WO2022019325A1 - 栄養障害型表皮水疱症の治療薬 - Google Patents

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    • C12N2740/16043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Definitions

  • the present disclosure relates to a therapeutic agent for nutritionally impaired epidermolysis bullosa.
  • Epidermolysis bullosa is a disease in which the epidermis peels off from the dermis and causes blisters (blisters) and skin ulcers when force is applied to the skin due to the loss or disappearance of the adhesive structural molecules responsible for the adhesion of skin tissue. be.
  • the type in which the epidermis is torn and blisters are formed is simple epidermolysis bullosa
  • the type in which blisters are formed by peeling between the epidermis and the dermis is junctional epidermolysis bullosa, and the part between the epidermis and the dermis is peeled off.
  • the type of disease is called epidermolysis bullosa.
  • Nutritional disorder type epidermolysis bullosa is the most common type of epidermolysis bullosa, accounting for about 50% of all epidermolysis bullosa, and is a hereditary disease caused by a mutation in the COL7A1 gene that encodes type VII collagen.
  • the epidermal basal cells at the bottom of the epidermis are bound to a sheet-like structure called the basement membrane.
  • Type VII collagen forms a fiber called anchoring fibril in the dermis and connects the basement membrane and the dermis.
  • Skin sheets are difficult to manufacture because they require advanced process control and culture technology, and are expensive, so there is a demand for therapeutic agents that are easier to manufacture.
  • the present disclosure is a composition for use in the treatment of dystrophic epidermolysis bullosa, comprising blistering-derived cells of a dystrophic epidermolysis bullosa patient genetically modified to produce type VII collagen. Regarding the composition.
  • the present disclosure provides a therapeutic agent for nutritionally impaired epidermolysis bullosa.
  • FIG. 1 is a photograph showing the appearance of blister-derived cells up to 20 days after the start of culture.
  • FIG. 2 shows the results of FACS analysis of blister-derived cells and human bone marrow-derived mesenchymal stem cells.
  • blisters-derived cells and human bone marrow-derived mesenchymal stem cells were cultured under conditions for inducing differentiation into osteoblasts, adipocytes, and chondrocytes, and alkaline phosphatase (ALP) staining, oil red O staining, and al. The result of cyan blue staining is shown.
  • FIG. 3 shows the results of cyan blue staining.
  • FIG. 4 shows that blisters-derived cells and human bone marrow-derived mesenchymal stem cells of a nutritionally impaired epidermal vesicular disease patient different from those in FIG. 3 were cultured under conditions for inducing differentiation into osteoblasts, adipocytes, and chondrocytes. The results of ALP staining, oil red O staining, and alcian blue staining are shown.
  • FIG. 5 shows the expression level and secretion level of type VII collagen in various cells.
  • FIG. 5 (top) is a photograph (left) showing the results of Western blotting using an anti-VII collagen antibody against cell lysate and a graph (right) quantifying the density of the obtained band. be.
  • FIG. 5 (bottom) is a photograph (left) showing the results of Western blotting on a medium in which cells were cultured, and a graph (right) quantifying the density of the obtained band.
  • KC indicates human epidermal keratinocytes.
  • FB refers to human skin fibroblasts.
  • MSC refers to human bone marrow-derived mesenchymal stem cells.
  • BFC indicates blister-derived cells.
  • FIG. 6 shows the cleavage of genomic DNA by the designed sgRNA (sgAAVS1- # 1 to # 3) and the cleavage efficiency thereof.
  • FIG. 7 is an explanatory diagram of genome editing in which the COL7A1 gene is introduced into the AAVS1 region.
  • HA-R and HA-L indicate the homologous sequence part
  • SA indicates the splice acceptor sequence
  • T2A indicates the T2A sequence encoding the T2A peptide
  • Puro indicates the puromycin resistance gene
  • CAG indicates the CAG promoter sequence.
  • the length from F2 to R2 in the wild-type genome (top) is 1952 bp
  • the length from F1 to R1 in the genome into which the COL7A1 gene is introduced (bottom) is 1246 bp
  • the length from F2 to R2 is 14249 bp. be.
  • FIG. 8 shows the expression and secretion amount of type VII collagen after introducing the COL7A1 gene into various cells with CRISPR-Cas9.
  • FIG. 8 (top) is a photograph (left) showing the results of Western blotting using an anti-VII collagen antibody against cell lysate and a graph (right) quantifying the density of the obtained band. be.
  • FIG. 8 (bottom) is a photograph (left) showing the results of Western blotting on a medium in which cells were cultured, and a graph (right) quantifying the density of the obtained band.
  • FB refers to human skin fibroblasts.
  • MSC refers to human bone marrow-derived mesenchymal stem cells.
  • BFC indicates blister-derived cells.
  • FIG. 9 is an explanatory diagram of the production of an epidermolysis bullosa model mouse. The photo on the right shows the formed blisters.
  • FIG. 9 is an explanatory diagram of the production of an epidermolysis bullosa model mouse. The photo on the right shows the formed blisters.
  • FIG. 10 shows a skin tomographic image of an epidermolysis bullosa model mouse in which blister-derived cells are injected into the blister.
  • the photo on the left shows the results of immunostaining for type VII collagen, and the photo on the right shows the results of immunostaining for DAPI staining and type VII collagen.
  • Control shows the results of mice injected with unmodified blister-derived cells
  • CAG-hCOL7 shows the results of mice injected with COL7A1 gene-introduced blister-derived cells.
  • FIG. 11 is a skin tomographic photograph of an epidermolysis bullosa model mouse in which human bone marrow-derived mesenchymal stem cells or blisters-derived cells are injected intradermally or into blisters.
  • the photograph shows the deposited portion of type VII collagen. From the top, the results of mice injected intradermally with unmodified human bone marrow-derived mesenchymal stem cells (hMSC intradermal), and the results of mice injected intradermally with COL7A1 gene-introduced human bone marrow-derived mesenchymal stem cells.
  • mice infused with unmodified human bone marrow-derived mesenchymal stem cells into vesicles results of mice infused with unmodified human bone marrow-derived mesenchymal stem cells into vesicles (intrahMSC vesicles), COL7A1 gene-introduced human bone marrow-derived mesenchymal stem cells into vesicles
  • the results of mice injected into COL7-hMSC vesicles (inside COL7-hMSC vesicles) and the results of mice in which COL7A1 gene-introduced vesicular-derived cells were injected into vesicles (inside COL7-BF vesicles) are shown. The left side of FIG.
  • FIG. 12 is a schematic diagram illustrating an experiment for investigating how much the blister-derived cells administered into the blister settle in the blister.
  • the right side of FIG. 12 is a graph showing the firefly luciferase activity level of the intrablister solution collected from the blisters 30 minutes after the cells were administered into the blisters.
  • the left side of FIG. 13 is a schematic diagram illustrating an experiment for observing the long-term colonization ability of cells administered in vivo.
  • the right side of FIG. 13 is a photograph of the firefly luciferase activity level measured 1 day and 9 months after the administration of the cells into the blisters.
  • “MSC” indicates bone marrow-derived mesenchymal stem cells
  • BFC indicates blister-derived cells.
  • FIG. 14 is a graph showing the time course of the firefly luciferase activity level after administration of cells into the blisters.
  • the right side of FIG. 14 is a graph showing the level of firefly luciferase activity one month after administration of cells into the blisters.
  • FIG. 15 is a fluorescence micrograph after 72 hours have passed since various cells were infected with the GFP lentiviral vector.
  • GFP is a photograph showing green fluorescence of cells.
  • “Merge” is a superimposition of a bright-field photo on a “GFP” photo.
  • MOI 1 cells were infected with a lentiviral vector with MOI 1.
  • MOI 5" cells were infected with a lentiviral vector with MOI 5.
  • FIG. 16 is a graph showing the GFP positive rate of cells after 72 hours of infection of each cell type with the GFP lentiviral vector with MOI1.
  • FIG. 17 is a plasmid map.
  • FIG. 17 (left) shows the structure of pLVSIN-EF1 ⁇ -COL7A1, a plasmid prepared by the present inventor.
  • FIG. 17 (right) shows the structure of pLVSIN-PGK-COL7A1, a plasmid prepared by the present inventor.
  • the pLVSIN vector is a SIN (self-inactivating) type lentiviral vector plasmid that expresses the human type VII collagen gene by the EF1 ⁇ promoter (left) or PGK promoter (right).
  • FIG. 18 is a schematic diagram showing the gene structure of the lentiviral vector produced by the present inventor.
  • the LVSIN-EF1 ⁇ -COL7A1 vector shown in FIG. 18 (top) comprises the EF1 ⁇ promoter and the COL7A1 gene in an expression cassette.
  • the LVSIN-PGK-COL7A1 vector shown in FIG. 18 (bottom) comprises the PGK promoter and the COL7A1 gene in an expression cassette.
  • FIG. 19 is a photograph of blister-derived cells infected with the EF1 ⁇ -COL7A1 lentiviral vector and immunostained with an anti-VII collagen antibody 14 days later.
  • DAPI is a photograph of DAPI staining.
  • EF1a-C7 is a photograph showing the result of immunostaining for type VII collagen.
  • FIG. 20 is a photograph of blister-derived cells infected with the PGK-COL7A1 lentiviral vector and immunostained with an anti-VII collagen antibody 14 days later.
  • DAPI is a photograph of DAPI staining.
  • PGK-C7 is a photograph showing the results of immunostaining for type VII collagen. In “mock”, the cells were not infected with the lentiviral vector.
  • FIG. 21 shows the results of FACS analysis using anti-VII collagen antibody after 14 days of infection of blister-derived cells with a type VII collagen gene-carrying lentiviral vector.
  • EF1a-C7 blistering-derived cells were infected with a lentiviral vector containing the EF1 ⁇ promoter and the COL7A1 gene in an expression cassette.
  • PGK-C7 blistering-derived cells were infected with a lentiviral vector containing the PGK promoter and the COL7A1 gene in an expression cassette.
  • FIG. 22 is a graph in which the FACS data shown in FIG. 21 is quantified.
  • FIG. 22 (left) is a bar graph showing the rate of type VII collagen positive cells.
  • FIG. 22 (right) is a bar graph showing the average fluorescence intensity of type VII collagen-positive cells.
  • FIG. 23 is a graph showing the change over time in the number of vector copies in the genome of blister-derived cells infected with the type VII collagen gene-carrying lentiviral vector.
  • FIG. 24 shows a skin tomographic image of an epidermolysis bullosa model mouse in which blister-derived cells into which the COL7A1 gene has been introduced using a lentiviral vector are injected into the blisters.
  • DAPI is a photograph of DAPI staining.
  • C7 is a photograph showing the result of immunostaining for type VII collagen.
  • Mege is a combination of the results of DAPI staining and the results of immunostaining for type VII collagen.
  • Uninfected BFC indicates the result of injecting blister-derived cells not infected with the lentiviral vector into the blisters of mice.
  • “LVSIN-EF1a-C7 infected BFC” shows the result of injecting blister-derived cells into which the COL7A1 gene was introduced into mouse blisters by a lentiviral vector.
  • Dystrophic Epidermolysis Bullosa is a hereditary disease caused by a mutation in the COL7A1 gene that encodes type VII collagen, and type VII collagen is not produced at all or its function is impaired by the mutation. It is known that type VII collagen is produced as its characteristic. Type VII collagen forms a fiber called anchoring fibril in the dermis and connects the basement membrane and the dermis. Type VII collagen contains a first non-collagen region, a collagen region, and a second non-collagen region from the N-terminal, and forms a triple chain at the collagen region portion characterized by a repeating sequence of glycine-XY, forming a triple chain and a C-terminal.
  • Mutations include mutations in which glycine in the collagen region is replaced with other amino acids, stop codon mutations that stop protein translation, and splice site mutations.
  • the mutation may be in one of the alleles or in both.
  • the malnourished epidermolysis bullosa includes a dominant malnutrition type and a recessive malnutrition type, and the recessive malnutrition type includes a severe generalized type and other generalized types with relatively mild symptoms.
  • the malnutrition-type epidermolysis bullosa in the present specification may be any type of malnutrition-type epidermolysis bullosa, and may be caused by a mutation in any COL7A1 gene.
  • Blisters are fluids such as body fluids and interstitial fluids that collect under the epidermis.
  • the blisters are blisters in the form of fluid pooled in the space formed between the epidermis and the dermis by exfoliating the epidermis from the dermis. More preferably, the blisters are blisters in the form of fluid accumulated in the space formed between the basement membrane and the dermis by exfoliating the basement membrane of the epidermis from the dermis.
  • the blister-derived cells of a dystrophic epidermolysis bullosa patient refer to adherent cells collected from within the blister of a dystrophic epidermolysis bullosa patient, and in the present disclosure, "DEB patient blister-derived cells” or Also called “blister-derived cells”.
  • the cells can be obtained by culturing the blister contents of a nutritionally impaired epidermolysis bullosa patient on a solid phase.
  • the blister content is a liquid that collects in the blisters, and this liquid is referred to herein as a "blister solution".
  • the blister contents can be collected from the blisters of a nutritionally impaired epidermolysis bullosa patient by means such as a syringe.
  • the syringe is inserted by piercing the syringe needle into the syringe and pulling the pusher of the syringe with the tip of the syringe positioned in the space formed between the epidermis and the dermis.
  • Intravesicular solution can be aspirated into the syringe.
  • blister-derived cells can be obtained by seeding the blister-derived solution in a medium without treating it with an enzyme such as collagenase or dispase and culturing it on a solid phase.
  • the intrablister solution collected from the blister can be directly seeded in a medium, the medium is incubated on the solid phase for a predetermined time, and then the cells attached to the solid phase can be used as blister-derived cells. At this time, it is preferable to obtain cells that have formed colonies on the solid phase.
  • the intrablister solution is preferably seeded in the medium within 3 hours after collection, more preferably within 2 hours, and even more preferably within 1 hour.
  • the solid phase means a solid support to which cells can adhere, and includes, for example, a culture vessel made of plastic or glass, such as a culture dish, a flask, or a multi-well plate. In one embodiment, the solid phase is a plastic culture vessel.
  • the solid phase may be coated, and examples of the coating substance include collagen I, laminin, vitronectin, fibronectin, poly-L-lysine, and poly-L-ornithine. In one embodiment, the solid phase is coated with collagen I.
  • Culturing can be carried out in a general incubator under conditions such as "37 ° C, 5% CO 2 ", "37 ° C, 5% O 2 , 5% CO 2".
  • the culture medium may be any medium that can be used for culturing animal cells, for example, MEM, MEM ⁇ , DMEM, GMEM, RPMI 1640, MesenCult TM (STEMCELL Technologies), Messengerle Stem Cell Growth Medium 2 (PromoCell).
  • MSCGM Mesenchymal Stem Cell Growth Medium (Lonza), Cellartis MSC Xeno-Free Culture Medium (Takara Bio), and a mixed medium thereof.
  • media for mesenchymal stem cells such as MesenCult TM , Mesenchymal Stem Cell Growth Medium 2, MSCGM Mesenchymal Stem Cell Growth Medium, and Cellartis MSC Xeno-Free Culture Medium are preferably used.
  • the medium is preferably a serum-free medium.
  • the culture period may be long enough for the cells to adhere to the solid phase, eg, 1 day to several months (eg, 2, 3 or 4 months), 1 day to 1 month, 1 day. It can be from several weeks (eg, two, three or four weeks), one day to one week.
  • blister-derived cells of DEB patients have one or more characteristics selected from the following 1) -6): 1) Adhesive to the solid phase, 2) One or more surface markers selected from the group consisting of CD73, CD105 and CD90 are positive. 3) One or more surface markers selected from the group consisting of CD45, CD34, CD11b, CD79A, HLA-DR and CD31 are negative, 4) It does not have the ability to differentiate into osteoblasts, or its differentiation ability is lower than that of bone marrow-derived mesenchymal stem cells. 5) It does not have the ability to differentiate into adipocytes, or its differentiation ability is lower than that of bone marrow-derived mesenchymal stem cells.
  • chondrocytes It does not have the ability to differentiate into chondrocytes, or its differentiation ability is lower than that of bone marrow-derived mesenchymal stem cells.
  • a cell "does not have the ability to differentiate" into osteoblasts, fat cells or chondrocytes means osteoblasts, fat cells or or using normal differentiation induction conditions and detection methods (staining, etc.). It means that differentiation into cartilage cells cannot be detected.
  • the DEB patient blister-derived cells are CD73-positive, CD105-positive, and CD90-positive cells.
  • DEB patient blister-derived cells are CD45-negative, CD34-negative, CD11b-negative, CD79A-negative, HLA-DR-negative, and CD31-negative cells.
  • DEB patient blisters are cells that are less capable of differentiating into osteoblasts, adipocytes, and chondrocytes than bone marrow-derived mesenchymal stem cells. be.
  • DEB patient blisters-derived cells have a lower ability to differentiate into osteoblasts and adipocytes than bone marrow-derived mesenchymal stem cells, and have no ability to differentiate into chondrocytes. It is a cell.
  • blister-derived cells of a nutritionally impaired epidermolysis bullosa patient genetically modified to produce type VII collagen are used.
  • “cells genetically modified to produce type VII collagen” means cells genetically modified to produce functional (ie, capable of forming anchoring fibrils) type VII collagen.
  • the gene modification of a cell means both the modification of a gene in the genome of the cell and the modification of the cell to express the gene from an extragenome nucleic acid construct (for example, a vector). That is, the expression “gene-modify to produce type VII collagen” refers to modifying cells to express type VII collagen from the COL7A1 gene in the genome, and to VII from the COL7A1 gene of the extragenomic nucleic acid construct. It involves modifying cells to express type collagen.
  • “cells genetically modified to produce type VII collagen” include cells that express type VII collagen from the COL7A1 gene in the genome and cells that express type VII collagen from the COL7A1 gene, which is a nucleic acid construct outside the genome. And are included.
  • Gene modification of cells can be performed by introducing the COL7A1 gene or by modifying the mutation of the COL7A1 gene in the genome.
  • the introduction of the COL7A1 gene can be performed either by introducing the COL7A1 gene into the cell genome or by allowing a nucleic acid construct containing the COL7A1 gene to be present in the cell so that the COL7A1 gene is expressed from an extragenome nucleic acid construct. Can be done.
  • the COL7A1 gene is introduced into the genome of a cell, it may be introduced at a specific position or may be introduced at random.
  • the COL7A1 gene is introduced into the COL7A1 locus of the genome, or a safe harbor such as the AAVS1 region.
  • DEB patient blister-derived cells are cells of the dystrophic epidermolysis bullosa patient (ie, autologous cells) to which the cells are administered, but are different from those of the patient receiving the cells. It may be a patient's cell (ie, an allogeneic cell).
  • the cells of the epidermolysis bullosa patient with malnutrition include cells that do not produce type VII collagen and cells that produce type VII collagen but whose function is reduced due to mutation.
  • the "cells of a patient with epidermolysis bullosa" may be any of them.
  • the DEB patient blister-derived cells may be cells that can produce type VII collagen in the vicinity of the epidermal basement membrane when administered to the patient.
  • cells are used in the sense of including those grown as needed.
  • Cell proliferation can be performed by culturing the cells.
  • blister-derived cells in patients with dystrophy-type epidermolysis bullosa
  • gene-modified cells are cells obtained by genetic modification. Includes those that have been propagated.
  • genetically modified cells may be grown until the amount required for the genetic modification is obtained. Also, after genetic modification, cells may be grown until the amount required for treatment is obtained.
  • the term "cell” can mean one cell or a plurality of cells depending on the context. Further, the cell may be a cell population consisting of one type of cell, or may be a cell population including a plurality of types of cells.
  • the COL7A1 gene means a nucleic acid sequence encoding type VII collagen, and is used to include cDNA as well as a sequence containing one or more introns (eg, a genomic sequence or a minigene).
  • the representative nucleic acid sequence of the human COL7A1 gene (cDNA) is shown in SEQ ID NO: 1, and the representative amino acid sequence of human type VII collagen is shown in SEQ ID NO: 2.
  • the cDNA sequence of the COL7A1 gene is disclosed in GenBank: NM_000094.3, and the genomic sequence is disclosed in GenBank: AC121252.4.
  • the COL7A1 gene may encode functional type VII collagen (ie, capable of forming anchoring fibrils), and its sequence is not limited.
  • CDNA sequence of human COL7A1 gene (8835 bp) (SEQ ID NO: 1) Amino acid sequence of human type VII collagen (2944 AA) (SEQ ID NO: 2) *
  • the COL7A1 gene is a nucleic acid having 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99% or more sequence identity with the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 1. Contains or consists of the nucleic acid sequence. In another embodiment, the COL7A1 gene is 1-30, 1-20, 1-10, 1-5, 1-3, 1-2 or 1 in the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 1. The base contains or consists of the nucleic acid sequence inserted, deleted, substituted, or added. In a further embodiment, the COL7A1 gene comprises or consists of the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • type VII collagen has 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99% or more sequence identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. Contains or consists of the amino acid sequence. In another embodiment, type VII collagen is 1-30, 1-20, 1-10, 1-5, 1-3, 1-2 or 1 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. Contains or consists of the amino acid sequence of which the amino acid residue of is inserted, deleted, substituted, or added. In a further embodiment, type VII collagen comprises or consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
  • the COL7A1 gene is an amino acid having 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99% or more sequence identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. Contains or consists of the nucleic acid sequence encoding the sequence. In another embodiment, the COL7A1 gene is 1-30, 1-20, 1-10, 1-5, 1-3, 1-2 or 1 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. The amino acid residue comprises or consists of a nucleic acid sequence encoding an inserted, deleted, substituted, or added amino acid sequence.
  • sequence identity with respect to a nucleic acid sequence or amino acid sequence coincides between two sequences that are optimally aligned (maximum match) over the entire region of the sequence to be compared. Means the proportion of base or amino acid residues.
  • sequence to be compared may have insertions, additions or deletions (eg, gaps, etc.) in the optimal alignment of the two sequences.
  • Sequence identity can be calculated using programs such as FASTA, BLAST, and CLUSTAL W provided in public databases (eg, DDBJ (http://www.ddbj.nig.ac.jp)). Alternatively, it can be obtained by using commercially available sequence analysis software (for example, Vector NTI (registered trademark) software, GENETYX (registered trademark) ver. 12).
  • cells are genetically modified by genome editing such as CRISPR systems (eg, CRISPR / Cas9, CRISPR / Cpf1), TALENs, ZFNs.
  • CRISPR systems eg, CRISPR / Cas9, CRISPR / Cpf1
  • TALENs TALENs
  • ZFNs ZFNs.
  • the cell is genetically modified by a viral vector such as a retroviral vector, a lentiviral vector, an adenoviral vector, an adeno-associated virus vector.
  • the cells are genetically modified by CRISPR / Cas9.
  • the cells are genetically modified with a retroviral vector or a lentiviral vector.
  • the sequence can be inserted into the cleavage site of the genome by causing cleavage in the genome and introducing a donor vector containing the target sequence into the cell.
