KR102216941B1 - 마이크로니들 패치를 포함하는 최소 침습적 홍조성 민감피부 평가 키트 및 홍조성 민감피부 평가를 위한 바이오마커 - Google Patents

Abstract

본 발명의 일 실시예에 따른 최소 침습적 홍조성 민감피부 평가 키트는 대상체의 피부로부터 추출된 가검물로부터 RNA 유전자의 발현 정도를 정량화 할 수 있는 장비와 생분해성 고분자 히알루론산으로 이루어지고 중실 구조인 복수개의 마이크로니들을 포함하는 마이크로니들 패치를 포함한다. 상기 마이크로니들 패치가 대상체의 피부에 적용되고, 소정 시간 유지 후 분리된 상태에서, 상기 마이크로니들 패치의 마이크로니들 표면에 흡착된 대상체 피부로부터의 가검물 또는 이로부터의 추출물이 상기 장비에 의해 정량 분석된다. 상기 장비는 상기 마이크로니들 패치의 마이크로니들 표면에 흡착된 대상체 피부로부터의 가검물 또는 이로부터의 추출물로부터 홍조성 민감피부 관련 RNA 바이오마커 유전자의 발현 정도를 정량화하고, 상기 정량화 값을 기초로 홍조성 민감피부의 평가가 이루어진다.

Description

마이크로니들 패치를 포함하는 최소 침습적 홍조성 민감피부 평가 키트 및 홍조성 민감피부 평가를 위한 바이오마커{MINIMALLY INVASIVE KIT EVALUATING ROSACEA TYPE SENSITIVE SKIN INCLUDING MICRONEEDLE PATCH AND BIOMARKER FOR EVALUATING ROSACEA TYPE SENSITIVE SKIN}

본 발명은 마이크로니들 패치를 포함하는 최소 침습적 홍조성 민감피부 평가 키트 및 홍조성 민감피부 평가를 위한 바이오마커에 관한 것이다.

바우만 피부타입의 4가지 카테고리 중 하나인 민감성은 다시 4가지 타입으로 분류할 수 있는데, 이는 여드름성 민감피부(acne type), 주관적 자극성 민감피부(stinging type), 알러지성 민감피부(allergic type), 그리고 홍조(주사)성 민감피부(rosacea type)이다. 이 중 한가지에 대한 민감성만 가질 수도 있고, 복합적인 민감성을 가질 수도 있다. 미국인 27,485명을 대상으로 한 바우만 피부타입 설문 연구에서 응답자 중 73%가 민감성 피부이었으며, 49%가 홍조성 민감피부 타입으로 관찰되었다 (Baumann L., Dermatol Clin. 2008:26(3):359-373).

홍조란 피부색이 붉게 변하는 것으로 주로 얼굴 중앙부위에 발생하며, 모세혈관 확장에 의해 나타나는 증상으로 갱년기 호르몬 불균형, 피부 장벽 약화에 의한 민감, 스테로이드 부작용 등 다양한 원인에 의해 발생한다. 외부자극에 의해 일시적으로 발생하지만 만성화 될 경우 주사(Rosacea)라고 불리는 만성염증성 질환이 발생할 수 있다.

홍조성 민감피부란 특정 성분이 포함된 화장품을 발랐을 때 피부가 붉어지고 화끈거리며, 때로 염증성 구진과 모세혈관확장을 동반하는 피부를 말한다. 홍조성 민감피부일 경우, 얼굴 온도의 급격한 변화를 최소화하는 것이 좋고, 항염증 효능이 있는 성분이 들어간 세안제나 보습제, 자외선차단제를 사용하는 것이 좋으며, 예로는 알로에, 아르간오일, 비사볼올, 카페인, 캐모마일, 오이, 녹차, 위치하젤, 나이아신아마이드, 살리실릭산 등이 있다.

이에, 홍조성 민감피부의 새로운 기전을 발굴하고 각종 화장품 성분에 대한 홍조성 민감피부 발생의 예측, 새로운 치료제의 개발 등을 위해서는 적절한 유효성 평가가 필요하다. 동물실험을 실시한 화장품, 동물실험을 실시한 원료를 사용하여 제조된 화장품, 또한 동물실험을 실시하거나 동물실험을 실시한 원료를 사용하여 만든 수입 화장품의 유통 및 판매가 전면 금지됨에 따라, 현재 홍조성 민감피부의 기전 연구나 화장품의 유효성 평가는 인체적용기기를 이용한 효능평가나 3D skin을 이용한 ex vivo 효능평가로 진행되고 있다.

홍조성 민감피부 측정을 위한 인체적용 기기로는 Mexameter (Courage+Khazaka Electronic 사)와 Spectrophotometer가 있다. Mexameter는 멜라닌 값과 홍반을 나타내는 헤모글로빈(hemoglobin) 값을 동시에 측정하는데, 멜라닌과 홍반에 대응하는 서로 다른 3종의 파장대(568 nm, 660 nm, 880 nm)를 이용하여 probe에서 방출하는 빛의 반사도를 측정하는 분광학적 방식의 기기이며, 홍반량을 홍반지수(Erythema index, EI)로 제공한다. Spectrophotometer는 물체색의 분광반사율을 측정하는 장비로 CIE 표색계인 L*, a*, b*로 색을 계산한다. L*은 명도를 의미하고, a*는 적색도, b*는 황색도를 의미하는데, 0에 가까울수록 무채색을 나타내고, 반대가 되면 색도가 높아짐을 의미한다.

이러한 인체적용 기기는 민감하기 때문에 측정하는 환경과 측정자에 의한 영향을 많아 숙련된 측정자와 항온 및 항습 조건에서 측정해야 신뢰성 있는 결과를 얻을 수 있다. 또한, 단순히 피부 표면의 색을 측정하기 때문에 홍조성 민감피부의 구체적인 기전의 연구에 활용되기에는 미흡하고 특정 인자들의 변화를 과학적으로 설명할 수 없다. 또한, 홍조에서 중요한 진피에 존재하는 모세혈관에 대한 구체적인 자료를 제공하지 않는다.

