WO2022091065A1 - 신규한 공결정, 이를 포함하는 약학 조성물 및 이의 제조 방법 - Google Patents

신규한 공결정, 이를 포함하는 약학 조성물 및 이의 제조 방법 Download PDF

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WO2022091065A1
WO2022091065A1 PCT/IB2021/060117 IB2021060117W WO2022091065A1 WO 2022091065 A1 WO2022091065 A1 WO 2022091065A1 IB 2021060117 W IB2021060117 W IB 2021060117W WO 2022091065 A1 WO2022091065 A1 WO 2022091065A1
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niclosamide
cancer
napamostat
diffraction
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최숙
이가행
노동현
박영준
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(주)아이엠디팜
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Definitions

  • Novel cocrystal pharmaceutical composition comprising the same, and method for manufacturing the same ⁇ Novel cocrystal, pharmaceutical compos i t i on comprising the same, and method for the cocrystal ⁇
  • the present invention relates to a novel co-crystal, a pharmaceutical composition comprising the same, and a method for preparing the same, and more particularly, to a co-crystal of nafamostat or a pharmaceutically acceptable salt thereof and niclosamide, including the same It relates to a pharmaceutical composition and a method for preparing the same.
  • a cocrystal is a co-crystal with two or more different drugs or drugs, a hydrogen bond, a van der waals interaction, and A solid with a crystalline orientation that is bound in the same way as the pi interaction ( ⁇ - ⁇ stacking interaction ion). Since these co-crystals form a crystal structure through new hydrogen bonds of two or more molecules, the solubility and dissolution rate of the drug can be changed, and further, the bioavailability can be changed by changing the absorption rate of the drug in the human body. For this reason, the co-crystallization technology is attracting attention in the pharmaceutical or food field for the purpose of improving solubility and oral rate for poorly soluble substances and substances with low bioabsorption rate.
  • Niclosamide is a drug represented by the following formula (1).
  • Niclosamide is prescribed as a method of oral administration of an excess of niclosamide due to its very low water solubility and intestinal permeability and extremely low bioavailability. It is difficult to expect the drug effect by Recently, niclosamide can be used in anticancer therapy for various types of cancer, and it is reported that it can treat corona by inhibiting the endocytosis and delivery process of Corona 19 virus Coronavirus 2019) through endosomal neutralization of cells. Due to the low solubility, there is a limit in obtaining the therapeutic or improving effect thereof.
  • Nafamostat is a drug represented by the following Chemical Formula 2, and is known to have potential antiviral and anticancer effects as well as being used as an anticoagulant for the treatment of pancreatitis. Recently, by inhibiting the activity of TMPRSS2 on the cell surface, it was reported that napamostat is a useful compound for the treatment and prevention of, for example, coronavirus disease 2019 (COVID-19), which requires S protein priming of TMPRSS2. (Ko, M. , Jeon, S., Ryu, WS , & Kim, S. (2020.08.07). Comparat ive analysis of ant iviral efficacy of FDA-approved drugs against SARS-CoV-2 in human lung cells (Journal of medical virology).
  • One object of the present invention is to provide a co-crystal of napamostat or a pharmaceutically acceptable salt thereof and niclosamide, a pharmaceutical composition comprising the same, and a method for preparing the same.
  • Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of cancer or a coronavirus-infected disease, comprising a co-crystal of napamostat or a pharmaceutically acceptable salt thereof and niclosamide.
  • Another object of the present invention is to provide a method for preventing or treating cancer or a coronavirus-infected disease, comprising administering to a subject a co-crystal of napamostat or a pharmaceutically acceptable salt thereof and niclosamide.
  • Another object of the present invention is to provide a use of a co-crystal of nafamostat or a pharmaceutically acceptable salt thereof and niclosamide for the prevention or treatment of cancer or a coronavirus-infected disease.
  • Another object of the present invention is to provide the use of a co-crystal of nafamostat or a pharmaceutically acceptable salt thereof and niclosamide for the manufacture of a medicament for the prevention or treatment of cancer or a coronavirus-infected disease.
  • the co-crystal of the present invention includes nafamostat or a pharmaceutically acceptable salt thereof and niclosamide.
  • the co-crystal of the present invention may be a complex comprising napamostat or a pharmaceutically acceptable salt thereof and niclosamide.
  • the “pharmaceutically acceptable salt” is not particularly limited as long as it is a salt prepared by a conventional method known to those skilled in the art.
  • the pharmaceutically acceptable salt of nafamostat may be a sulfonic acid salt prepared from methanesulfonic acid, ethanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, p-toluenesulfonic acid, naphthalenesulfonic acid, and the like.
  • the co-crystal of the present invention may have a structure in which one molecule of niclosamide or four molecules of niclosamide is combined with one molecule of nafamostat.
  • the co-crystal of the present invention may be co-crystal A including napamostat and niclosamide in a molar ratio of 1:1.
  • the co-crystal of the present invention may be co-crystal B including napamostat and niclosamide in a molar ratio of 1:4.
  • cocrystal A containing napamostat and niclosamide in a molar ratio of 1:1 of the present invention exhibits a differential scanning calorimetry (DSC) endothermic peak at 92.96 to 225.66 um. At this time, the differential scanning calorimetry endothermic peak appears when the temperature increase rate is io °C /min.
  • DSC differential scanning calorimetry
  • the cocrystal B containing napamostat and niclosamide in a molar ratio of 1:4 of the present invention has a differential scanning calorimetry (DSC) at 116.49 to 210.19 Q when the temperature increase rate is 10 °C / min. ) shows an endothermic peak.
  • the powder streak diffraction (XRD) pattern of the co-crystal of the present invention is 9.4367° 11.6241° , 15.1910° , 15.9004° , 16.9252° , 17.7331° , 23.3495° , 25.0048° ,
  • the co-crystal is co-crystal A in which napamostat and niclosamide are included in a molar ratio of 1:1.
  • the powder streak diffraction (XRD) pattern of the co-crystal of the present invention is 7.6434°
  • the co-crystal is co-crystal A in which napamostat and niclosamide are included in a molar ratio of 1:1.
  • the powder X-ray diffraction (XRD) pattern of the co-crystal of the present invention has a diffraction angle of 20 of 9.61405°, 13.6342°, 16.2945°, 19.4476°, 19.8023°, 21.773°, 23.1327°, 26.1478° and 26.5419°.
  • the co-crystal is co-crystal B containing napamostat and niclosamide in a molar ratio of 1:4.
  • the powder X-ray diffraction (XRD) pattern of the present invention is 6.6187°, 8.9637°, 9.61405°, 13.6342°, 14.0283°, 16.2945°, 17.3587°, 19.4476°, 19.8023° , 20.9453° , 21.7730° , 23.1327° , 26.1478° , 26.5419° , 26.6753° , 30.4241° , 31.0547° , 32.9268° , 35.9025° and 39.5285° diffraction angles of 20 (with a peak of 0.2°) include At this time, the co-crystal is co-crystal B containing napamostat and niclosamide in a molar
  • cocrystal A containing napamostat and niclosamide in a molar ratio of 1:1 of the present invention is 1.859% at 75°C or 2.616% at 150 Q ⁇ as a result of thermogravimetric analysis (TGA). has a rate of mass loss.
  • cocrystal B containing napamostat and niclosamide in a molar ratio of 1:4 of the present invention has a mass reduction rate of 2.060% at 150 °C as a result of thermogravimetric analysis (TGA).
  • the method for preparing a co-crystal of napamostat or a pharmaceutically acceptable salt thereof and niclosamide comprises mixing napamostat or a pharmaceutically acceptable salt thereof and niclosamide to form a co-crystal.
  • the step of forming the co-crystal is, Napamostat or a pharmaceutically acceptable salt thereof; and mixing niclosamide in a solvent to prepare a mixed solution; and obtaining a co-crystal from the mixed solution.
  • the mixed solution napamostat or a pharmaceutically acceptable salt thereof and niclosamide are crystallized to obtain a co-crystal, and the co-crystal synthesized in the mixed solution can be separated into a solid phase.
  • the solvent may include a straight-chain or branched-chain alcohol having 1 to 5 carbon atoms, water, or acetone. These can be used in combination of two or more, including necessarily water as a solvent. Examples of alcohols include methanol, ethanol, 2-propanol, n- propanol and the like. For example, as the solvent, ethanol with water or acetone with water may be used. In one embodiment, nafamostat or a pharmaceutically acceptable salt thereof and niclosamide may be mixed in a molar ratio of 1:1 or 1:4. The step of removing the solvent to obtain the co-crystal may include drying the mixed solution under reduced pressure after removing the solvent through filtration.
  • nafamostat mesylate may be used as a salt of nafamostat.
  • Pharmaceutical composition and use The pharmaceutical composition comprising the co-crystal of the present invention as an active ingredient can be prepared as tablets, powders, fine grains, It can be prepared as granules, capsules, pills, solutions, injections, suppositories, ointments and patches and administered orally or parenterally.
  • the dose (therapeutically effective amount) of the co-crystal according to the present invention to a subject may be appropriately determined in consideration of indications, disease severity, weight, age, sex, etc., and administration dose and usage may be changed under various conditions .
  • Pharmaceutically acceptable carriers specifically lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, gum acacia, calcium phosphate, alginate, gelatin, calcium silicate, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidine, cellulose, water, syrup, methyl cellulose, methyl hydroxybenzoate, propyl hydroxybenzoate, talc, magnesium stearate, minerals, or oils.
  • the formulation may be prepared by a conventional method used for formulation in the art, and may be formulated into various formulations according to each disease or component.
  • Liquid compositions for oral administration include pharmaceutically acceptable emulsions, solutions, suspensions, syrups, elixirs, and the like, and commonly used inert diluents, for example, purified water, DMSO, Tween 20, Tween 80 or ethyl alcohol.
  • the composition may contain adjuvants such as solubilizing agents, solubilizing agents, wetting agents, and suspending agents, sweetening agents, flavoring agents, perfuming agents, and preservatives.
  • Injections for parenteral administration may include sterile aqueous or non-aqueous solutions, suspensions, emulsions, and the like.
  • diluent for aqueous solutions and suspensions examples include distilled water for injection and physiological saline.
  • diluents for water-insoluble solutions and suspensions include vegetable oils such as propylene glycol, polyethylene glycol, olive oil and corn oil, alcohols such as ethyl alcohol, and surfactants such as polysorbate 80.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may contain additives such as isotonic agents, preservatives, wetting agents, emulsifying agents, dispersing agents, stabilizing agents, solubilizing agents or solubilizing agents. They can be sterilized by filtration through a bacteria retention filter to sterilize, blending of disinfectants or UV irradiation.
