品。一般来说，生物样品必须允许测定TTV载量。本文理解的生物样品包括但不限于全血、血清、血浆、痰液、鼻咽样品、尿、粪便、皮肤、脑脊液、唾液、胃分泌物、精子、精液、眼泪、脊髓组织或液体、脑液、三叉神经节样品、骶淋巴结样品、脂肪组织、淋巴组织、胎盘组织、上生殖系统组织、胃肠系统组织、生殖器组织和中枢神经系统组织。测试样品可以直接来自生物来源使用或在用于改变样品特性的预处理后使用。例如，这种预处理可以包括从血液中制备血浆、稀释粘性流体等。预处理方法还可以包括过滤、沉淀、稀释、蒸馏、混合、浓缩、干扰成分的灭活、试剂的添加、裂解等。此外，对固体测试样品进行改性以形成液体介质或释放分析物可能是有益的。优选地，生物样品是血液或其衍生物，例如血浆或血清。因此，生物样品优选为来自被测试的受试者的血液、血浆或血清。
“细环病毒或Torque Teno病毒或TTV”是指一种指环病毒科(Anelloviridae)的病毒。本文理解的TTV是一种无包膜病毒，具有负极性环状单链DNA的基因组。“TTV基因组”在本文是指所有指环病毒科的基因组，包括α-托克特诺病毒(alphatorqueviruses，TTV)、β-托克特诺病毒(betatorqueviruses，TTMV)、γ-托克特诺病毒(gammatorqueviruses，TTMDV)。作为一个实例，本文参考了细环病毒原型株TTV-1a的基因组。更具体地说，TTV基因组的一个实例是由SEQ ID No 1代表的序列，其Genbank登录号为AB017610。
优选地，TTV基因组的大小约为3.8kb。TTV的结构和基因组组织是众所周知的(参见例如Biagini,Curr Top Microbiol Immunol.331:21-33,2009)，并在[图1]中举例说明。因此，TTV基因组可分为约1-1.2kb的非翻译区(UTR)和约2.6-2.8kb的潜在编码区。编码区特别包含两个大的开放阅读框：ORF1和ORF2，分别编码具有770和202个残基的两种蛋白质。在SEQ ID No 1代表的TTV基因组中，开放阅读框ORF1和ORF2分别位于核苷酸589-2901和107-715之间。TTV基因组可能具有其他开放阅读框架。例如，TTV基因组可以包含两个额外的阅读框，ORF3和ORF 4[图1]。
相反，非翻译区UTR非常保守。它特别包含富含GC的序列，可以形成二级结构。在非翻译区UTR-5’选择的序列的扩增使得有可能证明该病毒在全世界人群中的患病率非常高(Hu等人,J Clin Microbiol.43(8):3747–3754,2005)。该区域特别包含一段128bp的序列，可以用TTV R-诊断试剂盒(bioMérieux，法国)扩增。
本文理解的“病毒载量”是生物样品中存在的病毒颗粒的数量。病毒载量反映了病毒感染的严重程度。病毒载量可以通过测量这个生物样本里病毒的一种成分(基因组DNA、mRNA、蛋白质等)的量来确定。因此，优选地，病毒载量是指生物样品中属于所述病毒的核酸序列的比例。更优选地，病毒载量代表生物样品中所述病毒基因组的拷贝数。
在目前的情况下，病毒载量代表TTV载量。“TTV载量”在此更具体地对应于TTV的病毒载量，即生物样品中存在的TTV病毒颗粒的数量。受试者中的TTV载量是指所述受试者携带的所有TTV的病毒载量。可以通过测量该生物样品中的TTV成分(如核酸或蛋白质)的量来确定TTV载量。优选地，TTV载量对应于生物样品中存在的TTV核酸序列的量。因此，根据本发明确定受试者中的TTV载量包括估计来自所述受试者的生物样品中所有TTV的序列数。特别地，根据本发明，没有在所述生物样品中选择待测量的特定TTV菌株。优选地，TTV载量的测定包括活性和/或非活性病毒拷贝的量的测定。它由确定的整合的或潜伏的循环病毒拷贝的数量组成。
通过测量TTV DNA、TTV RNA或TTV蛋白质的水平，可以确定TTV的水平，从而确定TTV的载量。因此，根据本发明的方法可以在从患者采集样品和如上定义的步骤a)之间包括另一个预备步骤，对应于将生物样品转化为双链DNA样品，或mRNA(或相应cDNA)样品，或蛋白质样品，然后准备用于步骤a)中TTV的体外检测。从细胞样品开始制备或提取双链病毒DNA、mRNA(以及后者反转录成cDNA)或蛋白质仅仅是本领域技术人员熟悉的常规程序。双链DNA可以对应于整个TTV基因组，或仅对应于其一部分。一旦获得了双链DNA、mRNA(或相应的cDNA)或即用型蛋白质样品，就可以根据样品或转化的类型，通过基因组DNA(即基于由TTV基因组的至少一部分组成的至少一个序列的存在)，或通过mRNA(即基于样品中TTV mRNA的含量)，或在蛋白质水平(即基于样品中TTV蛋白质的含量)进行TTV的检测。
优选地，TTV的水平通过测量TTV核酸的水平来确定，更优选地通过测量TTV DNA的水平来确定。
检测生物样品中核酸的方法尤其包括扩增，包括PCR扩增、测序、与标记探针的杂交以及本领域技术人员已知的所有其他方法。
根据第一个实施方案，TTV载量通过TTV序列的扩增来确定。
一种优选的方法由扩增已知对TTV基因组特异的序列组成。本文，“TTV基因组特异性序列”是指存在于大多数已知TTV中，但不存在于大多数其它病毒中，特别是大多数其它指环病毒中的序列。优选地，TTV特异性序列存在于已知TTV的至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的基因组中。更优选地，它存在于100％的已知TTV基因组中。或者，TTV特异性序列存在于小于10％、小于5％、小于4％、小于3％、小于2％、小于1％的除TTV之外的已知指环病毒基因组中。优选地，除TTV之外，TTV特异性序列不存在于所有已知指环病毒的基因组中。这种序列例如是包含在非翻译区UTR的序列。更具体地，这样的序列对应于使用TTV诊断试剂盒(bioMérieux，法国)扩增的非翻译区5’-UTR的128bp序列。
因此，根据该实施方案，本文描述的方法包括使用引物和探针来扩增已知对TTV基因组特异的序列。如本技术领域中常用的，这些引物优选是寡核苷酸。例如，这些引物可以包含少于30个核苷酸、少于25个核苷酸、少于20个核苷酸、少于15个核苷酸或少于12个核苷酸。或者，这些引物包含至少12、15、20、25或30个核苷酸。优选地，所用引物包含12至20个核苷酸，12至25个核苷酸，15至20个核苷酸，或者15至25个核苷酸。一旦选择了TTV的特异性序列，本领域技术人员将知道如何确定要使用的扩增引物的长度和序列。例如，可以使用与TTV诊断试剂盒(bioMérieux，法国)中提供的引物相同的引物。
扩增技术尤其包括等温方法和基于PCR(聚合酶链式反应)的技术。等温扩增的方法包括许多方法。最常用于检测病原体的方法是LAMP(环介导扩增)和RPA(重组酶聚合酶扩增)。等温扩增的方法还包括例如NASBA(基于核酸序列的扩增)、HDA(依赖解旋酶的扩增)、RCA(滚环扩增)和SDA(链置换扩增)、EXPAR(指数扩增反应)、ICANs(核酸的等温和嵌合引物起始扩增)、SMART(RNA技术的信号介导扩增)等方法。(参见例如Asiello和Baeumner,LabChip 11(8):1420-1430,2011)。优选地，所用的PCR技术定量测量DNA、cDNA或RNA的初始量。可用于本文所述方法的基于PCR的技术的实例包括但不限于诸如实时PCR(Q-PCR)、逆转录PCR(RT-PCR)、多重逆转录PCR、实时逆转录PCR(QRT-PCR)和数字PCR的技术。这些技术对于本领域技术人员来说是众所周知且容易获得的技术。在本文没有必要详述它们。
优选地，TTV载量通过实时定量PCR来确定。现有技术中已经描述了许多检测和定量TTV的方法(参见例如Maggi等人,J Virol.77(4):2418-2425,2003)。将特别参考Kulifaj等人(J Clin Virol.105:118-127,2018)描述的方法。这种方法由于其简单性和稳定性而特别有利。它基于非编码区UTR中包含的序列的扩增。该序列存在于所有已知的TTV中，因此赋予该方法非常大的特异性。此外，它特别通用，可以用任何类型的PCR平台进行。使用TTV诊断试剂盒(bioMérieux，法国)进行该方法是特别有利的。
或者，通过数字PCR进行病毒载量的测定。数字PCR包括对极度稀释的核酸进行几次PCR分析，因此大多数阳性扩增反映了单个基质分子的信号。因此，数字PCR允许对单个模型分子进行计数。分析的PCR总数中阳性扩增的比例允许估计原始或未稀释样品中基质的浓度。提出这种技术是为了允许检测各种遗传现象(Vogelstein等人,Proc Natl Acad SciUSA 96:9236-924,1999)。数字PCR，就像实时PCR一样，潜在地允许区分样品之间靶序列的细微定量差异。
根据另一个实施方案，通过测序测量TTV DNA的水平。如本文所用，术语“测序”具有其最广泛的含义，指本领域技术人员已知的用于确定多核苷酸分子(DNA或RNA)序列的任何技术，即用于确定组成该分子的核苷酸序列的技术。
因此，可以通过本领域已知的任何技术对TTV DNA进行测序。如本文所理解的，测序包括Sanger法测序、全基因组测序、杂交测序、焦磷酸测序(特别是454测序、Solexa基因组分析仪测序)、毛细管电泳测序、循环测序、单碱基延伸测序、固相测序、高通量测序、大规模平行测序(MPSS)、可逆染料终止子测序、成对测序、短期测序、核酸外切酶测序、连接测序、单分子测序、合成测序、电子显微镜测序、实时测序、反向末端测序、纳米孔测序、可逆末端测序、半导体测序、SOLiD(R)测序、SMRT测序(单分子实时分析)、MS-PET测序、质谱法及其组合。一个具体实施方案使用高通量DNA测序，例如使用由Illumina开发的平台MiSeq、NextSeq 500和HiSeq系列(Reuter等人,Mol Cell,58:586-597,2015；Bentley etal.Nature；456:53-59,2008)，454基因组测序仪和Roche平台(Margulies等人,Nature；437:376-380,2005)，Applied Biosystems的SOLiD平台(McKernan等人,Genome Res；19:1527-1541,2009)、Polanator平台(Shendure等人,Science,309:1728-1732)或Helicos单分子测序平台(Harris等人,Science；320:106-109,2008)。高通量测序还包括诸如SMRT实时测序(Roads等人,Genomics,Proteomics&Bioinformatics,13(5):278-289,2015)，离子激流测序(WO 2010/008480；Rothberg等人,Nature,475:348-352,2011)和使用纳米孔的测序(Clarke J等人,Nanotechnol:4:265-270,2009)。
