WO2022065602A1 - 배 유래 석세포의 추출방법 - Google Patents

배 유래 석세포의 추출방법 Download PDF

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WO2022065602A1
WO2022065602A1 PCT/KR2020/018706 KR2020018706W WO2022065602A1 WO 2022065602 A1 WO2022065602 A1 WO 2022065602A1 KR 2020018706 W KR2020018706 W KR 2020018706W WO 2022065602 A1 WO2022065602 A1 WO 2022065602A1
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WO
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pear
derived
stone cells
extracting
stone
Prior art date
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PCT/KR2020/018706
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English (en)
French (fr)
Inventor
남승희
양광열
임애은
Original Assignee
전남대학교 산학협력단
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/04—Plant cells or tissues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2509/00—Methods for the dissociation of cells, e.g. specific use of enzymes

Definitions

  • the present invention relates to a method for extracting pear-derived stone cells, and more particularly, to a method for conveniently extracting pear-derived stone cells with high purity and uniform size using pear baek, which is a by-product after juicing, as a material.
  • Stone cells are a lignin phenomenon in which lignin is deposited in the cellulose of the cell wall within the cell tissue, and the cell wall is hardened and fixed. scattered in groups The occurrence of stone cells in the flesh of the embryo is observed from 14 days after full bloom, and is characterized by a spherical shape at the beginning, and a radial shape as it grows. It has a structure in which several cells are aggregated, and the content and size vary depending on the variety. In addition, stone cells rapidly increase up to 28 days in full bloom, accounting for about 50% of the dry matter weight, and decrease as the fruit grows, so there are differences between varieties. is composed of lignocellulose, carbohydrates (cellulose, hemicellulose, pectin), and lignin.
  • Fig. 7 shows a photograph of the characteristics of stone cells according to the fruit distribution site of the stone cells of the embryo.
  • Microplastics are plastic particles with a diameter of 5 mm or less and are widely used in toothpaste, soap, and exfoliating products because they are effective in effectively removing foreign substances.
  • related laws ⁇ Regulations on safety standards for cosmetics ⁇ (Ministry of Food and Drug Safety Announcement No. 2016-74, 2016. 7. 28) Cosmetics Act Enforcement Rules, Annex 3, Quasi-drug product permission, notification, and examination regulations (Ministry of Food and Drug Safety) No. 2017-43, 2017. 1. 26.) Cosmetics containing this product cannot be made or imported, and sales are prohibited.
  • An object of the present invention is to provide a method for extracting stone cells with high purity and uniform size while minimizing the use of substances and enzymes.
  • the mixed enzyme may further include beta glucanase ( ⁇ -glucanse) and pectinase (pectinase).
  • beta glucanase ⁇ -glucanse
  • pectinase pectinase
  • the method for extracting pear-derived stone cells may further include an alcohol treatment step.
  • the embryo-derived stone cell extraction method may further include an acid treatment step.
  • the method for extracting pear-derived stone cells includes: the alcohol treatment step; and the enzymatic treatment step; may be performed sequentially.
  • the method for extracting pear-derived stone cells includes: the alcohol treatment step; the acid treatment step; and the enzymatic treatment step; may be performed sequentially.
  • the method for extracting pear-derived stone cells comprises:
  • the alcohol may be an aqueous solution of ethanol having a concentration of 90 to 100%.
  • the mixed enzyme may be added in an amount of 0.01 to 0.15 wt% of the solid.
  • the embryo-derived stone cell extraction method comprises:
  • the pear may be a dried powder of pear baek, which is a by-product remaining after squeezing the pear.
  • the dry powder of the pear baek may have a particle size of 30 to 60 mesh.
  • the pear may be a pulverized product of 30 to 60 days after flowering.
  • the pulverized product of the endosperm may be in a dry powder state.
  • the alcohol used for the alcohol treatment may be any one selected from ethanol, propanol and butanol.
  • the acid used for the acid treatment may be at least one selected from hydrochloric acid (HCl), nitric acid (HNO 3 ), sulfuric acid (H 2 SO 4 ), hydrofluoric acid (HF), and phosphoric acid (H 3 PO 4 ).
  • the method for extracting pear-derived stone cells of the present invention does not use complicated processes or harmful chemical products in extracting pear-derived stone cells, and extracts stone cells simply by treatment with alcohol and enzymes. By screening, it is possible to extract high-purity and uniformly sized stone cells while minimizing the use of unnecessary processes, chemicals, and enzymes.
  • FIG. 1 is a schematic diagram of a procedure for extracting stone cells and observation of stone cells in Comparative Examples 1 to 5 and Examples 1 to 7;
  • FIG. 4 is a microscope image of each extraction condition of basil powder-derived basil cells selected to have a particle size of 30 to 60 mesh according to Experimental Example 2.
  • FIG. 4 is a microscope image of each extraction condition of basil powder-derived basil cells selected to have a particle size of 30 to 60 mesh according to Experimental Example 2.
  • FIG. 5 is a microscopic image of goblet cells derived from powder of young pears 60 days after flowering according to the extraction conditions.
  • FIG. 7 is a photograph showing the appearance of stone cells according to the fruit distribution site of the stone cells of the embryo.
  • the method for extracting pear-derived stone cells of the present invention includes treating pears with a mixed enzyme containing cellulose and hemicellulose.
  • the mixed enzyme may further include beta glucanase ( ⁇ -glucanse) and pectinase (pectinase).
  • beta glucanase ⁇ -glucanse
  • pectinase pectinase
  • the step of extracting stone cells may further include an alcohol treatment step.
  • the method for extracting the embryo-derived stone cells may further include an acid treatment step.
  • the pear pear it is preferable to add only the alcohol treatment step alone, and in the case of an endosperm fruit 30 to 60 days after flowering in which stone cell formation is not complete, it is preferable to perform alcohol treatment and acid treatment in parallel. It is advantageous to improve efficiency.
