KR20090123049A - 민감성 피부 진단용 바이오 마커 및 이를 이용한 진단 키트 - Google Patents

민감성 피부 진단용 바이오 마커 및 이를 이용한 진단 키트 Download PDF

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Abstract

민감성 피부에 대해서 특이적으로 유전자 발현량이 증가 또는 억제되는 바이오 마커가 개시된다. 상기 민감성 피부에 특이적인 바이오 마커를 이용하여 민감성 피부 진단 키트 및 자극감 완화제의 스크리닝 방법 등에 활용할 수 있다.
민감성 피부, 자극감, 바이오 마커, 진단 키트, 완화제 스크리닝, 유전자 발현

Description

민감성 피부 진단용 바이오 마커 및 이를 이용한 진단 키트 {Biomarker for prediction of sensitive skin and test kit using the same}
본 발명은 민감성 피부 진단용 바이오 마커 및 이를 이용한 민감성 피부 진단 키트에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 민감성 피부에 대한 자극감을 효과적으로 완화시키는 완화제를 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.
사람의 유전체는 3 x 109개의 염기쌍으로 이루어져 있으며, 대략 5 만 개의 유전자를 가지고 있는 것으로 추정되고, 하나의 세포에서 발현되는 기능성 유전자의 개수는 대략 10,000개 정도로 예측된다. 즉, 50,000개의 유전자로부터 약 10,000개의 단백질만을 선택적으로 만들어내고 있으며, 어떤 단백질을 발현하느냐에 따라 그 세포의 기능적 특성이 결정된다. 또한, 세포의 유전자 발현 특성의 차이는 단지 서로 다른 세포 간에서만 나타나는 것이 아니며, 동일한 세포의 병적인 상황, 예를 들면, 젊은 세포와 노화된 세포 간에도 유전자 발현 특성의 차이가 나 타난다.
생명과학분야에서, 종래에는, 이러한 유전자 발현의 변화를 일대일의 관계로부터 찾고자 하였다. 그러나, 특정 단백질의 작용은, 하나의 단백질에만 국한되는 것이 아니라, 다양한 단백질의 발현에 관여하게 된다. 즉, 세포의 특성은 특정 단백질 하나에 의하여 결정되는 것이 아니라 다양한 단백질들의 특성이 총체적으로 조화를 통해 결정된다는 점에서, 종래의 접근 방식은 매우 제한적일 수밖에 없었다.
민감성 피부는 UV, ROS 등과 같은 외부 자극 뿐만 아니라 유전자, 단백질 등과 같은 세포 내에 내재하는 인자 간의 상호작용에 의해 결정되므로 이런 여러 인자들을 아울러 관찰할 필요가 있다.
그러나, 지금까지의 민감성 피부에 대한 연구는 인위적으로 자극감을 유발하는 물질을 피부에 처치하고, 이에 대한 피험자의 주관적인 반응을 관찰하거나, 설문 등을 통해 평소 외부 요인에 의한 피부 변화 등을 분석, 관찰하는 것이었다. 따라서, 민감성 피부의 원인 또는 실체에 대해서 객관적으로 이해하는 데에는 한계가 있었다.
또한, 사람들이 말하는 민감성 피부의 여러 현상과 실제 피부 상태와의 관계가 명확하지 않기 때문에, 민감성 피부라는 개념 자체가 충분히 객관화되지 못한 실정이었다. 더욱이, 민감성 피부의 특성을 이해하기 위한 시도 역시 효능이 예상되는 물질 혹은 여러 종류의 자극감 유발 물질을 처리하여 인체에서의 현상을 파악하거나, 세포에 처리하여, 신경과 관련된 물질에 대해 알아보는 연구에 국한되어 있다는 한계를 안고 있다.
민감성 피부에 대해서는 대부분 외적, 내적 요인에 의해 피부 생리 기능의 저하 또는 이상이 발생하여 다양한 피부 증상이 나타나는 것으로 풀이하고 있다. 일반적으로, 민감성 피부의 원인으로는, 감각신경의 자극(neurosensory input) 증가, 면역 반응성 상승 또는 장벽 기능(barrier function)의 저하 등을 꼽을 수 있으며, 상기 장벽 기능의 저하는 다른 두 요인에 의해 유발된다고 한다. 민감성 피부는 다양한 여러 피부 증상으로 나타나지만, 그 중에서도 피부에서 느끼는 여러 가지 불쾌한 감각(자극감)을 상대적으로 크게 혹은 자주 느끼는 것이 가장 두드러지는 현상이라고 알려져 있다.
민감성 피부의 두드러진 특징을 “자극감”이라고 할 때, 사람들의 피부를 크게 민감성과 비민감성을 나눌 수 있다. 이러한 차이는, 피부 신경의 분포나 개수, 감도의 차이 또는 장벽 기능의 차이에 의한 경우가 많다. 피부에서 자극감에 관계되는 것으로 추정되는 신경섬유는 Aδ와 C 섬유(fiber)이며, 이는 따가움, 화끈거림 등 피부에서 약한 불쾌감을 느끼는데 관여한다고 알려져 있다. 또한, 장벽 기능의 저하도 많은 민감성 피부에서 관찰되는 특징 중 하나로서, 자극감 외에 민감성 피부에서 흔히 관찰할 수 있는 홍조, 알레르기 또는 자극 등과 연관지어 볼 수 있는 특성이다.