3D 인공피부를 이용한 ex vivo 시험은 인체 표피층과 진피층의 세포를 포함하여 피부를 모방한 가장 발전된 구조체를 보여주지만, 가격이 고가인데다 실제 피부 내 존재하는 혈관, 모낭, 피하지방 등의 구조나 표피 및 진피에 존재하는 다양한 면역세포를 포함하지는 않아 실제 피부의 변화와는 다를 수 있다.

이에 홍조성 민감피부에 적합한 치료제나 화장품을 사용하기 위한 홍조성 민감피부를 예측할 수 있는 새로운 검사가 필요하다.

마이크로니들은 1 mm 이하의 길이를 갖는 미세한 바늘로, 최소한의 침습으로 각질층을 뚫고 피부에 미세한 구멍을 생성하여 약물을 효과적으로 전달하는 약물전달 기술이며, 최근에는 약물 및 생리활성물질의 전달에만 사용되는 것이 아니라 체내 가검물을 취득하고 질병을 진단하는 데에도 그 사용 범위가 넓어지고 있다. 특히 마이크로니들로 형성된 미세구멍을 통해 체액 또는 혈액 등 인체 가검물을 채취하여 바이오마커 검출 및 진단 등에 사용할 수 있다. 일례로 중공형(hollow) 마이크로니들은 니들 내부에 모세관이 있어, 피부에 부착 후 모세관을 통해 혈액을 추출하는 목적으로 사용되고 있다. 환자의 고통을 최소화하면서 비교적 안전하게 혈액을 추출하여 혈액 내 글루코오스와 콜레스테롤을 검출하거나 바이오마커를 진단할 수 있다는 장점이 있지만, 니들이 피부속에서 부러지면 부작용이 발생할 가능성이 높고 출혈 등의 부작용이 발생할 수 있다.

팽윤형(swellable) 마이크로니들은 피부에 부착 후 피부 내 간질액을 흡수해 부풀어오르고 천공부위를 밀폐해 피부에 접착제 없이 부착되는 원리이며, 흡수된 체액을 분리하여 바이오마커 검출, 모니터링 및 진단에 사용되고 있다. 하지만 분석에 필요한 체액을 흡수하기 위해 오랜 시간 패치를 부착해야 하기에 여러 환경적인 요인에 따라 안정적으로 패치를 부착하기 어렵다는 한계점이 있다.

본 발명에 사용되는 용해성(dissolving) 마이크로니들은 생체 내에서 용해되는 고분자 소재와 유효성분을 혼합한 후 마이크로니들로 고형화하여 제조된다. 이러한 용해성 마이크로니들이 피부에 부착되면 효율적으로 체액에 의해 녹게 되고, 피부 내부로 약물을 용이하게 전달 가능하다. 또한, 용해성 마이크로니들은 금속이나 플라스틱으로 제작되지 않아 피부 속에서 부러질 위험이 없어 안전하다. 본 출원인은 본 발명에 이르러 용해성 마이크로니들을 새로운 용도로 활용하고자 한다. 이는 용해성 마이크로니들을 이용한 최초의 피부 가검물(RNA, DNA, 단백질) 채취, 상기 가검물을 이용한 RNA microarray 분석, 상기 분석 결과를 바탕으로 한 홍조성 민감피부 바이오마커 발굴, 상기 바이오마커를 이용한 홍조성 민감피부 평가 및 홍조성 민감피부 개선을 위한 약제 또는 화장품 등의 유효성 평가 등이다.

최근, DTC (Direct-To-Consumer) 서비스의 제공으로 피부유형을 분석하는 연구가 활발히 진행되고 있는데, 이는 피부와 연관된 유전자 DNA의 단일염기다형성(SNP)을 분석한 정보를 제공하는 서비스이다. 주로 구강 상피를 채취하여 DNA 염기서열을 분석하는데, 특정 유전자의 염기서열이 정상인과 다른 지를 비교하여 위험도를 제시한다. 비침습적 방법으로 피부 유전자를 검사할 수 있지만 한계점도 존재한다. DNA는 모든 세포에 동일하게 존재하며 불변하기 때문에 여러 환경적 요인에 의해 변화하는 실제 피부상태를 반영하지 못한다. 특정 SNP를 가지고 태어났다 하더라도 후천적인 관리나 치료를 통해 회복한 경우에 SNP 분석에서는 해당 결과를 반영할 수 없다. 이러한 특징으로 인해 SNP 분석은 새로운 유효물질의 발굴이나 기전 연구, 효능 평가 등에 적용하기 어렵다. 뿐만 아니라, 현재의 구강 상피를 이용한 SNP 분석은, 가검물 채취 부위가 피부가 아닌 구강 상피라는 점에서 실제 피부의 홍조 정도를 반영할 수 없다. 반면에 RNA는 실제 세포에서 작용하는 단백질로 번역 가능한 물질이며 세포마다 특이적인 발현 정도를 나타내기 때문에 여러 요인에 의해 변화하는 실제 피부의 특성을 반영할 수 있다. 따라서, 실제 피부세포에서 RNA 및 단백질 수준에서의 발현을 관찰하는 것이 정확한 피부 상태 분석에 필수적이라 할 수 있다.

DNA 유전체 분석과 달리, RNA 전사체 분석은 피부 세포에서만 특이적으로 발현하거나 약물 노출 등 환경적 조건에 따라 발현이 달라지는 유전자의 검출이 가능하고, 시험군과 대조군 간의 유전자 발현량의 차이를 확인할 수 있어 시험 전후 비교가 필요한 유효성 평가나 기전 연구 및 후보 물질 발굴에 적용할 수 있다. 또한, microarray 기술을 통해 하나의 샘플에서 4만개 이상의 유전자에 대해 발현을 비교할 수 있어 질병의 진단이나 치료 바이오마커 발굴에 있어 매우 유용하다. 하지만, 앞서 기술한 바와 같이 RNA와 단백질을 비침습적 방식으로 수집하는 방법에 한계가 존재하였다. 본 발명자들은 본 발명에 이르러 상술한 한계를 극복할 수 있는 방식을 제안하고자 한다.

