WO2021248255A1 - Método de aislamiento de bacterias ácido lácticas (bals) a partir de muestras complejas - Google Patents

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WO2021248255A1
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lactic acid
acid bacteria
samples
mrs agar
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PCT/CL2020/050062
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Paola Andrea DURÁN CUEVAS
Mariannys CHÁVEZ JEREZ
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Universidad De La Frontera
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
    • C12Q1/045—Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/46—Streptococcus ; Enterococcus; Lactococcus

Definitions

  • the present invention belongs to the field of Microbiology, Biotechnology and Food.
  • the present invention refers to a microbiological method that allows the growth, isolation and identification of lactic acid bacteria (BALs) from samples where the BALs are in a low concentration, wherein said method comprises the following stages: (1) Fermentation , (2) Seeding on MRS agar, (3) Incubation in a microaerophilic atmosphere, and (4) Colony selection and depletion seeding. 0 BACKGROUND OF THE INVENTION
  • Lactic acid bacteria are a large and heterogeneous group of Gram-positive bacteria, characterized by their strict fermentative metabolism, with lactic acid being the main secondary product during the fermentation of sugars.
  • This bacterial group is of great importance for the biotechnology industry since they are part of starter cultures and are part of probiotics, widely used in the food industry.
  • This particular group of bacteria comprises more than a dozen different genera, some of the best known being the genus Lactococcus and Lactobacillus, since they have been used as components of different products in the food industry. Due to the importance and versatility of this bacterial group, the number of BALs that are isolated from different environments continues to increase, and special culture media for the isolation of these bacteria from different types of samples continue to be developed.
  • JP2019122296A describes a method for isolating lactic acid bacteria from the root of a plant called kudzu (Pueraria Montana var. Lobata) and methods for the production of yogurt using said lactic acid bacteria as starter cultures are also disclosed.
  • the described method includes an enrichment step using a culture medium for Lactic Acid Bacteria, however it is only mentioned that this culture medium is standard and its components are not disclosed.
  • the samples are grown in the culture medium containing cycloheximide and then grown between 25 ° C and 37 ° C for between 24 and 48 hours. Then, the enriched culture is plated on a BCP 0 agar plate CN109337838A discloses a method that describes a preparation of aquatic products and methods of preparing the same.
  • the preparation method refers to a fermentation from a water sample obtained from a culture medium where aquatic animals live.
  • the culture medium used was MRS (Peptone 1%; meat extract 0.5%, yeast extract 0.4%, glucose 2%, Tween 800.1%, dipotassium phosphate 0.2%, 5 sodium acetate 0 , 5%, 0.2% triammonium citrate, 0.02% magnesium sulfate, 0.005% manganese sulfate, pH 6.2
  • the samples were incubated in said culture medium at 37 ° C for between 24 and 48 hours.
  • KR20180072225A discloses a method for isolating Lactic Acid Bacteria from kefir, which comprises inoculating the samples of this food in MRS culture medium and subsequently growing said cultures under strict anaerobic conditions at 37 ° C for 48 hours. After growth, the Lactic Acid Bacteria are selected in a first approximation by their colony shape and then they are selected by the gram test and the catalase test. It is indicated that the selected colonies were passed through different passages in selective plates until pure cultures are obtained.
  • US2017360052A1 describes a protocol for the isolation of lactic acid bacteria from a food called Nuruk and related samples.
  • the protocol includes a first breakdown of the sample to later grow them in MRS medium supplemented with 0.01% cycloheximide and 5 SBD (2% maltose, 0.3% yeast extract, 1.5% fresh yeast extract, Tween 80 0 , 03%, 0.6% casein peptone, pH 5.6 Growth conditions are 37 ° C for 48 hours.
  • the isolation and selection protocol for this type of 0 bacteria includes: (1) Suspension of the samples in 0.1% peptone water, (2) Serial dilutions and growth on MRS agar supplemented with 2% fructose or 2% glucose, ( 3) Incubation at 37 ° C for between 24 and 72 hours under anaerobic conditions, (4) Detection of lactic acid bacteria using calcium carbonate, and (5) Selection of LAB by morphological characteristics and catalase activity. 5 Saguibo., Et al, describe a protocol for the isolation of lactic acid bacteria from medicinal and edible plants of the Philippines.
  • the isolation and selection protocol for this type of bacteria includes: (1) Suspension of the samples in 0.1% peptone water, (2) Serial dilutions and growth on MRS agar supplemented with 2% fructose or 2% glucose, (3 ) Incubation at 30 ° C for between 24 and 72 hours under anaerobic conditions, (4) Detection of lactic acid bacteria using calcium carbonate, and (5) Selection of LAB by morphological characteristics and catalase activity.
  • the present invention corresponds to a microbiological method that allows the growth, isolation and identification of lactic acid bacteria from samples where the LABs are in a low concentration, where said method comprises the following stages: (1) Fermentation, (2 ) Sowing on MRS agar, (3) Incubation in a microaerophilic atmosphere, and (4) Selection of colonies and sowing by depletion. 0 BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES
  • the central image shows the four different conditions: 1- upper left quadrant, sowing from a non-fermented sample in medium enriched with sorbic acid; 2- upper right quadrant, cultures from non-fermented sample and medium not enriched with sorbic acid; 3- lower left quadrant5, plates seeded from fermented samples and medium enriched with sorbic acid; 4- lower right quadrant, cultures seeded from fermented sample, in medium not enriched with sorbic acid.