화장품 또는 피부과 분야에서, 민감성 피부로 분류할 수 있는 사람들이 증가하는 추세이고, 이에 대한 원인 규명에 대한 중요성이 부각되고 있다. 그럼에도 불구하고, 앞서 언급한 현상적인 연구 외에는 충분한 연구가 진행되지 못하고 있으 며, 특히, 민감성 피부가 선천적인 요인에 의한 것인지 후천적인 요인에 의한 것인지 또는 어떤 기전에 의하여 유발되는 것인가에 대한 연구가 매우 미흡할 실정이다. 또한 피험자 자신의 판단이나 주관적 감각에 대한 테스트 결과만으로 민감성 피부를 설명하기에는 객관성이 부족할 뿐만 아니라, 민감성 피부의 분류 또는 그 학술적 의미를 설명하는데 한계가 있다.
더불어, 민감성 피부에 대한 여러 연구들에서, 민감성 피부에 대한 가족력의 가능성이 나타나고 있으며, 그로부터, 민감성 피부가 선천적 혹인 유전적일 가능성을 시사하고 있다. 또한, 피부가 특정시기에 민감해지는 경우도 관찰되고 있으므로, 어떤 대사의 변화 내지 유전자 발현의 변화가 영향을 주는 것으로 여겨지고 있다.
본 발명의 일실시예의 목적은 민감성 피부 진단용 바이오 마커를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 일실시예의 목적은 민감성 피부 진단 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 일실시예의 목적은 민감성 피부에 대한 자극감 완화제를 스크리닝하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명에 따른 민감성 피부 진단용 바이오 마커는, HLA-C, TCEA1, IGHA1, TFRC, S100A8, LOC652128, SERPINB13, EHF, FLJ10781, TP63, CDH1, TNFRSF19, GM2A, FKBP5, PI3, PSPH, HORMAD1, SPRR2G 및 ACTR2 이루어진 군 또는 KBTBD10, TTN, ACTA1, MYBPC1, MB, MYOZ1, TPM1, CA3, CASQ1, ENO3, RBP4, GYG2, PPP1R1A, PYGM, G0S2, NEB, H19, LIPE, PLIN, H19, GPAM, FABP4, CIDEC, LPL, PCK1, ADIPOQ, PDE3B, ACVR1C, LPL, FABP4, DKFZP761N09121, TNMD, ATP6V1B1, C8orf22 및 CRISP3로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자를 포함하며, 상기 유전자의 발현량이 민감성 피부에서 정상치에 비해 증가 또는 감소하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 민감성 피부 진단용 바이오 마커는, 생물정보학 기술을 이용하여 피부의 민감성 여부를 빠르게 진단할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 민감성 피부 진단용 바이오 마커와 이를 이용한 민감성 피부 진단 키트 및 자극감 완화제의 스크리닝 방법 등은 미용 및 피부 관련 의학 분야 등에서 다양하게 활용이 가능하다.
본 발명은 민감성 피부로부터 유래한 피부조직에서 비민감성 정상치에 비하여 발현이 증가되는 19 종의 유전자와 발현이 감소되는 35 종의 유전자를 발굴하였다. 따라서, 상기 유전자들의 발현 정도를 측정함으로써, 민감성 피부인지 여부를 판단할 수 있게 된다.
하기 표 1에서는 민감성 피부로 판단되는 피험자의 피부에서 정상치에 비하여 발현이 증가되는 유전자를 나타내었으며, 하기 표 2에는 발현이 감소되는 유전자를 나타내었다. 참고로, 하기 표에서 GBAcc는 NCBI의 genebank의 accession ID를 의미한다.
GBAcc 유전자 이름 공식유전자심볼
XR_015693 Major histocompatibility complex, class I, C HLA-C
BX538034 Transcription elongation factor A (SII), 1 TCEA1
AK128652 Immunoglobulin heavy constant alpha 1 IGHA1
BC001188 Transferrin receptor (p90, CD71) TFRC
BG739729 S100 calcium binding protein A8 S100A8
BU838441 Similar to Ig heavy chain V-II region ARH-77 precursor LOC652128
AJ001696 Serpin peptidase inhibitor, clade B (ovalbumin), member 13 SERPINB13
NM_012153 Ets homologous factor EHF
BC032508 Hypothetical protein FLJ10781 FLJ10781
NM_003722 Tumor protein p63 TP63
NM_004360 Cadherin 1, type 1, E-cadherin (epithelial) CDH1
NM_148957 Tumor necrosis factor receptor superfamily, member 19 TNFRSF19
AK127910 GM2 ganglioside activator GM2A
AB209893 FK506 binding protein 5 FKBP5
CF596521 Peptidase inhibitor 3, skin-derived (SKALP) PI3
BX537439 Phosphoserine phosphatase PSPH
BC047406 HORMA domain containing 1 HORMAD1
BG200844 Small proline-rich protein 2G SPRR2G
BM466590 ARP2 actin-related protein 2 homolog (yeast) ACTR2
GBAcc 유전자 이름 공식유전자심볼
NM_006063 Kelch repeat and BTB (POZ) domain containing 10 KBTBD10
NM_133378 Titin TTN
BC012597 Actin, alpha 1, skeletal muscle ACTA1
BX649073 Myosin binding protein C, slow type MYBPC1
BF670653 Myoglobin MB
NM_021245 Myozenin 1 MYOZ1
BX648171 Tropomyosin 1 (alpha) TPM1
NM_005181 Carbonic anhydrase III, muscle specific CA3
NM_001231 Calsequestrin 1 (fast-twitch, skeletal muscle) CASQ1
NM_001976 Enolase 3 (beta, muscle) ENO3
BQ064708 Retinol binding protein 4, plasma RBP4
NM_003918 Glycogenin 2 GYG2