  • the sequence to be inserted into the genome can be the COL7A1 gene, or a sequence for replacement with a site containing a mutation in the COL7A1 gene (eg, a partial sequence of the COL7A1 gene).
  • the donor vector may contain regulatory sequences such as promoters and enhancers that control the expression of the sequence of interest, as well as other elements such as drug resistance genes for cell selection, at both ends of the genome. It may contain homologous sequences at both ends of the insertion site.
  • the donor vector can be introduced at the desired site by non-homologous end binding or homologous recombination.
  • a viral vector such as a plasmid, an adeno-associated virus vector, or an integrase-deficient lentivirus vector can be used.
  • endonucleases such as Cas9 or Cas12 (eg, Cas12a (also known as Cpf1), Cas12b, Cas12e) recognize the PAM sequence, which is a specific base sequence, and the action of the endonuclease double-strands the target DNA. To disconnect. If the endonuclease is Cas9, it cleaves about 3-4 bases upstream of the PAM sequence.
  • endonucleases include S. pyogenes, S. aureus, N. meningitidis, S. thermophilus, or T. denticola Cas9, L. bacterium ND2006 or Acidaminococcus sp. BV3L6 Cpfl.
  • the PAM sequence is endonuclease dependent, for example, the PAM sequence of Cas9 in S. pyogenes is NGG.
  • the gRNA contains a sequence (target sequence) of about 20 bases upstream of the PAM sequence or a sequence complementary thereto on the 5'end side, and plays a role of recruiting endonucleases to the target sequence.
  • the sequence of the portion of the gRNA other than the target sequence (or a sequence complementary thereto) can be appropriately determined by those skilled in the art depending on the endonuclease used.
  • gRNA is a crRNA (CRISPRRNA) that contains a target sequence or a sequence complementary to it and is responsible for the sequence specificity of gRNA, and a tracrRNA (Trans-activating crRNA) that forms a double strand and contributes to the formation of a complex with Cas9. And can be included.
  • crRNA and tracrRNA may exist as different molecules.
  • the endonuclease is Cpf1
  • crRNA alone functions as a gRNA.
  • a gRNA containing an element necessary for the function of the gRNA on a single strand may be particularly referred to as sgRNA.
  • the gRNA sequence can be determined by tools available for target sequence selection and gRNA design, such as CRISPRdirect (https://crispr.dbcls.jp/).
  • a vector containing a nucleic acid sequence encoding a gRNA and a nucleic acid sequence encoding an endonuclease may be introduced and expressed in the cell, or an extracellularly prepared gRNA and an endonuclease protein may be introduced into the cell. ..
  • the endonuclease may include a nuclear localization signal.
  • the nucleic acid sequence encoding the gRNA and the nucleic acid sequence encoding the endonuclease may be present on different vectors.
  • Vectors, gRNAs, and endonucleases can be introduced into cells by lipofection, electroporation, microinjection, calcium phosphate method, DEAE-dextran method, etc., but are not limited to these methods.
  • the gRNA that can be used to introduce the COL7A1 gene into the genome comprises any of the sequences of SEQ ID NOs: 3-5 or a sequence complementary thereto.
  • the COL7A1 gene can be introduced into the cell genome by using a retroviral vector or a lentiviral vector having integrase activity.
  • the retroviral vector and the lentiviral vector may be integrase-deficient. Integrase-deficient vectors lack integrase activity, for example, due to mutations in the integrase gene.
  • an integrase-deficient vector, an adenovirus vector, or an adeno-associated virus vector is used, the sequence integrated into the vector is usually not introduced into the cell genome.
  • type VII collagen is expressed from the COL7A1 gene of the vector existing in the cell (intranuclear).
  • the viral vector contains a sequence encoding the COL7A1 gene, and may contain regulatory sequences such as promoters and enhancers that control the expression of the COL7A1 gene, and other elements such as drug resistance genes for cell selection.
  • the viral vector may be prepared by any method known in the art.
  • retroviral and lentiviral vectors are viral vector plasmids containing LTR sequences (5'LTR and 3'LTR) at both ends, packaging signals, and sequences of interest, viral structures such as Gag, Pol, Env. It can be prepared by introduction into packaging cells with one or more plasmid vectors expressing the proteins, or by introduction into packaging cells expressing these structural proteins.
  • the packaging cells include, but are not limited to, 293T cells, 293 cells, HeLa cells, COS1 cells, COS7 cells, and the like.
  • the viral vector may be pseudotyped and may express an enveloped protein such as, for example, the vesicular stomatitis virus G protein (VSV-G).
  • VSV-G vesicular stomatitis virus G protein
  • the viral vector is a lentiviral vector.
  • Lentivirus vectors include HIV (human immunodeficiency virus) (for example, HIV-1 and HIV-2), SIV (simian immunodeficiency virus), FIV (feline immunodeficiency virus), MVV (Maedi-Visna virus), EV1 (Maedi-). Visna-like virus), EIAV (equine infectious anemia virus), and CAEV (caprine arthritis encephalitis virus), but are not limited to these.
  • the lentiviral vector is HIV.
  • the lentiviral vector can be produced as follows. First, a viral vector plasmid encoding the viral genome and one or more plasmid vectors expressing Gag, Pol, and Rev (and optionally Tat) and one or more plasmid vectors expressing enveloped proteins such as VSV-G. , Introduced into packaging cells. Viral vector plasmids are LTR sequences at both ends (5'LTR and 3'LTR), packaging signals, and promoters that control the COL7A1 gene and its expression (eg, CMV promoter, CAG promoter, EF1 ⁇ promoter, PGK promoter, or hCEF). Promoter) is included.
  • LTR sequences at both ends 5'LTR and 3'LTR
  • promoters that control the COL7A1 gene and its expression (eg, CMV promoter, CAG promoter, EF1 ⁇ promoter, PGK promoter, or hCEF). Promoter) is included.
  • the 5'LTR functions as a promoter that induces transcription of the viral RNA genome, it may be replaced with another promoter such as the CMV promoter in order to enhance the expression of the RNA genome.
  • the viral RNA genome is transcribed from the vector plasmid and packaged to form the viral core.
  • the virus core is transported to the cell membrane of the packaging cell, encapsulated in the cell membrane, and released as virus particles from the packaging cell.
  • the released virus particles can be recovered from the culture supernatant of the packaging cells.
  • virus particles can be recovered by conventional purification methods such as centrifugation, filter filtration, column purification and the like.
  • lentiviral vectors can be manufactured using kits such as Lentiviral High Titer Packaging Mix, Lenti-X TM Packaging Single Shots (Takara Bio Inc.), and ViraSafe TM Lentivirus Complete Expression System (Cell Biolabs Inc.). can.
  • Adeno-associated virus vectors can be prepared using a kit such as AAVpro (R) Helper Free System (Takara Bio Inc. ).
  • the present disclosure provides a plasmid used in the production of a lentiviral vector having an EF1 ⁇ promoter and a COL7A1 gene located downstream of the EF1 ⁇ promoter.
  • the present disclosure provides a lentiviral vector having an EF1 ⁇ promoter and a COL7A1 gene located downstream of the EF1 ⁇ promoter.
  • EF1 ⁇ promoter (SEQ ID NO: 6)
  • the EF1 ⁇ promoter is a nucleic acid having 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99% or more sequence identity with the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 6.
  • the EF1 ⁇ promoter is 1-30, 1-20, 1-10, 1-5, 1-3, 1-2 or 1 in the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 6.
  • the base contains or consists of the nucleic acid sequence inserted, deleted, substituted, or added.
  • the EF1 ⁇ promoter comprises or consists of the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 6.
  • the cells into which the target sequence has been introduced can be confirmed by Southern blotting or PCR.
  • the sequence of interest may be introduced into at least one of the alleles.
  • DEB patient blister-derived cells are the most abundant cells contained in the composition.
  • DEB patient blister-derived cells make up 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98 or 99% or more of the cells contained in the composition.
  • the compositions of the present disclosure are substantially free of cells other than DEB patient blister-derived cells. "Substantially free of cells other than DEB patient blister-derived cells” means that only cells obtained by substantially the same method as the method for obtaining DEB patient blister-derived cells described herein are included. means.
  • the number of cells contained in the composition is an amount required to exert the desired effect (also referred to herein as an effective amount), and those skilled in the art will appreciate the age, weight, and medical condition of the patient, as well as the type of cells. It can be appropriately determined in consideration of factors such as the gene modification method.
  • the number of cells is not limited, but is, for example, 1 cell to 1 ⁇ 10 7 cells, 1 ⁇ 10 cells to 1 ⁇ 10 7 cells, 1 ⁇ 10 2 cells to 1 ⁇ 10 7 cells, 1 ⁇ 10 3 cells to 1 ⁇ .
  • composition may include pharmaceutically acceptable vehicles and / or additives in addition to the cells.
  • Pharmaceutically acceptable vehicles include water, medium, saline, glucose, infusions containing D-sorbitol, D-mannitol and the like, phosphate buffered saline (PBS) and the like.
  • PBS phosphate buffered saline
  • the additive include a solubilizing agent, a stabilizer, a preservative and the like.
  • the dosage form of the composition is not particularly limited, but is a parenteral administration preparation, for example, an injection.
  • Injections include solution injections, suspension injections, emulsion injections, and time-prepared injections.
  • the composition may be frozen or may contain cryoprotectants such as DMSO, glycerol, polyvinylpyrrolidone, polyethylene glycol, dextran, sucrose and the like.
  • compositions of the present disclosure may be administered systemically or topically.
  • the composition is administered to the affected area of a nutritionally impaired epidermolysis bullosa patient.
  • the affected area means a blister or an area in the vicinity thereof.
  • the composition is administered intracutaneously or intrablister of the blister portion.
  • the composition is administered intrablister.
  • administration in the blister means administration in the space under the epidermis of the blister portion.
  • the composition is preferably administered into the space formed between the epidermis and the dermis by exfoliating the epidermis from the dermis.
  • the composition is more preferably administered into the space formed between the basement membrane and the dermis by exfoliating the basement membrane of the epidermis from the dermis. For example, by puncturing the blisters with the injection needle of a syringe containing the composition in a syringe and ejecting the composition with the tip of the injection needle positioned in the space formed between the epidermis and the dermis.
  • the composition can be administered intrablister.
  • the blisters may be naturally formed as a pathological condition of epidermolysis bullosa or may be artificially formed. In patients with epidermolysis bullosa, blisters can be artificially formed, for example, by pinching or rubbing the patient's skin.
  • Intrablister administration can reduce patient distress as compared to intradermal or subcutaneous administration, and type VII collagen can be well expressed near the basement membrane.
  • the number of cells administered per site is an amount (effective amount) necessary for exerting the desired effect, and those skilled in the art will be able to determine the patient's age, weight, and medical condition, as well as the cell type and gene modification method. It can be determined as appropriate in consideration of the factors of.
  • the number of cells is not limited, but for example, 1 cell to 1 ⁇ 10 7 cells, 1 ⁇ 10 cells to 1 ⁇ 10 7 cells, 1 ⁇ 10 2 cells to 1 ⁇ 10 7 cells, 1 ⁇ 10 3 cells to 1 ⁇ 10 7 cells, 1 ⁇ 10 4 cells to 1 ⁇ 10 7 cells, 1 ⁇ 10 5 cells to 1 ⁇ 10 7 cells, 1 ⁇ 10 5 cells to 5 ⁇ 10 6 cells, 5 ⁇ 10 5 cells to 1 ⁇ 10 6 cells, or 1 x 10 5 cells to 1 x 10 6 cells.
  • the dose per blister may be a standard blister having a diameter of 7 to 8 mm when the blister is approximately circularly approximated, and the above dose may be adjusted according to the size of the blister.
  • the preferred dosage is blisters area 1 cm 2 per 1 ⁇ 10 5 ⁇ 1 ⁇ 10 7 cells, more preferred dosage area of blister 1 cm 2 per 5 ⁇ 10 5 ⁇ 5 x 10 6 cells.
  • a composition for use in the treatment of dystrophic epidermolysis bullosa comprising blister-derived cells of a dystrophic epidermolysis bullosa patient genetically modified to produce type VII collagen.
  • the composition according to 1 above, wherein the blister-derived cells have been genetically modified by introducing the COL7A1 gene.
  • the COL7A1 gene contains a nucleic acid sequence having 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99% or more sequence identity with the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 1 Containing a nucleic acid sequence encoding an amino acid sequence having 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99% or more sequence identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
  • composition according to any one of 1 to 4 above, wherein the blister-derived cells have one or more characteristics selected from the following 1) to 6): 1) Adhesive to the solid phase, 2) One or more surface markers selected from the group consisting of CD73, CD105 and CD90 are positive. 3) One or more surface markers selected from the group consisting of CD45, CD34, CD11b, CD79A, HLA-DR and CD31 are negative, 4) It does not have the ability to differentiate into osteoblasts, or its differentiation ability is lower than that of bone marrow-derived mesenchymal stem cells. 5) It does not have the ability to differentiate into adipocytes, or its differentiation ability is lower than that of bone marrow-derived mesenchymal stem cells.
  • composition according to any one of 1 to 11 above, wherein the blister-derived cells have been genetically modified by genome editing.
  • the composition according to 12 above, wherein the genome editing is performed by CRISPR / Cas9.
  • the composition according to any one of 1 to 11 above, wherein the blister-derived cells are genetically modified by a viral vector.
  • the viral vector is a retrovirus vector or a lentiviral vector.
  • a method for producing a composition for use in the treatment of nutritionally impaired epidermolysis bullosa comprising genetically modifying a blister-derived cell of a dystrophic epidermolysis bullosa patient to produce type VII collagen, and preparing a composition comprising the genetically modified blister-derived cell.
  • a method for treating dystrophic epidermolysis bullosa wherein a composition containing blister-derived cells of a dystrophic epidermolysis bullosa patient genetically modified to produce type VII collagen is administered to the patient. How to include.
  • [19] 18 The method according to 18 above, wherein the blister-derived cells have been genetically modified by introducing the COL7A1 gene. [20] 19.
  • the method according to 19 above wherein the COL7A1 gene has been introduced into the genome of a blister-derived cell.
  • the COL7A1 gene contains a nucleic acid sequence having 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99% or more sequence identity with the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 1 Containing a nucleic acid sequence encoding an amino acid sequence having 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99% or more sequence identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
  • the method according to 19 or 20 above [22] The method according to any one of 18 to 21, wherein the blister-derived cells have been genetically modified by genome editing.
  • the COL7A1 gene contains a nucleic acid sequence having 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99% or more sequence identity with the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 1 Containing a nucleic acid sequence encoding an amino acid sequence having 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99% or more sequence identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. 28 or 29 above.
  • composition comprising blister-derived cells of a dystrophy-type epidermolysis bullosa patient genetically modified to produce type VII collagen for the manufacture of a pharmaceutical for the treatment of dystrophic epidermolysis bullosa.
  • composition is administered intrablister.
  • blister-derived cells are derived from the blister content fluid of a nutritionally impaired epidermolysis bullosa patient.
  • composition containing blister-derived cells in patients with dystrophic epidermolysis bullosa genetically modified to produce type VII collagen for the treatment of dystrophic epidermolysis bullosa.
  • composition is administered intrablister.
  • blister-derived cells are derived from the blister content fluid of a nutritionally impaired epidermolysis bullosa patient.
  • a gRNA comprising any of the sequences of SEQ ID NOs: 3 to 5 or a sequence complementary thereto.
  • a method for producing cells which comprises a step of culturing the contents of blisters of a patient with epidermolysis bullosa with malnutrition on a solid phase.
  • 54 or 55, wherein the blister contents collected from a patient's blister are seeded in a medium without enzymatic treatment and cultured on a solid phase.
  • the cell according to 57 which has one or more characteristics selected from 1) to 6) below: 1) Adhesive to the solid phase, 2) One or more surface markers selected from the group consisting of CD73, CD105 and CD90 are positive.
  • One or more surface markers selected from the group consisting of CD45, CD34, CD11b, CD79A, HLA-DR and CD31 are negative, 4) It does not have the ability to differentiate into osteoblasts, or its differentiation ability is lower than that of bone marrow-derived mesenchymal stem cells. 5) It does not have the ability to differentiate into adipocytes, or its differentiation ability is lower than that of bone marrow-derived mesenchymal stem cells. 6) It does not have the ability to differentiate into chondrocytes, or its differentiation ability is lower than that of bone marrow-derived mesenchymal stem cells.
  • [59] Cell production method including the following steps: 1) The process of culturing the contents of blisters in patients with epidermolysis bullosa with malnutrition on a solid phase, 2) Culture step A step of genetically modifying the cells obtained in 1) to produce type VII collagen. [60] 59. The method of 59 above, wherein the blister content is a blister content solution. [61] 59 or 60 above, wherein the blister contents collected from a patient's blister are seeded in a medium without enzymatic treatment and cultured on a solid phase. [62] A cell produced by the method according to any one of 59 to 61.
  • the COL7A1 gene contains a nucleic acid sequence having 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99% or more sequence identity with the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 1 Containing a nucleic acid sequence encoding an amino acid sequence having 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99% or more sequence identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
  • the cell according to 66. The cell according to any one of 62 to 67 above, which has been genetically modified by genome editing.
  • One or more surface markers selected from the group consisting of CD45, CD34, CD11b, CD79A, HLA-DR and CD31 are negative, 4) It does not have the ability to differentiate into osteoblasts, or its differentiation ability is lower than that of bone marrow-derived mesenchymal stem cells. 5) It does not have the ability to differentiate into adipocytes, or its differentiation ability is lower than that of bone marrow-derived mesenchymal stem cells. 6) It does not have the ability to differentiate into chondrocytes, or its differentiation ability is lower than that of bone marrow-derived mesenchymal stem cells.
  • a plasmid used to produce lentiviral vectors With the EF1 ⁇ promoter, The COL7A1 gene located downstream of the EF1 ⁇ promoter and A plasmid having. [75] With the EF1 ⁇ promoter, The COL7A1 gene located downstream of the EF1 ⁇ promoter and Lentiviral vector with.
  • the medium was exchanged and subcultured as appropriate to grow the cells to the desired number of cells (the culture progress up to 20 days after the start of the culture is shown in FIG. 1).
  • the cells obtained by such a method are also referred to as "blister-derived cells” below.
  • the following surface marker analysis and differentiation induction experiments used cells of the 3rd passage, and cells of the 3rd to 4th passages were used for gene transfer.
  • Blister-derived cell characterization a) Surface marker analysis (FACS) Regarding the blisters-derived cells obtained in 1. above and human bone marrow-derived mesenchymal stem cells (hereinafter, also referred to as BM-MSC) [purchased from PromoCell (Heidelberg, Germany) or Lonza (Basel, Switzerland)], the following. Surface marker analysis was performed according to the procedure of: Cells were peeled from the plate using Accutase-Solution (PromoCell, C-41310), washed with medium, and then placed in two tubes based on the cell count measurement results. 100,000 cells were separated.
  • FACS Surface marker analysis
  • the cells were washed once with 2 ml of Flow Cytometry Staining Buffer (1X), resuspended in 300 ⁇ l of Flow Cytometry Staining Buffer (1X), and then analyzed with BD FACSAria (BD). FACS analysis was also performed on CD31 according to the following procedure to confirm the presence or absence of expression in blister-derived cells and human BM-MSC: cells were peeled from the plate using Accutase-Solution (PromoCell, C-41310), and the medium was used. After washing with, 100,000 cells were separated into two tubes based on the measurement result of the cell number.
  • BD FACSAria BD FACSAria
  • both blister-derived cells and BM-MSC were positive for CD73, CD105 and CD90, and negative for CD45, CD34, CD11b, CD79A, HLA-DR and CD31 (Fig. 2).
  • Induction of differentiation (osteoblasts, adipocytes and chondrocytes)
  • the blisters-derived cells and BM-MSC obtained in 1. above were induced to differentiate into osteoblasts, adipocytes and chondrocytes under the following conditions.
  • Induction of differentiation into osteoblasts Cells are cultured in medium containing 0.1 ⁇ M Dexamethasone, 0.2 mM Ascorbic acid 2-phosphate, 10 mM Glycerol 2-phosphate (all numerical values are final concentrations) at 37 ° C. and 5% CO 2 for 3 weeks (2 weeks). (Culture exchange) was performed to induce differentiation into osteoblasts.
  • Alkaline phosphatase (ALP) staining was performed using the TRACP & ALP Assay Kit (Takara Bio Inc., MK301) according to the product manual.
  • Induction of differentiation into adipocytes Cells were cultivated in medium containing 1 ⁇ M Dexamethasone, 0.5 mM 3-Isobutyl-1-methylanxthine (IBMX), 10 ⁇ g / mL Insulin, 100 ⁇ M Indomethacin (all numbers are final concentrations) under 37 ° C., 5% CO 2 conditions. Insulin differentiation into adipocytes was induced by culturing for 3 weeks (medium exchange twice a week).
  • the cells were stained with Oil Red O using the Lipit assay kit (Cosmo Bio Co., Ltd., AK09F) according to the product manual.
  • Induction of differentiation into chondrocytes The components of Human Mesenchymal Stem Cell (hMSC) Chondrogenic Differentiation Medium Bullet Kit (tm) (Lonza, PT-3003) were mixed as instructed to prepare a cartilage differentiation-inducing medium (incomplete medium).
  • Recombinant Human TGF-beta 3 Protein R & D Systems, 243-B3 was added to this to a final concentration of 10 ng / ml, and a cartilage differentiation-inducing medium (complete medium) was prepared for each use.
  • the third passage cells were peeled off with Accutase-Solution PromoCell (C-41310), washed with a medium, and then 250,000 cells were separated into 15 ml polypropylene conical tubes based on the cell number measurement results.
  • the cells were washed twice with cartilage differentiation-inducing medium (incomplete medium), the supernatant was removed, and then suspended in 500 ⁇ l of cartilage differentiation-inducing medium (complete medium).
  • Cell pellets were formed by centrifugation at 150 g for 5 minutes, the lid was loosened and placed in a CO 2 incubator (37 ° C, 5% CO 2 ), and then the medium (complete medium) was changed every 2 to 3 days.
  • the pellet was taken out and fixed with 4% paraformaldehyde, frozen sections were prepared, and chondrocyte-derived proteoglycan was stained by Alcian blue staining.
  • chondrocyte-derived proteoglycan was stained by Alcian blue staining.
  • the same differentiation-inducing operation was performed on human bone marrow-derived mesenchymal stem cells.
  • BM-MSC was positive in all of ALP staining, Oil Red O staining, and Alcian blue staining.
  • blistering-derived cells were positive for ALP staining (however, the staining intensity was lower than BM-MSC), positive for Oil Red O staining (however, the staining intensity was lower than that for BM-MSC), and negative for alcyan blue staining.
  • Fig. 3 A similar differentiation-inducing experiment was also performed on blister-derived cells obtained from the blister content fluid collected from another patient with dystrophic epidermolysis bullosa. The results are shown in FIG. Similar to the results in FIG.
  • BM-MSC was positive in all of ALP staining, Oil Red O staining, and Alcian blue staining.
