WO2022045846A1 - 미선나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 안드로겐 수용체 관련 질환 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

미선나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 안드로겐 수용체 관련 질환 치료용 약학적 조성물 Download PDF

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androgen receptor
extract
prostate
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isoquercetin
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이승현
김은경
문상호
최영진
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Definitions

  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for the treatment of androgen receptor-related diseases, and the like, comprising an extract of Miseon tree as an active ingredient.
  • Androgen is a generic term for hormones that affect the growth and development of the male reproductive system. As a hormone that acts on the development of secondary sexual characteristics in men, it is mainly secreted from the testes of men, and some is also secreted from the adrenal cortex and ovaries of women. It is a 19-carbon steroid that is produced by reducing cells including testosterone secreted from the testes. These include dehydrotestosterone, which is converted and excreted in the urine, androsterone or dehydroepiandrosterone, and adrenosterone secreted from the adrenal cortex.
  • Benign prostatic hyperplasia in the past is a condition in which the prostate is enlarged and blocks the passage of urine from the lower part of the bladder, causing obstruction of the urethra, which reduces the flow of urine. Histologically, it was defined as proliferating prostate stromal or prostate epithelial cells. However, recently, the pathophysiology of the disease is too complex to be explained with such a definition or concept. Currently, men over 50 urinate more than 8 times a day, frequent urination, nocturia, and strong and sudden urge to urinate (feeling to urinate).
  • Bladder storage symptoms such as unbearable urge to urinate, delayed urination (a phenomenon in which urine comes out when you urinate when you urinate), interrupted urination (a phenomenon in which the flow of urine is interrupted), and the need for force during urination BPH is defined as a complaint of lower urinary tract symptoms, which collectively refers to symptoms indicating bladder discharge disorders, such as symptoms.
  • Prostate enlargement occurs in the presence of androgens, and anabolic steroids are known to increase prostate capacity and decrease urinary flow, resulting in increased urinary frequency.
  • the prostate is an androgen-dependent organ in which testosterone and its extratesticular origin are activated to the more potent dihydrotestosterone (DHT).
  • DHT dihydrotestosterone
  • the prostate is an important organ for DHT formation, and the systemic effect of endocrine activity of the prostate is mainly involved in DHT formation and its excretion for circulation.
  • the production of DHT increases with age, leading to enlargement and hypertrophy of prostate growth.
  • the importance of DHT is confirmed by clinical studies in which 5 ⁇ -reductase inhibitors have been applied to male patients with BPH. In many cases, treatment with 5 ⁇ -reductase inhibitors is known to significantly reduce prostate DHT level and prostate size.
  • Finasteride is widely used for the treatment of androgen-dependent disorders such as male pattern baldness, enlarged prostate (BPH) and prostate cancer. Finasteride is a competitive and specific inhibitor of 5 ⁇ -reductase, which blocks the conversion of testosterone to DHT in the prostate, hair follicles and other androgen-sensitive tissues, resulting in inhibition of serum and prostate DHT concentrations.
  • conventionally used drugs such as finasteride and dutasteride, have proven to be effective methods of treatment for BPH, their use has been associated with erectile dysfunction, loss of libido, dizziness and It is strictly limited due to side effects such as upper respiratory tract infection.
  • Miseon tree ( ⁇ -, scientific name: Abeliophyllum distichum ) is a tree belonging to the family Aceae, and is the only species belonging to the Miseon tree. It is endemic to the Korean Peninsula, and grows rarely in the sunny foothills of Gyeonggi-do and Chungcheong-do.
  • composition for preventing, improving or treating androgen receptor-related diseases comprising the extract of Miseon tree as an active ingredient.
  • the present inventors completed the present invention by confirming that the Miseon tree extract and isoquercetin, an active ingredient thereof, has anti-androgen activity, inhibits androgen signaling and related factors, and has a significant therapeutic effect on an enlarged prostate animal model.
  • an object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of androgen receptor-related diseases comprising isoquercetin or Miseon tree extract as an active ingredient.
  • Another object of the present invention is to provide a food composition for the prevention or improvement of androgen receptor-related diseases comprising isoquercetin or Miseon tree extract as an active ingredient.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating androgen receptor-related diseases comprising isoquercetin or Miseon tree extract as an active ingredient.
  • the present invention provides a food composition for preventing or improving androgen receptor-related diseases comprising isoquercetin or Miseon tree extract as an active ingredient.
  • the extract is water, an alcohol having 1 to 6 carbon atoms, acetone, ether, benzene, chloroform, ethyl acetate, It may be an extract using one or more solvents selected from the group consisting of methylene chloride, hexane, cyclohexane, petroleum ether, subcritical fluid, and supercritical fluid, but is limited thereto it is not going to be
  • the androgen receptor-related disease may be one or more selected from the group consisting of prostate cancer, prostatic hyperplasia, dysuria and hair loss, but is not limited thereto.
  • the Miseon tree extract may include isoquercetin, but is not limited thereto.
  • the Miseon tree extract may be a Miseon tree leaf extract, but is not limited thereto.
  • the composition may inhibit androgen receptor expression, but is not limited thereto.
  • the composition comprises at least one androgen signal selected from the group consisting of 5AR2 (5 ⁇ -reductase 2), SRC1 (steroid receptor coactivator 1), ER (estrogen receptor), and prostate-specific antigen (PSA). It can inhibit related factors, but is not limited thereto.
  • the composition may inhibit the PI3K/AKT signaling pathway, but is not limited thereto.
  • the food composition may be a health functional food, but is not limited thereto.
  • the present invention provides a method for preventing or treating androgen receptor-related diseases, comprising administering to an individual a composition comprising isoquercetin or Miseon tree extract as an active ingredient.
  • the present invention provides a preventive or therapeutic use of androgen receptor-related diseases of a composition comprising isoquercetin or Miseon tree extract as an active ingredient.
  • the present invention provides the use of isoquercetin or extract of Miseon tree to produce a medicament for the prevention or treatment of androgen receptor-related diseases.
  • the extract or isoquercetin according to the present invention has androgen receptor inhibitory activity and has excellent therapeutic effect on an enlarged prostate animal model. can be widely used for
  • 1A and 1B show testosterone (TP)-induced AR, by treatment with hot water (DW), ethanol (EtOH), and hexane (Hexane) extracts of Abeliophyllum distichum leaf (ADL) to LNCaP (prostate cells); 5AR2 and PSA overexpression inhibitory effect.
  • Figure 2 shows the testosterone (TP)-induced AR, 5AR2, PSA overexpression inhibitory effect of hot water extract (ADLD), ethanol extract (ADLE), and hexane extract (ADLH) of Miseon tree leaves by fluorescence staining.
  • ADLD hot water extract
  • ADLE ethanol extract
  • ADLH hexane extract
  • Figure 3 shows the testosterone (TP)-induced 5AR2, and PSA overexpression inhibitory effect according to the harvest period of Miseon tree leaves.
  • Figure 4 shows the metabolite analysis chromatogram of the ethanol extract of Miseon tree leaves.
  • Figures 5a and 5b are testosterone (TP)-induced AR, 5AR2, and PSA of 4 functional components of Miseon tree (Isoquercetin (IQ), rutin, chlorogenic acid (CA), Isorhamnetin 3-glucoside-7-rhamnoside (IR)) It showed an overexpression inhibitory effect.
  • IQ immunoquercetin
  • CA chlorogenic acid
  • IR Isorhamnetin 3-glucoside-7-rhamnoside
  • 6A and 6B show the inhibitory effect of testosterone (TP)-induced overexpression of AR, 5AR2, PSA and PI3K according to the concentration of isoquercetin (IQ).
  • 7a and 7b show the effect of inhibiting the overexpression of testosterone (TP)-induced PI3K (Cell Signaling), PCNA (SantaCruz) and Cyclin D1 (Cell Signaling) according to the concentration of isoquercetin (IQ) and extracts from Miseon tree leaves.
  • TP testosterone
  • PCNA Cell Signaling
  • Cyclin D1 Cell Signaling
  • FIG 9 shows the production process of an enlarged prostate animal model and the administration plan of the Miseon tree extract.
  • Positive control saw palmetto (saw) or finasteride (Fi).
  • FIG. 10a to 10e show the results of measuring the prostate index after oral administration of 100 mg/kg/d of Miseon tree extract to an enlarged prostate animal model
  • FIG. 10a is the size of the prostate
  • FIG. 10b is the weight of the prostate
  • FIG. Weight is the weight of the prostate
  • FIG. 10D shows the lumen area of the prostate tissue
  • FIG. 10E shows the epithelial thickness of the prostate tissue.
  • 11a shows the expression levels of 5AR2, SCR1, AR, ER and PSA in prostate tissue obtained after oral administration of 100 mg/kg/d of Miseon tree extract to an enlarged prostate animal model.
  • Figure 11b is a quantitative representation of the expression levels of 5AR2, SCR1, AR, ER and PSA in the prostate tissue obtained after oral administration of 100 mg/kg/d of Miseon tree extract to an enlarged prostate animal model.
  • 11c shows the results of observing prostate epithelial cells in prostate tissue obtained after oral administration of 100 mg/kg/d of Miseon tree extract to an enlarged prostate animal model by H&E staining.
  • Figure 11d shows the results of measuring the DHT level in the serum obtained after oral administration of 100 mg/kg/d of Miseon tree extract to an enlarged prostate animal model.
  • Figure 12a shows the results of measuring the expression levels of PI3K, p-AKT, and t-AKT in the prostate tissue obtained after oral administration of 100 mg/kg/d of Miseon tree extract to an enlarged prostate animal model.
  • FIG. 12b shows quantitatively the expression levels of PI3K and p-AKT in prostate tissue obtained after oral administration of 100 mg/kg/d of Miseon tree extract to an animal model of benign prostatic hyperplasia.
  • Figure 13a is EGF (SantaCruz), IGF-1 (ABCam), TGF-1 ⁇ (SantaCruz), and VEGF (SantaCruz) in the prostate tissue obtained after oral administration of 100 mg / kg / d of extract of Miseon tree to an enlarged prostate animal model. Shows the results of measuring the expression level.
  • Figure 13b is EGF (SantaCruz), IGF-1 (ABCam), TGF-1 ⁇ (SantaCruz), and VEGF (SantaCruz) in the prostate tissue obtained after oral administration of 100 mg / kg / d of extract of Miseon tree to an enlarged prostate animal model.
  • the expression level is quantitatively expressed.
  • Figure 14a shows the results of measuring the expression levels of PCNA and Cyclin D1 in the prostate tissue obtained after oral administration of 100 mg/kg/d of Miseon tree extract to an enlarged prostate animal model.
  • Figure 14b shows quantitatively the expression levels of PCNA and Cyclin D1 in the prostate tissue obtained after oral administration of 100 mg/kg/d of Miseon tree extract to an enlarged prostate animal model.
  • 14c shows the results of observing PCNA in prostate tissue obtained after oral administration of 100 mg/kg/d of Miseon tree extract to an enlarged prostate animal model through histochemical staining.
  • Figure 15a shows the results of measuring the expression levels of Bax (SantaCruz) and Bcl-2 (Cell Signaling) in the prostate tissue obtained after oral administration of 100 mg/kg/d of extract of Miseon tree to an enlarged prostate animal model.
  • Figure 15b shows quantitatively the expression levels of Bax (SantaCruz), and Bcl-2 (Cell Signaling) in the prostate tissue obtained after oral administration of 100 mg/kg/d of extract of Miseon tree to an animal model of benign prostatic hyperplasia.
  • FIG. 16 shows the results of measuring the prostate index after oral administration of 1 mg/kg or 10 mg/kg of isoquercetin (IQ) to an enlarged prostate animal model (A: prostate size, B: prostate weight, C: body weight versus prostate weight).
  • IQ isoquercetin
  • FIG. 17 shows the effect of inhibiting the expression of AR, SRC-1, and 5AR2 in prostate tissue obtained after oral administration of 1 mg/kg or 10 mg/kg of isoquercetin (IQ) to an enlarged prostate animal model.
  • IQ isoquercetin
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating androgen receptor-related diseases comprising isoquercetin or Miseon tree extract as an active ingredient.
  • Miseon tree of the present invention may be Miseon tree ( Abeliophyllum distichum ), more preferably Abeliophyllum distichum Nakai, but is not limited thereto.
  • the Miseon tree is a tree belonging to the Ash family, and it is the only species belonging to the Miseon tree. It is endemic to the Korean Peninsula, and grows rarely in the sunny foothills of Gyeonggi-do and Chungcheong-do.
  • the Miseon tree of the present invention can be used as it is without damaging its original form, or after performing a pretreatment process in consideration of the process speed and process (manufacturing) efficiency intended by those skilled in the art, the pretreatment process includes, for example, a conventional Phosphorus screening, washing with water, cutting, powdering, drying, etc. may be performed.