  • a sterile solid composition can be prepared and used by dissolving it in a sterile injectable solvent before use.
  • the co-crystal of niclosamide can be usefully used for the prevention or treatment of cancer or a coronavirus-infected disease.
  • the pharmaceutical composition comprising the co-crystal of the present invention as an active ingredient can be usefully used for the prevention or treatment of cancer or coronavirus-infected diseases.
  • prevention refers to any action that inhibits or delays the invention of a disease by administering the co-crystal of the present invention.
  • the term “treatment” refers to any action in which the symptoms of a suspected disease and the subject of the invention are improved or beneficially changed by administration of the co-crystal of the present invention.
  • the co-crystal of the present invention may be administered to a subject who has developed cancer or a coronavirus-infected disease.
  • the term “subject” refers to all animals, such as rats, mice, and livestock, including humans, and specifically may be mammals including humans, but is not limited thereto.
  • administration means introducing a given substance into a subject by an appropriate method.
  • cancer refers to lung cancer, pancreatic cancer, gastric cancer, myelodysplastic syndrome, acute lymphocytic leukemia (ALL) and acute myeloid leukemia (acute mye 1 oid leukemia: AML), including leukemia, adrenal cancer, Anal cancer, basal squamous cell skin cancer, cholangiocarcinoma, bladder cancer, bone cancer, cerebrospinal tumor, brain cancer, breast cancer, cervical cancer, chronic lymphocytic leukemia (CLL), chronic myelogenous leukemia (CML), chronic myelomonocytic leukemia (CMML), colorectal cancer, Endometrial cancer, esophageal cancer, Ewing's tumor, Eye cancer, gallbladder cancer, gastrointestinal carcinoma, gastrointestinal stromal tumor (GIST), gestational villous disease, glioma, Hodgkin's lymphoma, Kaposi's sarcoma, renal cancer, hypopha
  • the coronavirus infectious disease is a disease caused by coronavirus infection
  • the coronavirus is alpha-coronavirus (J/pAgazaMr/rw) , beta-coronavirus ( ⁇ Bet acoronavi rus) , gamma-coronavirus ⁇ Gammacoronavi rus) or delta-coronavirus (Zfe/AgcoraMyZras).
  • the coronavirus infection disease may be acute respiratory syndrome (Severe Acute Respiratory Syndrome, SARS), and specifically, may be a disease caused by severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2), more specifically coronavirus Infectious Disease - May be 19.
  • the co-crystal of the present invention has excellent antiviral activity against SARS-CoV-2.
  • the co-crystal of the present invention can inhibit the cellular invasion of SARS-CoV-2.
  • the co-crystal of the present invention can prevent or treat coronavirus infection-19 as a disease caused by SARS-CoV-2. Symptoms of SARS-CoV-2 infection may include fever, malaise, cough, shortness of breath, sputum, sore throat, headache, hemoptysis, nausea, gastrointestinal symptoms, kidney disease, respiratory disease, diarrhea, and the like.
  • the present invention nafamostat or a pharmaceutically acceptable salt thereof; And it provides a method for preventing or treating cancer or a coronavirus-infected disease comprising administering a co-crystal of niclosamide to a subject.
  • the method for preventing or treating cancer or a coronavirus-infected disease of the present invention includes nafamostat or a pharmaceutically acceptable salt thereof; And it may be to administer the co-crystal of niclosamide in a therapeutically effective amount.
  • the term "therapeutically effective amount” refers to an amount sufficient to treat a disease at a reasonable benefit/risk ratio applicable to medical treatment and not to cause side effects, which is the sex, age, and weight of the patient.
  • a specific therapeutically effective amount for a particular patient will depend on the type and extent of the response to be achieved, the specific composition, including whether other agents are used, if necessary, the patient's age, weight, general health, sex and diet, time of administration; It is preferable to apply differently depending on various factors including the route of administration and secretion rate of the composition, the duration of treatment, the drug used together or concurrently with the specific composition, and similar factors well known in the pharmaceutical field.
  • the present invention for the prevention or treatment of cancer or a coronavirus-infected disease, nafamostat or a pharmaceutically acceptable salt thereof; and a co-crystal of niclosamide.
  • the present invention nafamostat or a pharmaceutically acceptable salt thereof, for the preparation of a medicament for the prevention or treatment of cancer or a coronavirus-infected disease; and the use of a co-crystal of niclosamide. Matters mentioned in the pharmaceutical composition, treatment method, and use of the present invention are equally applied as long as they do not contradict each other.
  • the present invention by securing a co-crystal of nafamostat or a pharmaceutically acceptable salt thereof with improved stability and water solubility, and niclosamide, it can be usefully used as a complex drug substance.
  • the co-crystal according to the present invention determines the ratio between the equivalent of nafamostat or a pharmaceutically acceptable salt thereof and niclosamide, stirring speed, stirring time, type of stirring solvent, amount of stirring solvent, and stirring solvent in a specific solvent environment.
  • By controlling the co-crystalization it is possible to obtain a novel co-crystal in an optimal ratio with excellent purity and yield.
  • a co-crystal of nafamostat or a pharmaceutically acceptable salt thereof with improved stability and water solubility and niclosamide it is possible to effectively prevent and/or treat cancer or coronavirus-infected diseases.
  • ⁇ Brief Description of Drawings ⁇ 1 is a powder streak diffractogram (XRD) of niclosamide.
  • 2 is a powder streak diffractogram (XRD) of nafamostat mesylate.
  • 3 is a differential scanning calorimetry (DSC) graph of niclosamide.
  • 4 is a DSC graph of nafamostat mesylate.
  • 5 is a TGA graph of niclosamide.
  • 6 is a TGA graph of nafamostat mesylate.
  • 7 is a co-crystal in which napamostat and niclosamide are combined in a molar ratio of 1:1.
  • DSC Differential scanning calorimetry
  • DSC differential scanning calorimetry
  • thermogravimetric analysis (TGA) test graph of (cocrystal A). 12 is a co-crystal in which napamostat and niclosamide are combined in a molar ratio of 1:4;
  • 13 to 16 are diagrams showing the test results of evaluating cell viability using CCK-8 for inhibition of proliferation by the co-crystal according to the present invention using liver cancer, lung cancer, breast cancer and pancreatic cancer cell lines.
  • 17 is a dose-response curve test result for evaluating inhibition of proliferation by a co-crystal according to the present invention using 10 breast cancer cell lines by type.
  • 18 is a schematic diagram illustrating an experimental method for evaluating proliferation inhibition by co-crystals using pancreatic cancer patient cells.
  • 19 is a co-crystal in which napamostat and niclosamide are combined in a molar ratio of 1:1.
  • 21 is a schematic diagram showing an experimental method for verifying the antiviral efficacy of a co-crystal using a SARS-CoV-2 cell infection model.
  • 22 is a co-crystal in which napamostat and niclosamide are combined in a molar ratio of 1:1.
  • Cocrystal A is the result of a dose-response curve test in the SARS-CoV-2 cell infection model.
  • 23 is a co-crystal in which napamostat and niclosamide are combined in a molar ratio of 1:4;
  • the co-crystal of the present invention can be stably supplied as a crystal of an original drug (medicinal raw material) used for the manufacture of a drug, and has excellent storage stability.
  • the difference between the crystalline form of the simple mixture and the co-crystal is clear from the results of differential scanning calorimetry analysis (DSC analysis), thermogravimetric analysis (TGA analysis) and powder X-ray diffraction (PXRD analysis).
  • DSC analysis differential scanning calorimetry analysis
  • TGA analysis thermogravimetric analysis
  • PXRD analysis powder X-ray diffraction
  • co-crystals A and B are characterized by the diffraction angle, heat flow and thermogravimetric measurement results shown in Tables 2, 3, and 4, respectively.
  • the crystal lattice spacing or overall pattern is important in recognizing the identity of crystals due to the characteristics of the data, and heat flow and thermogravimetric measurement results may vary somewhat depending on the direction of crystal growth, particle size, and measurement conditions. It should not be interpreted strictly.
  • the method for preparing a co-crystal according to the present invention includes the step of co-crystallizing by mixing napamostat or a pharmaceutically acceptable salt thereof and niclosamide, wherein the co-crystalization step is a method for producing a co-crystal
  • the co-crystalization step is a method for producing a co-crystal
  • solvent evaporation method solvent evaporation method
  • solvent evaporation method solvent evaporation method
  • it can be prepared by using a crystallization method such as a solvent cooling method (solvent cooling method).
  • a solvent cooling method solvent cooling method
  • napamostat or a pharmaceutically acceptable salt thereof and an alkalizing agent are ground and reacted with a solvent such as a trace amount of distilled water using an instrument such as a pestle and a bowl, followed by a trace amount of acetone or an organic solvent such as alcohol
  • the co-crystal according to the present invention can be synthesized by continuously grinding by adding and niclosamide.
  • amostat or a pharmaceutically acceptable salt thereof and an alkalizing agent are stirred and reacted in a solvent such as distilled water, and then acetone or an organic solvent such as alcohol and niclosamide are added to make a supersaturated solution, and then continuously
  • the co-crystal according to the present invention can be synthesized by stirring.
  • napamostat or a pharmaceutically acceptable salt thereof and an alkalizing agent are stirred and reacted in a first solvent such as distilled water, and then heated in a second solvent such as acetone or alcohol to obtain a cleanly dissolved niclosamide solution.
  • the co-crystal according to the present invention can be synthesized by addition and stirring while evaporating the solvent.
  • a volume ratio of the first solvent and the second solvent may be 10:1 to 1:10.
  • a volume ratio of the first solvent to the second solvent may be 4:1 to 5:1.
  • napamostat or a pharmaceutically acceptable salt thereof and an alkalizing agent are stirred and reacted in a first solvent such as distilled water, and then heated in a second solvent such as acetone or alcohol to dissolve a clean niclosamide solution.
  • the co-crystal according to the present invention can be synthesized by addition and stirring while cooling the solvent.
  • the alkalizing agent may be a basic material such as sodium hydrogen carbonate, sodium carbonate, sodium hydroxide, potassium hydroxide, calcium hydroxide, magnesium hydroxide, and the like, but is not particularly limited thereto.
  • the present invention will be specifically described by way of Examples, but the present invention is not particularly limited by these Examples.
  • the content of each of niclosamide anhydride and nafamostat mesylate, the type and content of the alkalizing agent, the first solvent (solvent (2) ) and the type and content of the second solvent (solvent (1)) may be used according to Table 1 below.
  • Example 1.1 - Cocrystal A (molar ratio of napamostat and niclosamide of 1) Produce Napamostat mesylate 86,332.8 mg was dissolved in 1,950 mL of distilled water at room temperature with stirring at 500 rpm.
