WO2021261898A1 - 대마 줄기 추출물을 유효성분으로 함유하는 고콜레스테롤혈증의 예방, 개선 또는 치료용 조성물 - Google Patents

대마 줄기 추출물을 유효성분으로 함유하는 고콜레스테롤혈증의 예방, 개선 또는 치료용 조성물 Download PDF

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stem extract
preventing
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김현기
신명자
박병길
손현선
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주식회사 유셀파마
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Definitions

  • the present invention relates to a composition for preventing, improving or treating hypercholesterolemia containing a hemp stem extract as an active ingredient.
  • Cholesterol is absorbed through food, but it is also synthesized by the body. Cholesterol is found in high concentrations in organs with many membranes, such as the liver, spinal cord, and brain, and is also a major component of blood clots. Cholesterol plays an important role in many physiological and biochemical reactions and is closely related to cardiovascular disease.
  • Cholesterol is mainly produced in the liver, and lipoproteins present in the blood play a role in transporting cholesterol to all parts of the body.
  • the lipoprotein includes low-density lipoprotein (LDL) and high-density lipoprotein (HDL), and HDL transports cholesterol from other tissues to the liver.
  • LDL low-density lipoprotein
  • HDL high-density lipoprotein
  • LDL is mainly produced in the liver and transported to other tissues of the body, so when LDL is high, cholesterol accumulates in blood vessels.
  • the cholesterol is an essential component for maintaining normal functions of the human body, a nutrient essential for making biological membranes and cells, a component that is a material for various hormones such as adrenocortical hormone and sex hormone, and a material for making bile do.
  • Cholesterol in the blood varies according to race, gender, and age. In Korea, when cholesterol is less than 240 mg per 1 dL of blood, it is considered normal, and when cholesterol in the blood is more than 240 mg/dL, it is called hypercholesterolemia. High cholesterol can be caused by genetic factors and occurs when saturated fat and cholesterol are consumed through foods such as meat. When cholesterol is excessively accumulated in the body and becomes hypercholesterolemia, it can cause fatal diseases such as cardiovascular diseases as well as degenerative neurological diseases.
  • Korean Patent No. 2041875 discloses a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of colorectal cancer containing cannabidiol extract and trail extracted from hemp
  • Korean Patent No. 1198017 discloses hemp fiber
  • a composition for sun protection and/or oily skin control comprising a composition for preventing, improving or treating hypercholesterolemia containing the hemp stem extract of the present invention as an active ingredient has not been disclosed.
  • the present invention has been derived from the above needs, and the present invention provides a composition for preventing, improving or treating hypercholesterolemia containing a hemp stem extract as an active ingredient, and the hemp stem extract of the present invention is cytotoxic.
  • the present invention was completed by confirming that there was no, lowering the cholesterol content in hepatocytes, reducing the expression level of the cholesterol synthesis gene, and lowering the blood cholesterol content without significant change in body weight in an animal model.
  • the present invention provides a health functional food composition for preventing or improving hypercholesterolemia containing hemp stem extract as an active ingredient.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating hypercholesterolemia comprising a hemp stem extract as an active ingredient.
  • the present invention relates to a composition for the prevention, improvement or treatment of hypercholesterolemia containing a hemp stem extract as an active ingredient, and the hemp stem extract of the present invention has no cytotoxicity, lowers cholesterol content in hepatocytes, and It also reduces the expression level and has the effect of lowering blood cholesterol content in animal models without significant change in body weight.
  • FIG. 1 is a graph showing the cell viability of HepG 2 according to the treatment of cannabis stem extract
  • (A) is a normal carbohydrate metabolic condition
  • (B) is a cell viability in an abnormal carbohydrate metabolic condition in which the glucose content is lowered. ** and *** indicate a statistically significant increase in cell viability compared to the control group not treated with the hemp stem extract, ** is p ⁇ 0.01, and *** is p ⁇ 0.001.
  • Figure 2 is the result of confirming the total cholesterol content in hepatocytes according to the treatment of hemp stem extract, ## is the cholesterol content in the group induced with high cholesterol by treatment with fructose compared to the control group that did not induce high cholesterol increased, p ⁇ 0.01, *, *** indicates that the cholesterol content was statistically significantly decreased by treatment with hemp stem extract or lovastatin (Lovastatin), * is p ⁇ 0.05, *** is p ⁇ 0.001.
  • 3 is a result confirming the change in the expression level of the cholesterol synthesis-related gene according to the treatment of the hemp stem extract of the present invention.
  • # indicates that the expression level of the cholesterol synthesis-related gene was increased in the high cholesterol group (Fructose 20mM) compared to the normal group (Control), p ⁇ 0.05, * is the hemp stem extract treatment group of the present invention compared to the high cholesterol induction group The expression level of cholesterol synthesis-related genes was statistically significantly decreased, p ⁇ 0.05.
  • Figure 5 confirms the total cholesterol content change (A) and the total cholesterol / HDL- cholesterol ratio (B) according to the feeding of the hemp stem extract of the present invention in the high cholesterol animal model induced by feeding the high cholesterol feed .
  • #### indicates that the total cholesterol content or the ratio of total cholesterol/HDL-cholesterol in the high cholesterol group induced through cholesterol feeding compared to the normal group increased statistically significantly, p ⁇ 0.0001, *, ***, **** indicates that the total cholesterol content or total cholesterol/HDL-cholesterol ratio of the group treated with the hemp stem extract of the present invention compared to the total cholesterol content or total cholesterol/HDL-cholesterol ratio of the high cholesterol group is statistically significant
  • * is p ⁇ 0.05
  • *** is p ⁇ 0.001
  • **** is p ⁇ 0.0001.