AK123969 Protein phosphatase 1, regulatory (inhibitor) subunit 1A PPP1R1A
NM_005609 Phosphorylase, glycogen; muscle (McArdle syndrome, glycogen storage disease type V) PYGM
CD511787 G0/G1switch 2 G0S2
NM_004543 Nebulin NEB
BC040073 H19, imprinted maternally expressed untranslated mRNA H19
BC070041 Lipase, hormone-sensitive LIPE
BC031084 Perilipin PLIN
BC040073 H19, imprinted maternally expressed untranslated mRNA H19
AL833061 Glycerol-3-phosphate acyltransferase, mitochondrial GPAM
CB999901 Fatty acid binding protein 4, adipocyte FABP4
NM_022094 Cell death-inducing DFFA-like effector c CIDEC
NM_000237 Lipoprotein lipase LPL
BX648510 Phosphoenolpyruvate carboxykinase 1 (soluble) PCK1
NM_004797 Adiponectin, C1Q and collagen domain containing ADIPOQ
AB209326 Phosphodiesterase 3B, cGMP-inhibited PDE3B
BC022530 Activin A receptor, type IC ACVR1C
NM_000237 Lipoprotein lipase LPL
CB999901 Fatty acid binding protein 4, adipocyte FABP4
AK123640 Hypothetical protein DKFZp761N09121 DKFZP761N09121
BC034030 Tenomodulin TNMD
BC063411 ATPase, H+ transporting, lysosomal 56/58kDa, V1 subunit B1 (Renal tubular acidosis with deafness) ATP6V1B1
AJ276240 Chromosome 8 open reading frame 22 C8orf22
X94323 Cysteine-rich secretory protein 3 CRISP3
하나의 실시예에 따른 민감성 피부 진단용 바이오 마커는, 상기 표 1의 유전자인, HLA-C, TCEA1, IGHA1, TFRC, S100A8, LOC652128, SERPINB13, EHF, FLJ10781, TP63, CDH1, TNFRSF19, GM2A, FKBP5, PI3, PSPH, HORMAD1, SPRR2G 및 ACTR2 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자를 포함하며, 상기 유전자의 발현량이 민감성 피부에서 정상치에 비해 증가하는 것을 특징으로 한다. 상기 유전자의 발현량은 민감성 피부에서 정상치에 비해 2 배 이상 증가되는 것이 바람직하다.
또 다른 실시예에 따른 민감성 피부 진단용 바이오 마커는, 상기 표 2의 유전자인, KBTBD10, TTN, ACTA1, MYBPC1, MB, MYOZ1, TPM1, CA3, CASQ1, ENO3, RBP4, GYG2, PPP1R1A, PYGM, G0S2, NEB, H19, LIPE, PLIN, H19, GPAM, FABP4, CIDEC, LPL, PCK1, ADIPOQ, PDE3B, ACVR1C, LPL, FABP4, DKFZP761N09121, TNMD, ATP6V1B1, C8orf22 및 CRISP3로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자를 포함하며, 상기 유전자의 발현량이 민감성 피부에서 정상치에 비해 감소되는 것을 특징으로 한다. 상기 유전자의 발현량은 민감성 피부에서 정상치에 비해 50% 이하로 감소되는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명은 상기 표 1 또는 2의 유전자로부터 코딩된 단백질을 이용한 민감성 피부 진단용 바이오 마커를 제공한다.
하나의 실시예에 따른 민감성 피부 진단용 바이오 마커는, HLA-C, TCEA1, IGHA1, TFRC, S100A8, LOC652128, SERPINB13, EHF, FLJ10781, TP63, CDH1, TNFRSF19, GM2A, FKBP5, PI3, PSPH, HORMAD1, SPRR2G 및 ACTR2 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자로부터 코딩된 단백질을 포함하며, 상기 단백질의 양이 민감성 피부에서 정상치에 비해 증가하는 것을 특징으로 한다.
또 다른 실시예에 따른 민감성 피부 진단용 바이오 마커는, KBTBD10, TTN, ACTA1, MYBPC1, MB, MYOZ1, TPM1, CA3, CASQ1, ENO3, RBP4, GYG2, PPP1R1A, PYGM, G0S2, NEB, H19, LIPE, PLIN, H19, GPAM, FABP4, CIDEC, LPL, PCK1, ADIPOQ, PDE3B, ACVR1C, LPL, FABP4, DKFZP761N09121, TNMD, ATP6V1B1, C8orf22 및 CRISP3로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자로부터 코딩된 단백질을 포함하며, 상기 단백질의 양이 민감성 피부에서 정상치에 비해 감소되는 것을 특징으로 한다.
본 발명은 또한 상기 표 1 또는 2의 유전자의 폴리뉴클레오티드를 이용하여 민감성 피부를 진단하는 민감성 피부 진단 키트를 제공한다.
하나의 실시예에 따른 상기 민감성 피부 진단 키트는, HLA-C, TCEA1, IGHA1, TFRC, S100A8, LOC652128, SERPINB13, EHF, FLJ10781, TP63, CDH1, TNFRSF19, GM2A, FKBP5, PI3, PSPH, HORMAD1, SPRR2G 및 ACTR2 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자의 폴리뉴클레오티드 또는 그 단편으로서, 상기 단편은 10개 이상의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드, 또는 상기 폴리뉴클레오티드 및 그 단편에 상보적인 폴리뉴클레오티드; 및 상기 폴리뉴클레오티드를 표면에 결합시킨 고상 지지체를 포함하며, 상기 폴리뉴클레오티드에 혼성화된 전사체의 양이 정상치에 비해 증가하면 민감성 피부인 것으로 진단하는 것을 특징으로 한다.