본 발명은 상술한 바와 같은 종래의 홍조성 민감피부의 예측 평가 및 그에 대한 맞춤형 치료제나 화장품 개발 방법들의 문제를 해결하는 것을 목적으로 한다. 종래의 Mexameter 혹은 Spectrometer 등 인체적용기기를 이용한 측정방식은 측정하는 환경과 측정자에 의한 영향을 많이 받아 숙련된 측정자와 항온 및 항습 조건에서 측정해야 신뢰성 있는 결과를 얻을 수 있다. 또한, 단순히 피부 표면의 색을 측정하기 때문에 홍조성 민감피부의 구체적인 기전의 연구에 활용되기에는 미흡하고 특정 인자들의 변화를 과학적으로 설명할 수 없다. 또한, 홍조에서 중요한 진피에 존재하는 모세혈관에 대한 구체적인 자료를 제공하지 않는다.

종래의 방식 중 SNP array는 인체 가검물의 DNA를 이용하는데, 태어날 때부터 결정되어 변하지 않는 DNA는 여러 환경적 요인에 의해 변화하는 실제 피부상태를 반영하기 어렵다는 단점이 있다. 또 하나의 종래의 방식인 3D 인공피부를 이용한 ex vivo 시험은 가격이 고가인데다 실제 피부 내 존재하는 혈관, 모낭, 피하지방 등의 구조나 표피 및 진피에 존재하는 다양한 면역세포를 포함하지는 않아 실제 피부의 변화와는 다르다는 단점이 있다.

본 발명의 목적은, 여러 환경적 요인에 의해 변화하는 실제 피부상태를 반영할 수 있는 새로운 최소 침습적 홍조성 민감피부 평가 키트를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 생물학적 시료로서 피부 가검물을 사용하는 홍조성 민감피부 평가를 위한 바이오마커를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은, 상술한 목적이 달성에 수반하여, 다음의 것들을 아울러 제공하는 것에 있다.

- 홍조성 민감피부 예측용 조성물

- 홍조성 민감피부 예측용 검사 방법 및 피부 타입 분류 방법

- 홍조성 민감피부에 대한 유도 또는 억제의 후보물질을 스크리닝 하고 홍조성 민감피부 개선 치료법의 유효성을 평가하는 방법

- 홍조성 민감피부 개선을 위한 일반화장품, 기능성화장품, 의료기기, 의약품 등의 동물실험 대체 인체적용 효능평가 방법

본 발명의 일 실시예에 따른 최소 침습적 홍조성 민감피부 평가 키트는 대상체의 피부로부터 추출된 가검물로부터 RNA 유전자의 발현 정도를 정량화 할 수 있는 장비와 생분해성 고분자 히알루론산으로 이루어지고 중실 구조인 복수개의 마이크로니들을 포함하는 마이크로니들 패치를 포함한다. 상기 마이크로니들 패치가 대상체의 피부에 적용되고, 소정 시간 유지 후 분리된 상태에서, 상기 마이크로니들 패치의 마이크로니들 표면에 흡착된 대상체 피부로부터의 가검물 또는 이로부터의 추출물이 상기 장비에 의해 정량 분석된다. 상기 장비는 상기 마이크로니들 패치의 마이크로니들 표면에 흡착된 대상체 피부로부터의 가검물 또는 이로부터의 추출물로부터 홍조성 민감피부 관련 RNA 바이오마커 유전자의 발현 정도를 정량화하고, 상기 정량화 값을 기초로 홍조성 민감피부의 평가가 이루어진다.

본 발명의 일 실시예에 따른 홍조성 민감피부 평가를 위한 바이오마커는 생물학적 시료로서 피부 가검물을 사용하는 RNA 유전자 바이오마커이고, COL3A1, TAC1, KLK5, CAMP, MMP9, TRPA1, IL13RA1, HSD3B1, CXCR4, ANGPT2, CXCL2, CXCR5 및 PSMB9 중 어느 하나 또는 둘 이상을 포함한다.

이외에도 추가적인 구성이 본 발명에 따른 최소 침습적 홍조성 민감피부 평가 키트 또는 홍조성 민감피부 평가를 위한 바이오마커에 더 제공될 수 있다.

본 발명 특유의 최소 침습적 피부 가검물 획득 방식에 따라 홍조성 민감피부 평가를 위한 바이오마커로서 COL3A1, TAC1, KLK5, CAMP, MMP9, TRPA1, IL13RA1, HSD3B1, CXCR4, ANGPT2, CXCL2, CXCR5 및 PSMB9의 유용성이 밝혀졌다.

이러한 바이오마커는 개개인의 홍조성 민감피부를 평가할 수 있는 마커로서, 어느 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 수준을 측정할 수 있다. 상기 유전자 또는 이의 단백질 수준이 홍조성 민감피부 평가 대상자에서 증가 또는 감소됨을 확인하였으므로, 이의 수준을 측정함으로써 홍조성 민감피부의 평가에 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명에 따르면, 종래의 인체 가검물의 DNA를 이용한 SNP array 방식의 피부유형 진단 방법의 문제점이 해결될 수 있다. 종래의 SNP array는 인체 가검물의 DNA를 이용하는데, 태어날 때부터 결정되어 변하지 않는 DNA는 여러 환경적 요인에 의해 변화하는 실제 피부상태를 반영하기 어렵다는 단점이 있다.

또한, 본 발명에 따르면, 종래의 인체적용기기 측정 및 3D 인공피부 ex vivo 시험 방식의 홍조성 민감피부 평가 방법의 문제점이 해결될 수 있다.

종래의 인체적용기기 측정은 피부의 표면을 단층적으로 측정하는 방법이라, 구체적인 기전의 연구에 활용되거나 특정 인자들의 변화를 과학적으로 설명하기 어렵다는 단점이 있다.

종래의 3D 인공피부를 이용한 ex vivo 시험은 가격이 고가인데다 실제 피부 내 존재하는 혈관, 모낭, 피하지방 등의 구조를 포함하지 않아 실제 피부의 변화를 반영한다고 볼 수 없다.

본 발명에 따르면, 조직 생검 대비 고통이 거의 없고, 흉터도 남지 않고, 환자의 사용 편의성을 높일 수 있음과 동시에, 각질층 내부 변화를 포함하여 표피 하부와 혈관이 분포하는 진피까지의 피부 인자를 채취함으로써 분석 결과의 신뢰성을 높일 수 있는 새로운 최소 침습적 홍조성 민감피부 평가 키트 및 홍조성 민감피부 평가를 위한 바이오마커가 제공될 수 있다.