  • 12,799.04 mg of sodium hydroxide was dissolved in 50 mL of distilled water at room temperature with stirring at 500 rpm.
  • the obtained sodium hydroxide solution was added to the nafamostat mesylate solution, mixed, and stirred at 500 rpm. When the mixed solution became sufficiently opaque, ethanol was added thereto. Then 16,679.8 uL of phosphate was added followed by 52,339.04 mg of niclosamide anhydride. After vigorous stirring at 4,000 rpm for 3 hours, the solvent was removed by filtration using a vacuum pump and a paper filter. After removing the solvent, it was dried for one day under reduced pressure using a vacuum dryer to obtain a raw material for co-crystals in the form of dry powder (yield 94.94%, content 75.47%).
  • Example 2.3 - Cocrystal B (molar ratio of napamostat to niclosamide: 4) 40,468.5 mg of prepared nafamostat mesylate was dissolved in 1,000 mL of distilled water at room temperature with stirring at 500 rpm.
  • the cleanly dissolved napamostat mesylate solution was filtered using a vacuum pump and a nylon filter of 0.45 iim pore size.
  • 12,601 mg of sodium hydrogen carbonate was dissolved in 500 mL of distilled water at room temperature with stirring at 500 rpm.
  • the cleanly dissolved sodium bicarbonate solution was filtered using a vacuum pump and a nylon filter of 0.45 iim pore size.
  • the filtered sodium bicarbonate solution was mixed with the filtered nafamostat mesylate solution and stirred at 500 rpm for 10 minutes.
  • 98,135.7 mg of niclosamide anhydride was dissolved in 6,500 mL of acetone at 60 °C with stirring at 500 rpm for 1 hour.
  • the cleanly dissolved niclosamide anhydride solution was filtered using a vacuum pump and a 0.45 ym pore size nylon filter.
  • the filtered niclosamide anhydride solution was added to the nafamostat mesylate/sodium hydrogen carbonate mixture, followed by stirring at a speed of 4,000 rpm at room temperature for 1 hour. After stirring, the solvent was removed by filtration using a vacuum pump and a paper filter. After the solvent was removed, it was dried under reduced pressure using a vacuum dryer for one day to obtain a co-crystal raw material in the form of a dry powder.
  • the co-crystal samples of the present invention are co-crystals in dry powder form obtained according to Examples 1.1 and 2.1, respectively, and the comparative samples are niclosamide and nafamostat mesylate, which are raw materials used to form the co-crystals. am.
  • the diffraction angles (20) of the streak diffraction patterns analyzed by PXRD of the co-crystal samples and comparative samples according to Examples 1.1 and 2.1 of the present invention are shown in Tables 3 and 4 below. Table 3]
  • the x-axis is 20 (Bragg angle, unit: °), and the y-axis is the preferred intensity (cps).
  • the process of forming the co-crystal of the co-crystal formers has a non-stoichiometric hydrate, resulting in a misalignment at a distant distance, It can be seen that the diffraction angle 20 shifts. That is, compared with the conventional niclosamide and nafamostat in FIGS. 1 and 2, respectively, through the results of FIGS.
  • the co-crystals of the present invention are a new crystalline form showing a diffraction pattern different from the raw material.
  • a DSC Q2000 System (trade name, TA Instrument, USA) was used as a DSC analysis device, from 0°C to a melting point of 10°C/min. The measurement was carried out while increasing the temperature at a temperature increase rate. At the time of measurement, N 2 gas was supplied at a rate of 50 mL/min, and immediately in an aluminum sample pan. Data were analyzed using Universal Analysis 2000 software (trade name, TA instruments, USA). The heat of fusion values obtained through DSC are shown in Table 5 below.
  • the x-axis represents temperature (unit: °C), and the y-axis represents heat flow (unit: W/g).
  • the differential scanning calorimetry (DSC) endothermic peak at 92.96 to 225.66 Q C in cocrystal A is shown, and 116.49 in cocrystal B It can be confirmed that the differential scanning calorimetry (DSC) endothermic peak is shown at 210.19. That is, when compared with the conventional niclosamide and nafamostat of FIGS. 3 and 4, respectively, through the results of FIGS. 9 and 10, the co-crystals of the present invention are crystals showing new thermodynamic properties different from the raw material. can check Experiment 3 - TGA analysis and results
  • thermogravimetric loss values obtained through TGA are shown in Table 6 below.
  • DMSO and polysorbate 80 were dissolved in purified water to a concentration of 0.5% each. About 10 mL of this solution was placed in a vial, 10 mg each of niclosamide and nafamostat co-crystals were added, and then sonicated for 10 seconds to spread homogeneously. After stirring at room temperature for 24 hours, the sample was filtered to obtain only a dissolved solution. The filtered sample was diluted 2-fold with methanol to prepare a sample solution. The solubility measurement was confirmed through HPLC.
  • the measurement was carried out at 332 nm at 0.7 ml/min for 30 minutes when the injection amount was 20 ul, and a mixture of aqueous ammonium solution and methanol was used as the mobile phase.
  • the analysis conditions are shown in Table 7 below, and the results are shown in Table 8 below.
  • co-crystal A is a co-crystal obtained according to Example 1.1
  • co-crystal B is a co-crystal obtained according to Example 2.1.
  • Two pancreatic cancer cell lines PANC-1, MIAPACA-2
  • MCF-7 breast cancer cell lines
  • MDA- MB-231 two non-small cell lung cancer cell lines
  • Hep-3B, Huh-7 two liver cancer cell lines
  • the co-crystal drug was treated with a total of 6 concentrations of 0.3, 3, 30, 300, 3000, and 30000 ng/mL.
  • single agents Niclosamide and Nafamostat were treated with drugs by setting the amount corresponding to the ratio of each component in the co-crystal.
  • the reagent was reacted for 1 to 4 hours using the CCK-8 assay kit to observe the color change, and the absorbance was measured at 450 nm wavelength with a microreader to measure cell viability.
  • IC50 was derived by measuring cell viability in pancreatic cancer, breast cancer, non-small cell lung cancer, and liver cancer cells. The results are shown in Fig. 13 and Table 10 below.
  • the IC50 of co-crystal A according to the present invention is 355 nM in PANC-1 cells, a pancreatic cancer cell line, 287 nM in MIAPACA-2 cells, and 589 in MCF-7 cells, a breast cancer cell line.
  • the IC50 of the co-crystal was 794 nM in PANC-1 cells, 190 nM in MIAPACA-2 cells, 96 nM in MCF-7 cells, 33 nM in MDA-MB-231 cells, 44 nM in A-549 cells, and H- 1 nM in 1299 cells, 82 nM in Hep-3B cells, and 272 nM in Hu7-7 cells.
  • Luminescent Cell viabi 1 ity assay was performed using Cel ITiter gio by setting each drug in a range of 6 concentrations by 10 fold for each cell line.
  • the drug treatment dose was treated by measuring the mass in ng/ml, and the dose of a single agent was set as a dose corresponding to each co-crystal ratio.
  • the IC50 value was calculated using the luminescence intensity for each drug condition, and the unit was converted to molar concentration.
  • ant i -SARS-CoV-2 nucleocapsid (N) primary antibody was treated, and Alexa Fluor 488 - Cells were stained with conjugated goat ant i -rabbi t IgG secondary antibody and Hoechst 33342. Fluorescence images of infected cells were acquired using a large-capacity image analysis instrument, Operetta (Perkin Elmer).

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Abstract

본 발명의 공결정, 이를 포함하는 약학적 조성물 및 이의 제조 방법에서, 새로운 공결정은 니클로사마이드 및 나파모스타트 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함한다. 본 발명의 새로운 공결정은 우수한 안정성 및 용해도를 가지고, 이의 제조 방법에 따라 우수한 순도 및 수율로 수득할 수 있다. 본 발명의 공결정을 이용하여, 암 또는 코로나바이러스 감염 질환을 효과적으로 예방 및/또는 치료할 수 있다.

Description

【명세서】
【발명의 명칭】 신규한 공결정, 이를 포함하는 약학 조성물 및 이의 제조 방법 {Novel cocrystal , pharmaceutical compos i t i on comprising the same, and method for the cocrystal}
【기술분야】 본 발명은 신규한 공결정, 이를 포함하는 약학 조성물 및 이의 제조 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 나파모스타트 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염과 니클로사마이드의 공결정, 이를 포함하는 약학 조성물 및 이의 제조 방법에 관한 것이다.
【배경기술】 공결정 (cocrystal)은, 서로 다른 2종 이상의 약물들 또는 약물과 공결정 형성자 (co- former)가 수소 결합 (hydrogen bond) , 반데르발스 결합 (van der waals interaction) , 및 파이 상호작용 (冗-冗 stacking interact ion)과 같은 방법으로 결합된 결정성 배향을 갖는 고체를 말한다. 이러한 공결정은 2 분자 이상의 새로운 수소결합을 통해 결정 구조를 이루기 때문에, 약물의 용해도 및 용해 속도를 변화시키고, 나아가 인체 내의 약물의 흡수율을 변화시켜 생체 이용률을 변화시킬 수 있다 . 이러한 이유로 공결정화 기술은 난용성 물질 및 생체 흡수율이 낮은 물질에 대하여 용해도와 경구율을 개선할 목적으로 제약 또는 식품 분야에서 관심을 받고 있다. 니클로사마이드 (Niclosamide)는 하기 화학식 1 로 나타내는 약물이다.
<화학식 1>
Figure imgf000004_0001
니클로사마이드는 수용해도 및 장관투과도가 매우 낮고 생체이용율이 극도로 낮음에 따라 과량의 니클로사마이드를 경구 투여하는 방법으로 처방되고 있지만, 니클로사마이드 자체의 특성에 의해서 근본적으로 약물의 전신노출에 의한 약효를 기대하기 힘들다. 최근에는 니클로사마이드가 다양한 종류의 암에 대한 항암 요법에 사용될 수 있고 , 세포의 엔도좀 중성화를 통해 코로나 19 바이러스 Coronavirus 2019)의 세포 내입 및 전달과정을 억제하여 코로나를 치료할 수 있다고 보고되고 있으나 여전히 낮은 용해도에 의해 이들의 치료 또는 개선 효과를 얻는데 한계가 있는 실정이다. 나파모스타트 (Nafamostat)는 하기 화학식 2 로 나타내는 약물로서, 항응고제로서 췌장염 치료제로 사용될 뿐만 아니라, 잠재적인 항바이러스 및 항암 효과도 있는 것으로 알려져 있다. 최근에는 나파모스타트가 세포 표면의 TMPRSS2의 활동을 억제함으로써 , 예를 들면 TMPRSS2의 S 단백질 프라이밍이 필요한 코로나바이러스 감염증- 19(Coronavirus disease 2019, COVID- 19)의 치료 및 예방에 유용한 화합물인 것을 보고 되고 있다 (Ko, M. , Jeon, S., Ryu, W. S. , & Kim, S. (2020.08.07) . Comparat ive analysis of ant iviral efficacy of FDA- approved drugs against SARS-CoV-2 in human lung cells. Journal of medical virology) .