또 다른 하나의 실시예에 따른 상기 민감성 피부 진단 키트는, KBTBD10, TTN, ACTA1, MYBPC1, MB, MYOZ1, TPM1, CA3, CASQ1, ENO3, RBP4, GYG2, PPP1R1A, PYGM, G0S2, NEB, H19, LIPE, PLIN, H19, GPAM, FABP4, CIDEC, LPL, PCK1, ADIPOQ, PDE3B, ACVR1C, LPL, FABP4, DKFZP761N09121, TNMD, ATP6V1B1, C8orf22 및 CRISP3로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자의 폴리뉴클레오티드 또는 그 단편으로서, 상기 단편은 10개 이상의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드, 또는 상기 폴리뉴클레오티드 및 그 단편에 상보적인 폴리뉴클레오티드; 및 상기 폴리뉴클레오티드를 표면에 결합시킨 고상 지지체를 포함하며, 상기 폴리뉴클레오티드에 혼성화된 전사체의 양이 정상치에 비해 감소되면 민감성 피부인 것으로 진단하는 것을 특징으로 한다.
상기 민감성 피부 진단 키트에서, 프로브로 사용되는 폴리뉴클레오티드는 비민감성 피부에 비하여 민감성 피부에서 발현이 증가하거나 감소하는 마커 유전자의 전장(full length) 또는 그 단편을 포함한다. 상기 단편의 길이는 10 개 이상의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 것이 바람직하다. 이는 프로브의 길이가 10 bps 미만이면 비특이적으로 결합되기 때문이다.
본 발명에 따른 하나의 실시예에 따른 상기 민감성 피부 진단 키트는, HLA-C, TCEA1, IGHA1, TFRC, S100A8, LOC652128, SERPINB13, EHF, FLJ10781, TP63, CDH1, TNFRSF19, GM2A, FKBP5, PI3, PSPH, HORMAD1, SPRR2G 및 ACTR2로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자의 폴리뉴클레오티드의 단편으로서 18 ~ 22 개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드; 및 상기 유전자의 폴리뉴클레오티드에 상보적인 폴리뉴클레오티드의 단편으로서 18 ~ 22 개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 상기 폴리뉴클레오티드들을 프라이머로 하여 증폭된 DNA 양이 정상치에 비해 증가하면 민감성 피부인 것으로 진단하는 것을 특징으로 한다.
또 하나의 실시예에 따른 상기 민감성 피부 진단 키트는, 유전자는 KBTBD10, TTN, ACTA1, MYBPC1, MB, MYOZ1, TPM1, CA3, CASQ1, ENO3, RBP4, GYG2, PPP1R1A, PYGM, G0S2, NEB, H19, LIPE, PLIN, H19, GPAM, FABP4, CIDEC, LPL, PCK1, ADIPOQ, PDE3B, ACVR1C, LPL, FABP4, DKFZP761N09121, TNMD, ATP6V1B1, C8orf22 및 CRISP3로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자의 폴리뉴클레오티드의 단편으로서 18 ~ 22 개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드; 및 상기 유전자의 폴리뉴클레오티드에 상보적인 폴리뉴클레오티드의 단편으로서 18 ~ 22 개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 상기 폴리뉴클레오티드들을 프라이머로 하여 증폭된 DNA 양이 정상치에 비해 감소하면 민감성 피부인 것으로 진단하는 것을 특징으로 한다.
상기 폴리뉴클레오티드를 이용한 민감성 피부 진단 키트에서, 프라이머로 사용되는 폴리뉴클레오티드는 그 길이가 18 ~ 22 개인 것이 바람직하다. 이는, 프라이머의 길이가 18 bps 미만이면 비특이적으로 결합되고, 22 bps 초과이면 프라이머끼리 자체 결합하는 문제가 발생하고 비용 및 생산성 측면에서 효율성이 저하되기 때문이다.
또한, 본 발명은 상기 표 1 또는 2의 유전자에 의해 코딩되는 폴리펩티드에 대한 모노클로날 항체를 포함하는 민감성 피부 진단 키트를 제공한다.
하나의 실시예에서, 상기 민감성 피부 진단 키트는, HLA-C, TCEA1, IGHA1, TFRC, S100A8, LOC652128, SERPINB13, EHF, FLJ10781, TP63, CDH1, TNFRSF19, GM2A, FKBP5, PI3, PSPH, HORMAD1, SPRR2G 및 ACTR2로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자에 의해 코딩되는 폴리펩티드에 대한 모노클로날 항체를 포함하며, 상기 항체에 결합된 항원의 양이 정상치에 비해 증가하면 민감성 피부인 것으로 진단하는 것을 특징으로 한다.
또 하나의 실시예에서, 상기 민감성 피부 진단 키트는, KBTBD10, TTN, ACTA1, MYBPC1, MB, MYOZ1, TPM1, CA3, CASQ1, ENO3, RBP4, GYG2, PPP1R1A, PYGM, G0S2, NEB, H19, LIPE, PLIN, H19, GPAM, FABP4, CIDEC, LPL, PCK1, ADIPOQ, PDE3B, ACVR1C, LPL, FABP4, DKFZP761N09121, TNMD, ATP6V1B1, C8orf22 및 CRISP3로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자에 의해 코딩되는 폴리펩티드에 대한 모노클로날 항체를 포함하며, 상기 항체에 결합된 항원의 양이 정상치에 비해 감소되면 민감성 피부인 것으로 진단하는 것을 특징으로 한다.