본 발명에 따라 제공되는 상기 키트 또는 바이오마커를 활용하면, 종래기술 대비 한층 효율적으로 홍조성 민감피부의 유도 또는 억제 물질을 개발 및 스크리닝 할 수 있으며, 개개인에 대한 정확한 피부 유형에 대한 정보를 제공할 수 있고, 이를 통해 개인의 피부 유형을 과학적으로 분류하여 맞춤형 화장품 개발에 이용할 수 있다.

또한, 본 발명에 따르면, 홍조성 민감피부 개선을 위한 일반화장품, 기능성화장품, 의료기기, 의약품의 개발에 있어서 동물 실험을 대체 가능한 새로운 인체적용 효능평가 방법이 제공될 수 있다.

도 1은 종래기술의 피부 생체 검사 방법을 도시하는 도면이다.
도 2는 본 발명에 따른 피부 생체 검사 방법을 개념적으로 도시하는 도면이다.
도 3은 공패치, 저분자량 히알루론산 패치와 고분자량 히알루론산 패치를 사용하여 각각 30대와 60대 연령 환자군에 대하여 Pro-Collagen 1 검출 시험을 수행한 결과를 도시한 표이다.
도 4는 공패치, 저분자량 히알루론산 패치와 고분자량 히알루론산 패치를 사용하여 각각 30대 연령 환자군과 60대 연령 환자군에 대하여 Pro-Collagen 1 검출 시험한 결과를 도시하는 표로서, y축이 흡광도(OD)인 표이다.
도 5는 저분자량 히알루론산 마이크로니들 패치와 고분자량 히알루론산 마이크로니들 패치의 생체 검사 적용 전후의 길이 변화 측정 결과를 도시한 표이다.
도 6은 microarray 절차를 도시하는 도면이다.
도 7은 유전자 정렬 결과를 도시하는 도면이다.
도 8은 문헌조사를 통해 홍조성 민감피부와 관련된 것으로 확인된 유전자들의 microarray 시험 결과인 유전자 발현에 관한 수치를 정리한 표이다.
도 9는 RNA microarray 분석을 통해 선정된 홍조성 민감피부 바이오마커 후보들의 발현 정도를 시각적으로 비교분석하기 위해 heatmap 분석을 진행한 결과를 도시한다.
도 10 내지 도 12는 RNA microarray 분석을 통해 선정된 홍조성 민감피부 관련 바이오마커 후보 유전자들과 인체적용기기(Mexameter, Spectrophotometer) 측정 결과와의 상관관계를 확인하기위해 이변량 상관분석을 시행한 결과를 도시한다.

후술하는 본 발명에 대한 상세한 설명은, 본 발명이 실시될 수 있는 특정 실시예를 예시로서 도시하는 첨부 도면을 참조한다. 이러한 실시예는 당업자가 본 발명을 실시할 수 있기에 충분하도록 상세히 설명된다. 본 발명의 다양한 실시예는 서로 다르지만 상호 배타적일 필요는 없음이 이해되어야 한다. 예를 들어, 본 명세서에 기재되어 있는 특정 형상, 구조 및 특성은 본 발명의 정신과 범위를 벗어나지 않으면서 일 실시예로부터 다른 실시예로 변경되어 구현될 수 있다. 또한, 각각의 실시예 내의 개별 구성요소의 위치 또는 배치도 본 발명의 정신과 범위를 벗어나지 않으면서 변경될 수 있음이 이해되어야 한다. 따라서, 후술하는 상세한 설명은 한정적인 의미로서 행하여지는 것이 아니며, 본 발명의 범위는 특허청구범위의 청구항들이 청구하는 범위 및 그와 균등한 모든 범위를 포괄하는 것으로 받아들여져야 한다.

이하에서는, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 본 발명을 용이하게 실시할 수 있도록 하기 위하여, 본 발명의 여러 바람직한 실시예에 관하여 첨부된 도면을 참조하여 상세히 설명하기로 한다.

마이크로니들 패치를 이용한 최소 침습적 방식의 피부 가검물 채취

도 1은 종래기술의 피부 생체 검사 방법을 도시하는 도면이고,

도 2는 본 발명에 따른 피부 생체 검사 방법을 개념적으로 도시하는 도면이다.

도 2의 좌측 상단에는 제품명 "Therapass"인 시판 중인 마이크로니들 패치가 도시되어 있다. 이 제품은 본 출원인 회사에서 시장에 출시하여 판매 중인 제품으로서, 분자량이 1000kDa인 고분자량 히알루론산 마이크로니들 패치다. 도 2의 좌측 하단에는 이러한 마이크로니들 패치가 피부에 적용된 모습이 도시되어 있으며, 보다 구체적으로는 패치의 마이크로니들이 피부의 진피층까지 침투된 모습을 도시한다. 도 2의 우측 부분에는 피부염 환자에게 마이크로니들 패치가 적용된 후 패치의 마이크로니들에 묻어나온 피부 내 단백질을 활용하여 생체 검사를 실시하는 본 발명의 대표적인 기술적 사상이 개념적으로 도시되어 있다. 여기에 표시된 용어인 바이오 마이닝(Bio-Mining)은 생체 검사를 위하여 대상체 피부 내의 단백질을 캐낸다는 의미로 사용되었다.

이하에서 기술할 도 3 내지 도 5와 관련한 사항들은 본 발명자들이 본 발명에 이르기 이전에 생분해성 고분자량 히알루론산 마이크로니들 패치의 피부 단백질 추출 성능을 실험한 결과이다. 이 실험 결과는 본 발명자들이 본 발명에 이르러 홍조성 민감피부 평가 키트의 구성요소 중 피부 가검물 채취 수단으로 생분해성 고분자 히알루론산 마이크로니들 패치를 사용한 이유이다. 본 발명에서 피부 가검물 채취 수단으로 사용된 생분해성 고분자 히알루론산 마이크로니들 패치(상용화된 제품명 "Therapass")는 중실(solid) 구조이며, 본 발명자 특유의 송풍인장 공정(Droplet Extension, DEN)으로 제조되었으나, 본 발명의 범주가 이와 다른 방식, 예컨대 몰딩 방식으로 제조된 마이크로니들 패치의 사용을 배제하는 것으로 해석되어서는 안된다. 제조방식을 불문하고 동일 재질, 동일 구조의 마이크로니들 패치는 피부 가검물 채취 성능에 있어서 대동소이 한 것으로 평가된다.