  • the blister-derived cells of this dystrophic epidermolysis bullosa patient are positive for ALP staining (however, the staining intensity is lower than BM-MSC) and positive for Oil Red O staining (however, the staining intensity is lower than BM-MSC).
  • the alcian blue stain was positive (however, the stain intensity was lower than that of BM-MSC).
  • KC human epidermal keratinocytes
  • FB human skin fibroblasts
  • MSC human bone marrow-derived mesenchymal stem cells
  • BFC blister fluid cell
  • Each lysate was corrected based on the protein concentration, and a sample for electrophoresis was prepared using an LDS sample buffer and a sample reducing agent (Invitrogen, NP0007, NP0009, respectively). After electrophoresis using a 3-8% NuPAGE gel (Invitrogen, EA0375BOX), it was transferred to a PVDF membrane (Millipore, IPVH07850), and Anti-Col7 (Atlas, HPA042420), secondary antibody was used as the primary antibody.
  • Anti-Rabbit IgG-HRP GE helthcare, NA9340-1ML was used for antibody reaction.
  • FIG. 5 The results are shown in Fig. 5.
  • FIG. 5 (top) Western blots were performed on cell lysates, and as a result, the expression level of COL7A in blisters-derived cells was higher than that in skin fibroblasts and bone marrow-derived mesenchymal stem cells, and epidermal keratinized cells. It was a level comparable to that.
  • FIG. 5 (bottom) as a result of Western blotting on the concentrate of the medium in which the cells were cultured, the amount of COL7A secreted from the blister-derived cells was higher than that of any cell. From the above results, it is inferred that the blister-derived cells are optimal as cells into which a gene is introduced to express type VII collagen.
  • sgRNAs Three types were prepared in order to select a position in the human genome that has good cleavage efficiency by the CRISPR-Cas9 system in the AAVS1 (Adeno-associated virus integration site 1) region.
  • the AAVS1 region is a safe region (safe harbor) that is not easily affected by gene transfer. Since the CRISPR-Cas9 system recognizes the base sequence of "NGG” and cleaves 3 bases upstream of it, it selects the region where "GG" is located at the end and selects the target sequence of 20 bases upstream of "NGG". Included sgRNAs (sgAAVS1- # 1 to # 3) were designed (Fig. 6, top; Table 2).
  • a plasmid expressing the Cas9 protein and sgRNA was prepared by cloning the oligonucleotide consisting of any of SEQ ID NOs: 3 to 5 and its complementary strand into the Bbs1 site of eSpCas9 (1.1) (Addgene plasmid # 71814). Created (eSpCas9 (1.1)-sgAAVS1- # 1, eSpCas9 (1.1)-sgAAVS1- # 2, eSpCas9 (1.1)-sgAAVS1- # 3, respectively).
  • This plasmid (2.5 ⁇ g) was introduced into HEK293 cells (human fetal kidney cell line) seeded in 6 well dishes by Lipofectamin 3000 (Thermo Fisher Scientific). Forty-eight hours after transfection, genomic DNA was extracted from the cells and the region containing the target site was amplified by PCR. The PCR amplified fragments were single-stranded by heat treatment, annealed by slow cooling, and then treated with a mismatch site-specific endonuclease. This was fractionated by electrophoresis, the degree of insertion or deletion mutation introduced by genome cleavage was measured by the band density, and the genome editing efficiency was calculated by the following formula (in the formula, a is digested). Band concentration that was not present, b and c indicate the band concentration that was cleaved).
  • COL7A1 gene into blister-derived cells
  • a plasmid expressing the COL7A1 gene was designed under the control of the CAG promoter (Fig. 7).
  • the COL7A1 cDNA was obtained from the Flexi ORF sequence-verified clone (Promega, Madison, WI, USA).
  • the COL7A1 cDNA was subcloned into the pENTR1A plasmid (Thermo Fisher Scientific, A10462) to give pENTR1A-COL7A1.
  • COL7A1 cDNA was introduced from pENTR1A-COL7A1 to pAAVS1-P-CAG-DEST (Addgene plasmid # 80490) by Gateway reaction using LR recombinase (Thermo Fisher Scientific) to obtain donor plasmid pAAVS1-P-CAG-COL7A1.
  • the blister-derived cells obtained in 1. above were suspended in a dedicated buffer of the Neon transfection system (Thermo Fisher Scientific), and the Cas9-sgRNA expression plasmid (eSpCas9 (1.1) -sgAAVS1- # 3) and donor plasmid (pAAVS1-P) were suspended.
  • eSpCas9 1.1
  • pAAVS1-P donor plasmid
  • the above plasmid was introduced into blister-derived cells by electroporation under the conditions of 1,200 V, 20 ms, and 2 pulses, and then seeded and cultured on a 6-well plate.
  • As the medium an equal amount mixed medium of Mesenchymal Stem Cell Growth Medium 2 (PromoCell, C-28009) and MSCGM Mesenchymal Stem Cell Growth Medium (Lonza, PT-3001) was used. 48 hours after transfection, puromycin was added to a final concentration of 0.5 ⁇ g / mL, cultured for about 2 weeks, and the selected cells were transferred to the mice in “5. Transplantation of genetically modified blisters-derived cells into mice” below. Used for transplantation experiments.
  • a donor plasmid expressing the COL7A1 gene was prepared under the control of the PGK promoter, and this plasmid was introduced into various cells including blister-derived cells. Then, the expression level and secretion amount of COL7A1 in the modified cells were subjected to Western blotting in the same manner as in "c) Evaluation of expression ability and secretion ability of type VII collagen" in "2. Characterizing cells derived from blisters". ,evaluated. In this experiment, blister-derived cells obtained from patients who did not express type VII collagen were used. The results are shown in FIG. As shown in FIG. 8 (top), more type VII collagen was detected in the lysates of blister-derived cells than in the lysates of fibroblasts.
  • Type VII collagen in transgenic mice The deposition of type VII collagen in epidermolysis bullosa model mice was compared between blistering-derived cells and mesenchymal stem cells.
  • NOD-SCID immunodeficient mouse
  • 1.0 ⁇ 10 6 cells were injected into the dermis (intradermal) or the space under the epidermis (inside the blisters).
  • ⁇ HMSC Human bone marrow-derived mesenchymal stem cells without gene modification
  • COL7-hMSC Gene-modified (type VII collagen overexpression) Human bone marrow-derived mesenchymal stem cells, “4.
  • COL7A1 gene introduced into blisters-derived cells
  • COL7A1 gene introduced into human bone marrow-derived mesenchymal stem cells (hMSC) [purchased from London (Basel, Switzerland)] by the same method as above.
  • hMSC human bone marrow-derived mesenchymal stem cells
  • the skin was collected from the genetically modified blisters-derived cells prepared in "Introduction", immunostained with an anti-type VII collagen antibody (clone LH7.2; Sigma Aldrich, C6805), and stained images were taken. Then, using image analysis software, a plurality of photographs were superimposed so that the stained portions of type VII collagen exactly matched, and one image was synthesized.
  • type VII collagen was better deposited in the skin when cells into which the COL7A1 gene had been introduced were injected into the blisters than when they were injected into the skin. It was also found that more type VII collagen can be deposited near the basement membrane by using blistering-derived cells.
  • blisters-derived cells genetically modified with the CAG promoter-controlled firefly luciferase gene donor plasmid were placed 1.0 x 10 6 , 0.5 x 10 6 , 0.25 x 10 6 or 0.1 x 10 6
  • Individuals were injected into separate bodies. After 30 minutes, the intrablister solution was collected, the level of firefly luciferase was measured by the Luciferase assay system (Promega, E2510), and the number of surplus cells that did not settle on the dermis and remained in the fluid in the blisters was evaluated.
  • Retronectin coating plate PBS (Dalvecolinic acid buffered saline (Ca, Mg-free)) [Nakaraitesk (Kyoto) so that the amount of retronectin [Takara Bio Inc. (Shiga, Japan), T100B] is 40 ⁇ g / mL. , Japan), 14249-95] and added to a 96-well plate [Corning (Tokyo, Japan), 3370] without surface treatment as 100 ⁇ L / well. Then, the plate was allowed to stand at 4 ° C. overnight. Before using the plate, the retronectin solution was removed, washed twice with PBS, and the following operations were performed.
  • GFP gene-carrying lentivirus pLenti-C-mGFP [ORIGENE (Rockville, USA), PS100071] was added to each well so as to have MOI 1 or MOI 5, and the cells were cultured in a CO 2 incubator for 72 hours.
  • Detection of GFP-positive cells The detection of GFP-positive cells was performed with a fluorescence microscope [KEYENCE (Tokyo, Japan), BZ-X710]. The results are shown in FIG.
  • GFP-positive cells of each cell type infected with MOI 1 were quantified by the following method. First, the ratio of the number of GFP-positive cells to the total number of cells in the visual field was defined as the GFP-positive cell rate. This measurement was repeated 3 times and statistical processing was performed (*: P ⁇ 0.05, Dunnett's test). The results are shown in FIG.
  • blisters-derived cells had a higher GFP-positive cell rate and GFP fluorescence intensity than mesenchymal stem cells and fibroblasts. Furthermore, as shown in FIG. 16, it was revealed that the GFP-positive cell rate of blister-derived cells was significantly higher than that of mesenchymal stem cells and fibroblasts.
  • lentivirus vector plasmid carrying the type VII collagen gene A lentivirus vector plasmid containing the EF1 ⁇ promoter and the COL7A1 gene in the expression cassette was prepared as shown in Fig. 17 (left).
  • COL7A1 cDNA is excised from Flexi ORF sequence-verified clone (Promega) containing COL7A1 cDNA by SpeI and XbaI treatment to generate paired sequences, and ligated to pLVSIN-EF1 ⁇ Puro (Takara Bio Inc.) treated with XbaI.
  • the pLVSIN-EF1 ⁇ -C7 Puro was prepared in. By further treating this with NotI and MluI, the PGK-Puro cassette was removed to prepare pLVSIN-EF1 ⁇ -COL7A1.
  • a vector plasmid of lentivirus containing the PGK promoter and the COL7A1 gene in the expression cassette was prepared.
  • the pLVSIN-EF1 ⁇ -Col7A1 was treated with ClaI and SwaI to cut out the EF1 ⁇ promoter region, and the PGK promoter region (501 bp) amplified by PCR using the AAVS1 hPGK-PuroR-pA donor plasmid (addgene # 22072) as a template was used in Gibson assembly.
  • pLVSIN-PGK-COL7A1 was produced.
  • KOD One Toyobo Co., Ltd.
  • Gibson assembly NEBuilder HiFi DNA Assembly kit (New England Biolabs) was used.
  • a lentiviral vector carrying the COL7A1 gene shown in FIG. 18 was produced.
  • Transfection using a lentivirus plasmid The plasmid shown in FIG. 17 was used as a lentivirus vector plasmid.
  • Lentiviral High Titer Packaging Mix [Takara Bio Inc. (Shiga, Japan), 6194] was used as the packaging plasmid.
  • Lenti-X 293T cells [Takara Bio Inc. (Shiga, Japan), 632180], which is a cell line for lentivirus packaging, should be converted to 5000000 cells / dish in 100 mm dish [Corning Inc. (New York, USA), 353003].
  • Lenti-X 293T cells contains 10% FBS and DMEM containing penicillin and streptomycin (added to a final concentration of 100 unit / mL and 100 ⁇ g / mL, respectively) [Nakarai (Kyoto, Japan), 08457-55. ] was used.
  • the vector and packaging plasmids were then transfected with polyethyleneimine. Transfected cells were cultured overnight in a CO 2 incubator and then medium exchanged.
  • OPTI-MEM Thermo Fisher Science (Tokyo, Japan), 31985062] and PEI-MAX [Polysciences (Warrington, USA), 24765-100] were used as transfection reagents.
  • the transfection protocol followed the recommended protocol of PEI-MAX.
  • the mixing ratio of the vector plasmid and the packaging plasmid was in accordance with the recommended protocol of Lentiviral High Titer Packaging Mix.
  • Recovery and purification of lentiviral vector Cell debris was removed by recovering the culture supernatant of Lenti-X 293T cells 72 hours after transfection and coarsely centrifuging at 300 g for 5 min.
  • the supernatant was filtered using a 0.45 ⁇ m filter [Merck (Tokyo, Japan), SLHVR33RS] to further remove Cell debris.
  • the filtered supernatant was then centrifuged (6000 g, 4 ° C, 20 hr) to precipitate the lentiviral vector and the pellet was resuspended in 1.5 mL PBS.
  • the layer of lentiviral vector appearing between the 55% sucrose / PBS solution and the 20% sucrose / PBS solution was recovered and diluted with PBS to 1 mL.
  • a layer of 20% sucrose / PBS solution (4 mL) and lentiviral vector solution (1 mL) was formed in the ultracentrifugation tube, and ultracentrifugation (41000 rpm, 4 ° C., 2 hr) was performed again.
  • the pellet of the precipitated lentiviral vector was well suspended in 400 ⁇ L DMEM to prepare a lentiviral vector solution.
  • the titer of the lentiviral vector was measured as follows. Preparation of retronectin coating plate: Retronectin [Takara Bio Inc. (Shiga, Japan), T100B] diluted with PBS to 100 ⁇ g / mL, flat bottom 48-well plate without surface treatment [IWAKI (Tokyo, Japan), 1830 -048] was added as 100 ⁇ L / well. Then, the plate was allowed to stand at 4 ° C. overnight. Before using the plate, the retronectin solution was removed and blocked with PBS containing 2% FBS for 30 minutes at room temperature, and the following operation was performed.
  • LVSIN-EF1 ⁇ -COL7A1 lentiviral vector or LVSIN-PGK-COL7A1 lentiviral vector (see Figure 18) on a 48-well plate coated with retronectin in each well at any viral volume.
  • 2000 g was centrifuged at 32 ° C for 2 hours. After that, the virus solution was removed and washed once with PBS. The blister-derived cells were then stripped from the plate using Accutase-Solution and recovered using medium. The number of recovered cells was measured and seeded on the above-mentioned retronectin-coated 48-well plate so as to be 12500 cells / well.
  • the virus solution was removed and washed once with PBS.
  • the blister-derived cells were then stripped from the plate using Accutase-Solution and recovered using medium. The number of recovered cells was measured and seeded on the above-mentioned retronectin-coated 48-well plate so as to be 12500 cells / well.
  • Immunostaining Blisters-derived cells 14 days after lentivirus infection were stripped from the plate using Accutase-Solution and recovered using medium. The number of recovered cells was measured, seeded on a CC2 coated chamber slide [Thermo Fisher Science (Tokyo, Japan), 154852] so as to be 50,000 cells / well, and cultured in a CO 2 incubator.
  • FIGS. 19 and 20 The results are shown in FIGS. 19 and 20.
  • the highest rates of type VII collagen-positive cells were those infected with MOI2 in all cells, about 30% with the LVSIN-EF1 ⁇ -COL7A1 lentiviral vector and about 30% with the LVSIN-PGK-COL7A1 lentiviral vector. It was 16%.
  • blistering-derived cells infected with the LVSIN-EF1 ⁇ -COL7A1 lentiviral vector have a higher rate of type VII collagen-positive cells than blistering-derived cells infected with the LVSIN-PGK-COL7A1 lentiviral vector. And the dyeing intensity was strong.
  • FACS flow cytometry
  • FIG. 22 The results are shown in FIG. The percentage of cells contained in the framed portion of each FACS data is shown in FIG. 22 (left) as the type VII collagen-positive cell rate. Further, the average fluorescence intensity (MFI: Mean Fluorescence Intensity) in the region surrounded by the frame is shown in FIG. 22 (right) as the average fluorescence intensity of type VII collagen-positive cells. As shown in FIGS. 21 and 22 (left), the rate of type VII collagen-positive cells increased in a MOI-dependent manner. The highest rates of type VII collagen-positive cells were all infected with MOI 2, about 18% with the EF1 ⁇ -COL7A1 lentivirus and about 12% with the PGK-COL7A1 lentivirus. Moreover, as shown in FIG.
  • the MFI of the EF1 ⁇ -COL7A1 lentivirus-infected cells was about 2.2 times higher than that of the PGK-COL7A1 lentivirus-infected cells. From this, it is considered that the EF1 ⁇ promoter expresses a larger amount of COL7A1 than the PGK promoter in the blister-derived cells gene-introduced with the lentiviral vector.
  • blisters-derived cells, human bone marrow-derived mesenchymal stem cells, and normal adult skin fibroblasts were infected with EF1 ⁇ -COL7A1 lentiviral vector or PGK-COL7A1 lentiviral vector and immunized by the same method as above. Staining and flow cytometry (FACS) were performed to measure the rate of type VII collagen positive cells. As a result, the rate of type VII collagen-positive cells was higher in blisters-derived cells than in human bone marrow-derived mesenchymal stem cells and normal adult skin fibroblasts.
  • FACS flow cytometry
  • VCN Vector Copy Number
  • VCN of blister-derived cells infected with type VII collagen-carrying lentiviral vector was analyzed.
  • the blister-derived cells were infected with a lentiviral vector by the same procedure as in "12. Analysis of type VII collagen gene transfer efficiency by immunostaining".
  • Cells 7, 14, 21, and 28 days after infection were stripped from the plate using Accutase-Solution and collected using medium.
  • Maxwell (TM) RSC Instrument Promega Corp. (Tokyo, Japan), AS4500]
  • Maxwell (TM) RSC Blood DNA Kit [Promega Corp. (Tokyo, Japan), AS1400] using, from the recovered cells Genomic DNA was extracted.
  • VNC was calculated from the recovered genomic DNA using the Lenti-X TM Provirus Quantitation Kit [Takara Bio Inc. (Shiga, Japan), 631239].
  • VCN increased in a MOI-dependent manner.
  • VCN decreased as the number of days of infection decreased, but VCN became stable after 21 days after infection. This result suggests that the type VII collagen gene inserted into the genome of blister-derived cells by the lentiviral vector can survive in the genome for a long period of time.
  • Type VII collagen in mice transplanted with vesicle-derived cells genetically modified by lentiviral vector Type VII collagen in the basement membrane of epidermolysis bullosa model mice into which the type VII collagen gene was introduced by lentiviral vector. was investigated to supply. First, the full-thickness skin of a newborn Col7A1 gene knockout mouse was transplanted to the back of an immunodeficient mouse. Immediately after transplantation, blisters were formed by pinching and rubbing the skin surface. Immediately, the space under the epidermis (inside the blisters) was infected with the LVSIN-EF1 ⁇ -COL7A1 lentiviral vector with MOI 5 from the cells created in "12. Analysis of type VII collagen gene transfer efficiency by immunostaining".
  • 1.0 ⁇ 10 6 blister-derived cells that had not been infected with the lentiviral vector were injected into the control group of mice.
  • the skin was collected and immunostained with an anti-type VII collagen antibody (clone LH7.2; Sigma Aldrich, C6805) to examine the deposition of type VII collagen on the basement membrane.
  • FIG. As shown in the figure, in mice in which blisters-derived cells infected with the LVSIN-EF1 ⁇ -COL7A1 lentiviral vector were injected into the blisters, type VII collagen deposition was observed near the basement membrane. On the other hand, no deposition of type VII collagen was observed in mice in which blister-derived cells not infected with the lentiviral vector were injected into the blisters. From this result, the blister-derived cells into which type VII collagen was introduced by the lentiviral vector can settle in the vicinity of the administration site after administration in the blister and supply type VII collagen to the adhesion site between the dermis and the basement membrane. Inferred.
  • the blisters-derived cells into which the COL7A1 gene has been introduced exert a higher therapeutic effect than the bone marrow-derived mesenchymal stem cells and fibroblasts in the gene therapy of dystrophy-type epidermolysis bullosa.