  • the harvest time of the Miseon tree of the present invention is not limited, it may be harvested in spring or autumn, preferably in autumn, more preferably in late autumn.
  • the extract of Miseon tree of the present invention may be obtained from the whole plant or a part of a plant, for example, it may be obtained from a site including one or more selected from the group consisting of stems, roots, leaves, fruits, and flowers. In an embodiment of the present invention, an extract was obtained from the leaves of Miseon tree.
  • the extract of Miseon tree of the present invention may be extracted by a known natural product extraction method.
  • extraction may be performed with one or more solvents selected from the group consisting of water, an organic solvent having 1 to 6 carbon atoms, and a subcritical or supercritical fluid.
  • the organic solvent having 1 to 6 carbon atoms is alcohol, acetone, ether, benzene, chloroform, ethyl acetate, methylene chloride, having 1 to 6 carbon atoms. chloride), hexane, cyclohexane, and petroleum ether may be at least one selected from the group consisting of, but is not limited thereto.
  • the Miseon tree extract of the present invention may preferably be extracted with ethanol, but is not limited thereto.
  • extraction method conventional extraction methods such as cold extraction, warm soaking, and heating using the above solvent can be used.
  • the ethanol concentration is not limited, for example, 30 to 100%, 40 to 100%, 50 to 100%, 60 to 100%, 50 to 90%, 60 to 90%, 60 to 80 %, 65-75%, or about 70% ethanol extract.
  • isoquercetin (isoquercetin) is also named as IUPAC name “3-( ⁇ -D-Glucopyranosyloxy)-3′,4′,5,7-tetrahydroxyflavone”, has a molecular formula C 21 H 20 O 12 and a molecular weight This 464.379 [g/mol] compound has a CAS registration number 482-35-9.
  • the isoquercetin may be represented by Formula 1 below.
  • the composition may inhibit the expression of androgen receptor, but is not limited thereto.
  • the composition may inhibit one or more androgen signal-related factors selected from the group consisting of 5AR2 (5 ⁇ -reductase 2), SRC1 (steroid receptor coactivator 1), ER (estrogen receptor), and prostate-specific antigen (PSA).
  • 5AR2 5 ⁇ -reductase 2
  • SRC1 steroid receptor coactivator 1
  • ER ER
  • PSA prostate-specific antigen
  • the composition may inhibit the PI3K / AKT signaling pathway, but is not limited thereto.
  • the inhibitory effect of the Miseon tree extract harvested in late autumn is the inhibitory effect of the Miseon tree extract harvested in late spring It was confirmed that more excellent (see Example 4),
  • the extract of Miseon tree or isoquercetin of the present invention can be used as an active ingredient in a composition for treating androgen receptor-related diseases.
  • the term “androgen receptor-related disease” refers to various diseases caused by signal transduction that may occur due to abnormal excessive stimulation of androgen receptor (AR), and is not particularly limited to the type, but prostate cancer , prostate enlargement, dysuria and hair loss, etc. can be exemplified.
  • AR androgen receptor
  • prostate cancer cells mainly depend on androgen receptors for growth and survival, which is essential for both androgen-dependent and non-dependent prostate cancer. Therefore, therapies that can inhibit the transcriptional action of androgen receptors play an important role in the treatment of prostate cancer.
  • DHT dihydrotestosterone
  • AH Androgenic hormones
  • Miseon tree extract or isoquercetin of the present invention can inhibit androgen receptor expression at the transcriptional level (mRNA level), so it is useful to treat androgen receptor-related diseases such as prostate cancer, prostatic hypertrophy, urination disorder and hair loss.
  • mRNA level transcriptional level
  • isoquercetin may be included as an active ingredient in the form of a pharmaceutically acceptable salt.
  • pharmaceutically acceptable salt includes salts derived from pharmaceutically acceptable inorganic acids, organic acids, or bases.
  • acids examples include hydrochloric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, nitric acid, perchloric acid, fumaric acid, maleic acid, phosphoric acid, glycolic acid, lactic acid, salicylic acid, succinic acid, toluene-p-sulfonic acid, tartaric acid, acetic acid, citric acid, methanesulfonic acid, formic acid , benzoic acid, malonic acid, gluconic acid, naphthalene-2-sulfonic acid, benzenesulfonic acid, and the like.
  • Acid addition salts can be prepared by conventional methods, for example, by dissolving the compound in an aqueous solution of an excess of acid, and precipitating the salt using a water-miscible organic solvent such as methanol, ethanol, acetone or acetonitrile. It can also be prepared by heating an equimolar amount of the compound and an acid or alcohol in water and then evaporating the mixture to dryness, or by suction filtration of the precipitated salt.
  • a water-miscible organic solvent such as methanol, ethanol, acetone or acetonitrile.
  • Salts derived from suitable bases may include, but are not limited to, alkali metals such as sodium and potassium, alkaline earth metals such as magnesium, and ammonium.
  • the alkali metal or alkaline earth metal salt can be obtained, for example, by dissolving the compound in an excess alkali metal hydroxide or alkaline earth metal hydroxide solution, filtering the undissolved compound salt, and then evaporating and drying the filtrate.
  • the metal salt it is pharmaceutically suitable to prepare a sodium, potassium or calcium salt, and the corresponding silver salt can be obtained by reacting an alkali metal or alkaline earth metal salt with a suitable silver salt (eg, silver nitrate).
  • the content of the Miseon tree extract or isoquercetin in the composition of the present invention can be appropriately adjusted according to the symptoms of the disease, the degree of progression of the disease, the condition of the patient, etc., for example, 0.0001 to 99.9% by weight, or 0.001 based on the total weight of the composition. to 50% by weight, but is not limited thereto.
  • the content ratio is a value based on the dry amount from which the solvent is removed.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention may further include suitable carriers, excipients and diluents commonly used in the preparation of pharmaceutical compositions.
  • the excipient may be, for example, at least one selected from the group consisting of a diluent, a binder, a disintegrant, a lubricant, an adsorbent, a humectant, a film-coating material, and a controlled-release additive.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention can be prepared according to a conventional method, respectively, in powders, granules, sustained-release granules, enteric granules, liquids, eye drops, elsilic, emulsions, suspensions, alcohols, troches, fragrances, and limonaade.
  • tablets, sustained release tablets, enteric tablets, sublingual tablets, hard capsules, soft capsules, sustained release capsules, enteric capsules, pills, tinctures, soft extracts, dry extracts, fluid extracts, injections, capsules, perfusates, Warnings, lotions, pasta, sprays, inhalants, patches, sterile injection solutions, or external preparations such as aerosols can be formulated and used, and the external preparations are creams, gels, patches, sprays, ointments, warning agents , lotion, liniment, pasta, or cataplasma.
  • Carriers, excipients and diluents that may be included in the pharmaceutical composition according to the present invention include lactose, dextrose, sucrose, oligosaccharide, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, gum acacia, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinyl pyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil.
  • formulation it is prepared using commonly used diluents or excipients such as fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrants, and surfactants.
  • water diluted hydrochloric acid, diluted sulfuric acid, sodium citrate, monostearate sucrose, polyoxyethylene sorbitol fatty acid esters (Twinester), polyoxyethylene monoalkyl ethers, lanolin ethers, Lanolin esters, acetic acid, hydrochloric acid, aqueous ammonia, ammonium carbonate, potassium hydroxide, sodium hydroxide, prolamine, polyvinylpyrrolidone, ethyl cellulose, sodium carboxymethyl cellulose, etc.
  • water diluted hydrochloric acid, diluted sulfuric acid, sodium citrate, monostearate sucrose, polyoxyethylene sorbitol fatty acid esters (Twinester), polyoxyethylene monoalkyl ethers, lanolin ethers, Lanolin esters, acetic acid, hydrochloric acid, aqueous ammonia, ammonium carbonate, potassium hydroxide, sodium hydroxide, prolamine, polyvinylpyrrolidone,
  • sucrose solution other sugars or sweeteners may be used, and if necessary, a fragrance, colorant, preservative, stabilizer, suspending agent, emulsifying agent, thickening agent, etc. may be used.
  • Purified water may be used in the emulsion according to the present invention, and if necessary, an emulsifier, preservative, stabilizer, fragrance, etc. may be used.
  • Suspending agents such as acacia, tragacantha, methylcellulose, carboxymethylcellulose, sodium carboxymethylcellulose, microcrystalline cellulose, sodium alginate, hydroxypropylmethylcellulose (HPMC), HPMC1828, HPMC2906, HPMC2910 may be used in the suspending agent according to the present invention. and, if necessary, surfactants, preservatives, stabilizers, colorants, and fragrances may be used.
  • the injection according to the present invention includes distilled water for injection, 0.9% sodium chloride injection solution, ring gel injection solution, dextrose injection solution, dextrose + sodium chloride injection solution, PEG (PEG), lactated ring gel injection solution, ethanol, propylene glycol, non-volatile oil-sesame oil , solvents such as cottonseed oil, peanut oil, soybean oil, corn oil, ethyl oleate, isopropyl myristate, and benzene benzoate; Solubilizing aids such as sodium benzoate, sodium salicylate, sodium acetate, urea, urethane, monoethylacetamide, butazolidine, propylene glycol, tweens, nijeongtinamide, hexamine, and dimethylacetamide; Weak acids and their salts (acetic acid and sodium acetate), weak bases and their salts (ammonia and ammonium acetate), organic compounds, proteins, buffers such as albumin
  • the suppository according to the present invention includes cacao fat, lanolin, witepsol, polyethylene glycol, glycerogelatin, methyl cellulose, carboxymethyl cellulose, a mixture of stearic acid and oleic acid, Subanal, cottonseed oil, peanut oil, palm oil, cacao butter + Cholesterol, Lecithin, Lanet Wax, Glycerol Monostearate, Tween or Span, Imhausen, Monolene (Propylene Glycol Monostearate), Glycerin, Adeps Solidus, Butyrum Tego -G), Cebes Pharma 16, Hexalide Base 95, Cotomar, Hydroxote SP, S-70-XXA, S-70-XX75 (S-70-XX95), Hydro Hydrokote 25, Hydrokote 711, Idropostal, Massa estrarium, A, AS, B, C, D, E, I, T, Massa-MF, Masupol, Masupol-15, Neos
  • Solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, etc., and these solid preparations include at least one excipient in the extract, for example, starch, calcium carbonate, sucrose ) or lactose, gelatin, etc.
  • excipients for example, starch, calcium carbonate, sucrose ) or lactose, gelatin, etc.
  • lubricants such as magnesium stearate and talc are also used.
  • Liquid formulations for oral administration include suspensions, solutions, emulsions, syrups, etc.
  • various excipients such as wetting agents, sweeteners, fragrances, preservatives, etc. may be included.
  • Formulations for parenteral administration include sterile aqueous solutions, non-aqueous solutions, suspensions, emulsions, freeze-dried preparations, and suppositories.
  • Non-aqueous solvents and suspending agents include propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, and injectable esters such as ethyl oleate.
  • composition according to the present invention is administered in a pharmaceutically effective amount.
  • pharmaceutically effective amount means an amount sufficient to treat a disease at a reasonable benefit/risk ratio applicable to medical treatment, and the effective dose level is determined by the type, severity, drug activity, and type of the patient's disease; Sensitivity to the drug, administration time, administration route and excretion rate, treatment period, factors including concurrent drugs and other factors well known in the medical field may be determined.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention may be administered as an individual therapeutic agent or may be administered in combination with other therapeutic agents, may be administered sequentially or simultaneously with conventional therapeutic agents, and may be administered singly or multiple times. In consideration of all of the above factors, it is important to administer an amount capable of obtaining the maximum effect with a minimum amount without side effects, which can be easily determined by a person skilled in the art to which the present invention pertains.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be administered to an individual by various routes. All modes of administration can be contemplated, for example, oral administration, subcutaneous injection, intraperitoneal administration, intravenous injection, intramuscular injection, paraspinal space (intrathecal) injection, sublingual administration, buccal administration, rectal insertion, vaginal It can be administered according to internal insertion, ocular administration, ear administration, nasal administration, inhalation, spraying through the mouth or nose, skin administration, transdermal administration, and the like.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is determined according to the type of drug as an active ingredient along with several related factors such as the disease to be treated, the route of administration, the patient's age, sex, weight, and the severity of the disease.
  • “individual” means a subject in need of treatment for a disease, and more specifically, human or non-human primates, mice, rats, dogs, cats, horses, cattle, etc. It may be a mammal of, but is not limited thereto.
  • administration means providing a given composition of the present invention to a subject by any suitable method.