<화학식 2>
Figure imgf000005_0001
【발명의 상세한설명】
【기술적 과제】 본 발명자들은 니클로사마이드의 낮은 용해도 및 나파모스타트의 낮은 안정성을 향상시킬 수 있는 기술을 개발하고자 연구 및 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 나파모스타트와 니클로사마이드를 포함하면서 안정성과 용해도가 모두 개선된 공결정을 확보할 수 있었으며 이를 통해 본 발명을 완성하게 되었다. 본 발명의 일 목적은 나파모스타트 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염과 니클로사마이드의 공결정 , 이를 포함하는 약학적 조성물 및 이의 제조 방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 나파모스타트 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염과 니클로사마이드의 공결정을 포함하는 , 암 또는 코로나바이러스 감염 질환의 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물을 제공하는 것이다. 본 발명의 또 다른 목적은 나파모스타트 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염과 니클로사마이드의 공결정을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 암 또는 코로나바이러스 감염 질환의 예방 또는 치료 방법을 제공한다. 본 발명의 또 다른 목적은 암 또는 코로나바이러스 감염 질환의 예방 또는 치료를 위한, 나파모스타트 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염과 니클로사마이드의 공결정의 용도를 제공한다 . 본 발명의 또 다른 목적은 암 또는 코로나바이러스 감염 질환의 예방 또는 치료용 약제의 제조를 위한, 나파모스타트 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염과 니클로사마이드의 공결정의 용도를 제공한다 .
【기술적 해결방법】 이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편 , 본 발명에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각에 대한 다른 설명 및 실시형태에도 적용될 수 있다. 즉 , 본 발명에 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기에 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다. 공결정 및 이의 제조 방법 본 발명의 공결정은 나파모스타트 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염과 니클로사마이드를 포함한다 . 본 발명의 공결정은 나파모스타트 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염과 니클로사마이드를 포함하는 복합체일 수 있다 . 나파모스타트 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염에서 , “약학적으로 허용가능한 염 ” 은 당업계의 통상의 기술자에게 공지된 통상적인 방법으로 제조되는 염이면 특별히 제한 되지 않는다. 예를 들어 , 나파모스타트의 약학적으로 허용가능한 염은, 메탄설폰산, 에탄설폰산, 벤젠설폰산, p- 톨루엔설폰산, 나프탈렌설폰산 등으로 제조된 설폰산염일 수 있다. 본 발명의 공결정은 한 분자의 니클로사마이드 또는 네 분자의 니클로사마이드가 한 분자의 나파모스타트와 결합된 구조를 가질 수 있다 . 일 실시 예에서 , 본 발명의 공결정은 나파모스타트와 니클로사마이드가 1：1 의 몰비로 포함된 공결정 A 일 수 있다. 일 실시 예에서 , 본 발명의 공결정은 나파모스타트와 니클로사마이드가 1：4 의 몰비로 포함된 공결정 B 일 수 있다. 일 실시 예에서 , 본 발명의 나파모스타트와 니클로사마이드가 1：1 의 몰비로 포함된 공결정 A는 92.96 내지 225.66 으仁에서 시차주사열량 (DSC) 흡열 피크를 나타낸다. 이때 , 시차주사열량 흡열 피크는 승온속도가 io °C /min 인 경우에 나타나는 것이다. 일 실시 예에서 , 본 발명의 나파모스타트와 니클로사마이드가 1：4 의 몰비로 포함된 공결정 B 는 승온 속도가 10 °C /min 인 경우 , 116.49 내지 210.19 Q으 에서 시차주사열량 (DSC) 흡열 피크를 나타낸다. 일 실시 예에서 , 본 발명의 공결정의 분말 오선 회절 (XRD) 패턴은 9.4367° 11.6241° , 15.1910° , 15.9004° , 16.9252° , 17.7331° , 23.3495° , 25.0048° ,
25.6551° 및 27.2514° 의 회절각 20 (士 0.2。 ) 값에서 나타내는 회절 피크를 포함한다. 이때 , 공결정은 나파모스타트와 니클로사마이드가 1：1 의 몰비로 포함된 공결정 A 이다. 일 실시 예에서 , 본 발명의 공결정의 분말 오선 회절 (XRD) 패턴은 7.6434° ,
9.4367° , 10.9541° 11.6241° , 12.7868° , 15.1910° , 15.9004° , 16.9252°
17.7331° , 18.4229° , 19.1717° , 20.0191° , 21.0044° , 22.5809° , 23.3495° ,
23.7830° , 25.0048° , 25.6551° , 26.3843° , 27.2514° , 28.7096° , 30.0694° ,
31.7642° , 33.9516 , 및 35.3310° 의 회절각 20 (士 0.2。 ) 값에서 나타내는 회절 피크를 포함한다. 이때 , 공결정은 나파모스타트와 니클로사마이드가 1：1 의 몰비로 포함된 공결정 A 이다. 일 실시 예에서 , 본 발명의 공결정의 분말 X 선 회절 (XRD) 패턴은 9.61405° , 13.6342° , 16.2945° , 19.4476° , 19.8023° , 21.773° , 23.1327° , 26.1478° 및 26.5419° 의 회절각 20 (士 0.2。 ) 값에서 나타내는 회절 피크를 포함한다. 이때 , 공결정은 나파모스타트와 니클로사마이드가 1：4 의 몰비로 포함된 공결정 B 이다. 일 실시 예에서 , 본 발명의 분말 X 선 회절 (XRD) 패턴은 6.6187° , 8.9637° , 9.61405° , 13.6342° , 14.0283° , 16.2945° , 17.3587° , 19.4476° , 19.8023° , 20.9453° , 21.7730° , 23.1327° , 26.1478° , 26.5419° , 26.6753° , 30.4241° , 31.0547° , 32.9268° , 35.9025° 및 39.5285° 의 회절각 20 (士 0.2。 ) 값에서 나타내는 회절 피크를 포함한다. 이때 , 공결정은 나파모스타트와 니클로사마이드가 1：4 의 몰비로 포함된 공결정 B 이다. 일 실시 예에서 , 본 발명의 나파모스타트와 니클로사마이드가 1：1 의 몰비로 포함된 공결정 A 는 열중량 분석 (TGA) 결과로 75 으 C 에서 1.859 % 또는 150 Q仁에서 2.616 %의 질량감소율을 갖는다. 일 실시 예에서 , 본 발명의 나파모스타트와 니클로사마이드가 1：4 의 몰비로 포함된 공결정 B 는 열중량 분석 (TGA) 결과로 150 으 C 에서 2.060 %의 질량감소율을 갖는다. 본 발명에서 , 나파모스타트 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염과 니클로사마이드의 공결정의 제조 방법은 , 나파모스타트 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염과 니클로사마이드를 혼합하여 공결정을 형성하는 단계를 포함한다. 일 실시 예에서 , 상기 공결정을 형성하는 단계는 , 나파모스타트 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 ; 및 니클로사마이드를 용매에서 혼합하여 혼합 용액을 제조하는 단계 ; 및 상기 혼합 용액으로부터 공결정을 얻는 단계를 포함한다. 일례로, 상기 혼합 용액 내에서 나파모스타트 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염과 니클로사마이드가 결정화되어 공결정을 얻을 수 있고 , 상기 혼합 용액 내에서 합성된 공결정을 고체 상으로 분리해낼 수 있다. 상기 용매는 직쇄 또는 분지쇄의 탄소수 1 내지 5 를 갖는 알코올, 물 또는 아세톤을 포함할 수 있다. 이들은 물을 용매로서 반드시 포함하여 2 이상을 조합하여 이용할 수 있다. 알코올의 예로서는 , 메탄올, 에탄올, 2 -프로판올, n- 프로판올 등을 들 수 있다. 일례로, 상기 용매로서는 물과 함께 에탄올을 이용하거나, 물과 함께 아세톤을 이용할수 있다. 일 실시예에서, 나파모스타트 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염과 니클로사마이드는 1：1 또는 1：4의 몰 비로혼합될 수 있다. 상기 용매를 제거하여 공결정을 얻는 단계는, 상기 혼합 용액을 여과를 통해 용매를 제거한후 감압조건에서 건조 시키는 단계를 포함할수 있다. 건조 공정을 통해서 최종적으로고체 상의 공결정 분말을 얻을수 있다. 일 실시예에서, 나파모스타트의 염으로서 나파모스타트 메실산염을 이용할 수 있다. 약학적 조성물 및 용도 본 발명의 공결정을 유효 성분으로서 포함하는 약학적 조성물은, 통상적으로 사용되고 있는 약학적으로 허용 가능한 제제용의 담체나 부형제, 그 밖의 첨가제를 이용하여 정제, 산제, 세립제, 과립제, 캡슐제, 환제, 액제, 주사제, 좌제, 연고 및 첩부제 등으로 제조되어 경구적 또는 비경구적으로 투여될 수 있다. 본 발명에 따른 공결정을 대상체에 대한 투여량 （치료 유효량）은 적응증, 질환의 중증도, 체중, 연령, 성별 등을 고려하여 적절하게 결정될 수 있으며, 투여 용량 및 용법은 여러 가지 조건으로 변동될 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체는, 구체적으로 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알지네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로오스, 폴리비닐피롤리딘, 셀룰로오스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로오스, 메틸 히드록시벤조네이트, 프로필 히드록시벤조네이트, 활석, 스테아르산 마그네슘, 미네랄, 또는 오일일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 제제는 당업계에서 제제화에 사용되는 통상의 방법으로 제조될 수 있으며 , 각 질환또는 성분에 따라다양한 제제로 제제화될 수 있다. 경구 투여를 위한 액체 조성물은, 약제적으로 허용되는 유탁제, 용액제, 현탁제, 시럽제, 엘릭실제 등을 포함하며, 일반적으로사용되는 불활성인 희석제, 예를 들면 정제수, DMSO, Tween 20, Tween 80 또는 에틸알콜을 포함할 수 있다. 당해 조성물은 불활성인 희 석제 이외에 가용화제 , 용해보조제 , 습윤제 , 현탁제와 같은 보조제, 감미제, 풍미제, 방향제, 방부제를 함유할수 있다. 비경구 투여를 위한 주사제로서는, 무균의 수성 또는 비수성의 용액제, 현탁제, 유탁제 등을 포함할 수 있다. 수성의 용액제, 현탁제의 희석제로서는, 예를 들면 주사제용 증류수, 생리식염수 등을 들 수 있다. 