본 발명은 또한 상기 표 1 또는 2의 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 이용하여 자극감 완화제를 스크리닝하는 방법을 제공한다.
하나의 실시예에서, 상기 자극감 완화제의 스크리닝 방법은, HLA-C, TCEA1, IGHA1, TFRC, S100A8, LOC652128, SERPINB13, EHF, FLJ10781, TP63, CDH1, TNFRSF19, GM2A, FKBP5, PI3, PSPH, HORMAD1, SPRR2G 및 ACTR2로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자에 의해 코딩되는 단백질에 시험물질을 결합시키는 단계; 및 상기 시험물질이 단백질의 작용을 억제하는지를 확인하는 단계를 포함한다.
또 하나의 실시예에서, 상기 자극감 완화제의 스크리닝 방법은, KBTBD10, TTN, ACTA1, MYBPC1, MB, MYOZ1, TPM1, CA3, CASQ1, ENO3, RBP4, GYG2, PPP1R1A, PYGM, G0S2, NEB, H19, LIPE, PLIN, H19, GPAM, FABP4, CIDEC, LPL, PCK1, ADIPOQ, PDE3B, ACVR1C, LPL, FABP4, DKFZP761N09121, TNMD, ATP6V1B1, C8orf22 및 CRISP3로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자에 의해 코딩되는 단백질에 시험물질을 결합시키는 단계; 및 상기 시험물질이 단백질의 작용을 증진시키는지를 확인하는 단계를 포함한다.
또한, 본 발명은 상기 유전자로부터 추출되는 전사인자 유전자를 이용하여 자극감 완화제를 스크리닝하는 방법을 제공한다.
하나의 실시예에서, 상기 자극감 완화제의 스크리닝 방법은, NFYA, MYOG 및 ATF4로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 전사인자 유전자 및 프로모터를 포함하는 제 1 플라스미드, 및 상기 전사인자가 결합하는 DNA 서열 및 리포터 유전자를 포함하는 제 2 플라스미드를 세포에 트랜스펙션시키는 단계, 상기 세포에 시험물질을 처리하는 단계, 및 상기 시험물질이 리포터 유전자의 발현을 억제하는지를 확인하는 단계를 포함한다.
또 하나의 실시예에서, 상기 자극감 완화제의 스크리닝 방법은, NFKB1, SRF, RELA, TCF3, POU2F1, USF 및 JUN로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 전사인자 유전자 및 프로모터를 포함하는 제 1 플라스미드, 및 상기 전사인자가 결합하는 DNA 서열 및 리포터 유전자를 포함하는 제 2 플라스미드를 세포에 트랜스펙션시키는 단계, 상기 세포에 시험물질을 처리하는 단계, 및 상기 시험물질이 리포터 유전자의 발현을 증가시키는지를 확인하는 단계를 포함한다.
하기 표 3 및 4에는, 민감성 피부에서 발현이 증가하는 유전자의 프로모터에 과다 관찰되는 전사인자(표 3)와 발현이 감소되는 유전자의 프로모터에서 과다 관찰되는 전사인자(표 4)들을 나타내었다.
GBAcc 유전자 이름 공식유전자심볼
NM_007122 CCAAT box/V$CAAT_01 CEBPB
NM_002505 NF-Y/V$NFY_Q6 NFYA
NM_002479 Myogenin / NF-1/V$MYOGNF1_01 MYOG
NM_001675 Tax/CREB/V$TAXCREB_02 ATF4　
GBAcc 유전자 이름 공식유전자심볼
NM_003998 NF-kappaB/V$NFKB_Q6 　NFKB1
NM_003131 SRF/V$SRF_Q6 SRF　
NM_021975 NF-kappaB (p65)/V$NFKAPPAB65_01 RELA　
NM_003200 E47/V$E47_02 TCF3
NM_000545 HNF-1/V$HNF1_C HNF1A
NM_002697 Oct-1/V$OCT1_05 POU2F1
AL832119 USF/V$USF_C USF
NM_007122 CCAAT box/V$CAAT_01 CEBPB
NM_002228 AP-1/V$AP1_Q2 JUN
상기 전사인자 유전자는, 민감성 피부에서 발현이 증가하는 유전자(표 1)의 프로모터에 과다 관찰되는 전사인자인 NFYA, MYOG 및 ATF4 등과, 발현이 감소하는 유전자(표 2)의 프로모터에 과다 관찰되는 전사인자인 NFKB1, SRF, RELA, TCF3, POU2F1, USF 및 JUN 등이 있다. 또한, 발현이 증가되는 유전자와 감소되는 유전자에서 동시에 과다 관찰되는 전사인자로는 CEBPB를 들 수 있다. 상기 전사인자 유전자의 전사조절 활성을 측정하여 자극감 억제제를 스크리닝하는 방법은, 종래의 분자생물학 기법에 따라 제조된 리포터 유전자 벡터를 이용하여, 실시가 가능하다.
상기 전사인자 유전자를 이용하여 자극감 완화제를 스크리닝하는 방법에 대하여 좀더 구체적으로 살펴보면, 다음과 같다.
일반적인 배양 조건에서도 발현되는 유니버셜 프로모터에 상기 표 3 또는 4의 유전자가 결합된 제 1 플라스미드, 및 상기 전사인자들이 결합하여 전사를 활성화시킬 수 있는 DNA(Transcription Response Element)를 가지는 프로모터에 리포터 역할을 하는 반딧불(firefly) 루시퍼라제(luciferase) 유전자가 결합된 제 2 플라스미드를 사용할 수 있다.