  • prevention means any action that inhibits or delays the onset of a desired disease
  • treatment means that the desired disease and metabolic abnormalities are improved or It means all actions that are advantageously changed
  • improvement means all actions that reduce the parameters related to the desired disease, for example, the degree of symptoms by administration of the composition according to the present invention.
  • the present invention provides a food composition comprising Miseon tree extract or isoquercetin as an active ingredient.
  • food includes functional food and health functional food.
  • the Miseon tree extract or isoquercetin of the present invention When used as a food additive, the Miseon tree extract may be added as it is or used together with other foods or food ingredients, and may be appropriately used according to a conventional method.
  • the mixed amount of the active ingredient may be appropriately determined according to the purpose of use (prevention, health or therapeutic treatment).
  • the extract of Miseon tree of the present invention may be added in an amount of 15% by weight or less, or 10% by weight or less based on the raw material.
  • the amount may be less than the above range, and since there is no problem in terms of safety, the active ingredient may be used in an amount above the above range.
  • Examples of foods to which the above substances can be added include meat, sausage, bread, chocolate, candy, snacks, confectionery, pizza, ramen, other noodles, gums, dairy products including ice cream, various soups, beverages, tea, drinks, There are alcoholic beverages and vitamin complexes, and includes all health functional foods in the ordinary sense.
  • the health beverage composition according to the present invention may contain various flavoring agents or natural carbohydrates as additional ingredients, as in a conventional beverage.
  • the above-mentioned natural carbohydrates are monosaccharides such as glucose and fructose, disaccharides such as maltose and sucrose, polysaccharides such as dextrin and cyclodextrin, and sugar alcohols such as xylitol, sorbitol and erythritol.
  • natural sweeteners such as taumartin and stevia extract, synthetic sweeteners such as saccharin and aspartame, and the like can be used.
  • the proportion of the natural carbohydrate is generally about 0.01-0.20 g, or about 0.04-0.10 g per 100 mL of the composition of the present invention.
  • the composition of the present invention includes various nutrients, vitamins, electrolytes, flavoring agents, coloring agents, pectic acid and its salts, alginic acid and its salts, organic acids, protective colloidal thickeners, pH adjusters, stabilizers, preservatives, glycerin, alcohol, Carbonating agents used in carbonated beverages, etc. may be contained.
  • the composition of the present invention may contain the pulp for the production of natural fruit juice, fruit juice beverage, and vegetable beverage. These components may be used independently or in combination. Although the proportion of these additives is not critical, it is generally selected in the range of 0.01-0.20 parts by weight per 100 parts by weight of the composition of the present invention.
  • Miseon trees were provided by the Woori Tree Farming Association. 1000 mL of distilled water (DW) was added to 100 g of Abeliophyllum distichum Nakai leaves in an Erlenmeyer flask, and extracted by boiling at 100 °C for 1 hour. The extract was filtered under reduced pressure (0.2 ⁇ m pore size) and then concentrated using a rotary vacuum concentrator. Then, it was freeze-dried for 5 days using a freeze dryer.
  • DW distilled water
  • LNCaP cells (5x10 4 ) were dispensed and the cells were attached to the slide. After 24 hours, testosterone was treated with 100 nM and hot water (DW), ethanol (EtOH), and hexane (Hexane) extracts of Abeliophyllum distichum Nakai leaf (ADL) were treated with 100 ⁇ g/ml, respectively. After 24 hours, the cells were fixed in cold methanol and then treated with 0.1% Triton X-100 for 1 hour. After blocking with 5% goat serum, slides were treated with androgen receptor (AR) antibody (1:300) diluted with BSA overnight at 4°C.
  • AR androgen receptor
  • AlexaFluor 588 secondary antibody (1:1,000 dilution) was treated for 1 hour. After the nuclei were stained with DAPI staining, they were mounted with a cover glass. The expression level of AR was confirmed using a Zeiss fluorescence microscope.
  • LNCaP cells are treated with testosterone propionate (TP) to induce androgen receptor signals, and AR (androgen receptor, SantaCruz) extracts are treated with DW, ethanol (EtOH), and hexane extracts ), 5AR2 (5 alpha reductase, ABCam), and PSA (prostate specific antigen, SantaCruz) expression inhibitory effects were confirmed and the inhibitory ability of androgen receptor signal-related factors for each extract of Miseon tree leaves in LNCaP cells was compared.
  • TP testosterone propionate
  • the cells were lysed in a RIPA (Radioimmunoprecipitation assay) buffer containing a protein inhibitor cocktail (Sigma), the protein concentration was estimated using a BCA assay, and then electrophoresed on a 12% SDS polyacrylamide gel. , The gel was transferred to the membrane using Mini Trans-Blot ® cells (Bio rad). Thereafter, the primary antibody was treated on the membrane at 4° C. for 12 hours. Then, after washing 3 times for 5 minutes using TBST, the secondary antibody was treated for 1 hour. Then, the color was developed on the HPR substrate (Advansta Inc., San Jose, CA, USA), and the band was confirmed using the Azure c300 imaging system (Azure Biosystems) equipment. The band intensity was quantified by setting the area of each sample using Image J software (NIH ver. 1.48, USA) and calculating the area of the relative ⁇ -Actin in the same way and dividing the value.
  • RIPA Radioimmunoprecipitation assay
  • mice were sacrificed using zoletil, blood was collected through a heart puncture, and serum was separated and stored at -80°C. After separating the prostate with a surgical instrument from which RNAse has been removed, weighing it, and storing it at -80°C, a Western blot experiment was performed.
  • isoquercetin (IQ) administration also used the same method and control group, the low concentration administration group (BPH+IQ1) dissolved IQ in sterile distilled water 1 mg/kg, the high concentration administration group (BPH+IQ10) 10 mg/kg was orally administered using a sonde for 4 weeks.
  • Prostate tissue was fixed in 10% formaldehyde, dehydrated, and embedded in paraffin.
  • the paraffin block was cut into 4 ⁇ m using a microtome (Leica).
  • Leica microtome
  • the cut sections were deparaffinized using xylene, washed, and then stained with hematoxylin for 5 minutes and then washed with water for 5 minutes. After that, after staining with eosin for 30 seconds, it was dehydrated and encapsulated.
  • Tissues were analyzed using a Leica DM6 Research Inverted Phase microscope (Leica, Werzlar, Germany). Epithelial thickness and lumen area were measured using Leica Application Suite (LAS) microscopy software.
  • LAS Leica Application Suite
  • the protein expression of androgen signaling related factors 5AR2 (5alpha reductase), SRC-1 (steroid receptor coactivator), AR (androgen receptor), ER (estrogen receptor), and PSA (prostate specific antigen) was analyzed for the animal test group. .
  • RIPA buffer containing protein inhibitor cocktail (Sigma) was added to the ventral prostate lobe region, and then the prostate tissue was homogenized using a tacoPrep Bead beater. After estimating the protein concentration using a protein BCA assay, electrophoresis was performed on a 12% SDS polyacrylamide gel, and the gel was transferred to the membrane using Mini Trans-Blo ® cells (Bio rad).
  • the membrane was treated with the primary antibody for each protein at 4° C. for 12 hours, washed 3 times for 5 minutes using TBST, and treated with the secondary antibody for 1 hour. Then, the color was developed on the HPR substrate (Advansta Inc., San Jose, CA, USA), and the band was confirmed using the Azure c300 imaging system (Azure Biosystems) equipment. The band intensity was quantified by setting the area of each sample using Image J software (NIH ver. 1.48, USA), setting the area of the relative ⁇ -Actin in the same way, and calculating by dividing the value.
  • the sections were placed in 0.01M citrate buffer (pH, 6.0) for antigen retrieval and reacted in a microwave for 10 minutes. After leaving at room temperature for 10 minutes, washed with DW, and then treated with 3% H 2 O 2 for 10 minutes. Then, non-specific binding was blocked by treatment with goat serum. Then, the sections were aliquoted with anti-PCNA and anti-AR and reacted overnight at 4°C. After treatment with secondary antibody for 1 hour, all immunostained sections were counted with hematoxylin, and tissues were analyzed using a Leica DM6 Research Inverted Phase microscope (Leica, Werzlar, Germany).
  • EGF Epidermal growth factor
  • IGF-1 Insulin like growth factor I
  • TGF-1 ⁇ Transforming growth factor beta 1
  • VEGF Vascular endothelial growth factor
  • MS operating conditions are as follows: capillary voltage 2.5kV, sample cone 20V, ion source temperature 200°C, desolvation temperature 400°C, cons gas 30L/h, desolvation gas 900L/h, scan time 0.2sec, scan range m/z 50 -1500, collision energy ramp 10-30 eV (m/z 50-1000).
  • Testosterone-induced AR, 5AR2, and PSA expression levels were confirmed by treating prostate cells LNCaP with hot water, ethanol, and hexane extracts of Miseon tree leaves prepared in Examples 1-1 to 1-3.
  • 5AR2 is known to play an important role in the development of normal prostate and prostate enlargement in old age. It is known that when AR expression is increased, DHT in the prostate binds to more AR, thereby causing enlargement of the prostate. In addition, AR binds to DHT and promotes the production of PSA, a prostate-specific antigen.
  • the hot water extract of Miseon tree significantly reduced AR and 5AR2 increased by testosterone
  • the hexane extract significantly reduced the expression of 5AR2 and PSA
  • the ethanol extract significantly reduced AR
  • UPLC-MS was used to analyze the active ingredient of the ethanol extract of Miseon tree leaf.
  • isoquercetin (IQ), rutin, chlorogenic acid (CA), isoramnetin 3-glucoside-7-rhamnoside (IR) as functional components of ethanol extract of Miseon tree leaf were prepared based on the above results. was selected, and the effect on the expression of factors related to prostatic hyperplasia was confirmed.
  • Example 5-1 Testosterone-induced differences in the expression levels of AR, 5AR2, and PSA of the four candidate functional ingredient candidates selected in Example 5-1 (IQ, Rutin, CA, IR) were confirmed. The method was performed in the same manner as in Example 2.
  • BPH-1 cells were treated with 100 nM of testosterone to induce cell proliferation, and 25, 50, and 100 ⁇ M of isoquercetin (IQ), and 25, 50, and 100 ⁇ g/ml of ethanol extract from Miseon tree leaves were treated for 24 hours, respectively.
  • the inhibitory effect on the expression of PI3K, proliferating cell nuclear antigen (PCNA), and cyclin D1 was confirmed.
  • PCNA proliferating cell nuclear antigen
  • cyclin D1 was confirmed.
  • the method was performed in the same manner as in Example 2.
  • PCNA is a factor that is increased when prostatic hyperplasia is induced
  • Cyclin D1 is a cell cycle positive regulator in prostate cells.
  • isoquercetin which shows both functionality and differentiation according to time, was judged to be appropriate.
  • the prostate index was significantly lowered in the mice ingesting the extract of Miseon tree leaf extract (ADLE) harvested in the fall compared to the positive control group.
  • ADLE Miseon tree leaf extract
  • the prostate weight was significantly reduced
  • the prostate weight to body weight was also significantly lowered compared to the prostatic hyperplasia induction model
  • the prostate epithelial thickness was also significantly reduced compared to the prostatic hyperplasia model
  • the positive control saw palmetto it was confirmed that the effect was excellent compared to finaceride.
  • Miseon tree extract significantly improves the levels of androgen receptor and prostate-related factors, such as reducing the expression levels of 5AR2, SRC1, AR, ER, and PSA, which are androgen receptor signal-related factors, It was confirmed that it exhibits a significant therapeutic effect on an enlarged prostate animal model. Therefore, it can be seen that the extract of Miseon tree of the present invention can be used for the treatment of diseases related to androgen receptors and prostate.
  • Example 7-1 in order to confirm whether isoquercetin, a functional component of the Miseon tree extract, exhibits an effect in vivo, an enlarged prostate animal model was prepared and an experiment was conducted.
  • isoquercetin significantly improves the levels of androgen receptor and prostate-related factors, such as reducing the expression levels of 5AR2, SRC-1, and AR, which are factors related to androgen receptor signaling, as well as a significant treatment for an enlarged prostate animal model. It was confirmed that the effect was shown. Therefore, it is expected that isoquercetin, a functional component of Miseon tree extract, can be used for the treatment of diseases related to androgen receptors and prostate.
  • the extract or isoquercetin according to the present invention has androgen receptor inhibitory activity and has excellent therapeutic effect on an enlarged prostate animal model. It can be widely used in the industry, so it has industrial applicability.