비수용성의 용액제, 현탁제의 희석제로서는 예를 들면 프로 필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브유, 콘 오일 등과 같은 식물유, 에틸알콜과 같은 알코올류, 폴리솔베이트 80과 같은 계면활성제 등이 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 등장화제, 방부제, 습윤제, 유화제, 분산제, 안정화제, 가용화제 또는 용해보조제와 같은 첨가제를 포함할 수 있다. 이들은 무균화 하기 위해 박테리아 보류 필터를 통과시키는 여과, 살균제의 배합 또는 자외선 조사에 의해서 무균화 될 수 있다. 또한, 본 발명에서는 무균의 고체 조성물을 제조하여 사용 전에 무균화된 주사용 용매에 용해시켜 사용할수 있다. 본 발명의 나파모스타트 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염; 및 니클로사마이드의 공결정은 암 또는 코로나바이러스 감염 질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다. 본 발명의 공결정을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물은 암 또는 코로나바이러스 감염 질환의 예방또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다. 본 발명의 용어, “예방” 은 본 발명의 공결정의 투여에 의해 질환의 발명을 억제시키거나지연시키는 모든 행위를 의미한다. 본 발명의 용어, “치료” 는 본 발명의 공결정의 투여에 의해 질환의 의심 및 발명 대상체의 증상이 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다. 본 발명의 공결정은 암 또는 코로나바이러스 감염 질환이 발병된 대상체에 투여되는 것일 수 있다. 본 발명의 용어, "대상체"는 인간을 포함한 쥐, 생쥐, 가축 등의 모든 동물을 의미하며, 구체적으로 인간을 포함하는 포유동물일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 용어, "투여"는 적절한 방법으로 대상체에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미한다. 본 발명에서, “암” 은 폐암, 췌장암, 위암, 골수이형성 증후군, 급성 림프구성 백혈병 (acute lymphocytic leukaemia： ALL) 및 급성 골수성 백혈병 (acute mye 1 o i d leukaemia： AML)을 포함하는 백혈병 , 부신암, 항문암, 기저 편평세포 피부암, 담관암, 방광암, 골암, 뇌척수종양, 뇌암, 유방암, 자궁경부암, 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 만성 골수성 백혈병 (CML), 만성 골수단핵구 백혈병 (CMML), 결장직장암, 자궁내막암, 식도암, 유잉 계열 종양, 눈암, 담낭암, 위장 유암종, 위장관 기질 종양 (가스 trointestinal stromal tumour : GIST), 임신융모질환, 신경교종, 호지킨 림프종, 카포시 육종, 신장 암, 하인두암, 간암, 폐유암종, 피부 T세포 림프종을 포함하는 림프종, 악성 중피종, 흑색종 피부암, 머켈 세포 피부 암, 다발성 골수종, 비강 및 부비강암, 비인두암, 신경모세포종, 비호 ■지킨 림프종, 비소세포 폐암, 구강 및 구인두암, 골육종, 난소암, 음경암, 뇌하수체 종양, 전립선암, 망막모세포종, 횡문근육종, 침샘암, 피부 암, 소세포 폐암, 소장 암, 연조직 육종, 고환암, 흉선암, 미분화 갑상선암을 포함하는 갑상선암, 자궁육종, 질 암, 외음부 암, 발텐스트롬 마크로글로불린혈증, 윌름스 종양등을 포함할수 있다. 본 발명에서, 코로나바이러스 감염 질환은 코로나바이러스 감염에 의해 유발되는 질환으로서 , 코로나바이러스는 알파-코로나바이러스 (J/pAgazaMr/rw) , 베타-코로나바이러스 (、Bet acoronavi rus) , 감마-코로나바이러스｛Gammacoronavi rus) 또는 델타-코로나바이러스 (Zfe/AgcoraMyZras)를포함할수 있다. 상기 코로나바이러스 감염 질환은 급성 호흡기 증후군 (Severe Acute Respiratory Syndrome, SARS) 일 수 있고, 구체적으로, 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 2(SARS- CoV- 2)에 의한 질환일 수 있고, 보다 구체적으로 코로나바이러스 감염증- 19일 수 있다. 본 발명의 공결정은 SARS- CoV- 2에 대한 항바이러스 활성이 우수한 것이 확인되었다. 본 발명의 공결정은 SARS- CoV- 2의 세포 침입을 억제할 수 있다. 본 발명의 공결정은 SARS-CoV-2 에 의한 질환으로서 코로나바이러스 감염증- 19을 예방또는 치료할수 있다 . SARS-CoV-2 감염 질환의 증상은 발열, 권태감, 기침, 호흡곤란, 가래, 인후통, 두통, 객혈, 오심, 위장관 증상, 신장질환, 호흡기 질환, 설사 등일 수 있다. 본 발명은, 나파모스타트 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염; 및 니클로사마이드의 공결정을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 암 또는 코로나바이러스 감염 질환의 예방또는 치료방법을 제공한다. 본 발명의 암 또는 코로나바이러스 감염 질환의 예방 또는 치료 방법은 나파모스타트 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염; 및 니클로사마이드의 공결정을 치료학적으로유효한 양으로투여하는 것일 수 있다. 본 발명의 용어, "치료학적으로 유효한 양"이란 의학적 치료에 적용가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분하며 부작용을 일으키지 않을 정도의 양을 의미하며, 이는 환자의 성별, 연령, 체중, 건강상태, 질병의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 방법, 투여 시간, 투여 경로, 배출 비율, 치료 기간, 배합 또는 동시에 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 당업자에 의해 결정될 수 있다. 특정 환자에 대한 구체적인 치료적 유효량은 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 경우에 따라 다른 제제가 사용되는지의 여부를 비롯한 구체적 조성물, 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 구체적 조성물과 함께 사용되거나 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자와 의약 분야에 잘 알려진 유사 인자에 따라 다르게 적용하는 것이 바람직하다. 본 발명은 , 암 또는 코로나바이러스 감염 질환의 예방 또는 치료를 위한, 나파모스타트 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 ; 및 니클로사마이드의 공결정의 용도를 제공한다. 본 발명은 , 암 또는 코로나바이러스 감염 질환의 예방 또는 치료용 약제의 제조를 위한, 나파모스타트 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 ; 및 니클로사마이드의 공결정의 용도를 제공한다 . 본 발명의 약학적 조성물 , 치료 방법 및 용도에서 언급된 사항은 서로 모순되지 않는 한 동일하게 적용된다.
【발명의 효과】 본 발명에 따르면 , 안정성과 수용해도가 개선된 나파모스타트 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염과 니클로사마이드의 공결정을 확보함으로써 복합체 원료 의약품으로 유용하게 사용할 수 있다. 본 발명에 따른 공결정은 특정 용매환경에 나파모스타트 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염과 니클로사마이드의 당량, 교반 속도, 교반 시간, 교반 용매의 종류 , 교반 용매의 양, 교반 용매 간의 비율을 조절하여 공결정화 시킴으로써 최적 비율의 신규 공결정을 우수한 순도 및 수율로 수득할 수 있다. 안정성과 수용해도가 개선된 나파모스타트 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염과 니클로사마이드의 공결정을 이용하여 , 암 또는 코로나바이러스 감염 질환을 효과적으로 예방 및/또는 치료할 수 있다.
【도면의 간단한 설명】 도 1은 니클로사마이드의 분말오선 회절도 (XRD)이다. 도 2는 나파모스타트 메실산염의 분말오선 회절도 (XRD)이다. 도 3은 니클로사마이드의 시차주사열량계 (DSC) 그래프이다 . 도 4는 나파모스타트 메실산염의 DSC 그래프이다 . 도 5는 니클로사마이드의 TGA그래프이다 . 도 6은 나파모스타트 메실산염의 TGA그래프이다 . 도 7은 나파모스타트와 니클로사마이드가 1：1의 몰 비로 결합한 공결정
(공결정 A)의 분말오선 회절도이다. 도 8은 나파모스타트와 니클로사마이드가 1：4의 몰 비로 결합한 공결정
(공결정 B)의 분말오선 회절도이다. 도 9는 나파모스타트와 니클로사마이드가 1:1의 몰 비로 결합한 공결정
(공결정 A)의 시차주사열량계 (DSC) 그래프이다 . 도 10은 나파모스타트와 니클로사마이드가 1：4의 몰 비로 결합한 공결정
(공결정 B)의 시차주사열량계 (DSC) 그래프이다. 도 11은 나파모스타트와 니클로사마이드가 1：4의 몰 비로 결합한 공결정
(공결정 A)의 열중량분석기 (TGA) 시험 그래프이다. 도 12는 나파모스타트와 니클로사마이드가 1：4의 몰 비로 결합한 공결정
(공결정 B)의 열중량분석기 (TGA) 시험 그래프이다. 도 13 내지 도 16은 간암, 폐암, 유방암 및 췌장암 세포주를 이용하여 본 발명에 따른 공결정에 의한 증식 억제를 CCK-8을 이용하여 세포생존율을 평가한 시험 결과를 나타낸 도면들이다. 도 17 은 유형별 유방암 세포주 10 종을 이용하여 본 발명에 따른 공결정에 의한 증식 억제를 평가한 용량-반응 곡선 시험 결과이다. 도 18 은 췌장암 환자 세포를 이용하여 공결정에 의한 증식 억제를 평가하기 위한 실험 방법을 나타낸 모식도이다. 도 19 는 나파모스타트와 니클로사마이드가 1：1 의 몰 비로 결합한 공결정
（공결정 A）의 췌장암 organoi d mode l 에서 세포 생존력을 즉정한 공결정 농도별 ce l l vi abi 1 i ty (%) 시험 결과이다. 도 20 은 나파모스타트와 니클로사마이드가 1：4 의 몰 비로 결합한 공결정
（공결정 B）의 췌장암 organoi d mode l 에서 세포 생존력을 즉정한 공결정 농도별 ce l l vi abi 1 i ty （%） 시험 결과이다. 도 21 은 SARS-CoV-2 세포 감염모델을 이용해 공결정의 항바이러스 효능 검증을 위한 실험 방법을 나타낸 모식도이다. 도 22 는 나파모스타트와 니클로사마이드가 1：1 의 몰 비로 결합한 공결정
（공결정 A）의 SARS- CoV- 2 세포 감염 모델에서 용량-반응 곡선 시험 결과이다. 도 23 은 나파모스타트와 니클로사마이드가 1：4 의 몰 비로 결합한 공결정
（공결정 B）의 SARS- CoV- 2 세포 감염 모델에서 용량-반응 곡선 시험 결과이다. 도 24 는 본 발명의 공결정 A , B 의 처리 농도별 SARS- CoV- 2 에 감염된 세포 현미경 촬영 사진이다.
