WO2022035075A1 - 마이크로니들 패치를 포함하는 최소 침습적 피부 상태 진단 키트 - Google Patents

마이크로니들 패치를 포함하는 최소 침습적 피부 상태 진단 키트 Download PDF

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WO2022035075A1
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Abstract

본 발명의 일 실시예에 따른 최소 침습적 피부 상태 진단 키트는, 대상체의 피부로부터 추출된 가검물로부터 RNA 유전자의 발현 정도를 정량화 할 수 있는 장비와; 생분해성 고분자 히알루론산으로 이루어지고 중실 구조인 복수개의 마이크로니들을 포함하는 마이크로니들 패치를 포함한다. 상기 마이크로니들 패치가 대상체의 피부에 적용되고, 소정 시간 유지 후 분리된 상태에서, 상기 마이크로니들 패치의 마이크로니들 표면에 흡착된 대상체 피부로부터의 가검물 또는 이로부터의 추출물이 상기 장비에 의해 정량 분석되고, 상기 장비는 상기 마이크로니들 패치의 마이크로니들 표면에 흡착된 대상체 피부로부터의 가검물 또는 이로부터의 추출물로부터 진단하고자 하는 각 피부 상태 관련 RNA 바이오마커 유전자의 발현 정도를 정량화 하고, 상기 정량화 값을 기초로 각 피부 상태의 진단이 이루어진다.

Description

마이크로니들 패치를 포함하는 최소 침습적 피부 상태 진단 키트
본 발명은 마이크로니들 패치를 포함하는 최소 침습적 피부 상태 진단 키트에 관한 것이다.
본 발명은 아래에 특정하는 7개의 한국 특허출원으로부터 우선권을 주장하는 바이다. 아래에 특정된 7개의 한국 특허출원의 발명의 상세한 설명, 특허청구범위 및 도면에 기재된 모든 기술적 내용은 본 발명의 명세서에 포함된 것으로 간주되어야 한다.
한국 특허출원 제10-2020-0100151호(발명의 명칭: 마이크로니들 패치를 포함하는 최소 침습적 피부주름 또는 피부탄력 진단 키트)
한국 특허출원 제10-2020-0100165호(발명의 명칭: 마이크로니들 패치를 포함하는 최소 침습적 피부보습 정도 평가 키트 및 피부보습 정도 평가를 위한 바이오마커)
한국 특허출원 제10-2020-0100168호(발명의 명칭: 마이크로니들 패치를 포함하는 최소 침습적 피부 색소침착 정도 평가 키트 및 피부 색소침착 정도 평가를 위한 바이오마커)
한국 특허출원 제10-2020-0100579호(발명의 명칭: 마이크로니들 패치를 포함하는 최소 침습적 피부유분 정도 평가 미트 및 피부유분 정도 평가를 위한 바이오마커)
한국 특허출원 제10-2020-0101117호(발명의 명칭: 마이크로니들 패치를 포함하는 최소 침습적 홍조성 민감피부 평가 키트 및 홍조성 민감피부 평가를 위한 바이오마커)
한국 특허출원 제10-2020-0101124호(발명의 명칭: 마이크로니들 패치를 포함하는 최소 침습적 주관적 자극성 민감피부 정도 평가 키트 및 주관적 자극성 민감피부 정도 평가를 위한 바이오마커)
한국 특허출원 제10-2020-0100561호(발명의 명칭: 마이크로니들 패치를 포함하는 최소 침습적 화장품여드름 예측 키트 및 화장품여드름 예측용 바이오마커)
본 발명은 다양한 피부 상태의 정확한 진단, 측정 또는 평가를 위한 것이다. 본 발명이 다루는 피부 상태는 다음의 총 7가지이다.
- 피부노화(피부주름 또는 피부탄력 관련)
- 피부보습
- 피부 색소침착
- 피부유분
- 홍조성 민감피부
- 자극성 민감피부
- 화장품여드름
이하에서는, 상술한 7가지 피부 상태 각각의 진단, 측정 또는 평가를 위해서 어떠한 기술이 사용되고 있는지, 현재 사용 중인 이러한 기술에 대하여 본 발명자(들)가 인식한 문제는 무엇인지에 대하여 상세히 기술하기로 한다.
<피부노화>
모든 생명체는 태어나면서부터 노화의 길로 들어서며, 피부 역시 노화가 진행된다. 피부노화의 원인으로는 나이가 듦에 따라 진행되는 내인성 요인과 햇볕, 추위, 바람, 스모그 등 환경적 요인에 장기간 노출되어 진행되는 외인성 요인으로 나눌 수 있다.
피부가 노화됨에 따라 진피층 세포외 기질의 주요 성분인 콜라겐, 엘라스틴과 히알루론산의 함량과 섬유아세포의 수가 감소되며, 이러한 결과로 주름이 발생하고 탄력이 떨어져 살이 처지게 된다. 진피층 내 세포외 기질의 감소는 matrix metalloproteinase(MMP) 효소인 collagenase(MMP-1) 및 gelatinase(MMP-2, MMP9) 등에 의한 것이며, 실제로 노화된 피부에서 이들 효소의 활성 및 발현이 현저히 증가되어 있다.
피부장벽은 "Brick and Mortar"로 요약되는 표피층의 분화의 마지막 형태인 각질층을 일컫는다. Brick은 핵이 소멸된 각질세포와 다양한 세포 내 단백질, 자연보습인자를 포함한 분해산물 그리고 이에 연결된 막(cornified envelope)으로 구성된다. Mortar은 주로 세라마이드, 콜레스테롤, 지방산으로 구성된 각질세포간 지질을 지칭하며 다층판 구조이다. 노화가 진행되면 대략 75%의 비율로 건조한 피부가 관찰되며, 이는 나이가 듦에 따라 피부장벽의 유지 및 기본적인 기능 발휘에 중요한 요소(각질층 지질 함량, 표피 pH)들에 장애가 발생하기 때문이다. 노화된 피부 장벽에서는 라멜라 층판의 수가 적고 층판 소체의 분비가 감소되며, 각질층에서의 지질 감소 등 지질대사의 이상이 발생한다. 또한, 세라마이드, 콜레스테롤, 지방산 등의 생성 속도 제한 효소의 기능이 저하되고, 특히 콜레스테롤의 합성이 매우 저하되어 전체 지질의 함량이 감소된다. 또한, cornified envelope 및 자연보습인자의 발현이 감소된다.
이러한 피부노화의 상태를 측정하거나 피부노화의 새로운 기전을 발굴하고 치료에 대한 효과 판정, 예후에 대한 예측 검사, 새로운 치료제의 개발 등을 위해서는 적절한 유효성 평가가 필요하다. 동물실험을 실시한 화장품, 동물실험을 실시한 원료를 사용하여 제조된 화장품, 또한 동물실험을 실시하거나 동물실험을 실시한 원료를 사용하여 만든 수입 화장품의 유통 및 판매가 전면 금지됨에 따라, 현재는 피부노화의 기전 연구나 화장품의 유효성 평가는 인체적용기기를 이용한 효능평가나 테이프 스트리핑, 피부 조직생검 또는 3D skin을 이용한 ex vivo 효능평가에 의존하고 있다.
인체적용기기를 이용한 피부노화의 측정 방법으로서 후술하는 다양한 기술이 본 발명의 출원일 현재 사용되고 있다.
- PRIMOS 장비를 이용한 피부의 형태학적인 부분만을 영상으로 측정하는 방법
- Cutometer 장비로 음압을 이용하여 피부의 반복적인 수축과 이완작용의 평균값을 측정하는 방법
- Tewameter 장비를 이용하여 피부 장벽 기능의 이상과 관련된 경피수분소실도(TEWL)의 변화를 측정하는 방법
- Corneometer 장비를 이용하여 물의 전도도 등을 이용한 수분량의 변화를 측정하는 방법
- Skin-pHmeter 장비를 이용하여 피부 표면의 산성도를 측정하는 방법
그러나 상술한 방법들은 피부노화의 구체적인 기전의 연구에 사용되기 어렵고, 특정 인자들의 변화를 과학적으로 설명하기 위한 근거를 제공하지 못한다. 특히 피부노화의 가장 중요한 타겟인 진피 내 콜라겐을 비롯한 세포 외 기질의 변화에 대한 구체적인 데이터를 제공하지 못한다.
근래 병변 부위에 테이프를 탈부착하여 테이프에 붙어 나온 피부 가검물을 분석하는 테이프를 이용한 비침습적 스트리핑 방법이 제시되었다. 그러나, 피부노화의 주된 원인은 콜라겐이나 탄력섬유의 변성 등 진피의 변화에 있는 반면, 테이프에 붙어 나오는 물질은 각질층으로 한정되어 진피의 변화를 반영할 수 없다.
이러한 단점을 보완하기 위해서 피부생검이 사용되나, 이는 집도의의 숙련된 기술이 필요하며, 매우 침습적인 방법이라 환자의 고통이 수반되기에 거부감이 발생하고, 시험 후 생검 부위의 흉터가 남는 단점이 있다. 이러한 이유로 실제 인체에서 유효성평가를 위한 시험에서 일일이 시험 약제 사용 전후에 피부생검을 시행하기에는 어려움이 있고, 환자들의 순응도가 매우 떨어진다.
3D 인공피부를 이용한 ex vivo 시험은 실제 인체 표피층과 진피층의 세포를 모두 포함하여 피부를 모방한 가장 발전된 구조체를 보여주지만, 가격이 고가인데다 실제 피부 내 존재하는 혈관, 모낭, 피하지방 등의 구조를 포함하지 않아 실제 피부의 변화를 반영한다고 볼 수 없기에 피부생검을 완벽하게 대체할 수 없다.
따라서 현재는 피부노화의 기전 연구나 항피부노화제의 유효성평가 연구에서 동물실험이나 피부생검을 대체할 방법이 부재한 실정이며, 이에 비침습적이며 진피의 콜라겐을 비롯한 세포 외 기질의 변화를 실제적으로 측정할 수 있는 방법의 개발이 절실히 요청되고 있다.
<피부보습>
피부는 외부의 물리 및 화학적 자극으로부터의 보호 장벽 역할과 수분 유지의 역할을 담당한다. 피부장벽은 여러 층으로 구성된 피부 중 표피 각질층에 존재하며 외부 자극으로부터 일차적으로 물리적 방어 역할을 담당한다. 이는 각질세포와 각질세포간 지질의 견고한 결합으로 이루어져 있는 다층판 구조이다. 피부장벽은 "Brick and mortar"로 요약되며 각질세포가 주된 Brick은 핵이 소멸된 각질세포와 다양한 세포 내 단백질, 자연보습인자를 포함한 분해산물 그리고 이에 연결된 막(cornified envelope)으로 구성된다. Mortar은 주로 세라마이드, 콜레스테롤, 지방산으로 구성된 각질세포간 지질을 지칭한다. 이로 인해 수분손실 방지와 수분 유지 기능을 담당한다. 각질층은 각질형성세포의 증식과 분화를 통해 형성되며 여러 단백질 가수분해 효소의 작용으로 인해 주기적으로 탈락하며 항상성을 유지한다.
건조한 피부는 각질이 증가하고 피부표면이 거칠며, 당기거나 가려움 등의 증상을 동반하는 피부 상태를 의미한다. 아토피피부염이나 건선 등의 피부질환으로 인한 내인성 요인과 건조한 환경, 바람과 같은 기후 조건, 세제, 유기용제 등의 화학물질, 과도한 목욕이나 세안, 자외선, 물리적 자극 등의 외인성 요인으로 인해 자연보습인자, 각질층 지질, 피지 등의 감소와 각질층의 비정상적인 탈락과 같이 다양한 원인에 의해 유발되기 때문에 원인에 따른 적절한 보습제 사용과 생활습관의 관리가 필요하다.
이에 피부보습 상태를 파악하고 피부보습 장애에 대한 기전 연구나 그러한 장애를 교정 또는 치료할 수 있는 보습제나 피부관리의 개발을 위한 적절한 유효성 평가가 필요하다. 동물실험을 실시한 화장품, 동물실험을 실시한 원료를 사용하여 제조된 화장품, 또한 동물실험을 실시하거나 동물실험을 실시한 원료를 사용하여 만든 수입 화장품의 유통 및 판매가 전면 금지됨에 따라, 현재 피부보습의 기전 연구나 화장품의 유효성 평가는 인체적용기기를 이용한 효능평가나 테이프 스트리핑, 피부 조직생검 또는 3D skin을 이용한 ex vivo 효능평가 등의 방법이 이용되고 있다.
피부보습 측정을 위한 인체적용 기기로는 Corneometer, Tewameter 및 Skin-pHmeter가 있다. Corneometer는 전기전하를 저장하는 전기량인 정전부하용량(capacitance)이 수분량과 비례하는 경향을 이용하여 피부의 보습도를 측정하는 것으로 각질층 하방 30-40 μm 깊이 이내의 수분함량을 측정한다. 수분이 높을수록 수치 또한 높아진다. Tewameter는 피부장벽의 손상과 밀접한 관련이 있는데, 경표피수분손실량(TEWL; Transepidermal water loss)을 측정하는 장비이다. 피부장벽이 손상되면 표피로 손실되는 수분증발이 많아지는데, 기기로 피부표피에서 증발하는 수분을 감지하여 수치를 제공하는 것으로 수치가 클수록 손실량이 많음을 의미한다. Skin-pHmeter는 피부 산도를 측정하는 기기이며 피부 표면의 수소이온 농도를 측정하여 정상적인 피부의 산도인 약산성(pH 4.5 - 5.5)에서 벗어나는 지를 확인할 수 있다.
이러한 인체적용 기기는 매우 민감하기 때문에 측정하는 환경과 측정자에 의한 영향을 많이 받는다. 따라서, 일정 시간 항온 항습 조건에 노출된 상태에서 고가의 장비로 숙련된 측정자가 측정해야 신뢰성 있는 결과를 얻을 수 있다. 또한, 이 방법은 단순히 피부 수분함유량, 경피수분손실량, 피부 pH 만을 측정하므로 피부의 건조도를 파악할 수는 있지만 다양한 원인에 의해 피부 보습정도가 비정상인 경우, 그 원인 기전이나 그에 대한 치료법 혹은 관리법을 개발하기는 어렵다.
병변 부위에 테이프를 탈부착하여 테이프에 붙어 나온 피부 가검물을 분석하는 테이프를 이용한 비침습적 스트리핑 방법 또한 단순히 피부 표피의 최상부인 각질층을 측정하기 때문에 각질층 하방의 과립층부터 기저세포층과 진피층에 존재하는 보습과 관련된 변화에 대한 구체적인 자료를 얻을 수 없다.
이러한 단점을 보완하기 위해서 피부생검이 사용되나, 이는 집도의의 숙련된 기술이 필요하며, 매우 침습적인 방법이라 환자의 고통이 수반되기에 거부감이 발생하고, 시험 후 생검 부위의 흉터가 남는 단점이 있다. 이러한 이유로 실제 인체에서 유효성 평가를 위해 일일이 시험 약제 사용 전, 후에 피부생검을 시행하기에는 어려움이 있고, 환자들의 순응도가 매우 떨어진다.
3D 인공피부를 이용한 ex vivo 시험은 인체 표피층과 진피층의 세포를 포함하여 피부를 모방한 가장 발전된 구조체를 보여주지만, 가격이 고가인데다 실제 피부 내 존재하는 혈관, 모낭, 피하지방 등의 구조나 표피 및 진피에 존재하는 다양한 면역세포를 포함하지는 않아 실제 피부의 변화와는 다를 수 있기에 피부생검을 완벽하게 대체할 수 없다.
따라서 현재는 피부보습의 기전 연구나 보습제의 유효성 평가 연구에서 동물실험이나 피부생검을 대체할 방법이 부재한 실정이며, 이에 비침습적이며, 피부 표피 전층과 진피의 변화를 측정할 수 있는 방법이 필요하다.
<피부 색소침착>
멜라닌은 자연계에 분포하는 페놀류의 고분자 물질로 검은 색소와 단백질의 복합체이다. 멜라닌은 일정량 이상의 자외선을 차단하는 기능이 있어 피부의 체온을 유지해주고 자외선으로부터 피부를 보호해준다. 또한, 멜라닌은 사람의 피부색을 결정하는 중요한 요소이다. 피부의 멜라닌은 멜라닌세포에 의해 생성되는데, 인종에 따라서 멜라닌 발현 유전자가 다르고 이에 따라 멜라닌 세포의 양이 조절되어 피부색이 결정된다.
피부가 자외선에 노출되면 각질형성세포는 멜라닌세포자극호르몬을 분비하게 되고, 멜라닌세포자극호르몬은 멜라닌세포의 멜라노코르틴1 수용체 (MC1R)와 결합하여 멜라닌세포의 핵에 작용하여 타이로시나제와 TYRP1, TYRP2 등의 효소를 발현시키고 멜라닌의 생성을 시작하게 된다.
멜라닌 생성과정은 다음과 같다. 먼저, 멜라닌세포 내 소기관인 멜라노좀이 생성되고, 멜라노좀에서 티로신이라는 아미노산으로부터 시작하여 DOPA로 산화하고, 티로시나아제라는 산화효소가 관여하여 DOPA-quinone으로 산화한다. 이후부터는 자동 산화반응이 일어나 5,6-dihydroxyindol, indol-5,6-quinone이 형성되고 최종적으로 흑갈색의 멜라닌이 생성된다. 이후, 멜라닌세포의 수지상 돌기를 통해 주위의 각질형성세포로 대량의 멜라노좀이 이동하고 분해되며 각질형성세포에 멜라닌이 축적되고 피부색을 나타내게 된다.
피부색에 따른 피부유형 분류는 1975년 미국의 Fitzpatrick이 건선의 초기 치료량을 결정하기 위해 백인 피부를 4가지 타입으로 처음 분류하면서 시작되었다. 이후 2가지 타입을 추가하여 백인은 I, II, III, IV, 갈색 피부인 동양인은 V형, 흑인은 VI형이라고 정의하였다. 그러나 여러 연구자에 의해 동양인에서도 다양한 피부형이 존재함이 밝혀지고 여러 오차가 발생하여, 현재는 태양 자외선에 의한 피부 반응을 기준으로 항상 태양에 의한 화상을 입는 I형부터 화상 없이 태닝만 되는 VI형까지로 분류하고 있다.
피부의 색소침착 상태를 평가 또는 측정하거나 여러가지 피부 색소성 질환에서 피부색소 변화의 새로운 원인, 기전을 발굴하고 피부색소 변화 치료에 대한 효과 판정, 예후에 대한 예측 검사, 새로운 피부색소 치료제의 개발 등을 위해서는 적절한 유효성 평가가 필요하다. 그런데, 동물실험을 실시한 화장품, 동물실험을 실시한 원료를 사용하여 제조된 화장품, 또한 동물실험을 실시하거나 동물실험을 실시한 원료를 사용하여 만든 수입 화장품의 유통 및 판매가 전면 금지됨에 따라, 현재는 피부 색소침착의 기전 연구나 화장품의 유효성 평가는 인체적용기기를 이용한 효능평가나 테이프 스트리핑, 피부 조직생검 또는 3D skin을 이용한 ex vivo 효능평가로 진행되고 있다.
인체적용기기를 이용한 피부색소의 측정 방법으로는 피부색을 결정하는 주요 요인인 멜라닌과 헤모글로빈 양의 피부 흡수율을 흡광 원리를 이용하여 측정하는 Mexameter 장비를 이용한 방법이나 피부색의 분광반사율을 측정하여 삼색 자극 값(tristimulus value)으로 피부의 밝기 및 채도를 계산하는 Spectrophotometer 장비를 이용한 방법 등이 사용되고 있다. 그러나 이들 방법은 단순히 피부 색갈이나 홍조의 정도만을 측정할 뿐 피부 색소침착의 구체적인 기전의 연구에 사용되기 어려운 실정이다. 또한, 특정 인자들의 변화를 과학적으로 설명할 수 없고 특히 색소침착의 가장 중요한 타겟인 melanogenesis의 변화에 대한 구체적인 자료를 제공하지 않는다.
병변 부위에 테이프를 탈부착하여 테이프에 붙어 나온 피부 가검물을 분석하는 테이프를 이용한 비침습적 스트리핑 방법이 제시되었다. 그러나, 피부 색소침착의 주된 기전은 melanogenesis 등 기저층에 존재하는 멜라닌세포의 변화가 주된 것임에 반해, 테이프에 붙어 나오는 물질은 각질층으로 한정되어 그 아래 표피층 (과립층, 상피세포층, 기저세포등)이나 진피층 내의 변화까지는 반영하기 어렵다는 한계점이 있다.
이러한 단점을 보완하기 위해서 피부생검이 사용되나, 이는 집도의의 숙련된 기술이 필요하며, 매우 침습적인 방법이라 환자의 고통이 수반되기에 거부감이 발생하고, 시험 후 생검 부위의 흉터가 남는 단점이 있다. 이러한 이유로 실제 인체에서 유효성 평가를 위해 일일이 시험 약제 사용 전, 후에 피부생검을 시행하기에는 어려움이 있고, 환자들의 순응도가 매우 떨어진다.
3D 인공피부를 이용한 ex vivo 시험은 인체 표피층과 진피층의 세포를 포함하여 피부를 모방한 가장 발전된 구조체를 보여주지만, 가격이 고가인데다 실제 피부 내 존재하는 혈관, 모낭, 피하지방 등의 구조나 표피 및 진피에 존재하는 다양한 면역세포를 포함하지는 않아 실제 피부의 변화와는 다를 수 있기에 피부생검을 완벽하게 대체할 수 없다.
따라서 현재는 피부 색소침착의 기전 연구나 색소 치료제의 유효성 평가 연구에서 동물실험이나 피부생검을 대체할 방법이 부재한 실정이며, 이에 비침습적이며, 피부 표피 전층의 변화를 측정할 수 있는 방법이 필요하다.
<피부유분>
피부유분에 관여하는 피지는 피지선에서 분비되는 물질로 트리글리세라이드, 왁스에스테르, 스쿠알렌이 주성분이다. 피지선은 털의 부속 분비샘으로 진피층에 존재하며, 분비된 피지는 피부 표면을 덮어 수분이 밖으로 방출되는 것을 막아주는 역할을 한다. 또한 알칼리를 중화하고 살균력이 있으며 피부건조를 방지하고 피부노화를 지연시키는 중요한 요소이다.
그러므로, 적정한 수준의 피지 분비가 유지되어야 건강한 피부라 할 수 있는데, 남성호르몬에 의한 피지 분비 증가, 모낭벽 과각화, 여드름균에 의한 염증, 스트레스 등 환경적 요인과 유전적 요인에 의해 피지 분비가 과도하게 증가하면 모공을 막아 피부 트러블이 생길 수 있으며, 이와 관련된 질환으로는 여드름, 지루성 피부염 등이 있다.
피지 분비는 나이와 성별에 따라 달라지는데, 유아기에는 적게 분비되다가 청소년기에 분비가 증가하고 이후 나이가 듦에 따라 감소하는 양상을 보인다. 또한, 여자보다는 남자에서 호르몬에 의한 피지 분비가 증가한다. 일반적으로 건성의 반대를 피지 분비가 많은 지성으로 칭한다. 피지선이 주로 분포하는 이마, 미간 및 코 부위를 T존 부위라 한다. 양볼에서 턱으로 이어지는 부위를 U존 부위라 하고, 일반적으로 이 부위에서는 피지선의 분포 정도가 낮다. U존은 건성이고 T존은 지성인 피부를 복합성으로 분류하기도 한다. 지성피부의 경우, 이에 따른 세안제와 보습제의 선택이 중요하다.
피부유분의 상태를 파악하고 피부유분의 분비 장애나 분비과다에 대한 기전 연구에 있어서 적절한 유효성 평가 방법이 필요하다. 피부유분 장애를 교정하거나 치료할 수 있는 세정제 및 치료제의 개발이나 피부 관리방법의 개발에 있어서도 마찬가지이다.