对生物样品中包含的全部DNA或生物样品中包含的部分DNA进行测序。本领域技术人员将立即清楚所述样品至少包含TTV DNA和宿主受试者DNA的混合物。此外，TTV DNA可能只代表样品中总DNA的一小部分。有利的是，在测序之前，通常通过物理方法将DNA随机片段化。
第一种方法由对TTV物种基因组的特定序列进行测序组成。另一种方法由使用一种方法组成，该方法允许以很高的准确度对从生物样品中获得的核酸进行定量基因分型。在一个具体的实施方案中，通过分析大量(例如，数百万或数十亿)核酸分子而不进行任何扩增，使用基于靶序列(即，在这种情况下，TTV的序列)的现有知识的方案来获得准确性。
在优选实施方案中，本发明的方法包括量化读数的步骤。
在一个具体的实施方案中，将生物样品的核酸分子的随机子集进行高通量测序。优选地，通过与公开保藏的TTV序列比较，在全球测序数据中鉴定TTV序列。这种比较有利地基于与已知TTV序列的序列同一性水平，并且使得检测甚至远亲的变体成为可能。常用软件如BLAST可用于确定序列间的同一性水平。
因此，与已知TTV序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的序列被鉴定为TTV序列。根据该实施方案，TTV载量的确定因此包括对来自受试者的生物样品中通过测序鉴定的TTV序列进行量化。
在另一个实施方案中，通过测量生物样品中病毒蛋白的量来确定TTV载量。因此，可以使用特异性抗体，特别是在众所周知的技术中，例如免疫沉淀、免疫组织学、蛋白质印迹、斑点印迹、ELISA或ELISPOT、电化学发光(ECLIA)、蛋白质芯片、抗体芯片或与免疫组织化学偶联的组织芯片。可以使用的其他技术包括FRET或BRET技术、显微镜或组织化学方法，特别包括共聚焦显微镜和电子显微镜的方法、基于使用一种或多种激发波长的方法和适合的光学方法的方法(例如电化学方法(伏安法和电流分析法))、原子力显微镜和射频方法(例如多极、共聚焦和非共聚焦共振波谱)、荧光、发光、化学发光、吸光度、反射率、透射率和双折射能力或折射率的检测(例如通过表面等离子体共振、椭圆偏振、共振镜法等)、流式细胞术、放射性同位素或磁共振成像、聚丙烯酰胺凝胶电泳分析(SDS-PAGE)；通过质谱和与质谱联用的液相色谱(LC-MS/MS)。所有这些技术对于本领域技术人员来说都是熟悉的，因此没有必要在此详述。此外，TTV蛋白的特异性抗体已经可以获得。
在一个优选的实施方案中，本文所述的方法包括对所测核酸或病毒蛋白的量进行标准化的一个额外步骤。
根据一个优选的实施方案，将生物样品中存在的TTV水平，即TTV DNA、TTV RNA或TTV蛋白质的量，标准化为该样品的特定参数可能是有利的。当比较两种不同生物样品的病毒载量时，将测得的TTV载量标准化为特定参数使得降低错误率成为可能。可能对这种标准化有用的参数的实例可以是独立于样品内容的物理参数，例如后者的体积。也可以将TTVDNA、TTV RNA或TTV蛋白质的量标准化为样品中存在的DNA、RNA或蛋白质的总量。或者，可以使用特定的DNA或RNA序列或特定的蛋白质作为标准化工具。例如，该序列或该蛋白质可以是人类序列或蛋白质。
或者，将给定样品中TTV DNA或RNA或TTV蛋白的量与内部对照进行比较。为此，在生物样品中测量的TTV核酸或蛋白质的量可以指可鉴定和可定量的核酸或合适蛋白质的确定量，例如宿主或外源核酸或蛋白质。优选地，这种可识别和可定量的核酸或蛋白质被当作目标核酸或蛋白质进行处理(例如，扩增、测序等)。因此，可以从一开始就向样品中加入已知量的这种可鉴定和可定量的核酸或蛋白质，然后将其作为靶核酸或蛋白质处理，并在测量这种病毒核酸或蛋白质的量之前通过样品制备的所有步骤。制备步骤可以包括保护病毒核酸和破坏宿主核酸的手段，例如使用各种核酸酶。或者，这些步骤可以包括保护病毒蛋白和破坏宿主蛋白的手段，例如使用各种蛋白酶。内部对照使评估样品中所考虑的分子(核酸或蛋白质)的质量和处理程度(例如扩增或测序)成为可能。优选地，所述内部对照是已知序列的核酸分子，该核酸分子以已知浓度存在于样品中。更优选地，该核酸分子是样品中已知序列和浓度的病毒的基因组单链环状DNA分子。这种已知的病毒可以是例如圆环病毒科(Circoviridae)的病毒。样品与对照的序列数量之比使得估计已知序列和浓度的TTV基因组的绝对数量成为可能。或者，该内部对照是已知序列的蛋白质，其以已知浓度存在于样品中。
一旦通过测量所确定的TTV核酸或蛋白质的量确定了TTV载量，后者任选地被标准化，将其与参考TTV载量进行比较可能是有利的。
“参考TTV载量”或“参考病毒载量”在本申请的意义上是指用作参考的任何TTV载量。这意味着参考TTV载量对应于“TTV核酸(或蛋白质)的参考水平”或“TTV核酸(或蛋白质)的对照水平”，即对应于用作参考的TTV核酸(或蛋白质)的浓度。如本文所理解的，“TTV核酸(或蛋白质)的参考浓度”是在与测试样品相当的对照样品中测量的基线水平，并且是从具有特定免疫活性状态的受试者或一组受试者中获得的。它可以是例如健康的或没有导致免疫抑制的疾病的受试者或一组受试者。它也可以是免疫抑制的受试者或受试者组，例如在免疫抑制剂治疗后。最后，可能是接受了移植的同一个人，例如在移植之前或之后。
可以通过多种方法来确定参考水平。例如，对照可以是预定值，其可以采取各种形式。它可以是唯一阈值，例如中值或平均值。“参考水平”可以是唯一的值，也分别地适用于每个患者。或者，参考水平可以按照患者特定亚群的函数而变化。因此，举例来说，对于TTV病毒载量，老年男性的参考水平可能与年轻男性不同，而对于这种病毒载量，女性的参考水平可能与男性不同。此外，“参考水平”可以在对照组的基础上建立，例如不具有高水平TTV核酸(或蛋白质)的组和具有高水平TTV核酸(或蛋白质)的组。对照组的另一个实例是患有疾病、病况或特定症状的组和未患病的组。例如，当测试人群被平等地(或不平等地)分成诸如低风险组、中风险组和高风险组的组时，可以定义预定值。
参考水平也可以通过比较接受移植的患者群体或患有导致免疫抑制的疾病的患者群体中TTV核酸(或蛋白质)的水平来确定。这可以通过例如直方图分析来实现，其中整个受试者群组以图表形式呈现，第一轴代表所述TTV核酸(或蛋白质)的水平，第二轴代表在给定水平下表达TTV核酸(或蛋白质)的所述患者组中的患者数量。可以通过鉴定群组中具有相同或相似水平的TTV核酸(或蛋白质)的亚群来确定两个独立组或更多组的受试者。然后，可以基于最能区分这些独立组的水平来确定参考水平。参考水平也可以代表存在的两种或多种TTV核酸(或蛋白质)的水平。两个或更多标志物可以例如通过每个标志物的水平值的比率来表示。
此外，明显健康良好的人群的正常范围将“不同于”已知具有与高浓度所述TTV核酸(或蛋白质)相关的状态的人群的正常范围。因此，所选择的预定值可以考虑个人所属的类别。本领域技术人员可以通过常规实验简单地选择合适的范围和类别。“高”或“升高”是指相对于所选对照高。通常，对照将基于在适当年龄组中明显健康良好的正常个体。
在优选的实施方案中，参考浓度对应于普通人群中TTV核酸(或蛋白质)或TTV核酸(或蛋白质)组合物的浓度。
还应当理解，除了预定值之外，本文所述方法中的对照可以是与测试样品平行测量的生物样品。根据该实施方案，参考水平将是从健康良好受试者获得的样品中的一种或多种TTV核酸(或一种或多种蛋白质)的水平。
优选地，TTV核酸(或蛋白质)的参考浓度将是健康良好受试者或健康良好受试者群体中该TTV核酸(或该TTV蛋白质)的浓度。根据另一个优选的实施方案，TTV核酸(或蛋白质)的参考浓度将是免疫抑制受试者或免疫抑制受试者群体中该TTV核酸(或该TTV蛋白质)的浓度(例如，在免疫抑制剂治疗后)。根据另一个优选的实施方案，TTV核酸(或蛋白质)的参考浓度将是在特定时间点，例如在移植之前或之后，接受移植的同一个体中该TTV核酸(或该TTV蛋白质)的浓度。
优选地，在上述方法中，在其所有实施方案中，T细胞是CD3+ T细胞、CD4+T细胞、CD8+ T细胞或CD3+和/或CD4+和/或CD8+ T细胞群，优选CD3+ T细胞。
监测T细胞活性的方法
本文描述的方法允许快速和简单地评估受试者中T细胞的增殖能力。
多种因素导致了HSCT接受者，尤其是allo-HSCT接受者的严重免疫抑制状态。所述预处理特别改变了接受者的淋巴组织。GvHD的存在及其治疗引起新的免疫并发症。最后，与免疫功能正常的人的T细胞区的大小相比，移植的T细胞数量很少，而且移植的供体的免疫前体数量极其有限，这也是导致受体恢复免疫力缓慢的原因。所有这些因素都使接受者易受移植后并发症的影响，如微生物感染或GvHD。
由于本文所述的方法，可以很容易地评估免疫系统受损情况下T细胞的活性，例如在HSCT之后，尤其是allo-HSCT。
因此，本发明的另一方面涉及一种用于监测接受HSCT(尤其是allo-HSCT)的患者中T细胞活性的方法。该方法包括以下步骤：
a)通过上述方法在第一时间点测量T细胞的增殖能力；
b)将a)中测量的T细胞的增殖能力与T细胞的参考增殖能力进行比较；和
c)根据步骤b)中的比较，确定患者T细胞活性的变化。
本文所理解的“T细胞的参考增殖能力”是由上述参考TTV载量估计的T细胞的增殖能力。当然，步骤b)中的比较可以简单地通过将步骤a)中确定的患者样本中的TTV载量与参考TTV载量进行比较来完成。