  • Figure 6 confirms the total cholesterol content change (A) and LDL- cholesterol content change (B) according to the feeding of the hemp stem extract of the present invention in the high cholesterol animal model induced by feeding the high fat feed.
  • #### indicates that the total cholesterol content or LDL-cholesterol content in the high-cholesterol group was statistically significantly increased compared to the normal group, p ⁇ 0.0001, *, ** are the total cholesterol content or LDL-cholesterol in the high-cholesterol group
  • Total cholesterol content or LDL-cholesterol content of the group treated with the hemp stem extract of the present invention compared to the content was statistically significantly decreased, * is p ⁇ 0.05, ** is p ⁇ 0.01.
  • the present invention relates to a health functional food composition for preventing or improving hypercholesterolemia containing a hemp stem extract as an active ingredient.
  • the cannabis stem extract may be prepared by a method comprising the following steps, but is not limited thereto:
  • step (3) Concentrating the filtered extract of step (2) under reduced pressure and drying to prepare an extract.
  • the extraction solvent is preferably selected from water, C 1 to C 4 lower alcohols or mixtures thereof, and more preferably water, but is not limited thereto.
  • Hemp stem extraction in the present invention can use all conventional methods known in the art, such as filtration, hot water extraction, immersion extraction, reflux cooling extraction, and ultrasonic extraction.
  • the extraction solvent is preferably extracted by adding 1 to 20 times the weight of the dried hemp stem, and more preferably adding 5 to 15 times.
  • the extraction temperature is preferably 50 ⁇ 150 °C, but is not limited thereto.
  • the extraction time is preferably 6 to 24 hours, more preferably 10 to 14 hours, but is not limited thereto.
  • the vacuum concentration in step (3) is preferably, but not limited to, a vacuum vacuum concentrator or a vacuum rotary evaporator.
  • drying under reduced pressure, vacuum drying, boiling drying, spray drying or freeze drying is preferable, but is not limited thereto.
  • the hemp stem extract is characterized by reducing low-density lipoprotein (LDL)-cholesterol and increasing high-density lipoprotein (HDL)-cholesterol.
  • LDL low-density lipoprotein
  • HDL high-density lipoprotein
  • the cannabis stem extract is preferably prepared in any one formulation selected from beverages, pills, tablets, capsules, and powders, but is not limited thereto.
  • the health functional food composition of the present invention may be used with hemp stem extract as it is or with other foods or food ingredients, and may be appropriately used according to a conventional method.
  • the type of the health functional food composition There is no particular limitation on the type of the health functional food composition.
  • foods to which the hemp stem extract can be added include meat, sausage, bread, chocolate, candy, snacks, confectionery, pizza, ramen, other noodles, gum, dairy products including ice cream, various soups, beverages, tea, There are drinks, alcoholic beverages, vitamin complexes, etc., and includes all health functional foods in the ordinary sense.
  • a health drink including the composition of the present invention may contain various flavoring agents or natural carbohydrates as additional ingredients like conventional drinks.
  • the above-mentioned natural carbohydrates are monosaccharides such as glucose and fructose, disaccharides such as maltose and sucrose, polysaccharides such as dextrin and cyclodextrin, and sugar alcohols such as xylitol, sorbitol and erythritol.
  • sweetener natural sweeteners such as taumartin and stevia extract, synthetic sweeteners such as saccharin and aspartame, and the like can be used.
  • the proportion of the natural carbohydrate is generally about 0.01 to 0.04 g, preferably about 0.02 to 0.03 g per 100 g of the composition of the present invention.
  • the health functional food composition of the present invention contains, in addition to the active ingredients, various nutrients, vitamins, electrolytes, flavoring agents, coloring agents, pectic acid and its salts, alginic acid and its salts, organic acids, protective colloidal thickeners, pH adjusters, stabilizers, and preservatives. , glycerin, alcohol, a carbonation agent used in carbonated beverages, and the like may be further contained. In addition, it may further contain the pulp for the production of fruit juice or vegetable beverage. These components may be used independently or in combination. The proportion of these additives is not very important, but is generally selected in the range of 0.01 to 2 parts by weight based on 100 parts by weight of the composition of the present invention.
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating hypercholesterolemia comprising a hemp stem extract as an active ingredient.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be in various oral or parenteral formulations.
  • a pharmaceutically acceptable carrier, excipient or diluent may be further included, and generally used fillers, extenders, binders, wetting agents, diluents or excipients such as disintegrants or surfactants are used.
  • Solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, etc., and such solid preparations include at least one excipient in one or more compounds, for example, starch, calcium carbonate, sucrose or lactose ( lactose), gelatin, etc.
  • Liquid formulations for oral administration include suspensions, solutions, emulsions, syrups, etc.
  • various excipients such as wetting agents, sweeteners, fragrances, and preservatives may be included.
  • Formulations for parenteral administration include sterile aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, freeze-dried preparations, and suppositories.
  • non-aqueous solvent and the suspending solvent propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, and injectable esters such as ethyl oleate may be used.