한편, 동물실험을 실시한 화장품, 동물실험을 실시한 원료를 사용하여 제조된 화장품, 또한 동물실험을 실시하거나 동물실험을 실시한 원료를 사용하여 만든 수입 화장품의 유통 및 판매가 전면 금지됨에 따라, 현재 피부유분 장애나 과다분비의 기전 연구나 이와 관련된 기능성 화장품의 유효성 평가는 인체적용기기를 이용한 효능평가나 테이프 스트리핑, 피부 조직생검 또는 3D skin을 이용한 ex vivo 효능평가로 진행되고 있다.
피부유분 측정을 위한 인체적용 기기로는 Courage+Khazaka Electronic 사의 Sebumeter가 있다. 두께 0.1 mm의 피지 수집용 테이프를 피부에 접촉한 뒤 흡수된 피지를 측정하는 데, 피지에 의해 테이프가 투명해지면 광투과도가 높아지는 원리로 유분량을 측정한다.
이러한 인체적용 기기는 민감하기 때문에 측정하는 환경과 측정자에 의한 영향을 많이 받아 일정 시간 항온항습 조건에 노출된 상태에서 숙련된 측정자가 측정해야 신뢰성 있는 결과를 얻을 수 있다. 또한, 이 방법은 단순히 피부 표면의 분비된 피지만을 측정하기 때문에 피부유분 분비의 구체적인 기전의 연구에 사용되기에는 적합하지 않다. 또한, 특정 인자들의 변화를 과학적으로 설명할 수 없고 진피에 존재하는 피지선 변화에 대한 구체적인 데이터를 제공하지 않는다.
병변 부위에 테이프를 탈부착하여 테이프에 붙어 나온 피부 가검물을 분석하는 테이프를 이용한 비침습적 스트리핑 방법 또한 가검물 채취 영역이 각질층으로 한정되어 피부유분과 관련된 진피층의 변화까지 반영할 수 없다.
이러한 단점을 보완하기 위해서 피부생검이 사용되나, 이는 집도의의 숙련된 기술이 필요하며, 매우 침습적인 방법이라 환자의 고통이 수반되기에 거부감이 발생하고, 시험 후 생검 부위의 흉터가 남는 단점이 있다. 이러한 이유로 실제 인체에서 유효성 평가를 위해 일일이 시험 약제 사용 전, 후에 피부생검을 시행하기에는 어려움이 있고, 환자들의 순응도가 매우 떨어진다.
3D 인공피부를 이용한 ex vivo 시험은 인체 표피층과 진피층의 세포를 포함하여 피부를 모방한 가장 발전된 구조체를 보여주지만, 가격이 고가인데다 실제 피부 내 존재하는 혈관, 모낭, 피하지방 등의 구조나 표피 및 진피에 존재하는 다양한 면역세포를 포함하지는 않아 실제 피부의 변화와는 다를 수 있기에 피부생검을 완벽하게 대체할 수 없다.
따라서 현재는 피부유분의 분비 상태 및 피부유분 분비의 기전 연구나 피부유분에 대한 유효성 평가 연구에서 동물실험이나 피부생검을 대체할 방법이 부재한 실정이며, 이에 비침습적이며 피부 진피층의 변화를 측정할 수 있는 방법이 필요하다.
<홍조성 민감피부>
바우만 피부타입의 4가지 카테고리 중 하나인 민감성은 다시 4가지 타입으로 분류할 수 있는데, 이는 여드름성 민감피부(acne type), 주관적 자극성 민감피부(stinging type), 알러지성 민감피부(allergic type), 그리고 홍조(주사)성 민감피부(rosacea type)이다. 이 중 한가지에 대한 민감성만 가질 수도 있고, 복합적인 민감성을 가질 수도 있다. 미국인 27,485명을 대상으로 한 바우만 피부타입 설문 연구에서 응답자 중 73%가 민감성 피부이었으며, 49%가 홍조성 민감피부 타입으로 관찰되었다 (Baumann L., Dermatol Clin. 2008:26(3):359-373).
홍조란 피부색이 붉게 변하는 것으로 주로 얼굴 중앙부위에 발생하며, 모세혈관 확장에 의해 나타나는 증상으로 갱년기 호르몬 불균형, 피부 장벽 약화에 의한 민감, 스테로이드 부작용 등 다양한 원인에 의해 발생한다. 외부자극에 의해 일시적으로 발생하지만 만성화 될 경우 주사(Rosacea)라고 불리는 만성염증성 질환이 발생할 수 있다.
홍조성 민감피부란 특정 성분이 포함된 화장품을 발랐을 때 피부가 붉어지고 화끈거리며, 때로 염증성 구진과 모세혈관확장을 동반하는 피부를 말한다. 홍조성 민감피부일 경우, 얼굴 온도의 급격한 변화를 최소화하는 것이 좋고, 항염증 효능이 있는 성분이 들어간 세안제나 보습제, 자외선차단제를 사용하는 것이 좋으며, 예로는 알로에, 아르간오일, 비사볼올, 카페인, 캐모마일, 오이, 녹차, 위치하젤, 나이아신아마이드, 살리실릭산 등이 있다.
이에, 홍조성 민감피부의 새로운 기전을 발굴하고 각종 화장품 성분에 대한 홍조성 민감피부 발생의 예측, 새로운 치료제의 개발 등을 위해서는 적절한 유효성 평가가 필요하다. 동물실험을 실시한 화장품, 동물실험을 실시한 원료를 사용하여 제조된 화장품, 또한 동물실험을 실시하거나 동물실험을 실시한 원료를 사용하여 만든 수입 화장품의 유통 및 판매가 전면 금지됨에 따라, 현재 홍조성 민감피부의 기전 연구나 화장품의 유효성 평가는 인체적용기기를 이용한 효능평가나 3D skin을 이용한 ex vivo 효능평가로 진행되고 있다.
홍조성 민감피부 측정을 위한 인체적용 기기로는 Mexameter(Courage+Khazaka Electronic 사)와 Spectrophotometer가 있다. Mexameter는 멜라닌 값과 홍반을 나타내는 헤모글로빈(hemoglobin) 값을 동시에 측정하는데, 멜라닌과 홍반에 대응하는 서로 다른 3종의 파장대(568 nm, 660 nm, 880 nm)를 이용하여 probe에서 방출하는 빛의 반사도를 측정하는 분광학적 방식의 기기이며, 홍반량을 홍반지수(Erythema index, EI)로 제공한다. Spectrophotometer는 물체색의 분광반사율을 측정하는 장비로 CIE 표색계인 L*, a*, b*로 색을 계산한다. L*은 명도를 의미하고, a*는 적색도, b*는 황색도를 의미하는데, 0에 가까울수록 무채색을 나타내고, 반대가 되면 색도가 높아짐을 의미한다.
이러한 인체적용 기기는 민감하기 때문에 측정하는 환경과 측정자에 의한 영향을 많아 숙련된 측정자와 항온 및 항습 조건에서 측정해야 신뢰성 있는 결과를 얻을 수 있다. 또한, 단순히 피부 표면의 색을 측정하기 때문에 홍조성 민감피부의 구체적인 기전의 연구에 활용되기에는 미흡하고 특정 인자들의 변화를 과학적으로 설명할 수 없다. 또한, 홍조에서 중요한 진피에 존재하는 모세혈관에 대한 구체적인 자료를 제공하지 않는다.
3D 인공피부를 이용한 ex vivo 시험은 인체 표피층과 진피층의 세포를 포함하여 피부를 모방한 가장 발전된 구조체를 보여주지만, 가격이 고가인데다 실제 피부 내 존재하는 혈관, 모낭, 피하지방 등의 구조나 표피 및 진피에 존재하는 다양한 면역세포를 포함하지는 않아 실제 피부의 변화와는 다를 수 있다.
이에 홍조성 민감피부에 적합한 치료제나 화장품을 사용하기 위한 홍조성 민감피부를 예측할 수 있는 새로운 검사가 필요하다.
<자극성 민감피부>
민감피부는 자극 물질, 스트레스, 환경적 요인 등에 대해 민감하게 반응하여 자극감과 자극반응이 나타나는 피부를 말한다. 민감피부는 주관적 관점과 객관적 관점에서 정의될 수 있다. 주관적 자극에 민감한 피부에서는 객관적인 염증 증상 없이 작열감, 소양감 등의 본인이 느끼는 주관적인 증상이 발생한다. 객관적 반응의 민감한 피부에서는 전문의에 의해 관찰되는 홍반, 팽진, 수포 등의 피부병변을 동반한 객관적인 증상이 발생한다.
민감피부의 발생기전은 신경감각의 신호전달 증가, 면역반응의 증가, 피부장벽의 약화 등 여러 기전이 관여하는 것으로 알려져 있지만 매우 복합적이다. 민감피부 발생의 원인 인자 중 내인성 인자로는 유전, 과로, 스트레스, 수면부족 등이 있으며, 외인성 인자로는 화장품, 세정제, 자외선, 화학물질, 환경 등이 있다. 미국의 27,485명의 환자를 대상으로 진행한 바우만 피부타입 설문조사에서 73%의 환자가 민감성으로 관찰되었으며, 그 중 주관적 자극성 민감피부는 15%에서 관찰되었다.
주관적 자극성 민감피부의 정도를 측정하거나 주관적 자극성 민감피부의 새로운 기전을 발굴하고, 예후에 대한 예측 검사, 주관적 자극성 민감피부를 예방할 수 있는 국소도포제나 화장품의 개발 등을 위해서는 적절한 유효성 평가가 필요하다. 동물실험을 실시한 화장품, 동물실험을 실시한 원료를 사용하여 제조된 화장품, 또한 동물실험을 실시하거나 동물실험을 실시한 원료를 사용하여 만든 수입 화장품의 유통 및 판매가 전면 금지됨에 따라, 현재 주관적 자극성 민감피부의 기전 연구나 개인의 민감도 평가 방법으로는 시험대상자의 의견에 따라 피부자극정도를 결정하는 주관적 측정법과 전문의의 시진을 통해 관찰하는 객관적 측정법 또는 피부조직생검 등으로 효능평가를 시행할 수 있다.
시험대상자의 의견에 따라 피부자극정도를 결정하는 주관적 측정법으로는 lactic acid sting test(젖산자상검사), 클로로포름과 메탄올 혼합용액을 이용한 작열감 혹은 통증유발검사 등이 있으며, 객관적 측정법으로는 SLS, DMSO, ammonium hydroxide, sodium hydroxide 등을 피부에 도포하여 홍반, 수포 등 피부의 변화를 관찰하는 방법 등이 있다. 그러나 주관적 자극성 민감피부의 진단을 위한 표준화된 검사방법은 아직 없으며, 다수의 연구에 인용되고 있는 lactic acid sting test 역시 lactic acid 도포 후 시험대상자의 주관적인 느낌에 의존하므로 실험의 재현성과 정확성이 떨어져 객관적으로 정량화 할 수가 없다는 한계점이 있어 완전한 검사법이라 보기 어렵기 때문에, 주관적인 평가를 배제한 재현 가능한 객관적인 자극 진단방법이 필요한 실정이다.
이러한 단점을 보완하기 위해서 피부생검이 사용될수 있으나, 이는 집도의의 숙련된 기술이 필요하며, 매우 침습적인 방법이라 환자의 고통이 수반되기에 거부감이 발생하고, 시험 후 생검 부위의 흉터가 남는 단점이 있다. 이러한 이유로 실제 인체에서 유효성 평가를 위해 일일이 시험 약제 사용 전, 후에 피부생검을 시행하기에는 어려움이 있고, 환자들의 순응도가 매우 떨어진다.
따라서 현재는 주관적 자극성 민감피부의 기전 연구나 주관적 자극성 민감피부의 예방을 위한 국소도포제나 화장품의 개발을 위해서 젖산 자상시험 외에 민감피부의 정도를 객관적으로 평가할 방법이 부재한 실정이다. 주관적 자극성 민감피부에서 특이적으로 발현되는 바이오마커를 발굴하고, 이를 이용하여 비침습적으로 주관적 자극성 민감피부의 정도를 평가하는 방법 또는 이를 실행하는 키트의 개발이 필요하다.
<화장품여드름>
민감성 피부에는 구진 및 농포와 같은 여드름성 병변이 발생하는 여드름 유형, 반복적인 홍조 및 화끈거림 증상이 나타나는 주사 유형, 따끔거림 느낌이 나타나는 자극성 유형과 알레르겐 접촉 시 홍반 및 가려움증 등의 증상이 나타나는 알레르기 유형의 4가지 유형이 있다.
여드름은 털피지샘 단위에 발생하는 염증성 피부질환으로, 사춘기의 청소년과 젊은 성인에서 80%의 유병률을 보일 정도로 빈번하게 발생하는 질환이다. 여드름의 발생요인은 모낭의 과다각질화, 염증반응, 피지 분비의 증가, Proprionibacterium acnes 균의 집락 형성 등이 있다. 이 외에도 환경적 요인 등 복합적인 요인에 의해 여러 가지 임상증상이 발생한다. 여드름은 블랙헤드로 알려진 개방면포와 화이트헤드로 알려진 폐쇄면포로 나타나는 비염증성 병변 및 구진, 농포, 결절 등의 염증성 병변의 양상으로 나타난다. 경증 여드름에서는 면포가 주된 병변이지만, 조금 더 심해지면 구진과 농포가 위주이고, 중증 여드름 이상에서는 결절과 거짓낭이 주된 병변이다.
사춘기 후에 발생하는 여드름에 화장품이 중요한 영향을 미친다. 즉 화장품 사용 후 일부 환자에서는 여드름 모양 발진 이 자주 발생하는데 이런 병변을 소위 화장품여드름이라 부른다. 미국의 27,485명의 환자를 대상으로 진행한 바우만 피부타입 설문조사에서 73%의 환자가 민감성으로 관찰되었으며, 그 중 화장품여드름은 58%에서 관찰되었다. 화장품 사용 후 여드름 유발 능력은 모낭각전으로 유발되는 면포유발능력과 구진고름물집 형성에 의한다.
검사하는 기술에 따라 다양한 결과가 나타날 수 있는데, 이소프로필 미리스테이트 농도나 바셀린의 농도가 10% 미만일 경우에는 토끼 귀에서는 조기에 면포를 유발하지만 인체에서는 구진고름물질을 유발한다. 소듐라우릴설페이트와 같은 유화제는 용량에 비례하여 고름물질을 발생시킨다. Isopropyl myristate, isopropyl palmitate, coconut oil과 같은 면포생성 성분들은 화장품여드름을 유발하므로 화장품여드름을 보이는 민감성 피부에는 이러한 성분들이 포함되지 않은 것을 사용하여야 한다. 그러나 아직 이러한 화장품여드름의 정확한 발생 기전은 잘 알려져 있지 않고 여러 유형의 피부 중에서 민감성으로 화장품여드름이 발생할 지 예측할 수 있는 검사법은 확립되어 있지 않다.
따라서 화장품여드름 발생의 새로운 기전을 발굴하고, 각종 화장품 성분에 대한 화장품여드름 발생의 예측, 새로운 치료제의 개발 등을 위해서는 적절한 새로운 평가법이 필요하다. 동물실험을 실시한 화장품, 동물실험을 실시한 원료를 사용하여 제조된 화장품, 또한 동물실험을 실시하거나 동물실험을 실시한 원료를 사용하여 만든 수입 화장품의 유통 및 판매가 전면 금지됨에 따라, 현재 여드름의 발생 기전 연구나 개인의 화장품여드름 평가 방법으로는 피부과 전문의의 시진을 통해 관찰하는 방법과 식품의약안전처 가이드라인의 여드름에 대한 유효성 평가변수에 따른 시험방법이 있다. 최근에는 화장품에서 동물실험을 중지한 후, 사용검사를 하거나 화장품을 4주 동안 등에 밀폐도포한 후 강력접착제나 양이온 중합체 표면생검으로 미세면포생성을 확인하는 방법으로 인체검사를 하기도 한다.
식품의약안전처 가이드라인의 여드름에 대한 유효성 평가변수에 따른 시험방법으로는, 시험물질의 작용 전과 후에 시험대상자의 얼굴에서 병변의 종류와 그 수를 측정하여 1~5등급 중 기준에 맞는 등급을 기록하는 방법과 병변의 수를 측정하여 Michaelson's Acne Severity Index (ASI) 수치를 계산하는 방법이 있다. 그러나, 이는 시험자의 주관적인 기준에 따라 판정이 되기에 객관적으로 정량화 할 수 없다는 한계점이 있고, 현재 육안으로 보이는 여드름의 현상 만을 기록하기 때문에 화장품여드름 발생의 구체적인 기전의 연구나 특정 인자들의 변화를 과학적으로 설명할 수 없어 완전한 검사법이라 보기 어렵다. 3D 인공피부를 이용한 ex vivo 시험은 실제 인체 표피층과 진피층의 세포를 모두 포함하여 피부를 모방한 가장 발전된 구조체를 보여주지만, 가격이 고가인데다 실제 피부 내 존재하는 혈관, 모낭, 피하지방 등의 구조를 포함하지 않아 실제 피부의 변화와는 다를 수 있다. 이에 사춘기 이후 화장품 사용 등에 의해 여드름 모양 발진의 발생이 잦은 피부에서 적합한 치료제나 화장품을 선택하기 위해서는 적절한 화장품여드름 발생 예측 검사가 필요하다.
이상 7가지 피부 상태 측정 및 평가를 위하여 본 출원일 현재 사용 중인 기술의 문제점에 대하여 살펴보았다. 본 발명자(들)는 본 발명의 피부 상태 진단, 측정 또는 평가에 있어서 마이크로니들을 사용하기로 한다. 마이크로니들은 1 mm 이하의 길이를 갖는 미세한 바늘로, 최소한의 침습으로 각질층을 뚫고 피부에 미세한 구멍을 생성하여 약물을 효과적으로 전달하는 약물전달 기술이며, 최근에는 약물 및 생리활성물질의 전달에만 사용되는 것이 아니라 체내 가검물을 취득하고 질병을 예측 및 진단하는 데에도 그 사용 범위가 넓어지고 있다. 특히 마이크로니들로 형성된 미세구멍을 통해 체액 또는 혈액 등 인체 가검물을 채취하여 바이오마커 검출 및 질병의 예측 등에 사용할 수 있다. 일례로 중공형(hollow) 마이크로니들은 니들 내부에 모세관이 있어, 피부에 부착 후 모세관을 통해 혈액을 추출하는 목적으로 사용되고 있다. 환자의 고통을 최소화하면서 비교적 안전하게 혈액을 추출하여 혈액 내 글루코오스와 콜레스테롤을 검출하거나 바이오마커를 검출할 수 있다는 장점이 있지만, 니들이 피부속에서 부러지면 부작용이 발생할 가능성이 높고 출혈 등의 부작용이 발생할 수 있다.
팽윤형(swellable) 마이크로니들은 피부에 부착 후 피부 내 간질액을 흡수해 부풀어오르고 천공부위를 밀폐해 피부에 접착제 없이 부착되는 원리이며, 흡수된 체액을 분리하여 바이오마커 검출, 모니터링 및 질병의 예측에 사용되고 있다. 하지만 분석에 필요한 체액을 흡수하기 위해 오랜 시간 패치를 부착해야 하기에 여러 환경적인 요인에 따라 안정적으로 패치를 부착하기 어렵다는 한계점이 있다.
본 발명에 사용되는 용해성(dissolving) 마이크로니들은 생체 내에서 용해되는 고분자 소재와 유효성분을 혼합한 후 마이크로니들로 고형화하여 제조된다. 이러한 용해성 마이크로니들이 피부에 부착되면 효율적으로 체액에 의해 녹게 되고, 피부 내부로 약물을 용이하게 전달 가능하다. 또한, 용해성 마이크로니들은 금속이나 플라스틱으로 제작되지 않아 피부 속에서 부러질 위험이 없어 안전하다. 본 출원인은 본 발명에 이르러 용해성 마이크로니들을 새로운 용도로 활용하고자 한다. 이는 용해성 마이크로니들을 이용한 최초의 피부 가검물(RNA, DNA, 단백질) 채취; 상기 가검물을 이용한 RNA microarray 분석; 상기 분석 결과를 바탕으로 한 화장품여드름 바이오마커 발굴; 상기 바이오마커를 이용한 화장품여드름 예측 및 치료제나 화장품의 유효성 평가 등이다.
최근, DTC(Direct-To-Consumer) 서비스의 제공으로 피부유형을 분석하는 연구가 활발히 진행되고 있는데, 이는 피부와 연관된 유전자 DNA의 단일염기다형성(SNP)을 분석한 정보를 제공하는 서비스이다. 주로 구강 상피를 채취하여 DNA 염기서열을 분석하는데, 특정 유전자의 염기서열이 정상인과 다른 지를 비교하여 위험도를 제시한다. 비침습적 방법으로 피부 유전자를 검사할 수 있지만 한계점도 존재한다. DNA는 모든 세포에 동일하게 존재하며 불변하기 때문에 여러 환경적 요인에 의해 변화하는 실제 피부상태를 반영하지 못한다. 특정 SNP를 가지고 태어났다 하더라도 후천적인 관리나 치료를 통해 회복한 경우에 SNP 분석에서는 해당 결과를 반영할 수 없다. 이러한 특징으로 인해 SNP 분석은 새로운 유효물질의 발굴이나 기전 연구, 효능 평가 등에 적용하기 어렵다. 뿐만 아니라, 현재의 구강 상피를 이용한 SNP 분석은, 가검물 채취 부위가 피부가 아닌 구강 상피라는 점에서 실제 피부 상태를 반영할 수 없다. 반면에 RNA는 실제 세포에서 작용하는 단백질로 번역 가능한 물질이며 세포마다 특이적인 발현 정도를 나타내기 때문에 여러 요인에 의해 변화하는 실제 피부의 특성을 반영할 수 있다. 따라서, 실제 피부세포에서 RNA 및 단백질 수준에서의 발현을 관찰하는 것이 정확한 피부 상태 분석에 필수적이라 할 수 있다.
DNA 유전체 분석과 달리, RNA 전사체 분석은 피부 세포에서만 특이적으로 발현하거나 약물 노출 등 환경적 조건에 따라 발현이 달라지는 유전자의 검출이 가능하고, 시험군과 대조군 간의 유전자 발현량의 차이를 확인할 수 있어 시험 전후 비교가 필요한 유효성 평가나 기전 연구 및 후보 물질 발굴에 적용할 수 있다. 또한, microarray 기술을 통해 하나의 샘플에서 4만개 이상의 유전자에 대해 발현을 비교할 수 있어 질병의 예측이나 치료 바이오마커 발굴에 있어 매우 유용하다. 하지만, 앞서 기술한 바와 같이 RNA와 단백질을 비침습적 방식으로 수집하는 방법에 한계가 존재하였다. 본 발명자(들)는 본 발명에 이르러 상술한 한계를 극복할 수 있는 방식을 제안하고자 한다.
본 발명은 상술한 바와 같은 종래의 피부 상태 진단, 측정 또는 평가 방법들의 문제를 해결하는 것을 목적으로 한다. 종래의 방식 중 예컨대 조직 생검은 집도의의 숙련된 기술이 필요하고, 환자의 고통이 수반되기에 거부감이 발생하고, 시험 후 생검 부위의 흉터가 남는 단점이 있다. 또 하나의 종래의 방식인 테이프 스트리핑은 테이프에 붙어 나오는 물질이 각질층으로 한정되어, 단지 보조적인 검사 방법으로 사용될 수 있을 뿐, 완전한 결과를 제공하지 못한다는 단점이 있다. 또한, 종래의 SNP array는 인체 가검물의 DNA를 이용하는데, 태어날 때부터 결정되어 변하지 않는 DNA는 여러 환경적 요인에 의해 변화하는 실제 피부상태를 반영하기 어렵다는 단점이 있다.
본 발명의 목적은, 기존 조직 생검 대비 고통이 거의 없고, 흉터도 남지 않고, 환자의 사용 편의성을 높일 수 있음과 동시에, 각질층 내부의 피부 인자를 채취함으로써 기존의 테이프 스트리핑 대비 분석 결과의 신뢰성을 높일 수 있고, 여러 환경적 요인에 의해 변화하는 실제 피부상태를 반영할 수 있는 새로운 최소 침습적 피부 상태 진단 키트를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 생물학적 시료로서 피부 가검물을 사용하는 피부 상태 측정을 위한 바이오마커를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은, 상술한 목적이 달성에 수반하여, 다음의 것들을 아울러 제공하는 것에 있다.