【발명의 실시를 위한 형태】 이하, 본 발명을 실시하기 위한 형태를 구체적으로 설명한다. 본 발명의 발명자들은 나파모스타트와 니클로사마이드의 몰 비가 1：1인 공결정 A 와 나파모스타트와 니클로사마이드의 몰 비가 1：4 인 공결정 으 을 개발하였으며, 공결정 형성을 확인하기 위해 아래와 같이 얻어진 결과물을 다양한 분석 방법으로 분석하였다. 본 발명의 공결정에 있어서는, 상기한 바와 같이 일정한 품질을 갖는 단일의 공결정이 재현성이 양호하게 수득된다. 또한, 본 발명의 공결정은 의약의 제조에 사용되는 원약（의약원료 물질）의 결정으로서 안정적으로 공급할 수 있고 보존 안정성이 우수하다. 단순 혼합물과 공결정의 결정형의 차이는 시차주사열량계 분석 （DSC 분석） , 열중량 분석 （TGA 분석） 및 분말 X선 회절 （PXRD분석）의 결과로부터 명확하다고 할 수 있다. 니클로사마이드 및 나파모스타트 메실산염은 표 1, 도 1 및 도 2 에 기재되는 PXRD 회절각 및 상대 강도에 의해서 특정된다. 이와 대조적으로, 본 발명의 공결정으로서 , 공결정 A 및 공결정 B는 표 2, 표 3 및 표 4 각각에 기재되는 회절각, 열흐름 및 열중량 측정결과 의하여 특정 지어진다. 또한 XRD 회절은 데이터 특성상, 결정의 동일성 인정에 있어서는 결정 격자 간 격이나 전체적인 패턴이 중요하고, 열흐름 및 열중량 측정결과는 결정 성장의 방향, 입자의 크기, 측정 조건에 따라 다소 변할 수 있기 때문에 엄밀하게 해석되어서는 안 된다. 본 발명에 따른 공결정의 제조 방법은, 나파모스타트 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 및 니클로사마이드를 혼합하여 공결정화시키는 단계를 포함한고, 이때의 공결정화시키는 단계는, 공결정의 제조 방법으로 알려진 다양한 방법으로 수행될 수 있다. 예를 들어 , 본 발명에 따른 공결정 A및 으는 각각 독립적으로 액체 보조 연삭법 (liquid-assisted grinding), 슬러리법
(slurry method) , 용매 증발법 (solvent evaporation method) , 용매 냉각법 (solvent cooling method) 등의 결정화 방법을 활용해 제조할 수 있다. 액체 보조 연삭법에서는, 나파모스타트 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염과 알칼리화제를 미량의 증류수 등의 용매와 함께 막자와 사발과 같은 기구를 사용해 갈아서 반응시킨 뒤 미량의 아세톤 혹은 알코올류의 유기용매와 니클로사미드를 첨가하여 지속적으로 갈아서 본 발명에 따른 공결정을 합성할 수 있다. 슬러리 법에서는, 나파모스타트 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염과 알칼리화제를 증류수 등의 용매에서 교반하여 반응시킨 뒤 아세톤 혹은 알코올류의 유기용매와 니클로사미드를 첨가하여 과포화 용액으로 만든 뒤 지속적으로 교반하여 본 발명에 따른 공결정을 합성할 수 있다. 용매 증발법에서는, 나파모스타트 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염과 알칼리화제를 증류수 등의 제 1 용매에서 교반하여 반응시킨 뒤 아세톤 혹은 알코올류의 제 2 용매에서 가열하여 깨끗하게 녹인 니클로사미드 용액을 첨가하고 용매를 증발시키면서 교반하여 본 발명에 따른 공결정을 합성할 수 있다. 상기 제 1 용매와 제 2 용매의 부피비는 10：1 내지 1：10일 수 있다. 일례로, 상기 제 1 용매와 제 2 용매의 부피비는 4：1 내지 5：1일 수 있다. 용매 냉각법에서는, 나파모스타트 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염과 알칼리화제를 증류수 등의 제 1 용매에서 교반하여 반응시킨 뒤 아세톤 혹은 알코올류의 제 2 용매에서 가열하여 깨끗하게 녹인 니클로사미드 용액을 첨가하고 용매를 냉각시키면서 교반하여 본 발명에 따른 공결정을 합성할 수 있다. 상기 방법들에서 , 알칼리화제로는 탄산수소나트륨, 탄산나트륨, 수산화나트륨, 수산화칼륨, 수산화칼슘, 수산화마그네슘 등의 염기성 물질을 이용할 수 있고, 특별히 이에 제한되지 않는다. 이하에서는 본 발명을 실시예에 의해 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이러한 실시예에 의해 특별히 제한되는 것은 아니다. 일 실시예에서 , 본 발명에 따른 공결정 A를 슬러리 법을 통해서 합성하는 경우, 니클로사미드 무수물 및 나파모스타트 메실산염 각각의 함량, 알칼리화제의 종류 및 함량, 제 1 용매 (용매 (2)) 및 제 2 용매 (용매 (1))의 종류 및 함량은 하기 표 1에 따라 이용될 수 있다.
[표 1]
Figure imgf000020_0001
일 실시예에서, 본 발명에 따른 공결정 B 를 용매 냉각법을 통해서 합성하는 경우, 니클로사미드 무수물 및 나파모스타트 메실산염 각각의 함량, 알칼리화제의 종류 및 함량, 제 1 용매 (용매 (2)) 및 제 2 용매 (용매 (1))의 종류 및 함량은 하기 표 2에 따라 이용될 수 있다.
[표 2]
Figure imgf000021_0002
이하, 표 1의 실시예 1.1와 표 2의 실시예 2.1 및 실시예 2.3에 따라 공결정의 제조 방법 및 이를 통해 얻은 공결정의 분석 실험과 그 결과에 대해서 보다 구체적으로 설명한다. 실시예 1.1 - 공결정 A (나파모스타트와 니클로사마이드의 몰 비 1)의
Figure imgf000021_0001
제조 나파모스타트 메실산염 86,332.8 mg을 상온에서 증류수 1,950 mL에 500 rpm으로 교반 하며 용해시켰다. 또한, 수산화나트륨 12,799.04 mg을 상온에서 증류수 50 mL에 500 rpm으로교반 하며 용해시켰다. 얻어진 수산화나트륨 용액을 나파모스타트 메실산염 용액에 첨가하여 혼합하고 , 500 rpm으로 교반 하였다. 혼합된 용액이 충분히 불투명해졌을 때, 여기에 에탄올 8므를 첨가하였다. 이어서 , 인산염 16,679.8 uL를 첨가하였고, 이어서 니클로사마이드 무수물 52,339.04 mg을 첨가하였다. 3시간 동안 4,000 rpm으로 강하게 교반한 후 진공 펌프와 종이 필터를 사용하여 여과하여 용매를 제거하였다. 용매 제거 후 진공 건조기를 사용하여 감압 조건에서 하룻동안 건조하여 건조 분말 형태의 공결정 원료（수율 94.94%, 함량 75.47%）를 얻었다. 실시예 2.1 - 공결정 B （나파모스타트와 니클로사마이드의 몰 비 =1：4）의 제조 나파모스타트 메실산염 40,468.5 mg을 상온에서 증류수 l,000mL에 500 rpm으로 교반 하며 용해시켰다. 또한, 탄산수소나트륨 12,601 mg을 상온에서 증류수 500 mL에 500 rpm으로 교반 하며 용해시켰다. 얻어진 탄산수소나트륨 용액을 나파모스타트 메실산염 용액에 첨가하여 혼합하고 500 rpm 으로 교반하였다. 혼합된 용액이 불투명해졌을 때 , 에탄올 6,500 mL를 첨가하였다. 에탄올 첨가후, 니클로사마이드 무수물 98,135.7 mg을 첨가하였고, 3시간 동안 4,000 rpm으로 강하게 교반 하였고, 진공 펌프와 종이 필터를 사용하여 여과하여 용매를 제거하였다. 용매 제거 후 진공 건조기를 사용하여 감압 조건에서 하룻동안 건조하여 건조 분말 형태의 공결정 원료（수율 88.27%, 함량 100.4%）를 얻었다. 실시예 2.3 - 공결정 B（나파모스타트와 니클로사마이드의 몰 비 ：4）의
Figure imgf000023_0001
제조 나파모스타트 메실산염 40,468.5mg 을 상온에서 증류수 l,000mL 에 500 rpm으로 교반 하며 용해시켰다. 깨끗하게 녹은 나파모스타트 메실산염 용액을 진공 펌프와 0.45 iim pore size의 나일론 필터를 이용하여 여과하였다. 또한, 탄산수소나트륨 12,601 mg을 상온에서 증류수 500mL에 500 rpm으로 교반 하며 용해시켰다. 깨끗하게 녹은 탄산수소나트륨 용액을 진공 펌프와 0.45 iim pore size 의 나일론 필터를 이용하여 여과하였다. 여과된 탄산수소나트륨 용액을 여과된 나파모스타트 메실산염 용액과혼합하고 500 rpm으로 10분간 교반하였다. 니클로사미드 무수물 98,135.7 mg 을 60 °C에서 아세톤 6,500mL 에 500 rpm으로 1시간 동안교반 하며 용해시켰다. 깨끗하게 녹은 니클로사미드 무수물 용액을 진공 펌프와 0.45 ym pore size의 나일론 필터를 이용하여 여과하였다. 여과된 니클로사미드 무수물 용액을 나파모스타트 메실산염 /탄산수소나트륨 혼합물에 첨가하였고, 이어서 4,000 rpm 의 속도로 상온에서 1 시간 동안 교반하였다. 교반 후 진공 펌프와 종이 필터를 사용하여 여과하여 용매를 제거하였고, 용매 제거 후 진공 건조기를 사용하여 감압 조건에서 하룻동안 건조하여 건조분말 형태의 공결정 원료를 얻었다. 실험 1 - PXRD분석 및 결과 분말 오선 회절 (PXRD) 분석 장치로 D8 ADVANCE with Davinci (상품명, Bruker AXS Inc, GmbH, 독일)를 사용하여 하기 조건에서 본 발명의 실시예 1.1 및 실시예 2.1에 따른공결정 샘플들과 비교 샘플들 각각에 대해서 측정하였다. 검출기 : 고속 LynxEye 검출기 , 관구: Cu, 관 전류: 40mA, 관 전압: 40 kV, 샘플링 폭: 0.020 ° , 주사 속도: 0.1 sec/step, 파장: 1.54056 A, 측정 회절각 범위 (20)： 2.5 에서 40 ° 본 발명의 공결정 샘플들은 각각 실시예 1.1 및 실시예 2.1에 따라 얻은 건조 분말 형태의 공결정이고, 비교샘플들은 공결정을 형성하기 위해 이용한 원료물질인 니클로사마이드 및 나파모스타트 메실산염이다. 본 발명의 실시예 1.1 및 실시예 2.1에 따른 공결정 샘플들 및 비교샘플들의 PXRD를 분석된 오선 회절 패턴의 회절각 (20)은 하기 표 3 및 표 4에 나타낸다. 표 3]
Figure imgf000024_0001
Figure imgf000025_0001
[표 4]
Figure imgf000026_0001
도 1, 도 2, 도 7 및 도 8에서 , x축은 20 (Bragg angle, 단위 : ° )이고, y축은 우선의 강도 (cps)이다. 표 3 및 표 4를 도 1, 도 2, 도 7 및 도 8과 함께 참조하면, 공결정 형성자들의 공결정을 형성하는 과정은 비화학량론적인 수화물을 가짐으로써, 먼 간격에 어긋남이 생기며, 회절각 (20)이 시프트하는 현상이 나타났음을 확인할 수 있다. 즉, 도 1 및 도 2의 기존의 니클로사마이드 및 나파모스타트 각각과 비교하였을 때, 도 7 및 도 8 의 결과를 통해서 본 발명의 공결정들은 원료물질과는 다른 회절 패턴을 나타내는새로운 결정형임을 확인할수 있다. 실험 2 - DSC분석 및 결과 온도 시차주사열량법에 따른 분석을 위해, DSC 분석 장치로서 DSC Q2000 System (상품명 , TA Instrument , 미국)을 사용하여 , 0°C 에서부터 녹는점까지 10 °C/min의 승온 속도로 온도를 높이며 측정하였다. 측정 시 , N2 가스를 50 mL/min 의 속도로 공급하였고, 알루미늄 샘플 팬에서 즉정하였다. Universal Analysis 2000 software (상품명, TA instruments , 미국)를 사용하여 자료를 분석하였다. DSC를 통해 얻은 융해열 값은 하기 표 5에 나타낸다.