  • the alcohol treatment step, the acid treatment step and the enzyme treatment step are sequentially performed, or the acid treatment is omitted and the alcohol treatment step and the enzyme treatment step are sequentially performed can be done.
  • pear baek which is a by-product remaining after squeezing the pear
  • the pear baek powder preferably has a particle size of 30 to 60 mesh, more preferably 30 to 50 mesh, and even more preferably 30 to 40 mesh. In this case, the density of stone cells is high, and unnecessary processes can be minimized.
  • the mesh unit was based on KS A 5101 (unit indicating the particle size by a standard sieve), and the mesh and micrometer ( ⁇ m) unit conversion table according to this is shown in Table 1 below.
  • the pear may use a pulverized product of a pear fruit that has passed 30 to 60 days after flowering, and in this case, the pulverized product may be a dry powder.
  • the alcohol used for the alcohol treatment is any one selected from ethanol, propanol and butanol. It may be one, preferably ethanol.
  • the acid used for the acid treatment may be at least one selected from hydrochloric acid (HCl), nitric acid (HNO 3 ), sulfuric acid (H 2 SO 4 ), hydrofluoric acid (HF) and phosphoric acid (H 3 PO 4 ), preferably hydrochloric acid can be used
  • step a alcohol is added to the vessel to mix (step a).
  • the alcohol is preferably an aqueous ethanol solution having a concentration of 90 to 100%, and more preferably an aqueous ethanol solution having a concentration of 95 to 100%.
  • the reaction is preferably carried out at 20 to 30 °C.
  • step b After centrifuging the alcohol mixture, the supernatant is removed and a precipitate is obtained (step b).
  • the enzyme reaction solution is prepared by adding the mixed enzyme and the buffer solution to the precipitate (step c).
  • the mixed enzyme is added in an amount of 0.01 to 0.15 wt% of the precipitate, and more preferably in an amount of 0.05 to 0.1 wt%.
  • the enzymatic reaction is preferably carried out at 35 to 40 °C, more preferably 36 to 38 °C may be carried out.
  • the separation efficiency of stone cells may be reduced because the decomposition of dietary fiber in pear pear is not sufficiently achieved.
  • the enzymatic reaction is preferably performed for 8 to 20 hours, more preferably 10 to 18 hours, even more preferably 14 to 16 hours. If the reaction time is less than 8 hours, it is difficult to sufficiently decompose the dietary fiber, and if it exceeds 20 hours, an unnecessary process or stone cells may be damaged.
  • alcohol is added to the vessel to mix (step 1).
  • the precipitate is acid-treated by mixing an acid to obtain an acid-treated precipitate (step 3).
  • the samples used in the extraction of stone cells are i) dried powder of whole pears and the by-products remaining after squeezing the whole pears are dried at 65°C to 70°C for 24 hours, ii) selected with a particle size of 30 to 60 mesh Dry pear powder, iii) 60 days after flowering, dried pears (Yugwae) were used as three dry powders, respectively.
  • 450 ml of 1N HCl was added to 10 g of the sample and reacted at a speed of 120 rpm at 25° C. for 1 hour. Then, 450 ml of distilled water was added, washed 3 times, centrifuged at 8,000 rpm for 10 minutes, cooled to 4° C., and the supernatant was Stone cells were extracted by removal.
  • Example 3 Mixed enzyme -> ethanol treatment
  • Example 2 After the mixed enzyme treatment under the same conditions as in Example 1, washed twice with distilled water and centrifuged to remove the salt contained in the buffer, treated with ethanol under the same conditions as in Comparative Example 2, and the final sample was at 60° C. for 15 hours. hot air dried.
  • Example 5 Mixed enzyme -> hydrochloric acid treatment
  • Example 7 Mixed enzyme -> ethanol -> hydrochloric acid treatment
  • Pears used as samples were washed twice with water and then freeze-dried and pulverized to pulverize the remaining pears after preparing pear juice.
  • the powdered pears were separated by size in the range of 0 to 120 mesh, and the composition of each pear particle size composed of the whole was observed. They were observed by adding a 2% phloroglucinol-HCl staining solution and staining at room temperature for 1 hour at 100 rpm, then magnified 20 to 25 times with a stereo microscope (Stereo Zoom microscopy KS-208M, Olympus). Accordingly, a photograph and a microscope image for each size of pear pear particle size are shown in FIG. 2, and the content of each size of pear pear particle size is shown in Table 2 below. At this time, the content of stone cells was analyzed using the redness (a value) of the colorimeter.
  • pear powder ii) pear basil powder selected to a particle size of 30 to 60 mesh, iii) 60 days after flowering
  • the extracted stone cells were stained under the same conditions as in Experimental Example 1, and stereoscopic images were observed.
  • i) Microscopic images of basil powder-derived blastocyst cells for each extraction condition are shown in FIG. 3
  • ii) microscopic images of pear blastic blastocyst cells selected with a particle size of 30 to 60 mesh for each extraction condition are shown in FIG. 4 .
  • iii) Microscopic images for each extraction condition of goblet cells derived from the powder (fruit family) of young pears 60 days after flowering are shown in FIG. 5 .
  • the samples of stone cell extraction showed a high content of stone cells in the order of the selected pear powder, pear powder, and yew fruit. It was confirmed that it is not clear that it is preferable to extract from pears of the mature family, and it is more suitable to extract with pear powder selected with a particle size of 30 to 60 mesh as a material.
  • Example 1 when whole pears or selected pears were used as samples, Example 1 was the most effective because it was an enzyme treatment capable of removing dietary fiber in the single treatment group, and in the complex treatment group, the ethanol -> enzyme of Example 2 It was found that the treatment group had the highest efficiency, and Example 6, in which hydrochloric acid was additionally treated, showed that the efficiency was rather decreased. On the other hand, when a milk fruit sample was used, the extraction efficiency of the ethanol -> hydrochloric acid -> enzyme treatment group of Example 6 was found to be as excellent as possible. According to these results, it seems that the chemical treatment played a role in improving the efficiency because stone cells are being generated.