  • injectable esters such as ethyl oleate
  • base of the suppository witepsol, macrogol, tween 61, cacao butter, laurin, glycero gelatin, and the like can be used.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be administered orally or parenterally, and for parenteral administration, it is preferable to select an external skin or intraperitoneal, rectal, intravenous, intramuscular, subcutaneous, intrauterine dural or intracerebrovascular injection method.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention is administered in a pharmaceutically effective amount.
  • pharmaceutically effective amount means an amount sufficient to treat a disease at a reasonable benefit/risk ratio applicable to medical treatment, and the effective dose level is the type, severity, and drug activity of the patient. , can be determined according to factors including sensitivity to drug, administration time, administration route and excretion rate, duration of treatment, concurrent drugs, and other factors well known in the medical field.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be administered as an individual therapeutic agent or may be administered in combination with other therapeutic agents, may be administered sequentially or simultaneously with conventional therapeutic agents, and may be administered single or multiple. In consideration of all of the above factors, it is important to administer an amount that can obtain the maximum effect with a minimum amount without side effects, which can be easily determined by those skilled in the art.
  • the dosage of the composition of the present invention varies according to the patient's weight, age, sex, health status, diet, administration time, administration method, excretion rate, and severity of disease, and the daily dosage is based on the amount of hemp stem extract It is 0.01 to 2,000 mg/kg as a standard, preferably 30 to 500 mg/kg, and more preferably 50 to 300 mg/kg, and may be administered 1 to 6 times a day.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be used alone or in combination with methods using surgery, radiation therapy, hormone therapy, chemotherapy, and biological response modifiers.
  • HepG 2 carcinoma cells were purchased from ATCC (American Type Culture Collection, Seoul, Korea). HepG 2 cells were subcultured using DMEM medium (including 25 mM glucose, 10% FBS, and 1% antibiotics) every 2 days to maintain development, and 1 ⁇ 10 6 cells were placed in a 6-well plate at 100 ng/ml PMA (phorbol 12). -myristate 13-acetate) was seeded.
  • DMEM medium including 25 mM glucose, 10% FBS, and 1% antibiotics
  • HepG 2 cells were laid on a 96 well plate, and the hot water extract of hemp stem was added at a concentration of 50, 100, 200, 400, 600, 800 and 1000 ⁇ g/ml.
  • DMEM medium containing 25 mM glucose (including 25 mM glucose, 10% FBS, 1% penicillin/streptomycin mixture) and 5.5 mM glucose (5.5 mM glucose, 1% FBS, 1% penicillin) /streptomycin mixture) respectively.
  • CCK-8 was added to the medium at a concentration of 10%, and then reacted at 37° C. for 2 hours, and then absorbance was measured at 450 nm using a microplate spectrometer. The relative cell viability (%) was confirmed through comparison.
  • Example 3 Confirmation of changes in total cholesterol content in hepatocytes according to the treatment of cannabis stem hot water extract
  • HepG 2 cells were treated with cannabis stem hot water extract and 3 days later, the total cholesterol content was measured using a cholesterol cell-based detection assay kit (Cayman Chemical) according to the manufacturer's method.
  • RNA isolation was performed according to the Trizol method, and was isolated using the Easy spid-RNA extraction kit (Intron, Seoul, Korea) according to the manufacturer's method. The concentration was measured and quantified with a Nanodrop DS-11 spectrometer (DeNovix, Wilmington, DE USA) and cDNA was synthesized from each RNA using an iScript cDNA synthesis kit (BioRad, Hercules, CA, USA), and each gene Expression of each gene was compared by q-PCR method using CFX96 Real Time PCR instrument (BioRad, Hercules, CA, USA) and SsoAdvenced TM universal Sybrgreen supermix (BioRad, Hercules, CA, USA).
  • the primer information used is shown in Table 1, and the conditions of Real Time PCR were amplified for 40 cycles and the reaction proceeded (95°C, 30 seconds; 58°C, 30 seconds; 72°C for 30 seconds). Relative quantification was calculated by qPCR of the target group using GAPDH or 18S rRNA as an internal standard.
  • HMGCR HMG-CoA reductase
  • HMGCS1 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA synthase 1
  • ACAT2 acetyl-CoA involved in cholesterol biosynthesis Expression changes of acetyltransferase 2
  • MVD Mevalonate Diphosphate Decarboxylase
  • LSS Longnosterol Synthase
  • SQLE SQLE
  • DHCR7 7-dehydroxholesterol reductase
  • CYP51A1 cytochrome P450 family 51 subfamily A member1
  • the expression level of the cholesterol synthesis-related gene was increased by fructose treatment.
  • the expression level of the cholesterol synthesis-related gene decreased. Confirmed.
  • Example 5 Confirmation of changes in body weight and cholesterol content according to administration of hot water extract from cannabis stems in high cholesterol animal model induced by feeding high cholesterol feed
  • C57BL/6 mice male, 5 weeks old were purchased from Orient Bio (Seongnam, Korea), acclimatized for 1 week, and then used for testing.
  • Breeding environment is SPF breeding area, temperature range: 20.1 ⁇ 22.1°C, relative humidity: 46.8 ⁇ 52.9%, number of ventilation: 10 ⁇ 15 times/hr, lighting time and light/dark cycle: 12 hours
  • Purified water, general feed (Harlan, Ltd.) and high-cholesterol feed (D12336, Research diets) that had undergone the purification process were allowed to be freely consumed through the feeding period.
  • blood was collected by orbital blood sampling and divided into groups based on total cholesterol.