- 피부 상태 예측용 조성물
- 피부 상태 예측용 검사 방법 및 피부 타입 분류 방법
- 각 피부 상태에 대한 유도 또는 억제의 후보물질을 스크리닝 하고 치료제의 유효성을 평가하는 방법
- 피부 상태 개선을 위한 일반화장품, 기능성화장품, 의료기기, 의약품 등의 동물실험 대체 인체적용 효능평가 방법.
본 발명의 일 실시예에 따른 최소 침습적 피부 상태 진단 키트는, 대상체의 피부로부터 추출된 가검물로부터 RNA 유전자의 발현 정도를 정량화 할 수 있는 장비와; 생분해성 고분자 히알루론산으로 이루어지고 중실 구조인 복수개의 마이크로니들을 포함하는 마이크로니들 패치를 포함한다. 상기 마이크로니들 패치가 대상체의 피부에 적용되고, 소정 시간 유지 후 분리된 상태에서, 상기 마이크로니들 패치의 마이크로니들 표면에 흡착된 대상체 피부로부터의 가검물 또는 이로부터의 추출물이 상기 장비에 의해 정량 분석되고, 상기 장비는 상기 마이크로니들 패치의 마이크로니들 표면에 흡착된 대상체 피부로부터의 가검물 또는 이로부터의 추출물로부터 진단하고자 하는 각 피부 상태 관련 RNA 바이오마커 유전자의 발현 정도를 정량화 하고, 상기 정량화 값을 기초로 각 피부 상태의 진단이 이루어진다.
진단하고자 하는 피부 상태가 피부노화인 경우, 콜라겐/탄력 관련 RNA 바이오마커 유전자와 피부장벽기능/수분합성 관련 RNA 바이오마커 유전자의 크게 두 종류 바이오마커 유전자를 사용한다. 상기 콜라겐/탄력 관련 바이오마커는 COL1A1, COL3A1, FN1, GSTA3, PON1, PINK1, COL4A4 및 MMP8 중 어느 하나 또는 둘 이상을 포함하고, 피부장벽기능/수분합성 관련 바이오마커는 IVL, HAS2, HAS3, AQP3, CERS6, CLDN1, SLC9A1, TGM1, SPINK5, KLF4, LCE1A, LCE1B, LCE1F, LCE2A, BGN 및 AZGP1 중 어느 하나 또는 둘 이상을 포함한다.
진단하고자 하는 피부 상태가 피부보습인 경우, 피부보습 관련 바이오마커로서, CDSN, FLG, FLG2, LOR, KLF4, KRT10, LCE1A, LCE2A, LCE2B, LCE2C, SMPD3, CDH1, ITGB4, IVL, SPINK5, CLDN1, AQP3, BGN, HAS3, TGM1, CLDN7, CERS3, CLDN4 및 KRT1 중 어느 하나 또는 둘 이상을 사용할 수 있다.
진단하고자 하는 피부 상태가 피부 색소침착인 경우, 피부 색소침착 관련 바이오마커로서, CAT, CLU, DSG1, GPNMB, GPX4, GSTM2, GSTP1, MLANA, PAX3, SOX10, TFAP2A, TYR, TYRP1, MC1R, F2RL1 및 CLDN1 중 어느 하나 또는 둘 이상을 사용할 수 있다.
진단하고자 하는 피부 상태가 피부유분인 경우, 피부유분 관련 바이오마커로서, MFAP2, IGF1, HSD11B1, GPAM, CPT1C, AR, MPZL3, AQP3, SREBF2 및 HSD17B2 중 어느 하나 또는 둘 이상을 사용할 수 있다.
진단하고자 하는 피부 상태가 홍조성 민감피부인 경우, 홍조성 민감피부 관련 바이오마커로서, COL3A1, TAC1, KLK5, CAMP, MMP9, TRPA1, IL13RA1, HSD3B1, CXCR4, ANGPT2, CXCL2, CXCR5 및 PSMB9 중 어느 하나 또는 둘 이상을 사용할 수 있다.
진단하고자 하는 피부 상태가 주관적 자극성 민감피부인 경우, 주관적 자극성 민감피부 관련 바이오마커로서, IVL, LOR, FLG, FLG2, PGF, CYR61, HLA-B, IGHA1, MMP3, RBP4 및 G0S2 중 어느 하나 또는 둘 이상을 사용할 수 있다.
진단하고자 하는 피부 상태가 화장품여드름인 경우, 화장품여드름 관련 바이오마커로서, MMP3, MMP12, CCR1, AKR1B10, THY1 및 IL-6 중 어느 하나 또는 둘 이상을 사용할 수 있다.
또한, 본 발명의 일 실시예에 따른 피부 상태 진단 키트는 대상체 피부로부터의 가검물로부터 RNA를 추출하는 장비를 더 포함할 수 있다. 상기 RNA 추출 장비에 의하여 획득한 RNA가 증폭 과정을 거쳐 상기 정량화 장비에 제공될 수 있다.
이외에도 추가적인 구성이 본 발명에 따른 최소 침습적 피부 상태 진단 키트에 더 제공될 수 있다.
본 발명 특유의 최소 침습적 피부 가검물 획득 방식에 따라 각 피부 상태 진단용 바이오마커의 유용성이 밝혀졌다. 각 피부 상태의 진단, 평가 또는 측정에 유용한 바이오마커에 대해서는 후술하는 실시예에서 자세히 밝히기로 한다.
이들 바이오마커로써 어느 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 수준을 측정할 수 있다. 상기 유전자 또는 이의 단백질 수준이 각 피부 상태 측정 대상자에서 증가 또는 감소됨을 확인하였으므로, 이의 수준을 측정함으로써 피부 상태의 측정 및 평가에 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명에 따르면, 종래의 인체 가검물의 DNA를 이용한 SNP array 방식의 피부유형 진단 방법의 문제점이 해결될 수 있다. 종래의 SNP array는 인체 가검물의 DNA를 이용하는데, 태어날 때부터 결정되어 변하지 않는 DNA는 여러 환경적 요인에 의해 변화하는 실제 피부상태를 반영하기 어렵다는 단점이 있다. 또한, 본 발명에 따르면, 종래의 인체적용기기 측정, 테이프 스트리핑, 조직 생검 및 3D 인공피부 ex vivo 시험 방식의 피부노화 진단 방법의 문제점이 해결될 수 있다.
종래의 인체적용기기 측정은 피부의 표면을 단층적으로 측정하는 방법이라, 구체적인 기전의 연구에 활용되거나 특정 인자들의 변화를 과학적으로 설명하기 어렵다는 단점이 있다.
종래의 테이프 스트리핑은 테이프에 붙어 나오는 물질이 각질층으로 한정되어 단지 보조적인 검사 방법으로 사용될 수 있을 뿐, 완전한 결과를 제공하지 못한다는 단점이 있다.
종래의 조직 생검은 집도의의 숙련된 기술이 필요하고, 환자의 고통이 수반되기에 거부감이 발생하고, 시험 후 생검 부위의 흉터가 남는 단점이 있다.
종래의 3D 인공피부를 이용한 ex vivo 시험은 가격이 고가인데다 실제 피부 내 존재하는 혈관, 모낭, 피하지방 등의 구조를 포함하지 않아 실제 피부의 변화를 반영한다고 볼 수 없기에 피부생검을 완벽하게 대체할 수 없다.
본 발명에 따르면, 기존 조직 생검 대비 고통이 거의 없고, 흉터도 남지 않고, 환자의 사용 편의성을 높일 수 있음과 동시에, 각질층 내부의 피부 인자를 채취함으로써 기존의 테이프 스트리핑 대비 분석 결과의 신뢰성을 높일 수 있는 새로운 최소 침습적 피부 상태 측정 키트 및 피부 상태 측정을 위한 바이오마커가 제공될 수 있다.
본 발명에 따라 제공되는 상기 키트 또는 바이오마커를 활용하면, 종래기술 대비 한층 효율적으로 특정 피부 상태 유도 또는 억제 물질 및 치료제를 개발 및 스크리닝 할 수 있으며, 개개인에 대한 정확한 피부 유형에 대한 정보를 제공할 수 있고, 이를 통해 개인의 피부 유형을 과학적으로 분류하여 맞춤형 화장품 개발에 이용할 수 있다.
또한, 본 발명에 따르면, 각 피부 상태 개선을 위한 일반화장품, 기능성화장품, 의료기기, 의약품의 개발에 있어서 동물 실험을 대체 가능한 새로운 인체적용 효능평가 방법이 제공될 수 있다.
도 1은 종래기술의 피부 생체 검사 방법을 도시하는 도면이다.
도 2는 본 발명에 따른 피부 생체 검사 방법을 개념적으로 도시하는 도면이다.
도 3은 눈가주름의 측정과 관련하여 촬영한 고해상도 사진이다.
도 4와 도 5는 GeneChip® Human Gene 2.0 ST Array(Affymetrix) 플랫폼의 매뉴얼에 소개된 microarray 절차를 도시하는 도면이다.
도 6은 R 4.0.0 프로그램을 이용하여 유전자 정렬을 실시한 결과를 도시하는 도면이다.
도 7은 피부노화 원인 중 콜라겐이나 탄력과 관련된 유전자를 선별하여 열거한 표이다.
도 8은 피부노화 원인 중 장벽 기능이나 수분 합성과 관련된 유전자를 선별하여 열거한 표이다.
도 9 내지 도 12는 RNA microarray 분석을 통해 선정된 피부노화 바이오마커 후보들의 발현 정도를 시각적으로 비교분석하기 위해 heatmap 분석을 진행한 결과를 도시한다.
도 13 내지 도 20은 RNA microarray 분석을 통해 선정된 피부노화 바이오마커 후보와 인체적용기기(PRIMOS, Cutometer, Corneometer, Tewameter 및 Skin-pHmeter) 측정 결과와의 상관관계를 확인하기 위해 이변량 상관분석을 시행한 결과를 도시한다.
도 21은 PRIMOS 장비를 이용하여 촬영한 고해상도 사진이다.
도 22는 PRIMOS 장비를 이용하여 눈가주름의 거칠기를 측정한 결과를 도시한다.
도 23은 Cutometer 장비를 이용하여 피부탄력을 측정한 결과를 도시한다.
도 24는 Corneometer 장비를 이용하여 수분함유량을 측정한 결과를 도시한다.
도 25는 콜라겐/탄력 관련 피부노화 유효성평가 바이오마커 후보를 표시한 표이다.
도 26은 피부장벽기능/수분합성 관련 피부노화 유효성평가 바이오마커 후보를 표시한 표이다.
도 27은 피부노화 유효성평가를 진행한 시험대상자의 RNA microarray 분석결과를 이용한 콜라겐/탄력 관련 피부노화 유효성평가 바이오마커 후보들의 발현을 나타내는 heatmap을 도시한다.
도 28은 피부장벽기능/수분합성 관련 피부노화 유효성평가 바이오마커 후보들의 발현을 나타내는 heatmap을 도시한다.
도 29 내지 도 32는 피부노화 유효성평가 RNA microarray 분석을 통해 선별된 피부노화 유효성평가 바이오마커 후보와 인체적용기기(PRIMOS, Cutometer 및 Corneometer) 측정결과와의 상관관계를 확인하기위해 이변량 상관분석을 시행한 결과를 도시한다.
도 33은 유전자 정렬 결과를 도시하는 도면이다.
도 34는 문헌조사를 통해 피부보습과 관련된 것으로 확인된 유전자들의 microarray 시험 결과 확인된 유전자 발현에 관한 수치를 정리한 표이다.
도 35 내지 도 38은 RNA microarray 분석을 통해 선정된 피부보습 관련 바이오마커 후보들의 발현 정도를 시각적으로 비교분석하기 위해 heatmap 분석을 진행한 결과를 도시한다.
도 39 내지 도 45는 RNA microarray 분석을 통해 선정된 피부보습 바이오마커 후보와 인체적용기기(Corneometer, Tewameter 및 Skin-pHmeter) 측정 결과와의 상관관계를 확인하기 위해 이변량 상관분석을 시행한 결과를 도시한다.
도 46은 피부보습 유효성 평가를 시행한 결과를 도시한다.
도 47은 피부보습 유효성평가 RNA microarray 분석을 통해 도 35 내지 도 38의 피부보습(수분함유/수분손실/피부pH) 바이오마커와 동일한 경향성이 확인되는 유전자를 선정하여 유전자 발현에 관한 수치를 정리한 표이다.
도 48은 피부보습 유효성평가 RNA microarray 분석을 통해 선별된 피부보습 유효성평가 바이오마커 후보들의 발현 정도를 시각적으로 비교분석하기 위해 그래프화한 도면이다.
도 49는 유전자 정렬 결과를 도시하는 도면이다.
도 50은 문헌조사를 통해 피부 색소침착과 관련된 것으로 확인된 유전자들의 microarray 시험 결과인 유전자 발현에 관한 수치를 정리한 표이다.
도 51과 도 52는 RNA microarray 분석을 통해 선정된 피부 색소침착 바이오마커 후보들의 발현 정도를 시각적으로 비교분석하기 위해 heatmap 분석을 진행한 결과를 도시한다.
도 53 내지 도 58은 RNA microarray 분석을 통해 선정된 피부 색소침착 관련 바이오마커 후보인 CAT, CLU, DSG1, GPNMB, GPX4, GSTM2, GSTP1, MC2R, MLANA, PAX3, SOX10, TFAP2A, TYR 및 TYRP1 유전자와 인체적용기기(Spectrophotometer 및 Mexameter) 측정 결과와의 상관관계를 확인하기위해 이변량 상관분석을 시행한 결과를 도시한다.
도 59와 도 60은 피부미백 유효성 평가이 있어서 각각 Spectrophotometer 장비를 이용하여 피부 색을 측정하고, Mexameter 장비를 이용하여 눈가 멜라닌을 측정한 결과를 도시한다.
도 61은 피부미백 유효성 바이오마커 후보를 나열한 표이다.
도 62는 피부미백 유효성평가 RNA microarray 분석을 통해 선별된 피부미백 유효성평가 바이오마커 후보들의 발현 정도를 시각적으로 비교분석하기 위해 heatmap 분석을 진행한 결과를 도시한다.
도 63과 도 64는 피부미백 유효성평가를 진행한 시험대상자의 RNA microarray 분석을 통해 선정된 피부미백 유효성 바이오마커 후보와 인체적용기기 측정결과와의 상관관계를 분석한 결과를 도시한다.
도 65는 유전자 정렬 결과를 도시하는 도면이다.
도 66은 문헌조사를 통해 피부유분과 관련된 것으로 확인된 유전자들의 microarray 시험 결과인 유전자 발현에 관한 수치를 정리한 표이다.
도 67은 RNA microarray 분석을 통해 선정된 피부유분 바이오마커 후보들의 발현 정도를 시각적으로 비교분석하기 위해 heatmap 분석을 진행한 결과를 도시한다.
도 68 및 도 69는 RNA microarray 분석을 통해 선정된 피부유분 관련 바이오마커 후보 유전자들과 인체적용기기(Sebumeter) 측정 결과와의 상관관계를 확인하기위해 이변량 상관분석을 시행한 결과를 도시한다.
도 70은 유전자 정렬 결과를 도시하는 도면이다.
도 71은 문헌조사를 통해 홍조성 민감피부와 관련된 것으로 확인된 유전자들의 microarray 시험 결과인 유전자 발현에 관한 수치를 정리한 표이다.
도 72는 RNA microarray 분석을 통해 선정된 홍조성 민감피부 바이오마커 후보들의 발현 정도를 시각적으로 비교분석하기 위해 heatmap 분석을 진행한 결과를 도시한다.
도 73 내지 도 75는 RNA microarray 분석을 통해 선정된 홍조성 민감피부 관련 바이오마커 후보 유전자들과 인체적용기기(Mexameter, Spectrophotometer) 측정 결과와의 상관관계를 확인하기위해 이변량 상관분석을 시행한 결과를 도시한다.
도 76은 젖산 자상 검사 방법을 도시하는 도면이다.
도 77은 유전자 정렬 결과를 도시하는 도면이다.
도 78은 문헌조사를 통해 주관적 자극성 민감피부와 관련된 것으로 확인된 유전자들의 microarray 시험 결과인 유전자 발현에 관한 수치를 정리한 표이다.
도 79와 도 80은 RNA microarray 분석을 통해 선정된 주관적 자극성 민감피부의 바이오마커 후보들의 발현 정도를 시각적으로 비교분석하기 위해 heatmap 분석을 진행한 결과를 도시한다.
도 81 내지 도 84는 RNA microarray 분석을 통해 선정된 주관적 자극성 민감피부 관련 바이오마커 후보 유전자들과 Lactic acid sting test 점수와의 상관관계를 확인하기위해 이변량 상관분석을 시행한 결과를 도시한다.
도 85는 R 4.0.0 프로그램을 이용하여 유전자 정렬을 실시한 결과를 도시하는 도면이다.
도 86은 문헌조사를 통해 여드름과 관련된 것으로 확인된 유전자들의 microarray 시험 결과 확인된 유전자 발현에 관한 수치를 정리한 표이다.
도 87은 피부과 전문의의 이학적 소견을 통해 화장품여드름 활성도가 높은 시험군 5명과 화장품여드름 활성도가 낮고 lactic acid sting test 점수가 0.5점 이하인 대조군 5명, 총 10명의 시험대상자를 선정한 후, RNA microarray 분석 결과를 통해 선정된 화장품여드름 바이오마커 후보들의 발현 정도를 시각적으로 비교분석하기 위해 heatmap 분석을 진행한 결과를 도시하는 도면이다.
도 88 내지 도 94는 유전자별 발현 정도와 이학적 소견과의 상관관계 분석 결과를 보여주는 도면들이다.
도 95 내지 도 98은 유전자별 발현 정도와 육안평가를 통한 지성 점수와의 상관관계 분석 결과를 보여주는 도면들이다.
도 99 내지 도 101은 유전자별 발현 정도와 인체적용기기(Sebumeter) 측정결과와의 상관관계 분석 결과를 보여주는 도면들이다.
후술하는 본 발명에 대한 상세한 설명은, 본 발명이 실시될 수 있는 특정 실시예를 예시로서 도시하는 첨부 도면을 참조한다. 이러한 실시예는 당업자가 본 발명을 실시할 수 있기에 충분하도록 상세히 설명된다. 본 발명의 다양한 실시예는 서로 다르지만 상호 배타적일 필요는 없음이 이해되어야 한다. 후술하는 상세한 설명은 한정적인 의미로서 행하여지는 것이 아니며, 본 발명의 범위는 특허청구범위의 청구항들이 청구하는 범위 및 그와 균등한 모든 범위를 포괄하는 것으로 받아들여져야 한다.
이하에서는, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 본 발명을 용이하게 실시할 수 있도록 하기 위하여, 본 발명의 여러 바람직한 실시예에 관하여 첨부된 도면을 참조하여 상세히 설명하기로 한다.
도 1은 종래기술의 피부 생체 검사 방법을 도시하는 도면이고, 도 2는 본 발명에 따른 피부 생체 검사 방법을 개념적으로 도시하는 도면이다.
도 2는 본 발명에 따른 피부 생체 검사 방법을 개념적으로 도시하는 도면이다.
도 2의 좌측 상단에는 본 출원일 당시 당업계에 알려진 마이크로니들 패치가 도시되어 있다. 도 2의 좌측 하단에는 이러한 마이크로니들 패치가 피부에 적용된 모습이 도시되어 있으며, 보다 구체적으로는 패치의 마이크로니들이 피부의 진피층까지 침투된 모습을 도시한다. 도 2의 우측 부분에는 대상자에게 마이크로니들 패치가 적용된 후 패치의 마이크로니들에 묻어나온 피부 내 단백질을 활용하여 생체 검사를 실시하는 본 발명의 대표적인 기술적 사상이 개념적으로 도시되어 있다. 여기에 표시된 용어인 바이오 마이닝(Bio-Mining)은 생체 검사를 위하여 대상체 피부 내의 단백질을 캐낸다는 의미로 사용되었다.
본 발명에서 피부 가검물 채취 수단으로 사용된 생분해성 고분자 히알루론산 마이크로니들 패치는 중실(solid) 구조이며, 송풍인장 공정(Droplet Extension, DEN)으로 제조되었으나, 본 발명의 범주가 이와 다른 방식, 예컨대 몰딩 방식으로 제조된 마이크로니들 패치의 사용을 배제하는 것으로 해석되어서는 안된다. 제조방식을 불문하고 동일 재질, 동일 구조의 마이크로니들 패치는 피부 가검물 채취 성능에 있어서 대동소이 한 것으로 평가된다.
본 발명자(들)는 각 피부 상태 측정 및 평가에 유용한 바이오마커 발굴을 위하여 임상시험을 실시하였다. 임상시험 대상자는 다음과 같이 선정하였다.
임상시험 대상자의 선정
본 발명자들은 각 피부 상태와 관련된 바이오마커를 발굴하고 이를 이용하여 각 피부 상태 진단 방법과 진단 키트를 개발하기 위하여 33명의 20~70세의 건강한 시험대상자를 대상으로 실험을 수행하였다. 아래 표 1에는 시험대상자의 임상 특성이 정리된다.
표본 수 (명) 33
남자 (명) 19 여자 (명) 14
연령 (평균 ± SD) 37.12 ± 12.90
이 때, ① IRB 승인 이후 자발적으로 본 연구에 동의하지 않아 동의서를 작성하지 않은 자, ② 인체 유래물 제공에 동의하지 않은 자, ③ 임신 또는 수유중인 여성과 프로토콜에서 정한 피임방법에 동의하지 않는 가임기 여성, ④ 피부 질환의 치료를 위해 스테로이드가 함유된 피부 외형제를 1개월 이상 사용하는 사람, ⑤ 최근 한 달간 경구 스테로이드제, 경구 항생제, 면역억제제 사용자, ⑥ 대상 병변 부위에 감염(진균, 세균 및 바이러스 감염)의 소견이 있는 환자, ⑦ 자외선 치료를 받고 있는 자, ⑧ 심각한 전신질환이 있는 자, ⑨ 동의서를 읽고 이해할 수 없는 시험대상자(문맹 등), 및 ⑩ 그 외 시험책임자의 판단으로 시험에 부적합하다고 생각되는 사람은 시험대상자에서 제외하였다.
그 이후의 임상 시험 진행에 대한 내용은 본 발명에 따라 진단, 평가 또는 측정되는 각 피부 상태 별로 이하에 기술하기로 한다.
<피부노화>
피부노화 정도에 따른 시험대상자 분류, 전문의 문진, 인체적용기기 평가, lactic acid sting test 및 피부 가검물 채취
세안 후 30분 동안 항온 및 항습 조건에서 대기한 후, 시험대상자를 대상으로 설문평가 및 피부과 전문의 문진을 시행하였고, 평상시 표정일 때의 눈가주름, 피부탄력, 수분함유량, 경피수분증발량 및 피부산성도를 측정하였다. 구체적으로 눈가주름은 PRIMOSCR, 피부탄력은 Cutometer® Dual MPA 580, 수분함유량은 Corneometer, 경피수분증발량은 Tewameter, 피부산성도는 Skin-pHmeter 장비를 이용하여 측정하였다. 이 중 눈가주름의 측정 관련해서는 도 3의 고해상도 사진을 참조 가능하다. 눈가주름은 roughness (Ra)값, 피부탄력은 R2값, 수분함유량은 A.U.값, 경피수분증발량은 g/h/m2값, 피부산성도는 pH값으로 정량화 하였다.
시험대상자의 눈가주름에 대한 이학적 소견은 화장품 표시·광고 실증을 위한 시험방법 가이드라인 개정(안)의 육안평가 기준에 근거하여, 피부과 전문의에 의해 육안판정을 진행하였다.
표 2는 전체 시험대상자 중 20대(대조군) 5명과 50대 이상(시험군) 5명을 선정하여 인체적용기기를 통해 피부노화를 평가한 결과이다.