  • the method for extracting pear-derived stone cells of the present invention does not use complicated processes or harmful chemical products in extracting pear-derived stone cells, and extracts stone cells simply by treatment with alcohol and enzymes. By screening, it is possible to extract stone cells with high purity and uniform size while minimizing unnecessary processes, chemicals, and enzymes.

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Abstract

본 발명은 배(pear)에 셀룰레이즈(cellulose) 및 헤미셀룰레이즈(hemicellulose)를 포함하는 혼합효소를 처리하는 단계를 포함하는 배 유래 석세포의 추출방법에 관한 것이다. 이에 의하여, 본 발명의 배 유래 석세포의 추출방법은 배 유래의 석세포를 추출하는데 있어서 복잡한 공정이나 유해한 화학제품의 사용을 하지 않고 알코올과 효소처리만으로 간편하게 석세포를 추출하며, 나아가 석세포가 밀집된 부분을 선별하여 불필요한 공정과 화학물질, 효소의 사용을 최소화하며 고순도의 균일한 크기를 갖는 석세포를 추출할 수 있다.

Description

배 유래 석세포의 추출방법
본 발명은 배 유래 석세포의 추출방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 배의 착즙 후 부산물인 배박 등을 재료로 고순도의 균일한 크기를 갖는 배 유래 석세포를 간편하게 추출하는 방법에 관한 것이다.
최근 우리나라 배 면적은 수입 자유화 이후 상대적으로 경제성이 낮은 수도 등 타 작목 전환에 의해 매우 짧은 기간에 재배 면적이 확대되어 전체 과수재배 면적의 16% 이상을 차지하는 중요한 과종이 되었다. 배의 최대 수출입 국가인 유럽 지역에 동양배가 최근 수출되어 과육 내 수분이 많고 생과로 소비가 가능한 동양배의 특성이 알려지기 시작했으며 소비자들은 중소과 및 조직감이 부드러운 유연 다즙한 배를 선호하는 것으로 조사되었다. 특히 리그닌과 셀룰로오스 등으로 구성되어있는 단단한 석세포가 많이 존재하는 배는 과실의 조직감이 강해 불량한 것으로 알려져 있다. 이러한 석세포에 대한 연구는 서양배에서는 석페포의 성분, 형성시기, 과육내 석세포 밀도 등의 많은 연구가 이루어졌다. 그러나 우리나라에서 주로 재배하고 있는 남방형 동양배에서는 연구가 미흡한 상태이다.
석세포는 세포 조직 내에서 세포벽의 셀룰로오스 안에 리그닌이 침적되는 목질화 현상으로 세포벽이 단단하게 굳어 고정된 형태로 배나무(Pyrus)속 과실, 작약과 다알리아의 덩이뿌리, 벚나무(Prunus)속 종자의 껍질에 군을 이루어 산재한다. 배 과육 내 석세포의 발생은 만개 후 14일 이후부터 관찰되고 초기에는 구형을 나타내다가 생장하면서 방사 형태로 되는 것을 특징으로 한다. 여러 개의 세포가 뭉쳐진 구조이고 품종에 따라 함량과 크기가 다양하다. 또한 석세포는 만개 28일까지 급속히 증가하여 건물중의 50% 정도를 차지하며 과실이 생장하면서 줄어들어 품종 간 차이가 있지만 수확기에 건물중의 12 내지 18% 크기는 0.1 내지 0.5mm 정도를 이루며 주요 성분은 리그노셀룰로오스, 탄수화물(셀룰로오스, 헤미셀룰로오스, 펙틴), 리그닌 등으로 구성된다. 석세포의 형성은 수체 내 수분 부족 시 엽과 과실간의 수분 경합 등 환경요인이나 기계적인 장해를 극복하기 위한 과정에서 나타나는 목질화 현상(lignification)에 의해 발생이 촉진된다. 참고로 도 7에 배의 석세포의 과실 분포 부위에 따른 석세포의 성상에 대한 사진을 나타내었다.
미세플라스틱은 지름 5mm 이하의 플라스틱 알갱이로 이물질을 효과적으로 제거하는 효과적이므로 치약, 비누, 각질제거용품 등에 널리 사용되고 있다. 또한 관계법령:「화장품 안전기준 등에 관한 규정」(식품의약품안전처 고시 제2016-74호, 2016. 7. 28) 화장품법 시행규칙, 별표3, 의약외품 품목허가·신고·심사 규정(식품의약품안전처 고시 제2017-43호, 2017. 1. 26.) 이 들어간 화장품 등은 만들거나 수입할 수 없고 판매가 금지된다.
치약의 플라그 제거, 화장품의 각질제거 또는 세정, 공업용 연마용으로 사용되는 미세플라 스틱으로 인한 환경오염 문제가 지속적으로 제기되며 현재, 국내외에는 미세플라스틱이 함유된 화장품, 치약등 관련 제품의 제조, 사용이 전면 금지됨. 국내에서는 미세플라스틱 대체제로 살구씨나 호두껍질 분말 등을 외국에서 전량 수입해 판매하고 있는 실정으로 배석세포 활용 개발 상업용 제품은 전무하다. ‘18년도 농촌진흥청에서는 배의 석세포 함유 치약 등 의약외품으로 이용하기 위한 식약청 인증 획득을 위해 안전성·유효성 및 인체적용 시험을 추진한 바 있으며, 미국, 독일 등에서 미세플라스틱 대체재로 살구씨, 밀랍, 쌀 왁스, 바이오기반 생분해성 폴리머를 포함한 천연물들에 대한 연구 진행중이다.