상기 제 2 플라스미드의 TRE 서열은, Matlnspector(Quandt et al., 1995) 및 Transfac(Knuppel et al., 1994)과 같은, 모티프(motif)를 예측, 발견 및 분석하는 프로그램에 상기 표 1 및 2의 유전자들의 accession ID를 입력하여 서열을 검색할 수 있다. COS7 세포에 상기 전사인자 유전자를 지닌 제 1 플라스미드와 해당 TRE 프로모터-리포터 제 2 플라스미드를 동시에 트랜스펙션시킨 후, 24시간 경과 시점에 피부 자극감 억제제 후보 약물을 처리하고 세포를 수확하여 루시퍼라제 활성을 측정하게 된다. 이를 통해, 상기 후보 약물이 상기 전사인자의 활성에 미치는 영향을 확인할 수 있다.
민감성 피부에서 발현이 증가하는 유전자의 프로모터에서 과다 관찰되는 전사인자의 경우에는 세포의 루시퍼라제 활성이 감소했을 때 효과적인 피부 민감성 억제제라고 판단할 수 있다. 반대로, 발현이 감소하는 유전자의 프로모터에서 과다 관찰되는 전사인자의 경우에는 세포의 루시퍼라제 활성이 증가했을 때 효과적인 피부 민감성 억제제라고 할 수 있을 것이다. 또한, 발현이 증가, 감소하는 유전자의 프로모터에서 모두 과다 관찰되는 전사인자의 경우에는 보조적인 스크리닝 방법으로 활용될 수 있다.　　
도1과 2를 통해 본 발명을 더욱 상술하면 다음과 같다.
NCBI Accession No 기준으로 변화된 유전자의 프로모터 서열 수집하였다. Upstream 유전자 서열을 Ensembl 게놈 데이터 베이스로부터 확보한 후, 전사 개시 부위(transcription start site)로부터 2000 bp upstream 영역을 포함하는 게놈 서열을 확보하였다. MatInspector(Quandt et al., 1995)와 Transfac(Knuppel et al., 1994)같은 모티프(motif)를 예측, 발견, 분석하는 프로그램을 이용하여 전사인자 결합 부위(transcription factor binding site, TFBS)를 검색하였다. 검색 결과에 대하여, 하이퍼지오메트리 통계 방법으로, 과다 출현 혹은 과소 출현하는 전사인자 결합 부위를 선별하였다. 그런 다음, 발현 변화를 보이는 유전자 클러스터와 그 유전자 클러스터를 조절한 것으로 예측되는 전사인자 간의 조절 네트워크의 연결 고리를 추출하여, 그래프로 시각화 하였다. 도 1은 민감성 피부로부터 유래한 피부조직에서 비민감성 정상치에 비하여 발현이 증가되는 유전자에 대한 프로모터 분석을 한 결과이고, 도면 2는 민감성 피부로부터 유래한 피부조직에서 비민감성 정상치에 비하여 발현이 감소되는 유전자에 대한 프로모터 분석을 한 결과이다. 네트워크의 중심에 있는 것이 전사인자이고 주변에 있는 것이 그 전사인자의 조절을 받는 타겟 유전자이다.
이하, 실시예 등을 통해 본 발명을 더욱 상술하지만, 하기 실시예 등은 본 발명을 예시하기 위한 것이며, 본 발명의 범주가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.
[실시예 1] 민감성 피부 마커 유전자 확인
1-1. 조직 샘플의 확보 및 조직샘플로부터 RNA 채취
민감성 증상을 보이는 환자 9명와 대조군 환자 9명으로부터 피부 조직 샘플을 채취하였다. 조직 샘플들은 각각 생검하여 세트로 조직을 회수하였다. 조직으로부터 RNA를 정제하기 위해, 트리졸(trizol, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 첨가하여 세포를 분쇄시킨 후, 클로로포름을 넣어 상층액의 RNA를 분리하였다. 얻어진 상층액의 RNA를 농축하기 위해, 동량의 이소프로파놀을 넣고 원심분리한 후, 침전된 RNA를 얻었다. 침전된 RNA는 염기 제거를 위하여 70% 에탄올로 세척하였다.
1-2. 마이크로어레이 실험
총 54,675종의 인간 전사체(transcripts) 프로브가 집적된 유전자 칩 HG U133 Plus 2.0 (Affymetrix®)로 마이크로어레이 실험을 수행하였다. 피부 민감도에 따라 발현에 변화가 나타나는 유전자를 선택하고 그 발현 패턴을 확인하였다. 10 ug의 RNA를 cDNA 합성에 이용하여, in vitro 전사방법으로 비오틴화(Biotinylated) cRNA를 합성하였다.
구체적으로는, Affymetrix에서 제안하는 프로토콜을 따라, 먼저 T7 프라이머 및 역전사효소를 이용하여 RNA로부터 프로모터를 포함하는 cDNA를 합성하였다. 그런 다음, 이중 가닥의 cDNA를 원형으로 사용하여 in vitro 전사 반응을 수행하여 cRNA를 합성하였다. in vitro 전사 반응은, cRNA 증폭 및 표지화(labeling)를 위하여 T7 RNA 중합효소 및 비오틴화 리보뉴클레오티드 유사체를 이용하였다.
이렇게 제조된 비오틴화 cRNAs는 절편화(fragmentation) 된 후, 상기 유전자 칩에서 17 시간 동안 42℃에서 혼성화되었다. 상기 유전자 칩은 세척, 염색 후 스캐닝하였고, 데이터 전처리는 GenPlex 소프트웨어의 기본 정규화(normalization) 알고리즘인 Global scaling를 적용하였다.