도 3은 공패치, 저분자량 히알루론산 패치와 고분자량 히알루론산 패치를 사용하여 각각 30대와 60대 연령 환자군에 대하여 Pro-Collagen 1 검출 시험을 수행한 결과를 도시한 표이다. 도 3의 x축에는 공패치, 저분자량 히알루론산 패치와 고분자량 히알루론산 패치가 표시되어 있다. y축은 검출된 Pro-Collagen 1의 단위 부피당 질량이 밀리리터 당 피코그램의 단위로 표시되어 있다. 도 3에 표시된 ELISA라는 표기는 항체나 항원에 효소를 표지하여 효소의 활성을 측정하여 항원-항체 반응의 강도와 그 양을 정량적으로 측정하는 방법으로 현대 생명공학에서 이용되고 있는 방법을 일컫는다.

도 3의 표에서 주의 깊게 보아야 하는 것은 제1 대조군인 공패치와의 실질적인 차별성 여부이다. 공패치는 본 발명의 출원 이전에 존재하던 종래기술로서, 검출 결과가 공패치와 실질적으로 차별화되지 않는다면 본 발명이 생체 검출 효과 향상에 이바지하는 바가 없다는 것이기 때문이다. 도 3의 결과를 보면, 저분자량(110kDa) 히알루론산 패치에서의 Pro-Collagen 1 검출량은 공패치의 경우와 실질적으로 차별화되지 않았다. 그러나, 고분자량(1000kDa) 히알루론산 패치에서에서의 Pro-Collagen 1 검출량은 공패치 및 저분자량 히알루론산 패치의 경우와 대비하여 현격히 늘어났음을 알 수 있다.

또 다른 실험 결과가 도 4에 도시된다. 도 4는 상술한 세 가지의 대조군을 사용하여 30대 연령 환자군과 60대 연령 환자군에 대하여 Pro-Collagen 1 검출 시험한 결과를 도시하는 표로서 y축이 흡광도(OD)인 표이다. 도 3의 표에서 y축이 검출된 Pro-Collagen 1의 단위 부피당 질량인 것과 대비하여 도 4의 표에서는 흡광도(OD)라는 점이 차이가 있다. 표준물질을 이용한 검량곡선을 토대로 생체 조직이 추출되는 정량을 유추할 수 있다. 따라서, 각군의 흡광도(OD) 값을 측정하여 Pro-Collagen 1의 정량을 유추할 수 있다. 도 4의 결과를 보면 저분자량 히알루론산 패치에서의 흡광도 값이 공패치와 다소 구분되는 결과를 보이나, 여전히 공패치와 저분자량 히알루론산 패치에서의 결과가 대동소이하며, 고분자량 히알루론산 패치에서의 결과가 현격히 차별화된다.

마이크로니들 패치의 성분이 되는 히알루론산의 분자량에 따라 어떻게 이와 같이 현격한 결과의 차별성이 나타나는 것인지에 대하여 본 발명자들은 실험을 지속하며 그 원인을 분석하였고, 그 원인을 분자량의 차이에 따른 피부 내로의 용해 속도에서 찾았다. 현재 상용화되고 있는 마이크로니들 패치의 마이크로니들 성분은 생체적합성이며 생분해성 고분자 물질이 대세이다. "생체적합성 물질"이란 인체에 독성이 없고 화학적으로 불활성인 물질을 의미한다. 그리고, "생분해성 물질"은 생체 내에서 체액, 효소 또는 미생물등에 의해서 분해될 수 있는 물질을 의미한다. 또한, 생분해성 물질들 중에서는 분자량이 작을수록 생체내로의 용해 속도가 빨라지고 분자량이 클수록 생체내로의 용해 속도가 느려지는 경향성이 알려져 있다. 한편, 생체적합성 고분자(biocompatible polymer)로는 다음과 같은 물질들이 알려져 있다:

히알루론산(hyaluronic acid; HA), 젤라틴(gelatin), 키토산(chitosan), 콜라겐(collagen), 알긴산, 펙틴, 카라기난, 콘드로이틴(설페이트), 덱스트란(설페이트), 폴리라이신(polylysine), 카르복시메틸티틴, 피브린, 아가로스, 풀루란, 셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈(PVP), 폴리에틸렌글리콜(PEG), 폴리비닐알콜(PVA), 히드록시프로필셀룰로스(HPC), 히드록시에틸셀룰로스(HEC), 히드록시프로필메틸셀룰로스(HPMC), 나트륨카르복시메틸셀룰로스, 폴리알콜, 아라비아검, 알기네이트, 시클로덱스트린, 덱스트린, 포도당, 과당, 녹말, 트레할로스, 글루코스, 말토스, 락토스, 락툴로스, 프럭토스, 투라노스, 멜리토스, 멜레지토스, 덱스트란, 소르비톨, 크실리톨, 팔라티니트, 폴리락트산(polylactic acid), 폴리글리콜산(polyglycolic acid), 폴리에틸렌옥사이드, 폴리아크릴산, 폴리아크릴아마이드, 폴리메타아크릴산, 폴리말레인산, 폴리에틸렌글리콜-폴리에스터공중합체(poly(ethyleneglycol)/polyester), 키토산-글리세롤포스페이트(Chitosan/glycerol phosphate), 폴리포스파젠(Polyphosphazene), 폴리카프로락톤 (Polycaprolactone), 폴리카르보네이트(Polycarbonate), 폴리에틸렌글리콜-폴리프로필렌글리콜(Poly(ethylene glycol)/poly(propylene glycol), 폴리시아노아크릴레이트 (Polycyanoacrylate), 폴리오르소에스터(Polyorthoester), 폴리하이드록시에틸메타크릴아미드락테이트 (Poly(N-(2-hydroxyethyl) methacrylamide-lactate), 폴리프로필렌포스페이트 (Poly(propylene phosphate) 등.