본 발명의 목적은 배 유래의 석세포를 추출하는데 있어서 복잡한 공정이나 유해한 화학제품의 사용을 하지 않고 알코올과 효소처리만으로 간편하게 석세포를 추출하며, 나아가 석세포가 밀집된 부분을 선별하여 불필요한 공정과 화학물질, 효소의 사용을 최소화하며 고순도의 균일한 크기를 갖는 석세포를 추출하는 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 일 측면에 따르면,
배(pear)에 셀룰레이즈(cellulose) 및 헤미셀룰레이즈(hemicellulose)를 포함하는 혼합효소를 처리하는 단계를 포함하는 배 유래 석세포의 추출방법이 제공된다.
상기 혼합효소는 베타클루카네이즈(β-glucanse) 및 펙티나아제(pectinase)를 추가로 포함할 수 있다.
상기 배 유래 석세포 추출방법은 알코올 처리 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기 배 유래 석세포 추출방법은 산 처리 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기 배 유래 석세포 추출방법은, 상기 알코올 처리 단계; 및 상기 효소 처리 단계;를 순차적으로 수행할 수 있다.
상기 배 유래 석세포 추출방법은, 상기 알코올 처리 단계; 상기 산 처리 단계; 및 상기 효소 처리 단계;를 순차적으로 수행할 수 있다.
바람직하게는 상기 배 유래 석세포 추출방법은,
(a) 배에 알코올을 첨가하여 알코올을 혼합하는 단계;
(b) 상기 알코올 혼합물로부터 침전물을 수득하는 단계; 및
(c) 상기 침전물에 상기 혼합효소와 완충용액을 첨가하여 효소 반응시켜 효소반응 용액을 제조하는 단계; 및
(d) 상기 효소반응 용액을 원심분리한 후 상등액을 제거하고 석세포를 추출하는 단계;를 순차적으로 수행할 수 있다.
단계 (a)에서, 상기 알코올은 90 내지 100% 농도의 에탄올 수용액일 수 있다.
단계 (c)에서, 상기 혼합효소는 고형물의 0.01 내지 0.15wt% 함량으로 첨가할 수 있다.
상기 배 유래 석세포 추출방법은,
(1) 배에 알코올을 첨가하여 알코올을 혼합하는 단계;
(2) 상기 알코올 혼합물로부터 침전물을 수득하는 단계;
(3) 상기 침전물에 산을 혼합하여 산처리하고 산처리된 침전물을 수득하는 단계;
(4) 상기 산처리된 침전물에 상기 혼합효소와 완충용액을 첨가하여 효소 반응시켜 효소반응 용액을 제조하는 단계; 및
(5) 상기 효소반응 용액을 원심분리한 후 상등액을 제거하고 석세포를 추출하는 단계;를 순차적으로 수행할 수 있다.
상기 배는 배를 착즙한 후 잔여하는 부산물인 배박의 건조 분말일 수 있다.
상기 배박의 건조 분말은 입자 크기가 30 내지 60 메쉬일 수 있다.
상기 배는 개화 후 30 내지 60일이 경과된 배 유과의 분쇄물일 수 있다.
상기 배 유과의 분쇄물은 건조 분말 상태일 수 있다.
상기 알코올 처리에 사용되는 알코올은 에탄올, 프로판올 및 부탄올 중에서 선택된 어느 하나일 수 있다.
상기 산 처리에 사용되는 산은 염산(HCl), 질산(HNO3), 황산(H2SO4), 불산(HF) 및 인산(H3PO4) 중에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
본 발명의 배 유래 석세포의 추출방법은 배 유래의 석세포를 추출하는데 있어서 복잡한 공정이나 유해한 화학제품의 사용을 하지 않고 알코올과 효소처리만으로 간편하게 석세포를 추출하며, 나아가 석세포가 밀집된 부분을 선별하여 불필요한 공정과 화학물질, 효소의 사용을 최소화하며 고순도의 균일한 크기를 갖는 석세포를 추출할 수 있다.
도 1은 비교예 1 내지 5, 및 실시예 1 내지 7의 석세포 추출과정 및 석세포의 관찰에 대한 과정의 개략도이다.
도 2는 실험예 1의 배박 입자 크기별 사진과 현미경 이미지이다.
도 3은 실험예 2에 따른 배박 분말 유래의 배석세포의 추출조건 별 현미경 이미지이다.
도 4는 실험예 2에 따른 30 내지 60mesh의 입자크기로 선별된 배박 분말 유래의 배석세포의 추출조건 별 현미경 이미지이다.
도 5는 개화 후 60일 경과된 어린 배의 분말(유과) 유래의 배석세포의 추출조건 별 현미경 이미지이다.
도 6은 실험예 3에 따른 석세포의 전자현미경 이미지이다.
도 7은 배의 석세포의 과실 분포 부위에 따른 석세포의 성상에 대한 사진이다.
본 발명은 다양한 변환을 가할 수 있고 여러 가지 실시예를 가질 수 있는 바, 특정 실시예들을 도면에 예시하고 상세한 설명에 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변환, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.
본 출원에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 출원에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
이하, 본 발명의 배(pear) 유래 석세포의 추출방법에 대해 설명하도록 한다.
본 발명의 배 유래 석세포의 추출방법은 배(pear)에 셀룰레이즈(cellulose) 및 헤미셀룰레이즈(hemicellulose)를 포함하는 혼합효소를 처리하는 단계를 포함한다.
경우에 따라, 상기 혼합효소는 베타클루카네이즈(β-glucanse) 및 펙티나아제(pectinase)를 추가로 포함할 수 있다.
바람직하게는 상기 배 유래 석세포 추출방법은 석세포 추출 단계는 알코올 처리 단계를 추가로 포함할 수 있다.