그 결과, 민감성 피부 샘플과 대조군 샘플과의 유전자 발현에서 유의적 차이를 보이는 유전자군을 p-value와 유전자 발현 증가폭의 비교로 확보하였다.
유전자 발현 패턴을 기준으로, 발현이 감소된 유전자의 경우 50%이하로 감소한 유전자, 발현이 증가된 유전자의 경우 2배 이상 증가한 유전자를 선택하여 민감성 피부를 진단하는 데 활용될 수 있는 유전자 마커로서 추출하였다. 그 결과가 상기 표 1 및 2에 나열된 유전자들이다.
도 1은 민감성 피부로부터 유래한 피부조직에서 비민감성 정상치에 비하여 발현이 증가되는 유전자에 대한 프로모터 분석 결과이다.
도 2는 민감성 피부로부터 유래한 피부조직에서 비민감성 정상치에 비하여 발현이 감소되는 유전자에 대한 프로모터 분석 결과이다.

Claims (16)

  1. HLA-C, TCEA1, IGHA1, TFRC, S100A8, LOC652128, SERPINB13, EHF, FLJ10781, TP63, CDH1, TNFRSF19, GM2A, FKBP5, PI3, PSPH, HORMAD1, SPRR2G 및 ACTR2 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자를 포함하며,
    상기 유전자의 발현량이 민감성 피부에서 정상치에 비해 증가하는 것을 특징으로 하는 민감성 피부 진단용 바이오 마커.
  2. KBTBD10, TTN, ACTA1, MYBPC1, MB, MYOZ1, TPM1, CA3, CASQ1, ENO3, RBP4, GYG2, PPP1R1A, PYGM, G0S2, NEB, H19, LIPE, PLIN, H19, GPAM, FABP4, CIDEC, LPL, PCK1, ADIPOQ, PDE3B, ACVR1C, LPL, FABP4, DKFZP761N09121, TNMD, ATP6V1B1, C8orf22 및 CRISP3로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자를 포함하며,
    상기 유전자의 발현량이 민감성 피부에서 정상치에 비해 감소하는 것을 특징으로 하는 민감성 피부 진단용 바이오 마커.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 유전자의 발현량이 민감성 피부에서 정상치에 비해 2 배 이상 증가하는 것을 특징으로 하는 민감성 피부 진단용 바이오 마커.
  4. 제 2 항에 있어서,
    상기 유전자의 발현량이 민감성 피부에서 정상치에 비해 50% 이하로 감소하는 것을 특징으로 하는 민감성 피부 진단용 바이오 마커.
  5. HLA-C, TCEA1, IGHA1, TFRC, S100A8, LOC652128, SERPINB13, EHF, FLJ10781, TP63, CDH1, TNFRSF19, GM2A, FKBP5, PI3, PSPH, HORMAD1, SPRR2G 및 ACTR2 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자로부터 코딩된 단백질을 포함하며,
    상기 단백질의 양이 민감성 피부에서 정상치에 비해 증가하는 것을 특징으로 하는 민감성 피부 진단용 바이오 마커.
  6. KBTBD10, TTN, ACTA1, MYBPC1, MB, MYOZ1, TPM1, CA3, CASQ1, ENO3, RBP4, GYG2, PPP1R1A, PYGM, G0S2, NEB, H19, LIPE, PLIN, H19, GPAM, FABP4, CIDEC, LPL, PCK1, ADIPOQ, PDE3B, ACVR1C, LPL, FABP4, DKFZP761N09121, TNMD, ATP6V1B1, C8orf22 및 CRISP3로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자로부터 코딩된 단백질을 포함하며,
    상기 단백질의 양이 민감성 피부에서 정상치에 비해 감소되는 것을 특징으로 하는 민감성 피부 진단용 바이오 마커.
  7. HLA-C, TCEA1, IGHA1, TFRC, S100A8, LOC652128, SERPINB13, EHF, FLJ10781, TP63, CDH1, TNFRSF19, GM2A, FKBP5, PI3, PSPH, HORMAD1, SPRR2G 및 ACTR2 이루어 진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자의 폴리뉴클레오티드 또는 그 단편으로서,
    상기 단편은 10개 이상의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드,
    또는 상기 폴리뉴클레오티드 및 그 단편에 상보적인 폴리뉴클레오티드; 및
    상기 폴리뉴클레오티드를 표면에 결합시킨 고상 지지체를 포함하며,
    상기 폴리뉴클레오티드에 혼성화된 전사체의 양이 정상치에 비해 증가되면 민감성 피부인 것으로 진단하는 것을 특징으로 하는 민감성 피부 진단 키트.
  8. KBTBD10, TTN, ACTA1, MYBPC1, MB, MYOZ1, TPM1, CA3, CASQ1, ENO3, RBP4, GYG2, PPP1R1A, PYGM, G0S2, NEB, H19, LIPE, PLIN, H19, GPAM, FABP4, CIDEC, LPL, PCK1, ADIPOQ, PDE3B, ACVR1C, LPL, FABP4, DKFZP761N09121, TNMD, ATP6V1B1, C8orf22 및 CRISP3로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자의 폴리뉴클레오티드 또는 그 단편으로서,
    상기 단편은 10개 이상의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드,
    또는 상기 폴리뉴클레오티드 및 그 단편에 상보적인 폴리뉴클레오티드; 및
    상기 폴리뉴클레오티드를 표면에 결합시킨 고상 지지체를 포함하며,
    상기 폴리뉴클레오티드에 혼성화된 전사체의 양이 정상치에 비해 감소되면 민감성 피부인 것으로 진단하는 것을 특징으로 하는 민감성 피부 진단 키트.