例如，通过将患者在该第一时间点的T细胞增殖能力与免疫抑制个体的T细胞的参考增殖能力进行比较，有可能在该第一时间点估计HSCT(尤其是allo-HSCT)后患者免疫活性的恢复。本文，“免疫活性”是指免疫细胞功能的获得。因此，相对于免疫抑制个体而言，患者T细胞增殖能力的增加表明患者免疫能力的恢复正在进行中。如上所述，相对于免疫抑制受试者，患者中所述T细胞增殖能力的增加对应于较低的TTV载量。
或者，T细胞的参考增殖能力可以是健康个体的增殖能力。在这种情况下，相对于T细胞的参考增殖能力，患者T细胞的增殖能力降低表明患者的免疫活性没有完全恢复。很容易理解，相对于健康受试者，患者T细胞增殖能力的降低对应于TTV载量的增加。
本文在某些实施方案中使用的术语“增加”表示更大的量，例如略高于原始量的量，或者例如相对于原始量极大地过量的量，特别是该范围内的所有量。作为变量，“增加”可以指比与增加的量或活性相比较的量或活性多至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的量或活性。术语“增强”、“大于”、“更大”和“增加”在本文可互换使用。
本文在某些实施方案中使用的术语“减少”表示更小的量，例如略小于原始量的量，或者例如相对于原始量非常不足的量，特别是该范围内的所有量。作为一种变量，“减少”可以指比与减少的量或活性相比较的量或活性少至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的量或活性。术语“减少的”、“小于”、“低于”和“减少的”在本文可互换使用。
还可以使用同一患者在第二时间点的T细胞增殖能力作为T细胞的参考增殖能力。因此，通过在第一和第二时间点简单测量患者体内的TTV载量，可以容易地监测移植后该患者体内这些T细胞活性的变化，而无需使用昂贵和复杂的测试设备。
根据该具体实施方案，本发明用于监测接受HSCT(特别是allo-HSCT)的患者中T细胞活性的方法包括以下步骤：
a)通过上述方法在第一时间点测量T细胞的增殖能力；
b)通过上述方法在第二时间点测量T细胞的增殖能力，该第二时间点晚于步骤a)中的第一时间点；
c)比较a)和b)中测量的T细胞的增殖能力；和
d)根据步骤c)中的比较确定患者T细胞活性的变化。
根据另一个具体实施方案，用于监测接受移植(优选HSCT，特别是allo-HSCT)的受试者中T细胞活性的方法，因此包括以下步骤：
a)从在第一时间点采集的受试者的生物样品中确定TTV病毒载量；
b)从在第二时间点采集的受试者的生物样品中确定TTV病毒载量，该第二时间点晚于步骤a)中的第一时间点；
c)比较a)和b)中测量的TTV病毒载量；和
d)根据步骤c)中的比较确定受试者的TTV载量的变化。
如上所述，由于TTV病毒载量与T细胞的增殖能力呈负相关，因此TTV载量的变化使得有可能确定T细胞的增殖能力是增加还是降低，从而提供了T细胞活性的指示，特别是关于受试者免疫活性的恢复或其他方面。
因此，该方法对于监测患者体内T细胞随时间的活性特别有用。在优选实施方案中，步骤a)中的第一时间点位于移植时。在另一个优选的实施方案中，在步骤b)中使用在HSCT后至少30天、60天、90天、100天、120天、150天、180天、210天、240天、270天、300天、330天、360天、720天或1080天采集的样品测量T细胞的增殖能力。或者，该样品在HSCT后30天、60天、90天、100天、120天、150天、180天、210天、240天、270天、300天、330天、360天、720天或1080天采集。
很明显，如果细胞在第二个时间点相对于第一个时间点具有增加的增殖能力，它们的活性本身在该时间点增加。例如，如果第一时间点是移植时间，则在第二时间点T细胞增殖能力的增加意味着有更多的活性T细胞，并且患者尤其能够抵抗威胁。T细胞增殖能力的这些变化将转变为相反方向的TTV负载的变化：后者随时间的减少因此反映了T细胞增殖能力的增加，即患者免疫活性的恢复。因此，本方法使得估计接受者免疫系统的恢复成为可能。换句话说，T细胞增殖能力的变化使得评估移植后患者免疫活性的再现成为可能。
通过监测T细胞活性随时间的变化，尤其使得监测接受过预处理的患者移植后免疫活性的恢复成为可能。根据这一具体实施方案，上述监测T细胞活性的方法用于在接受HSCT(尤其是allo-HSCT)之前已经接受过预处理的患者。在一个优选的实施方案中，该预处理是清髓性的。在另一个优选实施方案中，该预处理是减毒的。
评估微生物感染风险的方法
HSCT，尤其是allo-HSCT，可能导致早期或晚期并发症，这些并发症因患者而异。
特别是，接受了HSCT(尤其是allo-HSCT)的患者，在其免疫系统恢复之前，仍然对微生物感染敏感，无论所述微生物感染是细菌性的、病毒性的、寄生性的或真菌性的。通过评估HSCT(尤其是allo-HSCT)后给定时刻T细胞的增殖能力，使得确定接受移植的患者对微生物感染的易感性成为可能。
在这一特定方面，本说明书涉及一种用于确定接受HSCT(尤其是allo-HSCT)的患者对微生物感染的易感性的方法。该方法包括以下步骤：
a)通过上述方法在第一时间点测量来自患者样品的T细胞的增殖能力；
b)将T细胞的增殖能力与T细胞的参考增殖能力进行比较；和
c)通过步骤b)中的比较确定患者对微生物感染的易感性。
通过监测T细胞活性随时间的变化，尤其使得监测接受过预处理的患者移植后免疫活性的恢复成为可能。根据这一具体实施方案，将上述监测T细胞活性的方法用于在接受HSCT(尤其是allo-HSCT)之前已经接受过预处理的患者。在一个优选的实施方案中，预处理是清髓性的。在另一个优选实施方案中，预处理是减毒的。
本文所述的方法可进一步包括一个或多个特定诊断一种或多种感染原的存在的步骤，所述感染原例如下文更详细提及的细菌、病毒、寄生虫或酵母和丝状真菌。这些试剂的检测是常规的临床实践，特别是与HSCT相关的，并且相应的技术是本领域技术人员所熟悉的。因此，没有必要在本文详述它们。
这些微生物感染特别是病毒、细菌、寄生虫或真菌感染。病毒感染特别是由疱疹病毒科(Herpesviridae)病毒引起的感染，例如病毒HSV、VZV、HHV-6、爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)或人巨细胞病毒(HCMV)。这些病毒感染也可能由腺病毒、呼吸道合胞病毒(RSV)、流感病毒(也称为流感病毒或粘液病毒流感(Myxovirus influenzae))或BK病毒引起。引起细菌感染的细菌尤其可以是葡萄球菌(staphylococci)如金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)或凝固酶阴性葡萄球菌、包囊细菌如肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)或流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、军团菌(Legionella sp.)或严格好氧的非发酵革兰氏阴性杆菌，如假单胞菌属(Pseudomonas)、不动杆菌属(Acinetobacter)、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)、伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)、产碱杆菌属(Alkaligenes)等。也可观察到非典型分枝杆菌感染。可能发生高发病率和高死亡率的寄生虫感染，特别是可能发生卡氏肺囊虫(Pneumocystis carinii)感染，也可能发生弓形体病(由弓形虫(Toxoplasma gondii)引起)。最后，酵母如假丝酵母(Candida)或隐球菌(Cryptococcus)，以及丝状真菌如曲霉菌(Aspergillus)引起侵袭性真菌感染，侵袭性真菌感染是仅次于HSCT的感染性死亡的主要原因之一。
T细胞的参考增殖能力对应于由上述参考TTV载量确定的T细胞的增殖能力。步骤b)中的比较可以简单地通过将步骤a)中确定的患者样本中的TTV载量与参考TTV载量进行比较来完成。
该参考TTV载量可以是例如没有免疫抑制的健康个体的载量。T细胞的参考增殖能力是该未免疫抑制的健康个体的增殖能力。
在该具体实施方案中，本说明书涉及一种用于确定接受HSCT(尤其是allo-HSCT)的患者对微生物感染的易感性的方法。该方法包括以下步骤：
a)通过上述方法在第一时间点测量来自患者样品的T细胞的增殖能力；
b)将T细胞的增殖能力与健康受试者的增殖能力进行比较；和
c)通过步骤b)中的比较确定患者对微生物感染的易感性。
通过监测T细胞活性随时间的变化，尤其有可能监测接受过预处理的患者移植后免疫活性的恢复。根据这一具体实施方案，将上述监测T细胞活性的方法用于在接受HSC(尤其是allo-HSCT)之前已经接受过预处理的患者。在一个优选的实施方案中，该预处理是清髓性的。在另一个优选的实施方案中，该预处理是减毒的。
在这种情况下，相对于健康受试者，患者T细胞的增殖能力降低表明患者的免疫系统功能不全。患者T细胞的增殖能力低于健康受试者的增殖能力对应于在患者样品中测得的病毒载量高于健康受试者的TTV载量。换句话说，受试者具有免疫系统缺陷，这使他容易受到病原体的攻击。因此，患者有被微生物感染的风险。然而，当患者的T细胞具有与健康良好受试者基本相同的增殖能力时，患者不易受微生物感染。
同一患者在第二时间点的T细胞增殖能力也可用作T细胞的参考增殖能力。因此，本领域技术人员能够监测移植后微生物感染风险随时间的演变。因此，抗感染治疗可根据患者对微生物感染的实际易感性进行调整，这限制了出现耐药性的风险，同时提高了患者的生活质量。
在这个具体的实施方案中，确定接受HSCT(尤其是allo-HSCT)的患者对微生物感染的易感性的方法包括以下步骤：
a)通过上述方法在第一时间点测量T细胞的增殖能力；
b)通过上述方法在第二时间点测量T细胞的增殖能力，该第二时间点晚于步骤a)中的第一时间点；