또한, 경우에 따라 상기 상기 배 유래 석세포 추출방법은 산 처리 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기 배가 배박인 경우에는 알코올 처리 단계만 단독으로 추가하는 것이 바람직하고, 석세포 형성이 완전하지 않은 개화 후 30 내지 60일 경과된 배 유과의 경우에는 알코올 처리와 산처리를 병행하는 것이 석세포 추출효율을 향상시키는데 유리하다.
또한, 상기 배 유래 석세포 추출방법은, 상기 알코올 처리 단계, 상기 산 처리 단계 및 상기 효소 처리 단계를 순차적으로 수행하거나, 또는 상기 산 처리를 생략하고 상기 알코올 처리 단계 및 상기 효소 처리 단계를 순차적으로 수행할 수 있다. 이때, 상기 배를 배박으로 사용하는 경우에는 알코올 처리와 효소 처리를 순차적으로 하는 것이 바람직하고, 석세포 형성이 완전하지 않은 배 유과를 사용하는 경우에는 알코올 처리, 산 처리, 효소 처리를 순차적으로 수행하는 것이 추출효율을 높이는 데 더욱 유리하다.
상기 배는 배를 착즙한 후 잔여하는 부산물인 배박을 사용하는 것이 바람직하고, 추출 전 상기 배박은 분쇄하여 건조 분말 상태로 사용하는 것이 바람직하다.
상기 배박의 분말은 입자 크기가 30 내지 60 메쉬인 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 30 내지 50 메쉬, 더욱 더 바람직하게는 30 내지 40 메쉬인 것을 선별하여 사용할 수 있다. 이 경우 석세포의 밀도가 높아 불필요한 공정을 최소화할 수 있다.
본 발명에서 메쉬(mesh) 단위는 KS A 5101(표준체에 의한 입도를 나타내는 단위)를 기준으로 하였으며, 이에 따른 메쉬와 마이크로미터(㎛) 단위 환산표를 아래의 표 1에 나타내었다.
메쉬(Mesh) 마이크로미터(㎛) 메쉬(Mesh) 마이크로미터(㎛)
10 1900 40 381
12 1520 42 355
14 1300 45 323
16 1130 48 295
18 980 50 279
20 864 60 221
24 701 65 203
28 577 70 185
30 535 80 173
32 500 90 150
35 447 100 140
또는, 상기 배는 개화 후 30 내지 60일이 경과된 배 유과의 분쇄물을 사용할 수 있고, 이때 분쇄물은 건조 분말일 수 있다.상기 알코올 처리에 사용되는 알코올은 에탄올, 프로판올 및 부탄올 중에서 선택된 어느 하나일 수 있고, 바람직하게는 에탄올일 수 있다.
상기 산 처리에 사용되는 산은 염산(HCl), 질산(HNO3), 황산(H2SO4), 불산(HF) 및 인산(H3PO4) 중에서 선택된 1종 이상일 수 있고, 바람직하게는 염산을 사용할 수 있다.
상기 배 유래 석세포 추출방법은 전체 배박 또는 30 내지 60메쉬로 선별된 배박을 사용하는 경우 아래의 순서에 따라 석세포를 추출하는 것이 바람직하다.
먼저, 배에 알코올을 첨가하여 알코올을 혼합한다(단계 a).
상기 알코올은 90 내지 100% 농도의 에탄올 수용액인 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 95 내지 100% 농도의 에탄올 수용액일 수 있다.
상기 반응은 20 내지 30℃에서 반응시키는 것이 바람직하다.
다음으로, 상기 알코올 혼합물을 원심분리 후 상등액을 제거하고 침전물을 수득한다(단계 b).
이후, 상기 침전물에 상기 혼합효소와 완충용액을 첨가하여 효소 반응시켜 효소반응 용액을 제조한다(단계 c).
상기 혼합효소는 침전물의 0.01 내지 0.15wt% 함량으로 첨가하는 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 0.05 내지 0.1wt% 함량으로 첨가할 수 있다.
상기 효소 반응은 35 내지 40℃에서 수행되는 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 36 내지 38℃에서 수행될 수 있다. 상기 온도범위를 벗어나는 경우 배박의 식이섬유의 분해가 충분히 이루어지지 않으므로 석세포의 분리 효율이 저하될 수 있다.
상기 효소 반응은 8 내지 20시간 동안 수행되는 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 10 내지 18시간, 더욱 더 바람직하게는 14 내지 16시간 동안 수행될 수 있다. 8시간 미만으로 반응시킬 경우 식이섬유 분해가 충분히 이루어지기 어렵고, 20시간 초과시에는 불필요한 공정이 되거나 석세포가 손상될 수 있다.
마지막으로, 상기 효소반응 용액을 원심분리한 후 상등액을 제거하고 석세포를 추출한다(단계 d).
한편, 상기 배 유래 석세포 추출방법은 개화 후 30 내지 60일이 경과된 배 유과를 사용하는 경우 아래의 순서에 따라 석세포를 추출하는 것이 바람직하다.
먼저, 배에 알코올을 첨가하여 알코올을 혼합한다(단계 1).
이후, 상기 알코올 혼합물로부터 침전물을 수득한다(단계 2).
다음으로, 상기 침전물에 산을 혼합하여 산처리하고 산처리된 침전물을 수득한다(단계 3).
이후, 상기 산처리된 침전물에 상기 혼합효소와 완충용액을 첨가하여 효소 반응시켜 효소반응 용액을 제조한다(단계 4).
마지막으로, 상기 효소반응 용액을 원심분리한 후 상등액을 제거하고 석세포를 추출한다(단계 5).
상술한 석세포 추출방법에서 세부적인 사항은 배박을 사용한 석세포 추출방법과 동일하다.
이하 본 발명의 실시예를 들어 설명하나 본 발명의 범위가 여기에 한정되는 것은 아니다.