시험군 (50대 이상) 대조군 (20대)
표본 수 (명) 5 5
연령 (평균 ± SD) 60.80 ± 5.72 24.20 ± 1.15
이학적 소견 (점수) 3.60 ± 0.84 0.80 ± 0.79
눈가주름 (Ra) 32.10 ± 3.69 18.24 ± 3.23
피부탄력 (R2) 0.61 ± 0.06 0.76 ± 0.02
수분함유량 (A.U.) 51.06 ± 18.61 61.74 ± 11.58
경피수분증발량 (g/h/m2) 17.07 ± 7.21 15.71 ± 5.34
피부산성도 (pH) 4.89 ± 0.40 5.26 ± 0.47
또한, 마이크로니들 패치를 안면에 15분 동안 부착 후 피부 가검물을 채취하였다.
피부 가검물로부터 RNA 채취
시험대상자로부터 획득한 피부 가검물을 RNeasy® Plus Mini Kit (Qiagen)에 제공하였고, 상기 Kit를 이용하여 고순도의 RNA를 추출하였다. 그 다음, NanoDrop 장비와 2100 Bioanalyzer 장비를 이용하여 RNA 샘플의 QC(Quality Control)를 확인한 후 RNA microarray 분석을 시행하였다.
RNA microarray 분석
상술한 방법으로 분리한 RNA는 소량(100 pg)의 총 RNA를 cRNA로 증폭하는 방법인 GeneChip® WT Pico Kit(Applied Biosystems)를 사용하여 시료에 유연하고 감도 높은 전처리를 시행하였다. 증폭된 RNA는 GeneChip® Human Gene 2.0 ST Array(Affymetrix) 플랫폼의 매뉴얼에 따라 microarray를 실행하였다. 증폭 과정에 대해 보다 구체적으로 설명하면 다음과 같다.
분리한 RNA는 GeneChip® WT Pico Kit(Applied Biosystems)를 사용하여 증폭하였으며, 제조사의 동봉된 시험방법에 따라 진행하였다. mRNA를 주형으로 T7 프로모터 서열과 first strand cDNA를 합성하였고, DNA polymerase와 RNase H를 사용하여 RNA를 동시에 분해하고 3’ Adaptor로 단일 가닥 cDNA를 합성하였으며, Taq DNA polymerase와 어댑터 별 프라이머를 사용하여 주형 역할을 하는 이중 가닥 cDNA를 합성하였다. 이후, antisense RNA(cRNA)는 T7 RNA polymerase를 사용하여 in vitro transcription(IVT)에 의해 합성되고 증폭되었고, 수득 된 antisense cRNA purification beads를 사용하여 정제하였고, 역전사를 위한 주형으로 사용하여 sense 방향으로 단일 가닥 cDNA를 생성하였다. 이후, sense cDNA를 조각화하고, GeneChip® WT Terminal Labeling Kit(Affymetrix)를 사용하여 TdT(Terminal deoxynucleotidyl transferase)로 비오틴 라벨링을 하였다. 약 5.5 μg의 라벨링 된 DNA 타겟은 GeneChip® Human 2.0 ST Array(Affymetrix) 플랫폼의 매뉴얼에 따라 microarray를 실행하였다.
도 4와 도 5는 상기 플랫폼의 매뉴얼에 소개된 microarray 절차를 도시하고 있다. 아래의 표 3은 상기 플랫폼의 RNA microarray 분석 프로토콜을 정리한 것이다.
Sample type Total RNA
Platform GeneChip® Human Gene 2.0 ST Array
cDNA synthesize cDNA was synthesized using the GeneChip WT (Whole Transcript) Amplification kit as described by the manufacturer.
Label protocol The sense cDNA was then fragmented and biotin-labeled with TdT (terminal deoxynucleotidyl transferase) using the GeneChip WT Terminal labeling kit
Hybridization protocol Approximately 5.5 μg of labeled DNA target was hybridized to the Affymetrix GeneChip Array at 45°C for 16hour
Scan protocol Hybridized arrays were washed and stained on a GeneChip Fluidics Station 450 and scanned on a GCS3000 Scanner (Affymetrix).
Data processing Array data export processing and analysis was performed using Affymetrix® GeneChip Command Console® Software (AGCC)
그 이후, Affymetrix® Power Tools (APT)의 Robust Multi-Average (RMA) 방법을 통해 전체 데이터를 요약 및 정규화 하였고, 유전자 수준으로 결과를 정리하고 Differentially Expressed Gene(DEG) 분석을 수행하였다. 데이터의 통계적 유의성은 독립적 t-test와 fold change의 변화를 이용하여 분석하였고, False discovery rate(FDR)는 Benjamini-Hochberg 알고리즘을 사용하여 p 값을 조정하였고, DEG 세트는 linkage와 Euclidean distance를 사용하여 Hierarchical cluster 분석을 수행하였다. 또한, 유전자 발현의 차이를 확인하기 위한 모든 데이터 분석과 시각화 작업은 R 4.0.0 프로그램을 사용하여 수행하였다.
생물정보학 분석(Bioinformatics analysis) 및 유의적 상관관계 분석을 통한 피부노화 바이오마커 후보 선별
RNA microarray 시험 진행 후, 시험군과 대조군의 약 4만여가지의 유전자 발현 차이를 확인하기 위해, R 4.0.0 프로그램을 이용하여 유전자 정렬을 실시하였다. 도 6은 유전자 정렬 결과를 도시하는 도면이다. 도 6의 유전자 정렬은 heatmap 분석이라고도 불린다. Heatmap 분석은 열을 뜻하는 히트 (heat)와 지도를 뜻하는 맵(map)을 결합시킨 용어로서, 색으로 표현할 수 있는 다양한 정보를 이미지 위에 열분포 형태의 도면으로 나타내는 분석 방법이다. 본 명세서에 기재한 heatmap 분석에서는 빨간색으로 나타낼수록 유전자의 발현값이 커지는 것을 의미하고, 파란색으로 나타낼수록 유전자의 발현값이 작아지는 것을 의미한다. 도 6에서는 수 백가지의 유전자를 분석했을 때, 시험군과 대조군에서 다수의 유전자의 발현값이 특이적으로 차이가 나는 것을 확인하였다.
그 이후, 본 발명자들은 문헌조사를 통해 피부노화 원인 중 콜라겐이나 탄력과 관련된 유전자를 선별하였고(도 7), 피부노화 원인 중 장벽 기능이나 수분 합성과 관련된 유전자를 선별하였다(도 8). 본 발명자들은 상기 문헌조사를 통해 피부노화와 관련된 것으로 확인된 유전자들의 microarray 시험 결과 확인된 유전자 발현에 관한 수치를 위 도면들의 표에 정리하였다.
피부노화가 진행된 시험군과 그렇지 않은 대조군에 있어서 microarray를 실시함으로써 얻어진 유전자 발현에 관한 수치값에 차별성이 존재하여야 피부노화에 관한 바이오마커로서 유용할 것이다. 이를 판단하기 위하여 본 발명자들은 fold change와 p-value를 사용하였다. Fold change는 시험군에서의 측정 수치가 대조군에서의 측정 수치에 비해 몇 배나 높아졌거나 낮아졌는지를 보여주는 값이고, p-value는 통계처리에 있어서 시험군과 대조군 사이의 값이 통계적으로 유의한 차이를 보이는지에 대한 값이다. RNA microarray 시험을 통해 얻은 각 샘플의 normalized signal 값(발현값)을 도 7 및 도 8의 표에 표시하였으며, fold change는 시험군과 대조군 간 normalized signal 값을 사용하여 1:1 발현 차를 계산한 값이다. p-value는 데이터가 귀무가설과 양립하는 정도를 0에서 1사이의 값으로 표현한 것으로 대개 0.05보다 작을 경우 귀무가설을 기각함을 의미한다.
결과적으로 콜라겐/탄력 관련 피부노화 유전자 중 fold change가 1.2배 혹은 -1.2배 이상이거나 p-value가 0.05 이하인 유전자는 COL3A1, FN1, GSTA3 및 PINK1이며, 피부장벽기능/수분합성 관련 피부노화 유전자 중 fold change가 1.2배 혹은 -1.2배 이상이거나 p-value가 0.05 이하인 유전자는 IVL, HAS3, AQP3, CERS6, CLDN1, SLC9A1, TGM1, SPINK5, KLF4, BGN, LCE1A, LCE1B, LCE1F 및 LCE2A로 확인되었다.
도 9 내지 도 12는 상술한 바와 같은 RNA microarray 분석을 통해 선정된 피부노화 바이오마커 후보들의 발현 정도를 시각적으로 비교분석하기 위해 heatmap 분석을 진행한 도면이다. 도 9는 50대 이상의 시험군 5명과 20대 대조군 5명을, 도 10은 20대, 30대, 40대 및 50대 이상의 각 연령대 별 5명씩, 총 20명의 시험대상자의 RNA microarray 분석 결과를 이용한 탄력/콜라겐 관련 피부노화 바이오마커 후보들의 발현을 나타내는 heatmap 도면이다. 도 11은 50대 이상의 시험군 5명과 20대 대조군 5명을, 도 12는 20대, 30대, 40대 및 50대 이상의 각 연령대 별 5명씩, 총 20명의 시험대상자의 RNA microarray 분석 결과를 이용한 피부장벽기능/수분합성 관련 피부노화 바이오마커 후보들의 발현을 나타내는 heatmap 도면이다.
도 6의 경우와 동일하게 도 9 내지 도 12의 heatmap 분석도 빨간색으로 나타낼수록 유전자의 발현값이 커지는 것을 의미하고, 파란색으로 나타낼수록 유전자의 발현값이 작아지는 것을 의미한다. 도 9 내지 도 12의 실험 결과로부터는 대조군에 비해 시험군에서 문헌조사를 통해 선별한 특정 유전자들의 발현이 빨간색으로 높게 나타남을 시각적으로 확인하였다.
상기의 RNA microarray 분석을 통해 선정된 피부노화 바이오마커 후보와 인체적용기기(PRIMOS, Cutometer, Corneometer, Tewameter 및 Skin-pHmeter) 측정 결과와의 상관관계를 확인하기 위해 이변량 상관분석을 시행하였다. 그 결과가 도 13 내지 도 20에 도시된다.
도 13과 도 14는 50대 이상의 시험군 5명과 20대 대조군 5명의, 도 15와 도 16은 20대, 30대, 40대 및 50대 이상의 각 연령대 별 5명씩, 총 20명의 시험대상자의 RNA microarray 분석을 통해 선정된 콜라겐/탄력 관련 피부노화 바이오마커 후보와 나이 및 인체적용기기 측정 결과와의 상관관계를 분석한 도면이다.
그 결과, 50대 이상의 시험군 5명과 20대 대조군 5명, 총 10명 시험대상자의 RNA microarray 분석결과의 FN1, GSTA3 및 PINK1 유전자는 시험대상자의 나이와 통계적으로 유의한 음의 상관관계를 나타냄을 확인하였고, COL1A1, COL3A1, FN1, GSTA3, PON1 및 PINK1 유전자는 눈가주름을 측정한 PRIMOS 장비의 측정결과와 통계적으로 유의한 음의 상관관계를 나타내며, PINK1 유전자는 피부탄력을 측정한 Cutometer 장비의 측정결과와 통계적으로 유의한 양의 상관관계를 나타냄을 확인하였다. 도 14에는 각 유전자에 대한 표기가 생략되어 있으나, 도 14에 관한 위 설명은 도 14의 상단 좌측으로부터 순서대로 이루어졌다. 즉, 시험대상자의 나이와 통계적으로 음의 상관관계를 나타낸 FN1, GSTA3 및 PINK1 유전자에 대한 결과는 도 14의 첫번째 줄 좌측으로부터 순서대로, 눈가주름을 측정한 PRIMOS 장비의 측정결과와 통계적으로 유의한 음의 상관관계를 나타낸 COL1A1, COL3A1, FN1, GSTA3, PON1 및 PINK1 유전자에 대한 결과는 도 14의 가운데 줄 좌측에서부터 순서대로, 피부탄력을 측정한 Cutometer 장비의 측정결과와 통계적으로 유의한 양의 상관관계를 나타낸 PINK1 유전자는 도 14의 마지막 줄에 표시되었다. 이하 도 14에서와 같이 복수개 유전자들의 상관 관계를 나타내는 산점도 그래프에서 유전자 표기가 그래프에서 생략된 것들에 대해서도 이 내용이 동일하게 적용된다. 즉, 산점도 그래프의 좌측 상단에서부터 순서대로 상관관계를 기술하기로 한다.
또한, 20대, 30대, 40대 및 50대 이상의 각 연령대 별 5명씩, 총 20명의 시험대상자 RNA microarray 분석결과의 COL1A1, FN1, GSTA3 및 PINK1 유전자는 시험대상자의 나이와 통계적으로 유의한 음의 상관관계를 나타냄을 확인하였고, FN1, GSTA3 및 PINK1 유전자는 눈가주름을 측정한 PRRMOS 장비의 측정결과와 통계적으로 유의한 음의 상관관계를 나타내며, GSTA3 및 PINK1 유전자는 피부탄력을 측정하는 Cutometer 장비의 측정결과와 양의 상관관계를 나타냄을 확인하였다.
따라서, 시험대상자의 RNA microarray 분석결과와 인체적용기기 측정결과를 종합적으로 분석하였을 때, 콜라겐/탄력 관련 피부노화 바이오마커는 COL1A1, COL3A1, FN1, GSTA3, PON1 및 PINK1, 총 6가지의 유전자로 선정하였다.
도 17과 도 18은 50대 이상의 시험군 5명과 20대 대조군 5명의, 도 19와 도 20은 20대, 30대, 40대 및 50대 이상의 각 연령대 별 5명씩, 총 20명의 시험대상자의 RNA microarray 분석을 통해 선정된 피부장벽기능/수분함량 관련 피부노화 바이오마커 후보와 나이 및 인체적용기기 측정 결과와의 상관관계를 분석한 도면이다.
그 결과, 50대 이상의 시험군 5명과 20대 대조군 5명, 총 10명 시험대상자의 RNA microarray 분석결과의 IVL, CERS6, SPINK5 및 KLF4 유전자는 시험대상자의 나이와 유의한 음의 상관관계를 나타냄을 확인하였고, IVL, HAS2 및 HAS3 유전자는 눈가주름을 측정한 PRIMOS 장비의 측정결과와 통계적으로 유의한 음의 상관관계를 나타내며, IVL, TGM1, SPINK5 및 KLF4 유전자는 피부탄력을 측정한 Cutometer 장비의 측정결과와 통계적으로 유의한 양의 상관관계를 나타냄을 확인하였다. 더불어, KLF4 유전자는 수분함유량을 측정하는 Corneometer 장비의 측정결과와 양의 상관관계를 나타냄을 확인하였다.
또한, 20대, 30대, 40대 및 50대 이상의 각 연령대 별 5명씩, 총 20명의 시험대상자 RNA microarray 분석결과의 IVL, CERS6 및 TGM1 유전자는 시험대상자의 나이와 유의한 음의 상관관계를 나타냄을 확인하였고, BGN 유전자는 눈가주름을 측정한 PRIMOS 장비의 측정결과와 통계적으로 유의한 음의 상관관계를 나타내며, IVL, TGM1, SPINK5 및 KLF4 유전자는 피부탄력을 측정하는 Cutometer 장비의 측정결과와 통계적으로 유의한 양의 상관관계를 나타냄을 확인하였다. 더불어, CERS6 및 KLF4 유전자는 수분함유량을 측정하는 Corneometer 장비의 측정결과와 통계적으로 유의한 양의 상관관계를 나타내며, KLF4 유전자는 경피수분손실량을 측정하는 Tewameter 장비의 측정결과와 통계적으로 유의한 음의 상관관계를 나타냄을 확인하였다.
따라서, 시험대상자의 RNA microarray 분석결과와 인체적용기기 측정결과를 종합적으로 분석하였을 때, 피부장벽기능/수분합성 관련 피부노화 바이오마커는 IVL, HAS2, HAS3, AQP3, CERS6, CLDN1, SLC9A1, TGM1, SPINK5, KLF4, LCE1A, LCE1B, LCE1F, LCE2A 및 BGN, 총 15가지의 유전자로 선정하였다.
피부노화 유효성평가를 통한 콜라겐/탄력 및 피부장벽기능/수분합성 관련 피부노화 바이오마커 선정
상기에서 선정된 콜라겐/탄력 및 피부장벽기능/수분합성 관련 피부노화 바이오마커가 피부노화의 정도를 측정하고 진단하는 것과 더불어, 실제 피부노화와 관련 있는 유효성분 또는 항노화제를 스크리닝 하거나 일반화장품, 기능성화장품, 의료기기, 의약품 등의 사용 전과 후의 피부노화를 평가하고, 더 나아가 동물대체실험으로 사용되어질 수 있는지 검증하기 위해 피부노화 유효성평가를 시행하였다.
구체적으로, 60대 이상의 시험대상자 2명을 대상으로 4주간 트레티노인 크림(스티바-A® 크림, 0.025%)을 눈가에 도포하였고, 0주차와 4주차에 PRIMOS 장비를 이용하여 고해상도 사진촬영(도 21) 및 눈가주름의 거칠기를 측정하였고(표 4, 도 22), Cutometer 장비를 이용하여 피부탄력을 측정하였고(표 5, 도 23), Corneometer 장비를 이용하여 수분함유량을 측정하였으며(표 6, 도 24), 눈가에 마이크로니들 패치를 15분간 부착 후 피부 가검물을 취득하고 RNA를 추출하여 RNA microarray를 수행하였다.
눈가주름 (Ra) 0주 4주
시험대상자 1 27.87 ± 2.67 22.97 ± 0.81
시험대상자 2 36.80 ± 0.70 22.77 ± 2.76
피부탄력 (R2) 0주 4주
시험대상자 1 0.4886 ± 0.0158 0.5909 ± 0.0245
시험대상자 2 0.5460 ± 0.0430 0.6252 ± 0.0123
수분함유량 (A.U.) 0주 4주
시험대상자 1 59.53 ± 2.29 69.37 ± 2.93
시험대상자 2 58.36 ± 5.83 71.68 ± 4.66
RNA microarray 시험 진행 후 피부노화 유효성평가에 따른 유전자 발현 차이를 확인하기 위해 R 4.0.0 프로그램을 이용하여 유전자 정렬을 실시하였다. 이후 문헌조사를 통해 선별한 콜라겐/탄력과 관련 유전자와 상기에서 선정된 콜라겐/탄력과 관련된 피부노화 바이오마커(COL1A1, COL3A1, FN1, GSTA3, PON1 및 PINK1) 중 동일한 경향성이 확인되는 유전자를 선정하여 도 25의 표에 분류하였고, 문헌조사를 통해 선별한 피부장벽기능/수분합성 관련 유전자와 상기에서 선정된 피부장벽기능/수분합성과 관련된 피부노화 바이오마커(IVL, HAS2, HAS3, AQP3, CERS6, CLDN1, SLC9A1, TGM1, SPINK5, KLF4, LCE1A, LCE1B, LCE1F, LCE2A 및 BGN) 중 동일한 패턴을 나타내는 유전자를 선정하여 도 26의 표에 분류하였다.
도 25의 표에 표시된 상기의 콜라겐/탄력 관련 피부노화 유전자 중 fold change가 1.2배 혹은 -1.2배 이상이거나 p-value가 0.05 이하인 유전자는 GSTA3이며, 도 26의 표에 표시된 피부장벽기능/수분합성 관련 피부노화 유전자 중 fold change가 1.2배 혹은 -1.2배 이상이거나 p-value가 0.05 이하인 유전자는 LEC1A, LCE1F, LCE2A, LOR, AQP3, AQP10, BGN, HAS2 및 HAS3로 확인되었다.
도 27과 도 28은 상기의 피부노화 유효성평가 RNA microarray 분석을 통해 선별된 피부노화 유효성평가 바이오마커 후보들의 발현 정도를 시각적으로 비교분석하기 위해 heatmap 분석을 진행한 결과를 도시하는 도면이다. 도 27은 피부노화 유효성평가를 진행한 시험대상자의 RNA microarray 분석결과를 이용한 콜라겐/탄력 관련 피부노화 유효성평가 바이오마커 후보들의 발현을 나타내는 heatmap 도면이며, 도 28은 피부장벽기능/수분합성 관련 피부노화 유효성평가 바이오마커 후보들의 발현을 나타내는 heatmap 도면이다.
본 발명자들은 상기의 피부노화 유효성평가 RNA microarray 분석을 통해 선별된 피부노화 유효성평가 바이오마커 후보와 인체적용기기(PRIMOS, Cutometer 및 Corneometer) 측정결과와의 상관관계를 확인하기위해 이변량 상관분석을 시행하였다. 그 결과가 도 29 내지 도 32에 도시된다. 도 29와 도 30은 피부노화 유효성평가를 진행한 시험대상자의 RNA microarray 분석을 통해 선정된 콜라겐/탄력 관련 피부노화 유효성 바이오마커 후보와 인체적용기기 측정결과와의 상관관계를 분석한 도면이다. 그 결과, 0주차에 비해 트레티노인 크림을 4주간 도포한 후, 콜라겐/탄력 관련 피부노화 바이오마커인 COL4A4, FN1 및 PINK1 유전자는 눈가주름을 측정한 PRIMOS 측정결과와 통계적으로 유의한 음의 상관관계를 확인하였으며, COL4A4 및 MMP8 유전자는 수분함유량을 측정한 Corneometer 측정결과와 양의 혹은 음의 상관관계를 나타냄을 확인하였다. 따라서, 상기의 피부노화 및 피부노화 유효성평가를 종합적으로 분석하였을 때, 콜라겐/탄력 관련 피부노화 유효성평가 바이오마커는 상기의 피부노화 바이오마커(COL1A1, COL3A1, FN1, GSTA3, PON1 및 PINK1)와 더불어 COL4A4 및 MMP8, 총 8가지의 유전자로 선정하였다. 또한, 정확하고 효과적인 피부 상태 진단의 관점에서, 본 발명자(들)는 이들 유전자 중 COL1A1, COL3A1 FN1 및 PINK1을 바이오마커 군에 포함하도록 실시하는 것이 유리하다는 것을 발견하였다.
도 31과 도 32는 피부노화 유효성평가를 진행한 시험대상자의 RNA microarray 분석을 통해 선정된 피부장벽기능/수분합성 관련 피부노화 유효성 바이오마커 후보와 인체적용기기 측정결과와의 상관관계를 분석한 도면이다. 결과, 0주차에 비해 트레티노인 크림을 4주간 도포한 후, 피부장벽기능/수분합성 관련피부노화 바이오마커인 AQP3 및 HAS3 유전자는 눈가주름을 측정한 PRIMOS 측정결과와 통계적으로 유의한 음의 상관관계를 확인하였으며, LCE1A, AZGP1 및 BGN 유전자는 피부탄력을 측정한 Cutometer 측정결과와 양의 상관관계를 나타내며, LCE1B, HAS2 및 HAS3 유전자는 수분함유량을 측정한 Corneometer 측정결과와 양의 상관관계를 나타냄을 확인하였다.
따라서, 상기의 피부노화 및 피부노화 유효성평가를 종합적으로 분석하였을 때, 피부장벽기능/수분합성 관련 피부노화 유효성평가 바이오마커는 상기의 피부노화 바이오마커 (IVL, HAS2, HAS3, AQP3, CERS6, CLDN1, SLC9A1, TGM1, SPINK5, KLF4, LCE1A, LCE1B, LCE1F, LCE2A 및 BGN)와 AZGP1, 총 16가지의 유전자로 선정하였다. 또한, 정확하고 효과적인 피부 상태 진단의 관점에서, 본 발명자(들)는 이들 유전자 중 IVL, HAS3, AQP3, BGN 및 AZGP1을 바이오마커 군에 포함하도록 실시하는 것이 유리하다는 것을 발견하였다.