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Abstract

본 발명은 미선나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 안드로겐 수용체 관련 질환 치료용 약학적 조성물 등에 관한 것으로, 본 발명에 따른 미선나무 추출물 또는 이소퀘르세틴은 안드로겐 수용체 억제 활성이 있으며, 전립선 비대증 동물모델에 대한 치료 효과가 우수하므로, 안드로겐 수용체 관련 질환인 전립선비대증, 안드로겐 의존성 탈모, 배뇨장애 및 전립선암 등 관련 치료제 산업에 널리 활용될 수 있다.

Description

미선나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 안드로겐 수용체 관련 질환 치료용 약학적 조성물
본 발명은 미선나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 안드로겐 수용체 관련 질환 치료용 약학적 조성물 등에 관한 것이다.
본 출원은 2020년 8월 31일에 출원된 한국특허출원 제10-2020-0109845호 및 2021년 8월 27일에 출원된 한국특허출원 제10-2021-0114027호에 기초한 우선권을 주장하며, 해당 출원의 명세서 및 도면에 개시된 모든 내용은 본 출원에 원용된다.
안드로겐(androgen)은 남성 생식계 성장과 발달에 영향을 미치는 호르몬의 총칭으로, 남성호르몬이라고도 하며, 남성호르몬의 작용을 나타내는 모든 물질을 일컫는 말이다. 남성의 2차 성징 발달에 작용하는 호르몬으로 주로 남성의 정소에서 분비되며 일부는 부신피질과 여성의 난소에서도 분비되는데, 탄소원자 19개를 가진 스테로이드로서 고환에서 분비되는 테스토스테론을 비롯하여 세포에서 환원되어 생성되는 디히드로테스토스테론(dehydrotestosterone), 그것이 변하여 오줌 속에 배설되는 안드로스테론이나 디히드로에피안드로스테론(dehydroepiandrosterone) 등과 부신피질에서 분비되는 아드레노스테론 등이 포함된다.
이들은 생식기관이나 그 밖의 성적 특징의 발육이나 유지 및 기능을 관장한다. 특히 뼈 조직에서 단백질의 증가, 신장의 무게와 크기 증가, 땀과 피지샘의 활동 증가, 적혈구 세포의 재생 등에 관여하고, 피부에 작용하면 표피의 각질층이 두꺼워져 피지가 증가하므로, 사춘기의 청소년들에게 발생하는 여드름의 원인이 되기도 한다. 또한 체모와도 관계가 있는데, 남성의 수염의 경우는 안드로겐이 증가할수록 증가하는 경향을 보이지만, 이마나 정수리부위의 털이 줄어드는 탈모를 진행시키기도 한다.
이와 같이 안드로겐이 비정상적으로 증가하여 발생하는 안드로겐 의존성 질환 중에서 전립선 비대증(Benign prostatic hyperplasia, BPH)은 과거에는 전립선이 비대해져 방광 하부의 소변이 나오는 통로를 막아 요도 폐색을 일으켜 소변의 흐름이 감소된 상태로 정의하였고, 조직학적으로는 전립선 간질이나 전립선의 상피조직 세포가 증식된 것으로 정의하였다. 하지만, 최근에는 이와 같은 정의나 개념으로 설명하기에는 질병의 병태 생리가 너무 복잡하여, 현재는 50세 이상의 남성에서 하루 8회 이상 소변을 보는 빈뇨, 야간 빈뇨, 강하고 갑작스런 요의(오줌이 마려운 느낌)를 느끼면서 소변이 마려우면 참을 수 없는 절박뇨 등의 방광 저장 증상과 지연뇨(소변을 볼 때 뜸을 들여야 소변이 나오는 현상), 단절뇨(소변의 흐름이 끊기는 현상), 배뇨 시 힘을 주어야 하는 현상 등 방광의 배출 장애를 나타내는 증상을 통칭한 하부 요로증상의 호소로 전립선 비대증을 정의하고 있다.
주요한 임상적 특징으로는 전립선 확대(prostate enlargement) 및 하부 요로(lower urinary tract) 징후가 있다. 전립선 확대는 안드로겐의 존재 하에서 일어나고, 단백동화 스테로이드들(anabolic steroids)이 전립선의 용량을 증가시키며 요류 속도(urine flow)를 감소시켜 증가된 배뇨 빈도(urinary frequency)를 유발한다고 알려져 있다.
전립선은 테스토스테론 및 이의 고환 외부 기원 전구체들(extratesticular origin)이 더욱 강력한 DHT(dihydrotestosterone)로 활성화되는 안드로겐-의존성 기관이다. 통상적으로, 전립선은 DHT 형성의 중요한 기관으로, 전립선의 내분비 활성의 전반적인 효과(systemic effect)는 주로 DHT 형성 및 순환(circulation)을 위한 이의 배출에 관여된다. DHT의 생산은 나이가 듦에 따라 증가하여 전립선 성장의 증대 및 비대증을 유발한다. DHT의 중요성은 5α-환원효소(5α-reductase) 억제제가 BPH 남성 환자에 적용된 임상 연구들에 의해 확인된다. 많은 경우에, 5α-환원효소 억제제를 이용한 치료법은 전립선의 DHT 레벨과 전립선 크기를 현저하게 감소시킨다는 것이 알려져 있다. 피나스테라이드(finasteride)는 안드로겐-의존성 질환들, 예를 들어 남성형 대머리, 전립선 비대증(BPH) 및 전립선암의 치료에 폭넓게 이용되고 있다. 피나스테라이드는 5α-환원효소의 경쟁적 및 특이적 억제제로, 전립선, 모낭세포(hair follicles) 및 다른 안드로겐-민감성 조직에서 테스토스테론의 DHT 전환을 차단하여 혈청 및 전립선 내 DHT 농도의 억제를 초래한다. 피나스테라이드 및 두타스테라이드(dutasteride) 같은 종래에 이용된 약물들은 BPH의 효과적인 치료 방법이라는 것이 증명되었지만, 이들의 사용은 발기 부전(erectile dysfunction), 성욕감퇴(loss of libido), 현기증(dizziness) 및 상기도 감염(upper respiratory tract infection) 같은 부작용들로 인하여 엄격하게 제한되고 있다.
한편, 미선나무(尾扇-, 학명: Abeliophyllum distichum)는 물푸레나무과에 속하는 나무로, 미선나무속에 속하는 유일한 종이다. 한반도의 고유종이며, 경기도와 충청도의 볕이 잘 드는 산기슭에서 드물게 자란다.
하지만, 미선나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 안드로겐 수용체 관련 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 대해서는 알려진 바 없다.
이에 본 발명자들은 미선나무 추출물 및 그 활성 성분인 이소퀘르세틴이 항안드로겐 활성이 있으며 안드로겐 시그널링 및 관련 인자들을 억제하고, 전립선 비대증 동물모델에 대한 치료 효과가 유의함을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 이소퀘르세틴 또는 미선나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 안드로겐 수용체 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 이소퀘르세틴 또는 미선나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 안드로겐 수용체 관련 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 이소퀘르세틴 또는 미선나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 안드로겐 수용체 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 이소퀘르세틴 또는 미선나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 안드로겐 수용체 관련 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 추출물은 물, 탄소수 1 내지 6개의 알코올(alcohol), 아세톤(acetone), 에테르(ether), 벤젠(benzene), 클로로포름(chloroform), 에틸아세테이트(ethyl acetate), 메틸렌클로라이드(methylene chloride), 헥산(hexane), 시클로헥산(cyclohexane), 석유에테르(petroleum ether), 아임계 유체, 및 초임계 유체로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 용매에 의한 추출물일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 실시예에서, 상기 안드로겐 수용체 관련 질환은 전립선암, 전립선비대증, 배뇨장애 및 탈모로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 실시예에서, 상기 미선나무 추출물은 이소퀘르세틴을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 실시예에서, 상기 미선나무 추출물은 미선나무 잎 추출물일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 실시예에서, 상기 조성물은 안드로겐 수용체의 발현을 억제할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 실시예에서, 상기 조성물은 5AR2(5α-reductase 2), SRC1(steroid receptor coactivator 1), ER(estrogen receptor), 및 전립선특이항원(PSA)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 안드로겐 신호 관련 인자를 억제할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 실시예에서, 상기 조성물은 PI3K/AKT 시그널링 경로를 억제할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 실시예에서, 상기 식품 조성물은 건강기능식품일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 이소퀘르세틴 또는 미선나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 안드로겐 수용체 관련 질환의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 이소퀘르세틴 또는 미선나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물의 안드로겐 수용체 관련 질환의 예방 또는 치료 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 이소퀘르세틴 또는 미선나무 추출물의 안드로겐 수용체 관련 질환의 예방 또는 치료 약제를 생산하기 위한 용도를 제공한다.
본 발명에 따른 미선나무 추출물 또는 이소퀘르세틴은 안드로겐 수용체 억제 활성이 있으며, 전립선 비대증 동물모델에 대한 치료 효과가 우수하므로, 안드로겐 수용체 관련 질환인 전립선비대증, 안드로겐 의존성 탈모, 배뇨장애 및 전립선암 등 관련 산업에 널리 활용될 수 있다.
도 1a 및 도 1b는 미선나무 잎(Abeliophyllum distichum leaf, ADL)의 열수(D.W.), 에탄올(EtOH), 헥산(Hexane) 추출물을 LNCaP(전립선 세포)에 처리함에 따라 테스토스테론(TP)-유도 AR, 5AR2, 및 PSA 과발현 억제 효과를 나타낸 것이다.
도 2는 미선나무 잎의 열수 추출물(ADLD), 에탄올 추출물(ADLE), 및 헥산 추출물(ADLH)의 테스토스테론(TP)-유도 AR, 5AR2, PSA 과발현 억제 효과를 형광염색으로 나타낸 것이다.
도 3은 미선나무 잎의 수확시기에 따른 테스토스테론(TP)-유도 5AR2, 및 PSA 과발현 억제 효과를 나타낸 것이다.
도 4는 미선나무 잎 에탄올 추출물의 대사물질(metabolite) 분석 크로마토그램을 나타낸 것이다.
도 5a 및 5b는 미선나무 기능성분 4종(Isoquercetin(IQ), rutin, chlorogenic acid (CA), Isorhamnetin 3-glucoside-7-rhamnoside(IR))의 테스토스테론(TP)-유도 AR, 5AR2, 및 PSA 과발현 억제 효과를 나타낸 것이다.
도 6a 및 6b은 이소퀘르세틴(IQ)의 농도에 따른 테스토스테론(TP)-유도 AR, 5AR2, PSA 및 PI3K의 과발현 억제 효과를 나타낸 것이다. 양성대조군 : Fi, 피나스테라이드
도 7a 및 7b는 이소퀘르세틴(IQ) 및 미선나무 잎 추출물의 농도에 따른 테스토스테론(TP)-유도 PI3K(Cell Signaling), PCNA(SantaCruz) 및 Cyclin D1(Cell Signaling)의 과발현 억제 효과를 나타낸 것이다.
도 8은 미선나무의 추출 시기에 따른 이소퀘르세틴의 함량을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 전립선 비대증 동물모델의 제작과정 및 미선나무 추출물의 투여계획을 나타낸 것이다. 양성대조군 : 쏘팔메토(saw) 또는 피나스테라이드(Fi).
도 10a 내지 10e는 전립선 비대증 동물모델에 미선나무 추출물 100 mg/kg/d 경구투여 후 전립선 인덱스를 측정한 결과를 나타낸 것으로, 도 10a는 전립선 크기, 도 10b는 전립선 무게, 도 10c는 체중 대비 전립선 무게, 도 10d는 전립선 조직의 루멘 영역, 도 10e는 전립선 조직의 상피 두께를 나타낸 것이다.
도 11a는 전립선 비대증 동물모델에 미선나무 추출물 100 mg/kg/d 경구투여 후 수득한 전립선 조직 내 5AR2, SCR1, AR, ER 및 PSA의 발현량을 나타낸 것이다.
도 11b는 전립선 비대증 동물모델에 미선나무 추출물 100 mg/kg/d 경구투여 후 수득한 전립선 조직 내 5AR2, SCR1, AR, ER 및 PSA의 발현량을 정량적으로 나타낸 것이다.
도 11c는 전립선 비대증 동물모델에 미선나무 추출물 100 mg/kg/d 경구투여 후 수득한 전립선 조직 내 전립선 상피세포를 H&E 염색으로 관찰한 결과를 나타낸 것이다.
도 11d는 전립선 비대증 동물모델에 미선나무 추출물 100 mg/kg/d 경구투여 후 수득한 혈청 내 DHT 수준을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 12a는 전립선 비대증 동물모델에 미선나무 추출물 100 mg/kg/d 경구투여 후 수득한 전립선 조직 내 PI3K, p-AKT, 및 t-AKT의 발현 수준을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 12b는 전립선 비대증 동물모델에 미선나무 추출물 100 mg/kg/d 경구투여 후 수득한 전립선 조직 내 PI3K, 및 p-AKT의 발현량을 정량적으로 나타낸 것이다.