  9. HLA-C, TCEA1, IGHA1, TFRC, S100A8, LOC652128, SERPINB13, EHF, FLJ10781, TP63, CDH1, TNFRSF19, GM2A, FKBP5, PI3, PSPH, HORMAD1, SPRR2G 및 ACTR2로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자의 폴리뉴클레오티드의 단편으로서 18 ~ 22 개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드; 및
    상기 유전자의 폴리뉴클레오티드에 상보적인 폴리뉴클레오티드의 단편으로서 18 ~ 22 개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하며,
    상기 폴리뉴클레오티드들을 프라이머로 하여 증폭된 DNA 양이 정상치에 비해 증가되면 민감성 피부인 것으로 진단하는 것을 특징으로 하는 민감성 피부 진단 키트.
  10. KBTBD10, TTN, ACTA1, MYBPC1, MB, MYOZ1, TPM1, CA3, CASQ1, ENO3, RBP4, GYG2, PPP1R1A, PYGM, G0S2, NEB, H19, LIPE, PLIN, H19, GPAM, FABP4, CIDEC, LPL, PCK1, ADIPOQ, PDE3B, ACVR1C, LPL, FABP4, DKFZP761N09121, TNMD, ATP6V1B1, C8orf22 및 CRISP3로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자의 폴리뉴클레오티드의 단편으로서 18 ~ 22 개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드; 및
    상기 유전자의 폴리뉴클레오티드에 상보적인 폴리뉴클레오티드의 단편으로서 18 ~ 22 개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함 하며,
    상기 폴리뉴클레오티드들을 프라이머로 하여 증폭된 DNA 양이 정상치에 비해 감소되면 민감성 피부인 것으로 진단하는 것을 특징으로 하는 민감성 피부 진단 키트.
  11. HLA-C, TCEA1, IGHA1, TFRC, S100A8, LOC652128, SERPINB13, EHF, FLJ10781, TP63, CDH1, TNFRSF19, GM2A, FKBP5, PI3, PSPH, HORMAD1, SPRR2G 및 ACTR2로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자에 의해 코딩되는 폴리펩티드에 대한 모노클로날 항체를 포함하며,
    상기 항체에 결합된 항원의 양이 정상치에 비해 증가되면 민감성 피부인 것으로 진단하는 것을 특징으로 하는 민감성 피부 진단 키트.
  12. KBTBD10, TTN, ACTA1, MYBPC1, MB, MYOZ1, TPM1, CA3, CASQ1, ENO3, RBP4, GYG2, PPP1R1A, PYGM, G0S2, NEB, H19, LIPE, PLIN, H19, GPAM, FABP4, CIDEC, LPL, PCK1, ADIPOQ, PDE3B, ACVR1C, LPL, FABP4, DKFZP761N09121, TNMD, ATP6V1B1, C8orf22 및 CRISP3로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자에 의해 코딩되는 폴리펩티드에 대한 모노클로날 항체를 포함하며,
    상기 항체에 결합된 항원의 양이 정상치에 비해 감소되면 민감성 피부인 것으로 진단하는 것을 특징으로 하는 민감성 피부 진단 키트.
  13. HLA-C, TCEA1, IGHA1, TFRC, S100A8, LOC652128, SERPINB13, EHF, FLJ10781, TP63, CDH1, TNFRSF19, GM2A, FKBP5, PI3, PSPH, HORMAD1, SPRR2G 및 ACTR2로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자에 의해 코딩되는 단백질에 시험물질을 결합시키는 단계; 및
    상기 시험물질이 단백질의 작용을 억제하는지를 확인하는 단계를 포함하는 자극감 완화제의 스크리닝 방법.
  14. KBTBD10, TTN, ACTA1, MYBPC1, MB, MYOZ1, TPM1, CA3, CASQ1, ENO3, RBP4, GYG2, PPP1R1A, PYGM, G0S2, NEB, H19, LIPE, PLIN, H19, GPAM, FABP4, CIDEC, LPL, PCK1, ADIPOQ, PDE3B, ACVR1C, LPL, FABP4, DKFZP761N09121, TNMD, ATP6V1B1, C8orf22 및 CRISP3로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자에 의해 코딩되는 단백질에 시험물질을 결합시키는 단계; 및
    상기 시험물질이 단백질의 작용을 증진시키는지를 확인하는 단계를 포함하는 자극감 완화제의 스크리닝 방법.
  15. NFYA, MYOG 및 ATF4로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 전사인자 유전자 및 프로모터를 포함하는 제 1 플라스미드, 및 상기 전사인자가 결합하는 DNA 서열 및 리포터 유전자를 포함하는 제 2 플라스미드를 세포에 트랜스펙션시키는 단계;
    상기 세포에 시험물질을 처리하는 단계; 및
    상기 시험물질이 리포터 유전자의 발현을 억제하는지를 확인하는 단계를 포함하는 자극감 완화제의 스크리닝 방법.
  16. NFKB1, SRF, RELA, TCF3, POU2F1, USF 및 JUN로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 전사인자 유전자 및 프로모터를 포함하는 제 1 플라스미드, 및 상기 전사인자가 결합하는 DNA 서열 및 리포터 유전자를 포함하는 제 2 플라스미드를 세포에 트랜스펙션시키는 단계;
    상기 세포에 시험물질을 처리하는 단계; 및
    상기 시험물질이 리포터 유전자의 발현을 증가시키는지를 확인하는 단계를 포함하는 자극감 완화제의 스크리닝 방법.
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