  • Upper left box with yellow border enlargement of a plate from condition 3, where innumerable colonies of small diameter and dark spots are visualized on the agar, product of the dissolution of CaCC> 3 from the medium, indicating the presence of BALs.
  • Lower left box with red border enlargement of the plate of condition 3 where around ten small, round colonies are visualized, with a dilution halo around them, revealing the presence of BALs.
  • Right frame with orange border enlargement of a plate completely covered by large, irregular and globular colonies, it is not possible to visualize the presence of BALs.
  • the present invention corresponds to a new method that allows the isolation of BALs from complex samples, which comprises the following steps:
  • Fermentation The sample is incubated in a 0.1% sterile peptone solution, at 25-37 ° C for 24-48 hours maximum.
  • Step 2 Sowing on MRS agar: Serial dilutions are made from step 1, and these are seeded on a MRS agar enriched with 0.2% sorbic acid and 1% CaCO3, and the medium is adjusted to pH 5.8 .
  • Colonies that are rounded, convex and have a dilution halo around them are selected, and seeding by depletion is carried out until pure cultures are obtained.
  • the first step of the method corresponds to the inoculation of the sample from which the BALs are to be isolated in a sterile 0.1% w / v peptone solution.
  • the sample is selected from the group consisting of: soil sample, river sediment sample, marine sediment sample, fresh water sample, salt water sample, and plant sample.
  • the plant sample may correspond to parts of the plants such as: stem, leaves and flowers.
  • the plant sample is from the endosphere (internal part of the plant)
  • the outer part of the sample to be inoculated must be disinfected (preferably with ethanol), then the sample must be cut under sterile conditions and finally the sample is inoculated in the sterile peptone solution.
  • the samples from the fermentation stage are grown for a period of time between 24 hours and a maximum of 48 hours.
  • the samples in the fermentation stage are grown for between 30 and about 48 hours.
  • the samples in the fermentation stage are grown at a temperature between 25 ° C and 40 ° C. In an even more specific embodiment, the samples in the fermentation stage are grown at 37 ° C.
  • an aliquot from the fermentation stage is seeded on the MRS agar.
  • the MRS culture medium has the following composition: Peptone 5 1%; meat extract 0.5%, yeast extract 0.4%, glucose 2%, Tween 80 0.1%, dipotassium phosphate 0.2%, sodium acetate 0.5%, triammonium citrate 0.2%, sulfate magnesium 0.02%, manganese sulfate 0.005%.
  • the MRS medium is supplemented with sorbic acid in a concentration of between 0.1% to 0.5%. In a more specific embodiment the sorbic acid concentration is 0.2%.
  • the MRS medium is supplemented with a calcium carbonate (CaCO 3 ) concentration of between 0.1% to 2%.
  • CaCO 3 calcium carbonate
  • the CaCO 3 concentration is around 1%.
  • the MRS medium is supplemented with 0.2% sorbic acid, and with 1% CaCO 3 5.
  • the MRS agar inoculated with the fermented sample (derived from steps 1 and 2) is grown in a microaerophilic atmosphere.
  • concentration of 0 2 within the microaerophilic atmosphere is between 0.2% to 20.9%.
  • the oxygen concentration within the microaerophilic atmosphere is between 8% to 20%.
  • the oxygen concentration is around 15%, preferably 15%.
  • the incubation in microaerophilia is for a period of time between 48 hours and 72 hours.
  • the incubation in microaerophilia is for period 0 between about 48 and about 72 hours.
  • the incubation in microaerophilia is at a temperature between 25 ° C and 40 ° C.
  • the microaerophilic incubations are grown at 37 ° C.
  • the colonies are observed macromorphologically and those that present a dilution halo around them, and that their colony is rounded, convex, are selected for subsequent characterization.
  • the selected colonies are seeded by exhaustion, seeding said colonies on MRS agar and then said inoculated plates are grown under microaerophilic conditions as mentioned above.
  • the pure colonies of BALs obtained are grown in liquid MRS culture medium, and then they are stored in a 25% glycerol solution at low temperatures (preferably -20 and / or -80).
  • a cryopreservative medium is used for the storage of the isolated lactic acid bacteria, which may comprise glycerol or sucrose.
  • the glycerol or sucrose may be in a concentration of between 10% and 50%, preferably 30%.
  • Example 1 Evaluation of sorbic acid for the growth and isolation of lactic acid bacteria from complex samples
  • quadrant 4 plaques totally covered by opportunistic bacteria are visualized; in contrast, quadrant 3, which was enriched with sorbic acid, exhibits plaques with many colonies with putative BALs morphology and very little or no growth of opportunistic microorganisms 5 (almost null ).
  • BALs are slow-growing and have high nutritional requirements, therefore, if it is required to isolate them from complex samples where microorganisms with a higher growth rate abound, it is necessary to add an antimicrobial to limit their growth. In this way they do not deplete the nutrients and the space in the medium, before the BALs0 can flourish.
  • previous fermentation contributes to the probability of successful isolation of BALs, since it increases the number of microorganisms with respect to the fresh sample. It must be taken into account that in complex samples these are found in a very low proportion with respect to the general microbiota.
  • the photos that are enlarged and labeled with R are sowings from5 the Rhizosphere, which is nothing more than the soil attached to the root of the plant; but it does not contemplate the root, only the soil that surrounds it.
  • the Rhizosphere which is nothing more than the soil attached to the root of the plant; but it does not contemplate the root, only the soil that surrounds it.