  • high-cholesterol feed was supplied and at the same time, 100, 300 and 500 mg/kg of cannabis stem extract, and 30 mg/kg of simvastatin, a comparative drug, was administered orally once a day for 12 weeks.
  • Body weight and feed intake were measured once a week, and serum was separated through orbital blood sampling once every 4 weeks, and analysis was performed using a serological analyzer (Toshiba, Accute).
  • Composition of efficacy test group of hemp stem extract using animal model test group food feed substance to be administered Dosing Concentration (mg/kg) number of animals
  • G1 general feed Vehicle (0.5% CMC) - 8
  • G2 high cholesterol feed Vehicle (0.5% CMC) - 8
  • Simvastatin 30
  • G4 high cholesterol feed Hemp Stem Hot Water Extract (CSE) 100
  • G5 high cholesterol feed Hemp Stem Hot Water Extract (CSE) 300
  • Example 6 Confirmation of changes in body weight and cholesterol content according to administration of hot water extract from hemp stems in high-cholesterol animal model induced by feeding high-fat feed
  • Composition of efficacy test group of hemp stem extract using animal model test group food feed substance to be administered Dosing concentration (mg/kg) number of animals
  • G1 general feed Vehicle distilled water
  • G2 high fat feed Vehicle distilled water
  • Hemp Stem Hot Water Extract CSE
  • 300 7 G4 high fat feed Hemp Stem Hot Water Extract CSE 500 7

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Abstract

본 발명은 대마 줄기 추출물을 유효성분으로 함유하는 고콜레스테롤혈증의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 대마 줄기 추출물은 세포독성이 없고, 간세포에서 콜레스테롤 함량을 낮추며, 콜레스테롤 합성유전자의 발현량도 감소시키고, 동물모델에서 체중에 큰 변화 없이, 혈중 콜레스테롤 함량을 낮추는 효과가 있다. 따라서 본 발명의 조성물은 고콜레스테롤 혈증 관련 건강기능식품 및 의약품에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

대마 줄기 추출물을 유효성분으로 함유하는 고콜레스테롤혈증의 예방, 개선 또는 치료용 조성물
본 발명은 대마 줄기 추출물을 유효성분으로 함유하는 고콜레스테롤혈증의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
콜레스테롤은 음식을 통해서도 흡수되지만 우리 몸에서 합성하기도 한다. 콜레스테롤은 간, 척수, 뇌와 같이 세포막이 많은 기관에서 높은 농도로 발견되며 혈전의 주요 구성성분이기도 하다. 콜레스테롤은 많은 생리적, 생화학적 반응에 중요한 역할을 하며, 심혈관 질환에 밀접한 관련이 있다.
콜레스테롤은 주로 간에서 생성되며, 혈액 중에 존재하는 지질단백질(lipoprotein)이 콜레스테롤을 우리 몸의 곳곳으로 운반하는 역할을 한다. 상기 지질 단백질에는 저밀도 지질단백질(low density lipoprotein, LDL)과 고밀도 지질단백질(high density lipoprotein, HDL)이 있으며, HDL은 다른 조직에서 간으로 콜레스테롤을 운반하기 때문에 HDL이 많으면, 혈관에서 콜레스테롤이 제거된다. LDL은 간에서 주로 생성되어 인체의 다른 조직으로 운반되므로 LDL이 많은 경우 혈관에 콜레스테롤이 많이 쌓이게 된다. 구체적으로, 상기 콜레스테롤은 인체의 기능을 정상적으로 유지시키는데 필수적인 구성성분이며, 생체막과 세포를 만드는데 꼭 필요한 영양소이고, 부신피질 호르몬이나 성호르몬 등 여러 가지 호르몬의 재료가 되는 성분이며, 담즙을 만드는 재료가 된다.
혈액 중의 콜레스테롤은 인종, 성별, 연령에 따라 다르다. 국내에서는 보통 혈액 1dL 당 콜레스테롤 240mg 미만일 때 정상으로 보고, 혈액 내에 콜레스테롤이 240mg/dL 이상이면 고콜레스테롤혈증이라고 부른다. 고콜레스테롤은 유전적 요인으로 생길 수 있으며, 육류 같은 식품을 통해 포화지방과 콜레스테롤을 섭취하는 경우에 발생한다. 체내에 콜레스테롤이 과도하게 축적되어 고콜레스테롤혈증 상태가 되면 심혈관계 질환뿐만 아니라 퇴행성 신경질환과 같은 치명적인 질병을 유발시킬 수 있다.
한편, 대마 관련 기술로는 한국등록특허 제2041875호에 대마로부터 추출된 칸나비디올 추출물 및 트레일을 함유하는 대장암 예방 또는 치료용 약학 조성물이 개시되어 있고, 한국등록특허 제1198017호에 대마섬유를 포함하는 자외선 차단 및/또는 지성 피부 조절용 조성물이 개시되어 있으나, 본 발명의 대마 줄기 추출물을 유효성분으로 함유하는 고콜레스테롤혈증의 예방, 개선 또는 치료용 조성물이 개시된 바 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명은 대마 줄기 추출물을 유효성분으로 함유하는 고콜레스테롤혈증의 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공하고, 본 발명의 대마 줄기 추출물은 세포독성이 없고, 간세포에서 콜레스테롤 함량을 낮추며, 콜레스테롤 합성유전자의 발현량도 감소시키고, 동물모델에서 체중에 큰 변화 없이, 혈중 콜레스테롤 함량을 낮추는 효과가 있다는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 대마 줄기 추출물을 유효성분으로 함유하는 고콜레스테롤혈증의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 대마 줄기 추출물을 유효성분으로 포함하는 고콜레스테롤혈증의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명은 대마 줄기 추출물을 유효성분으로 함유하는 고콜레스테롤혈증의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 대마 줄기 추출물은 세포독성이 없고, 간세포에서 콜레스테롤 함량을 낮추며, 콜레스테롤 합성유전자의 발현량도 감소시키고, 동물모델에서 체중에 큰 변화 없이, 혈중 콜레스테롤 함량을 낮추는 효과가 있다.