c)比较a)和b)中测量的T细胞的增殖能力；和
d)根据步骤c)中的比较确定患者对微生物感染的易感性。
通过监测T细胞活性随时间的变化，尤其有可能监测接受过预处理的患者移植后免疫活性的恢复。根据这一具体实施方案，将上述监测T细胞活性的方法用于在接受HSCT(尤其是allo-HSCT)之前已经接受过预处理的患者。在一个优选的实施方案中，该预处理是清髓性的。在另一个优选实施方案中，该预处理是减毒的。
因此，有可能跟踪患者对微生物感染的易感性随时间的演变。步骤b)中T细胞的增殖能力相对于步骤a)的增加反映了它们活性的增加，因此在两个时间点之间患者对微生物感染的易感性降低。本方法尤其可以证实移植后时间越长，患者越不容易受到微生物感染，即他的免疫系统变得越来越功能性。
因此，可以使用本文所述的方法来确定患者对微生物感染的易感性，这使得针对患者的需要调整特定的治疗方法成为可能。因此，使用本发明的方法的患者免疫抑制状态的初步确定导致比基于现有技术方法设计的治疗更安全的治疗。
优选地，在上述方法中，在其所有实施方案中，T细胞的增殖能力对应于CD3+ T细胞、CD4+ T细胞、CD8+ T细胞或CD3+和/或CD4+和/或CD8+ T细胞群的增殖能力，优选对应于CD3+ T细胞的增殖能力。
因此，本发明还涉及一种为患有HSC(尤其是allo-HSCT)的患者设计微生物感染治疗的方法，所述方法包括：
a)通过上述方法确定患者对微生物感染的易感性；
b)根据步骤a)的结果决定治疗方法。
通过监测T细胞活性随时间的变化，尤其使得监测接受过预处理的患者移植后免疫活性的恢复成为可能。根据这一具体实施方案，上述监测T细胞活性的方法用于在接受HSCT(尤其是allo-HSCT)之前已经接受过预处理的患者。在一个优选的实施方案中，该预处理是清髓性的。在另一个优选实施方案中，该预处理是减毒的。
可以预防性地决定治疗方法，即可以根据患者的免疫缺陷状态来开处方，以防止感染的发生。在这种情况下，可能会在HSCT(尤其是allo-HSCT)后决定开出如下所述通常使用的治疗性或预防性治疗的处方。因此，如果确定了病毒、细菌、寄生虫或真菌感染的风险，本发明的方法使得决定和实施这种感染的预防性或治疗性治疗成为可能。
因此，本说明书还涉及一种治疗已接受HSCT(尤其是allo-HSCT)的患者的感染的方法，所述方法包括以下步骤：
a)通过上述方法确定患者对微生物感染的易感性；和
b)对所述受试者施用合适的治疗。
因此，本发明提出了一种旨在用于治疗已接受HSCT(尤其是allo-HSCT)的受试者的感染的治疗方法，所述用途包括以下步骤：
a)通过上述方法确定患者对微生物感染的易感性；和
b)对所述受试者施用合适的治疗。
换句话说，本发明涉及一种治疗方法在制备用于治疗已接受HSCT(尤其是allo-HSCT)的受试者的感染的药物产品中的用途，所述用途包括以下步骤：
a)通过上述方法确定患者对微生物感染的易感性；和
b)对所述受试者施用合适的治疗。
通过监测T细胞活性随时间的变化，尤其使得监测接受过预处理的患者移植后免疫活性的恢复成为可能。根据这一具体实施方案，将上述监测T细胞活性的方法用于在接受HSCT(尤其是allo-HSCT)之前已经接受过预处理的患者。在一个优选的实施方案中，该预处理是清髓性的。在另一个优选实施方案中，该预处理是减毒的。
如上所述，在HSCT(尤其是allo-HSCT)之后遭遇的感染，是病毒性的、细菌性的、寄生虫性的或真菌性的感染。这些感染的治疗是众所周知的，并且已经在临床实践中使用了许多年(参见例如Tomblyn等人,Biol Blood Marrow Transplant.15(10):1143-1238,2009)。因此，病毒性感染可通过抗病毒剂如阿昔洛韦(aciclovir)、更昔洛韦(ganciclovir)、西多福韦(cidofovir)、恩替卡韦(entecavir)、氟达拉滨(fludarabine)、拉米夫定(lamivudine)、替诺福韦(tenofovir)、利巴韦林(ribavirin)或伐昔洛韦(valaciclovir)，或特异性单克隆抗体如帕利珠单抗(palivizumab)(针对RSV)来预防。抗生素通常可以治疗细菌性感染。特别使用广谱抗生素，例如β-内酰胺抗生素、糖肽、磷霉素、大环内酯类、四环素类、氨基糖苷类、氯霉素、喹诺酮类、利福平和磺酰胺类。关于寄生虫性感染，通常通过施用抗寄生虫剂如磺胺甲基异恶唑、乙胺嘧啶和磺胺嘧啶来治疗。最后，可以施用的抗真菌剂是众所周知的，特别包括氟康唑和棘白菌素。
评估移植物抗宿主病(GvHD)风险的方法
本文描述的方法还提供了能够评估接受过HSCT(尤其是allo-HSCT)的患者发生GvHD的风险的优势。
因此，本说明书还涉及一种用于确定接受HSCT(尤其是allo-HSCT)的患者对GvHD易感性的方法，该方法包括以下步骤：
a)通过上述方法在第一时间点测量来自患者样品的T细胞的增殖能力；和
b)根据步骤a)中的测量确定患者对GvHD的易感性。
通过监测T细胞活性随时间的变化，尤其使得监测接受过预处理的患者移植后免疫活性的恢复成为可能。根据这一具体实施方案，将上述监测T细胞活性的方法用于在接受HSCT(尤其是allo-HSCT)之前已经接受过预处理的患者。在一个优选的实施方案中，该预处理是清髓性的。在另一个优选实施方案中，该预处理是减毒的。
如本文所理解的，“移植物抗宿主病”或“GvHD”，是一种针对接受者并涉及移植物中存在的免疫活性细胞的炎性免疫反应。有两种临床形式的GvHD：通常发生在移植后的第一个100天内的急性GvHD，和通常发生在超过这一限度的慢性GvHD。急性GvHD是指仅在三个器官中出现同种异体炎症反应：皮肤、肝脏和胃肠道。相反，慢性GvHD可能影响以下八个器官中的至少一个：皮肤、口腔、眼睛、胃肠道、肝脏、肺、肌肉、关节、筋膜和生殖器。无论是急性形式还是慢性形式，GvHD通常通过临床检查进行诊断，可能包括对所述器官的活检进行组织学分析(Schoemans等人,Bone Marrow Transplant 53:1401–1415,2018)。
应该注意的是，本发明的方法在这方面特别有用，例如因为它预测了中断患者免疫抑制剂治疗的可能性，从而确保了他们的存活。本发明的方法提供了将需要持续免疫抑制剂治疗的活性GvHD与不再有活性且可以停止治疗的GvHD简易相区分的可能性(参见Magro等人,Bull Cancer.104S:S145–S168,2017)。
更具体地说，急性GvHD发生在移植后的第一个月(30天)内，而慢性GvHD发生在移植后100至400天内。两者的特征都是移植物中供体T细胞的活化。宿主抗原和供体T细胞之间的相互作用导致T细胞的同种异体活化、其增殖和分化成攻击宿主上皮细胞的效应细胞。
如果患者样本中的T细胞具有增殖能力，HSCT(尤其是allo-HSCT)接受者很有可能发生GvHD。特别是，当免疫系统尚未恢复时，患者T细胞的增殖是患者很有可能受到GvHD侵袭的明显指征。这可以通过使用上述方法测量TTV载量来容易地评估。如有必要，可通过对患者的临床检查，特别是对患者一个或多个器官的一个或多个活检进行组织学分析，来补充该检查给出的指征。
优选地，在移植后不到400天采集受试者的样本。更优选地，在移植后不到100天采集样本；或者，在移植后100至400天采集样本。在一个具体的实施方案中，GvHD是急性GvHD；在另一个具体实施方案中，GvHD是慢性GvHD。
在一个具体的实施方案中，将步骤b)的测量值与具有已知T细胞增殖能力的参考值(即T细胞的参考增殖能力)进行比较可能是有用的。T细胞的参考增殖能力对应于如上所述从参考TTV载量估计的T细胞的增殖能力。步骤b)中的比较可以简单地通过将步骤a)中确定的患者样本中的TTV载量与参考TTV载量进行比较来完成。
该参考TTV载量可以是例如没有免疫抑制的健康个体的载量。T细胞的参考增殖能力是该未免疫抑制的健康个体的T细胞增殖能力。
或者，参考TTV载量可以是免疫抑制个体的TTV载量。在该具体实施方案中，本说明书涉及一种用于确定接受HSCT(尤其是allo-HSCT)的患者对GvHD易感性的方法。该方法包括以下步骤：
a)通过上述方法在第一时间点测量来自患者样品的T细胞的增殖能力；
b)将T细胞的增殖能力与免疫抑制受试者的T细胞增殖能力进行比较；和
c)通过步骤b)中的比较确定患者对GvHD的易感性。
通过监测T细胞活性随时间的变化，尤其使得监测接受过预处理的患者移植后免疫活性的恢复成为可能。根据这一具体实施方案，上述监测T细胞活性的方法用于在接受HSCT(尤其是allo-HSCT)之前已经接受过预处理的患者。在一个优选的实施方案中，该预处理是清髓性的。在另一个优选实施方案中，该预处理是减毒的。
在这种情况下，相对于免疫抑制的受试者，患者体内T细胞增殖能力的增加表明患者的免疫系统再次具有功能性。患者T细胞的增殖能力大于免疫抑制受试者的T细胞增殖能力对应于在患者样品中测得的病毒载量低于免疫抑制受试者的TTV载量。换句话说，受试者体内有活性的T细胞，这可能会攻击移植物的细胞并引发GvHD。然而，当患者的T细胞具有与免疫抑制受试者T细胞基本相同的增殖能力时，患者不太可能发生GvHD。
还可以使用同一患者在第二时间点的T细胞增殖能力作为T细胞的参考增殖能力。因此，本领域技术人员可以监测移植后发生GvHD的风险随时间的演变。因此，抗GvHD治疗可根据患者对GvHD的实际易感性进行调整，这限制了出现耐药性的风险，同时改善了患者的生活质量。
在这个具体的实施方案中，确定接受HSCT(尤其是allo-HSCT)的患者对GvHD易感性的方法包括以下步骤：
a)通过上述方法在第一时间点测量T细胞的增殖能力；
b)通过上述方法在第二时间点测量T细胞的增殖能力，该第二时间点晚于步骤a)中的第一时间点；
c)比较a)和b)中测量的T细胞的增殖能力；和
d)根据步骤c)中的比较确定患者对GvHD的易感性。
通过监测T细胞活性随时间的变化，尤其使得监测接受过预处理的患者移植后免疫活性的恢复成为可能。根据这一具体实施方案，将上述监测T细胞活性的方法用于在接受HSCT(尤其是allo-HSCT)之前已经接受过预处理的患者。在一个优选的实施方案中，该预处理是清髓性的。在另一个优选实施方案中，该预处理是减毒的。