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Abstract

本開示は、栄養障害型表皮水疱症の治療に用いるための組成物であって、VII型コラーゲンを産生するよう遺伝子改変された栄養障害型表皮水疱症患者の水疱由来細胞を含む組成物などを含む。

Description

栄養障害型表皮水疱症の治療薬
　本出願は、特願２０２０－１２５６２０号について優先権を主張するものであり、ここに参照することによって、その全体が本明細書中へ組み込まれるものとする。
　本開示は、栄養障害型表皮水疱症の治療薬に関する。
　表皮水疱症は、皮膚組織の接着を担っている接着構造分子が欠損または消失していることにより、皮膚に力が加わると、表皮が真皮から剥がれて水ぶくれ（水疱）や皮膚潰瘍を生じる疾患である。このうち、表皮が千切れて水疱ができる病型は単純型表皮水疱症、表皮と基底膜の間が剥がれて水疱ができる病型は接合部型表皮水疱症、基底膜と真皮の間が剥がれる病型は栄養障害型表皮水疱症と称される。
　栄養障害型表皮水疱症は表皮水疱症全体の約５割と最も多い病型であり、VII型コラーゲンをコードするCOL7A1遺伝子の変異を原因とする遺伝性疾患である。皮膚の構造において、表皮の一番下にある表皮基底細胞は、基底膜と称されるシート様の構造体と結合している。VII型コラーゲンは、真皮内でアンカリングフィブリルという線維を形成し基底膜と真皮をつなげている。このため、VII型コラーゲン遺伝子に異常があると基底膜と真皮の接着機能が損なわれ基底膜と真皮の間で水疱ができる栄養障害型表皮水疱症となる。栄養障害型表皮水疱症のなかでも、重症劣性栄養障害型表皮水疱症は、生直後より全身熱傷様皮膚症状が続き、３０歳前後より高率に皮膚有棘細胞癌（瘢痕癌）が多発して死に至る、極めて重篤な遺伝性水疱性皮膚疾患である。
　表皮水疱症に対して、現在有効な治療法はなく、根治的に水疱形成を抑制する遺伝子治療法の開発が求められている。このような遺伝子治療として、患者の皮膚細胞を採取し、VII型コラーゲンを産生するよう遺伝子操作した後、培養して皮膚シートを形成し、患者に移植する治療技術が開示されている（特許文献１参照）。また、VII型コラーゲンの活性が失活している間葉系幹細胞に対してゲノム編集を施し、VII型コラーゲンを産生可能となった間葉系幹細胞をケラチノサイトや線維芽細胞に分化させると共に、培養して皮膚シートを形成し、患者の治療に用いることが提案されている（特許文献２参照）。
国際公開第２０１７/１２０１４７号公報 国際公開第２０１８/１５４４１３号公報
　皮膚シートは、高度な工程管理や培養技術が必要であることから製造の難易度が高く、高コストとなることから、より製造容易な治療薬が求められている。
　ある態様において、本開示は、栄養障害型表皮水疱症の治療に用いるための組成物であって、VII型コラーゲンを産生するよう遺伝子改変された栄養障害型表皮水疱症患者の水疱由来細胞を含む組成物に関する。
　本開示により、栄養障害型表皮水疱症の治療薬が提供される。
図１は、培養開始20日後までの水疱由来細胞の外観を示す写真である。 図２は、水疱由来細胞とヒト骨髄由来間葉系幹細胞のFACS解析の結果を示す。 図３は、水疱由来細胞とヒト骨髄由来間葉系幹細胞を、骨芽細胞、脂肪細胞、軟骨細胞への分化誘導条件下で培養し、それぞれアルカリホスファターゼ（ALP）染色、オイルレッドO染色、アルシアンブルー染色を行った結果を示す。 図４は、図３とは別の栄養障害型表皮水疱症患者の水疱由来細胞とヒト骨髄由来間葉系幹細胞を、骨芽細胞、脂肪細胞、軟骨細胞への分化誘導条件下で培養し、それぞれALP染色、オイルレッドO染色、アルシアンブルー染色を行った結果を示す。 図５は、各種細胞のVII型コラーゲン発現量および分泌量を示す。図５（上）は、細胞のライセートに対して抗VII型コラーゲン抗体を用いてウエスタンブロットを行った結果を示す写真（左）および得られたバンドの濃さを定量化したグラフ（右）である。図５（下）は、細胞を培養した培地に対してウエスタンブロットを行った結果を示す写真（左）および得られたバンドの濃さを定量化したグラフ（右）である。「KC」はヒト表皮角化細胞を示す。「FB」はヒト皮膚線維芽細胞を示す。「MSC」はヒト骨髄由来間葉系幹細胞を示す。「BFC」は水疱由来細胞を示す。 図６は、設計したsgRNA（sgAAVS1-#1～#3）によるゲノムDNAの切断およびその切断効率を示す。 図７は、AAVS1領域にCOL7A1遺伝子を導入するゲノム編集の説明図である。HA-RおよびHA-Lは相同配列部分、SAはスプライスアクセプター配列、T2AはT2AペプチドをコードするT2A配列、Puroはピューロマイシン耐性遺伝子、CAGはCAGプロモーター配列を示す。野生型ゲノム（上）でのF2からR2までの長さは1952bp、COL7A1遺伝子が導入されたゲノム（下）でのF1からR1までの長さは1246bp、F2からR2までの長さは14249bpである。 図８は、各種細胞にCRISPR-Cas9でCOL7A1遺伝子を導入した後のVII型コラーゲンの発現および分泌量を示す。図８（上）は、細胞のライセートに対して抗VII型コラーゲン抗体を用いてウエスタンブロットを行った結果を示す写真（左）および得られたバンドの濃さを定量化したグラフ（右）である。図８（下）は、細胞を培養した培地に対してウエスタンブロットを行った結果を示す写真（左）および得られたバンドの濃さを定量化したグラフ(右）である。「FB」はヒト皮膚線維芽細胞を示す。「MSC」はヒト骨髄由来間葉系幹細胞を示す。「BFC」は水疱由来細胞を示す。 図９は、表皮水疱症モデルマウスの作製の説明図である。右側の写真は、形成された水疱を示す。 図１０は、水疱由来細胞を水疱内に注入した表皮水疱症モデルマウスの皮膚断層画像を示す。左側の写真はVII型コラーゲンに対する免疫染色の結果を示し、右側の写真はDAPI染色とVII型コラーゲンに対する免疫染色の結果を重ねたものである。「Control」は遺伝子改変していない水疱由来細胞を注入したマウス、「CAG-hCOL7」はCOL7A1遺伝子を導入した水疱由来細胞を注入したマウスの結果を示す。 図１１は、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞または水疱由来細胞を皮内または水疱内に注入した表皮水疱症モデルマウスの皮膚断層写真である。写真は、VII型コラーゲンの沈着部分を示す。上から、遺伝子改変していないヒト骨髄由来間葉系幹細胞を真皮内に注入したマウスの結果（hMSC皮内）、COL7A1遺伝子を導入したヒト骨髄由来間葉系幹細胞を真皮内に注入したマウスの結果（COL7-hMSC皮内）、遺伝子改変していないヒト骨髄由来間葉系幹細胞を水疱内に注入したマウスの結果（hMSC水疱内）、COL7A1遺伝子を導入したヒト骨髄由来間葉系幹細胞を水疱内に注入したマウスの結果（COL7-hMSC水疱内）、およびCOL7A1遺伝子を導入した水疱由来細胞を水疱内に注入したマウスの結果（COL7-BF水疱内）を示す。 図１２左は、水疱内に投与した水疱由来細胞がどれだけ水疱内に定着するかを調べるための実験を説明する模式図である。図１２右は、水疱内に細胞を投与してから30分後に水疱から採取した水疱内溶液のホタルルシフェラーゼ活性レベルを表したグラフである。 図１３左は、生体内に投与した細胞の長期定着能を見るための実験を説明する模式図である。図１３右は、水疱内に細胞を投与してから1日後および9か月後のホタルルシフェラーゼ活性レベルを測定した写真である。「MSC」は骨髄由来間葉系幹細胞、「BFC」は水疱由来細胞を示す。 図１４左は、水疱内に細胞を投与した後のホタルルシフェラーゼ活性レベルの経時変化を示すグラフである。図１４右は、水疱内に細胞を投与してから1か月後のホタルルシフェラーゼ活性レベルを示すグラフである。 図１５は、各種細胞にGFPレンチウイルスベクターを感染させて７２時間経過後の蛍光顕微鏡写真である。「GFP」は、細胞の緑色蛍光を示す写真である。「merge」は、「GFP」の写真に明視野の写真を重ね合わせたものである。「MOI 1」では、細胞にレンチウイルスベクターをMOI 1で感染させた。「MOI 5」では、細胞にレンチウイルスベクターをMOI 5で感染させた。「BFC」は水疱由来細胞の写真であり、「MSC」はヒト骨髄由来間葉系幹細胞の写真であり、「NHDF」は正常成人皮膚線維芽細胞の写真である。 図１６は、各細胞種にMOI 1でGFPレンチウイルスベクターを感染させて72時間経過後の細胞のGFP陽性率を示すグラフである。 図１７は、プラスミドマップである。図１７（左）は、本発明者が作成したプラスミド、pLVSIN-EF1α-COL7A1の構造を示す。図１７（右）は、本発明者が作成したプラスミド、pLVSIN-PGK-COL7A1の構造を示す。pLVSINベクターは、SIN（self-inactivating）型のレンチウイルスベクタープラスミドで、EF1αプロモーター（左）またはPGKプロモーターに（右）よって、ヒトVII型コラーゲン遺伝子を発現する。 図１８は、本発明者が製造したレンチウイルスベクターの遺伝子構造を示す模式図である。図１８（上）に示すLVSIN-EF1α-COL7A1ベクターは、EF1αプロモーターとCOL7A1遺伝子を発現カセットに備える。図１８（下）に示すLVSIN-PGK-COL7A1ベクターは、PGKプロモーターとCOL7A1遺伝子を発現カセットに備える。本ベクターは、HIV-1 LTR（5'LTRおよび3'LTR/ΔU3）とパッケージングシグナル（ψ）に加えて、導入遺伝子の発現やウイルス力価などを向上させるためにWPRE（ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント）、cPPT/CTS（セントラルポリプリン配列/セントラルターミネーション配列）、およびRRE（Rev応答エレメント）を含む。 図１９は、水疱由来細胞にEF1α-COL7A1レンチウイルスベクターを感染させて14日経過後に抗VII型コラーゲン抗体を用いて免疫染色した写真である。「DAPI」は、DAPI染色の写真である。「EF1a-C7」は、VII型コラーゲンに対する免疫染色の結果を示す写真である。「mock」では、細胞にレンチウイルスベクターを感染させなかった。「MOI 0.5」「MOI 1」「MOI 2」では、細胞にレンチウイルスベクターを、それぞれMOI 0.5, MOI 1, MOI 2で感染させた。 図２０は、水疱由来細胞にPGK-COL7A1レンチウイルスベクターを感染させて14日経過後に抗VII型コラーゲン抗体を用いて免疫染色した写真である。「DAPI」は、DAPI染色の写真である。「PGK-C7」は、VII型コラーゲンに対する免疫染色の結果を示す写真である。「mock」では、細胞にレンチウイルスベクターを感染させなかった。「MOI 0.5」「MOI 1」「MOI 2」では、細胞にレンチウイルスベクターを、それぞれMOI 0.5, MOI 1, MOI 2で感染させた。 図２１は、水疱由来細胞をVII型コラーゲン遺伝子搭載レンチウイルスベクターで感染させ、14日経過後に抗VII型コラーゲン抗体を用いてFACS解析した結果を示す。「EF1a-C7」では、EF1αプロモーターとCOL7A1遺伝子を発現カセットに備えるレンチウイルスベクターで、水疱由来細胞を感染させた。「PGK-C7」では、PGKプロモーターとCOL7A1遺伝子を発現カセットに備えるレンチウイルスベクターで、水疱由来細胞を感染させた。「mock」では、細胞にレンチウイルスベクターを感染させなかった。「MOI 0.5」、「MOI 1」、および「MOI 2」では、細胞にレンチウイルスベクターを、それぞれMOI 0.5、MOI 1、およびMOI 2で感染させた。 図２２は、図２１に示すFACSデータを定量化したグラフである。図２２（左）は、VII型コラーゲン陽性細胞率を示す棒グラフである。図２２（右）は、VII型コラーゲン陽性細胞の平均蛍光強度を示す棒グラフである。 図２３は、VII型コラーゲン遺伝子搭載レンチウイルスベクターを感染させた水疱由来細胞のゲノム中のベクターコピー数の経時変化を示すグラフである。 図２４は、レンチウイルスベクターを用いてCOL7A1遺伝子を導入した水疱由来細胞を水疱内に注入した表皮水疱症モデルマウスの皮膚断層画像を示す。「DAPI」は、DAPI染色の写真である。「C7」は、VII型コラーゲンに対する免疫染色の結果を示す写真である。「merge」は、DAPI染色の結果とVII型コラーゲンに対する免疫染色の結果を重ねたものである。「未感染BFC」は、レンチウイルスベクターを感染させていない水疱由来細胞をマウスの水疱内に注入した結果を示す。「LVSIN-EF1a-C7感染BFC」は、レンチウイルスベクターによってCOL7A1遺伝子を導入した水疱由来細胞をマウスの水疱内に注入した結果を示す。
　特に具体的な定めのない限り、本開示で使用される用語は、有機化学、医学、薬学、分子生物学、微生物学等の分野における当業者に一般に理解されるとおりの意味を有する。以下にいくつかの本開示で使用される用語についての定義を記載するが、これらの定義は、本開示において、一般的な理解に優先する。
　栄養障害型表皮水疱症（Dystrophic Epidermolysis Bullosa, DEB）は、VII型コラーゲンをコードするCOL7A1遺伝子の変異を原因とする遺伝性疾患であり、VII型コラーゲンが全く産生されないか、変異により機能の低下したVII型コラーゲンが産生されることが、その特徴として知られている。VII型コラーゲンは、真皮内でアンカリングフィブリルという線維を形成し、基底膜と真皮とをつないでいる。VII型コラーゲンは、N末端から、第一非コラーゲン領域、コラーゲン領域、および第二非コラーゲン領域を含み、グリシン-X-Yの繰り返し配列を特徴とするコラーゲン領域部分で3本鎖を形成し、C末端で2分子が結合し、N末端が基底膜に結合する。変異には、コラーゲン領域のグリシンが他のアミノ酸に置換される変異、タンパク質の翻訳が止まる終始コドン変異、スプライス部位変異などがある。変異は、対立遺伝子の一方にある場合と、両方にある場合がある。栄養障害型表皮水疱症には、優性栄養障害型と劣性栄養障害型とが含まれ、劣性栄養障害型には、重症汎発型と、比較的症状の軽いその他の汎発型が含まれる。本明細書における栄養障害型表皮水疱症は、いずれの病型の栄養障害型表皮水疱症であってもよく、また、如何なるCOL7A1遺伝子の変異を原因とするものであってもよい。
　水疱とは、表皮下に、体液、組織液等の液体が溜まったものをいう。好ましくは、水疱は、表皮が真皮から剥離することにより表皮と真皮との間に形成された空間に液体が溜まった形態の水疱である。より好ましくは、水疱は、表皮の基底膜が真皮から剥離することにより当該基底膜と真皮との間に形成された空間に液体が溜まった形態の水疱である。
　本開示において、栄養障害型表皮水疱症患者の水疱由来細胞とは、栄養障害型表皮水疱症患者の水疱内から採取される付着性の細胞をいい、本開示において「DEB患者水疱由来細胞」または「水疱由来細胞」とも称される。当該細胞は、栄養障害型表皮水疱症患者の水疱内容物を固相上で培養することによって得ることができる。一実施形態では、水疱内容物は、水泡内に溜まった液体であり、本明細書においてこの液体を「水疱内溶液」と称する。水疱内容物は、注射器等の手段により、栄養障害型表皮水疱症患者の水疱から採取することができる。例えば、水疱内溶液の場合、注射針を水疱内に穿刺し、注射針の先端を表皮と真皮との間に形成された空間内に位置させた状態で注射器の押し子を引くことで、注射器のシリンジ内に水疱内溶液を吸引することができる。一実施形態では、水疱由来細胞は、水疱内溶液をコラゲナーゼ、ディスパーゼ等の酵素で処理せず培地に播種して固相上で培養することにより、得ることができる。具体的には、水疱から採取した水疱内溶液を直接培地に播種し、当該培地を固相上で所定時間インキュベートした後、固相上に付着した細胞を水疱由来細胞とすることができる。このとき、固相上でコロニーを形成した細胞を取得することが好ましい。水疱内溶液は、採取後、3時間以内に培地に播種することが好ましく、2時間以内に播種することがより好ましく、1時間以内に播種することがさらに好ましい。本開示において、固相とは、細胞が接着できる固体の支持体を意味し、例えば、プラスチック製またはガラス製の、培養皿、フラスコ、マルチウェルプレートなどの培養容器が含まれる。ある実施形態では、固相は、プラスチック製の培養容器である。固相はコーティングされていてもよく、コーティング用の物質としては、例えば、コラーゲンI、ラミニン、ビトロネクチン、フィブロネクチン、ポリL-リジン、ポリL-オルニチンなどが挙げられる。ある実施形態では、固相はコラーゲンIでコーティングされている。培養は、一般的なインキュベーター内で、「37℃、5％CO2」、「37℃、5％O2、5％CO2」などの条件下で行うことができる。培養用の培地は、動物細胞の培養に用いることができる培地であればよく、例えば、MEM、MEMα、DMEM、GMEM、RPMI 1640、MesenCultTM（STEMCELL Technologies社）、Mesenchymal Stem Cell Growth Medium 2 (PromoCell社)、MSCGM Mesenchymal Stem Cell Growth Medium（Lonza社）、Cellartis MSC Xeno-Free Culture Medium（タカラバイオ社）、およびこれらの混合培地などが挙げられる。その中でも、MesenCultTM、Mesenchymal Stem Cell Growth Medium 2、MSCGM Mesenchymal Stem Cell Growth Medium、Cellartis MSC Xeno-Free Culture Medium等の間葉系幹細胞用培地が好ましく用いられる。また、培地は、無血清培地であることが好ましい。培養期間は、細胞が固相に接着するのに十分な期間であればよく、例えば、、1日間～数カ月間（例えば、2、3または4カ月間）、1日間～1カ月間、1日間～数週間（例えば、2、3または4週間）、1日間～1週間でありうる。
　ある実施形態において、DEB患者の水疱由来細胞は、以下の1)～6)から選択される１つ以上の特徴を有する：
　1)固相への接着性を有する、
　2)CD73、CD105およびCD90からなる群より選択される一つ以上の表面マーカーが陽性である、
　3)CD45、CD34、CD11b、CD79A、HLA-DRおよびCD31からなる群より選択される一つ以上の表面マーカーが陰性である、
　4)骨芽細胞への分化能を有しない、又は骨髄由来間葉系幹細胞と比較して当該分化能が低い、
　5)脂肪細胞への分化能を有しない、又は骨髄由来間葉系幹細胞と比較して当該分化能が低い、
　6)軟骨細胞への分化能を有しない、又は骨髄由来間葉系幹細胞と比較して当該分化能が低い。
　本開示において、ある細胞が骨芽細胞、脂肪細胞または軟骨細胞への「分化能を有しない」とは、通常の分化誘導条件および検出方法（染色等）を用いて骨芽細胞、脂肪細胞または軟骨細胞への分化を検出できないことを意味する。
　ある実施形態において、DEB患者水疱由来細胞は、CD73陽性、CD105陽性、且つCD90陽性の細胞である。別の実施形態において、DEB患者水疱由来細胞は、CD45陰性、CD34陰性、CD11b陰性、CD79A陰性、HLA-DR陰性、且つCD31陰性の細胞である。さらなる実施形態において、DEB患者水疱由来細胞は、骨芽細胞への分化能、脂肪細胞への分化能、および軟骨細胞への分化能がいずれも骨髄由来間葉系幹細胞と比較して低い細胞である。さらなる実施形態において、DEB患者水疱由来細胞は、骨芽細胞への分化能および脂肪細胞への分化能が骨髄由来間葉系幹細胞と比較して低く、且つ、軟骨細胞への分化能を有しない細胞である。
　本開示においては、VII型コラーゲンを産生するよう遺伝子改変された栄養障害型表皮水疱症患者の水疱由来細胞が用いられる。本開示における「VII型コラーゲンを産生するよう遺伝子改変された細胞」とは、機能的な（すなわち、アンカリングフィブリルを形成しうる）VII型コラーゲンを産生するよう遺伝子改変された細胞を意味する。
　本開示において、細胞の遺伝子改変とは、細胞のゲノムの遺伝子を改変することと、ゲノム外の核酸構築物（例えば、ベクター）から遺伝子を発現するよう細胞を改変することのいずれをも意味する。すなわち、「VII型コラーゲンを産生するよう遺伝子改変する」との表現には、ゲノム中のCOL7A1遺伝子からVII型コラーゲンを発現するよう細胞を改変すること、およびゲノム外の核酸構築物のCOL7A1遺伝子からVII型コラーゲンを発現するよう細胞を改変することが含まれる。また、「VII型コラーゲンを産生するよう遺伝子改変された細胞」には、ゲノム中のCOL7A1遺伝子からVII型コラーゲンを発現する細胞と、ゲノム外の核酸構築物のCOL7A1遺伝子からVII型コラーゲンを発現する細胞とが含まれる。
　細胞の遺伝子改変は、COL7A1遺伝子を導入することにより、またはゲノムのCOL7A1遺伝子の変異を修正することにより、行うことができる。COL7A1遺伝子の導入は、細胞のゲノムにCOL7A1遺伝子を導入することによっても、ゲノム外の核酸構築物からCOL7A1遺伝子を発現するよう、COL7A1遺伝子を含む核酸構築物を細胞内に存在させることによっても、行うことができる。COL7A1遺伝子を細胞のゲノムに導入する場合、特定の位置に導入してもよく、ランダムに導入してもよい。ある実施形態において、COL7A1遺伝子は、ゲノムのCOL7A1遺伝子座、またはAAVS1領域のようなセーフ・ハーバーに導入される。
　DEB患者水疱由来細胞は、その細胞が投与される栄養障害型表皮水疱症患者の細胞（すなわち、自家細胞）であっても、その細胞の投与を受ける患者とは別の栄養障害型表皮水疱症患者の細胞（すなわち、他家細胞）であってよい。栄養障害型表皮水疱症患者の細胞には、VII型コラーゲンを産生しない細胞と、VII型コラーゲンを産生するが変異によりその機能が低下している細胞とがあるが、本開示における「栄養障害型表皮水疱症患者の細胞」は、そのいずれであってもよい。
　DEB患者水疱由来細胞は、患者に投与された場合に表皮基底膜近傍でVII型コラーゲンを産生しうる細胞であればよい。
　本開示において、細胞は、必要に応じて増殖させたものを包含する意味で用いられる。細胞の増殖は、細胞を培養することによって行うことができる。例えば、「（栄養障害型表皮水疱症患者の）水疱由来細胞」は、患者から取得された後に増殖させたものを包含し、「遺伝子改変された細胞」は、遺伝子改変操作により得られた細胞を増殖させたものを包含する。遺伝子改変を行う場合、遺伝子改変に必要な量を得るまで、細胞を増殖させてもよい。また、遺伝子改変後に、治療に必要な量を得るまで、細胞を増殖させてもよい。
　本明細書において、「細胞」とは、文脈に応じて１個の細胞または複数個の細胞を意味しうる。また、細胞は、一種類の細胞からなる細胞集団であってもよく、複数種の細胞を含む細胞集団であってもよい。
　本明細書において、COL7A1遺伝子とは、VII型コラーゲンをコードする核酸配列を意味し、cDNAも、１以上のイントロンを含む配列（例えば、ゲノム配列またはミニジーン）も包含する意味で用いられる。ヒトCOL7A1遺伝子（cDNA）の代表的核酸配列を配列番号１に、ヒトVII型コラーゲンの代表的アミノ酸配列を配列番号２に示す。COL7A1遺伝子のcDNA配列はGenBank: NM_000094.3に、ゲノム配列はGenBank: AC121252.4に開示されている。COL7A1遺伝子は、機能的な（すなわち、アンカリングフィブリルを形成しうる）VII型コラーゲンをコードするものであればよく、その配列は限定されない。

ヒトCOL7A1遺伝子のcDNA配列（8835 bp）（配列番号１）