[표 5]
Figure imgf000027_0001
도 3, 도 4, 도 9 및 도 10에서 , x축은 온도 (단위 : °C)를 나타내고, y축은 열 흐름 (heat flow, 단위: W/g)을 나타낸다. 표 5를 도 9 및 도 10과 함께 참조하면, 승온 속도가 10 °C /min인 경우, 공결정 A에서는 92.96 내지 225.66 QC에서 시차주사열량 (DSC) 흡열 피크를 나타나고, 공결정 B에서는 116.49 내지 210.19으仁에서 시차주사열량 (DSC) 흡열 피크를 나타내는 것을 확인할 수 있다. 즉, 도 3 및 도 4 의 기존의 니클로사마이드 및 나파모스타트 각각과 비교하였을 때, 도 9 및 도 10 의 결과를 통해서 본 발명의 공결정들은 원료물질과는 다른새로운 열역학적 특성을 나타내는 결정임을 확인할수 있다. 실험 3 - TGA분석 및 결과
TGA Q50 System (상품명 , TA Instrument , 미국)을사용하여 , 약 2 - 5mg의 샘플을 백금 샘플 팬에 넣어, 실온에서부터 300 °C (10 °C /min.)까지 무게 변화를 측정하였다. 측정 시 , balance에는 40 mL/min. 그리고, 샘플에는 60 mL/min 의 고순도 此 가스를 공급하였다. Universal Analysis 2000 software (상품명 , TA instruments, 미국)를 사용하여 자료를 분석하였다. TGA를 통해 얻은 열중량손실값은 하기 표 6에 나타낸다.
[표 6]
Figure imgf000028_0001
Figure imgf000029_0001
도 5 , 도 6 , 도 11 및 도 12 에서 , x 축은 온도（단위 : °C）를 나타내고 , y죽은 중량（단위 : %）을 나타낸다 . 표 6 을 도 5 , 도 6 , 도 11 및 도 12 와 함께 참조하면 , 본 발명의 공결정 A는 약 4%의 용매를 결정 내 포함하여 공결정 B 는 약 2%의 용매를 결정 내 포함함을 알 수 있다. 실험 4 - 용해도
DMSO와 polysorbate 80 （Tween 80）을 정제수에 각 0.5% 농도가 되도록 용해시켰다. 이 용액을 바이알에 10 mL 가량 담고 니클로사미드와 나파모스타트의 공결정을 10 mg씩 넣은 뒤 10 초간 초음파 처리하여 균질하게 퍼지도록 하였다. 이후 24 시간동안 실온에서 교반한 뒤 용해된 액만을 얻기 위해 검체를 여과하였다. 여과된 검체를 메탄올로 2 배 희석하여 검 액으로 제조하였다. 용해도 측정은 HPLC를 통하여 확인되었다. 측정은 주입량 20 ul 일 때 332 nm 에서 0.7 ml/min 으로 30 분간 진행되었으며 이동상으로는 암모늄수용액과 메탄올을 혼합한 액을 사용하였다. 분석 조건은 하기 표 7 과 같고 , 그 결과를 하기 표 8 에 나타낸다.
[표 7]
Figure imgf000029_0002
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[표 8]
Figure imgf000030_0002
상기 표 8 을 참조하면, 니클로사마이드의 용해도는 13.1 mg/mL 이고, 공결정 A의 용해도는 14.6 mg/mL이며 , 공결정 으의 용해도는 19.7 mg/mL으로 측정되었다. 이 결과를 통해 , 공결정화 하지 않은 니클로사마이드의 용해도 대비 본 발명에 따른 공결정 A 및 공결정 B가 각각 111.5 % 및 150.4 % 상승됨을 알 수 있다. 상기 실험 1 내지 실험 4의 결과인 도 3, 도 4, 도 9 및 도 10에 나타낸 DSC 곡선과, 도 1, 도 2, 도 7 및 도 8에 나타난 PXRD 프로파일을 참조하면, 본 발명에 따른 공결정은 니클로사마이드와 나파모스타트의 단순한 혼합물이 아니라 결합된 몰 비율에 따른 공결정 A와 공결정 B가 얻어진 것으로 확인된다. 또한, 이들 본 발명에 따른 공결정은 Vehicle 로 사용하기 위한 충분한 용해도를 확보하였다. 실험 5 - 다양한 암세포주에서 공결정의 항암효능 검증을 위한 세포 증식 억제를 평가 CCK- 8을 이용한 cell viability측정 췌장암, 유방암, 비소세포폐암 세포주에서 공결정에 의한 증식 억제 평가를 위한 항암 in vitro 약효 시험의 조건은 하기 표 9와 같다. 이하, 공결정 A는 실시예 1.1에 따라 얻어진 공결정이고, 공결정 B는 실시예 2.1에 따라 얻어진 공결정이다. 췌장암세포주 2종 (PANC- 1, MIAPACA- 2)과 유방암 세포주 2종 (MCF- 7, MDA- MB- 231)과 비소세포폐암 세포주 2종 (A- 549, H-1299), 간암 세포주 2종 (Hep- 3B, Huh-7) 총 8종의 세포주를 이용하여 96 -조직배양플레이트에 웰당 2〜 4 x 1어개의 세포를 접종하였다. 24시간세포배양기에 배양한후, 공결정 약물을 0.3, 3, 30, 300, 3000, 30000 ng/mL 총 6 개 농도로 세포에 처리하였다. 공결정 외에 단일제제인 Niclosamide 와 Nafamostat는 공결정에서 각 성분 비율에 해당하는 양으로 설정하여 약물 처리하였다. 약물 처리 48시간 뒤에 CCK-8 assay kit를 이용하여 1〜 4시간 시약을 반응시켜 색의 변화를 관찰하고 마이크로리더 장비로 450nm파장에서 흡광도를 측정하여 세포 생존능을 측정하였다.
[표 9]
Figure imgf000031_0001
다양한 종류의 암세포에 대한 공결정의 항암 효능을 검증하기 위해 췌장암, 유방암, 비소세포폐암, 간암 세포에서 세포의 생존력 (Cell viability)를 측정하여 IC50를 도출하였다. 그 결과를 도 13 및 하기 표 10에 나타낸다.
[표 10]
Figure imgf000032_0001
도 13 내지 도 16 및 표 10을 참조하면 , 본 발명에 따른 공결정 A의 IC50는 췌장암 세포주인 PANC- 1세포에서 355 nM, MIAPACA-2 세포에서 287 nM, 유방암 세포주인 MCF-7 세포에서 589 nM, MDA-MB-231 세포에서 38 nM, 비소세포폐암 세포주인 A- 549세포에서 720 nM, H- 1299세포에서 254 nM, 간암 세포주인 Hep-3B 세포에서 125 nM, Hu7- 7 세포에서 672 nM로 확인되었다. 공결정 으의 IC50는 PANC- 1세포에서 794 nM, MIAPACA-2 세포에서 190 nM, MCF- 7세포에서 96 nM, MDA-MB-231 세포에서 33 nM, A- 549세포에서 44 nM, H- 1299 세포에서 1 nM, Hep-3B 세포에서 82 nM, Hu7-7 세포에서 272 nM 로 확인되었다. 이를 통해 공결정 2종을 비교하였을 때에 , 공결정 A보다 공결정 으에 의한 항암 효과가 더 크게 나타난 것을 확인하였다. 실험 6 - 유형별 유방암 세포주에서 공결정의 항암효능 검증을 위한 세포 증식 억제를평/} Cel ITiter— Gio (Promega G9632) 3D cell viability측정 유형별 유방암 세포주에서 공결정에 의한 증식억제 평가를 위한 항암 in vitro 약효평가 시험의 조건은 하기 표 11과 같다. 총 10종의 유방암 세포주 (T47D, MCF7, MCF7/ADR, ZR-75-1 , BT474, BT20, HCC70, BT549, HCC38, MDA-MB-231, Hs578T)를 대상으로 공결정 약물에 대한 검증을 하였다. 각 약물을 세포주별로 10배수씩 농도 6개 범위로 설정하여 Cel ITiter gio를 이용하여 Luminescent Cell viabi 1 ity assay를 수행하였다. 약물 처리 용량은 ng/ml 단위로 질량을 측정하여 처리하였고, 각 공결정 비율에 해당하는 용량으로 단일제제의 용량을 설정하였다. 각 약물의 조건별 발광도를 이용하여 IC50값을 산출하여 단위를 몰농도로 환산했고 계산시 필요한 분자량의 값은 공결정의 경우 단일제제 함량 비율에 따른분자량의 합으로설정하였다.