마이크로니들 패치를 피부에 부착하면 패치의 마이크로니들이 피부의 진피층까지 진입하는 과정에서 그리고 진입 후 유지되는 과정에서 생체적합성 마이크로니들 구조에 단백질이 달라붙었다가 추출될 수 있다. 그런데, 저분자량의 히알루론산 마이크로니들은 생체의 단백질이 그 표면에 달라붙더라도 용해 속도가 상대적으로 빨라 장시간 피부에 부착하는 경우 그 자신이 용해되면서 표면에 붙은 단백질이 유실될 수 있다. 이러한 원인으로 도 3의 실험 결과가 얻어진 것으로 분석되었다. 이를 뒷받침하는 결과가 도 5에 도시되어 있다.

도 5는 상술한 세 가지의 대조군 중 저분자량 히알루론산 마이크로니들 패치와 고분자량 히알루론산 마이크로니들 패치의 생체 검사 적용 전후의 길이 변화 측정 결과를 도시한 표이다.

도 5의 결과에 따르면, 110kDa의 저분자량 히알루론산 마이크로니들 패치의 마이크로니들은 인체의 피부에 부착되어 있는 동안 대략 30%의 길이 감소를 보였다. 한편, 1000kDa의 고분자량 히알루론산 마이크로니들 패치의 마이크로니들은 피부에 부착되어 있는 동안 대략 10%만의 길이 감소를 보였다. 이러한 실험 결과는 저분자량의 히알루론산 마이크로니들은 생체의 단백질이 그 표면에 달라붙더라도 용해 속도가 상대적으로 빨라 장시간 피부에 부착하는 경우 그 자신이 용해되면서 표면에 붙은 단백질이 유실될 수 있으며, 이것이 도 3 및 도 4에 도시된 실험 결과의 원인이라는 점을 뒷받침한다. 도 3 내지 도 5에 도시된 실험에서 각 대조군의 피부 부착 시간은 5분이었다.

임상시험 대상자의 선정

본 발명자들은 홍조성 민감피부의 평가를 위한 바이오마커를 발굴하고 이를 이용하여 홍조성 민감피부 평가 키트를 개발하기 위해 33명의 20~70세의 건강한 시험대상자를 대상으로 실험을 수행하였다(표 1).

표본 수 (명)		33
남자 (명)	19	여자 (명)	14
연령 (평균 ± SD)		37.12 ± 12.90

이 때, ① IRB 승인 이후 자발적으로 본 연구에 동의하지 않아 동의서를 작성하지 않은 자, ② 인체 유래물 제공에 동의하지 않은 자, ③ 임신 또는 수유중인 여성과 프로토콜에서 정한 피임방법에 동의하지 않는 가임기 여성, ④ 피부 질환의 치료를 위해 스테로이드가 함유된 피부 외형제를 1개월 이상 사용하는 사람, ⑤ 최근 한 달간 경구 스테로이드제, 경구 항생제, 면역억제제 사용자, ⑥ 대상 병변 부위에 감염(진균, 세균 및 바이러스 감염)의 소견이 있는 환자, ⑦ 자외선 치료를 받고 있는 자, ⑧ 심각한 전신질환이 있는 자, ⑨ 동의서를 읽고 이해할 수 없는 시험대상자(문맹 등), 및 ⑩ 그 외 시험책임자의 판단으로 시험에 부적합하다고 생각되는 사람은 시험대상자에서 제외하였다.

홍조성 민감피부에 따른 시험대상자 분류, 전문의 문진, 인체적용기기 평가, lactic acid sting test 및 피부 가검물 채취

세안 후 30분 동안 항온 및 항습 조건에서 대기한 후, 시험대상자를 대상으로 설문평가 및 피부과 전문의 문진을 시행하였고, 양 볼 부위를 인체적용기기로 측정하였으며, lactic acid sting test를 통해 주관적 자극 민감을 평가하였다.

구체적으로 Mexameter® MX18 장비를 이용하여 홍반량을 측정하였고, EI(Erythema index) 값을 분석하였다. 또한, Spectrophotometer (CM-700d) 장비를 이용하여 피부 적색도를 측정하였고, a* value 값을 분석하였다. 또한, Frosch & Kligman method (1977)에 따른 "5% lactic acid sting test"를 통해 주관적 자극 민감을 평가하였다. Lactic acid (5%)와 DW를 각각 50 ㎕씩 양쪽 비구순 부위(nasolabial fold)에 분주하고 0분, 2.5분, 5분, 8분마다 따가움, 화끈거림, 가려움을 그 강도에 따라 4 point scale(0; no sting, 1; slight sting, 2; moderate sting, 3; severe sting)로 시험대상자가 직접 평가하도록 하였다. 자극감의 강도를 수치화한 값이 높을수록 민감한 것을 의미하며, 본 시험에서는 Lactic acid (5%)와 DW의 차이값을 취하여 분석하였으며, 계산식은 다음과 같다.

Score = (총 Lactic acid 값-총 DW 값) / 12 (4구간*3항목)

표 2에는 전체 시험대상자 중 홍반량과 적색도가 낮으며 주관적 자극 민감이 없는 대조군 5명, 홍반량과 적색도가 높으며 주관적 자극민감이 없는 시험군 5명을 분류한 결과가 정리된다.

	시험군 (Rosacea)	대조군 (Control)
표본 수 (명)	5	5
연령 (평균 ± SD)	33.80 ± 6.94	39.00 ± 11.20
주관적 자극민감점수 (Score)	0.20 ± 0.14	0.20 ± 0.25
홍반량 (EI)	402.14 ± 50.13	250.48 ± 21.10
적색도 (a* value)	12.99 ± 0.66	9.84 ± 0.59

또한, 마이크로 구조체 패치를 안면에 15분 동안 부착 후 피부 가검물을 채취하였다.

피부 가검물로부터 RNA 채취

시험대상자로부터 획득한 피부 가검물을 RNeasy® Plus Mini Kit (Qiagen)에 제공하였고, 상기 Kit를 이용하여 고순도의 RNA를 추출하였다. 그 다음, NanoDrop 장비와 2100 Bioanalyzer 장비를 이용하여 RNA 샘플의 QC(Quality Control)를 확인한 후 RNA microarray 분석을 시행하였다.

RNA microarray 분석

상술한 방법으로 분리한 RNA를 GeneChip® Human Gene 2.0 ST Array(Affymetrix) 플랫폼의 매뉴얼에 따라 microarray를 실행하였다. 도 6은 상기 플랫폼의 매뉴얼에 소개된 microarray 절차를 도시하고 있으며, 본 발명자들은 동일 절차로 microarray를 실행하였다. 아래의 표 3은 상기 플랫폼의 RNA microarray 분석 프로토콜을 정리한 것이다.