ATGACGCTGCGGCTTCTGGTGGCCGCGCTCTGCGCCGGGATCCTGGCAGAGGCGCCCCGAGTGCGAGCCCAGCACAGGGAGAGAGTGACCTGCACGCGCCTTTACGCCGCTGACATTGTGTTCTTACTGGATGGCTCCTCATCCATTGGCCGCAGCAATTTCCGCGAGGTCCGCAGCTTTCTCGAAGGGCTGGTGCTGCCTTTCTCTGGAGCAGCCAGTGCACAGGGTGTGCGCTTTGCCACAGTGCAGTACAGCGATGATCCACGGACAGAGTTCGGCCTGGATGCACTTGGCTCTGGGGGTGATGTGATCCGCGCCATCCGTGAGCTTAGCTACAAGGGGGGCAACACTCGCACAGGGGCTGCAATTCTCCATGTGGCTGACCATGTCTTCCTGCCCCAGCTGGCCCGACCTGGTGTCCCCAAGGTCTGCATCCTGATCACAGACGGGAAGTCCCAGGACCTGGTGGACACAGCTGCCCAAAGGCTGAAGGGGCAGGGGGTCAAGCTATTTGCTGTGGGGATCAAGAATGCTGACCCTGAGGAGCTGAAGCGAGTTGCCTCACAGCCCACCAGTGACTTCTTCTTCTTCGTCAATGACTTCAGCATCTTGAGGACACTACTGCCCCTCGTTTCCCGGAGAGTGTGCACGACTGCTGGTGGCGTGCCTGTGACCCGACCTCCGGATGACTCGACCTCTGCTCCACGAGACCTGGTGCTGTCTGAGCCAAGCAGCCAATCCTTGAGAGTACAGTGGACAGCGGCCAGTGGCCCTGTGACTGGCTACAAGGTCCAGTACACTCCTCTGACGGGGCTGGGACAGCCACTGCCGAGTGAGCGGCAGGAGGTGAACGTCCCAGCTGGTGAGACCAGTGTGCGGCTGCGGGGTCTCCGGCCACTGACCGAGTACCAAGTGACTGTGATTGCCCTCTACGCCAACAGCATCGGGGAGGCTGTGAGCGGGACAGCTCGGACCACTGCCCTAGAAGGGCCGGAACTGACCATCCAGAATACCACAGCCCACAGCCTCCTGGTGGCCTGGCGGAGTGTGCCAGGTGCCACTGGCTACCGTGTGACATGGCGGGTCCTCAGTGGTGGGCCCACACAGCAGCAGGAGCTGGGCCCTGGGCAGGGTTCAGTGTTGCTGCGTGACTTGGAGCCTGGCACGGACTATGAGGTGACCGTGAGCACCCTATTTGGCCGCAGTGTGGGGCCCGCCACTTCCCTGATGGCTCGCACTGACGCTTCTGTTGAGCAGACCCTGCGCCCGGTCATCCTGGGCCCCACATCCATCCTCCTTTCCTGGAACTTGGTGCCTGAGGCCCGTGGCTACCGGTTGGAATGGCGGCGTGAGACTGGCTTGGAGCCACCGCAGAAGGTGGTACTGCCCTCTGATGTGACCCGCTACCAGTTGGATGGGCTGCAGCCGGGCACTGAGTACCGCCTCACACTCTACACTCTGCTGGAGGGCCACGAGGTGGCCACCCCTGCAACCGTGGTTCCCACTGGACCAGAGCTGCCTGTGAGCCCTGTAACAGACCTGCAAGCCACCGAGCTGCCCGGGCAGCGGGTGCGAGTGTCCTGGAGCCCAGTCCCTGGTGCCACCCAGTACCGCATCATTGTGCGCAGCACCCAGGGGGTTGAGCGGACCCTGGTGCTTCCTGGGAGTCAGACAGCATTCGACTTGGATGACGTTCAGGCTGGGCTTAGCTACACTGTGCGGGTGTCTGCTCGAGTGGGTCCCCGTGAGGGCAGTGCCAGTGTCCTCACTGTCCGCCGGGAGCCGGAAACTCCACTTGCTGTTCCAGGGCTGCGGGTTGTGGTGTCAGATGCAACGCGAGTGAGGGTGGCCTGGGGACCCGTCCCTGGAGCCAGTGGATTTCGGATTAGCTGGAGCACAGGCAGTGGTCCGGAGTCCAGCCAGACACTGCCCCCAGACTCTACTGCCACAGACATCACAGGGCTGCAGCCTGGAACCACCTACCAGGTGGCTGTGTCGGTACTGCGAGGCAGAGAGGAGGGCCCTGCTGCAGTCATCGTGGCTCGAACGGACCCACTGGGCCCAGTGAGGACGGTCCATGTGACTCAGGCCAGCAGCTCATCTGTCACCATTACCTGGACCAGGGTTCCTGGCGCCACAGGATACAGGGTTTCCTGGCACTCAGCCCACGGCCCAGAGAAATCCCAGTTGGTTTCTGGGGAGGCCACGGTGGCTGAGCTGGATGGACTGGAGCCAGATACTGAGTATACGGTGCATGTGAGGGCCCATGTGGCTGGCGTGGATGGGCCCCCTGCCTCTGTGGTTGTGAGGACTGCCCCTGAGCCTGTGGGTCGTGTGTCGAGGCTGCAGATCCTCAATGCTTCCAGCGACGTTCTACGGATCACCTGGGTAGGGGTCACTGGAGCCACAGCTTACAGACTGGCCTGGGGCCGGAGTGAAGGCGGCCCCATGAGGCACCAGATACTCCCAGGAAACACAGACTCTGCAGAGATCCGGGGTCTCGAAGGTGGAGTCAGCTACTCAGTGCGAGTGACTGCACTTGTCGGGGACCGCGAGGGCACACCTGTCTCCATTGTTGTCACTACGCCGCCTGAGGCTCCGCCAGCCCTGGGGACGCTTCACGTGGTGCAGCGCGGGGAGCACTCGCTGAGGCTGCGCTGGGAGCCGGTGCCCAGAGCGCAGGGCTTCCTTCTGCACTGGCAACCTGAGGGTGGCCAGGAACAGTCCCGGGTCCTGGGGCCCGAGCTCAGCAGCTATCACCTGGACGGGCTGGAGCCAGCGACACAGTACCGCGTGAGGCTGAGTGTCCTAGGGCCAGCTGGAGAAGGGCCCTCTGCAGAGGTGACTGCGCGCACTGAGTCACCTCGTGTTCCAAGCATTGAACTACGTGTGGTGGACACCTCGATCGACTCGGTGACTTTGGCCTGGACTCCAGTGTCCAGGGCATCCAGCTACATCCTATCCTGGCGGCCACTCAGAGGCCCTGGCCAGGAAGTGCCTGGGTCCCCGCAGACACTTCCAGGGATCTCAAGCTCCCAGCGGGTGACAGGGCTAGAGCCTGGCGTCTCTTACATCTTCTCCCTGACGCCTGTCCTGGATGGTGTGCGGGGTCCTGAGGCATCTGTCACACAGACGCCAGTGTGCCCCCGTGGCCTGGCGGATGTGGTGTTCCTACCACATGCCACTCAAGACAATGCTCACCGTGCGGAGGCTACGAGGAGGGTCCTGGAGCGTCTGGTGTTGGCACTTGGGCCTCTTGGGCCACAGGCAGTTCAGGTTGGCCTGCTGTCTTACAGTCATCGGCCCTCCCCACTGTTCCCACTGAATGGCTCCCATGACCTTGGCATTATCTTGCAAAGGATCCGTGACATGCCCTACATGGACCCAAGTGGGAACAACCTGGGCACAGCCGTGGTCACAGCTCACAGATACATGTTGGCACCAGATGCTCCTGGGCGCCGCCAGCACGTACCAGGGGTGATGGTTCTGCTAGTGGATGAACCCTTGAGAGGTGACATATTCAGCCCCATCCGTGAGGCCCAGGCTTCTGGGCTTAATGTGGTGATGTTGGGAATGGCTGGAGCGGACCCAGAGCAGCTGCGTCGCTTGGCGCCGGGTATGGACTCTGTCCAGACCTTCTTCGCCGTGGATGATGGGCCAAGCCTGGACCAGGCAGTCAGTGGTCTGGCCACAGCCCTGTGTCAGGCATCCTTCACTACTCAGCCCCGGCCAGAGCCCTGCCCAGTGTATTGTCCAAAGGGCCAGAAGGGGGAACCTGGAGAGATGGGCCTGAGAGGACAAGTTGGGCCTCCTGGCGACCCTGGCCTCCCGGGCAGGACCGGTGCTCCCGGCCCCCAGGGGCCCCCTGGAAGTGCCACTGCCAAGGGCGAGAGGGGCTTCCCTGGAGCAGATGGGCGTCCAGGCAGCCCTGGCCGCGCCGGGAATCCTGGGACCCCTGGAGCCCCTGGCCTAAAGGGCTCTCCAGGGTTGCCTGGCCCTCGTGGGGACCCGGGAGAGCGAGGACCTCGAGGCCCAAAGGGGGAGCCGGGGGCTCCCGGACAAGTCATCGGAGGTGAAGGACCTGGGCTTCCTGGGCGGAAAGGGGACCCTGGACCATCGGGCCCCCCTGGACCTCGTGGACCACTGGGGGACCCAGGACCCCGTGGCCCCCCAGGGCTTCCTGGAACAGCCATGAAGGGTGACAAAGGCGATCGTGGGGAGCGGGGTCCCCCTGGACCAGGTGAAGGTGGCATTGCTCCTGGGGAGCCTGGGCTGCCGGGTCTTCCCGGAAGCCCTGGACCCCAAGGCCCCGTTGGCCCCCCTGGAAAGAAAGGAGAAAAAGGTGACTCTGAGGATGGAGCTCCAGGCCTCCCAGGACAACCTGGGTCTCCGGGTGAGCAGGGCCCACGGGGACCTCCTGGAGCTATTGGCCCCAAAGGTGACCGGGGCTTTCCAGGGCCCCTGGGTGAGGCTGGAGAGAAGGGCGAACGTGGACCCCCAGGCCCAGCGGGATCCCGGGGGCTGCCAGGGGTTGCTGGACGTCCTGGAGCCAAGGGTCCTGAAGGGCCACCAGGACCCACTGGCCGCCAAGGAGAGAAGGGGGAGCCTGGTCGCCCTGGGGACCCTGCAGTGGTGGGACCTGCTGTTGCTGGACCCAAAGGAGAAAAGGGAGATGTGGGGCCCGCTGGGCCCAGAGGAGCTACCGGAGTCCAAGGGGAACGGGGCCCACCCGGCTTGGTTCTTCCTGGAGACCCTGGCCCCAAGGGAGACCCTGGAGACCGGGGTCCCATTGGCCTTACTGGCAGAGCAGGACCCCCAGGTGACTCAGGGCCTCCTGGAGAGAAGGGAGACCCTGGGCGGCCTGGCCCCCCAGGACCTGTTGGCCCCCGAGGACGAGATGGTGAAGTTGGAGAGAAAGGTGACGAGGGTCCTCCGGGTGACCCGGGTTTGCCTGGAAAAGCAGGCGAGCGTGGCCTTCGGGGGGCACCTGGAGTTCGGGG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ヒトVII型コラーゲンのアミノ酸配列（2944 AA）（配列番号２）
MTLRLLVAALCAGILAEAPRVRAQHRERVTCTRLYAADIVFLLDGSSSIGRSNFREVRSFLEGLVLPFSGAASAQGVRFATVQYSDDPRTEFGLDALGSGGDVIRAIRELSYKGGNTRTGAAILHVADHVFLPQLARPGVPKVCILITDGKSQDLVDTAAQRLKGQGVKLFAVGIKNADPEELKRVASQPTSDFFFFVNDFSILRTLLPLVSRRVCTTAGGVPVTRPPDDSTSAPRDLVLSEPSSQSLRVQWTAASGPVTGYKVQYTPLTGLGQPLPSERQEVNVPAGETSVRLRGLRPLTEYQVTVIALYANSIGEAVSGTARTTALEGPELTIQNTTAHSLLVAWRSVPGATGYRVTWRVLSGGPTQQQELGPGQGSVLLRDLEPGTDYEVTVSTLFGRSVGPATSLMARTDASVEQTLRPVILGPTSILLSWNLVPEARGYRLEWRRETGLEPPQKVVLPSDVTRYQLDGLQPGTEYRLTLYTLLEGHEVATPATVVPTGPELPVSPVTDLQATELPGQRVRVSWSPVPGATQYRIIVRSTQGVERTLVLPGSQTAFDLDDVQAGLSYTVRVSARVGPREGSASVLTVRREPETPLAVPGLRVVVSDATRVRVAWGPVPGASGFRISWSTGSGPESSQTLPPDSTATDITGLQPGTTYQVAVSVLRGREEGPAAVIVARTDPLGPVRTVHVTQASSSSVTITWTRVPGATGYRVSWHSAHGPEKSQLVSGEATVAELDGLEPDTEYTVHVRAHVAGVDGPPASVVVRTAPEPVGRVSRLQILNASSDVLRITWVGVTGATAYRLAWGRSEGGPMRHQILPGNTDSAEIRGLEGGVSYSVRVTALVGDREGTPVSIVVTTPPEAPPALGTLHVVQRGEHSLRLRWEPVPRAQGFLLHWQPEGGQEQSRVLGPELSSYHLDGLEPATQYRVRLSVLGPAGEGPSAEVTARTESPRVPSIELRVVDTSIDSVTLAWTPVSRASSYILSWRPLRGPGQEVPGSPQTLPGISSSQRVTGLEPGVSYIFSLTPVLDGVRGPEASVTQTPVCPRGLADVVFLPHATQDNAHRAEATRRVLERLVLALGPLGPQAVQVGLLSYSHRPSPLFPLNGSHDLGIILQRIRDMPYMDPSGNNLGTAVVTAHRYMLAPDAPGRRQHVPGVMVLLVDEPLRGDIFSPIREAQASGLNVVMLGMAGADPEQLRRLAPGMDSVQTFFAVDDGPSLDQAVSGLATALCQASFTTQPRPEPCPVYCPKGQKGEPGEMGLRGQVGPPGDPGLPGRTGAPGPQGPPGSATAKGERGFPGADGRPGSPGRAGNPGTPGAPGLKGSPGLPGPRGDPGERGPRGPKGEPGAPGQVIGGEGPGLPGRKGDPGPSGPPGPRGPLGDPGPRGPPGLPGTAMKGDKGDRGERGPPGPGEGGIAPGEPGLPGLPGSPGPQGPVGPPGKKGEKGDSEDGAPGLPGQPGSPGEQGPRGPPGAIGPKGDRGFPGPLGEAGEKGERGPPGPAGSRGLPGVAGRPGAKGPEGPPGPTGRQGEKGEPGRPGDPAVVGPAVAGPKGEKGDVGPAGPRGATGVQGERGPPGLVLPGDPGPKGDPGDRGPIGLTGRAGPPGDSGPPGEKGDPGRPGPPGPVGPRGRDGEVGEKGDEGPPGDPGLPGKAGERGLRGAPGVRGPVGEKGDQGDPGEDGRNGSPGSSGPKGDRGEPGPPGPPGRLVDTGPGAREKGEPGDRGQEGPRGPKGDPGLPGAPGERGIEGFRGPPGPQGDPGVRGPAGEKGDRGPPGLDGRSGLDGKPGAAGPSGPNGAAGKAGDPGRDGLPGLRGEQGLPGPSGPPGLPGKPGEDGKPGLNGKNGEPGDPGEDGRKGEKGDSGASGREGRDGPKGERGAPGILGPQGPPGLPGPVGPPGQGFPGVPGGTGPKGDRGETGSKGEQGLPGERGLRGEPGSVPNVDRLLETAGIKASALREIVETWDESSGSFLPVPERRRGPKGDSGEQGPPGKEGPIGFPGERGLKGDRGDPGPQGPPGLALGERGPPGPSGLAGEPGKPGIPGLPGRAGGVGEAGRPGERGERGEKGERGEQGRDGPPGLPGTPGPPGPPGPKVSVDEPGPGLSGEQGPPGLKGAKGEPGSNGDQGPKGDRGVPGIKGDRGEPGPRGQDGNPGLPGERGMAGPEGKPGLQGPRGPPGPVGGHGDPGPPGAPGLAGPAGPQGPSGLKGEPGETGPPGRGLTGPTGAVGLPGPPGPSGLVGPQGSPGLPGQVGETGKPGAPGRDGASGKDGDRGSPGVPGSPGLPGPVGPKGEPGPTGAPGQAVVGLPGAKGEKGAPGGLAGDLVGEPGAKGDRGLPGPRGEKGEAGRAGEPGDPGEDGQKGAPGPKGFKGDPGVGVPGSPGPPGPPGVKGDLGLPGLPGAPGVVGFPGQTGPRGEMGQPGPSGERGLAGPPGREGIPGPLGPPGPPGSVGPPGASGLKGDKGDPGVGLPGPRGERGEPGIRGEDGRPGQEGPRGLTGPPGSRGERGEKGDVGSAGLKGDKGDSAVILGPPGPRGAKGDMGERGPRGLDGDKGPRGDNGDPGDKGSKGEPGDKGSAGLPGLRGLLGPQGQPGAAGIPGDPGSPGKDGVPGIRGEKGDVGFMGPRGLKGERGVKGACGLDGEKGDKGEAGPPGRPGLAGHKGEMGEPGVPGQSGAPGKEGLIGPKGDRGFDGQPGPKGDQGEKGERGTPGIGGFPGPSGNDGSAGPPGPPGSVGPRGPEGLQGQKGERGPPGERVVGAPGVPGAPGERGEQGRPGPAGPRGEKGEAALTEDDIRGFVRQEMSQHCACQGQFIASGSRPLPSYAADTAGSQLHAVPVLRVSHAEEEERVPPEDDEYSEYSEYSVEEYQDPEAPWDSDDPCSLPLDEGSCTAYTLRWYHRAVTGSTEACHPFVYGGCGGNANRFGTREACERRCPPRVVQSQGTGTAQD*
　ある実施形態において、COL7A1遺伝子は、配列番号１の核酸配列と70%、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％または99％以上の配列同一性を有する核酸配列を含むか、前記核酸配列からなる。別の実施形態において、COL7A1遺伝子は、配列番号１の核酸配列において1～30個、1～20個、1～10個、1～5個、1～3個、1～2個または1個の塩基が挿入、欠失、置換、または付加された核酸配列を含むか、前記核酸配列からなる。さらなる実施形態において、COL7A1遺伝子は、配列番号１の核酸配列を含むか、配列番号１の核酸配列からなる。
　ある実施形態において、VII型コラーゲンは、配列番号２のアミノ酸配列と70%、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％または99％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、前記アミノ酸配列からなる。別の実施形態において、VII型コラーゲンは、配列番号２のアミノ酸配列において1～30個、1～20個、1～10個、1～5個、1～3個、1～2個または1個のアミノ酸残基が挿入、欠失、置換、または付加されたアミノ酸配列を含むか、前記アミノ酸配列からなる。さらなる実施形態において、VII型コラーゲンは、配列番号２のアミノ酸配列を含むか、配列番号２のアミノ酸配列からなる。
　ある実施形態において、COL7A1遺伝子は、配列番号２のアミノ酸配列と70%、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％または99％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列を含むか、前記核酸配列からなる。別の実施形態において、COL7A1遺伝子は、配列番号２のアミノ酸配列において1～30個、1～20個、1～10個、1～5個、1～3個、1～2個または1個のアミノ酸残基が挿入、欠失、置換、または付加されたアミノ酸配列をコードする核酸配列を含むか、前記核酸配列からなる。
　本明細書における、核酸配列またはアミノ酸配列に関する「配列同一性」とは、比較対象の配列の全領域にわたって最適な状態に（一致が最大となる状態に）アラインメントされた２つの配列間で一致する塩基またはアミノ酸残基の割合を意味する。ここで、比較対象の配列は、2つの配列の最適なアラインメントにおいて、挿入、付加または欠失（例えばギャップ等）を有していてもよい。配列同一性は、公共のデータベース（例えば、DDBJ（http://www.ddbj.nig.ac.jp））で提供されるFASTA、BLAST、CLUSTAL W等のプログラムを用いて算出することができる。あるいは、市販の配列解析ソフトウェア（例えば、Vector NTI（登録商標）ソフトウェア、GENETYX（登録商標） ver. 12）を用いて求めることもできる。
　細胞を遺伝子改変する方法は、特に限定されない。ある実施形態において、細胞は、CRISPRシステム（例えば、CRISPR/Cas9、CRISPR/Cpf1）、TALEN、ZFNなどのゲノム編集により、遺伝子改変される。別の実施形態において、細胞は、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターなどのウイルスベクターにより、遺伝子改変される。さらなる実施形態において、細胞は、CRISPR/Cas9により遺伝子改変される。さらなる実施形態において、細胞は、レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターにより遺伝子改変される。
　ゲノム編集による場合、ゲノムに切断を生じさせるとともに、目的の配列を含むドナーベクターを細胞に導入することにより、当該配列をゲノムの切断部位に挿入することができる。ゲノムに挿入する配列は、COL7A1遺伝子、またはCOL7A1遺伝子の変異を含む部位と置換するための配列（例えば、COL7A1遺伝子の部分配列）でありうる。ドナーベクターは、目的の配列に加えて、目的の配列の発現を制御するプロモーターやエンハンサーなどの調節配列や細胞選択のための薬剤耐性遺伝子などの他の要素を含んでよく、その両端にゲノムの挿入部位の両端に相同な配列を含んでもよい。ドナーベクターは、非相同性末端結合または相同組み換えにより、所望の部位に導入されうる。ドナーベクターとしては、プラスミドや、アデノ随伴ウイルスベクター、インテグラーゼ欠損型レンチウイルスベクターなどのウイルスベクターを使用することができる。
　CRISPRシステムでは、Cas9またはCas12（例えば、Cas12a（Cpf1ともいう）、Cas12b、Cas12e）などのエンドヌクレアーゼが、特定の塩基配列であるPAM配列を認識し、エンドヌクレアーゼの作用によって標的DNAの二本鎖を切断する。エンドヌクレアーゼがCas9であれば、PAM配列の約3-4塩基上流を切断する。エンドヌクレアーゼとしては、S. pyogenes、S. aureus、N. meningitidis、S. thermophilus、またはT. denticolaのCas9、L. bacterium ND2006またはAcidaminococcus sp. BV3L6のCpflなどが挙げられる。PAM配列はエンドヌクレアーゼに依存し、例えば、S. pyogenesのCas9のPAM配列はNGGである。gRNAは、PAM配列の上流約20塩基の配列（標的配列）またはこれに相補的な配列を5’末端側に含み、標的配列にエンドヌクレアーゼを動員する役割を果たす。gRNAのうち、標的配列（またはこれに相補的な配列）以外の部分の配列は、使用するエンドヌクレアーゼに応じて当業者が適宜決定しうる。gRNAは、標的配列またはそれに相補的な配列を含みgRNAの配列特異性を担うcrRNA（CRISPR RNA）と、二本鎖を形成してCas9との複合体形成に寄与するtracrRNA（Trans-activating crRNA）とを含み得る。crRNAとtracrRNAとは、別の分子として存在してもよい。エンドヌクレアーゼがCpf1の場合、crRNAのみでgRNAとして機能する。本明細書において、gRNAの機能に必要な要素を一本鎖上に含むgRNAを特にsgRNAと記載する場合がある。gRNAの配列は、CRISPRdirect (https://crispr.dbcls.jp/)など、標的配列の選択およびgRNAの設計に利用可能なツールにより決定することができる。
　細胞に、gRNAをコードする核酸配列とエンドヌクレアーゼをコードする核酸配列とを含むベクターを導入し発現させてもよく、細胞外で作製したgRNAとエンドヌクレアーゼのタンパク質とを細胞に導入してもよい。なお、エンドヌクレアーゼは核移行シグナルを備えていてもよい。gRNAをコードする核酸配列とエンドヌクレアーゼをコードする核酸配列とは、別のベクター上に存在してもよい。ベクター、gRNA、およびエンドヌクレアーゼは、リポフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リン酸カルシウム法、DEAE-デキストラン法などにより細胞に導入することができるが、これらの方法に限定されない。
　ある実施形態において、COL7A1遺伝子のゲノムへの導入に用いることができるgRNAは、配列番号３～５のいずれかの配列またはこれに相補的な配列を含む。
　ウイルスベクターによる場合、インテグラーゼ活性を有するレトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターを用いると、COL7A1遺伝子を細胞のゲノムに導入することができる。レトロウイルスベクターおよびレンチウイルスベクターは、インテグラーゼ欠損型であってもよい。インテグラーゼ欠損型ベクターは、例えば、インテグラーゼ遺伝子の変異によりインテグラーゼ活性を欠く。インテグラーゼ欠損型ベクターや、アデノウイルスベクターまたはアデノ随伴ウイルスベクターを用いると、通常、ベクターに組み込まれた配列は細胞のゲノムに導入されない。例えば、インテグラーゼ欠損型レンチウイルスベクターや、アデノウイルスベクターにCOL7A1遺伝子を組み込んだ場合は、細胞内(核内)に存在するベクターのCOL7A1遺伝子からVII型コラーゲンが発現される。