정리하면, 콜라겐/탄력 관련 피부노화 바이오마커는 COL1A1, COL3A1, FN1, GSTA3, PON1, PINK1, COL4A4 및 MMP8로, 피부장벽기능/수분합성 관련 피부노화 바이오마커 IVL, HAS2, HAS3, AQP3, CERS6, CLDN1, SLC9A1, TGM1, SPINK5, KLF4, LCE1A, LCE1B, LCE1F, LCE2A, BGN 및 AZGP1으로 최종 선정되었다. 이를 이용하여 피부노화 진단 방법 또는 진단 키트; 피부노화 유도 또는 억제 물질 및 항노화제 개발과 스크리닝; 개개인에 대한 피부 유형 정보 제공; 맞춤형 화장품 개발; 및 동물대체 피부노화 유효성 평가에 이용될 수 있다.
<피부보습>
피부보습(수분함유/수분손실/피부pH)에 따른 시험대상자 분류, 전문의 문진, 인체적용기기 평가 및 피부 가검물 채취
세안 후 30분 동안 항온 및 항습 조건에서 대기한 후, 시험대상자를 대상으로 설문평가와 피부과 전문의 문진을 시행하였다. 또한, 시험대상자를 대상으로 양 볼 부위의 수분함유량, 경피수분손실량, 및 피부pH를 측정하였다. 구체적으로, 수분함유량은 Corneometer® CM825 장비를, 경피수분손실량은 Tewameter® TM300 장비를, 피부pH는 Skin-pHmeter PH905 장비를 이용하여 측정하였고, 수분함유량은 arbitary unit(A.U.)값을, 경피수분손실량은 g/h/m2값을, 피부pH는 pH값을 분석하였다.
시험대상자의 피부보습에 대한 이학적 소견은 관련 문헌(Int J Dermatol. 2017 Yoshida-Amano et al)에 근거하여, 피부과 전문의가 육안판정을 시행한 결과이다.
표 7은 전체 시험대상자 중 상기 3가지 인체적용기기 측정 결과를 토대로 건조하지 않은 대조군 5명, 건조한 시험군 5명을 분류하여 피부보습 정도를 평가한 결과를 표시한다.
시험군 (건조) 대조군
표본 수 (명) 5 5
연령 (평균 ± SD) 32.60 ± 6.99 44.80 ± 20.89
이학적 소견 (점수) 1.20 ± 0.84 0.60 ± 0.55
수분함유량 (A.U.) 38.41 ± 8.78 65.81 ± 5.97
경피수분증발량 (g/h/m2) 24.12 ± 3.92 10.69 ± 1.57
피부산성도 (pH) 5.42 ± 0.43 4.72 ± 0.30
또한, 마이크로니들 패치를 안면에 15분 동안 부착 후 피부 가검물을 채취하였다.
피부 가검물로부터 RNA 채취
시험대상자로부터 획득한 피부 가검물을 RNeasy® Plus Mini Kit (Qiagen)에 제공하였고, 상기 Kit를 이용하여 고순도의 RNA를 추출하였다. 그 다음, NanoDrop 장비와 2100 Bioanalyzer 장비를 이용하여 RNA 샘플의 QC(Quality Control)를 확인한 후 RNA microarray 분석을 시행하였다.
RNA microarray 분석
상술한 방법으로 분리한 RNA는 소량(100 pg)의 총 RNA를 cRNA로 증폭하는 방법인 GeneChip® WT Pico Kit(Applied Biosystems)를 사용하여 시료에 유연하고 감도 높은 전처리를 시행하였다. 상술한 방식으로 증폭된 RNA는 GeneChip® Human Gene 2.0 ST Array(Affymetrix) 플랫폼의 매뉴얼에 따라 microarray를 실행하였다. 상기 플랫폼의 매뉴얼에 소개된 microarray 절차는 도 4 및 도 5에 도시한 바 있다. 본 발명자들은 동일 절차로 microarray를 실행하였다. 상기 플랫폼의 RNA microarray 분석 프로토콜은 표 3에 정리한 바와 동일하다.
그 이후, Affymetrix® Power Tools (APT)의 Robust Multi-Average (RMA) 방법을 통해 전체 데이터를 요약 및 정규화 하였고, 유전자 수준으로 결과를 정리하고 Differentially Expressed Gene(DEG) 분석을 수행하였다. 데이터의 통계적 유의성은 독립적 t-test와 fold change의 변화를 이용하여 분석하였고, False discovery rate(FDR)는 Benjamini-Hochberg 알고리즘을 사용하여 p 값을 조정하였고, DEG 세트는 linkage와 Euclidean distance를 사용하여 Hierarchical cluster 분석을 수행하였다. 또한, 유전자 발현의 차이를 확인하기 위한 모든 데이터 분석과 시각화 작업은 R 4.0.0 프로그램을 사용하여 수행하였다.
생물정보학 분석(Bioinformatics analysis) 및 유의적 상관관계 분석을 통한 피부보습(수분함유/수분손실/피부pH) 바이오마커 후보 선별
RNA microarray 시험 진행 후, 시험군과 대조군의 약 4만여가지의 유전자 발현 차이를 확인하기 위해, R 4.0.0 프로그램을 이용하여 유전자 정렬을 실시하였다. 도 33은 유전자 정렬 결과를 도시하는 도면이다. 도 33의 유전자 정렬은 heatmap 분석이라고도 불린다. Heatmap 분석은 열을 뜻하는 히트 (heat)와 지도를 뜻하는 맵(map)을 결합시킨 용어로서, 색으로 표현할 수 있는 다양한 정보를 이미지 위에 열분포 형태의 도면으로 나타내는 분석 방법이다. 본 명세서에 기재한 heatmap 분석에서는 빨간색으로 나타낼수록 유전자의 발현값이 커지는 것을 의미하고, 파란색으로 나타낼수록 유전자의 발현값이 작아지는 것을 의미한다. 도 33에서는 수 백가지의 유전자를 분석했을 때, 시험군과 대조군에서 다수의 유전자의 발현값이 특이적으로 차이가 나는 것을 확인하였다.
그 이후, 본 발명자들은 문헌조사를 통해 피부보습(수분함유/수분손실/피부pH) 관련 유전자를 선별하였다(도 34). 본 발명자들은 상기 문헌조사를 통해 피부보습과 관련된 것으로 확인된 유전자들의 microarray 시험 결과 확인된 유전자 발현에 관한 수치를 위 도면의 표에 정리하였다.
피부보습 정도가 양호한 대조군과 그렇지 않은 건조한 시험군에 있어서 microarray를 실시함으로써 얻어진 유전자 발현에 관한 수치값에 차별성이 존재하여야 피부보습 정도에 관한 바이오마커로서 유용할 것이다. 이를 판단하기 위하여 본 발명자들은 fold change와 p-value를 사용하였다. Fold change는 시험군에서의 측정 수치가 대조군에서의 측정 수치에 비해 몇 배나 높아졌거나 낮아졌는지를 보여주는 값이고, p-value는 통계처리에 있어서 시험군과 대조군 사이의 값이 통계적으로 유의한 차이를 보이는지에 대한 값이다. RNA microarray 시험을 통해 얻은 각 샘플의 normalized signal 값(발현값)을 도 34의 표에 표시하였으며, fold change는 시험군과 대조군 간 normalized signal 값을 사용하여 1:1 발현 차를 계산한 값이다. p-value는 데이터가 귀무가설과 양립하는 정도를 0에서 1사이의 값으로 표현한 것으로 대개 0.05보다 작을 경우 귀무가설을 기각함을 의미한다.
결과적으로 피부보습(수분함유/수분손실/피부pH) 관련 유전자 중 fold change가 1.2배 혹은 -1.2배 이상이거나 p-value가 0.05 이하인 유전자는 CDSN, FLG, FLG2, LOR, KLF4, KRT10, LCE1A, LCE2A, LCE2B, LCE2C, SMPD3, CDH1, ITGB4, IVL, SPINK5, CLDN1, AQP3, BGN, HAS3, TGM1, CLDN7, CERS3, CLDN4 및 KRT1으로 확인되었다.
도 35 내지 도 38은 상술한 바와 같은 RNA microarray 분석을 통해 선정된 피부보습 관련 바이오마커 후보들의 발현 정도를 시각적으로 비교분석하기 위해 heatmap 분석을 진행한 도면이다. 도 35는 상기 건조한 대상자 시험군 5명과 건조하지 않은 대조군 5명, 총 10명을 분석한 결과 피부보습 바이오마커 후보들의 발현을 나타내는 heatmap 도면이다. 도 36은 Corneometer 측정결과만을 토대로 수분함유량 결과값을 구간별로 나누어 총 15명을 분석한 결과, 피부보습 바이오마커 후보들의 발현을 나타내는 heatmap 도면이다. 도 37은 Tewameter 측정결과만을 토대로 경피수분손실량 결과값을 구간별로 나누어 총 15명을 분석한 결과, 피부보습 바이오마커 후보들의 발현을 나타내는 heatmap 도면이다. 도 38은 Skin-pHmeter 측정결과만을 토대로 피부pH 결과값을 구간별로 총 13명을 분석한 결과, 피부보습 바이오마커 후보들의 발현을 나타내는 heatmap 도면이다.
도 33의 경우와 동일하게 도 35 내지 도 38의 heatmap 분석도 빨간색으로 나타낼수록 유전자의 발현값이 커지는 것을 의미하고, 파란색으로 나타낼수록 유전자의 발현값이 작아지는 것을 의미한다. 도 35 내지 도 38의 실험 결과로부터는 피부보습이 양호한 대조군에 비해 건조한 시험군에서 문헌조사를 통해 선별한 특정 유전자들의 발현이 파란색으로 낮게 나타남을 시각적으로 확인하였다.
상기의 RNA microarray 분석을 통해 선정된 피부보습 바이오마커 후보와 인체적용기기(Corneometer, Tewameter 및 Skin-pHmeter) 측정 결과와의 상관관계를 확인하기 위해 이변량 상관분석을 시행하였다. 그 결과가 도 39 내지 도 43에 도시된다.
도 39는 피부보습 바이오마커 후보 유전자와 인체적용기기와의 상관관계 분석수치를 표시하는 표이다. 도 40은 도 39의 분석수치를 요약한 표이다. 도 41은 Corneometer 측정값과 유의한 상관관계를 가지는 유전자들의 산점도 그래프들을 보여준다. 이로부터, FLG, FLG2, LOR, KLF4, CDH1, ITGB4, SPINK5, TGM1, CLDN7 및 CLDN4 유전자가 수분함유량(Corneometer)과 통계적으로 유의한 양의 상관관계를 나타냄을 확인하였다. 도 42는 Tewameter 측정값과 유의한 상관관계를 가지는 유전자들의 산점도 그래프들을 보여준다. 이로부터, FLG, FLG2, LOR, KLF4, KRT10, LCE1A, CDH1, ITGB4, SPINK5, CLDN1, BGN, TGM1 및 CLDN7 유전자가 경피수분손실량(Tewameter)과 통계적으로 유의한 음의 상관관계를 나타냄을 확인하였다. 도 43은 Skin-pHmeter 측정값과 유의한 상관관계를 가지는 유전자들의 산점도 그래프들을 보여준다. 이로부터, CDSN, KLF4, CDH1, CLDN1, AQP3 및 CLDN7 유전자가 피부pH(Skin-pHmeter)와 통계적으로 유의한 음의 상관관계를 나타냄을 확인하였다. 도 44와 도 45는 도 36, 도 37 및 도 38에 표시된 결과를 토대로 피부보습 바이오마커 후보 유전자와 각 인체적용기기(Corneometer, Tewameter, Skin-pHmeter)와의 상관관계를 분석한 도면이다. 그 결과, SMPD3, CDSN, KLF4, FLG, KRT10, CDH1, FLG2, ITGB4, IVL, SPINK5, CLDN1, AQP3, TGM1, CLDN7, CLDN4 및 KRT1 유전자가 수분함유량(Corneometer)과 통계적으로 유의한 양의 상관관계를 나타냈으며, SMPD3, CDSN, KLF4, LOR, FLG, KRT10, LCE1A, CDH1, FLG2, ITGB4, IVL, SPINK5, CLDN1, AQP3, BGN, TGM1, CLDN7, CERS3 및 CLDN4 유전자가 경피수분손실량(Tewameter)과 통계적으로 유의한 음의 상관관계를 나타냈으며, SMPD3, CDSN, KLF4, LOR, FLG, KRT10, LCE2B, LCE1A, CDH1, FLG2, SPINK5, CLDN1, AQP3, TGM1 및 KRT1 유전자가 피부pH(Skin-pHmeter)와 통계적으로 유의한 음의 상관관계를 나타냈다.
피부보습(수분함유/수분손실/피부pH) 바이오마커의 유효성 검증 및 바이오마커 후보 선별
상술한 방식으로 선정된 피부보습(수분함유/수분손실/피부pH) 바이오마커들이 피부보습(수분함유/수분손실/피부pH)의 정도를 평가하는 것과 더불어, 실제 피부보습(수분함유/수분손실/피부pH)과 관련 있는 유효성분 혹은 보습제를 스크리닝 하거나 일반화장품, 기능성화장품, 의료기기, 의약품 등의 사용 전과 후의 피부보습(수분함유/수분손실/피부pH) 정도를 평가하고, 더 나아가 동물실험을 대체하도록 사용될 수 있는 지를 검증하기 위해 피부보습 유효성 평가를 시행하였다.
구체적으로, 피부 보습제를 1개월 이상 사용하지 않은 피부가 건조한 시험대상자(시험군) 1명을 대상으로 2주간 제로이드 인텐시브 크림 엠디를 안면에 도포하였고, 0주차와 2주차에 각각 수분함유량, 경피수분손실량, 피부pH를 측정하였고, 측정 부위에 마이크로니들 패치를 15분간 부착 후 피부 가검물을 취득하고 RNA를 채취하여 RNA microarray를 수행하였다. 시험대상자에서 0주차에 비해 제로이드 인텐시브 크림 엠디를 2주간 도포한 후 피부건조 정도가 완화되었다. 즉, 수분함유량이 증가하였고, 경피수분손실량이 감소하였고, 피부pH 값이 감소하였다. 구체적인 측정 결과는 아래 표 8 내지 표 10 및 도 46에 정리하였다.
0주 2주
수분함유량 (A.U.) 18.8 ± 6.1 35.1 ± 0.9
0주 2주
경피수분손실량 (g/h/m2) 33.1 ± 4.5 27.4 ± 3.3
0주 2주
피부pH (pH) 5.4 ± 0.2 4.9 ± 0.2
RNA microarray 시험 진행 후 피부보습 유효성평가에 따른 유전자 발현 차이를 확인하기 위해 R 4.0.0 프로그램을 이용하여 유전자 정렬을 실시하였다. 이후, 상기에서 선정된 피부보습(수분함유/수분손실/피부pH) 바이오마커 중 동일한 경향성이 확인되는 유전자를 선정하여 도 47의 표에 분류하였다.
도 47의 표에 표시된 피부보습 바이오마커 유전자 중 fold change가 1.2배 혹은 -1.2배 이상인 유전자는 CDSN, FLG, FLG2, LOR, KRT10, LCE1A, LCE2A, LCE2B, LCE2C 및 SMPD3의 10가지 유전자로 확인되었다.
도 48은 상기의 피부보습 유효성평가 RNA microarray 분석을 통해 선별된 피부보습 유효성평가 바이오마커 후보들의 발현 정도를 시각적으로 비교분석하기 위해 그래프화한 도면이다.
최종적으로 피부보습(수분함유/수분손실/피부pH) 바이오마커는 CDSN, FLG, FLG2, LOR, KLF4, KRT10, LCE1A, LCE2A, LCE2B, LCE2C, SMPD3, CDH1, ITGB4, IVL, SPINK5, CLDN1, AQP3, BGN, HAS3, TGM1, CLDN7, CERS3, CLDN4 및 KRT1로 선정되었다. 또한, 정확하고 효과적인 피부 상태 진단의 관점에서, 본 발명자(들)는 이들 유전자 중 FLG, AQP3 및 LOR을 바이오마커 군에 포함하도록 실시하는 것이 유리하다는 것을 발견하였다.
이상의 본 발명자들의 연구 결과는 피부보습 정도 평가 방법 또는 평가 키트의 개발, 피부보습 유도 또는 억제 물질의 개발과 스크리닝, 개개인에 대한 피부 유형 정보 제공, 맞춤형 화장품 개발 및 동물 실험 대체 피부보습 유효성 평가에 있어서 매우 유용한 툴을 제공할 수 있을 것으로 기대된다.
<피부 색소침착>
피부 색소침착에 따른 시험대상자 분류, 전문의 문진, 인체적용기기 평가 및 피부 가검물 채취
세안 후 30분 동안 항온 및 항습 조건에서 대기한 후, 시험대상자를 대상으로 설문평가 및 피부과 전문의 문진을 시행하였고, 인체적용기기를 이용하여 피부색과 멜라닌을 측정하였다. 구체적으로 피부색은 Spectrophotometer 장비를, 멜라닌은 Mexameter 장비를 이용하여 측정하였고, 피부색은 ITA° 값을, 멜라닌은 melanin index 값을 분석하였다.
시험대상자의 피부색에 대한 이학적 소견은 Fitzpatrick scale에 근거하여 피부과 전문의가 육안 판정을 진행하였다.
표 11은 전체 시험대상자 시험군과 대조군을 나눈 기준을 정리하고 있다. 시험군은 전체 시험대상자 중 ITA° 값이 28 이하인 Fitzpatrick type V이고 피부 색이 어두운 사람들로 구성되었다. 대조군은 전체 시험대상자 중 ITA° 값이 41 이상인 Fitzpatrick type II이고 피부 색이 밝은 사람들로 구성되었다. 이와 같은 시험군/대조군 선정 이후 인체적용기기를 통해 피부 색소침착을 평가하였다.
시험군 대조군
표본 수 (명) 5 5
연령 (평균 ± SD) 47.80 ± 12.85 36.00 ± 9.95
이학적 소견 (유형) 4.0 ± 0.0 3.2 ± 0.4
피부색 (ITA°) 23.49 ± 4.33 46.50 ± 3.03
멜라닌(Melanin index) 203.00 ± 24.48 132.20 ± 15.31
또한, 마이크로니들 패치를 안면에 15분 동안 부착 후 피부 가검물을 채취하였다.
피부 가검물로부터 RNA 채취
시험대상자로부터 획득한 피부 가검물을 RNeasy® Plus Mini Kit (Qiagen)에 제공하였고, 상기 Kit를 이용하여 고순도의 RNA를 추출하였다. 그 다음, NanoDrop 장비와 2100 Bioanalyzer 장비를 이용하여 RNA 샘플의 QC(Quality Control)를 확인한 후 RNA microarray 분석을 시행하였다.
RNA microarray 분석
상술한 방법으로 분리한 RNA는 소량(100 pg)의 총 RNA를 cRNA로 증폭하는 방법인 GeneChip® WT Pico Kit(Applied Biosystems)를 사용하여 시료에 유연하고 감도 높은 전처리를 시행하였다. 상술한 방법에 따라 증폭된 RNA는 GeneChip® Human Gene 2.0 ST Array(Affymetrix) 플랫폼의 매뉴얼에 따라 microarray를 실행하였다. 상기 플랫폼의 매뉴얼에 소개된 microarray 절차는 도 4 및 도 5에 도시한 바 있다. 본 발명자들은 동일 절차로 microarray를 실행하였다. 상기 플랫폼의 RNA microarray 분석 프로토콜은 표 3에 정리한 바와 동일하다.
그 이후, Affymetrix® Power Tools (APT)의 Robust Multi-Average (RMA) 방법을 통해 전체 데이터를 요약 및 정규화 하였고, 유전자 수준으로 결과를 정리하고 Differentially Expressed Gene(DEG) 분석을 수행하였다. 데이터의 통계적 유의성은 독립적 t-test와 fold change의 변화를 이용하여 분석하였고, False discovery rate(FDR)는 Benjamini-Hochberg 알고리즘을 사용하여 p 값을 조정하였고, DEG 세트는 linkage와 Euclidean distance를 사용하여 Hierarchical cluster 분석을 수행하였다. 또한, 유전자 발현의 차이를 확인하기 위한 모든 데이터 분석과 시각화 작업은 R 4.0.0 프로그램을 사용하여 수행하였다.
생물정보학 분석(Bioinformatics analysis) 및 유의적 상관관계 분석을 통한 피부 색소침착 바이오마커 후보 선별
RNA microarray 시험 진행 후, 시험군과 대조군의 약 4만여가지의 유전자 발현 차이를 확인하기 위해, R 4.0.0 프로그램을 이용하여 유전자 정렬을 실시하였다. 도 49는 유전자 정렬 결과를 도시하는 도면이다. 도 49의 유전자 정렬은 heatmap 분석이라고도 불린다. Heatmap 분석은 열을 뜻하는 히트(heat)와 지도를 뜻하는 맵(map)을 결합시킨 용어로서, 색으로 표현할 수 있는 다양한 정보를 이미지 위에 열분포 형태의 도면으로 나타내는 분석 방법이다. 본 명세서에 기재한 heatmap 분석에서는 빨간색으로 나타낼수록 유전자의 발현값이 커지는 것을 의미하고, 파란색으로 나타낼수록 유전자의 발현값이 작아지는 것을 의미한다. 도 49에서는 수 백가지의 유전자를 분석했을 때, 시험군과 대조군에서 다수의 유전자의 발현값이 특이적으로 차이가 나는 것을 확인하였다.
그 이후, 본 발명자들은 문헌조사를 통해 피부 색소침착 및 melanogenesis 기전과 관련된 유전자를 선별하였다(도 50). 본 발명자들은 상기 문헌조사를 통해 피부 색소침착과 관련된 것으로 확인된 유전자들의 microarray 시험을 실시하였다. 그 결과 확인된 유전자 발현에 관한 수치를 도 50의 표에 정리하였다.
피부 색소침착 정도가 심한 시험군과 그렇지 않은 대조군에 있어서 microarray를 실시함으로써 얻어진 유전자 발현에 관한 수치값에 차별성이 존재하여야 피부 색소침착 정도에 관한 바이오마커로서 유용할 것이다. 이를 판단하기 위하여 본 발명자들은 fold change와 p-value를 사용하였다. Fold change는 시험군에서의 측정 수치가 대조군에서의 측정 수치에 비해 몇 배나 높아졌거나 낮아졌는지를 보여주는 값이고, p-value는 통계처리에 있어서 시험군과 대조군 사이의 값이 통계적으로 유의한 차이를 보이는지에 대한 값이다. RNA microarray 시험을 통해 얻은 각 샘플의 normalized signal 값(발현값)을 도 50의 표에 표시하였으며, fold change는 시험군과 대조군 간 normalized signal 값을 사용하여 1:1 발현 차를 계산한 값이다. p-value는 데이터가 귀무가설과 양립하는 정도를 0에서 1사이의 값으로 표현한 것으로 대개 0.05보다 작을 경우 귀무가설을 기각함을 의미한다.
결과적으로 피부 색소침착 관련 유전자 중 fold change가 1.2배 혹은 -1.2배 이상이거나 p-value가 0.05 이하인 유전자는 CAT, CLU, DSG1, GPNMB, GPX4, GSTM2, GSTP1, MC2R, MLANA, PAX3, SOX10, TFAP2A, TYR 및 TYRP1로 확인되었다.
도 51과 도 52는 상술한 바와 같은 RNA microarray 분석을 통해 선정된 피부 색소침착 바이오마커 후보들의 발현 정도를 시각적으로 비교분석하기 위해 heatmap 분석을 진행한 결과를 보여준다. 도 51은 ITA° 값이 28 이하인 시험군 5명과 ITA° 값이 41 이상인 대조군 5명, 총 10명에 대한 heatmap 분석 결과 도면이다. 도 52는 ITA° 28 이하 5명, ITA° 29~40 7명, ITA° 41 이상 7명, 총 19명의 시험대상자 선정 후 RNA microarray 분석 결과를 이용한 피부 색소침착 바이오마커 후보들의 발현을 보여주는 heatmap 도면이다.