Sample type	Total RNA
Platform	GeneChip® Human Gene 2.0 ST Array
cDNA synthesize	cDNA was synthesized using the GeneChip WT (Whole Transcript) Amplification kit as described by the manufacturer.
Label protocol	The sense cDNA was then fragmented and biotin-labeled with TdT (terminal deoxynucleotidyl transferase) using the GeneChip WT Terminal labeling kit
Hybridization protocol	Approximately 5.5 μg of labeled DNA target was hybridized to the Affymetrix GeneChip Array at 45°C for 16hour
Scan protocol	Hybridized arrays were washed and stained on a GeneChip Fluidics Station 450 and scanned on a GCS3000 Scanner (Affymetrix).
Data processing	Array data export processing and analysis was performed using Affymetrix® GeneChip Command Console® Software (AGCC)

그 이후, Affymetrix® Power Tools (APT)의 Robust Multi-Average (RMA) 방법을 통해 전체 데이터를 요약 및 정규화 하였고, 유전자 수준으로 결과를 정리하고 Differentially Expressed Gene(DEG) 분석을 수행하였다. 데이터의 통계적 유의성은 독립적 t-test와 fold change의 변화를 이용하여 분석하였고, False discovery rate(FDR)는 Benjamini-Hochberg 알고리즘을 사용하여 p 값을 조정하였고, DEG 세트는 linkage와 Euclidean distance를 사용하여 Hierarchical cluster 분석을 수행하였다. 또한, 유전자 발현의 차이를 확인하기 위한 모든 데이터 분석과 시각화 작업은 R 4.0.0 프로그램을 사용하여 수행하였다.

생물정보학 분석(Bioinformatics analysis) 및 유의적 상관관계 분석을 통한 홍조성 민감피부 바이오마커 후보 선별

RNA microarray 시험 진행 후, 시험군과 대조군의 약 4만여가지의 유전자 발현 차이를 확인하기 위해, R 4.0.0 프로그램을 이용하여 유전자 정렬을 실시하였다. 도 7은 유전자 정렬 결과를 도시하는 도면이다. 도 7의 유전자 정렬은 heatmap 분석이라고도 불린다. Heatmap 분석은 열을 뜻하는 히트(heat)와 지도를 뜻하는 맵(map)을 결합시킨 용어로서, 색으로 표현할 수 있는 다양한 정보를 이미지 위에 열분포 형태의 도면으로 나타내는 분석 방법이다. 본 명세서에 기재한 heatmap 분석에서는 빨간색으로 나타낼수록 유전자의 발현값이 커지는 것을 의미하고, 파란색으로 나타낼수록 유전자의 발현값이 작아지는 것을 의미한다. 도 7에서는 수 백가지의 유전자를 분석했을 때, 시험군과 대조군에서 다수의 유전자의 발현값이 특이적으로 차이가 나는 것을 확인하였다.

그 이후, 본 발명자들은 문헌조사를 통해 홍조성 민감피부와 관련된 유전자를 선별하였다(도 8). 본 발명자들은 상기 문헌조사를 통해 홍조성 민감피부와 관련된 것으로 확인된 유전자들의 microarray 시험을 실시하였다. 그 결과 확인된 유전자 발현에 관한 수치를 도 8의 표에 정리하였다.

홍조성 민감도가 높은 시험군과 그렇지 않은 대조군에 있어서 microarray를 실시함으로써 얻어진 유전자 발현에 관한 수치값에 차별성이 존재하여야 홍조성 민감피부에 관한 바이오마커로서 유용할 것이다. 이를 판단하기 위하여 본 발명자들은 fold change와 p-value를 사용하였다. Fold change는 시험군에서의 측정 수치가 대조군에서의 측정 수치에 비해 몇 배나 높아졌거나 낮아졌는지를 보여주는 값이고, p-value는 통계처리에 있어서 시험군과 대조군 사이의 값이 통계적으로 유의한 차이를 보이는지에 대한 값이다. RNA microarray 시험을 통해 얻은 각 샘플의 normalized signal 값(발현값)을 도 8의 표에 표시하였으며, fold change는 시험군과 대조군 간 normalized signal 값을 사용하여 1:1 발현 차를 계산한 값이다. p-value는 데이터가 귀무가설과 양립하는 정도를 0에서 1사이의 값으로 표현한 것으로 대개 0.05보다 작을 경우 귀무가설을 기각함을 의미한다.

결과적으로 홍조성 민감피부 관련 유전자 중 fold change가 1.2배 혹은 -1.2배 이상이거나 p-value가 0.05 이하인 유전자는 COL3A1, TAC1, KLK5, CAMP, MMP9, TRPA1, IL13RA1, HSD3B1, CXCR4, ANGPT2, CXCL2, CXCR5 및 PSMB9로 확인되었다.

도 9는 상술한 바와 같은 RNA microarray 분석을 통해 선정된 홍조성 민감피부 바이오마커 후보들의 발현 정도를 시각적으로 비교분석하기 위해 heatmap 분석을 진행한 결과를 보여준다. 도 7의 경우와 동일하게 도 9의 heatmap 분석 결과에서도 빨간색으로 나타낼수록 유전자의 발현값이 커지는 것을 의미하고, 파란색으로 나타낼수록 유전자의 발현값이 작아지는 것을 의미한다.

상기의 RNA microarray 분석을 통해 선정된 홍조성 민감피부 관련 바이오마커 후보인 COL3A1, TAC1, KLK5, CAMP, MMP9, TRPA1, IL13RA1, HSD3B1, CXCR4, ANGPT2, CXCL2, CXCR5 및 PSMB9 유전자와 인체적용기기(Mexameter, Spectrophotometer) 측정 결과와의 상관관계를 확인하기위해 이변량 상관분석을 시행하였다. 그 결과가 도 10 내지 도 12에 도시된다.

도 10은 홍조성 민감피부 바이오마커 후보 유전자와 인체적용기기와의 상관관계 수치를 정리한 표이다.

도 11은 Mexameter 측정값과 유의한 상관관계를 가지는 유전자들의 산점도를 도시한다. 도 11의 결과로부터 알 수 있듯이, TAC1, CAMP 및 MMP9 유전자가 피부 홍반량(Mexameter)과 통계적으로 유의한 양의 상관관계를 나타냄을 확인하였다.