도 1은 대마 줄기 추출물의 처리에 따른 HepG2 세포 생존율을 확인한 것으로, (A)는 정상적인 탄수화물 대사 조건이고, (B)는 글루코오스 함량을 낮춘 비정상적 탄수화물 대사 조건에서의 세포 생존율이다. **, ***는 대마 줄기 추출물을 처리하지 않은 대조군에 비해 통계적으로 유의미하게 세포 생존률이 증가하였다는 것으로 **는 p<0.01이고, ***는 p<0.001이다.
도 2는 대마 줄기 추출물의 처리에 따른 간세포에서의 총 콜레스테롤 함량을 확인한 결과로, ##는 고콜레스테롤을 유도하지 않은 대조군에 비해 프럭토오스를 처리하여 고콜레스테롤을 유도한 군에서의 콜레스테롤 함량이 증가했다는 것으로, p<0.01이고, *, ***는 대마 줄기 추출물 또는 로바스타틴(Lovastatin)의 처리에 의해 콜레스테롤 함량이 통계적으로 유의미하게 감소하였다는 것으로, *는 p<0.05이고, ***는 p<0.001이다.
도 3은 본 발명의 대마 줄기 추출물 처리에 따른 콜레스테롤 합성 관련 유전자의 발현량 변화를 확인한 결과이다. #은 정상군(Control) 대비 고콜레스테롤군(Fructose 20mM)에서의 콜레스테롤 합성 관련 유전자의 발현량이 증가하였다는 것으로, p<0.05이고, *는 고콜레스테롤 유도군 대비 본 발명의 대마 줄기 추출물 처리군에서의 콜레스테롤 합성 관련 유전자의 발현량이 통계적으로 유의미하게 감소하였다는 것으로, p<0.05이다.
도 4는 고콜레스테롤 사료를 급이하여 확립한 고콜레스테롤 동물 모델에서, 본 발명의 대마 줄기 추출물의 급여에 따른 동물 모델의 체중 변화를 확인한 결과이다.
도 5는 고콜레스테롤 사료를 급이하여 유도한 고콜레스테롤 동물 모델에서, 본 발명의 대마 줄기 추출물의 급여에 따른 총 콜레스테롤 함량 변화(A) 및 총 콜레스테롤/HDL-콜레스테롤의 비율(B)을 확인한 것이다. ####은 정상군 대비 콜레스테롤 급여를 통해 유도한 고콜레스테롤 군의 총 콜레스테롤 함량 또는 총 콜레스테롤/HDL-콜레스테롤의 비율이 통계적으로 유의미하게 증가하였다는 것으로 p<0.0001이고, *, ***, ****은 고콜레스테롤 군의 총 콜레스테롤 함량 또는 총 콜레스테롤/HDL-콜레스테롤의 비율 대비 본 발명의 대마 줄기 추출물을 처리한 군의 총 콜레스테롤 함량 또는 총 콜레스테롤/HDL-콜레스테롤의 비율이 통계적으로 유의미하게 감소하였다는 것으로, *는 p<0.05이고, ***는 p<0.001이며, ****는 p<0.0001이다.
도 6은 고지방 사료를 급이하여 유도한 고콜레스테롤 동물 모델에서, 본 발명의 대마 줄기 추출물의 급여에 따른 총 콜레스테롤 함량 변화(A) 및 LDL-콜레스테롤 함량 변화(B)를 확인한 것이다. ####은 정상군 대비 고콜레스테롤 군의 총 콜레스테롤 함량 또는 LDL-콜레스테롤 함량이 통계적으로 유의미하게 증가하였다는 것으로 p<0.0001이고, *, **은 고콜레스테롤 군의 총 콜레스테롤 함량 또는 LDL-콜레스테롤 함량 대비 본 발명의 대마 줄기 추출물을 처리한 군의 총 콜레스테롤 함량 또는 LDL-콜레스테롤 함량이 통계적으로 유의미하게 감소하였다는 것으로, *는 p<0.05이고, **는 p<0.01이다.
본 발명은 대마 줄기 추출물을 유효성분으로 함유하는 고콜레스테롤혈증의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물에 관한 것이다.
상기 대마 줄기 추출물은 하기의 단계를 포함하는 방법에 의해 제조할 수 있으나, 이에 한정하지 않는다:
(1) 대마 줄기(Cannabis sativa stem)에 추출용매를 가하여 추출하는 단계;
(2) 단계 (1)의 추출물을 여과하는 단계; 및
(3) 단계 (2)의 여과한 추출물을 감압 농축하고 건조하여 추출물을 제조하는 단계.
상기 단계 (1)에서 추출용매는 물, C1~C4의 저급 알코올 또는 이들의 혼합물 중에서 선택하는 것이 바람직하며, 더 바람직하게는 물이지만 이에 한정하지 않는다.