도 49의 경우와 동일하게 도 51 및 도 52의 heatmap 분석도 빨간색으로 나타낼수록 유전자의 발현값이 커지는 것을 의미하고, 파란색으로 나타낼수록 유전자의 발현값이 작아지는 것을 의미한다. 도 51 및 도 52의 실험 결과로부터는 대조군에 비해 시험군에서 문헌조사를 통해 선별한 특정 유전자들의 발현이 빨간색으로 높게 나타남을 시각적으로 확인하였다.
상기의 RNA microarray 분석을 통해 선정된 피부 색소침착 관련 바이오마커 후보인 CAT, CLU, DSG1, GPNMB, GPX4, GSTM2, GSTP1, MC2R, MLANA, PAX3, SOX10, TFAP2A, TYR 및 TYRP1 유전자와 인체적용기기(Spectrophotometer 및 Mexameter) 측정 결과와의 상관관계를 확인하기위해 이변량 상관분석을 시행하였다. 그 결과가 도 53 내지 도 58에 도시된다.
도 53 내지 도 55는 ITA° 값이 28 이하인 시험군 5명과 ITA° 값이 41 이상인 대조군 5명의 총 10명의 시험대상자 선정 후 RNA microarray 분석을 통해 선정된 피부 색소침착 바이오마커 후보와 인체적용기기 측정 결과와의 상관관계를 분석한 결과를 도시한다. 도 56 내지 도 58은 ITA° 28 이하 5명, ITA° 29~40 7명, ITA° 41 이상 7명, 총 19명의 시험대상자 선정 후 RNA microarray 분석을 통해 선정된 피부 색소침착 바이오마커 후보와 인체적용기기 측정 결과와의 상관관계를 분석한 결과를 도시한다.
그 결과, ITA° 값이 28 이하인 시험군 5명과 ITA° 값이 41 이상인 대조군 5명, 총 10명 시험대상자의 RNA microarray 분석결과의 CAT, CLU, DSG1, GPNMB, GPX4, GSTM2, GSTP1, MLANA, SOX10, TFAP2A 및 TYR 유전자는 피부 색을 측정한 Spectrophotometer 장비의 측정결과와 통계적으로 유의한 양의 혹은 음의 상관관계를 나타내며, CAT, CLU, DSG1, GPNMB, GPX4, GSTM2, GSTP1, MLANA, PAX3 및 SOX10 유전자는 눈가 멜라닌을 측정한 Mexameter 장비와 통계적으로 유의한 음의 혹은 양의 상관관계를 나타냄을 확인하였다.
또한, ITA° 28 이하 5명, ITA° 29~40 7명, ITA° 41 이상 7명, 총 19명 시험대상자의 RNA microarray 분석결과의 CAT, CLU, DSG1, GPNMB, GPX4, GSTM2, GSTP1, MLANA, PAX3, SOX10 및 TYR 유전자는 피부 색을 측정한 Spectrophotometer 장비의 측정결과와 통계적으로 유의한 양의 혹은 음의 상관관계를 나타내며, CAT, CLU, DSG1, GPNMB, GPX4, GSTM2, GSTP1, MLANA, PAX3, SOX10 및 TYRP1 유전자는 눈가 멜라닌을 측정한 Mexameter 장비와 통계적으로 유의한 음의 혹은 양의 상관관계를 나타냄을 확인하였다.
따라서, 시험대상자의 RNA microarray 분석결과와 인체적용기기 측정결과를 종합적으로 분석하였을 때, 피부 색소침착 바이오마커는 CAT, CLU, DSG1, GPNMB, GPX4, GSTM2, GSTP1, MLANA, PAX3, SOX10, TFAP2A, TYR 및 TYRP1, 총 13가지의 유전자로 선정하였다.
피부미백 유효성 평가를 통한 피부 색소침착 바이오마커 선정
상술한 방식으로 선정된 피부 색소침착 바이오마커가 피부색소의 정도를 측정하고 진단하는 것과 더불어, 실제 피부 색소침착 또는 미백과 관련 있는 유효성분 혹은 미백제를 스크리닝 하거나 일반화장품, 기능성화장품, 의료기기, 의약품 등의 사용 전과 후의 피부 색소침착 혹은 미백을 평가하고, 더 나아가 동물대체실험으로 사용되어질 수 있는지 검증하기 위해 피부미백 유효성평가를 시행하였다.
구체적으로, 눈가에 기미가 있는 시험대상자 2명을 대상으로 2주간 트리루스트라크림(한국콜마)을 눈가에 도포하였고, 0주차와 2주차에 Spectrophotometer 장비를 이용하여 피부 색을 측정하고(표 12, 도 59), Mexameter 장비를 이용하여 눈가 멜라닌을 측정하였으며(표 13, 도 60), 눈가에 마이크로니들 패치를 15분간 부착 후 피부 가검물을 취득하고, RNA를 채취하여 RNA microarray를 수행하였다.
피부색 (ITA°) 0주 2주
시험대상자 1 40.34 ± 1.24 40.24 ± 1.26
시험대상자 2 28.77 ± 1.47 30.83 ± 1.02
멜라닌
(Melanin index)		 0주 2주
시험대상자 1 152.8 ± 15.9 152.7 ± 8.1
시험대상자 2 176.9 ± 25.4 163.5 ± 24.1
RNA microarray 시험 진행 후 피부미백 유효성평가에 따른 유전자 발현 차이를 확인하기 위해 R 4.0.0 프로그램을 이용하여 유전자 정렬을 실시하였다. 이후, 문헌조사를 통해 선별한 피부 색소침착 또는 melanogenesis 관련 유전자와 위에 기술한 방식으로 선정된 피부 색소침착 관련 바이오마커(CAT, CLU, DSG1, GPNMB, GPX4, GSTM2, GSTP1, MLANA, PAX3, SOX10, TFAP2A, TYR 및 TYRP1) 중 동일한 경향성이 확인되는 유전자를 선정하여 분류하였다. 도 61은 그 분류 결과에 대한 표이며, 피부미백 유효성 바이오마커 후보를 나열하고 있다.
문헌조사를 통해 선별한 피부 색소침착 또는 melanogenesis 관련 유전자와 상기의 피부 색소침착 유전자 중 fold change가 1.2배 혹은 -1.2배 이상이거나 p-value가 0.05 이하인 유전자는 MC1R, F2RL1, CLDN1, DSG1 및 GSTP1으로 확인되었다.
도 62는 상기의 피부미백 유효성평가 RNA microarray 분석을 통해 선별된 피부미백 유효성평가 바이오마커 후보들의 발현 정도를 시각적으로 비교분석하기 위해 heatmap 분석을 진행한 결과를 도시한다.
본 발명자들은 상술한 바와 같은 피부미백 유효성평가 RNA microarray 분석을 통해 선별된 피부미백 유효성평가 바이오마커 후보와 인체적용기기(Spectrophotometer 및 Mexameter) 측정결과와의 상관관계를 확인하기위해 이변량 상관분석을 시행하였다. 도 63과 도 64는 피부미백 유효성평가를 진행한 시험대상자의 RNA microarray 분석을 통해 선정된 피부미백 유효성 바이오마커 후보와 인체적용기기 측정결과와의 상관관계를 분석한 결과를 도시한다. 도 63과 도 64의 실험 결과를 참조하면, 0주차에 비해 트리루스트라 크림(트레티노인, 하이드로퀴논, 스테로이드복합제)을 2주간 도포한 후, TFAP2A 및 TYRP1 유전자는 피부 색을 측정한 Spectrophotometer 측정결과와 통계적으로 유의한 음의 상관관계가 있음을 알 수 있다. 또한, TFAP2A 유전자는 눈가 멜라닌을 측정하는 Mexameter 측정결과와 양의 상관관계가 있음을 알 수 있다.
상술한 바와 같은 본 발명자들이 수행한 피부 색소침착 및 피부미백 유효성평가 실험 결과를 종합적으로 분석하였을 때, 피부 색소침착 바이오마커를 가장 넓은 범위로 잡는 경우, CAT, CLU, DSG1, GPNMB, GPX4, GSTM2, GSTP1, MLANA, PAX3, SOX10, TFAP2A, TYR, TYRP1, MC1R, F2RL1 및 CLDN1, 총 16가지의 유전자를 선정할 수 있다. 또한, 정확하고 효과적인 피부 상태 진단의 관점에서, 본 발명자(들)는 이들 유전자 중 MLANA, TYRP1 및 GPNMB를 바이오마커 군에 포함하도록 실시하는 것이 유리하다는 것을 발견하였다.
이러한 선정 결과를 활용하면, 상기 16가지 RNA 유전자 중 어느 것 하나 또는 둘 이상의 유전자를 바이오마커로 삼아 피부 색소침착 또는 피부미백 정도의 평가를 정량적으로 수행할 수 있을 것이다. 나아가, 이상의 본 발명자들의 연구 결과는 피부 색소침착 정도 평가 방법 또는 평가 키트의 개발, 피부 색소침착 유도 또는 억제 물질의 개발과 스크리닝, 개개인에 대한 피부 유형 정보 제공, 맞춤형 화장품 개발 및 동물 실험 대체 피부 색소침착 유효성 평가에 있어서 매우 유용한 툴을 제공할 수 있을 것으로 기대된다.
<피부유분>
피부유분에 따른 시험대상자 분류, 전문의 문진, 인체적용기기 평가 및 피부 가검물 채취
세안 후 30분 동안 항온 및 항습 조건에서 대기한 후, 시험대상자를 대상으로 설문평가 및 피부과 전문의 문진을 시행하였고, 양 콧망울 부위의 피부유분을 측정하였다. 구체적으로 Sebumeter® SM815 장비를 이용하여 측정하였고, μg/cm2 값을 분석하였다.
시험대상자의 피부유분에 대한 이학적 소견은 관련 문헌(Reprod Biol Endocrinol. 2017 Homburg et al)에 근거하여, 피부과 전문의의 육안 판정에 의해 제공되었다.
표 14는 전체 시험대상자 중 피부유분이 적은 대조군 5명, 피부유분이 많은 시험군 5명을 분류하여 피부유분을 평가한 결과를 정리한 것이다.
시험군 (Oily) 대조군 (Non-oily)
표본 수 (명) 5 5
연령 (평균 ± SD) 38.40 ± 12.93 37.60 ± 18.15
이학적 소견 (점수) 1.80 ± 0.84 1.40 ± 0.55
피부유분량 (μg/cm2) 223.70 ± 65.96 53.90 ± 33.52
또한, 마이크로니들 패치를 안면에 15분 동안 부착 후 피부 가검물을 채취하였다.
피부 가검물로부터 RNA 채취
시험대상자로부터 획득한 피부 가검물을 RNeasy® Plus Mini Kit (Qiagen)에 제공하였고, 상기 Kit를 이용하여 고순도의 RNA를 추출하였다. 그 다음, NanoDrop 장비와 2100 Bioanalyzer 장비를 이용하여 RNA 샘플의 QC(Quality Control)를 확인한 후 RNA microarray 분석을 시행하였다.
RNA microarray 분석
상술한 방법으로 분리한 RNA는 소량(100 pg)의 총 RNA를 cRNA로 증폭하는 방법인 GeneChip® WT Pico Kit(Applied Biosystems)를 사용하여 시료에 유연하고 감도 높은 전처리를 시행하였다. 상술한 방법으로 증폭된 RNA는 GeneChip® Human Gene 2.0 ST Array(Affymetrix) 플랫폼의 매뉴얼에 따라 microarray를 실행하였다. 상기 플랫폼의 매뉴얼에 소개된 microarray 절차는 도 4와 도 5에 도시한 바 있다. 본 발명자들은 동일 절차로 microarray를 실행하였다. 상기 플랫폼의 RNA microarray 분석 프로토콜은 표 3에 정리한 바와 동일하다.
그 이후, Affymetrix® Power Tools (APT)의 Robust Multi-Average (RMA) 방법을 통해 전체 데이터를 요약 및 정규화 하였고, 유전자 수준으로 결과를 정리하고 Differentially Expressed Gene(DEG) 분석을 수행하였다. 데이터의 통계적 유의성은 독립적 t-test와 fold change의 변화를 이용하여 분석하였고, False discovery rate(FDR)는 Benjamini-Hochberg 알고리즘을 사용하여 p 값을 조정하였고, DEG 세트는 linkage와 Euclidean distance를 사용하여 Hierarchical cluster 분석을 수행하였다. 또한, 유전자 발현의 차이를 확인하기 위한 모든 데이터 분석과 시각화 작업은 R 4.0.0 프로그램을 사용하여 수행하였다.
생물정보학 분석(Bioinformatics analysis) 및 유의적 상관관계 분석을 통한 피부유분 바이오마커 후보 선별
RNA microarray 시험 진행 후, 시험군과 대조군의 약 4만여가지의 유전자 발현 차이를 확인하기 위해, R 4.0.0 프로그램을 이용하여 유전자 정렬을 실시하였다. 도 65는 유전자 정렬 결과를 도시하는 도면이다. 도 65의 유전자 정렬은 heatmap 분석이라고도 불린다. Heatmap 분석은 열을 뜻하는 히트 (heat)와 지도를 뜻하는 맵(map)을 결합시킨 용어로서, 색으로 표현할 수 있는 다양한 정보를 이미지 위에 열분포 형태의 도면으로 나타내는 분석 방법이다. 본 명세서에 기재한 heatmap 분석에서는 빨간색으로 나타낼수록 유전자의 발현값이 커지는 것을 의미하고, 파란색으로 나타낼수록 유전자의 발현값이 작아지는 것을 의미한다. 도 65에서는 수 백가지의 유전자를 분석했을 때, 시험군과 대조군에서 다수의 유전자의 발현값이 특이적으로 차이가 나는 것을 확인하였다.
그 이후, 본 발명자들은 문헌조사를 통해 피부유분과 관련된 유전자를 선별하였다(도 66). 본 발명자들은 상기 문헌조사를 통해 피부유분과 관련된 것으로 확인된 유전자들의 microarray 시험을 실시하였다. 그 결과 확인된 유전자 발현에 관한 수치를 도 66의 표에 정리하였다.
피부유분 정도가 높은 시험군과 그렇지 않은 대조군에 있어서 microarray를 실시함으로써 얻어진 유전자 발현에 관한 수치값에 차별성이 존재하여야 피부유분에 관한 바이오마커로서 유용할 것이다. 이를 판단하기 위하여 본 발명자들은 fold change와 p-value를 사용하였다. Fold change는 시험군에서의 측정 수치가 대조군에서의 측정 수치에 비해 몇 배나 높아졌거나 낮아졌는지를 보여주는 값이고, p-value는 통계처리에 있어서 시험군과 대조군 사이의 값이 통계적으로 유의한 차이를 보이는지에 대한 값이다. RNA microarray 시험을 통해 얻은 각 샘플의 normalized signal 값(발현값)을 도 66의 표에 표시하였으며, fold change는 시험군과 대조군 간 normalized signal 값을 사용하여 1:1 발현 차를 계산한 값이다. p-value는 데이터가 귀무가설과 양립하는 정도를 0에서 1사이의 값으로 표현한 것으로 대개 0.05보다 작을 경우 귀무가설을 기각함을 의미한다.
결과적으로 피부유분 관련 유전자 중 fold change가 1.2배 혹은 -1.2배 이상이거나 p-value가 0.05 이하인 유전자는 MFAP2, IGF1, HSD11B1, GPAM, CPT1C, AR, MPZL3, AQP3, SREBF2 및 HSD17B2로 확인되었다.
도 67은 상술한 바와 같은 RNA microarray 분석을 통해 선정된 피부유분 바이오마커 후보들의 발현 정도를 시각적으로 비교분석하기 위해 heatmap 분석을 진행한 결과를 보여준다. 도 65의 경우와 동일하게 도 67의 heatmap 분석 결과에서도 빨간색으로 나타낼수록 유전자의 발현값이 커지는 것을 의미하고, 파란색으로 나타낼수록 유전자의 발현값이 작아지는 것을 의미한다. 도 67의 결과로부터는 대조군에 비해 시험군에서 문헌조사를 통해 선별한 특정 유전자들의 발현이 빨간색으로 높게 나타나거나 파란색으로 낮게 나타남을 시각적으로 확인하였다.
상기의 RNA microarray 분석을 통해 선정된 피부유분 관련 바이오마커 후보인 MFAP2, IGF1, HSD11B1, GPAM, CPT1C, AR, MPZL3, AQP3, SREBF2 및 HSD17B2 유전자와 인체적용기기(Sebumeter) 측정 결과와의 상관관계를 확인하기위해 이변량 상관분석을 시행하였다. 그 결과가 도 68 및 도 69에 도시된다.
본 발명자들은 도 68 및 도 69와 관련된 이변량 상관분석 실험 결과, MFAP2, GPAM 및 IGF1 유전자가 피부유분량(Sebumeter에 의한 측정치)과 통계적으로 유의한 양의 상관관계를 나타내며, MPZL3 및 AQP3 유전자가 피부유분량((Sebumeter에 의한 측정치)과 통계적으로 유의한 음의 상관관계를 나타냄을 확인하였다.
상술한 바와 같은 본 발명자들이 수행한 피부유분 평가 실험 결과를 종합적으로 분석하였을 때, 피부유분 바이오마커를 가장 넓은 범위로 잡는 경우, MFAP2, AQP3, SREBF2, HSD17B2, GPAM, CPT1C, AR, IGF1, HSD11B1 및 MPZL3, 총 10가지의 유전자를 선정할 수 있다. 또한, 정확하고 효과적인 피부 상태 진단의 관점에서, 본 발명자(들)는 이들 유전자 중 MPZL3, GPAM 및 IGF1을 바이오마커 군에 포함하도록 실시하는 것이 유리하다는 것을 발견하였다.
이러한 선정 결과를 활용하면, 상기 10가지 RNA 유전자 중 어느 것 하나 또는 둘 이상의 유전자를 바이오마커로 삼아 피부유분 정도의 평가를 정량적으로 수행할 수 있을 것이다. 나아가, 이상의 본 발명자들의 연구 결과는 피부유분 평가 방법 또는 평가 키트의 개발, 피부유분 유도 또는 억제 물질의 개발과 스크리닝, 개개인에 대한 피부 유형 정보 제공, 맞춤형 화장품 개발 및 동물 실험 대체 피부유분 유효성 평가에 있어서 매우 유용한 툴을 제공할 수 있을 것으로 기대된다.
<홍조성 민감피부>
홍조성 민감피부에 따른 시험대상자 분류, 전문의 문진, 인체적용기기 평가, lactic acid sting test 및 피부 가검물 채취
세안 후 30분 동안 항온 및 항습 조건에서 대기한 후, 시험대상자를 대상으로 설문평가 및 피부과 전문의 문진을 시행하였고, 양 볼 부위를 인체적용기기로 측정하였으며, lactic acid sting test를 통해 주관적 자극 민감을 평가하였다.
구체적으로 Mexameter® MX18 장비를 이용하여 홍반량을 측정하였고, EI(Erythema index) 값을 분석하였다. 또한, Spectrophotometer (CM-700d) 장비를 이용하여 피부 적색도를 측정하였고, a* value 값을 분석하였다. 또한, Frosch & Kligman method (1977)에 따른 "5% lactic acid sting test"를 통해 주관적 자극 민감을 평가하였다. Lactic acid (5%)와 DW를 각각 50 ㎕씩 양쪽 비구순 부위(nasolabial fold)에 분주하고 0분, 2.5분, 5분, 8분마다 따가움, 화끈거림, 가려움을 그 강도에 따라 4 point scale(0; no sting, 1; slight sting, 2; moderate sting, 3; severe sting)로 시험대상자가 직접 평가하도록 하였다. 자극감의 강도를 수치화한 값이 높을수록 민감한 것을 의미하며, 본 시험에서는 Lactic acid (5%)와 DW의 차이값을 취하여 분석하였으며, 계산식은 다음과 같다.
Score = (총 Lactic acid 값-총 DW 값) / 12 (4구간*3항목)
표 15에는 전체 시험대상자 중 홍반량과 적색도가 낮으며 주관적 자극 민감이 없는 대조군 5명, 홍반량과 적색도가 높으며 주관적 자극민감이 없는 시험군 5명을 분류한 결과가 정리된다.
시험군 (Rosacea) 대조군 (Control)
표본 수 (명) 5 5
연령 (평균 ± SD) 33.80 ± 6.94 39.00 ± 11.20
주관적 자극민감점수 (Score) 0.20 ± 0.14 0.20 ± 0.25
홍반량 (EI) 402.14 ± 50.13 250.48 ± 21.10
적색도 (a* value) 12.99 ± 0.66 9.84 ± 0.59
또한, 마이크로 구조체 패치를 안면에 15분 동안 부착 후 피부 가검물을 채취하였다.
피부 가검물로부터 RNA 채취
시험대상자로부터 획득한 피부 가검물을 RNeasy® Plus Mini Kit (Qiagen)에 제공하였고, 상기 Kit를 이용하여 고순도의 RNA를 추출하였다. 그 다음, NanoDrop 장비와 2100 Bioanalyzer 장비를 이용하여 RNA 샘플의 QC(Quality Control)를 확인한 후 RNA microarray 분석을 시행하였다.
RNA microarray 분석
상술한 방법으로 분리한 RNA는 소량(100 pg)의 총 RNA를 cRNA로 증폭하는 방법인 GeneChip® WT Pico Kit(Applied Biosystems)를 사용하여 시료에 유연하고 감도 높은 전처리를 시행하였다. 상술한 방법으로 증폭된 RNA는 GeneChip® Human Gene 2.0 ST Array(Affymetrix) 플랫폼의 매뉴얼에 따라 microarray를 실행하였다. 상기 플랫폼의 매뉴얼에 소개된 microarray 절차는 도 4 및 도 5에 도시한 바 있다. 본 발명자들은 동일 절차로 microarray를 실행하였다. 상기 플랫폼의 RNA microarray 분석 프로토콜은 표 3에 정리한 바와 동일하다.
그 이후, Affymetrix® Power Tools (APT)의 Robust Multi-Average (RMA) 방법을 통해 전체 데이터를 요약 및 정규화 하였고, 유전자 수준으로 결과를 정리하고 Differentially Expressed Gene(DEG) 분석을 수행하였다. 데이터의 통계적 유의성은 독립적 t-test와 fold change의 변화를 이용하여 분석하였고, False discovery rate(FDR)는 Benjamini-Hochberg 알고리즘을 사용하여 p 값을 조정하였고, DEG 세트는 linkage와 Euclidean distance를 사용하여 Hierarchical cluster 분석을 수행하였다. 또한, 유전자 발현의 차이를 확인하기 위한 모든 데이터 분석과 시각화 작업은 R 4.0.0 프로그램을 사용하여 수행하였다.
생물정보학 분석(Bioinformatics analysis) 및 유의적 상관관계 분석을 통한 홍조성 민감피부 바이오마커 후보 선별
RNA microarray 시험 진행 후, 시험군과 대조군의 약 4만여가지의 유전자 발현 차이를 확인하기 위해, R 4.0.0 프로그램을 이용하여 유전자 정렬을 실시하였다. 도 70은 유전자 정렬 결과를 도시하는 도면이다. 도 70의 유전자 정렬은 heatmap 분석이라고도 불린다. Heatmap 분석은 열을 뜻하는 히트(heat)와 지도를 뜻하는 맵(map)을 결합시킨 용어로서, 색으로 표현할 수 있는 다양한 정보를 이미지 위에 열분포 형태의 도면으로 나타내는 분석 방법이다. 본 명세서에 기재한 heatmap 분석에서는 빨간색으로 나타낼수록 유전자의 발현값이 커지는 것을 의미하고, 파란색으로 나타낼수록 유전자의 발현값이 작아지는 것을 의미한다. 도 70에서는 수 백가지의 유전자를 분석했을 때, 시험군과 대조군에서 다수의 유전자의 발현값이 특이적으로 차이가 나는 것을 확인하였다.
그 이후, 본 발명자들은 문헌조사를 통해 홍조성 민감피부와 관련된 유전자를 선별하였다(도 71). 본 발명자들은 상기 문헌조사를 통해 홍조성 민감피부와 관련된 것으로 확인된 유전자들의 microarray 시험을 실시하였다. 그 결과 확인된 유전자 발현에 관한 수치를 도 71의 표에 정리하였다.