도 13a는 전립선 비대증 동물모델에 미선나무 추출물 100 mg/kg/d 경구투여 후 수득한 전립선 조직 내 EGF(SantaCruz), IGF-1(ABCam), TGF-1β(SantaCruz), 및 VEGF(SantaCruz)의 발현 수준을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 13b는 전립선 비대증 동물모델에 미선나무 추출물 100 mg/kg/d 경구투여 후 수득한 전립선 조직 내 EGF(SantaCruz), IGF-1(ABCam), TGF-1β(SantaCruz), 및 VEGF(SantaCruz)의 발현량을 정량적으로 나타낸 것이다.
도 14a는 전립선 비대증 동물모델에 미선나무 추출물 100 mg/kg/d 경구투여 후 수득한 전립선 조직 내 PCNA, 및 Cyclin D1의 발현 수준을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 14b는 전립선 비대증 동물모델에 미선나무 추출물 100 mg/kg/d 경구투여 후 수득한 전립선 조직 내 PCNA, 및 Cyclin D1의 발현량을 정량적으로 나타낸 것이다.
도 14c는 전립선 비대증 동물모델에 미선나무 추출물 100 mg/kg/d 경구투여 후 수득한 전립선 조직 내 PCNA를 조직화학염색을 통해 관찰한 결과를 나타낸 것이다.
도 15a는 전립선 비대증 동물모델에 미선나무 추출물 100 mg/kg/d 경구투여 후 수득한 전립선 조직 내 Bax(SantaCruz), 및 Bcl-2(Cell Signaling)의 발현 수준을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 15b는 전립선 비대증 동물모델에 미선나무 추출물 100 mg/kg/d 경구투여 후 수득한 전립선 조직 내 Bax(SantaCruz), 및 Bcl-2(Cell Signaling)의 발현량을 정량적으로 나타낸 것이다.
도 16은 전립선 비대증 동물모델에 이소퀘르세틴(IQ) 1 mg/kg 또는 10 mg/kg 경구투여 후 전립선 인덱스를 측정한 결과를 나타낸 것이다 (A:전립선 크기, B:전립선 무게, C:체중 대비 전립선 무게).
도 17은 전립선 비대증 동물모델에 이소퀘르세틴(IQ) 1 mg/kg 또는 10 mg/kg 경구투여 후 수득한 전립선 조직 내 AR, SRC-1, 및 5AR2의 발현 억제 효과를 나타낸 것이다.
본 발명은 이소퀘르세틴 또는 미선나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 안드로겐 수용체 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.
본 발명의 미선나무는 미선나무(Abeliophyllum distichum), 보다 바람직하게는 Abeliophyllum distichum Nakai일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 미선나무는 물푸레나무과에 속하는 나무로, 미선나무속에 속하는 유일한 종이다. 한반도의 고유종이며, 경기도와 충청도의 볕이 잘 드는 산기슭에서 드물게 자란다.
본 발명의 미선나무는 그 원형을 훼손하지 않고 그대로 사용하거나, 당업자가 의도하는 공정 속도 및 공정(제조) 효율을 고려하여 전처리 과정을 수행한 후 사용할 수 있으며, 상기 전처리 과정으로는 예를 들어 통상적인 선별, 수세, 절단, 분말화, 건조 등의 단계를 거칠 수 있다.
본 발명의 미선나무는 그 수확시기가 제한되는 것은 아니나, 봄 또는 가을에 수확된 것일 수 있으며, 바람직하게는 가을, 보다 바람직하게는 늦가을에 수확된 것일 수 있다.
본 발명의 미선나무 추출물은 식물체 전체 또는 식물의 일부로부터 수득될 수 있으며, 예를 들어 줄기, 뿌리, 잎, 열매, 및 꽃으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 부위로부터 수득될 수 있다. 본 발명의 일실시예에서는 미선나무의 잎으로부터 추출물을 수득하였다.
본 발명의 미선나무 추출물은 공지의 천연물 추출방법에 의하여 추출될 수 있다. 예를 들어, 물, 탄소수 1 내지 6개의 유기용매 및 아임계 또는 초임계 유체로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 용매로 추출될 수 있다. 상기 탄소수 1 내지 6개의 유기용매는 탄소수 1 내지 6개의 알코올(alcohol), 아세톤(acetone), 에테르(ether), 벤젠(benzene), 클로로포름(chloroform), 에틸아세테이트(ethyl acetate), 메틸렌클로라이드(methylene chloride), 헥산(hexane), 시클로헥산(cyclohexane) 및 석유에테르(petroleum ether)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 미선나무 추출물은 바람직하게는 에탄올로 추출될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 추출방법은 상기 용매를 사용하여 냉침, 온침, 가열 등 통상의 추출방법이 사용 가능하다.
본 발명에서, 상기 에탄올은 농도가 제한되지 않으나, 예를 들어, 30 내지 100%, 40 내지 100%, 50 내지 100%, 60 내지 100%, 50 내지 90%, 60 내지 90%, 60 내지 80%, 65 내지 75%, 또는 약 70% 에탄올 추출물일 수 있다.
본 발명에서, 이소퀘르세틴(isoquercetin)은 IUPAC 네임 “3-(β-D-Glucopyranosyloxy)-3′,4′,5,7-tetrahydroxyflavone”으로도 명명되며, 분자식 C21H20O12이고, 분자량이 464.379 [g/mol]인 화합물로서 CAS 등록 번호가 482-35-9이다. 상기 이소퀘르세틴은 하기 화학식 1로 표시될 수 있다.
[화학식 1]
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본 발명에서, 상기 조성물은 안드로겐 수용체의 발현을 억제할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, 상기 조성물은 5AR2(5α-reductase 2), SRC1(steroid receptor coactivator 1), ER(estrogen receptor), 및 전립선특이항원(PSA)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 안드로겐 신호 관련 인자를 억제할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, 상기 조성물은 PI3K/AKT 시그널링 경로를 억제할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에서는 미선나무 추출물의 용매에 따른 안드로겐 시그널링 관련 인자 AR, 5AR2, 및 PSA의 발현 수준을 확인한 결과, 미선나무 에탄올 추출물의 억제 효과가 가장 우수함을 확인하였으며(실시예 2 참조),
본 발명의 일 실시예에서는 미선나무 잎 수확시기에 따른 안드로겐 시그널링 관련 인자 5AR2, 및 PSA의 발현 수준을 확인한 결과, 늦가을에 수확한 미선나무 추출물의 억제 효과가 늦봄에 수확한 미선나무 추출물의 억제 효과보다 우수함을 확인하였으며(실시예 4 참조),
본 발명의 일 실시예에서는 미선나무 잎 추출물의 기능성 성분 중 하나인 이소퀘르세틴 처리에 따른 안드로겐 시그널링 관련 인자 AR, 5AR2, 및 PSA의 발현 수준을 확인한 결과, 이소퀘르세틴의 AR, 5AR2, 및 PSA 억제 효과가 유의함을 확인하였으며(실시예 5-2 참조),
본 발명의 일 실시예에서는 이소퀘르세틴 처리에 따른 PI3K 및 세포증식인자 PCNA(proliferating cell nuclear antigen), cyclin D1의 발현 저해 효과를 확인한 결과, 이소퀘르세틴 및 미선나무 잎 에탄올 추출물의 농도에 의존적으로 PI3K, PCNA, 및 Cyclin D1의 발현이 유의하게 감소하는 것을 확인하였으며(실시예 5-3 참조),
본 발명의 일 실시예에서는 전립선 비대증 동물모델에 대하여 미선나무 추출물 및 이소퀘르세틴의 전립선 비대증 치료 효과를 확인한 결과, 미선나무 추출물 및 이소퀘르세틴이 전립선 인덱스를 유의하게 개선하고, 안드로겐 수용체 및 전립선 관련 인자의 수준을 유의하게 개선함을 확인하였다(실시예 7 참조).
따라서, 본 발명의 미선나무 추출물 또는 이소퀘르세틴은 안드로겐 수용체 관련 질환의 치료용 조성물의 유효성분으로 사용할 수 있다.
본 발명의 용어 "안드로겐 수용체 관련 질환"이란 안드로겐 수용체(AR: androgenic receptor)의 비정상적인 과도한 자극으로 인해 일어날 수 있는 신호 전달에 의해 야기되는 다양한 질환을 의미하며, 특별히 종류를 한정하는 것은 아니나, 전립선암, 전립선비대증, 배뇨장애 및 탈모 등을 예시할 수 있다.
전립선의 정상적인 발달과 보존은 안드로겐 수용체를 통한 남성호르몬 안드로겐의 역할에 의존한다. 정상적인 전립선에서는 하루 1-2%의 세포가 사멸되고 새로운 세포로 대체되는데, 이는 안드로겐 수용체에 의해 제어되는 정상적 전립선 기능의 일부이다. 따라서 안드로겐 수용체 기능이 정상적으로 유지되는 것이 전립선 건강의 핵심이다. 특히, 전립선암세포는 성장과 생존을 위해 주로 안드로겐 수용체에 의존하며, 이는 안드로겐 의존성 전립선암과 비의존성 전립선암 모두에 필수적이다. 따라서 안드로겐 수용체의 전사 작용을 억제할 수 있는 요법이 전립선암 치료에 중요한 역할을 한다.
또한, 전립선비대증 발생의 가장 큰 유발인자로는 남성 생식계 성장과 발달에 영향을 미치는 안드로겐성 호르몬(AH: androgenic hormones)이며, 안드로겐성 호르몬은 안드로겐 수용체(AR: androgenic receptor)에 결합하여 전립선의 비대가 유발된다. 이에 전립선비대증 치료에 있어서 안드로겐 수용체의 발현 억제에 초점을 맞춰 연구가 이루어지고 있다.
한편, 안드로겐 수용체는 탈모와도 중요한 연관성을 가지고 있다. 테스토스테론은 5알파-리덕타아제와 만나 DHT(디하이드로테스토스테론)로 전환이 이루어지게 된다. 과도하게 형성된 DHT는 모낭 속에서 안드로겐 수용체와 결합함으로써 탈모 과정을 일으키게 된다. 안드로겐성 호르몬(AH: androgenic hormones)은 안드로겐 수용체만을 경유해서 작용하는데, 테르토스테론 및 디하이드로테스토스테론의 작용 기작은 안드로겐 수용체에 대한 결합에 의존하게 된다. 따라서 탈모 방지를 위해서는 모낭 속의 안드로겐 수용체의 발현을 억제하는 것이 중요한 역할을 한다.
이에 본 발명의 미선나무 추출물 또는 이소퀘르세틴은 안드로겐 수용체의 발현을 전사 수준(mRNA 수준)에서 억제할 수 있는 바, 전립선암, 전립선비대증, 배뇨장애 및 탈모 등과 같은 안드로겐 수용체 관련 질환을 치료하는데 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명에서, 이소퀘르세틴은 약학적으로 허용가능한 염의 형태로 유효성분으로 포함될 수 있다. 본 발명에서 용어, "약학적으로 허용 가능한 염"이란 약학적으로 허용되는 무기산, 유기산, 또는 염기로부터 유도된 염을 포함한다.
적합한 산의 예로는 염산, 브롬산, 황산, 질산, 과염소산, 푸마르산, 말레산, 인산, 글리콜산, 락트산, 살리실산, 숙신산, 톨루엔-p-설폰산, 타르타르산, 아세트산, 시트르산, 메탄설폰산, 포름산, 벤조산, 말론산, 글루콘산, 나프탈렌-2-설폰산, 벤젠설폰산 등을 들 수 있다. 산부가염은 통상의 방법, 예를 들면 화합물을 과량의 산 수용액에 용해시키고, 이 염을 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 아세토니트릴과 같은 수혼화성 유기 용매를 사용하여 침전시켜서 제조할 수 있다. 또한, 동몰량의 화합물 및 물 중의 산 또는 알코올을 가열하고 이어서 상기 혼합물을 증발시켜서 건조시키거나, 또는 석출된 염을 흡인 여과시켜 제조할 수 있다.
적합한 염기로부터 유도된 염은 나트륨, 칼륨 등의 알칼리 금속, 마그네슘 등의 알칼리 토금속, 및 암모늄 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속염은, 예를 들면 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리토 금속 수산화물 용액 중에 용해하고, 비용해 화합물염을 여과한 후 여액을 증발, 건조시켜 얻을 수 있다. 이 때, 금속염으로서는 특히 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하며, 또한 이에 대응하는 은염은 알칼리 금속 또는 알칼리토 금속염을 적당한 은염(예, 질산은)과 반응시켜 얻을 수 있다.