본 발명에서의 대마 줄기 추출은 여과법, 열수 추출, 침지 추출, 환류 냉각 추출 및 초음파 추출 등의 당 업계에 공지된 모든 통상적인 방법을 이용할 수 있다. 상기 추출용매는 건조된 대마 줄기 중량의 1~20배 첨가하여 추출하는 것이 바람직하며, 더 바람직하게는 5~15배 첨가하는 것이다. 추출온도는 50~150℃인 것이 바람직하지만 이에 한정하지 않는다. 또한, 추출시간은 6~24시간인 것이 바람직하며, 10~14시간이 더욱 바람직하지만 이에 한정하지 않는다. 상기 방법에 있어서, 단계 (3)의 감압농축은 진공 감압 농축기 또는 진공회전증발기를 이용하는 것이 바람직하지만, 이에 한정하지 않는다. 또한, 건조는 감압건조, 진공건조, 비등건조, 분무 건조 또는 동결 건조하는 것이 바람직하지만 이에 한정하지 않는다.
상기 대마 줄기 추출물은 저밀도 지질단백질(LDL)-콜레스테롤을 감소시키고, 고밀도 지질단백질(HDL)-콜레스테롤을 증가시키는 것이 특징이다.
상기 대마 줄기 추출물은 음료, 환, 정제(tablet), 캡슐제(capsule) 및 산제 중에서 선택된 어느 하나의 제형으로 제조되는 것이 바람직하지만 이에 한정하지 않는다.
본 발명의 건강기능식품 조성물은 대마 줄기 추출물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 상기 건강기능식품 조성물의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 대마 줄기 추출물을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강기능식품을 모두 포함한다. 본 발명의 조성물을 포함하는 건강 음료는 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100g당 일반적으로 약 0.01~0.04g, 바람직하게는 약 0.02~0.03g이다.
본 발명의 건강기능식품 조성물은 상기 유효성분 이외에 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 추가로 더 함유할 수 있다. 그 밖에 과일 주스 또는 야채 음료의 제조를 위한 과육을 더 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 혼합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부에 대하여, 0.01~2 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
또한, 본 발명은 대마 줄기 추출물을 유효성분으로 포함하는 고콜레스테롤혈증의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 약학 조성물은 경구 또는 비 경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 상기 유효성분 이외에 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있는데, 일반적으로 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제 또는 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용된다. 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성 용제 및 현탁 용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로 젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 경구 또는 비 경구로 투여될 수 있으며, 비 경구 투여 시 피부 외용 또는 복강 내, 직장, 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관 내 주사 방식을 선택하는 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, "약제학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 조성물의 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설률 및 질환의 중증도에 따라 그 범위가 다양하며, 일일 투여량은 대마 줄기 추출물의 양을 기준으로 0.01~2,000mg/kg이고, 바람직하게는 30~500mg/kg이고, 더욱 바람직하게는 50~300mg/kg이며, 하루 1~6회 투여될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 단독으로 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
이하, 실시예를 이용하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되지 않는다는 것은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 자명한 것이다.
[세포 배양]
HepG2 carcinoma 세포는 ATCC(American Type Culture Collection, Seoul, Korea)에서 분양 받았다. HepG2 세포는 2일마다 DMEM 배지(25mM glucose, 10% FBS, 1% antibiotics 포함)을 이용하여 계대하여 현상을 유지하였으며, 6웰 플레이트에 1×106개의 세포를 100ng/㎖ PMA(phorbol 12-myristate 13-acetate)와 함께 seeding하였다.
실시예 1. 대마 줄기 열수 추출물의 제조
2개월가량 자란 대마의 줄기 3kg에 물 30ℓ를 첨가한 후, 100~120℃에서 12시간 동안 열수 추출하였다. 이를 동결건조하여 108.69g의 추출물을 수득하였다.
실시예 2. 대마 줄기 열수 추출물의 간세포 독성 확인
대마 줄기 열수 추출물의 간세포 독성을 확인하기 위하여, 96웰 플레이트(well plate)에 HepG2 세포를 깔고, 대마 줄기 열수 추출물을 50, 100, 200, 400, 600, 800 및 1000㎍/㎖의 농도로 처리하고, 25mM의 글루코오스를 포함하는 DMEM 배지(25mM glucose, 10% FBS, 1% 페니실린/스트렙토마이신 혼합물 포함) 및 5.5mM의 글루코오스를 포함하는 DMEM 배지(5.5mM glucose, 1% FBS, 1% 페니실린/스트렙토마이신 혼합물 포함)에서 각각 배양하였다. 24시간 후에 배지에 CCK-8을 10% 농도로 첨가한 다음 2시간 동안 37℃에서 반응시킨 후, 마이크로플레이트 스펙트로미터를 이용하여 450nm에서 흡광도를 측정하였고, 대마 줄기 추출물을 처리하지 않은 대조군과의 비교를 통해 상대적인 세포 생존율(%)을 확인하였다.
그 결과, 도 1에 개시한 바와 같이, 배지에 포함된 글루코오스 함량에 상관 없이 대마 줄기 열수 추출물을 50~1000㎍/㎖의 농도로 처리하여도 세포 독성이 거의 나타나지 않는다는 것을 확인하였다. 낮은 농도의 글루코오스를 포함하는 배지에 대마 줄기 열수 추출물을 처리한 경우, 세포 생존률이 통계적으로 유의미하게 증진된 것을 확인할 수 있었다.