이하 석세포의 추출에서 사용되는 시료는 i) 배박 전체의 건조분말로서 배 전체를 착즙하고 남은 부산물을 65℃~70℃에서 24시간 동안 것조한 것, ii) 30 내지 60mesh의 입자크기로 선별된 배박 건조분말, iii) 개화 후 60일 경과된 어린 배(유과)의 건조분말 3종으로 각각 사용하였다.
비교예 1: 물리적 처리
시료 10g을 1L 삼각플라스크에 정량해 증류수 450㎖를 첨가하여 1시간 동안 25℃에서 120rpm 속도로 반응시킨 후, 8,000rpm으로 원심분리를 10분간 수행하고 4℃로 냉각시켜 상등액 제거함으로써 석세포를 추출하였다.
비교예 2: 에탄올 처리
시료 10g을 1L 삼각플라스크에 정량해 에탄올 450㎖를 첨가하여 1시간 동안 25℃에서 120rpm 속도로 반응시켰다. 이후 8,000rpm으로 원심분리를 10분간 수행하고 4℃로 냉각시켜 상등액 제거함으로써 석세포를 추출하였다.
비교예 3: 염산 처리
시료 10g에 1N HCl 450㎖를 첨가하여 1시간 동안 25℃에서 120 rpm 속도로 반응 후, 증류수 450㎖을 첨가해 3회 씻어낸 후 8,000rpm으로 원심분리를 10분간 수행하고 4℃로 냉각시켜 상등액 제거함으로써 석세포를 추출하였다.
비교예 4: 에탄올 -> 염산 처리
비교예 2와 동일한 조건의 에탄올 처리과정을 거친 후, 증류수로 2번 세척 해 잔류된 에탄올 성분을 원심분리로 제거하고, 비교예 3과 동일한 조건의 염산처리 과정을 순차적으로 거쳐 석세포를 추출하였다.
비교예 5: 염산 -> 에탄올 처리
비교예 3과 동일한 조건으로 염산 처리한 후, 원심분리로 수분 제거하고 비교예 2와 동일한 조건으로 에탄올 처리하여 석세포를 추출하였다.
실시예 1: 혼합효소 처리
시료 10g 에 셀룰레이즈(cellulose)와 헤미셀룰레이즈(hemicellulose)가 1:1중량비로 혼합된 혼합효소를 0.1중량%로 첨가한 후, 소듐아세테이트 버퍼(sodium acetate buffer)(0.01M, pH 5.0)를 450㎖ 첨가하고 37℃에서 80rpm 속도로 15시간 동안 반응시켜 원심분리한 후 상등액을 완전히 제거하고 석세포를 추출하였으며, 최종 시료는 60℃에서 15시간 동안 건조시켰다.
실시예 2: 에탄올 -> 혼합효소 처리
비교예 2와 동일한 조건으로 에탄올 처리한 후 증류수로 2번 세척하고 잔류 에탄올 성분을 원심분리로 제거하고, 실시예 1과 동일한 조건으로 혼합효소 처리하여 석세포를 추출하였다.
실시예 3: 혼합효소 -> 에탄올 처리
실시예 1과 동일한 조건으로 혼합효소 처리 후, 증류수로 2번 세척하고 원심분리하여 버퍼에 함유된 염을 제거하고, 비교예 2와 동일한 조건으로 에탄올 처리하였으며, 최종 시료는 60℃에서 15시간 동안 열풍 건조시켰다.
실시예 4: 염산 -> 혼합효소 처리
비교예 3과 동일한 조건으로 염산 처리한 후, 수득한 시료 pH를 확인하고 물로 3~4번 세척한 후 pH 1.5가 되면 소듐아세테이트 버퍼(0.01M, pH 5.0)를 첨가하여 pH 5.0가 되도록 하였다. 이후 실시예 1과 동일한 조건으로 혼합효소 처리 후 물로 세척하고, 원심분리로 수분 제거 후 60℃에서 15시간 열풍 건조시켰다.
실시예 5: 혼합효소 -> 염산 처리
실시예 1과 동일한 조건으로 혼합효소 처리 후, 증류수로 2번 세척하고 원심분리하여 버퍼에 함유된 염을 제거하고, 비교예 3과 동일한 조건으로 염산 처리하여 석세포를 추출하엿다.
실시예 6: 에탄올 -> 염산 -> 혼합효소 처리
비교예 4와 동일한 조건으로 에탄올 처리 및 염산 처리를 순차적으로 수행한 후, 수득한 시료 pH를 확인하고 물로 3~4번 세척한 후 pH 1.5가 되면 소듐아세테이트 버퍼(0.01M, pH 5.0)를 첨가하여 pH 5.0가 되도록 하였다. 이후 실시예 1과 동일한 조건으로 혼합효소 처리 후 물로 세척하고, 원심분리로 수분 제거 후 60℃에서 15시간 열풍 건조시켰다.
실시예 7: 혼합효소 -> 에탄올 -> 염산 처리
실시예 1과 동일한 조건으로 혼합효소 처리 후 증류수 세척하고, 비교예 4와 동일한 조건으로 에탄올 처리 및 염산 처리를 순차적으로 수행한 후 최종시료를 60℃에서 15시간 열풍 건조시켰다.
*참고로 비교예 1 내지 5, 및 실시예 1 내지 7의 석세포 추출과정 및 석세포의 관찰에 대한 과정의 개략도를 도 1에 나타내었다.
[실험예]
실험예 1: 배박 분말 크기별 배석세포 분석
시료로 사용한 배박은 배즙 제조 후 남은 배박을 물로 2회 세척 후 동결 건조 및 분쇄하여 분말화하였다. 분말화된 배박을 0~120 mesh 범위의 크기별로 분리하여 전체에서 구성되는 배박 입자 크기별 조성을 관찰하였다. 이들을 2% 플로로글루시놀-HCl(phloroglucinol-HCl) 염색 용액을 첨가해 실온에서 1시간 100rpm으로 염색 후 실체현미경(Stereo Zoom microscopy KS-208M, Olympus)으로 20~25배 확대하여 관찰하였다. 이에 따른 배박 입자 크기별 사진과 현미경 이미지를 도 2에 나타내었고, 배박 입자 크기별 함량을 아래의 표 2에 나타내었다. 이때, 석세포의 함량은 색차계의 적색도(a 값)을 이용하여 분석하였다.