因此，有可能跟踪患者对GvHD易感性随时间的演变。步骤b)中T细胞的增殖能力相对于步骤a)的增加反映了它们活性的增加，因此在两个时间点之间患者对GvHD发展的易感性增加。如果它发生在移植后不久，即当仅有的活性T细胞是供体的T细胞时，并且因此存在它们攻击宿主器官的风险时，这种风险更大。
因此，患者对GvHD的易感性可以使用本文所述的方法来确定，这使得针对患者的需要精心设计治疗成为可能。
因此，本发明还涉及为接受HSC(尤其是HSCT)的受试者设计GvHD治疗的方法，所述方法包括：
a)通过上述方法确定患者对GvHD的易感性；
b)根据步骤a)的结果决定治疗方法。
通过监测T细胞活性随时间的变化，尤其使得监测接受过预处理的患者移植后免疫活性的恢复成为可能。根据这一具体实施方案，将上述监测T细胞活性的方法用于在接受HSCT(尤其是allo-HSCT)之前已经接受过预处理的患者。在一个优选的实施方案中，该预处理是清髓性的。在另一个优选实施方案中，该预处理是减毒的。
本说明书还涉及一种治疗接受了HSCT(尤其是allo-HSCT)的患者的GvHD的方法，所述方法包括以下步骤：
a)通过上述方法确定患者对GvHD的易感性；
b)向所述受试者施用合适的治疗。
因此，本发明提出了一种旨在用于治疗接受了HSCT(尤其是allo-HSCT)的受试者的GvHD的治疗方法，所述用途包括以下步骤：
a)通过上述方法确定患者对GvHD的易感性；和
b)向所述受试者施用合适的治疗。
换句话说，本发明涉及一种治疗方法在制备用于治疗接受HSCT(尤其是allo-HSCT)的受试者的GvHD的药物产品中的用途，所述用途包括以下步骤：
a)通过上述方法确定患者对GvHD的易感性；和
b)向所述受试者施用合适的治疗。
通过监测T细胞活性随时间的变化，尤其使得监测接受过预处理的患者移植后免疫活性的恢复成为可能。根据这一具体实施方案，将上述监测T细胞活性的方法用于在接受HSCT(尤其是allo-HSCT)之前已经接受过预处理的患者。在一个优选的实施方案中，该预处理是清髓性的。在另一个优选实施方案中，该预处理是减毒的。
GvHD的治疗是众所周知的，并且是临床医生推荐的项目(参见例如Magro等人,BullCancer.104S:S145–S168,2017；Penack等人,Lancet Haematol.7(2):e157-e167；2020)。GvHD的治疗可用于预防，通常由免疫抑制剂治疗组成，如环孢素或他克莫司(tacrolimus)。
当GvHD的治疗用于治疗时，它们根据并发症的严重程度而变化功能。然而，这些治疗通常包括免疫抑制剂、皮质激素，特别是泼尼松龙和甲基泼尼松龙。如果皮质激素失效，也使用抗淋巴细胞血清(ALS)。最后，可以使用其他二线药物，如霉酚酸吗啉代乙酯单克隆抗体(抗TNFα或IL2抗受体)。
本说明书还涉及测量受试者中TTV载量的变化用于确定所述受试者的T细胞增殖能力的用途。
可以通过比较在第一时间点采集的样品和在第二时间点采集的样品中测量的TTV载量来确定载量的变化，第二时间点晚于第一时间点。
如上所述，如果TTV载量随时间增加，这通过T细胞增殖能力的降低反映了所述T细胞活性的降低。相反，TTV载量随时间的减少通过T细胞增殖能力的增加反映了所述T细胞活性的增加。
本说明书还涉及以下实施方案：
实施方案1：用于确定受试者中T细胞增殖能力的方法，该方法包括以下步骤：
a)测量来自所述受试者的生物样品的TTV载量；和
b)根据a)中测量的病毒载量确定T细胞的增殖能力。
实施方案2：根据实施方案1所述的方法，其特征在于通过TTV序列的扩增、测序或杂交来测量TTV载量，优选通过扩增，更优选通过实时PCR。
实施方案3：根据实施方案1或2的方法，其特征在于所述生物样品是全血、血浆或血清样品。
实施例4：根据实施方案1至3中任一项所述的方法，其特征在于步骤b)中的确定包括将a)中测量的TTV载量与参考TTV载量进行比较。
实施方案5：根据实施方案1至4中任一项所述的方法，其特征在于患者已经接受了移植。
实施方案6：根据实施方案5的方法，其特征在于所述患者已经接受了造血干细胞移植(HSCT)，优选allo-HSCT。
实施方案7：根据实施方案5或6所述的方法，其特征在于在移植前所述患者已经经历了预处理，优选清髓性或减毒的。
实施方案8：监测接受allo-HSCT的患者中T细胞活性的方法，该方法包括以下步骤：
a)根据实施方案1至6中任一项，在第一时间点测量患者中T细胞的增殖能力；
b)将a)中测量的T细胞的增殖能力与T细胞的参考增殖能力进行比较；和
c)根据步骤b)中的比较确定患者T细胞活性的变化。
实施方案9：确定接受allo-HSCT的患者对微生物感染的易感性的方法，该方法包括以下步骤：
a)根据实施方案1至6中任一项，在第一时间点测量患者中T细胞的增殖能力；
b)将a)中测量的T细胞的增殖能力与T细胞的参考增殖能力进行比较；和
c)根据步骤b)中的比较确定患者对微生物感染的易感性。
实施方案10：根据实施方案9的方法，其特征在于微生物感染是病毒性、细菌性、原虫性或真菌性感染。
实施方案11：确定接受allo-HSCT的患者对移植物抗宿主病(GvHD)易感性的方法，该方法包括以下步骤：
a)根据实施方案1至6中任一项，在第一时间点测量患者中T细胞的增殖能力；
b)将a)中测量的T细胞的增殖能力与T细胞的参考增殖能力进行比较；和
c)根据步骤b)中的比较确定患者对GvHD的易感性。
实施方案12：根据实施方案8至11中任一项的方法，其特征在于T细胞的参考增殖能力是健康个体的T细胞的增殖能力或免疫抑制个体的T细胞的增殖能力。
实施方案13：根据实施方案8至11中任一项的方法，其特征在于T细胞的参考增殖能力是在第二时间点在患者中测量的T细胞的增殖能力。
将通过下面给出的实施例更精确地描述本发明。
附图说明
[图1]：TTV分离物的基因组结构示意图。
原型TTV(TTV-1a分离物)的基因组结构。箭头代表主要的ORF(长度大于50个氨基酸)。显示了富含GC的区域和N22区域(最初从该区域分离出TTV)。非翻译区UTR对应于从ORF4的3’末端至ORF2的5’末端的区域。来自Biagini,Curr Top Microbiol Immunol.331:21-33,2009。
[图2]：来自allo-HSCT接受者和健康志愿者血浆样品的TTV病毒载量。
对41名allo-HSCT接受者(黑色)和54名健康志愿者(白色)的TTV病毒载量进行了定量。提取DNA后，使用TTV试剂盒(仅可用于研究，不用于诊断，Ref#69-030,bioMérieux.Marcy-l'Etoile,法国)对TTV病毒载量进行定量。检测到的最低病毒载量为0.46Log拷贝数/mL(log cp/mL)。Log拷贝数/mL用于描述两个群体之间TTV病毒载量的表达。使用F检验比较方差(##p<0.01)。使用不成对t检验与Welch校正比较平均TTV病毒载量(黑线)(***p<0.001)。
缩写：DNA.脱氧核糖核酸；allo.同种异体；HSCT.造血干细胞移植；TTV.细环病毒
在用有丝分裂原(PHA)刺激3天后，对来自41名allo-HSCT接受者(黑色)和20名健康志愿者(白色)的CD3+ T细胞的增殖能力进行定量，并通过流式细胞仪使用EdUAF488试剂盒进行测量。使用F检验比较两个群体的方差(##p<0.01)。使用不成对t检验与Welch校正比较平均值(黑线)(***.p<0.001)。
缩写：allo，同种异体；HSCT，造血干细胞移植；PHA，植物血凝素。
[图3A][图3B][图3C][图3D]：TTV病毒载量和T细胞计数以及CD3+ T细胞增殖能力之间的相关性。
41例allo-HSCT接受者中血浆的TTV病毒载量与几种T细胞亚型计数和CD3+ T细胞增殖能力的总体相关性(A)。所有评估参数的Pearsonρ和95％置信区间(CI95)分别用黑点和黑线表示。
来自41名allo-HSCT接受者血浆中以Log拷贝数/mL表示的TTV病毒载量与以下因素的详细相关性：(B)CD3+ T细胞的增殖能力，(C)绝对淋巴细胞计数和(D)CD3+ T细胞计数。患者用圆点表示。显示了严重患者：“A”(正方形)和“B”(三角形)，以及线性回归(黑线)。
通过流式细胞术在免疫学实验室中使用一组广泛的T细胞膜标志物测量淋巴细胞的数量。CD3+ T细胞的增殖能力在用有丝分裂原(PHA)刺激3天后测定，并使用EdU AF488试剂盒通过流式细胞仪测量。使用Pearson相关系数(显示在每个图表上)来确定TTV病毒载量(x轴)和淋巴细胞的数量或CD3+ T细胞的增殖能力(y轴)之间的相关性。
缩写：allo，同种异体；HSCT，造血干细胞移植；NK，自然杀伤；PHA,植物血凝素；TTV，细环病毒
从41例allo-HSCT接受者血浆中获得的以Log cp/mL表示的血浆TTV病毒载量与T细胞免疫表型和CD3+ T细胞增殖能力的总体相关性(A)。以Log cp/mL表示的41例allo-HSCT接受者血浆中TTV病毒载量与CD3+ T细胞增殖能力(B)、淋巴细胞绝对数量(C)和CD3+ T细胞数量(D)的详细相关性。在Edouard Herriot医院(Hospices Civils de Lyon)的免疫学实验室中，使用T细胞的广泛膜标志物通过流式细胞术测量淋巴细胞的亚型和绝对数量。在用有丝分裂原(PHA)刺激3天后测定CD3+的增殖能力，并使用EdU AF488流式试剂盒通过流式细胞仪测量。使用Pearson相关系数(显示在每个图表上)确定TTV病毒载量(横坐标)和细胞数量或CD3+ T细胞的增殖能力(纵坐标)的相关性。(A)由黑色虚线表示的值-0.5和0.5对应于相关置信区间的界限。所有参数的Pearsonρ和95％置信区间(CI)分别用点和黑线表示。(B、C和D)患者由黑点表示，严重患者由正方形和三角形表示；线性回归用黑线表示。
[图4]：对具有TTV病毒载量极端值的患者进行时间描述性监测。