　ウイルスベクターは、COL7A1遺伝子をコードする配列を含み、COL7A1遺伝子の発現を制御するプロモーターやエンハンサーなどの調節配列や細胞選択のための薬剤耐性遺伝子などの他の要素を含んでよい。ウイルスベクターは、当業界に知られるいずれの方法で作製してもよい。例えば、レトロウイルスベクターおよびレンチウイルスベクターは、両端のLTR配列（5'LTRおよび3'LTR）、パッケージングシグナル、および目的の配列を含むウイルスベクタープラスミドを、Gag、Pol、Envなどのウイルスの構造タンパク質を発現する1以上のプラスミドベクターとともにパッケージング細胞に導入することにより、またはこれら構造タンパク質を発現するパッケージング細胞に導入することにより、作製することができる。パッケージング細胞としては、293T細胞、293細胞、HeLa細胞、COS1細胞、COS7細胞などが挙げられるが、これらに限定されない。ウイルスベクターは、シュードタイプ化されていてもよく、例えば、水疱性口内炎ウイルスGタンパク質（VSV-G）などのエンベロープタンパク質を発現してもよい。作製されたウイルスベクターを標的細胞に感染させることで、目的の配列を標的細胞に導入することができる。
　ある実施形態において、ウイルスベクターは、レンチウイルスベクターである。レンチウイルスベクターとしては、HIV（human immunodeficiency virus）（例えば、HIV-1およびHIV-2)、SIV（simian immunodeficiency virus）、FIV（feline immunodeficiency virus）、MVV（Maedi-Visna virus）、EV1（Maedi-Visna-like virus）、EIAV（equine infectious anemia virus）、およびCAEV（caprine arthritis encephalitis virus）が挙げられるが、これらに限定されない。ある実施形態において、レンチウイルスベクターは、HIVである。
　一例として、レンチウイルスベクターは、下記のように製造することができる。まず、ウイルスゲノムをコードするウイルスベクタープラスミドと、Gag、Pol、およびRev（および場合によりTat）を発現する1以上のプラスミドベクターおよびVSV-Gなどのエンベロープタンパク質を発現する1以上のプラスミドベクターとを、パッケージング細胞に導入する。ウイルスベクタープラスミドは、両端のLTR配列（5'LTRおよび3'LTR）、パッケージングシグナル、並びにCOL7A1遺伝子およびその発現を制御するプロモーター（例えば、CMVプロモーター、CAGプロモーター、EF1αプロモーター、PGKプロモーター、またはhCEFプロモーター）を含む。5'LTRは、ウイルスRNAゲノムの転写を誘導するプロモーターとして機能するが、RNAゲノムの発現を高めるため、CMVプロモーターなどの別のプロモーターに置換されていてもよい。細胞内で、ベクタープラスミドからウイルスRNAゲノムが転写され、パッケージングされて、ウイルスコアが形成される。ウイルスコアは、パッケージング細胞の細胞膜に輸送され、細胞膜に封入されて、パッケージング細胞からウイルス粒子として放出される。放出されたウイルス粒子は、パッケージング細胞の培養上清から回収することができる。例えば、ウイルス粒子は、遠心分離、フィルターろ過、カラム精製などの通常の精製方法により、回収することができる。また、レンチウイルスベクターは、Lentiviral High Titer Packaging Mix、Lenti-XTM Packaging Single Shots （Takara Bio Inc.）、ViraSafeTM レンチウイルスコンプリート発現システム（Cell Biolabs Inc.）などのキットを用いて製造することができる。アデノ随伴ウイルスベクターは、AAVpro（登録商標） Helper Free System （Takara Bio Inc.）などのキットを用いて製造することができる。
　ある態様において、本開示は、レンチウイルスベクターの製造に用いられるプラスミドであって、EF1αプロモーターと、前記EF1αプロモーターの下流に配置されたCOL7A1遺伝子とを有するプラスミドを提供する。さらなる態様において、本開示は、　EF1αプロモーターと、前記EF1αプロモーターの下流に配置されたCOL7A1遺伝子とを有するレンチウイルスベクターを提供する。
　EF1αプロモーターの代表的配列を配列番号６に示す。

EF1αプロモーター（配列番号６）
GTGAGGCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCAGAGCGCACATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGGCAATTGAACCGGTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGATGTCGTGTACTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATATAAGTGCAGTAGTCGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAGGTAAGTGCCGTGTGTGGTTCCCGCGGGCCTGGCCTCTTTACGGGTTATGGCCCTTGCGTGCCTTGAATTACTTCCACGCCCCTGGCTGCAGTACGTGATTCTTGATCCCGAGCTTCGGGTTGGAAGTGGGTGGGAGAGTTCGAGGCCTTGCGCTTAAGGAGCCCCTTCGCCTCGTGCTTGAGTTGAGGCCTGGCTTGGGCGCTGGGGCCGCCGCGTGCGAATCTGGTGGCACCTTCGCGCCTGTCTCGCTGCTTTCGATAAGTCTCTAGCCATTTAAAATTTTTGATGACCTGCTGCGACGCTTTTTTTCTGGCAAGATAGTCTTGTAAATGCGGGCCAAGATCTGCACACTGGTATTTCGGTTTTTGGGGCCGCGGGCGGCGACGGGGCCCGTGCGTCCCAGCGCACATGTTCGGCGAGGCGGGGCCTGCGAGCGCGGCCACCGAGAATCGGACGGGGGTAGTCTCAAGCTGGCCGGCCTGCTCTGGTGCCTGGCCTCGCGCCGCCGTGTATCGCCCCGCCCTGGGCGGCAAGGCTGGCCCGGTCGGCACCAGTTGCGTGAGCGGAAAGATGGCCGCTTCCCGGCCCTGCTGCAGGGAGCTCAAAATGGAGGACGCGGCGCTCGGGAGAGCGGGCGGGTGAGTCACCCACACAAAGGAAAAGGGCCTTTCCGTCCTCAGCCGTCGCTTCATGTGACTCCACGGAGTACCGGGCGCCGTCCAGGCACCTCGATTAGTTCTCGAGCTTTTGGAGTACGTCGTCTTTAGGTTGGGGGGAGGGGTTTTATGCGATGGAGTTTCCCCACACTGAGTGGGTGGAGACTGAAGTTAGGCCAGCTTGGCACTTGATGTAATTCTCCTTGGAATTTGCCCTTTTTGAGTTTGGATCTTGGTTCATTCTCAAGCCTCAGACAGTGGTTCAAAGTTTTTTTCTTCCATTTCAGGTGTCGTGAA

　ある実施形態において、EF1αプロモーターは、配列番号６の核酸配列と70%、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％または99％以上の配列同一性を有する核酸配列を含むか、前記核酸配列からなる。別の実施形態において、EF1αプロモーターは、配列番号６の核酸配列において1～30個、1～20個、1～10個、1～5個、1～3個、1～2個または1個の塩基が挿入、欠失、置換、または付加された核酸配列を含むか、前記核酸配列からなる。さらなる実施形態において、EF1αプロモーターは、配列番号６の核酸配列を含むか、配列番号６の核酸配列からなる。
　目的の配列が導入された細胞は、サザンブロッティングやPCRにより確認することができる。目的の配列は、対立遺伝子の少なくとも一方に導入されていればよい。
　本開示の組成物のある実施形態では、DEB患者水疱由来細胞が、組成物に含まれる細胞で最も多い細胞である。さらなる実施形態では、DEB患者水疱由来細胞が、組成物に含まれる細胞の、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98または99％以上を占める。さらなる実施形態において、本開示の組成物は、実質的にDEB患者水疱由来細胞以外の細胞を含まない。「実質的にDEB患者水疱由来細胞以外の細胞を含まない」とは、本明細書に記載されるDEB患者水疱由来細胞の取得方法と実質的に同じ方法により得られた細胞のみを含むことを意味する。
　組成物に含まれる細胞の数は、所望の効果の発揮に必要な量（本明細書において、有効量とも称する）であり、当業者は、患者の年齢、体重、および病状、並びに細胞の種類および遺伝子改変方法などの因子を考慮して、適宜決定することができる。細胞数は、限定されないが、例えば、1細胞～1 × 107細胞、1 × 10細胞～1 × 107細胞、1 × 102細胞～1 × 107細胞、1 × 103細胞～1 × 107細胞、1 × 104細胞～1 × 107細胞、1 × 105細胞～1 × 107細胞、1 × 105細胞～5 × 106細胞、5 × 105細胞～1 × 106細胞、または1 × 105細胞～1 × 106細胞である。組成物は、細胞に加えて、医薬上許容される媒体および/または添加物を含んでもよい。医薬上許容される媒体としては、水、培地、生理食塩水、ブドウ糖、D-ソルビトール、またはD-マンニトールなどを含む輸液、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）などが挙げられる。添加物としては、溶解補助剤、安定剤、防腐剤などが挙げられる。組成物の剤形は、特に限定されないが、非経口投与製剤、例えば注射剤である。注射剤には、溶液性注射剤、懸濁性注射剤、乳濁性注射剤、用時調製型注射剤が含まれる。組成物は、凍結されていてもよく、DMSO、グリセロール、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール、デキストラン、スクロースなどの凍結保護剤を含んでもよい。
　本開示の組成物は、全身に、または局所的に投与されうる。ある実施形態において、組成物は、栄養障害型表皮水疱症患者の患部に投与される。本明細書において、患部とは、水疱またはその近傍の領域を意味する。さらなる実施形態において、組成物は、水疱部分の皮内または水疱内に投与される。さらなる実施形態において、組成物は、水疱内に投与される。本明細書において、水疱内に投与するとは、水疱部分の表皮下の空間に投与することを意味する。組成物は、好ましくは、表皮が真皮から剥離することにより表皮と真皮との間に形成された空間内に投与する。組成物は、より好ましくは、表皮の基底膜が真皮から剥離することにより当該基底膜と真皮との間に形成された空間内に投与する。例えば、組成物をシリンジ内に備える注射器の注射針を水疱に穿刺し、注射針の先端を表皮と真皮との間に形成された空間内に位置させた状態で組成物を吐出することにより、組成物を水疱内に投与することができる。水疱は、表皮水疱症の病態として自然に形成されたものであっても、人為的に形成させたものであってもよい。表皮水疱症患者において、例えば患者の皮膚をつまんだり擦ったりすることにより、水疱を人為的に形成させることができる。水疱内への投与により、皮内または皮下への投与と比較して、患者の苦痛を軽減することができ、また、VII型コラーゲンを基底膜近傍にて良好に発現させることができる。一箇所あたりに投与される細胞の数は、所望の効果の発揮に必要な量（有効量）であり、当業者は、患者の年齢、体重、および病状、並びに細胞の種類および遺伝子改変方法などの因子を考慮して、適宜決定することができる。細胞数は、限定はされないが、例えば、1細胞～1 × 107細胞、1 × 10細胞～1 × 107細胞、1 × 102細胞～1 × 107細胞、1 × 103細胞～1 × 107細胞、1 × 104細胞～1 × 107細胞、1 × 105細胞～1 × 107細胞、1 × 105細胞～5 × 106細胞、5 × 105細胞～1 × 106細胞、または1 × 105細胞～1 × 106細胞である。ある実施形態では、水疱1つあたり、1細胞～1 × 107細胞、1 × 10細胞～1 × 107細胞、1 × 102細胞～1 × 107細胞、1 × 103細胞～1 × 107細胞、1 × 104細胞～1 × 107細胞、1 × 105細胞～1 × 107細胞、1 × 105細胞～5 × 106細胞、5 × 105細胞～1 × 106細胞、または1 × 105細胞～1 × 106細胞が投与される。水疱1つあたりの投与量は、水疱を円形近似した場合の直径が7～8ｍｍであるものを標準的な水疱とし、上記投与量を、その大きさに応じて調整してもよい。細胞を水疱内に投与する場合、好ましい投与量は水疱の面積1 cm2あたり1 × 105 ～ 1 × 107細胞であり、より好ましい投与量は水疱の面積1 cm2あたり5 × 105 ～ 5 × 106細胞である。
　本発明の例示的な実施形態を以下に記載する。
［１］
　栄養障害型表皮水疱症の治療に用いるための組成物であって、VII型コラーゲンを産生するよう遺伝子改変された栄養障害型表皮水疱症患者の水疱由来細胞を含む、組成物。
［２］
　水疱由来細胞が、COL7A1遺伝子を導入することにより遺伝子改変されている、前記１に記載の組成物。
［３］
　水疱由来細胞のゲノムにCOL7A1遺伝子が導入されている、前記２に記載の組成物。
［４］
　COL7A1遺伝子が、配列番号１の核酸配列と70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％または99％以上の配列同一性を有する核酸配列を含むか、配列番号２のアミノ酸配列と70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％または99％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む、前記２または３に記載の組成物。
［５］
　水疱由来細胞が、以下の1)～6)から選択される１つ以上の特徴を有するものである、前記１～４のいずれかに記載の組成物：
　1)固相への接着性を有する、
　2)CD73、CD105およびCD90からなる群より選択される一つ以上の表面マーカーが陽性である、
　3)CD45、CD34、CD11b、CD79A、HLA-DRおよびCD31からなる群より選択される一つ以上の表面マーカーが陰性である、
　4)骨芽細胞への分化能を有しない、又は骨髄由来間葉系幹細胞と比較して当該分化能が低い、
　5)脂肪細胞への分化能を有しない、又は骨髄由来間葉系幹細胞と比較して当該分化能が低い、
　6)軟骨細胞への分化能を有しない、又は骨髄由来間葉系幹細胞と比較して当該分化能が低い。
［６］
　水疱由来細胞が、栄養障害型表皮水疱症患者の水泡内容液に由来する、前記１～５のいずれかに記載の組成物。
［７］
　水疱由来細胞が、組成物に含まれる細胞で最も多い細胞である、前記１～６のいずれかに記載の組成物。
［８］
　水疱由来細胞が、組成物に含まれる細胞の70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98または99％以上を占める、前記１～７のいずれかに記載の組成物。
［９］
　組成物が、実質的に水疱由来細胞以外の細胞を含まない、前記１～８のいずれかに記載の組成物。
［１０］
　患部に投与される、前記１～９のいずれかに記載の組成物。
［１１］
　水疱内に投与される、前記１～１０のいずれかに記載の組成物。
［１２］
　ゲノム編集により水疱由来細胞が遺伝子改変されている、前記１～１１のいずれかに記載の組成物。
［１３］
　ゲノム編集が、CRISPR/Cas9による、前記１２に記載の組成物。
［１４］
　ウイルスベクターにより水疱由来細胞が遺伝子改変されている、前記１～１１のいずれかに記載の組成物。
［１５］
　ウイルスベクターが、レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターである、前記１４に記載の組成物。
［１６］
　ウイルスベクターが、レンチウイルスベクターである、前記１４または１５に記載の組成物。
［１７］
　栄養障害型表皮水疱症の治療に使用するための組成物の製造方法であって、
　VII型コラーゲンを産生するよう栄養障害型表皮水疱症患者の水疱由来細胞を遺伝子改変すること、および
　該遺伝子改変された水疱由来細胞を含む組成物を調製すること
　を含む方法。
［１８］
　栄養障害型表皮水疱症を治療するための方法であって、VII型コラーゲンを産生するよう遺伝子改変された栄養障害型表皮水疱症患者の水疱由来細胞を含む組成物を前記患者に投与することを含む方法。
［１９］
　水疱由来細胞が、COL7A1遺伝子を導入することにより遺伝子改変されている、前記１８に記載の方法。
［２０］
　水疱由来細胞のゲノムにCOL7A1遺伝子が導入されている、前記１９に記載の方法。
［２１］
　COL7A1遺伝子が、配列番号１の核酸配列と70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％または99％以上の配列同一性を有する核酸配列を含むか、配列番号２のアミノ酸配列と70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％または99％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む、前記１９または２０に記載の方法。
［２２］
　ゲノム編集により水疱由来細胞が遺伝子改変されている、前記１８～２１のいずれかに記載の方法。
［２３］
　ゲノム編集が、CRISPR/Cas9による、前記２２に記載の方法。
［２４］
　ウイルスベクターにより水疱由来細胞が遺伝子改変されている、前記１８～２１のいずれかに記載の方法。
［２５］
　ウイルスベクターが、レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターである、前記２４に記載の方法。
［２６］
　ウイルスベクターが、レンチウイルスベクターである、前記２４または２５に記載の方法。
［２７］
　患者への投与に先立ち、VII型コラーゲンを産生するよう水疱由来細胞を遺伝子改変することをさらに含む、前記１８～２６のいずれかに記載の方法。
［２８］
　COL7A1遺伝子を導入することにより水疱由来細胞を遺伝子改変する、前記１７または２７に記載の方法。
［２９］
　水疱由来細胞のゲノムにCOL7A1遺伝子を導入する、前記２８に記載の方法。
［３０］
　COL7A1遺伝子が、配列番号１の核酸配列と70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％または99％以上の配列同一性を有する核酸配列を含むか、配列番号２のアミノ酸配列と70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％または99％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む、前記２８または２９に記載の方法。
［３１］
　ゲノム編集により水疱由来細胞を遺伝子改変する、前記１７および２７～３０のいずれかに記載の方法。
［３２］
　ゲノム編集が、CRISPR/Cas9による、前記３１に記載の方法。
［３３］
　ウイルスベクターにより水疱由来細胞を遺伝子改変する、前記１７および２７～３０のいずれかに記載の方法。
［３４］
　ウイルスベクターが、レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターである、前記３３に記載の方法。
［３５］
　ウイルスベクターが、レンチウイルスベクターである、前記３３または３４に記載の方法。
［３６］
　遺伝子改変に先立ち、栄養障害型表皮水疱症患者の水疱から細胞を得ることをさらに含む、前記１７および２７～３５のいずれかに記載の方法。
［３７］
　水疱由来細胞が、栄養障害型表皮水疱症患者の水泡内容液に由来する、前記１７～３６のいずれかに記載の方法。
［３８］
　水疱由来細胞が、組成物に含まれる細胞で最も多い細胞である、前記１７～３７のいずれかに記載の方法。
［３９］
　水疱由来細胞が、組成物に含まれる細胞の70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98または99％以上を占める、前記１７～３８のいずれかに記載の方法。
［４０］
　組成物が、実質的に水疱由来細胞以外の細胞を含まない、前記１７～３９のいずれかに記載の方法。
［４１］
　組成物が、患部に投与される、前記１８～４０のいずれかに記載の方法。
［４２］
　組成物が、水疱内に投与される、前記１８～４１のいずれかに記載の方法。
［４３］
　栄養障害型表皮水疱症を治療するための医薬の製造のための、VII型コラーゲンを産生するよう遺伝子改変された栄養障害型表皮水疱症患者の水疱由来細胞を含む組成物の使用。
［４４］
　組成物が水疱内に投与されるものである、前記４３に記載の使用。
［４５］
　水疱由来細胞が、栄養障害型表皮水疱症患者の水泡内容液に由来する、前記４３または４４に記載の使用。
［４６］
　栄養障害型表皮水疱症を治療するための、VII型コラーゲンを産生するよう遺伝子改変された栄養障害型表皮水疱症患者の水疱由来細胞を含む組成物の使用。
［４７］
　組成物が水疱内に投与されるものである、前記４６に記載の使用。
［４８］
　水疱由来細胞が、栄養障害型表皮水疱症患者の水泡内容液に由来する、前記４６または４７に記載の使用。
［４９］
　栄養障害型表皮水疱症の治療における使用のための、VII型コラーゲンを産生するよう遺伝子改変された栄養障害型表皮水疱症患者の水疱由来細胞。
［５０］
　水疱内に投与されるものである、前記４９に記載の細胞。
［５１］
　栄養障害型表皮水疱症患者の水泡内容液に由来する細胞である、前記４９または５０に記載の細胞。
［５２］
　配列番号３～５のいずれかの配列またはこれに相補的な配列を含む、gRNA。
［５３］
　前記５２のgRNAをコードする核酸配列を含むベクター。
［５４］
　栄養障害型表皮水疱症患者の水疱内容物を固相上で培養する工程を含む、細胞の製造方法。
［５５］
　水疱内容物が、水疱内容液である、前記５４に記載の方法。
［５６］
　患者の水疱から採取した水疱内容物を、酵素処理することなく培地に播種し、固相上で培養する、前記５４たは５５に記載の方法。
［５７］
　前記５４～５６のいずれかに記載の方法によって製造される細胞。
［５８］
　以下の1)～6)から選択される１つ以上の特徴を有する、前記５７に記載の細胞：
　1)固相への接着性を有する、
　2)CD73、CD105およびCD90からなる群より選択される一つ以上の表面マーカーが陽性である、
　3)CD45、CD34、CD11b、CD79A、HLA-DRおよびCD31からなる群より選択される一つ以上の表面マーカーが陰性である、
　4)骨芽細胞への分化能を有しない、又は骨髄由来間葉系幹細胞と比較して当該分化能が低い、
　5)脂肪細胞への分化能を有しない、又は骨髄由来間葉系幹細胞と比較して当該分化能が低い、
　6)軟骨細胞への分化能を有しない、又は骨髄由来間葉系幹細胞と比較して当該分化能が低い。
［５９］
　以下の工程を含む、細胞の製造方法：
1)栄養障害型表皮水疱症患者の水疱内容物を固相上で培養する工程、
2)培養工程1)によって得られた細胞を、VII型コラーゲンを産生するよう遺伝子改変する工程。
［６０］
　水疱内容物が、水疱内容液である、前記５９に記載の方法。
［６１］
　患者の水疱から採取した水疱内容物を、酵素処理することなく培地に播種し、固相上で培養する、前記５９または６０に記載の方法。
［６２］
　前記５９～６１のいずれかに記載の方法によって製造される細胞。
［６３］
　VII型コラーゲンを産生するよう遺伝子改変された、栄養障害型表皮水疱症患者の水疱由来細胞。
［６４］
　栄養障害型表皮水疱症患者の水泡内容液に由来する細胞である、前記６３に記載の細胞。
［６５］
　COL7A1遺伝子を導入することにより遺伝子改変されている、前記６２～６４のいずれかに記載の細胞。
［６６］
　細胞のゲノムにCOL7A1遺伝子が導入されている、前記６５に記載の細胞。
［６７］