홍조성 민감도가 높은 시험군과 그렇지 않은 대조군에 있어서 microarray를 실시함으로써 얻어진 유전자 발현에 관한 수치값에 차별성이 존재하여야 홍조성 민감피부에 관한 바이오마커로서 유용할 것이다. 이를 판단하기 위하여 본 발명자들은 fold change와 p-value를 사용하였다. Fold change는 시험군에서의 측정 수치가 대조군에서의 측정 수치에 비해 몇 배나 높아졌거나 낮아졌는지를 보여주는 값이고, p-value는 통계처리에 있어서 시험군과 대조군 사이의 값이 통계적으로 유의한 차이를 보이는지에 대한 값이다. RNA microarray 시험을 통해 얻은 각 샘플의 normalized signal 값(발현값)을 도 71의 표에 표시하였으며, fold change는 시험군과 대조군 간 normalized signal 값을 사용하여 1:1 발현 차를 계산한 값이다. p-value는 데이터가 귀무가설과 양립하는 정도를 0에서 1사이의 값으로 표현한 것으로 대개 0.05보다 작을 경우 귀무가설을 기각함을 의미한다.
결과적으로 홍조성 민감피부 관련 유전자 중 fold change가 1.2배 혹은 -1.2배 이상이거나 p-value가 0.05 이하인 유전자는 COL3A1, TAC1, KLK5, CAMP, MMP9, TRPA1, IL13RA1, HSD3B1, CXCR4, ANGPT2, CXCL2, CXCR5 및 PSMB9로 확인되었다.
도 72는 상술한 바와 같은 RNA microarray 분석을 통해 선정된 홍조성 민감피부 바이오마커 후보들의 발현 정도를 시각적으로 비교분석하기 위해 heatmap 분석을 진행한 결과를 보여준다. 도 70의 경우와 동일하게 도 72의 heatmap 분석 결과에서도 빨간색으로 나타낼수록 유전자의 발현값이 커지는 것을 의미하고, 파란색으로 나타낼수록 유전자의 발현값이 작아지는 것을 의미한다.
상기의 RNA microarray 분석을 통해 선정된 홍조성 민감피부 관련 바이오마커 후보인 COL3A1, TAC1, KLK5, CAMP, MMP9, TRPA1, IL13RA1, HSD3B1, CXCR4, ANGPT2, CXCL2, CXCR5 및 PSMB9 유전자와 인체적용기기(Mexameter, Spectrophotometer) 측정 결과와의 상관관계를 확인하기위해 이변량 상관분석을 시행하였다. 그 결과가 도 73 내지 도 75에 도시된다.
도 73은 홍조성 민감피부 바이오마커 후보 유전자와 인체적용기기와의 상관관계 수치를 정리한 표이다.
도 74는 Mexameter 측정값과 유의한 상관관계를 가지는 유전자들의 산점도를 도시한다. 도 74의 결과로부터 알 수 있듯이, TAC1, CAMP 및 MMP9 유전자가 피부 홍반량(Mexameter)과 통계적으로 유의한 양의 상관관계를 나타냄을 확인하였다.
도 75는 Spectrophotometer 측정값과 유의한 상관관계를 가지는 유전자들의 산점도를 도시한다. 도 75의 결과로부터 알 수 있듯이, TAC1, MMP9 및 ANGPT2 유전자가 피부 적색도(Spectrophotometer, a* value)와 통계적으로 유의한 양의 상관관계를 나타냄을 확인하였다.
상술한 바와 같은 본 발명자들이 수행한 홍조성 민감피부 평가 실험 결과를 종합적으로 분석하였을 때, 홍조성 민감피부 바이오마커를 가장 넓은 범위로 잡는 경우, COL3A1, TAC1, KLK5, CAMP, MMP9, TRPA1, IL13RA1, HSD3B1, CXCR4, ANGPT2, CXCL2, CXCR5 및 PSMB9, 총 13가지의 유전자를 선정할 수 있다. 또한, 정확하고 효과적인 피부 상태 진단의 관점에서, 본 발명자(들)는 이들 유전자 중 MMP9, TAC1 및 CAMP를 바이오마커 군에 포함하도록 실시하는 것이 유리하다는 것을 발견하였다.
이러한 선정 결과를 활용하면, 상기 13가지 RNA 유전자 중 어느 것 하나 또는 둘 이상의 유전자를 바이오마커로 삼아 홍조성 민감피부의 평가를 정량적으로 수행할 수 있을 것이다. 나아가, 이상의 본 발명자들의 연구 결과는 홍조성 민감피부 평가 방법 또는 평가 키트의 개발, 홍조성 민감피부 유도 또는 억제 물질의 개발과 스크리닝, 개개인에 대한 피부 유형 정보 제공, 맞춤형 화장품 개발 및 동물 실험 대체 홍조성 민감피부 유효성 평가에 있어서 매우 유용한 툴을 제공할 수 있을 것으로 기대된다.
<자극성 민감피부>
주관적 자극성 민감피부에 따른 시험대상자 분류, 전문의 문진, lactic acid sting test 및 피부 가검물 채취
세안 후 30분 동안 항온 및 항습 조건에서 대기한 후, 시험대상자를 대상으로 설문평가 및 피부과 전문의 문진을 시행하였고, lactic acid를 이용한 주관적 자극성 민감피부의 정도 평가를 시행하였다.
구체적으로, 민감도는 Frosch & Kligman method(1977)에 따른 "5% lactic acid sting test(젖산 자상 검사)"를 통해 평가하였다. 도 76은 젖산 자상 검사를 도식한 도면이다. Lactic acid(5%)와 DW를 각각 50 ㎕씩 양쪽 비구순 부위(nasolabial fold)에 분주하고 0분, 2.5분, 5분, 8분마다 따가움, 화끈거림, 가려움을 그 강도에 따라 4 point scale(0; no sting, 1; slight sting, 2; moderate sting, 3; severe sting)로 시험대상자가 직접 평가하도록 하였다. 자극감의 강도를 수치화한 값이 높을수록 민감한 것을 의미하며, 본 시험에서는 lactic acid(5%)와 DW의 차이값을 취하여 분석하였으며, 계산식은 다음과 같다.
Score = (총 Lactic acid 값-총 DW 값) / 12 (4구간*3항목)
표 16에는 전체 시험대상자 중 lactic acid sting test 점수가 0.5 이상인 주관적 자극성 민감피부가 있는 시험대상자(시험군)와 점수가 0점인 주관적 자극성 민감피부가 없는 시험대상자(대조군)을 선정한 결과를 정리하였다.
표 16
시험군 대조군
표본 수 (명) 5 5
연령 (평균 ± SD) 35.60 ± 13.03 25.80 ± 2.59
Lactic acid sting test (Score) 0.65 ± 0.07 0.00 ± 0.00
또한, 마이크로니들 패치를 안면에 15분 동안 부착 후 피부 가검물을 채취하였다.
피부 가검물로부터 RNA 채취
시험대상자로부터 획득한 피부 가검물을 RNeasy® Plus Mini Kit (Qiagen)에 제공하였고, 상기 Kit를 이용하여 고순도의 RNA를 추출하였다. 그 다음, NanoDrop 장비와 2100 Bioanalyzer 장비를 이용하여 RNA 샘플의 QC(Quality Control)를 확인한 후 RNA microarray 분석을 시행하였다.
RNA microarray 분석
상술한 방법으로 분리한 RNA는 소량(100 pg)의 총 RNA를 cRNA로 증폭하는 방법인 GeneChip® WT Pico Kit(Applied Biosystems)를 사용하여 시료에 유연하고 감도 높은 전처리를 시행하였다. 상술한 방법으로 증폭된 RNA는 GeneChip® Human Gene 2.0 ST Array(Affymetrix) 플랫폼의 매뉴얼에 따라 microarray를 실행하였다. 상기 플랫폼의 매뉴얼에 소개된 microarray 절차는 도 4 및 도 5에 도시한 바 있다. 본 발명자들은 동일 절차로 microarray를 실행하였다. 상기 플랫폼의 RNA microarray 분석 프로토콜은 표 3에 정리한 바와 동일하다.
그 이후, Affymetrix® Power Tools (APT)의 Robust Multi-Average (RMA) 방법을 통해 전체 데이터를 요약 및 정규화 하였고, 유전자 수준으로 결과를 정리하고 Differentially Expressed Gene(DEG) 분석을 수행하였다. 데이터의 통계적 유의성은 독립적 t-test와 fold change의 변화를 이용하여 분석하였고, False discovery rate(FDR)는 Benjamini-Hochberg 알고리즘을 사용하여 p 값을 조정하였고, DEG 세트는 linkage와 Euclidean distance를 사용하여 Hierarchical cluster 분석을 수행하였다. 또한, 유전자 발현의 차이를 확인하기 위한 모든 데이터 분석과 시각화 작업은 R 4.0.0 프로그램을 사용하여 수행하였다.
생물정보학 분석(Bioinformatics analysis) 및 유의적 상관관계 분석을 통한 주관적 자극성 민감피부 바이오마커 후보 선별
RNA microarray 시험 진행 후, 시험군과 대조군의 약 4만여가지의 유전자 발현 차이를 확인하기 위해, R 4.0.0 프로그램을 이용하여 유전자 정렬을 실시하였다. 도 77은 유전자 정렬 결과를 도시하는 도면이다. 도 77의 유전자 정렬은 heatmap 분석이라고도 불린다. Heatmap 분석은 열을 뜻하는 히트(heat)와 지도를 뜻하는 맵(map)을 결합시킨 용어로서, 색으로 표현할 수 있는 다양한 정보를 이미지 위에 열분포 형태의 도면으로 나타내는 분석 방법이다. 본 명세서에 기재한 heatmap 분석에서는 빨간색으로 나타낼수록 유전자의 발현값이 커지는 것을 의미하고, 파란색으로 나타낼수록 유전자의 발현값이 작아지는 것을 의미한다. 도 77에서는 수 백가지의 유전자를 분석했을 때, 시험군과 대조군에서 다수의 유전자의 발현값이 특이적으로 차이가 나는 것을 확인하였다.
그 이후, 본 발명자들은 문헌조사를 통해 주관적 자극성 민감피부와 관련된 유전자를 선별하였다(도 78). 본 발명자들은 상기 문헌조사를 통해 주관적 자극성 민감피부와 관련된 것으로 확인된 유전자들의 microarray 시험을 실시하였다. 그 결과 확인된 유전자 발현에 관한 수치를 도 78의 표에 정리하였다.
주관적 자극성 민감피부 정도가 높은 시험군과 그렇지 않은 대조군에 있어서 microarray를 실시함으로써 얻어진 유전자 발현에 관한 수치값에 차별성이 존재하여야 주관적 자극성 민감피부에 관한 바이오마커로서 유용할 것이다. 이를 판단하기 위하여 본 발명자들은 fold change와 p-value를 사용하였다. Fold change는 시험군에서의 측정 수치가 대조군에서의 측정 수치에 비해 몇 배나 높아졌거나 낮아졌는지를 보여주는 값이고, p-value는 통계처리에 있어서 시험군과 대조군 사이의 값이 통계적으로 유의한 차이를 보이는지에 대한 값이다. RNA microarray 시험을 통해 얻은 각 샘플의 normalized signal 값(발현값)을 도 8의 표에 표시하였으며, fold change는 시험군과 대조군 간 normalized signal 값을 사용하여 1:1 발현 차를 계산한 값이다. p-value는 데이터가 귀무가설과 양립하는 정도를 0에서 1사이의 값으로 표현한 것으로 대개 0.05보다 작을 경우 귀무가설을 기각함을 의미한다.
결과적으로 주관적 자극성 민감피부 관련 유전자 중 fold change가 1.2배 혹은 -1.2배 이상이거나 p-value가 0.05 이하인 유전자는 IVL, LOR, FLG, FLG2, PGF, CYR61, HLA-B, IGHA1, MMP3, RBP4 및 G0S2로 확인되었다.
도 79와 도 80은 상술한 바와 같은 RNA microarray 분석을 통해 선정된 주관적 자극성 민감피부 바이오마커 후보들의 발현 정도를 시각적으로 비교분석하기 위해 heatmap 분석을 진행한 도면이다. 도 79는 lactic acid sting test 점수가 0.5점 이상인 시험군 5명과 0점인 대조군 5명, 총 10명의 시험대상자를 선정한 후 RNA microarray 분석 결과를 이용한 주관적 자극성 민감피부 바이오마커 후보들의 발현을 나타내는 heatmap 도면이다. 도 80은 전체 시험대상자 33명을 lactic acid sting test 점수 별로 분류한 후 각 점수 별 RNA microarray 평균값을 이용한 주관적 자극성 민감피부 바이오마커 후보들의 발현을 나타내는 heatmap 도면이다. 도 77의 경우와 동일하게 도 79 및 도 80의 heatmap 분석 결과에서도 빨간색으로 나타낼수록 유전자의 발현값이 커지는 것을 의미하고, 파란색으로 나타낼수록 유전자의 발현값이 작아지는 것을 의미한다.
상기의 RNA microarray 분석을 통해 선정된 주관적 자극성 민감피부 관련 바이오마커 후보인 IVL, LOR, FLG, FLG2, PGF, CYR61, HLA-B, IGHA1, MMP3, RBP4 및 G0S2 유전자와 각각의 lactic acid sting test 점수와의 상관관계를 확인하기 위해 이변량 상관분석을 시행하였다. 그 결과가 도 81 내지 도 84에 도시된다.
그 결과, lactic acid sting test 점수가 0.5점 이상인 주관적 자극이 있는 시험군 5명과 점수가 0점인 주관적 자극이 없는 대조군 5명, 총 10명 시험대상자의 RNA microarray 분석결과의 CYR61, RBP4 및 PGF 유전자는 lactic acid sting test score와 통계적으로 유의한 양의 혹은 음의 상관관계를 나타내며, 전체 33명 시험대상자의 RNA microarray 분석결과의 LOR, PTGS2, PGF 및 HLA-B 유전자는 lactic acid sting test score와 통계적으로 유의한 음의 혹은 양의 상관관계를 나타냄을 확인하였다. 따라서, 시험대상자의 RNA microarray 분석결과와 lactic acid sting test를 종합적으로 분석하였을 때, 본 발명자들은 주관적 자극성 민감피부 바이오마커로서 IVL, LOR, FLG, FLG2, PGF, CYR61, HLA-B, IGHA1, MMP3, RBP4 및 G0S2, 총 11가지의 유전자를 선정하였다. 또한, 정확하고 효과적인 피부 상태 진단의 관점에서, 본 발명자(들)는 이들 유전자 중 PGF, RBP4 및 CYR61을 바이오마커 군에 포함하도록 실시하는 것이 유리하다는 것을 발견하였다.
이러한 선정 결과를 활용하면, 상기 11가지 RNA 유전자 중 어느 것 하나 또는 둘 이상의 유전자를 바이오마커로 삼아 주관적 자극성 민감피부 정도의 평가를 정량적으로 수행할 수 있을 것이다. 나아가, 이상의 본 발명자들의 연구 결과는 주관적 자극성 민감피부 평가 방법 또는 평가 키트의 개발, 주관적 자극성 민감피부 유도 또는 억제 물질의 개발과 스크리닝, 개개인에 대한 피부 유형 정보 제공, 맞춤형 화장품 개발 및 동물 실험 대체 주관적 자극성 민감피부 유효성 평가에 있어서 매우 유용한 툴을 제공할 수 있을 것으로 기대된다.
<화장품여드름>
화장품여드름 정도에 따른 시험대상자 분류, 전문의 문진, 인체적용기기 평가, lactic acid sting test 및 피부 가검물 채취
세안 후 30분 동안 항온 및 항습 조건에서 대기한 후, 시험대상자를 대상으로 설문평가 및 피부과 전문의 문진을 시행하였고, 인체적용기기를 이용하여 피부 유분량을 측정하였으며, lactic acid sting test를 통해 피부 자극 민감도를 평가하였다.
구체적으로 피부 유분량은 양 콧망울 부위에 대하여 Sebumeter® SM815 장비를 이용하여 측정하였고, μg/cm2 값을 분석하였다. 민감도는 Frosch & Kligman method (1977)에 따른 "5% lactic acid sting test"를 통해 평가하였다. Lactic acid (5%)와 DW를 각각 50 ㎕씩 양쪽 비구순 부위(nasolabial fold)에 분주하고 0분, 2.5분, 5분, 8분마다 따가움, 화끈거림, 가려움을 그 강도에 따라 4 point scale(0; no sting, 1; slight sting, 2; moderate sting, 3; severe sting)로 시험대상자가 직접 평가하도록 하였다. 자극감의 강도를 수치화한 값이 높을수록 민감한 것을 의미하며, 본 시험에서는 Lactic acid (5%)와 DW의 차이값을 취하여 분석하였으며, 계산식은 다음과 같다.
Score = (총 Lactic acid 값-총 DW 값) / 12 (4구간*3항목)
시험대상자의 화장품여드름에 대한 이학적 소견은 관련 문헌(한국형 여드름 중증도 시스템, 대한피부과학회지: 제24권 제10호 2004년)에 근거하여, 피부유분에 대한 이학적 소견은 관련 문헌(Reprod Biol Endocrinol. 2017 Homburg et al)에 근거하여, 피부과 전문의가 육안 판정 시행 후 제공하였다.
전체 시험대상자 중 전문의 육안판정을 통해 화장품여드름이 있는 시험대상자(시험군)와 화장품여드름이 없고 lactic acid sting test 점수가 0.5점 이하인 시험대상자(대조군)를 선정하였으며, 이러한 시험군 및 대조군 관련 구체적인 사항은 아래 표 17에 정리하였다.
시험군 대조군
표본 수 (명) 5 5
연령 (평균 ± SD) 31.40 ± 9.81 36.00 ± 11.42
이학적 소견 (여드름) O X
이학적 소견 (지성 Score) 2.60 ± 0.89 1.40 ± 0.55
Sebumeter (μg/cm2) 108.10 ± 59.93 75.20 ± 26.04
Lactic acid sting test (Score) 0.35 ± 0.26 0.17 ± 0.23
또한, 마이크로니들 패치를 안면에 15분 동안 부착 후 피부 가검물을 채취하였다.
피부 가검물로부터 RNA 채취
시험대상자로부터 획득한 피부 가검물을 RNeasy® Plus Mini Kit (Qiagen)에 제공하였고, 상기 Kit를 이용하여 고순도의 RNA를 추출하였다. 그 다음, NanoDrop 장비와 2100 Bioanalyzer 장비를 이용하여 RNA 샘플의 QC(Quality Control)를 확인한 후 RNA microarray 분석을 시행하였다.
RNA microarray 분석
상술한 방법으로 분리한 RNA는 소량(100 pg)의 총 RNA를 cRNA로 증폭하는 방법인 GeneChip® WT Pico Kit(Applied Biosystems)를 사용하여 시료에 유연하고 감도 높은 전처리를 시행하였다. 상술한 방법으로 증폭된 RNA는 GeneChip® Human Gene 2.0 ST Array(Affymetrix) 플랫폼의 매뉴얼에 따라 microarray를 실행하였다. 상기 플랫폼의 매뉴얼에 소개된 microarray 절차는 도 4 및 도 5에 도시한 바 있다. 본 발명자들은 동일 절차로 microarray를 실행하였다. 상기 플랫폼의 RNA microarray 분석 프로토콜은 표 3에 정리한 바와 동일하다.
그 이후, Affymetrix® Power Tools (APT)의 Robust Multi-Average (RMA) 방법을 통해 전체 데이터를 요약 및 정규화 하였고, 유전자 수준으로 결과를 정리하고 Differentially Expressed Gene(DEG) 분석을 수행하였다. 데이터의 통계적 유의성은 독립적 t-test와 fold change의 변화를 이용하여 분석하였고, False discovery rate(FDR)는 Benjamini-Hochberg 알고리즘을 사용하여 p 값을 조정하였고, DEG 세트는 linkage와 Euclidean distance를 사용하여 Hierarchical cluster 분석을 수행하였다. 또한, 유전자 발현의 차이를 확인하기 위한 모든 데이터 분석과 시각화 작업은 R 4.0.0 프로그램을 사용하여 수행하였다.
생물정보학 분석(Bioinformatics analysis) 및 유의적 상관관계 분석을 통한 여드름 바이오마커 후보 선별
RNA microarray 시험 진행 후, 시험군과 대조군의 약 4만여가지의 유전자 발현 차이를 확인하기 위해, R 4.0.0 프로그램을 이용하여 유전자 정렬을 실시하였다. 도 85는 유전자 정렬 결과를 도시하는 도면이다. 도 85의 유전자 정렬은 heatmap 분석이라고도 불린다. Heatmap 분석은 열을 뜻하는 히트(heat)와 지도를 뜻하는 맵(map)을 결합시킨 용어로서, 색으로 표현할 수 있는 다양한 정보를 이미지 위에 열분포 형태의 도면으로 나타내는 분석 방법이다. 본 명세서에 기재한 heatmap 분석에서는 빨간색으로 나타낼수록 유전자의 발현값이 커지는 것을 의미하고, 파란색으로 나타낼수록 유전자의 발현값이 작아지는 것을 의미한다. 도 85에서는 수 백가지의 유전자를 분석했을 때, 시험군과 대조군에서 다수의 유전자의 발현값이 특이적으로 차이가 나는 것을 확인하였다.
그 이후, 본 발명자들은 문헌조사를 통해 화장품여드름과 관련된 유전자를 선별하였다. 본 발명자들은 상기 문헌조사를 통해 화장품여드름과 관련된 것으로 확인된 유전자들의 microarray 시험 결과 확인된 유전자 발현에 관한 수치를 도 86의 표에 정리하였다.
화장품여드름 활성도가 높은 시험군과 화장품여드름 활성도가 낮은 대조군에 있어서 microarray를 실시함으로써 얻어진 유전자 발현에 관한 수치값에 차별성이 존재하여야 화장품여드름 예측에 관한 바이오마커로서 유용할 것이다. 이를 판단하기 위하여 본 발명자들은 fold change와 p-value를 사용하였다. Fold change는 시험군과 대조군 간 normalized signal 값을 사용하여 1:1 발현 차를 계산한 값으로 시험군에서의 측정 수치가 대조군에서의 측정 수치에 비해 몇 배나 높아졌거나 낮아졌는지를 보여주는 값이고, p-value는 데이터가 귀무가설과 양립하는 정도를 0에서 1사이의 값으로 표현한 것으로 대개 0.05보다 작을 경우 귀무가설을 기각함을 의미하며, 통계처리에 있어서 시험군과 대조군 사이의 값이 통계적으로 유의한 차이를 보이는지에 대한 값이다.
결과적으로 도 86의 표에 표시된 화장품여드름 관련 유전자 중 fold change가 1.2배 혹은 -1.2배 이상이거나 p-value가 0.05 이하인 유전자는 MMP3, MMP12, CCR1, AKR1B10, THY1 및 IL-6로 확인되었다.
도 87은 피부과 전문의의 이학적 소견을 통해 화장품여드름 활성도가 높은 시험군 5명과 화장품여드름 활성도가 낮고 lactic acid sting test 점수가 0.5점 이하인 대조군 5명, 총 10명의 시험대상자를 선정한 후, 상기의 RNA microarray 분석 결과를 통해 선정된 화장품여드름 바이오마커 후보들의 발현 정도를 시각적으로 비교분석하기 위해 heatmap 분석을 진행한 결과를 도시하는 도면이다. 도 84의 경우와 동일하게 도 87의 heatmap 분석도 빨간색으로 나타낼수록 유전자의 발현값이 커지는 것을 의미하고, 파란색으로 나타낼수록 유전자의 발현값이 작아지는 것을 의미한다. 도 87의 실험 결과로부터는 대조군에 비해 시험군에서 문헌조사를 통해 선별한 특정 유전자들의 발현이 빨간색으로 높게 나타남을 시각적으로 확인하였다.