본 발명의 조성물 내의 상기 미선나무 추출물 또는 이소퀘르세틴의 함량은 질환의 증상, 증상의 진행 정도, 환자의 상태 등에 따라서 적절히 조절 가능하며, 예컨대, 전체 조성물 중량을 기준으로 0.0001 내지 99.9중량%, 또는 0.001 내지 50중량%일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 함량비는 용매를 제거한 건조량을 기준으로 한 값이다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 상기 부형제는 예를 들어, 희석제, 결합제, 붕해제, 활택제, 흡착제, 보습제, 필름-코팅 물질, 및 제어방출첨가제로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 서방형 과립제, 장용과립제, 액제, 점안제, 엘실릭제, 유제, 현탁액제, 주정제, 트로키제, 방향수제, 리모나아데제, 정제, 서방형정제, 장용정제, 설하정, 경질캅셀제, 연질캅셀제, 서방캅셀제, 장용캅셀제, 환제, 틴크제, 연조엑스제, 건조엑스제, 유동엑스제, 주사제, 캡슐제, 관류액, 경고제, 로션제, 파스타제, 분무제, 흡입제, 패취제, 멸균주사용액, 또는에어로졸 등의 외용제 등의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 상기 외용제는 크림, 젤, 패치, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 또는 카타플라스마제 등의 제형을 가질 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 올리고당, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.
제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.
본 발명에 따른 정제, 산제, 과립제, 캡슐제, 환제, 트로키제의 첨가제로 옥수수전분, 감자전분, 밀전분, 유당, 백당, 포도당, 과당, 디-만니톨, 침강탄산칼슘, 합성규산알루미늄, 인산일수소칼슘, 황산칼슘, 염화나트륨, 탄산수소나트륨, 정제 라놀린, 미결정셀룰로오스, 덱스트린, 알긴산나트륨, 메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 카올린, 요소, 콜로이드성실리카겔, 히드록시프로필스타치, 히드록시프로필메칠셀룰로오스(HPMC), HPMC 1928, HPMC 2208, HPMC 2906, HPMC 2910, 프로필렌글리콜, 카제인, 젖산칼슘, 프리모젤 등 부형제; 젤라틴, 아라비아고무, 에탄올, 한천가루, 초산프탈산셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스칼슘, 포도당, 정제수, 카제인나트륨, 글리세린, 스테아린산, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 메칠셀룰로오스나트륨, 메칠셀룰로오스, 미결정셀룰로오스, 덱스트린, 히드록시셀룰로오스, 히드록시프로필스타치, 히드록시메칠셀룰로오스, 정제쉘락, 전분호, 히드록시프로필셀룰로오스, 히드록시프로필메칠셀룰로오스, 폴리비닐알코올, 폴리비닐피롤리돈 등의 결합제가 사용될 수 있으며, 히드록시프로필메칠셀룰로오스, 옥수수전분, 한천가루, 메칠셀룰로오스, 벤토나이트, 히드록시프로필스타치, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 알긴산나트륨, 카르복시메칠셀룰로오스칼슘, 구연산칼슘, 라우릴황산나트륨, 무수규산, 1-히드록시프로필셀룰로오스, 덱스트란, 이온교환수지, 초산폴리비닐, 포름알데히드처리 카제인 및 젤라틴, 알긴산, 아밀로오스, 구아르고무(Guar gum), 중조, 폴리비닐피롤리돈, 인산칼슘, 겔화전분, 아라비아고무, 아밀로펙틴, 펙틴, 폴리인산나트륨, 에칠셀룰로오스, 백당, 규산마그네슘알루미늄, 디-소르비톨액, 경질무수규산 등 붕해제; 스테아린산칼슘, 스테아린산마그네슘, 스테아린산, 수소화식물유(Hydrogenated vegetable oil), 탈크, 석송자, 카올린, 바셀린, 스테아린산나트륨, 카카오지, 살리실산나트륨, 살리실산마그네슘, 폴리에칠렌글리콜(PEG) 4000, PEG 6000, 유동파라핀, 수소첨가대두유(Lubri wax), 스테아린산알루미늄, 스테아린산아연, 라우릴황산나트륨, 산화마그네슘, 마크로골(Macrogol), 합성규산알루미늄, 무수규산, 고급지방산, 고급알코올, 실리콘유, 파라핀유, 폴리에칠렌글리콜지방산에테르, 전분, 염화나트륨, 초산나트륨, 올레인산나트륨, dl-로이신, 경질무수규산 등의 활택제;가 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 액제의 첨가제로는 물, 묽은 염산, 묽은 황산, 구연산나트륨, 모노스테아린산슈크로스류, 폴리옥시에칠렌소르비톨지방산에스텔류(트윈에스텔), 폴리옥시에칠렌모노알킬에텔류, 라놀린에텔류, 라놀린에스텔류, 초산, 염산, 암모니아수, 탄산암모늄, 수산화칼륨, 수산화나트륨, 프롤아민, 폴리비닐피롤리돈, 에칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨 등이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 시럽제에는 백당의 용액, 다른 당류 혹은 감미제 등이 사용될 수 있으며, 필요에 따라 방향제, 착색제, 보존제, 안정제, 현탁화제, 유화제, 점조제 등이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 유제에는 정제수가 사용될 수 있으며, 필요에 따라 유화제, 보존제, 안정제, 방향제 등이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 현탁제에는 아카시아, 트라가칸타, 메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 미결정셀룰로오스, 알긴산나트륨, 히드록시프로필메칠셀룰로오스(HPMC), HPMC1828, HPMC2906, HPMC2910 등 현탁화제가 사용될 수 있으며, 필요에 따라 계면활성제, 보존제, 안정제, 착색제, 방향제가 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 주사제에는 주사용 증류수, 0.9%염화나트륨주사액, 링겔주사액, 덱스트로스주사액, 덱스트로스+염화나트륨주사액, 피이지(PEG), 락테이티드 링겔주사액, 에탄올, 프로필렌글리콜, 비휘발성유-참기름, 면실유, 낙화생유, 콩기름, 옥수수기름, 올레인산에칠, 미리스트산 이소프로필, 안식향산벤젠과 같은 용제; 안식향산나트륨, 살리실산나트륨, 초산나트륨, 요소, 우레탄, 모노에칠아세트아마이드, 부타졸리딘, 프로필렌글리콜, 트윈류, 니정틴산아미드, 헥사민, 디메칠아세트아마이드와 같은 용해보조제; 약산 및 그 염(초산과 초산나트륨), 약염기 및 그 염(암모니아 및 초산암모니움), 유기화합물, 단백질, 알부민, 펩 톤, 검류와 같은 완충제; 염화나트륨과 같은 등장화제; 중아황산나트륨(NaHSO3) 이산화탄소가스, 메타중아황산나트륨(Na2S2O5), 아황산나트륨(Na2SO3), 질소가스(N2), 에칠렌디아민테트라초산과 같은 안정제; 소디움비설파이드 0.1%, 소디움포름알데히드 설폭실레이트, 치오우레아, 에칠렌디아민테트라초산디나트륨, 아세톤소디움비설파이트와 같은 황산화제; 벤질알코올, 클로로부탄올, 염산프로카인, 포도당, 글루콘산칼슘과 같은 무통화제; 시엠시나트륨, 알긴산나트륨, 트윈 80, 모노스테아린산알루미늄과 같은 현탁화제를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 좌제에는 카카오지, 라놀린, 위텝솔, 폴리에틸렌글리콜, 글리세로젤라틴, 메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스, 스테아린산과 올레인산의 혼합물, 수바날(Subanal), 면실유, 낙화생유, 야자유, 카카오버터+콜레스테롤, 레시틴, 라네트왁스, 모노스테아린산글리세롤, 트윈 또는 스판, 임하우젠(Imhausen), 모놀렌(모노스테아린산프로필렌글리콜), 글리세린, 아뎁스솔리두스(Adeps solidus), 부티룸 태고-G(Buytyrum Tego-G), 세베스파마 16 (Cebes Pharma 16), 헥사라이드베이스 95, 코토마(Cotomar), 히드록코테 SP, S-70-XXA, S-70-XX75(S-70-XX95), 히드록코테(Hydrokote) 25, 히드록코테 711, 이드로포스탈 (Idropostal), 마사에스트라리움(Massa estrarium, A, AS, B, C, D, E, I, T), 마사-MF, 마수폴, 마수폴-15, 네오수포스탈-엔, 파라마운드-B, 수포시로(OSI, OSIX, A, B, C, D, H, L), 좌제기제 IV 타입 (AB, B, A, BC, BBG, E, BGF, C, D, 299), 수포스탈 (N, Es), 웨코비 (W, R, S, M ,Fs), 테제스터 트리글리세라이드 기제 (TG-95, MA, 57)와 같은 기제가 사용될 수 있다.
경구 투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다.
경구 투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 본 발명이 속하는 기술분야에 통상의 기술자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 개체에게 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구 복용, 피하 주사, 복강 투여, 정맥 주사, 근육 주사, 척수 주위 공간(경막내) 주사, 설하 투여, 볼점막 투여, 직장 내 삽입, 질 내 삽입, 안구 투여, 귀 투여, 비강 투여, 흡입, 입 또는 코를 통한 분무, 피부 투여, 경피 투여 등에 따라 투여될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 치료할 질환, 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 질환의 중등도 등의 여러 관련 인자와 함께 활성성분인 약물의 종류에 따라 결정된다.
본 발명에서 "개체"란 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐 (mouse), 쥐 (rat), 개, 고양이, 말, 및 소 등의 포유류일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 "투여"란 임의의 적절한 방법으로 개체에게 소정의 본 발명의 조성물을 제공하는 것을 의미한다.
본 발명에서 "예방"이란 목적하는 질환의 발병을 억제하거나 지연시키는 모든 행위를 의미하고, "치료"란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 목적하는 질환과 그에 따른 대사 이상 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미하며, "개선"이란 본 발명에 따른 조성물의 투여에 의해 목적하는 질환과 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 감소시키는 모든 행위를 의미한다.
아울러, 본 발명은 미선나무 추출물 또는 이소퀘르세틴을 유효성분으로 포함하는 식품 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서 식품은 기능성 식품 및 건강기능성 식품을 포함한다.
본 발명의 미선나무 추출물 또는 이소퀘르세틴을 식품 첨가물로 사용할 경우, 상기 미선나무 추출물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 유효성분의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시 본 발명의 미선나무 추출물은 원료에 대하여 15 중량% 이하, 또는 10 중량% 이하의 양으로 첨가될 수 있다.그러나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강기능식품을 모두 포함한다.
본 발명에 따른 건강음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당 및 과당과 같은 모노사카라이드, 말토오스 및 수크로오스와 같은 디사카라이드, 덱스트린 및 시클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 및 자일리톨, 소르비톨 및 에리트리톨 등의 당알콜이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 mL당 일반적으로 약 0.01-0.20g, 또는 약 0.04-0.10g 이다.
상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 조성물은 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0.01-0.20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 실험방법
1-1. 열수 추출물 제조
미선나무는 우리나무영농조합으로부터 제공받았다. 삼각플라스크에 미선나무(Abeliophyllum distichum Nakai) 잎 100 g에 증류수(DW) 1000 mL를 넣고 100 ℃에서 1시간 동안 중탕하여 추출하였다. 추출물을 감압(0.2 μm 기공 크기) 하에 여과한 뒤, 회전식 진공 농축기를 사용하여 농축시켰다. 그런 다음 동결 건조기를 이용해 5일 동안 동결건조시켰다.
1-2. 70% 에탄올 추출물 제조
100 g의 미선나무 잎과 1000 mL의 70% 에탄올을 삼각 플라스크에 첨가한 뒤 교반기를 이용해 2시간 동안 추출한 후, 미선나무 잎은 제외한 추출물을 비커에 옮겨 담았다. 이후 삼각플라스크에 에탄올 1000 mL를 재차 첨가하여 2시간 동안 추출한 후 비커에 옮겨 담았다. 다음과 같은 과정을 총 3회 반복하였다. 그런 다음 70% 에탄올 추출물을 회전식 진공 농축기를 사용하여 농축시켰다. 그런 다음 추출물을 감압(0.2 μm 기공 크기) 하에 여과하고 동결 건조기에서 5일 동안 동결건조 시켰다.
1-3. 95% 헥산 추출물 제조
100 g의 미선나무 잎과 1000 mL의 95% 헥산을 삼각 플라스크에 첨가했다. 이후 과정은 위 70% 에탄올 추출과정과 동일하게 진행하였다.