낮은 농도의 글루코오스를 포함하는 배지 조건은 프럭토오스를 처리하여 고콜레스테롤을 유도할 때 글루코오스 함량을 일정하게 유지하기 위하여, 글루코오스 함량을 조절한 조건으로 고콜레스테롤 세포 모델에서 글루코오스 함량 변화에 따른 세포생존률을 확인하기 위한 것이다.
실시예 3. 대마 줄기 열수 추출물의 처리에 따른 간세포 내에서의 총 콜레스테롤 함량의 변화 확인
HepG2 세포에 대마 줄기 열수 추출물을 처리하고 3일 후, 콜레스테롤 세포 기반 검출 어세이 키트(Cayman Chemical)를 이용하여 제조사의 방법에 따라 총 콜레스테롤의 함량을 측정하였다.
그 결과 도 2에 개시한 바와 같이, 프럭토오스(fructose)의 처리에 의해 총 콜레스테롤 함량이 증가한 것을 확인하였고, 본 발명의 대마 줄기 추출물 400㎍/㎖을 처리한 경우 총 콜레스테롤 함량이 통계적으로 유의미하게 감소한 것을 확인하였다.
실시예 4. 대마 줄기 열수 추출물의 처리에 따른 콜레스테롤 합성 관련 유전자의 발현량 변화 확인
RNA 분리는 Trizol 방법에 따라 수행하였으며, Easy spid-RNA 추출키트(Intron, Seoul, Korea)를 이용하여 제조사의 방법에 따라 분리하였다. Nanodrop DS-11 스펙트로미터(DeNovix, Wilmington, DE USA)로 농도를 측정하여 정량한 다음각각의 RNA로부터 cDNA를 iScript cDNA 합성키트(BioRad, Hercules, CA, USA)를 이용하여 합성하였으며, 각각의 유전자 발현은 CFX96 Real Time PCR 기기(BioRad, Hercules, CA, USA) 및 SsoAdvencedTM universal Sybrgreen supermix(BioRad, Hercules, CA, USA)을 이용한 q-PCR 방법으로 각 유전자의 발현을 비교하였다. 사용된 프라이머 정보는 표 1에 표시하였으며, Real Time PCR의 조건은 40 사이클로 증폭시켜 반응을 진행하였다(95℃, 30초; 58℃, 30초; 72℃에서 30초). 내부표준물질로 GAPDH 또는 18S rRNA를 사용하여 타겟 그룹의 qPCR로 계산하여 상대적 정량화하였다.
유전자의 프라이머 정보
유전자 방향성 서열(5'->3') 서열번호
HMGCR 정방향 TGCTTTGGCTGCATGTCAGT 서열번호 1
역방향 GCTATCCAGCGACTGTGAGC 서열번호 2
HMGCS1 정방향 CCTGGTAGTTGCAGGAGATA 서열번호 3
역방향 CTAATGCACTGAGGTAGCAC 서열번호 4
ACAT2 정방향 TGGCTCCGGAAGATGTGTCT 서열번호 5
역방향 CCTCCTGCAACCACAATGCT 서열번호 6
MVD 정방향 CGAGTCACACTGGCCTGAAC 서열번호 7
역방향 GGATGATGCGCCAGGAGATG 서열번호 8
LSS 정방향 ACTTCGCCAGCATTGACTGG 서열번호 9
역방향 GTCCACATACCAGCGCACAA 서열번호 10
SQLE 정방향 CTTTGGCCAACAGGGAGGTC 서열번호 11
역방향 TGGTTCCTTTTCTGCGCCTC 서열번호 12
DHCR7 정방향 ACCTTGTGGGTCACCTTCCA 서열번호 13
역방향 GCAGTGGGATCCAGTTGTCG 서열번호 14
CYP51A1 정방향 GTAGCAGGGATGCTTATTGG 서열번호 15
역방향 GATGTCCTGGAGGAATGGTA 서열번호 16
GAPDH 정방향 GAGTCAACGGATTTGGTCGT 서열번호 17
역방향 GTTGTCATGGATGACCTTGG 서열번호 18
대마 줄기 추출물의 세포내 콜레스테롤 대사를 억제하는 효과를 확인하기 위하여, 콜레스테롤 생합성에 관여하는 HMGCR(HMG-CoA reductase), HMGCS1(3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA synthase 1), ACAT2(acetyl-CoA acetyltransferase 2), MVD(Mevalonate Diphosphate Decarboxylase), LSS(Lanosterol Synthase), SQLE(Squalene epoxidase), DHCR7(7-dehydroxholesterol reductase) 및 CYP51A1(cytochrome P450 family 51 subfamily A member1) 유전자의 발현 변화를 확인하였다.
그 결과 도 3에 개시한 바와 같이, 프럭토오스 처리에 의해 콜레스테롤 합성 관련 유전자의 발현량이 증가하였으며, 이에 대비하여 본 발명의 대마 줄기 열수 추출물을 처리한 경우, 콜레스테롤 합성 관련 유전자의 발현량이 감소한 것을 확인하였다.
실시예 5. 고콜레스테롤 사료를 급이하여 유도한 고콜레스테롤 동물 모델에서의 대마 줄기 열수 추출물의 투여에 따른 체중 및 콜레스테롤 함량 변화 확인
C57BL/6 마우스(수컷, 5주령)을 오리엔트바이오(성남, 한국)에서 구입하여, 1주 동안의 순화 과정을 거친 후 시험에 사용하였다.