상기의 RNA microarray 분석을 통해 선정된 화장품여드름 바이오마커 후보인 MMP3, MMP12, CCR1, AKR1B10, THY1 및 IL-6 유전자와 피부과 전문의의 이학적 소견을 통한 여드름 유/무 및 지성 육안평가, 그리고 인체적용기기(Sebumeter)와의 상관관계를 확인하기 위해 이변량 상관분석을 시행하였다. 그 결과가 도 88 내지 도 101에 도시된다.
본 발명자들은 이학적 소견을 통해 확인된 화장품여드름이 있는 시험군 5명과 화장품여드름이 없으면서 lactic acid sting test 점수가 0.5점 이하인 대조군 5명, 총 10명의 시험대상자의 RNA microarray 분석을 통해 선정된 화장품여드름 바이오마커 후보와 이학적 소견의 여드름 유/무에 따른 점수(유: +1점, 무: 0점), 육안평가를 통한 지성 점수(0~5점) 및 인체적용기기(Sebumeter) 측정결과와의 상관관계를 분석하였다.
그 결과, MMP3, MMP12, CCR1, THY1 및 IL6 유전자는 이학적 소견의 화장품여드름 유/무에 따른 점수와 통계적으로 유의한 양의 상관관계를 나타냄을 확인하였다(도 88 내지 도 94 참조). 도 88 및 도 89는 이학적 소견과의 상관관계 분석 결과를 나타내는 표이다. 도 90 내지 도 94는 상기 유의한 양의 상관관계를 나타내는 5개 유전자들의 산점도 그래프이다.
또한, MMP12 및 CCR1 유전자는 육안평가를 통한 지성 점수와 통계적으로 유의한 양의 상관관계를 나타냄을 확인하였다(도 95 내지 도 98참조). 도 95와 도 96은 육안평가를 통한 지성 점수와의 상관관계 분석 결과를 나타내는 표이다. 도 97과 도 98은 상기 유의한 양의 상관관계를 나타내는 2개 유전자들의 산점도 그래프이다.
또한, CCR1 유전자는 인체적용기기(Sebumeter) 측정결과와 통계적으로 유의한 양의 상관관계를 나타냄을 확인하였다(도 99 내지 도 101 참조). 도 99와 도 100은 인체적용기기(Sebumeter) 측정결과와의 상관관계 분석 결과를 나타내는 표이다. 도 101은 상기 유의한 양의 상관관계를 나타내는 1개의 유전자의 산점도 그래프이다.
상술한 바와 같은 본 발명자들이 수행한 화장품여드름 평가 실험 결과를 종합적으로 분석하였을 때, 화장품여드름 바이오마커를 가장 넓은 범위로 잡는 경우, MMP3, MMP12, CCR1, AKR1B10, THY1 및 IL-6, 총 6가지의 유전자를 선정할 수 있다. 또한, 정확하고 효과적인 피부 상태 진단의 관점에서, 본 발명자(들)는 이들 유전자 중 MMP3, MMP12 및 CCR1을 바이오마커 군에 포함하도록 실시하는 것이 유리하다는 것을 발견하였다.
이러한 선정 결과를 활용하면, 상기 6가지의 RNA 유전자 중 어느 것 하나 또는 둘 이상의 유전자를 바이오마커로 삼아 화장품여드름 예측을 정량적으로 수행할 수 있을 것이다. 나아가, 이상의 본 발명자들의 연구 결과는 화장품여드름 예측 방법 또는 예측 키트의 개발, 화장품여드름 유도 또는 억제 물질 및 치료제의 개발과 스크리닝, 개개인에 대한 피부 유형 정보 제공, 맞춤형 화장품 개발 및 동물 실험 대체 화장품여드름 유효성 평가에 있어서 매우 유용한 툴을 제공할 수 있을 것으로 기대된다.
이상의 실시예들에서 대상체의 피부로부터 마이크로니들을 사용하여 추출한 피부 가검물로부터 RNA를 추출하고, 이를 RNA microarray 정량 분석장비에 제공하여 RNA 유전자별 발현정도를 정량화하는 방식에 대하여 설명하였다. 그런데, 본 발명은 이러한 특정 정량화 방식에 국한되는 것으로 제한해석 되어서는 아니된다. 대상체의 피부 가검물을 사용하여 RNA 발현 정도를 정량화 할 수 있는 방식이면 모두 본 발명의 범주에 속하는 것으로 이해되어야 한다. 예컨대 ELISA 방식 등 단백질 수준에서의 측정 방식이 적용될 수 있다. 해당 RNA 바이오마커가 발현되어 생성되는 것으로 단백질의 종류를 특정하고 이 단백질의 정량화로써 RNA 유전자별 발현정도가 정량화 될 수 있을 것이다. 즉, 본 발명의 실행에 있어서 사용되는 정량화 장비 또는 키트는 ELISA, RT-PCR 키트, RNA 칩, DNA 칩 또는 단백질 칩 키트일 수 있다. 상기 단백질 수준의 측정은 ELISA, 웨스턴블랏팅, 자석비드-항체면역침강법, 면역화학조직염색 및 질량분석기 중에서 선택된 하나 이상의 방식에 의할 수 있다. 또한, 상기 mRNA 수준의 측정은 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR(competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법 (RPA: RNase Protection Assay), 노던블랏팅(Northern blotting) 및 DNA 칩 중에서 선택된 하나 이상의 방식에 의할 수 있다.
본 발명은 각 피부 상태의 측정 및 평가를 위하여 마이크로니들을 활용한 비침습적 방식으로 특정 RNA 바이오마커를 활용하는 것에 특징이 있고, 특정 RNA 바이오마커의 검출을 위하여 RNA 수준의 검사법과 단백질 수준의 검사법을 모두 사용 가능하지만, RNA 수준의 검사법을 활용할 경우 단백질 수준의 검사법을 활용하는 것에 대비하여 후술하는 장점을 얻을 수 있다. 단백질 대비 검출량이 적은 RNA 샘플을 증폭하는 기술을 적용함으로써 소량의 샘플로부터도 훨씬 많은 수의 바이오마커를 효율적이고 정확하게 검출해 낼 수 있다는 것이 RNA 수준 검사법의 장점으로 요약될 수 있다.
특정 바이오마커의 발현을 관찰하거나 정량화 하는데 있어서 단백질 수준의 검사법과 RNA 수준의 검사법의 가장 큰 실용상 차이 중 하나는 단백질 검사 대비 매우 소량으로 매우 많은 수의 바이오마커를 관찰 또는 정량화 가능하다는 점이다. 단백질 수준에서 다양한 바이오마커의 변화를 동시에 보기 위해서는 proteome 분석이 적합한데 이를 위해서는 많은 양의 샘플이 필요하며, 특히 피부조직에서 단백질을 추출할 경우, 수율이 10% 이하이므로 필요량의 10배 정도의 샘플이 필요하다. 구체적으로, proteome 분석에 최소 1-2 mg의 단백질 시료가 필요한데, 3 mm 펀치 피부 조직생검으로는 약 0.15 mg의 단백질이 추출된다. 즉, 3 mm 펀치 피부 조직생검 약 10개를 시행해야 proteome 분석이 가능하다는 계산이 나온다.
그런데, 조직생검의 여러 한계점에 비추어 볼 때 3 mm 펀치를 10회나 실시하는 것은 실제적으로 시도되기 어렵다. 마이크로니들 패치로 단백질을 추출하는 방법 역시, 마이크로니들 패치 1장에서는 약 0.06 mg의 단백질이 추출되므로 20장 이상의 마이크로니들 패치를 부착해야 proteome 분석이 가능하기 때문에 피부에 실용적으로 적용하기에 어려움이 있다. 또한, 이렇게 샘플에서 단백질을 추출해냈다 하더라도 proteome 분석을 통해 검출되는 바이오마커는 약 650개 정도로, RNA microarray 분석을 통해 검출되는 바이오마커 (4만개 이상)의 1-2% 정도 수준으로 효율성이 떨어진다.
다른 분석법으로 수행하더라도 한계가 존재한다. 단백질 분석법 중 가장 예민한 검사 방법인 ELISA 방법으로 비교를 해보아도, 마이크로니들 패치 1장으로 추출되는 0.06 mg의 단백질은 3회 반복 분석 시 1개의 바이오마커의 발현 변화만을 확인할 수 있는 양에 불과하다. 더불어 ELISA 방식의 특성상 한 kit 당 1개의 바이오마커만 검출이 가능하고, 용매에 따라 간섭현상이 일어날 수 있으며 실험자가 수행해야하는 단계가 많아 측정 시마다 variation이 크다는 단점이 존재한다. RNA와 달리 단백질은 그 구조가 3차원이고 증폭이 불가하기 때문에 가검물 채취량 한계를 극복할 수 없고 피부 유형이나 피부 질환의 예후판정 및 진단, 신소재 치료 유효성 평가 등을 위한 다수의 바이오마커 변화를 동시에 분석하는 데에 적용하기에는 어려움이 있다.
이러한 문제점을 해결하고자 본 발명에서는 RNA를 분석에 적용하였다. 특정 단백질이 합성되기 위해서는 세포 핵에 존재하는 DNA로부터 해당 단백질 합성에 관여하는 유전자 부위를 RNA 형태로 복제하고(전사) 이 RNA가 세포질로 이동하여 이를 주형으로 각 염기서열에 해당하는 아미노산을 연결하여 최종적으로 단백질이 합성(번역)되는 과정을 거치는데, 단백질 합성의 전구체이자 여러 환경적 요인에 의해 변화하는 실제 피부 단백질의 발현양을 반영하는 유전물질인 RNA를 분석에 활용하면 더욱 효율성 높은 분석이 가능하기 때문이다.
다만, RNA는 단백질보다 그 수율이 더 낮고 불안정성은 높아 분석에 활용하기 위해 최적의 조건을 설정하기 위한 연구가 필요하였다. 본 발명에 이르러서야 마이크로니들 패치를 이용하여 얻어낸 미량의 피부 가검물로부터 RNA 바이오마커를 신뢰성 있게 확인 가능하다는 점이 확인되었다. 본 발명에 이르기 전에는 앞서 기술한 바와 같이 RNA가 단백질보다 수율이 낮고 불안정성은 높다는 당업계의 인식으로 인하여 마이크로니들 패치로 얻어진 미량의 가검물로부터 RNA 바이오마커를 확인하여 특정 피부 상태 또는 질환을 진단하는 것에는 이르지 못하였다.
본 발명자(들)는 미량의 RNA를 분석을 시행하기 적합한 양으로 확보하기 위해 RNA를 증폭하는 과정을 거침으로써 앞선 실시예들에 자세히 기재한 바와 같이, 마이크로니들 패치로 얻어진 미량의 가검물로부터 RNA 바이오마커를 효율적으로 또한 정확하게 검출할 수 있다는 점을 최초로 확인하였다.
동일 단위로 환산하였을 때 마이크로니들 패치 1장 당 추출되는 단백질양은 약 60 ng/μL인 반면, RNA는 약 10 ng/μL으로 1/6 수준으로 추출할 수 있었다. 단백질양 보다도 미량이지만 이를 극복하기 위해 RNA를 증폭하는 기술을 적용하였고 RNA microarray 분석을 가능케 하였다. RNA 증폭 기술은 중합효소 반응 원리를 통해 10 ng의 RNA를 약 550배인 5500 ng으로 증폭할 수 있다. 이와 같은 방식으로 마이크로니들 패치 1장으로부터 추출되는 피부 가검물로부터 약 4만여가지의 바이오마커의 발현 변화를 확인할 수 있는 것이며, 앞서 기술한 실시예들에서 각 피부 상태를 측정, 평가 또는 진단하기 위하여 선정된 복수개의 RNA 바이오마커들은 매우 용이하고 정확하게 검출할 수 있다.
반면, 마이크로니들 패치로 피부 가검물을 획득하는 방식으로 복수개, 예컨대 9개의 단백질 바이오마커의 발현을 정확하게 검출하려면 1장의 마이크로니들 패치로부터 얻어지는 양으로는 불가능하다. 여러개의 마이크로니들 패치가 사용되어야 하며, 1개의 마이크로니들 패치로부터 검사를 위한 가검물 획득 과정이 복수 회 실행되어야 한다. 앞서 기술한 바와 같이, ELISA 방식을 사용한다면, kit 당 1개의 바이오마커만 검출 가능한 특징으로 인해 여러 개의 kit가 동원되어야 할 것이며, 그마저도 용매에 따라 간섭현상이 일어날 수 있으며 실험자가 수행해야 하는 단계가 많아 측정 시마다 variation이 크다는 단점을 감수해야 한다.
이상에서 본 발명이 구체적인 구성요소 등과 같은 특정 사항들이 한정된 실시예 및 도면에 의해 설명되었으나, 이는 본 발명의 보다 전반적인 이해를 돕기 위해서 제공된 것일 뿐, 본 발명이 상기 실시예들에 한정되는 것은 아니며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적인 지식을 가진 자라면 이러한 기재로부터 다양한 수정 및 변형을 꾀할 수 있다.
따라서, 본 발명의 사상은 상기 설명된 실시예에 국한되어 정해져서는 아니 되며, 후술하는 특허청구범위뿐만 아니라 이 특허청구범위와 균등하게 또는 등가적으로 변형된 모든 것들은 본 발명의 사상의 범주에 속한다고 할 것이다.

Claims (15)

  1. 대상체의 피부로부터 추출된 가검물로부터 RNA 유전자의 발현 정도를 정량화 할 수 있는 장비와,
    생분해성 고분자 히알루론산으로 이루어지고 중실 구조인 복수개의 마이크로니들을 포함하는 마이크로니들 패치를 포함하고,
    상기 마이크로니들 패치가 대상체의 피부에 적용되고, 소정 시간 유지 후 분리된 상태에서, 상기 마이크로니들 패치의 마이크로니들 표면에 흡착된 대상체 피부로부터의 가검물 또는 이로부터의 추출물이 상기 장비에 의해 정량 분석되고, 상기 장비는 상기 마이크로니들 패치의 마이크로니들 표면에 흡착된 대상체 피부로부터의 가검물 또는 이로부터의 추출물로부터 콜라겐/탄력 관련 RNA 바이오마커 유전자의 발현 정도 또는 피부장벽기능/수분합성 관련 RNA 바이오마커 유전자의 발현 정도를 정량화 하고, 상기 정량화 값을 기초로 피부노화의 진단이 이루어지고,
    상기 콜라겐/탄력 관련 바이오마커는 COL1A1, COL3A1, FN1, GSTA3, PON1, PINK1, COL4A4 및 MMP8 중 어느 하나 또는 둘 이상을 포함하고, 피부장벽기능/수분합성 관련 바이오마커는 IVL, HAS2, HAS3, AQP3, CERS6, CLDN1, SLC9A1, TGM1, SPINK5, KLF4, LCE1A, LCE1B, LCE1F, LCE2A, BGN 및 AZGP1 중 어느 하나 또는 둘 이상을 포함하는,
    최소 침습적 피부 상태 진단 키트.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 콜라겐/탄력 관련 바이오마커는 COL1A1, COL3A1, FN1 및 PINK1을 포함하고,
    피부장벽기능/수분합성 관련 바이오마커는 IVL, HAS3, AQP3, BGN 및 AZGP1을 포함하는,
    최소 침습적 피부 상태 진단 키트.
  3. 대상체의 피부로부터 추출된 가검물로부터 RNA 유전자의 발현 정도를 정량화 할 수 있는 장비와,
    생분해성 고분자 히알루론산으로 이루어지고 중실 구조인 복수개의 마이크로니들을 포함하는 마이크로니들 패치를 포함하고,
    상기 마이크로니들 패치가 대상체의 피부에 적용되고, 소정 시간 유지 후 분리된 상태에서, 상기 마이크로니들 패치의 마이크로니들 표면에 흡착된 대상체 피부로부터의 가검물 또는 이로부터의 추출물이 상기 장비에 의해 정량 분석되고, 상기 장비는 상기 마이크로니들 패치의 마이크로니들 표면에 흡착된 대상체 피부로부터의 가검물 또는 이로부터의 추출물로부터 피부보습 관련 RNA 바이오마커 유전자의 발현 정도를 정량화하고, 상기 정량화 값을 기초로 피부보습 정도의 평가가 이루어지고,
    상기 피부보습 관련 바이오마커는 CDSN, FLG, FLG2, LOR, KLF4, KRT10, LCE1A, LCE2A, LCE2B, LCE2C, SMPD3, CDH1, ITGB4, IVL, SPINK5, CLDN1, AQP3, BGN, HAS3, TGM1, CLDN7, CERS3, CLDN4 및 KRT1 중 어느 하나 또는 둘 이상을 포함하는,
    최소 침습적 피부 상태 진단 키트.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 피부보습 관련 바이오마커는 FLG, AQP3 및 LOR을 포함하는,
    최소 침습적 피부 상태 진단 키트.
  5. 대상체의 피부로부터 추출된 가검물로부터 RNA 유전자의 발현 정도를 정량화 할 수 있는 장비와,
    생분해성 고분자 히알루론산으로 이루어지고 중실 구조인 복수개의 마이크로니들을 포함하는 마이크로니들 패치를 포함하고,
    상기 마이크로니들 패치가 대상체의 피부에 적용되고, 소정 시간 유지 후 분리된 상태에서, 상기 마이크로니들 패치의 마이크로니들 표면에 흡착된 대상체 피부로부터의 가검물 또는 이로부터의 추출물이 상기 장비에 의해 정량 분석되고, 상기 장비는 상기 마이크로니들 패치의 마이크로니들 표면에 흡착된 대상체 피부로부터의 가검물 또는 이로부터의 추출물로부터 피부 색소침착 관련 RNA 바이오마커 유전자의 발현 정도를 정량화하고, 상기 정량화 값을 기초로 피부 색소침착 정도의 평가가 이루어지고,
    상기 피부 색소침착 관련 바이오마커는 CAT, CLU, DSG1, GPNMB, GPX4, GSTM2, GSTP1, MLANA, PAX3, SOX10, TFAP2A, TYR, TYRP1, MC1R, F2RL1 및 CLDN1 중 어느 하나 또는 둘 이상을 포함하는,
    최소 침습적 피부 상태 진단 키트.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 피부 색소침착 관련 바이오마커는 MLANA, TYRP1 및 GPNMB를 포함하는,
    최소 침습적 피부 상태 진단 키트.
  7. 대상체의 피부로부터 추출된 가검물로부터 RNA 유전자의 발현 정도를 정량화 할 수 있는 장비와,
    생분해성 고분자 히알루론산으로 이루어지고 중실 구조인 복수개의 마이크로니들을 포함하는 마이크로니들 패치를 포함하고,
    상기 마이크로니들 패치가 대상체의 피부에 적용되고, 소정 시간 유지 후 분리된 상태에서, 상기 마이크로니들 패치의 마이크로니들 표면에 흡착된 대상체 피부로부터의 가검물 또는 이로부터의 추출물이 상기 장비에 의해 정량 분석되고, 상기 장비는 상기 마이크로니들 패치의 마이크로니들 표면에 흡착된 대상체 피부로부터의 가검물 또는 이로부터의 추출물로부터 피부유분 관련 RNA 바이오마커 유전자의 발현 정도를 정량화하고, 상기 정량화 값을 기초로 피부유분 정도의 평가가 이루어지고,
    상기 피부유분 관련 바이오마커는 MFAP2, IGF1, HSD11B1, GPAM, CPT1C, AR, MPZL3, AQP3, SREBF2 및 HSD17B2 중 어느 하나 또는 둘 이상을 포함하는,
    최소 침습적 피부 상태 진단 키트.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 피부유분 관련 바이오마커는 MPZL3, GPAM, 및 IGF1을 포함하는,
    최소 침습적 피부 상태 진단 키트.
  9. 대상체의 피부로부터 추출된 가검물로부터 RNA 유전자의 발현 정도를 정량화 할 수 있는 장비와,
    생분해성 고분자 히알루론산으로 이루어지고 중실 구조인 복수개의 마이크로니들을 포함하는 마이크로니들 패치를 포함하고,
    상기 마이크로니들 패치가 대상체의 피부에 적용되고, 소정 시간 유지 후 분리된 상태에서, 상기 마이크로니들 패치의 마이크로니들 표면에 흡착된 대상체 피부로부터의 가검물 또는 이로부터의 추출물이 상기 장비에 의해 정량 분석되고, 상기 장비는 상기 마이크로니들 패치의 마이크로니들 표면에 흡착된 대상체 피부로부터의 가검물 또는 이로부터의 추출물로부터 홍조성 민감피부 관련 RNA 바이오마커 유전자의 발현 정도를 정량화하고, 상기 정량화 값을 기초로 홍조성 민감피부의 평가가 이루어지고,
    상기 홍조성 민감피부 관련 바이오마커는 COL3A1, TAC1, KLK5, CAMP, MMP9, TRPA1, IL13RA1, HSD3B1, CXCR4, ANGPT2, CXCL2, CXCR5 및 PSMB9 중 어느 하나 또는 둘 이상을 포함하는,
    최소 침습적 피부 상태 진단 키트.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 홍조성 민감피부 관련 바이오마커는 MMP9, TAC1 및 CAMP를 포함하는,
    최소 침습적 피부 상태 진단 키트.
  11. 대상체의 피부로부터 추출된 가검물로부터 RNA 유전자의 발현 정도를 정량화 할 수 있는 장비와,
    생분해성 고분자 히알루론산으로 이루어지고 중실 구조인 복수개의 마이크로니들을 포함하는 마이크로니들 패치를 포함하고,
    상기 마이크로니들 패치가 대상체의 피부에 적용되고, 소정 시간 유지 후 분리된 상태에서, 상기 마이크로니들 패치의 마이크로니들 표면에 흡착된 대상체 피부로부터의 가검물 또는 이로부터의 추출물이 상기 장비에 의해 정량 분석되고, 상기 장비는 상기 마이크로니들 패치의 마이크로니들 표면에 흡착된 대상체 피부로부터의 가검물 또는 이로부터의 추출물로부터 주관적 자극성 민감피부 관련 RNA 바이오마커 유전자의 발현 정도를 정량화하고, 상기 정량화 값을 기초로 주관적 자극성 민감피부 정도의 평가가 이루어지고,
    상기 주관적 자극성 민감피부 관련 바이오마커는 IVL, LOR, FLG, FLG2, PGF, CYR61, HLA-B, IGHA1, MMP3, RBP4 및 G0S2 중 어느 하나 또는 둘 이상을 포함하는,
    최소 침습적 피부 상태 진단 키트.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 주관적 자극성 민감피부 관련 바이오마커는 PGF, RBP4 및 CYR61을 포함하는,
    최소 침습적 피부 상태 진단 키트.
  13. 대상체의 피부로부터 추출된 가검물로부터 RNA 유전자의 발현 정도를 정량화 할 수 있는 장비와,
    생분해성 고분자 히알루론산으로 이루어지고 중실 구조인 복수개의 마이크로니들을 포함하는 마이크로니들 패치를 포함하고,
    상기 마이크로니들 패치가 대상체의 피부에 적용되고, 소정 시간 유지 후 분리된 상태에서, 상기 마이크로니들 패치의 마이크로니들 표면에 흡착된 대상체 피부로부터의 가검물 또는 이로부터의 추출물이 상기 장비에 의해 정량 분석되고, 상기 장비는 상기 마이크로니들 패치의 마이크로니들 표면에 흡착된 대상체 피부로부터의 가검물 또는 이로부터의 추출물로부터 화장품여드름 관련 RNA 유전자 바이오마커의 발현 정도를 정량화 하고, 상기 정량화 값을 기초로 화장품여드름의 예측이 이루어지고,
    상기 화장품여드름 관련 바이오마커는 MMP3, MMP12, CCR1, AKR1B10, THY1 및 IL-6 중 어느 하나 또는 둘 이상을 포함하는,
    최소 침습적 피부 상태 진단 키트.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 화장품여드름 관련 바이오마커는 MMP3, MMP12 및 CCR1을 포함하는,
    최소 침습적 피부 상태 진단 키트.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체 피부로부터의 가검물로부터 RNA를 추출하는 장비를 더 포함하고, 상기 RNA 추출 장비에 의하여 획득한 RNA가 증폭 과정을 거쳐 상기 정량화 장비에 제공되는,
    최소 침습적 피부 상태 진단 키트.
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