对患者“A”和患者“B”在HSCT和纳入移植物(inclusion)之间的主要临床阶段(黑色)和感染发作(灰色)的时间顺序描述。患者“A”具有最低的TTV病毒载量，相反地，患者“B”具有最高的TTV病毒载量。
缩写：CMV，巨细胞病毒；EBV，爱泼斯坦-巴尔病毒；HSCT，造血干细胞移植；GvHD，移植物抗宿主病；M，月。
[图5]：TTV病毒载量与自HSCT以来的时间之间的相关性。
41例allo-HSCT接受者血浆中以Log cp/mL表示的TTV病毒载量与HSCT和纳入移植物之间的以月表示的时间间隔之间的详细相关性。使用Pearson相关系数(显示在每个图表上)确定TTV病毒载量(横坐标)和延迟(纵坐标)的相关性。患者用黑点表示，线性回归用黑线表示。
缩写：HSCT，造血干细胞移植；TTV，细环病毒。
具体实施方式
实施例1
在我们的研究中，我们评估和比较了TTV病毒载量与同种异体HSCT(allo-HSCT)接受者在移植后免疫恢复期间的免疫细胞数量和免疫细胞功能之间的相关性。
材料和方法
研究人群
如前所述(13)，从接受allo-HSCT的患者中获得的肝素化全血样品和用EDTA处理的血浆样品从前瞻性组别Vaccheminf中获得。该组别已获得地区审查委员会(Comitédeprotection des personnes Sud-Est V,Grenoble,法国,number69HCL17_0769)的批准，并已在ClinicalTrial.gov注册(NCT03659773)。一旦获得患者的书面同意，在CHU Lyon血液科接受allo-HSCT移植的连续不断的成年患者将被前瞻性地纳入研究。
入院时，使用电子病例报告表(eCRF)记录收集的数据，如人口统计学特征(年龄、性别)和临床数据(移植类型、免疫表型、免疫抑制剂治疗、GvHD状态和GvHD治疗)。
同时，80名健康个体(HV)从Lyon血库(Etablissementdu Sang,EFS)的献血者中招募。根据EFS献血的标准化程序和公共卫生法规R.1243–49ff.的规定，从健康状况良好的人处获得了一份不反对将捐献的血液用于研究目的的书面文件。献血者的年龄和性别被匿名送到研究实验室。从地区伦理委员会(Comitéde protection des personnesSud-Est II,Bron,法国)和法国研究部(Ministry of Higher Education,Research andInnovation,Paris,法国)获得了处理和储存这些样本的监管授权。/>
TTV病毒载量的定量
按照制造商的说明，使用easyMag提取器(bioMérieux，法国)从200μl血浆样品中提取50μL洗脱体积的病毒DNA。如前所述(14，15)，使用TTV试剂盒(bioMérieux,Marcy-l'Etoile,法国)确定TTV的存在和TTV载量。
T细胞增殖试验
通过Ficoll密度梯度离心(U-04；Eurobio,Les Ulis,法国)从肝素化的新鲜血液样品(肝素化的全血)中分离外周血单核细胞(PBMC)。接下来，在37℃、5％ CO2下将105个细胞/孔在96孔细胞培养板中的补充培养基(RPMI 1640；Eurobio)中孵育24小时。然后用有丝分裂原植物血凝素(PHA)以4μg/mL刺激PBMCs两次(R30852801；Remel,Oxoid,ThermoFisher Scientific,美国)并孵育72小时。按照制造商的说明，回收PBMCs的培养上清液，使用ELLA纳米流体系统(ProteinSimple，San Jose，CA，美国)上的Simple Plex试剂盒进行IFNγ分泌测定(IGRA，用于“IFNγ释放测定”)。使用Click-iTTM Plus EdU Alexa FluorTM488流式细胞仪检测试剂盒(C10420；Life Technologies,Carlsbad,CA,美国)分析颗粒中T细胞的增殖，根据公布的方案(16)测量5-乙炔基-2’-脱氧尿苷(EdU)的掺入。简而言之，是通过在BD LSR FortessaTM流式细胞仪(BD Biosciences，San Jose，CA，美国)上进行的流式细胞术分析得到EdU+增殖细胞(在CD3+细胞中)的百分比。每次实验至少测量2.5x103个CD3+细胞。使用BD FACSDiva软件(版本8.0.3，BD Biosciences)分析数据。
移植后T细胞的免疫表型
在Edouard Herriot医院(Hospices Civils de Lyon)的免疫学实验室对白细胞和CD4+和CD8+ T细胞进行计数。此外，通过流式细胞术对全血进行了广泛的T细胞膜标志物测量。以这种方式对以下进行计数：如前所述(14)，幼稚CD4+和CD8+ T细胞(CD45+CCR7+)、中央记忆CD4+和CD8+ T细胞(CD45RA-CCR7+)、效应记忆CD4+和CD8+ T细胞(CD45-CCR7+)和分化记忆CD4+和CD8+ T细胞(CD45RA+CCR7-)。结果以细胞/μL表示。
统计分析
免疫表型数据、TTV病毒载量和T细胞的增殖能力以平均值(范围)表示。转换成对数格式的TTV载量用于分析(Log拷贝数/mL)。使用带有Welch校正的不成对参数t检验计算健康和allo-HSCT接受者之间的差异。使用参数Pearsonρ相关系数评估相关性。进行回归分析以评估因变量(TTV病毒载量)和自变量(增殖细胞百分比、淋巴细胞绝对数量和CD3+ T细胞数量)之间的关联。方差分析使用F检验进行。使用Mann-Whitney检验确定与各种临床特征相关的血浆TTV载量的差异。p<0.05的值被认为是显著的。使用GraphPad软件(版本5；GraphPad软件,La Jolla,CA,美国)和R(版本3.5.1)进行统计分析。
结果
组别的特征
健康志愿者(n＝80)和allo-HSCT接受者(n＝41)在2018年5月至2020年4月之间登记。健康良好个体和allo-HSCT接受者在年龄(中位数[IR]：分别为56[40-64]岁和46[31-53]岁)和性别(性别比分别为1.6和1.4)方面没有显著差异。在登记时，allo-HSCT接受者移植后的中位持续时间为6[5-8]个月。在纳入移植物时，78％的allo-HSCT接受者接受了免疫抑制剂药物(皮质激素、钙调磷酸酶抑制剂等)，17％的接受者患有慢性移植物抗宿主病[表1]。
健康志愿者和allo-HSCT血浆样本中的TTV病毒载量
研究了从80名健康受者和41名allo-HSCT接受者获得的血浆样本中的TTV病毒载量。通过实时PCR在68％的健康样本(54/80)中检测到TTV病毒载量。关于allo-HSCT接受者，研究中包括的所有患者都具有可检测的TTV病毒载量。与健康受试者相比，allo-HSCT接受者的平均(范围)TTV病毒载量显著更高(分别为3.9(0.7-7.7)对2.1(0.5-4.3)Log拷贝数/ml，p<0.0001)[图2]。
TTV病毒载量、T细胞数量与后者增殖能力的相关性。
当考虑到包括移植后6个月的allo-HSCT接受者时，大多数淋巴细胞亚群在正常值(NV)范围内。然而，T细胞CD4+、幼稚CD4+、中央记忆CD4+、终末分化中的效应记忆CD4+、幼稚CD8+和中央记忆CD8+的数量，以及CD4+/CD8+的比率低于正常值(见[表1])。
[表1]allo-HSCT接受者的基线特征
所有的实验室数据都是在接受者登记时记录的。*根据世界卫生组织骨髓和淋巴肿瘤分类2016年修订版。#免疫抑制剂治疗包括：抗胸腺细胞球蛋白、环孢素、他克莫司(tacrolimus)、甲氨蝶呤、霉酚酸吗啉代乙酯、环磷酰胺、皮质类固醇≥1mg/kg>21天。在Edouard Herriot医院(Hospices Civils de Lyon)的免疫学实验室中，使用一组广泛的T细胞膜标志物，通过流式细胞术测量淋巴细胞的亚型和总数。所示正常值由EdouardHerriot医院(Hospices Civils de Lyon)实验室提供。
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缩写：allo，同种异体；DLI，供体淋巴细胞输注；GvHD，移植物抗宿主病；HLA，人类白细胞抗原；HSCT，造血干细胞移植；IR，四分位距；TBI，全身照射；IS，免疫抑制剂；IVIG，静脉注射多克隆免疫球蛋白；MAC，清髓性预处理；NK，自然杀伤；ECP，体外光化学疗法；CR，完全缓解；RIC，
降低强度预处理；NV，正常值。
相对于健康受试者，除了allo-HSCT接受者中CD3+细胞的增殖能力显著降低(分别为40.5％对21.3％，p<0.0001)之外，还可以注意到更大和更显著的异质性分布(allo-HSCT和健康受试者分别为[2.9％对42.3％]和[29.7％对55.3％]；F检验p＝0.0040)，构成allo-HSCT接受者免疫恢复的个体间差异的基础(未以图表显示)。
使用Pearson相关检验(ρ[CI95])，在TTV病毒载量和T细胞的增殖能力之间观察到最高的相关性[图3A]和[图3B]。应当注意，没有观察到与淋巴细胞总数或特定细胞亚群(例如CD3+)的显著相关性(Pearsonρ＝-0.39[CI95％-0.62至-0.09])对(ρ＝0.13[-0.19至0.42])和(ρ＝0.09[-0.23至0.38])[图3C]和[图3D]。
TTV载量极端值患者的临床特征
在个体水平上分析TTV载量和响应PHA刺激的T细胞增殖能力之间的相关性时，我们注意到具有最低病毒载量(0.65Log拷贝数/ml)的患者(A，以正方形表示)具有高百分比的增殖细胞(41.6％)，相反地，具有最高病毒载量(7.72Log拷贝数/ml)的患者(B，以三角形表示)具有低百分比的增殖细胞(2.9％)[图3B]。这两名患者(一名男性和一名女性)属于同一年龄组(50<年龄<60)，在移植前处于完全缓解状态。患者(A)接受了来自基因完全相同的供体的干细胞移植，而患者(B)接受了来自表型完全相同的供体的外周血细胞移植。患者(A)具有简单的移植后进展，在移植和登记之间没有特殊的临床事件，即没有感染发作、没有GvHD以及没有免疫抑制剂治疗[图4]。相反，患者(B)接受了繁琐的免疫抑制剂治疗，并患有急性GvHD和多种严重的细菌/病毒感染[图4]。