크기 (메쉬) 함량 (g/kg DW) 함량 (%) 함량 (%)
10이상 28.2±0.464 2.90 5.6
10-20 10.9±0.202 1.10
20-30 15.8±0.216 1.60
30-40 368.5±9.37 36.90 60.7
40-50 198.2±3.164 19.76
50-60 41.3±0.626 4.07
60-80 30.7±0.414 3.10 33.70
80-120 64.7±1.001 6.40
120이하 242.4±1.848 24.20
전체 100.01 100.0 100.0
이에 따르면, 배유래 석세포는 대부분 30 내지 60 메쉬 크기의 배박입자에 집중되어 있는 것으로 나타났다. 즉, 30 내지 60 메쉬 크기의 배박 입자에 석세포 전체의 60.7%가 존재하는 것으로 나타났으며, 특히, 30 내지 40 메쉬 크기의 배박 입자에 석세포 함량이 36.9%로 가장 높은 것으로 나타났다. 따라서 배박을 재료로 하여 석세포 추출을 수행할 경우 배박 입자의 크기를 선별하면 더욱 높은 수율로 석세포를 추출할 수 있을 것으로 사료된다.
실험예 2: 석세포의 추출 효율 분석
i) 배박 분말, ii) 30 내지 60mesh의 입자크기로 선별된 배박 분말, iii) 개화 후 60일 경과된 어린 배의 분말(유과) 3종의 시료에 대하여 상기 비교예 또는 실시예의 방법에 따라 각각 추출된 석세포를 실험예 1과 동일한 조건으로 염색하여 실체 현미경 이미지를 관찰하였다. i) 배박 분말 유래의 배석세포의 추출조건 별 현미경 이미지를 도 3에 나타내었고, ii) 30 내지 60mesh의 입자크기로 선별된 배박 분말 유래의 배석세포의 추출조건 별 현미경 이미지를 도 4에 나타내었고, iii) 개화 후 60일 경과된 어린 배의 분말(유과) 유래의 배석세포의 추출조건 별 현미경 이미지를 도 5에 나타내었다.
이에 따르면, 석세포의 추출의 시료는 선별된 배박 분말, 배박 분말, 유과 순으로 석세포의 함량이 높은 것으로 나타났으며, 배의 유과는 석세포 함량은 높지만 성장이 완전하지 않아 조직간 한계선이 불분명하여 성숙과의 배박에서 추출하는 것이 바람직하고, 30 내지 60mesh의 입자크기로 선별된 배박 분말을 재료로 하여 추출하는 것이 더욱 적합한 것을 확인할 수 있었다.
또한, 시료별 추출 조건에 따른 석세포 추출효율을 분석한 결과를 아래의 표 3에 나타내었다.
시료명 전체 배박
(%)		 선별 배박
(%)		 유과(60일)
(%)
무처리(비교예1) 15.53f±0.11 32.74h±2.77 26.61i±0.26
단일처리 효소(실시예1) 45.91a±0.79 69.88de±1.13 31.14f±0.08
EtOH(비교예2) 30.52e±0.15 58.86f±1.01 38.22d±0.11
HCl(비교예3) 13.03g±0.28 41.16g±6.97 28.86g±0.12
에탄올
선처리		 EtOH+HCl(비교예4) 31.89e±2.49 66.52e±4.15 38.02d±0.52
EtOH+효소(실시예2) 46.50a±0.20 89.97a±1.15 58.49b±0.12
EtOH+HCl+효소(실시예6) 39.37c±0.20 83.53b±2.31 86.16a±0.22
효소 선처리 효소+HCl(실시예5) 35.01d±0.04 54.21f±1.28 27.39h±0.32
효소+EtOH(실시예3) 43.72b±0.53 80.43bc±4.11 32.95e±0.24
효소+EtOH+HCl(실시예7) 36.64d±1.72 75.85cd±2.40 43.79c±0.81
이에 따르면, 전체 배박이나 선별 배박을 시료로 사용한 경우에는 단일처리군 중에는 실시예 1이 식이섬유를 제거할 수 있는 효소처리이므로 가장 효율적인 것으로 나타났고, 복합처리군 중에는 실시예 2의 에탄올 -> 효소 처리군이 가장 효율이 높은 것으로 나타났고, 염산을 추가 처리한 실시예 6은 오히려 효율이 저하되는 것으로 나타났다. 한편 유과 시료를 사용한 경우에는 실시예 6의 에탄올 -> 염산 -> 효소처리군이 추출 효율이 가능 우수한 것으로 나타났다. 이와 같은 결과는 석세포가 생성중에 있으므로 화학적 처리가 효율을 향상시키는 역할을 한 것으로 보인다.
한편, 동일한 복합처리라 하더라도 에탄올을 선처리한 경우에 효소를 선처리한 경우와 대비하여 15 내지 20% 수율을 향상시키는 것으로 나타났다. 가장 효율적인 방법은 입자크기가 30 내지 50 메쉬로 선별된 배박 분말을 시료로 사용하고 에탄올 -> 효소 처리한 실시예 2의 추출방법으로 나타났다.
실험예 3; 배석세포 크기 및 분포 분석
전체 배박, 선별 배박, 유과로부터 최적 추출조건으로 확보된 시료의 석세포 입자크기를 2% Phloroglucinol-HCl 염색용액을 첨가해 실온에서 1시간 100rpm으로 염색 후 전자현미경 (ino-Lite Digital Microscope AM3111)으로 65배 확대한 이미지를 도 6에 나타내었고, DinoCapture 2.0 (AM/413ZT) 프로그램을 이용해 석세포의 크기를 측정하여 그 결과를 표 4에 나타내었다.