[표 11]
Figure imgf000033_0001
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유형별 유방암세포주에 대한 공결정의 항암 효능을 검증하기 위해 총 10 종의 유방암 세포에서 용량-반응 곡선 시험을 진행하였고, 세포의 생존력 (Cell viability)를 측정하여 IC50를 도출하였다. 그 결과를 도 17, 및 하기 표 12에 나타낸다. 표 12]
Figure imgf000034_0002
도 17 및 표 12를 참조하면 , 약물반응은 각 세포마다 다르게 나타났으나 모든 세포주에서 공결정 으가 공결정 A 보다 낮은 IC50값이 확인되었다. 이를 통해 공결정 으가 유방암 세포주에서 항암 효과가 더 높음을 알 수 있었다. 실험 7 - 췌장암 환자 세포를 이용하여 3D 조건에서 organoid 형태로 세포를 증식시킨 뒤 공결정에 의한 증식 억제를 평가 (CellTiter— Gio (Promega G9632) 3D cell viability측정) 췌장암 환자 세포를 이용하여 공결정에 의한 증식 억제를 평가하기 위한 항암 in vitro 약효 시험을 위한조건은 하기 표 13과 같고, 시험 방법의 개요는 도 18에 나타낸다. 췌장암 환자의 췌장암 세포주를 이용하여 96 -조직배양 플레이트에 웰당 2xl03개의 환자 췌장암 세포가 들어있는 배지를 Matrigel과 1：1비율로 섞은 혼합배지로 접종하였다. 7일간세포배양기에 배양한후, 공결정 약물을 0, 2, 5, 10, 50 uM로 세포에 처리하였다. 화합물 처리 24시간, 48시간 뒤에 현미경을 이용하여 배양중인 세포를 촬영하였다. 48시간 현미경 촬영 후 공결정에 의한 세포 증식 억제를 평가하기 위해 CellTiter-Glo(Promega G9632)를 이용하여 3D 세포 생존능을 측정하였다. 표 13]
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췌장암에 대한 공결정의 항암 효능을 검증하기 위해 췌장암 organoid model에서 세포의 생존력 (Cell viability)를 측정하였다. 그 결과를 도 19 및 도 20에 나타낸다. 도 19 및 도 20을 참조하면, 본 발명에 따른공결정 A를 2 uM처리시 cell viability 68.0%, 공결정 B를 2 yM 처리시 cell viability 36.7%로 나타났고, 이를 통해 공결정 A보다는 상대적으로 공결정 으에 의한 항암 효과가 더 크게 나타난 것을 확인할수 있다.
10 yM에서 공결정 A와 공결정 B에 의한 세포 생존율은 10% 이하인 것을 확인할 수 있다. 본 발명의 공결정은 젬시타빈 대비 암세포 생존 억제능이 우수함을 확인하였다. 실험 8 - SARS- CoV- 2에 대한공결정의 항바이러스효능 검증을위한 SARS- CoV- 2세포감염모델에서의 용량-반응곡선 실험 진행
SARS-CoV-2 세포 감염모델을 이용해 공결정의 항바이러스 효능 검증을 위한 실험 조건은 하기 표 14와 같고, 시험 방법의 개요는 도 21에 나타낸다.
SARS-CoV-2 에 대한 공결정 물질의 항바이러스 효능을 검증하고자 384 - 조직배양 플레이트에 웰당 1.2xl04개의 Vero 세포를 접종하였다 . 24 시간 후 , DMS0에 2배 연속 희석하여 10 포인트로 준비된 공결정의 최고농도를 50 uM로 하여 세포에 처리하였다. 공결정 처리 약 1시간후, BSL3 시설에서 세포에 SARS- CoV-2 (0.125 M0I)를 감염시키고, 37°C에서 24시간 동안 배양하였다. 이후 4% paraforma 1 dehyde (PFA)로 세포를 고정한 뒤, permeabi 1 izat ion 하였다. 그 후 ant i -SARS- CoV- 2 nucleocapsid (N) 1차 항체를 처리하고, Alexa Fluor 488 - conjugated goat ant i -rabbi t IgG 2차 항체와 Hoechst 33342 를 처리하여 세포를 염색하였다. 감염된 세포의 형광 이미지는 대용량 이미지 분석 기기인 Operetta(Perkin Elmer )를 이용하여 획득했다.
[표 14]
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SARS_CoV- 2 에 대한 공결정의 항바이러스 효능을 검증하기 위해 SARS-CoV-2 세포 감염 모델에서 용량-반응 곡선 시험을 진행하였고 , 그 결과를 도 22 , 도 23 및 하기 표 15 에 나타낸다.
[표 15]
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도 22 및 도 23 과 표 15 를 참조하면 , 공결정 A 의 IC50는 0.17 yM 로 나타났고 공결정 B 의 IC50는 0.17 uM 이었으며 공결정 A와 B 모두 0.4
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농도에서 바이러스 감염 억제 효과가 100%에 가깝게 나타났다. 도 24 를 참조하면 , 본 발명에 따른 공결정 A와 B는 적은 농도로 바이러스 감염 억제 효과가 뚜렷하게 관찰되었고 기존 치료제로 사용 중인 렘데시비르보다 IC5o 값이 현저히 낮아, 매우 우수한 바이러스 감염 억제 효과가 있는 것을 확인하였다. 상기에서는 본 발명의 바람직한 실시 예를 참조하여 설명하였지만, 해당 기술 분야의 숙련된 당업자는 하기의 특허 청구 범위에 기재된 본 발명의 사상 및 영 역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.

Claims

【청구의 범위】
【청구항 11 나파모스타트 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염; 및 니클로사마이드를 포함하는, 공결정.
【청구항이 제 1항에 있어서, 나파모스타트와 니클로사마이드를 1：1의 몰 비로포함하는 것인, 공결정.
【청구항 3] 제 1항에 있어서, 나파모스타트와 니클로사마이드를 1：4의 몰 비로포함하는 것인, 공결정 .
【청구항 4] 제 1항에 있어서, 승온 속도가 10 °C /min인 경우, 92.96 내지 225.66 Q仁에서 시차주사열량 (DSC)흡열 피크를 나타내는, 나파모스타트와 니클로사마이드의 몰 비가 1：1인 공결정 .
【청구항 5] 제 1항에 있어서,
37 승온 속도가 10 °C /min 인 경우 , 116.49 내지 210.19 으仁에서 시차주사열량 (DSC) 흡열 피크를 나타내는 , 나파모스타트와 니클로사마이드의 몰 비가 1：4 인 공결정 .
【청구항 6] 제 1 항에 있어서 , 분말 오선 회절 (XRD) 패턴이
9.4367° , 11.6241° , 15.1910° , 15.9004° , 16.9252° , 17.7331° , 23.3495° , 25.0048° , 25.6551° 및 27.2514° 의 회절각 20 (士 0.2。 ) 값에서 나타내는 회절 피크를 포함하는 , 공결정 .
【청구항 7] 제 6 항에 있어서 , 분말 오선 회절 (XRD) 패턴이
7.6434° , 9.4367° , 10.9541° , 11.6241° , 12.7868° , 15.1910° , 15.9004° , 16.9252° , 17.7331° , 18.4229° , 19.1717° , 20.0191° , 21.0044° ,
22.5809° , 23.3495° , 23.7830° , 25.0048° , 25.6551° , 26.3843° , 27.2514° ,
28.7096° , 30.0694° , 31.7642° , 33.9516° , 및 35.3310° 의 회절각 20
(士 0.2。 ) 값에서 나타내는 회절 피크를 포함하는 , 공결정 .
【청구항 8] 제 1 항에 있어서 ,
38 분말 X 선 회절 (XRD) 패턴이 9.61405° , 13.6342° , 16.2945° , 19.4476° , 19.8023° , 21.773° , 23.1327° , 26.1478° 및 26.5419° 의 회절각 20 (士 0.2。 ) 값에서 나타내는 회절 피크를 포함하는 , 공결정 .
【청구항 이 제 8 항에 있어서 , 분말 X 선 회절 (XRD) 패턴이 6.6187° , 8.9637° , 9.61405° , 13.6342° ,
14.0283° , 16.2945° , 17.3587° , 19.4476° , 19.8023° , 20.9453° , 21.7730° ,
23.1327° , 26.1478° , 26.5419° , 26.6753° , 30.4241° , 31.0547° , 32.9268° ,
35.9025° 및 39.5285° 의 회절각 20 (士 0.2。 ) 값에서 나타내는 회절 피크를 포함하는 , 공결정 .
【청구항 10】 제 1 항에 있어서 , 열중량 분석 (TGA) 결과로 75 Q 으 에서 1.859 % 또는 150 Q 으 에서 2.616 %의 질량감소율을 갖는 , 나파모스타트와 니클로사마이드의 몰 비가 1：1 인 공결정 .
【청구항 11】 제 1 항에 있어서 , 열중량 분석 (TGA) 결과로 150。으 에서 2.060 %의 질량감소율을 갖는 , 나파모스타트와 니클로사마이드의 몰 비가 1：4 인 공결정 .
【청구항 1이 나파모스타트 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 및 니클로사마이드를 혼합하여 공결정화시키는 단계를 포함하는 , 제 1 항에 따른 공결정의 제조 방법 .
【청구항 13】 제 12 항에 있어서 , 상기 공결정화시키는 단계는 나파모스타트 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 , 니클로사마이드 및 용매를 혼합하는 단계를 포함하고 , 상기 용매는 물 , 직쇄 또는 분지쇄의 탄소수 1 내지 5 를 갖는 알코올, 아세톤 또는 이 들로부터 선택된 2 이상을 포함하는 것인 , 제 1 항에 따른 공결정의 제조 방법 .
【청구항 14】 제 12 항에 있어서 , 상기 공결정화시키는 단계에서 , 나파모스타트 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염과 니클로사마이드는 1：1 또는 1：4 의 몰 비로 혼합되는 것인 , 제 1 항에 따른 공결정의 제조 방법 . 【청구항 15】 제 1 항에 따른 공결정을 유효성분으로 포함하는 , 암 또는 코로나바이러스 감염 질환의 치료 또는 예방을 위한 약학적 조성물 .
【청구항 16】 제 15 항에 있어서 , 암은 췌장암, 유방암, 간암 및 폐암 중 선택된 1 이상인 , 약학적 조성물 .
【청구항 17】 제 1 항에 따른 공결정을 치료적으로 유효한 양을 대상체에게 투여하는 , 암 또는 코로나바이러스 감염 질환의 예방 또는 치료 방법 .
【청구항 18】 암 또는 코로나바이러스 감염 질환의 예방 또는 치료를 위한, 제 1 항에 따른 공결정의 용도.
【청구항 1이 암 또는 코로나바이러스 감염 질환의 예방 또는 치료용 약제의 제조를 위한, 제 1 항에 따른 공결정의 용도.
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