讨论
首先，我们比较了两个不同人群(单中心前瞻性组别VaccHemInf的80名免疫活性的健康受试者和41名免疫抑制的allo-HSCT移植受试者)的TTV患病率和血浆中的病毒载量(13)。
根据最近的一项研究(18)，在健康受试者的样本中观察到68％的TTV患病率。相比之下，在来自免疫抑制患者的100％样本中发现了TTV。我们还证实了TTV的血浆病毒载量在allo-HSCT接受者中明显高于HV(10，19)。因此，在allo-HSC移植后6个月，尽管有足够数量的T细胞，一些患者仍不能调节TTV病毒载量。移植后延迟[5-8个月]和血浆TTV病毒载量之间没有相关性。这项研究的主要结果之一是，相对于健康受试者，allo-HSCT接受者(移植后6个月)的TTV血浆病毒载量明显更高，从而证实了Tyagi等人，2013年(移植后延迟未说明)或Masouridi等人，2016年(移植后2-3个月)的观察结果(10，18)。这一结果可以用T细胞是抵抗病毒感染的免疫反应的主要细胞(19，20)，是TTV复制的主要场所之一(21，22)这一事实来解释。在移植后6个月的allo-HSCT接受者中，T细胞的增殖正在进行，因为免疫系统正在恢复，这提供了病毒可以在其中复制的大量细胞。还描述了TTV载量在移植后大约3至6个月达到最大，然后恢复到所谓的正常值(23，24)。因此，可以假设，TTV将利用仍然幼稚且无功能的T细胞的生长，在最终被免疫系统和功能细胞调节之前进行复制，从而表明TTV病毒载量和免疫功能之间的重要联系。这项研究包括对血浆TTV载量和定量标志(免疫细胞计数，已在几项研究中进行了评估，但结果相互矛盾)之间的相关性的评估(17，23-25)，以及对免疫恢复的定性标记(非特异性刺激后T细胞增殖的测量)。没有观察到allo-HSCT移植和登记之间的时间的影响[图5]。尽管异质性T细胞增殖值分布的异质性强调了免疫抑制群体的个体间变异性，但我们观察到TTV病毒载量与T细胞增殖之间的相关性大于与免疫细胞计数的相关性[图3A]。更准确地说，有趣的是，这是一种负相关，表明功能性免疫细胞的数量越多，TTV载量越低。这一结果与2013年De Vlaminck等人在《实体器官移植》中描述的结果一致，其中免疫抑制水平的降低与TTV病毒载量的降低相关。这也对应于移植后TTV病毒载量动力学的许多描述(23，26)，其中最初观察到与免疫抑制剂治疗相关的降低期，随后是与具有复制TTV能力的免疫细胞的扩增相关的生长期，然后是稳定期，最后病毒载量降低至基线水平，这反映了功能性免疫恢复。可以认为，allo-HSCT移植后6个月，将有足够数量的免疫细胞扩增，以允许TTV的显著复制，但它们的功能不足以调节TTV病毒载量。因此，尽管有足够数量的T细胞，免疫抑制患者将不能调节TTV病毒载量。在allo-HSCT接受者中经典描述的其他病毒也是如此，如巨细胞病毒(CMV)或爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)(24，27，28)。在我们的组别中，分别有24％和37％的患者感染了这两种病毒。这也与我们对TTV病毒载量极端值患者的观察结果一致。
TTV病毒载量还与CD8+/CD57+ T细胞的数量有关，CD8+/CD57+ T细胞是一种淋巴细胞亚型，被描述为免疫衰老的潜在标志，并在某些病理过程中增加，如获得性免疫缺陷状态、移植或持续性病毒感染。因此所有这些结果表明，在TTV和免疫系统的功能之间存在潜在的重要联系，特别是在其调节病毒载量的能力的方面。
在我们的研究中，没有观察到各种临床特征(例如状态、基础疾病、免疫抑制剂治疗或GvHD)对TTV载量的影响([表2])。
表[2]41例allo-HSCT接受者的血浆TTV载量与临床特征的比较。
所有的数据都是在接受者登记时记录的。*根据世界卫生组织骨髓和淋巴肿瘤分类2016年修订版。#免疫抑制剂治疗包括：抗胸腺细胞球蛋白、环孢素、他克莫司(tacrolimus)、甲氨蝶呤、霉酚酸吗啉代乙酯、环磷酰胺、皮质类固醇≥1mg/kg>21天。使用Mann-Whitney检验将中位数血浆TTV载量[IR]与临床数据进行比较(***，p<0.001)。
/>
缩写：GvHD，移植物抗宿主病；IR，四分位距；IVIG，静脉注射多克隆免疫球蛋白；MAC，清髓性预处理；RIC，降低强度预处理；TBI，全身照射；TTV，细环病毒。
总之，这项研究证实了TTV病毒载量和T细胞功能之间存在相关性，并表明这种相关性与细胞数量无关。
实施例2
接受来自实施例1的同种异体HSCT(allo-HSCT)的几个患者之间的T细胞数量、所述T细胞的增殖能力和血浆TTV病毒载量之间的比较。
根据与实施例1相同的方案进行TTV病毒载量的定量、CD3+ T细胞的增殖检测和计数。结果如下表3所示。
表[3]血浆TTV病毒载量、CD3+ T细胞数量和所述淋巴细胞增殖能力的比较。
比较TTV病毒载量和CD3+ T细胞的数量，可以看出，对于患者中相似的病毒载量，CD3+ T细胞的数量可能显著不同(患者1对患者2)，相反，对于显著不同的病毒载量(患者3对患者4)，CD3+ T细胞的数量可能相似。因此，这证实了TTV病毒载量与CD3+ T细胞的数量无关。
然而，比较CD3+ T细胞的数量和增殖能力，可以看出在具有相似的CD3+T细胞增殖能力的患者中，所述淋巴细胞的数量可能显著不同(患者1对患者2)。相反，当CD3+ T细胞的数量相似时，增殖能力可能显著不同(患者3对患者4)。
因此，这证实了CD3+ T细胞的数量并不完全与其增殖能力相关，并且与TTV病毒载量相反，高数量的CD3+ T细胞并不表示刺激后所述淋巴细胞的增殖能力，因此也不表示免疫系统的功能性。
事实上，观察TTV病毒载量，可以看出它与CD3+ T细胞的增殖能力呈负相关(患者3对患者4)。
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attttgctac gtcactaacc acgtgacacc cacaggccaa ccgaatgcta tgtcatccat 60
ttcctgggcc gggtctacgt cctcatataa gtaagtgcac ttccgaatgg ctgagttttc 120
cacgcccgtc cgcagcggtg aagccacgga gggagatctc cgcgtcccga gggcgggtgc 180
cgaaggtgag tttacacacc gaagtcaagg ggcaattcgg gctcgggact ggccgggcta 240
tgggcaaggc tctgaaaaaa gcatgtttat tggcaggcat tacagaaaga aaagggcgct 300
gtcactgtgt gctgtgcgaa caacaaagaa ggcttgcaaa ctactaatag taatgtggac 360
cccacctcgc aatgatcaac actaccttaa ctggcaatgg tactcaagta tacttagctc 420
ccacgctgct atgtgcgggt gtcccgacgc tgtcgctcat tttaatcatc ttgcttctgt 480
gcttcgtgcc ccgcaaaacc caccccctcc cggtccccag cgaaacctgc ccctccgacg 540
gctgccggct ctcccggctg cgccagaggc gcccggagat agagcaccat ggcctatggc 600
tggtggcgcc gaaggagaag acggtggcgc aggtggagac gcagaccatg gaggcgccgc 660
tggaggaccc gaagacgcag acctgctaga cgccgtggcc gccgcagaaa cgtaaggaga 720
cgccgcagag gagggaggtg gaggaggaga tataggagat ggaaaagaaa gggcaggcgc 780
agaaaaaaag ctaaaataat aataagacaa tggcaaccaa actacagaag gagatgtaac 840
atagtaggct acatccctgt actaatatgt ggcgaaaata ctgtcagcag aaactatgcc 900
acacactcag acgataccaa ctacccagga ccctttgggg ggggtatgac tacagacaaa 960
tttactttaa gaattctgta tgacgagtac aaaaggttta tgaactactg gacagcatct 1020
aacgaagacc tagacctttg tagatatcta ggagtaaacc tgtacttttt cagacaccca 1080
gatgtagatt ttatcataaa aattaatacc atgcctcctt ttctagacac agaactcaca 1140
gcccctagca tacacccagg catgctagcc ctagacaaaa gagcaagatg gatacctagc 1200
ttaaaatcta gaccgggaaa aaaacactat attaaaataa gagtaggggc accaagaatg 1260
ttcactgata aatggtaccc ccaaacagat ctttgtgaca tggtgcttct aactgtctat 1320
gcaaccgcag cggatatgca atatccgttc ggctcaccac taactgactc tgtggttgtg 1380
aacttccagg ttctgcaatc catgtatgat aaaacaatta gcatattacc agacgaaaaa 1440
tcacaaagag aaattctact taacaagata gcaagttaca ttccctttta taataccaca 1500