도 12는 Spectrophotometer 측정값과 유의한 상관관계를 가지는 유전자들의 산점도를 도시한다. 도 12의 결과로부터 알 수 있듯이, TAC1, MMP9 및 ANGPT2 유전자가 피부 적색도(Spectrophotometer, a* value)와 통계적으로 유의한 양의 상관관계를 나타냄을 확인하였다.

상술한 바와 같은 본 발명자들이 수행한 홍조성 민감피부 평가 실험 결과를 종합적으로 분석하였을 때, 홍조성 민감피부 바이오마커를 가장 넓은 범위로 잡는 경우, COL3A1, TAC1, KLK5, CAMP, MMP9, TRPA1, IL13RA1, HSD3B1, CXCR4, ANGPT2, CXCL2, CXCR5 및 PSMB9, 총 13가지의 유전자를 선정할 수 있다. 이러한 선정 결과를 활용하면, 상기 13가지 RNA 유전자 중 어느 것 하나 또는 둘 이상의 유전자를 바이오마커로 삼아 홍조성 민감피부의 평가를 정량적으로 수행할 수 있을 것이다. 나아가, 이상의 본 발명자들의 연구 결과는 홍조성 민감피부 평가 방법 또는 평가 키트의 개발, 홍조성 민감피부 유도 또는 억제 물질의 개발과 스크리닝, 개개인에 대한 피부 유형 정보 제공, 맞춤형 화장품 개발 및 동물 실험 대체 홍조성 민감피부 유효성 평가에 있어서 매우 유용한 툴을 제공할 수 있을 것으로 기대된다.

이상의 실시예에서 대상체의 피부로부터 마이크로니들을 사용하여 추출한 피부 가검물로부터 RNA를 추출하고, 이를 RNA microarray 정량 분석장비에 제공하여 RNA 유전자별 발현정도를 정량화하는 방식에 대하여 설명하였다. 그런데, 본 발명은 이러한 특정 정량화 방식에 국한되는 것으로 제한해석 되어서는 아니된다. 대상체의 피부 가검물을 사용하여 RNA 발현 정도를 정량화 할 수 있는 방식이면 모두 본 발명의 범주에 속하는 것으로 이해되어야 한다. 예컨대 ELISA 방식 등 단백질 수준에서의 측정 방식이 적용될 수 있다. 해당 RNA 바이오마커가 발현되어 생성되는 것으로 단백질의 종류를 특정하고 이 단백질의 정량화로써 RNA 유전자별 발현정도가 정량화 될 수 있을 것이다. 즉, 본 발명의 실행에 있어서 사용되는 정량화 장비 또는 키트는 ELISA, RT-PCR 키트, RNA 칩, DNA 칩 또는 단백질 칩 키트일 수 있다. 상기 단백질 수준의 측정은 ELISA, 웨스턴블랏팅, 자석비드-항체면역침강법, 면역화학조직염색 및 질량분석기 중에서 선택된 하나 이상의 방식에 의할 수 있다. 또한, 상기 mRNA 수준의 측정은 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR (competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR (Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법 (RPA: RNase Protection Assay), 노던블랏팅 (Northern blotting) 및 DNA 칩 중에서 선택된 하나 이상의 방식에 의할 수 있다.

이상에서 본 발명이 구체적인 구성요소 등과 같은 특정 사항들과 한정된 실시예 및 도면에 의해 설명되었으나, 이는 본 발명의 보다 전반적인 이해를 돕기 위해서 제공된 것일 뿐, 본 발명이 상기 실시예들에 한정되는 것은 아니며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적인 지식을 가진 자라면 이러한 기재로부터 다양한 수정 및 변형을 꾀할 수 있다.

따라서, 본 발명의 사상은 상기 설명된 실시예에 국한되어 정해져서는 아니 되며, 후술하는 특허청구범위뿐만 아니라 이 특허청구범위와 균등하게 또는 등가적으로 변형된 모든 것들은 본 발명의 사상의 범주에 속한다고 할 것이다.

Claims (8)

1. 대상체의 피부로부터 추출된 가검물로부터 RNA 유전자의 발현 정도를 정량화 할 수 있는 장비와,
   생분해성 고분자 히알루론산으로 이루어지고 중실 구조인 복수개의 마이크로니들을 포함하는 마이크로니들 패치를 포함하고,
   상기 마이크로니들 패치가 대상체의 피부에 적용되고, 소정 시간 유지 후 분리된 상태에서, 상기 마이크로니들 패치의 마이크로니들 표면에 흡착된 대상체 피부로부터의 가검물 또는 이로부터의 추출물이 상기 장비에 의해 정량 분석되고, 상기 장비는 상기 마이크로니들 패치의 마이크로니들 표면에 흡착된 대상체 피부로부터의 가검물 또는 이로부터의 추출물로부터 홍조성 민감피부 관련 RNA 바이오마커 유전자의 발현 정도를 정량화 하고, 상기 정량화 값을 기초로 홍조성 민감피부의 평가가 이루어지고,
   상기 홍조성 민감피부 관련 바이오마커는 MMP9, TAC1 및 CAMP인,
   최소 침습적 홍조성 민감피부 평가키트.
2. 삭제
3. 제1항에 있어서, 대상체 피부로부터의 가검물로부터 RNA를 추출하는 장비를 더 포함하고, 상기 RNA 추출 장비에 의하여 획득한 RNA가 상기 정량화 장비에 제공되는,
   최소 침습적 홍조성 민감피부 평가 키트.
4. 제3항에 있어서, 상기 정량화 장비는 RNA microarray 키트인,
   최소 침습적 홍조성 민감피부 평가 키트.
5. 제4항에 있어서, 상기 소정 시간은 히알루론산의 분자량에 따른 용해속도를 고려하여 사전에 결정되는 것을 특징으로 하는,
   최소 침습적 홍조성 민감피부 평가 키트.
6. 제5항에 있어서, 상기 마이크로니들을 구성하는 히알루론산의 분자량이 커질수록 생체 검출 성능이 향상되는,
   최소 침습적 홍조성 민감피부 평가 키트.
7. 삭제
8. 삭제

Images