1-4. 면역형광법(Immunofluorescence)
12 well plate에 슬라이드를 깐 뒤 LNCaP 세포(5x104개)를 분주하여 슬라이드에 세포를 부착시켰다. 24시간 뒤 테스토스테론을 100 nM로 처리하고 미선나무 잎(Abeliophyllum distichum Nakai leaf, ADL)의 열수(D.W.), 에탄올(EtOH), 헥산(Hexane) 추출물을 각각 100 μg/ml을 처리하였다. 24시간 뒤 세포를 차가운 메탄올에 고정시킨 다음 0.1% Triton X-100를 1시간 동안 처리시켰다. 5% 염소 혈청을 이용해 차단한 뒤 슬라이드에 BSA로 희석한 안드로겐 수용체(AR) 항체(1:300)를 4 ℃에서 밤새 처리했다. 이후 AlexaFluor 588 2차 항체(1:1,000 희석)를 1시간 동안 처리했다. DAPI 염색을 통해 핵을 염색시킨 후 커버글라스로 마운팅하였다. Zeiss 형광 현미경을 사용하여 AR의 발현량을 확인하였다.
1-5. 웨스턴 블롯
LNCaP 세포에 테스토스테론 프로피오네이트(testosterone propionate, TP)를 처리하여 안드로겐 수용체 신호를 유도하고 미선나무 잎의 열수(D.W.), 에탄올(EtOH), 헥산(Hexane) 추출물을 처리하여 AR(androgen receptor, SantaCruz), 5AR2(5 alpha reductase, ABCam), PSA(prostate specific antigen, SantaCruz)의 발현억제 효능을 확인하여 LNCaP 세포 내에서 미선나무 잎 추출물별 안드로겐 수용체 신호 관련 인자의 억제능 비교하였다. LNCaP 세포 2x106개를 6 웰 플레이트에 시딩(seeding)한 뒤 100 nM의 테스토스테론 프로피오네이트(testosterone propionate, TP, Tokyo Chemical Industry)와 미선나무 잎 열수(D.W.), 에탄올(EtOH), 헥산(Hexane) 추출물을 각각 100 ㎍/㎖ 농도로 24시간동안 처리하였다. 이때 안드로겐 억제약물인 피나스테라이드(finasteride, Fi) 1 ㎍/㎖ 처리군은 양성대조군으로 사용하였다. 세포에 처리가 끝난 후 웨스턴 블롯(western blot)을 이용하여 안드로겐 수용체 신호 저해 효과를 분석하였다. 먼저, 세포를 단백질 억제제 칵테일(Sigma)이 포함된 RIPA(Radioimmunoprecipitation assay) 버퍼에 용해(lysis)시킨 후, BCA 어세이를 이용해 단백질 농도를 추정한 뒤 12% SDS 폴리아크릴아마이드 겔에 전기영동시킨 뒤, Mini Trans-Blot® 세포 (Bio rad)를 이용해 겔을 막으로 전달(transfer)하였다. 이후 1차 항체를 막에 4℃에서 12시간 동안 처리하였다. 이어서, TBST를 이용해 5분간 3회 세척한 뒤 2차 항체를 1시간 처리하였다. 그 뒤 HPR 기질(Advansta Inc., San Jose, CA, USA)에서 발색시켜, Azure c300 이미징 시스템(Azure Biosystems) 장비를 이용하여 밴드를 확인하였다. 밴드 세기는 이미지 J 소프트웨어(NIH ver. 1.48, USA)를 이용하여 각 샘플의 면적을 설정한 후 상대되는 β-Actin의 면적을 동일한 방법으로 설정하여 그 값을 나누는 방식으로 계산함으로써 정량하였다.
1-6. 전립선 비대증 모델 제작 및 투여 계획
8주령의 수컷 SD 래트(체중 200±5 g) 실험동물군을 도 9에 나타난 바와 같이 5그룹으로 나눈 다음, BPH 유발 그룹은 1주일 안정기 후 펜토바비탈(phentobarbital) 50mg/kg을 복강 내 주사하여 마취한 후 고환과 부고환을 제거하고, 봉합실을 이용하여 수술 부위를 봉합하였다. 모든 실험은 무균 환경에서 이루어졌다. 3일간의 수술 안정기를 가진 다음 전립선 비대증(benign prostatic hyperplasia) 유발군(BPH)은 테스토스테론을 옥수수 오일(corn oil)에 녹여 3 mg/kg의 농도로 매일 피하 주사함으로써 전립선 비대증을 유발시켰다. 미선나무 잎 에탄올 추출물 투여군(BPH+ADLE)은 미선나무 잎 에탄올 추출물을 멸균된 증류수에 녹여 100 mg/kg을 4주간 존데를 이용하여 경구투여하였다. 양성대조군인 쏘팔메토 투여군(BPH+Saw)은 쏘팔메토를 멸균된 증류수에 녹여 100 mg/kg의 농도로 경구투여하였고, 피나스테라이드 투여군(BPH+Fi)은 1mg/kg의 농도로 4주간 매일 존데를 이용하여 경구투여하였다. 실험 종료 후, 졸레틸(zoletil)을 이용하여 쥐를 희생시킨 후, 심장 천공(heart puncture)를 통해 혈액을 수집한 뒤 혈청을 분리하여 -80℃에 보관하였다. RNAse가 제거된 수술기구로 전립선을 분리하여 무게를 측정한 뒤 -80℃에 보관한 후 웨스턴 블롯 실험을 실시하였다.
한편, 이소퀘르세틴(IQ) 투여 또한, 동일한 방법 및 대조군을 사용하였으며, 저농도 투여군(BPH+IQ1)은 IQ를 멸균된 증류수에 녹여 1 mg/kg, 고농도 투여군(BPH+IQ10)은 10 mg/kg를 4주간 존데를 이용하여 경구투여하였다.
1-7. 헤마톡실린 및 에오신 염색 (Hematoxylin & Eosin staining, H&E staining)
전립선 조직을 10% 포름알데히드에 고정하고 탈수한 뒤 파라핀에 포매하였다. 마이크로톰(Leica)을 이용하여 파라핀블록을 4 μm로 절단하였다. H&E 염색을 위해, 절단된 절편을 자일렌을 이용하여 파라핀을 제거하고 세척한 뒤 헤마톡실린으로 5분 동안 염색한 다음 물로 5분 동안 세척하였다. 이후 30초 동안 에오신으로 염색한 뒤, 탈수한 후 봉입하였다. Leica DM6 Research Inverted Phase 현미경(Leica, Werzlar, Germany)을 사용하여 조직을 분석하였다. Leica Application Suite(LAS) 현미경 소프트웨어를 사용하여 상피 두께와 루멘(lumen) 영역을 측정하였다.
1-8. 안드로겐 시그널링 관련 인자 발현 억제능 분석
동물실험군 대하여 안드로겐 시그널링(androgen signaling) 관련 인자 5AR2(5alpha reductase), SRC-1(steroid receptor coactivator), AR(androgen receptor), ER(estrogen receptor), PSA(prostate specific antigen)의 단백질 발현을 분석하였다. 절제한 전립선 조직 중 전립선(ventral prostate) 엽(lobe) 부위를 단백질 억제제 칵테일(Sigma)이 포함된 RIPA 버퍼를 첨가한 뒤 조직파쇄기(tacoPrep Bead beater)를 이용해 전립선 조직을 균질화(homogenize)하였다. 이후 단백질 BCA 어세이를 이용해 단백질 농도를 추정한 뒤 12% SDS 폴리아크릴아마이드 겔에 전기영동시킨 뒤, Mini Trans-Blo® 세포(Bio rad)를 이용해 겔을 막으로 전달하였다. 이후 각 단백질에 대한 1차 항체를 막에 4℃에 12시간 처리한 뒤, TBST를 이용해 5분간 3회 세척하고 2차 항체를 1시간 처리하였다. 그리고나서 HPR 기질(Advansta Inc., San Jose, CA, USA)에서 발색시켜, Azure c300 이미징 시스템(Azure Biosystems) 장비를 이용하여 밴드를 확인하였다. 밴드 세기는 이미지 J 소프트웨어(NIH ver. 1.48, USA)를 이용하여 각 샘플의 면적을 설정하고, 상대되는 β-Actin의 면적을 동일한 방법으로 설정하여, 그 값을 나누는 방식으로 계산함으로써 정량하였다.
1-9. 조직화학염색(Immunohistochemistry)
4 μm 두께의 섹션을 탈파라핀화하고 수세한 뒤 항원 복원(antigen retrieval)을 위해 절편을 0.01M 시트레이트 버퍼(pH, 6.0)에 넣은 뒤 전자레인지로 10분간 반응시켰다. 이후 상온에서 10분간 방치한 후 DW로 세척한 뒤 3% H2O2를 10분간 처리하였다. 그리고 염소 혈청을 처리하여 비특이적 결합을 차단하였다. 그런 다음 섹션을 항-PCNA, 항-AR을 분주하여 4℃에서 밤새 반응시켰다. 이후 1시간 동안 2차 항체로 처리한 후, 모든 면역염색된 섹션을 헤마톡실린으로 계수 염색한 뒤 Leica DM6 Research Inverted Phase 현미경(Leica, Werzlar, Germany)을 사용하여 조직을 분석하였다.
1-10. PI3K/Akt 시그널링 경로(signaling pathway) 관련 인자 발현 억제능 분석
안드로겐 시그널링을 억제하고 이로 인해 표피성장인자(EGF)의 발현을 억제함을 확인하였다. 한편, 이로 인한 PI3K/Akt 시그널링 경로(signaling pathway) 관련 인자인 PI3K(phosphatidylinositol-3-kinase), Akt(protein kinase B) 발현이 미선나무 잎 에탄올 추출물에 의해 억제되는지 확인하기 위하여, 상술한 웨스턴 블롯 실험을 수행하였다.
1-11. 성장인자(Grow factor) 발현 억제능 분석
안드로겐 시그널링으로 인해 ARE(androgen response element)에서 성장인자(Grow factor)의 전사가 이루어져 발현량이 증가되는 경향을 보인다. 성장인자는 전립선 비대증을 유도하는 큰 요인으로 볼 수 있다. 이에 따라 미선나무 잎 에탄올 추출물 투여가 전립선 비대증을 유도시킨 쥐의 전립선 내 성장인자의 발현을 감소시키는지 확인하기 위하여 상술한 웨스턴 블롯 실험을 수행하였다. 성장인자인 EGF(Epidermal growth factor), IGF-1(Insulin like growth factor I), TGF-1β(Transforming growth factor beta 1), VEGF(Vascular endothelial growth factor)의 발현량을 확인하였다.
1-12. 전립선 조직 내 세포증식 관련 인자 발현 억제능 분석
전립선 조직 내 세포증식과 관련된 대표적인 인자인 PCNA(Proliferating Cell Nuclear Antigen)와 사이클린 D1(Cyclin D1) 단백질 발현을 분석하기 위하여, 상술한 웨스턴 블롯 실험을 수행하였다.
1-13. UPLC-MS을 이용한 대사체분석
Vion UPLC™ 시스템(Vion, Waters, Milford, MA, USA)을 이용해 미선나무 잎 에탄올 추출물의 대사체분석을 실시하였다. LC 조건은 Acquity UPLC BEH C18 컬럼(2.1 mm × 100 mm, 1.7 μm, Waters)을 사용하였으며 컬럼 온도는 55℃로 설정하였다. 유속은 0.35 mL/min으로 설정하였다. 이동상은 0.1% 포름산(FA)이 포함된 물 및 0.1% FA가 포함된 아세토니트릴(ACN)을 사용하였다. MS 작동 조건 다음과 같다 : capillary voltage 2.5kV, sample cone 20V, ion source temperature 200℃, desolvation temperature 400℃, cons gas 30L/h, desolvation gas 900L/h, 스캔 시간 0.2초, 스캔 범위 m/z 50-1500, collision energy ramp 10-30 eV(m/z 50-1000).
실시예 2. 미선나무 추출물의 용매에 따른 안드로겐 시그널링 관련 인자의 발현 확인
실시예 1-1 내지 1-3에서 제작한 미선나무 잎의 열수, 에탄올 및 헥산 추출물을 전립선 세포 LNCaP에 처리함으로써 테스토스테론으로 유도된 AR, 5AR2, 및 PSA의 발현 수준을 확인하였다. 5AR2는 정상 전립선의 발달과 노년의 전립선 비대에서 중요한 역할을 담당하는 것으로 알려져 있으며, AR의 발현이 증가하면 전립선 내 DHT가 더 많은 AR와 결합함으로써 전립선의 비대를 유발하는 것으로 알려져 있다. 또한, AR은 DHT와 결합하여 전립선특이항원인 PSA의 생성을 촉진한다.