사육환경은 SPF 사육구역, 온도범위: 20.1~22.1℃, 상대습도: 46.8~52.9%, 환기횟수: 10~15회/hr, 조명시간 및 명암주기: 12시간 명암 주기 조도: 175lux의 환경에서 주 2회 케이지 교체를 진행하고, 케이지당 2~4마리의 마우스를 수용하였다. 정수과정을 거친 정제수, 일반사료((주)Harlan) 및 고콜레스테롤 사료(D12336, Research diets)는 급이기를 통해 자유섭취하도록 하였다. 실험 시작 전에 안와채혈로 혈액을 수집하여 총 콜레스테롤을 기준으로 그룹을 나눴다. 그룹을 나눈 후 고콜레스테롤 사료를 공급함과 동시에 대마 줄기 추출물을 100, 300 및 500mg/kg으로, 비교 약물인 심바스틴(simvastatin)은 30mg/kg으로 경구 투여를 1일 1회, 12주 동안 진행하였다. 주 1회 체중과 사료섭취량을 측정하였으며, 4주에 1번씩 안와채혈을 통해 혈청을 분리하여 혈청분석기(Toshiba, Accute)를 통한 분석을 진행하였다.
동물 모델을 이용한 대마 줄기 추출물의 효능 시험군의 구성
시험군 식이사료 투여물질 투여농도
(mg/kg)		 동물 수
G1 일반사료 Vehicle(0.5% CMC) - 8
G2 고콜레스테롤 사료 Vehicle(0.5% CMC) - 8
G3 고콜레스테롤 사료 심바스타틴 30 8
G4 고콜레스테롤 사료 대마 줄기 열수 추출물(CSE) 100 8
G5 고콜레스테롤 사료 대마 줄기 열수 추출물(CSE) 300 8
G6 고콜레스테롤 사료 대마 줄기 열수 추출물(CSE) 500 8
그 결과, 12주 동안 체중이 점진적으로 증가하였으나 그룹 간 체중은 거의 차이가 나타나지 않았으며(도 4), 12주 후 콜레스테롤 사료를 급여한 그룹은 총 콜레스테롤 함량 및 총 콜레스테롤/HDL의 비율이 통계적으로 유의미하게 증가하였고, 이에 대비하여 본 발명의 대마 줄기 추출물을 급여한 그룹(G4~G6)에서는 통계적으로 유의미하게 총 콜레스테롤 함량 및 총 콜레스테롤/HDL의 비율이 감소하였다(도 5).
실시예 6. 고지방 사료를 급이하여 유도한 고콜레스테롤 동물 모델에서의 대마 줄기 열수 추출물의 투여에 따른 체중 및 콜레스테롤 함량 변화 확인
고콜레스테롤을 유도하기 위하여 고지방 사료를 급여한 것을 제외하고는 상기 실시예 5와 동일한 조건으로 실시하였다(표 3).
동물 모델을 이용한 대마 줄기 추출물의 효능 시험군의 구성
시험군 식이사료 투여물질 투여농도(mg/kg) 동물 수
G1 일반사료 Vehicle(증류수) - 7
G2 고지방 사료 Vehicle(증류수) - 7
G3 고지방 사료 대마 줄기 열수 추출물(CSE) 300 7
G4 고지방 사료 대마 줄기 열수 추출물(CSE) 500 7
그 결과, 12주 동안 체중이 점진적으로 증가하였으나 그룹 간 체중은 거의 차이가 나타나지 않았으며, 12주 후 고지방 사료를 급여한 그룹은 총 콜레스테롤 함량 및 LDL-콜레스테롤 함량이 통계적으로 유의미하게 증가하였고, 이에 대비하여 본 발명의 대마 줄기 추출물을 급여한 그룹에서는 통계적으로 유의미하게 총 콜레스테롤 함량 및 LDL-콜레스테롤 함량이 감소하였다(도 6).
[통계처리]
본 발명에서는 ANOVA 테스트를 통해 통계학적 유의성을 검정하였으며, 통계방법은 상용으로 널리 사용되는 통계 패키지인 GraphPad Prism 5.01 프로그램을 이용하였다.

Claims (6)

  1. 대마 줄기 추출물을 유효성분으로 함유하는 고콜레스테롤혈증의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 대마 줄기 추출물의 추출용매는 물, C1~C4의 저급 알코올 또는 이들의 혼합물인 것을 특징으로 하는 고콜레스테롤혈증의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 대마 줄기 추출물은 저밀도 지질단백질(LDL)-콜레스테롤을 감소시키고, 고밀도 지질단백질(HDL)-콜레스테롤을 증가시키는 것을 특징으로 하는 고콜레스테롤혈증의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 대마 줄기 추출물은 음료, 환, 정제(tablet), 캡슐제(capsule) 및 산제 중에서 선택된 어느 하나의 제형으로 제조되는 것을 특징으로 하는 고콜레스테롤혈증의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
  5. 대마 줄기 추출물을 유효성분으로 포함하는 고콜레스테롤혈증의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 유효성분 이외에 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 고콜레스테롤혈증의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
PCT/KR2021/007849 2020-06-23 2021-06-23 대마 줄기 추출물을 유효성분으로 함유하는 고콜레스테롤혈증의 예방, 개선 또는 치료용 조성물 WO2021261898A1 (ko)

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