　COL7A1遺伝子が、配列番号１の核酸配列と70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％または99％以上の配列同一性を有する核酸配列を含むか、配列番号２のアミノ酸配列と70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％または99％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む、前記６６に記載の細胞。
［６８］
　ゲノム編集により遺伝子改変されている、前記６２～６７のいずれかに記載の細胞。
［６９］
　ゲノム編集が、CRISPR/Cas9による、前記６８に記載の細胞。
［７０］
　ウイルスベクターにより遺伝子改変されている、前記６２～６７のいずれかに記載の細胞。
［７１］
　ウイルスベクターが、レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターである、前記７０に記載の細胞。
［７２］
　ウイルスベクターが、レンチウイルスベクターである、前記７０または７１に記載の細胞。
［７３］
　以下の1)～6)から選択される１つ以上の特徴を有する、前記６２～７２のいずれかに記載の細胞：
　1)固相への接着性を有する、
　2)CD73、CD105およびCD90からなる群より選択される一つ以上の表面マーカーが陽性である、
　3)CD45、CD34、CD11b、CD79A、HLA-DRおよびCD31からなる群より選択される一つ以上の表面マーカーが陰性である、
　4)骨芽細胞への分化能を有しない、又は骨髄由来間葉系幹細胞と比較して当該分化能が低い、
　5)脂肪細胞への分化能を有しない、又は骨髄由来間葉系幹細胞と比較して当該分化能が低い、
　6)軟骨細胞への分化能を有しない、又は骨髄由来間葉系幹細胞と比較して当該分化能が低い。
［７４］
　レンチウイルスベクターの製造に用いられるプラスミドであって、
　EF1αプロモーターと、
　前記EF1αプロモーターの下流に配置されたCOL7A1遺伝子と、
を有するプラスミド。
［７５］
　EF1αプロモーターと、
　前記EF1αプロモーターの下流に配置されたCOL7A1遺伝子と、
を有するレンチウイルスベクター。
　以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下に記載される態様に限定されるものではない。
1. 水疱由来細胞の取得
　栄養障害型表皮水疱症患者の水疱内容液を採取し、300gで 5分遠心した。得られた沈殿を培地（Mesenchymal Stem Cell Growth Medium 2 (PromoCell社、C-28009)にペニシリンおよびストレプトマイシンをそれぞれ終濃度100unit/mLおよび100μg/mLとなるよう添加したもの）で懸濁してコラーゲンIコート 6-well plateに播種し、37℃、5%CO2で培養することにより、付着性の細胞を得た。なお、水疱内溶液の採取から培地への播種までの所要時間は、患者によって異なるが、18分～1時間の範囲内であった。その後、適宜培地交換と継代を行って所望の細胞数まで増殖させた（培養開始20日後までの培養経過を図１に示す）。かかる方法によって得た細胞を、以下において「水疱由来細胞」とも称する。下記表面マーカー解析と分化誘導の実験には3継代目の細胞、遺伝子導入には3～4継代目の細胞をそれぞれ用いた。また、上記の培地に代えてMesenchymal Stem Cell Growth Medium 2 (PromoCell社、C-28009)とMSCGM Mesenchymal Stem Cell Growth Medium（Lonza社、PT-3001）の等量混合培地や、Cellartis MSC Xeno-Free Culture Medium (タカラバイオ社、Y50200)を用いた場合でも同等の水疱由来細胞が得られることを確認した。予備検討として、水疱内容液を患者の水疱内から採取してから培地に播種するまでの時間と培養後にプレートに形成されたコロニー数との相関を調べたところ、水疱内溶液を採取後1時間以内に播種すると多数のコロニーが得られ、採取後3時間を超えてから播種すると極めて少数のコロニーしか得られない、あるいはほとんどコロニーが得られないという結果であった。
2. 水疱由来細胞の特徴決定
a) 表面マーカー解析（FACS）
　上記1.で得られた水疱由来細胞と、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞（以下、BM-MSCとも称する）[PromoCell社 (Heidelberg, Germany) または Lonza社 (Basel, Switzerland)より購入]について、以下の手順で表面マーカー解析を行った：　細胞をAccutase-Solution (PromoCell社、C-41310)を用いてプレートから剥がし、培地で洗浄した後、細胞数の計測結果を基に、2本のチューブに細胞を10万個ずつ分取した。細胞をFlow Cytometry Staining Buffer (1X) (R&D Systems社、FC001)で1回洗浄し、100μlのFlow Cytometry Staining Buffer (1X)に再懸濁した。Fc受容体のブロッキングを行うため、Human TruStain FcXTM (BioLegend社、422301)を5μl加えて、氷上で10分間反応させた。1本のチューブには、Human Mesenchymal Stem Cell Verification Flow Kit (R&D Systems社、FMC020)に含まれるCD73-CFS Mouse IgG2B、CD90-APC Mouse IgG2A、およびNegative Marker Cocktail（CD45-PE Mouse IgG1、CD34-PE Mouse IgG1、CD11b-PE Mouse IgG2B、CD79A-PE Mouse IgG1、HLA-DR-PE Mouse IgG1）をそれぞれ10μlずつ加え、さらにBrilliant Violet 421TM anti-human CD105 Antibody (BioLegend社、323219)を5μl加えて、室温・遮光下で30分間反応させた。もう1本のチューブは陰性コントロールとして使用するため、それぞれのアイソタイプコントロール抗体を同量加えて、室温・遮光下で30分間反応させた。細胞を2mlのFlow Cytometry Staining Buffer (1X)で1回洗浄し、300μlのFlow Cytometry Staining Buffer (1X)に再懸濁した後、BD FACSAria(BD社)で解析した。また、CD31についても以下の手順でFACS解析を行い、水疱由来細胞およびヒトBM-MSCにおける発現有無を確認した：細胞をAccutase-Solution (PromoCell社、C-41310)を用いてプレートから剥がし、培地で洗浄した後、細胞数の計測結果を基に、2本のチューブに細胞を10万個ずつ分取した。細胞を2%FBS含有PBSで洗浄し、100μlの2%FBS含有PBSに再懸濁した。Fc受容体のブロッキングを行うため、Human TruStain FcXTM (BioLegend社, 422301)を5μl加えて、氷上で10分間反応させた。1本のチューブには、APC anti-human CD31 Antibody (BioLegend社, 303116)を5μl(タンパク質量0.4μg)加えて、氷上・遮光下で60分間反応させた。もう1本のチューブは陰性コントロールとして使用するため、APC Mouse IgG1, κ Isotype Ctrl Antibody (BioLegend社, 400120)を2μl(タンパク質量0.4μg)加えて、氷上・遮光下で60分間反応させた。細胞を2mlの2%FBS含有PBSで1回洗浄した後、300μlの2%FBS含有PBSに再懸濁し、BD FACSAria(BD社)で解析した。
　FACS解析の結果、水疱由来細胞とBM-MSCはいずれも、CD73、CD105およびCD90が陽性であり、CD45、CD34、CD11b、CD79A、HLA-DRおよびCD31が陰性であった（図２）。
b) 分化誘導（骨芽細胞、脂肪細胞および軟骨細胞）
　上記1.で得られた水疱由来細胞とBM-MSCについて、下記の条件で骨芽細胞、脂肪細胞および軟骨細胞への分化誘導を行った。

骨芽細胞への分化誘導：
　細胞を、0.1μM Dexamethasone、0.2mM Ascorbic acid 2-phosphate、10mM Glycerol 2-phosphate（数値はいずれも終濃度）を含む培地で、37℃、5%CO2の条件下、3週間培養（週2回培地交換）して骨芽細胞への分化を誘導した。TRACP & ALP Assay Kit (タカラバイオ社, MK301)を製品マニュアル通りに用いて、アルカリホスファターゼ（ALP）染色を行った。

脂肪細胞への分化誘導：
　細胞を、1μM Dexamethasone、0.5mM 3-Isobutyl-1-methylanxthine (IBMX)、10μg/mL Insulin、100μM Indomethacin（数値はいずれも終濃度）を含む培地で、37℃、5%CO2の条件下、3週間培養（週2回培地交換）して脂肪細胞への分化を誘導した。リピットアッセイキット（コスモ・バイオ社、AK09F）を製品マニュアル通りに用いて、細胞のオイルレッドO染色を行った。

軟骨細胞への分化誘導：
　Human Mesenchymal Stem Cell (hMSC) Chondrogenic Differentiation Medium Bullet Kit(tm) (Lonza社, PT-3003)の構成品を指示通りに混合して、軟骨分化誘導培地(不完全培地)を調製した。これにRecombinant Human TGF-beta 3 Protein (R&D Systems社, 243-B3)を、最終濃度10ng/mlになるように添加して、軟骨分化誘導培地(完全培地)を使用毎に調製した。第三継代細胞をAccutase-Solution PromoCell社, C-41310)で剥がし、培地で洗浄した後、細胞数の計測結果を基に、250,000個の細胞を15mlポリプロピレンコニカルチューブに分取した。細胞を軟骨分化誘導培地(不完全培地)で2回洗浄し、上清を除去した後、500μlの軟骨分化誘導培地(完全培地)で懸濁した。150gで5分間遠心して細胞のペレットを形成させ、ふたを緩めてCO2インキュベーターに静置し（37℃、5%CO2）、その後2～3日毎に培地(完全培地)を交換した。3週間経過後にペレットを取り出して4%パラホルムアルデヒドで固定し、凍結切片を作成してアルシアンブルー染色により軟骨細胞由来のプロテオグリカンを染色した。ポジティブコントロールとしてヒト骨髄由来間葉系幹細胞についても同様の分化誘導操作を行った。
　上記分化誘導実験の結果、BM-MSCはALP染色、オイルレッドO染色、およびアルシアンブルー染色の全てにおいて陽性であった。一方、水疱由来細胞は、ALP染色が陽性（但し、BM-MSCより染色強度は低い）、オイルレッドO染色が陽性（但し、BM-MSCより染色強度は低い）、アルシアンブルー染色が陰性であった（図３）。また、別の栄養障害型表皮水疱症患者から採取された水疱内容液から得られた水疱由来細胞に対しても、同様の分化誘導実験を行った。その結果を図４に示す。図３の結果と同様に、BM-MSCはALP染色、オイルレッドO染色、およびアルシアンブルー染色の全てにおいて陽性であった。一方、この栄養障害型表皮水疱症患者の水疱由来細胞は、ALP染色が陽性（但し、BM-MSCより染色強度は低い）、オイルレッドO染色が陽性（但し、BM-MSCより染色強度は低い）、アルシアンブルー染色が陽性（但し、BM-MSCより染色強度は低い）であった。
c) VII型コラーゲンの発現能力および分泌能力の評価
　水疱由来細胞がどの程度VII型コラーゲンを発現しているか、そして分泌しているかを、ウエスタンブロットで調べた。この実験では、VII型コラーゲンを発現するが、アミノ酸変異により発現したVII型コラーゲンが殆ど機能していないと考えられる患者から得られた水疱由来細胞を用いた。まず、ヒト表皮角化細胞（以下KCと称する）、ヒト皮膚線維芽細胞（以下FBと称する）、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞（以下、MSCと称する）、及び表皮水疱症患者の水疱由来細胞（以下BFC; blister fluid cellとも称する）を、下記表１に示す培地でそれぞれ培養した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　細胞が90-95%コンフルエントに到達したら、D-PBS(-)で洗浄し、アスコルビン酸（nacalai tesque社、13048-42、終濃度50 ug/ml）とプロテアーゼ阻害剤カクテル（SIGMA社、P1860-1ML、1/400倍希釈）を添加したそれぞれの培地（サプリメント未添加）を加え、CO2インキュベーターで24時間培養した。培養後、培地はメタノール・クロロホルム沈殿法を用いて濃縮した。また、RIPA buffer(nacalai tesque社、08714－04)を用いて、細胞から細胞ライセートを調製した。それぞれのライセートをタンパク質濃度をもとに補正し、LDS sample buffer、sample reducing agent（それぞれInvitrogen社、NP0007、NP0009）を用いて、電気泳動用サンプルを調製した。3-8% NuPAGEゲル（Invitrogen社、EA0375BOX）を用いて電気泳動を行った後、PVDF膜（Millipore社、IPVH07850）に転写し、一次抗体にAnti-Col7 (Atlas社、HPA042420)、二次抗体にAnti-Rabbit IgG-HRP（GE helthcare社、NA9340-1ML）を用いて抗体反応を行った。そして、Chemi-lumi-one ultra (nacalai tesque社、11644－40)、 Chemi DOC (BioRad社、17001402JA)を用いてバンドを検出し、Image Lab software（BioRad社、1709690）で解析、定量化した。また、濃縮した培地に対しても同様にウエスタンブロットを行い、VII型コラーゲンの濃度を定量化した。
　結果を図５に示す。図５（上）に示すように、細胞ライセートに対してウエスタンブロットを行った結果、水疱由来細胞のCOL7A発現量は、皮膚線維芽細胞および骨髄由来間葉系幹細胞よりも高く、表皮角化細胞と遜色ないレベルであった。また、図５（下）に示すように、細胞を培養した培地の濃縮物に対してウエスタンブロットを行った結果、水疱由来細胞からのCOL7A分泌量は、どの細胞よりも多かった 。以上の結果から、水疱由来細胞は、遺伝子を導入してVII型コラーゲンを発現させる細胞として、至適であると推察される。
3. ゲノム編集の設計
　ヒトゲノム内のAAVS1（Adeno-associated virus integration site 1）領域においてCRISPR-Cas9システムによる切断効率が良好な位置を選択するため、３種類のsgRNAを作製した。AAVS1領域は、遺伝子導入による影響を受けにくい安全領域（セーフ・ハーバー／safe harbor）である。CRISPR-Cas9システムは「NGG」の塩基配列を認識し、その３塩基上流を切断することから、末端に「GG」が配置される領域を選択し、「NGG」の上流２０塩基の標的配列を含むsgRNA（sgAAVS1-#1～#3）を設計した（図６、上；表２）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　配列番号３～５のいずれかの配列からなるオリゴヌクレオチドとその相補鎖をアニーリングした後にeSpCas9(1.1) (Addgene plasmid # 71814)のBbs1サイトにクローニングすることにより、Cas9タンパク質とsgRNAを発現するプラスミドを作成した（それぞれ、eSpCas9(1.1)-sgAAVS1-#1、eSpCas9(1.1)-sgAAVS1-#2、eSpCas9(1.1)-sgAAVS1-#3）。このプラスミド（2.5 μg）を、6ウェルディッシュに播種したHEK293細胞（ヒト胎児腎細胞株）にLipofectamin 3000 (Thermo Fisher Scientific)により導入した。トランスフェクションの48時間後、細胞からゲノムDNAを抽出し、標的部位を含む領域をPCRで増幅した。PCR増幅断片は熱処理により一本鎖にし、ゆっくり冷却することでアニーリングさせた後に、ミスマッチ部位特異的エンドヌクレアーゼで処理した。これを電気泳動で分画し、ゲノム切断によって導入された挿入または欠失変異の程度をバンドの濃さで測定し、以下の計算式によりゲノム編集効率を算出した(式中、aは消化されなかったバンド濃度、b, cは切断されたバンド濃度を示す)。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000003
　sgAAVS1-#1～#3のいずれのsgRNAによってもコントロールとは異なる短いDNA断片が生じ、二重鎖切断が生じることが確認された（図６、下）。以下の実験では、最も切断効率の高かったsgAAVS1-#3を使用した。
4. 水疱由来細胞へのCOL7A1遺伝子の導入
　AAVS1領域へのCOL7A1遺伝子の導入のため、CAGプロモーターの制御下にCOL7A1遺伝子を発現するプラスミドを設計した（図７）。COL7A1 cDNAは、Flexi ORF sequence-verified clone (Promega, Madison, WI, USA)より得た。COL7A1 cDNAをpENTR1Aプラスミド（Thermo Fisher Scientific, A10462）にサブクローニングし、pENTR1A-COL7A1を得た。LRリコンビナーゼ (Thermo Fisher Scientific) を用いたGateway反応によってpENTR1A-COL7A1からpAAVS1-P-CAG-DEST (Addgene plasmid # 80490)へCOL7A1 cDNAを導入し、ドナープラスミドpAAVS1-P-CAG-COL7A1を得た。
　上記1.で得られた水疱由来細胞をNeonトランスフェクションシステム（Thermo Fisher Scientific）の専用バッファーで懸濁し、Cas9-sgRNA発現プラスミド（eSpCas9(1.1)-sgAAVS1-#3）およびドナープラスミド（pAAVS1-P-CAG-COL7A1）と以下のように混合した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　Neonトランスフェクションシステムを用い、1,200 V, 20 ms, 2 pulsesの条件でエレクトロポレーションにより上記プラスミドを水疱由来細胞に導入した後、6-wellプレートに播種して培養した。培地は、Mesenchymal Stem Cell Growth Medium 2 (PromoCell社、C-28009)とMSCGM Mesenchymal Stem Cell Growth Medium（Lonza社、PT-3001）の等量混合培地を使用した。トランスフェクションの48時間後にpuromycinを最終濃度0.5μg/mLになるよう添加し、約2週間培養して選択された細胞を下記「5. 遺伝子改変水疱由来細胞のマウスへの移植」でのマウスへの移植実験に使用した。
　また、PGKプロモーターの制御下にCOL7A1遺伝子を発現するドナープラスミドを作成し、このプラスミドを水疱由来細胞を含む各種細胞に導入した。そして、改変した細胞のCOL7A1の発現量及び分泌量を、上記「2. 水疱由来細胞の特徴決定」の「c) VII型コラーゲンの発現能力および分泌能力の評価」と同様にしてウエスタンブロットを行い、評価した。この実験では、VII型コラーゲンを発現していない患者から得られた水疱由来細胞を用いた。結果を図８に示す。図８（上）に示すように、水疱由来細胞のライセートからは、線維芽細胞のライセートよりも、VII型コラーゲンが多く検出された。同様に、図８（下）に示すように、水疱由来細胞を培養した培地からも、線維芽細胞を培養した培地よりも、VII型コラーゲンが多く検出された。以上の結果から、COL7A遺伝子をCRISPR-Cas9で細胞に導入すると、水疱由来細胞は線維芽細胞よりもVII型コラーゲンを多く発現し、かつ、多く分泌することが分かった。（EF1αプロモーターを用いたCOL7A1遺伝子ドナープラスミドで水疱由来細胞を遺伝子改変した場合でもVII型コラーゲンを発現および分泌する細胞が得られることを、免疫染色および培養上清のウェスタンブロッティングにより確認している。）
5. 遺伝子改変水疱由来細胞のマウスへの移植
　水疱形成を示すCol7A1遺伝子ノックアウトマウス（Col7a1-/-）の新生児の全層皮膚を切除し、免疫不全マウス（NOD-SCID）の背部に移植した。移植直後に皮膚表面をつまみ、かつ擦ることで水疱を形成させ、直ちに表皮下の空間（水疱内）に上記4.で作成した1.0×106個の遺伝子改変水疱由来細胞を注入し（図９）、フィルムドレッシング材で密封した（対照群のマウスには、遺伝子改変していない水疱由来細胞を1.0×106個注入した）。4週間後に皮膚を採取し、抗VII型コラーゲン抗体(clone LH7.2; Sigma Aldrich, C6805)を用いた免疫染色により、VII型コラーゲン基底膜への沈着を確認した。その結果、遺伝子改変水疱由来細胞を水疱内に注入したマウスの基底膜近傍にVII型コラーゲンの沈着が認められた（図１０）。
　6. 遺伝子導入細胞を移植したマウスにおけるVII型コラーゲンの沈着
　表皮水疱症モデルマウスにおけるVII型コラーゲンの沈着を、水疱由来細胞と間葉系幹細胞とで比較した。まず、免疫不全マウス（NOD-SCID）の背部にCol7A1遺伝子ノックアウトマウスの新生児の全層皮膚を移植した。そして、その真皮内（皮内）あるいは表皮下の空間（水疱内）に、以下の細胞を1.0×106個注入した。
・hMSC: 遺伝子改変していないヒト骨髄由来間葉系幹細胞
・COL7-hMSC: 遺伝子改変（VII型コラーゲン過剰発現）ヒト骨髄由来間葉系幹細胞、上記「4. 水疱由来細胞へのCOL7A1遺伝子の導入」と同じ方法で、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞（hMSC）[Lonza社 (Basel, Switzerland)より購入]にCOL7A1遺伝子を導入したもの
・COL7-BF: 上記「4. 水疱由来細胞へのCOL7A1遺伝子の導入」で作成した遺伝子改変水疱由来細胞
　4週間後に皮膚を採取し、抗VII型コラーゲン抗体(clone LH7.2; Sigma Aldrich, C6805)を用いて免疫染色を行い、染色画像を撮影した。そして、画像解析ソフトを用いて、VII型コラーゲンの染色部分が正確に一致するように複数の写真を重ね合わせ、１枚の画像を合成した。
　その結果を図１１に示す。図１１の「hMSC」と「hMSC水疱内」の対比、および「COL7-hMSC皮内」と「COL7-hMSC水疱内」の対比によって示されるように、皮内に間葉系幹細胞を注入した場合よりも、水疱内に注入した場合の方が、基底膜近傍にVII型コラーゲンが多く検出された。また、図１１の「COL7-hMSC水疱内」と「COL7-BF水疱内」の対比によって示されるように、COL7A1遺伝子が導入された水疱由来細胞を水疱内に注入したマウスでは、COL7A1遺伝子が導入された間葉系幹細胞を水疱内に注入したマウスよりも、より多くのVII型コラーゲンが基底膜近傍に検出された。これにより、COL7A1遺伝子が導入された細胞を水疱内に注入した方が、皮内に注入するよりも、VII型コラーゲンがより良好に皮膚内に沈着することが判明した。また、水疱由来細胞を用いた方が、基底膜近傍により多くのVII型コラーゲンが沈着できることも判明した。
7. 水疱由来細胞を水疱内に移植するのに必要な細胞数
　どれくらいの数の水疱由来細胞を水疱内に移植すれば必要な効果が得られるのかを調べた。図１２左に示すように、まず、水疱形成を示すCol7A1遺伝子ノックアウトマウス（Col7a1-/-）の新生児の全層皮膚を切除し、免疫不全マウス（NOG）の背部に移植した。移植直後に皮膚表面をつまみ、かつ擦ることで直径約1cmの水疱を形成させた。直ちに表皮下の空間（水疱内）に、CAGプロモーターで制御されるホタルルシフェラーゼ遺伝子ドナープラスミドで遺伝子改変した水疱由来細胞を、1.0×106、0.5×106、0.25×106または0.1×106個、別個体にそれぞれ注入した。30分後水疱内溶液を回収し、Luciferase assay system (Promega社、E2510)でホタルルシフェラーゼのレベルを測定し、真皮上に定着せず水疱内の液中に残存した余剰細胞の数を評価した。