도 1a 및 도 1b에 나타난 바와 같이, 미선나무 열수 추출물은 테스토스테론에 의해 증가된 AR, 5AR2를 유의하게 감소시켰으며, 헥산 추출물은 5AR2 및 PSA의 발현을 유의하게 감소시켰으며, 에탄올 추출물은 AR, 5AR2 및 PSA를 모두 유의하게 억제할 뿐만 아니라, 열수 추출물 및 헥산 추출물과 비교해서도 현저히 우수한 억제능을 보임을 확인하였다.
실시예 3. 미선나무 추출물의 용매에 따른 안드로겐 수용체의 발현 확인
실시예 2의 웨스턴블롯에 더하여, 형광염색을 통해 AR 억제 효과를 재확인하였다.
도 2에 나타난 바와 같이, 미선나무 잎 에탄올 추출물 (ADLE)에서 현저히 우수한 AR 억제 효과를 나타냄을 확인할 수 있었다.
실시예 4. 미선나무 수확시기에 따른 안드로겐 시그널링 관련 인자의 발현 확인
미선나무 잎의 수확시기에 따른 테스토스테론으로 유도된 AR, 및 PSA의 발현 수준 차이를 확인하였다. 늦봄에 수확된 잎은 5월 중순 경에 수확되었으며, 늦가을에 수확된 잎은 9월 중순 경에 수확되었고, 추출물은 실시예 1-2의 에탄올 추출물 제법에 따라 제조되었다. 한편, 안드로겐 시그널링 관련 인자는 실시예 2와 동일한 방법으로 확인되었다.
도 3에 나타난 바와 같이, 늦봄에 수확한 미선나무 잎보다 늦가을에 수확한 미선나무 잎 에탄올 추출물의 5AR 및 PSA 발현 억제 효과가 현저히 우수함을 확인하였다.
실시예 5. 미선나무 에탄올 추출물의 성분 확인
5-1. 성분 분석 결과
미선나무 잎 에탄올 추출물의 활성 성분을 분석하기 위하여, UPLC-MS를 사용하였다.
그 결과를 도 4 및 표 1에 나타내었다.
Figure PCTKR2021011564-appb-img-000002
Figure PCTKR2021011564-appb-img-000003
상기 결과를 바탕으로 미선나무 잎 에탄올 추출물의 기능 성분으로서 이소퀘르세틴(Isoquercetin, IQ), 루틴(rutin), 클로로제닉산(CA), 이소람네틴 3-글루코시드-7-람노사이드(IR)을 선정하였으며, 전립선 비대증 관련 인자의 발현에 미치는 영향을 확인하였다.
5-2. 미선나무 에탄올 추출물 활성 성분의 효과 확인
실시예 5-1에서 선정된 기능성분 후보물질 4종(IQ, Rutin, CA, IR)의 테스토스테론으로 유도된 AR, 5AR2, 및 PSA의 발현 수준 차이를 확인하였다. 방법은 실시예 2와 동일하게 수행되었다.
도 5a 및 도 5b에 나타난 바와 같이, 4종의 후보 중에서 이소퀘르세틴의 효과가 가장 우수함을 확인하였다.
뿐만 아니라, 도 6a 및 도 6b에 나타난 바와 같이, 이소퀘르세틴의 농도에 의존적으로 AR, PI3K, 및 5AR2의 발현이 유의하게 감소하는 것을 확인하였다.
5-3. 이소퀘르세틴(IQ)의 안드로겐 시그널링 관련 인자의 발현 확인
BPH-1 세포에 테스토스테론을 100 nM 처리하여 세포증식을 유도하고 이소퀘르세틴(IQ)을 25, 50, 100 μM, 미선나무 잎 에탄올 추출물을 25, 50, 100 μg/ml 농도로 각각 24시간 처리하여 PI3K 및 세포증식인자 PCNA(proliferating cell nuclear antigen), cyclin D1의 발현 저해 효과를 확인하였다. 방법은 실시예 2와 동일하게 수행되었다. PCNA는 전립선 비대증이 유발되었을 때 증가하는 인자이며, Cyclin D1은 전립선 세포에서 세포주기 양성 조절자에 해당한다.
도 7a 및 도 7b에 나타난 바와 같이, 이소퀘르세틴 및 미선나무 잎 에탄올 추출물의 농도에 의존적으로 PI3K, PCNA, 및 Cyclin D1의 발현이 유의하게 감소하는 것을 확인하였다.
실시예 6. 미선나무 추출 시기에 따른 이소퀘르세틴의 함량 확인
미선나무 잎의 추출 시기에 따른 활성성분 이소퀘르세틴의 함량을 분석하기 위해, UPLC-MS를 사용하였다.
도 8에 나타난 바와 같이, 가을의 함량(20.8849 mg/g)이 봄의 함량(12.4916 mg/g) 보다 높은 것으로 확인되었다.
즉, 미선나무의 기능성 성분으로서 기능성 및 시기에 따른 차별성을 모두 나타내는 이소퀘르세틴이 적절한 것으로 판단하였다.
실시예 7. 전립선 비대증 동물 모델에 대한 효과 확인
7-1. 미선나무 추출물의 전립선 비대증 치료 효과 확인
미선나무 추출물이 in vivo에서도 효과를 나타내는지 확인하기 위하여, 전립선 비대증 동물모델을 제작하여 실험을 진행하였다(도 9 참조).
도 10a 내지 도 10e에 나타난 바와 같이, 가을에 수확된 미선나무 잎 추출물(ADLE)을 섭취한 마우스는 전립선 인덱스가 양성대조군에 비해 유의적으로 낮아짐을 확인하였다. 구체적으로, ADLE 투여군은 전립선 무게가 유의하게 감소되었으며, 체중 대비 전립선의 무게 또한 전립선 비대증 유발 모델과 비교하여 유의하게 낮아지며, 전립선 상피 두께 또한 전립선 비대증 모델과 비교하여 현저히 감소되었으며, 양성 대조군 쏘팔메토 및 피나세라이드와 비교해서도 그 효과가 우수함을 확인하였다.
또한, 도 11a 및 도 11b에 나타난 바와 같이, 전립선 조직 내 5AR2, SRC1, AR, ER, PSA의 발현량이 ADLE 섭취로 인해 유의하게 감소됨을 확인하였다.
또한, 도 11c에 나타난 바와 같이, 전립선 조직을 H&E 염색하여 전립선 상피세포를 관찰한 결과, 대조군(BPH)에 비해 ADLE 섭취군에서 상피세포 두께가 CON 수준으로 현저히 감소되는 것을 확인하였다. 이는 양성대조군 쏘팔메토 및 피나스테라이드와 비슷하거나 우수한 결과이다.
또한, 도 11d에 나타난 바와 같이, 혈청 내 DHT 수준이 유의하게 감소됨을 확인하였는 바, 전립선 성장의 증대 및 비대증을 유발하는 DHT 수준을 감소시킴으로써 전립선 비대증 치료 효과가 우수함을 뒷받침하는 결과이다.
또한, 도 12a 및 12b에 나타난 바와 같이, 전립선 조직 내 PI3K, 및 p-AKT의 발현양이 ADLE 섭취로 인해 유의적으로 감소하는 것을 확인하였다.
또한, 도 13a 및 13b에 나타난 바와 같이, 전립선 조직 내 EGF, IGF-1, TGF-1β, 및 VEGF의 발현양이 ADLE 섭취로 인해 유의적으로 감소하는 것을 확인하였다.
또한, 도 14a 및 도 14b에 나타난 바와 같이, 전립선 조직 내 PCNA 및 Cyclin D1의 발현양이 ADLE 섭취로 인해 유의적으로 감소하는 것을 확인하였다.
또한, 도 14c에 나타난 바와 같이, 전립선 조직 내 PCNA의 발현양이 ADLE 섭취로 인해 유의적으로 감소하는 것을 확인하였다.
또한, 도 15a 및 15b에 나타난 바와 같이, 전립선 조직 내 Bcl-2의 발현양이 ADLE 섭취로 인해 유의적으로 감소하고, Bax의 발현양이 ADLE 섭취로 인해 유의적으로 증가하는 것을 확인하였다.
이상의 실시예를 종합하여, 미선나무 추출물은 안드로겐 수용체 신호 관련 인자인 5AR2, SRC1, AR, ER, PSA의 발현량을 감소시키는 등, 안드로겐 수용체 및 전립선 관련 인자의 수준을 유의하게 개선할 뿐만 아니라, 전립선 비대증 동물모델에 대해 유의미한 치료 효과를 나타냄을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 미선나무 추출물을 안드로겐 수용체 및 전립선과 관련된 질환의 치료제에 이용할 수 있음을 알 수 있다.
7-2. 이소퀘르세틴의 전립선 비대증 치료 효과 확인
상기 실시예 7-1에 더하여, 미선나무 추출물의 기능성 성분인 이소퀘르세틴이 in vivo에서도 효과를 나타내는지 확인하기 위하여, 전립선 비대증 동물모델을 제작하여 실험을 진행하였다.
도 16에 나타난 바와 같이, 이소퀘르세틴을 저농도(1 mg/kg) 및 고농도(10 mg/kg)로 경구투여한 결과, 이소퀘르세틴의 농도의존적으로 전립선 인덱스가 낮아지는 것을 확인하였다. 구체적으로, 이소퀘르세틴 투여군은 전립선 무게가 유의하게 감소되었으며, 체중 대비 전립선의 무게 또한 전립선 비대증 유발 모델과 비교하여 유의하게 낮아짐을 확인하였다.
또한, 도 17에 나타난 바와 같이, 전립선 조직 내 AR, SRC-1, 5AR2의 발현양이 이소퀘르세틴의 섭취 농도에 의존적으로 감소하는 것을 확인하였다.
따라서, 이소퀘르세틴이 안드로겐 수용체 신호 관련 인자인 5AR2, SRC-1, AR의 발현량을 감소시키는 등, 안드로겐 수용체 및 전립선 관련 인자의 수준을 유의하게 개선할 뿐만 아니라, 전립선 비대증 동물모델에 대해 유의미한 치료 효과를 나타냄을 확인하였다. 따라서, 미선나무 추출물의 기능성 성분인 이소퀘르세틴을 안드로겐 수용체 및 전립선과 관련된 질환의 치료제에 이용할 수 있을 것으로 기대된다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
본 발명에 따른 미선나무 추출물 또는 이소퀘르세틴은 안드로겐 수용체 억제 활성이 있으며, 전립선 비대증 동물모델에 대한 치료 효과가 우수하므로, 안드로겐 수용체 관련 질환인 전립선비대증, 안드로겐 의존성 탈모, 배뇨장애 및 전립선암 등 관련 산업에 널리 활용될 수 있어, 산업상 이용가능성이 있다.

Claims (14)

  1. 이소퀘르세틴 또는 미선나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 안드로겐 수용체 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 추출물은 물, 탄소수 1 내지 6개의 알코올(alcohol), 아세톤(acetone), 에테르(ether), 벤젠(benzene), 클로로포름(chloroform), 에틸아세테이트(ethyl acetate), 메틸렌클로라이드(methylene chloride), 헥산(hexane), 시클로헥산(cyclohexane), 석유에테르(petroleum ether), 아임계 유체, 및 초임계 유체로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 용매에 의한 추출물인 것을 특징으로 하는, 안드로겐 수용체 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 안드로겐 수용체 관련 질환은 전립선암, 전립선비대증, 배뇨장애 및 탈모로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 안드로겐 수용체 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 미선나무 추출물은 이소퀘르세틴을 포함하는 것을 특징으로 하는, 안드로겐 수용체 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 미선나무 추출물은 미선나무 잎 추출물인 것을 특징으로 하는, 안드로겐 수용체 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 안드로겐 수용체의 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는, 안드로겐 수용체 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 5AR2(5α-reductase 2), SRC1(steroid receptor coactivator 1), ER(estrogen receptor), 및 전립선특이항원(PSA)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 안드로겐 신호 관련 인자를 억제하는 것을 특징으로 하는, 안드로겐 수용체 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 PI3K/AKT 시그널링 경로를 억제하는 것을 특징으로 하는, 안드로겐 수용체 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  9. 이소퀘르세틴 또는 미선나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 안드로겐 수용체 관련 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 식품 조성물은 건강기능식품인 것을 특징으로 하는, 안드로겐 수용체 관련 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
  11. 제9항에 있어서,
    상기 안드로겐 수용체 관련 질환은 전립선암, 전립선비대증, 배뇨장애 및 탈모로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 안드로겐 수용체 관련 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
  12. 이소퀘르세틴 또는 미선나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 안드로겐 수용체 관련 질환의 예방 또는 치료 방법.
  13. 이소퀘르세틴 또는 미선나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물의 안드로겐 수용체 관련 질환의 예방 또는 치료 용도.
  14. 이소퀘르세틴 또는 미선나무 추출물의 안드로겐 수용체 관련 질환의 예방 또는 치료 약제를 생산하기 위한 용도.
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