caaactatag cccaattaaa gccatttata gatgcaggca atgtaacatc aggcgcaaca 1560
gcaacaacat gggcatcata cataaacaca accaaattta ctacagcaac cacaacaact 1620
tatgcatatc caggcaccaa cagaccccca gtaactatgt taacctgtaa tgactcctgg 1680
tacagaggaa cagtatataa cacacaaatt caacagttac caataaaagc agctaaatta 1740
tacttagagg caacaaaaac cttgctagga aacaccttca caaatgagga ctacacacta 1800
gaatatcatg gaggactgta cagctcaata tggctatccc ctggtagatc ttactttgaa 1860
acaacaggag catatacaga cataaagtac aatccattca cagacagagg agaaggcaac 1920
atgttatgga tagactggct aagcaaaaaa aacatgaact atgacaaagt acaaagtaaa 1980
tgcttaatat cagacctacc tctatgggca gcagcatatg gatatgtaga attttgtgca 2040
aaaagtacag gagaccaaaa catacacatg aatgccaggc tactaataag aagtcccttt 2100
acagacccac aactactagt acacacagac cccacaaaag gctttgttcc ttactcttta 2160
aactttggaa atggtaaaat gccaggaggt agtagtaatg tgcctattag aatgagagct 2220
aaatggtatc caacattatt tcaccagcaa gaagtactag aggccttagc acagtcaggc 2280
ccctttgcat accactcaga cattaaaaaa gtatctctgg gtatgaaata ccgttttaag 2340
tggatctggg gtggaaaccc cgttcgccaa caggttgtta gaaatccctg caaagaaacc 2400
cactcctcgg gcaatagagt ccctagaagc ttacaaatcg ttgacccgaa atacaactca 2460
ccggaactca cattccatac ctgggacttc agacgtggcc tctttggccc gaaagctatt 2520
cagagaatgc aacaacaacc aacaactact gacatttttt cagcaggccg caagagaccc 2580
aggagggaca ccgaggtgta ccactccagc caagaagggg agcaaaaaga aagcttactt 2640
ttccccccag tcaagctcct cagacgagtc cccccgtggg aagactcgca gcaggaggaa 2700
agcgggtcgc aaagctcaga ggaagagacg cagaccgtct cccagcagct caagcagcag 2760
ctgcagcaac agcgaatcct gggagtcaaa ctcagactcc tgttcaacca agtccaaaaa 2820
atccaacaaa atcaagatat caaccctacc ttgttaccaa ggggggggga tctagcatcc 2880
ttatttcaaa tagcaccata aacatgtttg gtgaccccaa accttacaac ccttccagta 2940
atgactggaa agaggagtac gaggcctgta gaatatggga cagacccccc agaggcaacc 3000
taagagatac ccctttctac ccctgggccc ccaaggaaaa ccagtaccgt gtaaacttta 3060
aacttggatt ccaataaagc taggccgtgg gactttcact tgtcggtgtc tgcttataaa 3120
agtaactaag cactccgagc gaagcgagga gtgcgaccct tgggggctca acgccttcgg 3180
agccgcgcgc tacgccttcg gctgcgcgcg gcacctcaga cccccgctcg tgctgacacg 3240
ctcgcgcgtg tcagaccact tcgggctcgc gggggtcggg aaatttacta aacagactcc 3300
gagttgccat tggactcagg agctatgaat cagtaacgaa agtgagtggg gccagacttc 3360
gccataaggc ctttatcttc ttgccatttg tcagtaacag gggtcgccat agacttcggc 3420
ctccacttta ccttgtaaaa actaccaaaa tggccgttcc agtgacgtca cagccgccat 3480
tttaagtagc tgacgtcaag gattgacgta aaggttaaag gtcatcctcg gcggaagcta 3540
cacaaaatgg tggacaacat cttccgggtc aaaggttgtg cgtacgtcac aagtcacgtg 3600
gaggggaccc gctgtaaccc ggaagtaggc cccgtcacgt gacttaccac gtgtgtacac 3660
gtcaccgccg ccattttgtt ttacaaaatg gctgacttcc ttcctctttt ttgaaaaaag 3720
gcgccaaaaa accgtcggcg ggggggccgc gcgctgcgcg cgcggccccc ggggggaggc 3780
attgcctccc ccccccgcgc gcatgcgcgc gggtcccccc ccctccgggg ggctccgccc 3840
cccggccccc ccc 3853

Claims (15)

1.一种用于确定受试者中T细胞增殖能力的方法，该方法包括以下步骤：
a)测量来自所述受试者的生物样品的TTV载量；和
b)根据a)中测量的病毒载量确定T细胞的增殖能力。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于通过TTV序列的扩增、测序或杂交来测量所述TTV载量，优选通过扩增，更优选通过实时PCR。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述生物样品是全血、血浆或血清样品。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于所述步骤b)中的确定包括将a)中测量的TTV载量与参考TTV载量进行比较。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其特征在于所述受试者已接受移植。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述受试者已经接受了造血干细胞移植(HSCT)，优选allo-HSCT。
7.根据权利要求5或6中任一项所述的方法，其特征在于，在移植之前所述受试者已经过预处理，优选清髓或减毒的。
8.监测接受allo-HSCT的受试者中T细胞活性的方法，所述方法包括以下步骤：
a)如权利要求1至6中任一项在第一时间点测量受试者中T细胞的增殖能力；
b)将a)中测量的T细胞的增殖能力与T细胞的参考增殖能力进行比较；和
c)根据步骤b)中的比较确定受试者T细胞活性的变化。
9.监测接受移植的受试者中T细胞活性的方法，所述移植优选HSCT，更优选allo-HSCT，所述方法包括以下步骤：
a)从第一时间点取自患者的生物样品中确定TTV病毒载量；
b)从第二时间点取自患者的生物样品中确定TTV病毒载量，该第二时间点晚于步骤a)中的第一时间点；
c)比较a)和b)中测量的TTV病毒载量；和
d)根据步骤c)中的比较确定患者TTV载量的变化。
10.确定接受allo-HSCT的受试者对微生物感染的易感性的方法，所述方法包括以下步骤：
a)如权利要求1至6中任一项所述在第一时间点测量受试者中T细胞的增殖能力；
b)将a)中测量的T细胞的增殖能力与T细胞的参考增殖能力进行比较；和
c)根据步骤b)中的比较确定受试者对微生物感染的易感性。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述微生物感染是病毒性、细菌性、原虫性或真菌性感染。
12.确定接受allo-HSCT的受试者对移植物抗宿主病(GvHD)易感性的方法，该方法包括以下步骤:
a)如权利要求1至6中任一项所述在第一时间点测量受试者中T细胞的增殖能力；
b)将a)中测量的T细胞的增殖能力与T细胞的参考增殖能力进行比较；和
c)根据步骤b)中的比较确定受试者对GvHD的易感性。
13.根据权利要求8至12中任一项所述的方法，其特征在于所述T细胞的参考增殖能力是健康个体的T细胞的增殖能力或免疫抑制个体的T细胞的增殖能力。
14.根据权利要求8至12中任一项所述的方法，其特征在于所述T细胞的参考增殖能力是在第二时间点测量的受试者中T细胞的增殖能力。
15.测量受试者中TTV载量的变化用于确定所述受试者的T细胞的增殖能力的用途。
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