시료명 처리조건 지름 (㎛)
평균 표준편차
전체 배박 무처리(비교예 1) 654.70 268.90
에탄올->효소(실시예 2) 232.11 85.44
선별 배박 무처리(비교예 1) 362.64 82.99
에탄올->효소(실시예 2) 161.8 20.63
유과 무처리(비교예 1) 533.4 355.8
에탄올->염산->효소(실시예 6) 242.6 153.4
이에 따르면, 전자현미경을 이용하여 각 시료의 가장 높은 추출효율을 나타내는 방법으로 수득한 석세포의 크기 및 균일도를 조사한 결과, 전체 배박, 선별배박, 유과 중 선별 배박을 시료로 실시예 2의 방법으로 추출된 석세포의 크기가 161.8㎛로 가장 작고, 표준편차가 20.63㎛로 나타나 균일도도 높은 것으로 나타나 상업적 활용에 가장 적합할 것으로 보인다.
이상, 본 발명의 실시예들에 대하여 설명하였으나, 해당 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 특허청구범위에 기재된 본 발명의 사상으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서, 구성 요소의 부가, 변경, 삭제 또는 추가 등에 의해 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있을 것이며, 이 또한 본 발명의 권리범위 내에 포함된다고 할 것이다.
본 발명의 배 유래 석세포의 추출방법은 배 유래의 석세포를 추출하는데 있어서 복잡한 공정이나 유해한 화학제품의 사용을 하지 않고 알코올과 효소처리만으로 간편하게 석세포를 추출하며, 나아가 석세포가 밀집된 부분을 선별하여 불필요한 공정과 화학물질, 효소의 사용을 최소화하며 고순도의 균일한 크기를 갖는 석세포를 추출할 수 있다.

Claims (16)

  1. 배(pear)에 셀룰레이즈(cellulose) 및 헤미셀룰레이즈(hemicellulose)를 포함하는 혼합효소를 처리하는 단계를 포함하는 배 유래 석세포의 추출방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 혼합효소는 베타클루카네이즈(β-glucanse) 및 펙티나아제(pectinase)를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 배 유래 석세포의 추출방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 배 유래 석세포 추출방법은 알코올 처리 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 배 유래 석세포의 추출방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 배 유래 석세포 추출방법은 산 처리 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 배 유래 석세포의 추출방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 배 유래 석세포 추출방법은,
    상기 알코올 처리 단계; 및 상기 효소 처리 단계;를 순차적으로 수행하는 것을 특징으로 하는 배 유래 석세포의 추출방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 배 유래 석세포 추출방법은,
    상기 알코올 처리 단계; 상기 산 처리 단계; 및 상기 효소 처리 단계;를 순차적으로 수행하는 것을 특징으로 하는 배 유래 석세포의 추출방법.
  7. 제5항에 있어서,
    상기 배 유래 석세포 추출방법은,
    (a) 배에 알코올을 첨가하여 알코올을 혼합하는 단계;
    (b) 상기 알코올 혼합물로부터 침전물을 수득하는 단계; 및
    (c) 상기 침전물에 상기 혼합효소와 완충용액을 첨가하여 효소 반응시켜 효소반응 용액을 제조하는 단계; 및
    (d) 상기 효소반응 용액을 원심분리한 후 상등액을 제거하고 석세포를 추출하는 단계;를 순차적으로 수행하는 것을 특징으로 하는 배 유래 석세포의 추출방법.
  8. 제7항에 있어서,
    단계 (a)에서, 상기 알코올은 90 내지 100% 농도의 에탄올 수용액인 것을 특징으로 하는 배 유래 석세포의 추출방법.
  9. 제7항에 있어서,
    단계 (c)에서, 상기 혼합효소는 고형물의 0.01 내지 0.15wt% 함량으로 첨가하는 것을 특징으로 하는 배 유래 석세포의 추출방법.
  10. 제6항에 있어서,
    상기 배 유래 석세포 추출방법은,
    (1) 배에 알코올을 첨가하여 알코올을 혼합하는 단계;
    (2) 상기 알코올 혼합물로부터 침전물을 수득하는 단계;
    (3) 상기 침전물에 산을 혼합하여 산처리하고 산처리된 침전물을 수득하는 단계;
    (4) 상기 산처리된 침전물에 상기 혼합효소와 완충용액을 첨가하여 효소 반응시켜 효소반응 용액을 제조하는 단계; 및
    (5) 상기 효소반응 용액을 원심분리한 후 상등액을 제거하고 석세포를 추출하는 단계;를 순차적으로 수행하는 것을 특징으로 하는 배 유래 석세포의 추출방법.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 배는 배를 착즙한 후 잔여하는 부산물인 배박의 건조 분말인 것을 특징으로 하는 배 유래 석세포의 추출방법.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 배박의 건조 분말은 입자 크기가 30 내지 60 메쉬인 것을 선별한 것을 특징으로 하는 배 유래 석세포의 추출방법.
  13. 제1항에 있어서,
    상기 배는 개화 후 30 내지 60일이 경과된 배 유과의 분쇄물인 것을 특징으로 하는 배 유래 석세포의 추출방법.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 배 유과의 분쇄물은 건조 분말 상태인 것을 특징으로 하는 배 유래 석세포의 추출방법.
  15. 제3항에 있어서,
    상기 알코올 처리에 사용되는 알코올은 에탄올, 프로판올 및 부탄올 중에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 배 유래 석세포 추출방법.
  16. 제4항에 있어서,
    상기 산 처리에 사용되는 산은 염산(HCl), 질산(HNO3), 황산(H2SO4), 불산(HF) 및 인산(H3PO4) 중에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 배 유래 석세포 추출방법.
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