　図１２右にその結果を示す。同図に示すように、0.25×106個または0.1×106個の細胞を移植した群ではシグナル強度にほとんど差がなかった。一方、0.5×106個または1.0×106個の細胞を移植した群では、細胞数の増大に比例して、シグナルも増加した。この結果から、直径1cm（=約0.8cm2）の水疱あたり0.5×106個以上の細胞（=0.6×106細胞／cm2以上）を水疱内に投与すれば、治療効果が得られるのに十分な数の細胞が、基底膜に定着する可能性が示唆される。
8. 移植細胞の長期生着能
　マウスの皮内に投与した水疱由来細胞がどれくらいの期間投与部位で生存するのかを調べた。まず、図１３左に示すように、免疫不全マウス（NOG）の背部の左右に、CAGプロモーターで制御されるホタルルシフェラーゼ遺伝子ドナープラスミドで遺伝子改変した骨髄由来間葉系幹細胞または水疱由来細胞を、1.0×106個皮内注にて投与した。定期的に30mg/mlのluciferin（Promega社、P1042）を100μl腹腔内注にて投与し、IVIS LuminaＩＩ Imaging System(Caliper社)にて観察した。
　その結果を図１３右および図１４に示す。図１３右および図１４左に示すように、発光シグナル強度は水疱由来細胞、骨髄由来間葉系幹細胞共に最初の1カ月間は減衰していき、その後ほぼ一定となり、9カ月以上の長期にわたり持続した。1カ月間経過後の各個体のシグナル強度の平均値を用いて解析した結果、図１４右に示すように、水疱由来細胞と骨髄由来間葉系幹細胞との間で、発光シグナル強度に有意な差は認められなかった。以上の結果から、水疱由来細胞は、骨髄由来間葉系幹細胞に匹敵する高い生着能を有することが分かった。
9. 水疱由来細胞に対するレンチウイルスの感染効率
　水疱由来細胞に対するレンチウイルスの感染効率を解析した。この実験で用いた細胞、および細胞の培養に用いた培地を、下記表４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　レトロネクチンコーティングプレートの作製：　レトロネクチン[タカラバイオ社 (滋賀, 日本), T100B] を40μg/mLとなるようにPBS (ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(Ca, Mg不含)) [ ナカライテスク社（京都, 日本）, 14249-95 ] で希釈し、表面処理なしの 96-well plate [ Corning社(東京, 日本), 3370 ] に100μL/wellとして加えた。その後、プレートを4℃で一晩静置した。プレートを使用する前にレトロネクチン溶液を取り除き、PBSで2度洗浄し、以下の操作を実施した。
　細胞の播種・レンチウイルス感染：　水疱由来細胞をAccutase-Solution [ PromoCell社(Heidelberg, Germany), C-41310 ]、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞をTrypsin/EDTA for Mesenchymal Stem Cells [ Lonza社 (Basel, Switzerland), CC-3232 ]、正常成人皮膚線維芽細胞をTrypsin/EDTA Solution [ Lonza社 (Basel, Switzerland), CC-5012 ]、を用いてプレートから剥がし、それぞれの細胞の培地を用いて回収した。回収した細胞の細胞数を測定し、2500個/wellとなるように上述のレトロネクチンコーティング96-well plateに播種した。その後、GFP遺伝子搭載レンチウイルス : pLenti-C-mGFP [ ORIGENE社(Rockville, USA), PS100071 ]をMOI 1またはMOI 5となるように各ウェルに加え、細胞をCO2インキュベーターで72時間培養した。
　GFP陽性細胞の検出：　GFP陽性細胞率の検出は、蛍光顕微鏡 [キーエンス社(東京, 日本), BZ-X710]で行った。その結果を、図１５に示す。
　また、MOI 1で感染させた各細胞種のGFP陽性細胞を次の方法で定量した。まず、視野内の全細胞数に対するGFP陽性細胞数の割合をGFP陽性細胞率とした。この計測を3回繰り返し、統計処理を行った (＊: P < 0.05, Dunnett's test) 。結果を図１６に示す。
　図１５に示すように、水疱由来細胞は、間葉系幹細胞や線維芽細胞と比較して、GFP陽性細胞率及びGFPの蛍光強度が高いことが明らかとなった。さらには、図１６に示すように、間葉系幹細胞や線維芽細胞と比較して、水疱由来細胞のGFP陽性細胞率が有意に高いことが明らかとなった。これらの結果は、水疱由来液細胞は、間葉系幹細胞や繊維芽細胞と比較して、レンチウイルスによる遺伝子送達効率が高いことを示唆している。
10. VII型コラーゲン遺伝子を搭載したレンチウイルスベクタープラスミドの作製
　図１７（左）に示すような、EF1αプロモーターとCOL7A1遺伝子を発現カセットに備えるレンチウイルスのベクタープラスミドを作成した。まず、COL7A1 cDNAを含むFlexi ORF sequence-verified clone (Promega社) から、対合配列を生じるSpeＩとXbaＩ処理によってCOL7A1 cDNAを切り出し、XbaＩで処理したpLVSIN-EF1α Puro (タカラバイオ社)にライゲーションすることでpLVSIN-EF1α-C7 Puroを作製した。これを更にNotＩおよびMluＩで処理することでPGK-Puroカセットを取り除き、pLVSIN-EF1α-COL7A1を作製した。
　さらに、図１７（右）に示すような、PGKプロモーターとCOL7A1遺伝子を発現カセットに備えるレンチウイルスのベクタープラスミドを作成した。pLVSIN-EF1α-Col7A1をClaＩとSwaＩで処理してEF1αプロモーター領域を切り出し、AAVS1 hPGK-PuroR-pA donorプラスミド（addgene #22072）を鋳型にPCRで増幅したPGKプロモーター領域（501 bp）をGibson assemblyで組み込むことで、pLVSIN-PGK-COL7A1を作製した。PGKプロモーターの増幅には、KOD One (東洋紡社)を用いた。Gibson assemblyには、NEBuilder HiFi DNA Assemblyキット (New England Biolabs社)を用いた。
11. VII型コラーゲン遺伝子を搭載したレンチウイルスベクターの製造
　図１８に示される、COL7A1遺伝子を搭載したレンチウイルスベクターを製造した。
　レンチウイルス用プラスミドを用いたトランスフェクション：　図１７に示したプラスミドを、レンチウイルスのベクタープラスミドとして用いた。また、パッケージングプラスミドには、Lentiviral High Titer Packaging Mix[タカラバイオ社(滋賀, 日本), 6194]を用いた。まず、レンチウイルスパッケージング用細胞株であるLenti-X 293T細胞[タカラバイオ社(滋賀, 日本), 632180]を 100mm dish[コーニング社(NewYork, USA), 353003] に5000000 cells/dishとなるように播種し、一晩CO2インキュベーターで培養した。Lenti-X 293T細胞の培地には、10％FBSおよびペニシリン, ストレプトマイシン(それぞれ終濃度100unit/mLおよび100μg/mLとなるよう添加したもの)を含むDMEM[ナカライ社(京都, 日本), 08457-55]を用いた。次に、ポリエチレンイミンを用いてベクタープラスミドおよびパッケージングプラスミドをトランスフェクションした。トランスフェクションした細胞を一晩CO2インキュベーターで培養した後、培地交換を行った。トランスフェクション試薬には、OPTI-MEM [Thermo Fisher Science社 (東京, 日本), 31985062]および、PEI-MAX [Polysciences社(Warrington, USA), 24765-100]を用いた。トランスフェクションのプロトコルは、PEI-MAXの推奨プロトコルに従った。また、ベクタープラスミドとパッケージングプラスミドの混合比については、Lentiviral High Titer Packaging Mixの推奨プロトコルに従った。
　レンチウイルスベクターの回収および精製：　トランスフェクション後72時間が経過したLenti-X 293T細胞の培養上清を回収し、300g, 5min で粗遠心することで、Cell debrisを除去した。その上清を0.45μm フィルター[メルク社(東京, 日本), SLHVR33RS]を用いてろ過し、Cell debrisをさらに除去した。次に、ろ過済みの上清を遠心（6000g, 4℃, 20hr）し、レンチウイルスベクターを沈殿させ、ペレットを1.5mLのPBSで再懸濁した。次に超遠心用チューブ[ベックマン・コールター社(東京, 日本), 344058]内に、55%スクロース/PBS溶液(1mL), 20%スクロース/PBS溶液(2.5mL),レンチウイルスベクター液(1.5mL) の層を作り、超遠心(41000rpm, 4℃, 2hr)した。超遠心機は [ベックマン・コールター社(東京, 日本), L-90K]を、ローターは [ベックマン・コールター社(東京, 日本), SW55Ti]を用いた。超遠心後、55%スクロース/PBS溶液と20%スクロース/PBS溶液の間に現れるレンチウイルスベクターの層を回収し、PBSを用いて1mLとなるように希釈した。次に、超遠心用チューブ内に20%スクロース/PBS溶液(4mL)およびレンチウイルスベクター液(1mL)の層を作り、再び超遠心(41000rpm, 4℃, 2hr)した。沈殿したレンチウイルスベクターのペレットを400μLのDMEMでよく懸濁し、レンチウイルスベクター溶液とした。
　レンチウイルスベクターの力価を、以下のようにして測定した。
　レトロネクチンコーティングプレートの作製：　レトロネクチン[タカラバイオ社 (滋賀, 日本), T100B] を100μg/mLとなるようにPBSで希釈し、表面処理なしの平底48-well plate[IWAKI(東京, 日本), 1830-048]に100μL/wellとして加えた。その後、プレートを4℃で一晩静置した。プレートを使用する前に、レトロネクチン溶液を取り除いて2%FBS含有PBSで30分間室温にてブロッキングし、以下の操作を実施した。
　細胞の播種およびレンチウイルス感染：　レトロネクチンでコーティングした48-well plateに、LVSIN-EF1α-COL7A1レンチウイルスベクターまたはLVSIN-PGK-COL7A1レンチウイルスベクター（図１８参照）を、任意のウイルス液量で各ウェルに加え、2000g、32℃で2時間遠心した。その後、ウイルス液を取り除き、PBSで1回 洗浄した。次に、水疱由来細胞をAccutase-Solutionを用いてプレートから剥がし、培地を用いて回収した。回収した細胞の細胞数を測定し、12500個/wellとなるように、上述のレトロネクチンコーティング48-well plateに播種した。感染後14日目の細胞を、Accutase-Solutionを用いてプレートから剥がし、培地を用いて回収した。次に、Maxwell（登録商標） RSC Instrument[ Promega社(東京、日本), AS4500 ] およびMaxwell（登録商標） RSC Blood DNA Kit [ Promega社(東京、日本), AS1400 ] を用いて、回収した細胞からゲノムDNAを抽出した。Lenti-XTM Provirus Quantitation Kit [タカラバイオ社(滋賀, 日本), 631239 ]を用いて、回収したゲノムDNAからVCN（Vector Copy Number）を算出した。VCNとウイルス感染時のウイルス液量からウイルス力価(TU/mL, TU : Transduction Unit)を計算した。計算式は以下の通りである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000006
　このようにして得られたウイルス力価をもとに、レンチウイルス感染実験において多重感染度(MOI: Multiplicity of Infection)の設定に必要なウイルス液量を計算した。
12. 免疫染色によるVII型コラーゲン遺伝子導入効率の解析
　水疱由来細胞に対するレンチウイルスベクターによるVII型コラーゲン遺伝子導入効率を解析した。
　レトロネクチンコーティングプレートの作製：　上記「11. VII型コラーゲン遺伝子を搭載したレンチウイルスベクターの製造」と同様にして、プレートをレトロネクチンでコートした。
　細胞の播種およびレンチウイルス感染：　レトロネクチンでコーティングした48-well plateに、LVSIN-EF1α-COL7A1レンチウイルスベクターまたはLVSIN-PGK-COL7A1レンチウイルスベクター(図１８参照)を、MOI 0.5、MOI 1、またはMOI 2となるように各ウェルに加え、2000g、32℃で2時間遠心した。その後、ウイルス液を取り除き、PBSで1回洗浄した。次に、水疱由来細胞をAccutase-Solutionを用いてプレートから剥がし、培地を用いて回収した。回収した細胞の細胞数を測定し、12500個/wellとなるように、上述のレトロネクチンコーティング48-well plateに播種した。
　免疫染色：　レンチウイルス感染後14日経過した水疱由来細胞をAccutase-Solutionを用いてプレートから剥がし、培地を用いて回収した。回収した細胞の細胞数を測定し、50000個/wellとなるようにCC2コーティングチェンバースライド[Thermo Fisher Science社(東京, 日本), 154852]に播種し、CO2インキュベーターで培養した。24時間後、抗VII型コラーゲン抗体(clone LH7.2)[Sigma Aldrich社(東京, 日本), C6805],および Alexa488[Thermo Fisher Science社(東京, 日本), A-11001) を用いて免疫染色した。そして、VII型コラーゲンの発現を、共焦点蛍光顕微鏡[Nikon社(東京, 日本), Nikon A1R HD25]により解析した。
　結果を図１９および図２０に示す。EF1αプロモーターおよびPGKプロモーター搭載レンチウイルスのいずれのベクターで細胞を感染させても、VII型コラーゲンの発現はMOI依存的に増加した。最もVII型コラーゲン陽性細胞率が高かったのはいずれの細胞においてもMOI 2で感染させたものであり、LVSIN-EF1α-COL7A1レンチウイルスベクターでは約30%、LVSIN-PGK-COL7A1レンチウイルスベクターでは約16%であった。また、概して、LVSIN-EF1α-COL7A1レンチウイルスベクターで感染させた水疱由来細胞の方が、LVSIN-PGK-COL7A1レンチウイルスベクターで感染させた水疱由来細胞に比べて、VII型コラーゲン陽性細胞率が高く、かつ染色強度が強かった。
13. フローサイトメトリー(FACS)によるVII型コラーゲン遺伝子導入効率の解析
　水疱由来細胞に対するレンチウイルスベクターによるVII型コラーゲン遺伝子導入効率を解析した。
　レンチウイルス感染細胞の作成：　上記「12. 免疫染色によるVII型コラーゲン遺伝子導入効率の解析」と同様の手順で行った。
　FACS解析：　レンチウイルス感染後14日経過した水疱由来細胞を、Accutase-Solutionを用いてプレートから剥がし、培地を用いて回収した。回収した細胞の細胞数を測定し、300000個/sampleとなるように分取し、eBioscienceTM Permeabilization Buffer [Thermo Fisher Science社 (東京, 日本), 00-8333-56]を用いて透過処理を行った。その後、抗VII型コラーゲン抗体(clone LH7.2) [Sigma Aldrich社(東京, 日本), C6805],および Alexa488 [Thermo Fisher Science社(東京, 日本), A-11001)を用いた免疫染色を行い、VII型コラーゲンの発現をフローサイトメーター(BD FACSCantoTM II) [日本ベクトン・ディッキンソン社(東京, 日本)] により解析した。
　結果を図２１に示す。また、各FACSデータ中の枠で囲った部分に含まれる細胞の割合を、図２２（左）に、VII型コラーゲン陽性細胞率として示す。さらに、枠で囲った領域内の平均蛍光強度(MFI: Mean Fluorescence Intensity)を、VII型コラーゲン陽性細胞の平均蛍光強度として、図２２（右）に示す。図２１および図２２（左）に示すように、VII型コラーゲン陽性細胞率はMOI依存的に増加した。最もVII型コラーゲン陽性細胞率が高かったのは、いずれもMOI 2で感染させたものであり、EF1α-COL7A1レンチウイルスでは約18%、PGK-COL7A1レンチウイルスでは約12%であった。また、図２２（右）に示すように、EF1α-COL7A1レンチウイルス感染細胞のMFIは、PGK-COL7A1レンチウイルス感染細胞のMFIよりも、約2.2倍高かった。このことから、レンチウイルスベクターで遺伝子導入された水疱由来細胞では、EF1αプロモーターの方が、PGKプロモーターよりも、より多量のCOL7A1を発現させると考えられる。
　また、予備検討として、水疱由来細胞、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞、および正常成人皮膚線維芽細胞にEF1α-COL7A1レンチウイルスベクターまたはPGK-COL7A1レンチウイルスベクターを感染させ、上記と同様の方法で免疫染色およびフローサイトメトリー(FACS)を行い、VII型コラーゲン陽性細胞率を測定した。その結果、水疱由来細胞では、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞および正常成人皮膚線維芽細胞よりもVII型コラーゲン陽性細胞率が高かった。
14. レンチウイルス感染水疱由来細胞のVCN（Vector Copy Number）
　VII型コラーゲン搭載レンチウイルスベクターで感染した水疱由来細胞のVCNを解析した。まず、前記「12. 免疫染色によるVII型コラーゲン遺伝子導入効率の解析」と同様の手順で、水疱由来細胞にレンチウイルスベクターを感染させた。感染後7、14、21、および28日目の細胞を、Accutase-Solutionを用いてプレートから剥がし、培地を用いて回収した。次に、Maxwell（登録商標） RSC Instrument[ Promega社(東京、日本), AS4500 ] およびMaxwell（登録商標） RSC Blood DNA Kit [ Promega社(東京、日本), AS1400 ] を用いて、回収した細胞からゲノムDNAを抽出した。Lenti-XTM Provirus Quantitation Kit [タカラバイオ社(滋賀, 日本), 631239 ]を用いて、回収したゲノムDNAからVNCを算出した。
　結果を図２３に示す。同図に示すように、VCNはMOI依存的に増加した。また、感染日数が経過するごとにVCNは低下したが、感染後21日以降はVCNが安定した。この結果は、レンチウイルスベクターによって水疱由来細胞のゲノム内に挿入されたVII型コラーゲン遺伝子は、長期間ゲノム内に存続可能であることを示唆する。
15. レンチウイルスベクターにより遺伝子改変した水疱由来細胞を移植したマウスにおけるVII型コラーゲンの沈着
　レンチウイルスベクターによってVII型コラーゲン遺伝子が導入された水疱由来細胞が表皮水疱症モデルマウスの基底膜にVII型コラーゲンを供給するか調べた。まず、Col7A1遺伝子ノックアウトマウス新生児の全層皮膚を、免疫不全マウスの背部に移植した。移植直後に皮膚表面をつまみ、かつ擦ることで水疱を形成させた。そして、直ちに表皮下の空間（水疱内）に、前記「12. 免疫染色によるVII型コラーゲン遺伝子導入効率の解析」で作成した細胞の中から、MOI 5 でLVSIN-EF1α-COL7A1レンチウイルスベクターを感染させた水疱由来細胞を、1.0×106個注入した。また、対照群のマウスには、レンチウイルスベクターを感染させていない水疱由来細胞を、1.0×106個水疱内に注入した。1カ月後に皮膚を採取して抗VII型コラーゲン抗体(clone LH7.2; Sigma Aldrich, C6805)を用いて免疫染色を行い、VII型コラーゲンの基底膜への沈着を調べた。
　その結果を図２４に示す。同図に示すように、LVSIN-EF1α-COL7A1レンチウイルスベクターを感染させた水疱由来細胞を水疱内に注入したマウスでは、基底膜近傍にVII型コラーゲンの沈着が認められた。一方、レンチウイルスベクターを感染させていない水疱由来細胞を水疱内に注入したマウスでは、VII型コラーゲンの沈着が認められなかった。この結果から、レンチウイルスベクターによってVII型コラーゲンが導入された水疱由来細胞は、水疱内に投与後、投与部位付近に定着し、真皮と基底膜との接着部位にVII型コラーゲンを供給することが推察される。
　以上の結果から、COL7A1遺伝子を導入した水疱由来細胞は、栄養障害型表皮水疱症の遺伝子治療において、骨髄由来間葉系幹細胞や線維芽細胞よりも高い治療効果を発揮することが期待される。

Claims (15)

  1. 　栄養障害型表皮水疱症の治療に用いるための組成物であって、VII型コラーゲンを産生するよう遺伝子改変された栄養障害型表皮水疱症患者の水疱由来細胞を含む、組成物。
  2. 　水疱由来細胞が、COL7A1遺伝子を導入することにより遺伝子改変されている、請求項１に記載の組成物。
  3. 　COL7A1遺伝子が、配列番号１の核酸配列と90％以上の配列同一性を有する核酸配列を含むか、配列番号２のアミノ酸配列と90％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む、請求項２に記載の組成物。
  4. 　水疱由来細胞が、以下の1)～6)から選択される１つ以上の特徴を有するものである、請求項１～３のいずれかに記載の組成物：
    　1)固相への接着性を有する、
    　2)CD73、CD105およびCD90からなる群より選択される一つ以上の表面マーカーが陽性である、
    　3)CD45、CD34、CD11b、CD79A、HLA-DRおよびCD31からなる群より選択される一つ以上の表面マーカーが陰性である、
    　4)骨芽細胞への分化能を有しない、又は骨髄由来間葉系幹細胞と比較して当該分化能が低い、
    　5)脂肪細胞への分化能を有しない、又は骨髄由来間葉系幹細胞と比較して当該分化能が低い、
    　6)軟骨細胞への分化能を有しない、又は骨髄由来間葉系幹細胞と比較して当該分化能が低い。
  5. 　水疱由来細胞が、栄養障害型表皮水疱症患者の水泡内容液に由来する、請求項１～４のいずれかに記載の組成物。
  6. 　水疱内に投与される、請求項１～５のいずれかに記載の組成物。
  7. 　栄養障害型表皮水疱症患者の水疱内容物を固相上で培養する工程を含む、細胞の製造方法。
  8. 　請求項７に記載の方法によって製造される細胞。
  9. 　以下の1)～6)から選択される１つ以上の特徴を有する、請求項８に記載の細胞：
    　1)固相への接着性を有する、
    　2)CD73、CD105およびCD90からなる群より選択される一つ以上の表面マーカーが陽性である、
    　3)CD45、CD34、CD11b、CD79A、HLA-DRおよびCD31からなる群より選択される一つ以上の表面マーカーが陰性である、
    　4)骨芽細胞への分化能を有しない、又は骨髄由来間葉系幹細胞と比較して当該分化能が低い、
    　5)脂肪細胞への分化能を有しない、又は骨髄由来間葉系幹細胞と比較して当該分化能が低い、
    　6)軟骨細胞への分化能を有しない、又は骨髄由来間葉系幹細胞と比較して当該分化能が低い。
  10. 　以下の工程を含む、細胞の製造方法：
    1)栄養障害型表皮水疱症患者の水疱内容物を固相上で培養する工程、
    2)培養工程1)によって得られた細胞を、VII型コラーゲンを産生するよう遺伝子改変する工程。
  11. 　患者の水疱から採取した水疱内容物を、酵素処理することなく培地に播種し、固相上で培養する、請求項１０に記載の方法。
  12. 　請求項１０または１１に記載の方法によって製造される細胞。
  13. 　VII型コラーゲンを産生するよう遺伝子改変された、栄養障害型表皮水疱症患者の水疱由来細胞。
  14. 　レンチウイルスベクターの製造に用いられるプラスミドであって、
    　EF1αプロモーターと、
    　前記EF1αプロモーターの下流に配置されたCOL7A1遺伝子と、
    を有するプラスミド。
  15. EF1αプロモーターと、
    　前記EF1αプロモーターの下流に配置されたCOL7A1遺伝子と、
    を有するレンチウイルスベクター。
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