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Abstract

Método de crecimiento y aislamiento de bacterias ácido lácticas (BALs) en muestras complejas, que comprende cuatro etapas: a) Fermentación; b) Inoculación de un medio agar MRS suplementado con Carbonato de Calcio (CaCO3) y ácido sórbico, con una alícuota obtenida en a); c) Cultivar las placas inoculadas de la etapa b) en condiciones de microaerofilia; y d) Selección de colonias mediante inspección visual, y siembra por agotamiento en agar MRS bajo condiciones de microaerofilia.

Description

MÉTODO DE AISLAMIENTO DE BACTERIAS ÁCIDO LÁCTICAS (BALS) A PARTIR DE MUESTRAS COMPLEJAS.
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención pertenece al campo de la Microbiología, Biotecnología y Alimentos. La 5 presente invención está referida a método microbiológico que permite el crecimiento, aislamiento e identificación de bacterias ácido lácticas (BALs) desde muestras en donde las BALs se encuentran en una baja concentración, en donde dicho método comprende las siguientes etapas: (1) Fermentación, (2) Siembra en agar MRS, (3) Incubación en atmósfera microaerofílica, y (4) Selección de colonias y siembra por agotamiento. 0 ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Las bacterias ácido lácticas (LABs) son un amplio y heterogéneo grupo de bacterias Gram- positivas, que se caracteriza por su metabolismo fermentativo estricto, siendo el ácido láctico el principal producto secundario durante la fermentación de azúcares. Este grupo bacteriano es de gran importancia para la industria biotecnológica ya que forman parte de cultivos 5 iniciadores y son parte de probióticos, ampliamente utilizados en la industria de alimentos. Este particular grupo de bacterias comprende más de una docena de diferentes géneros, siendo alguno de los más conocidos el género Lactococcus y Lactobacillus, ya que han sido utilizados como componentes de diferentes productos de la industria alimenticia. Debido a la importancia y versatilidad de este grupo bacteriano, es que el número de BALs que se aíslan0 desde diferentes ambientes sigue aumentando, y se siguen desarrollando medios de cultivo especiales para el aislamiento de dichas bacterias desde diferentes tipos de muestras.
El estado del arte previo enseña que se han desarrollado diferentes medios de cultivos para el crecimiento de este grupo bacteriano. El medio de cultivo estándar para el aislamiento de LAB es el medio MRS (Schillinger y Holzapfel. 2003. Culture media for lactic acid bacteria. 5 Handbook of Culture Media for Food Microbiology, J.E.L. Corry et al. (Eds.), páginas 127-140). Sin embargo, se ha demostrado que este tipo de bacterias crecen bien en este medio de cultivo cuando provienen de muestras en donde las BALs están presentes en una gran cantidad en relación a otros organismos contaminantes, pero no se han obtenido buenos rendimientos cuando este grupo bacteriano está presente en bajas concentraciones en0 muestras complejas.
Existen algunos esfuerzos que se han hecho para mejorar la formulación del medio de cultivo MRS y se han optimizado las condiciones de crecimiento de las muestras con el objetivo de optimizar los rendimientos de obtención de LAB. Sin embargo, existe una necesidad no satisfecha en la técnica en cuanto a obtener un método robusto para aislar BALs desde muestras en donde estas bacterias estén en una baja concentración.
5 Específicamente en relación con el aislamiento de bacterias desde diferentes muestras, se han descrito en documentos de patentes y publicaciones científicas variaciones de las condiciones de crecimiento utilizando medios MRS (JP2019122296A; CN109337838A; KR20180072225A y US2017360052A1 ; Ruiz Rodríguez., et al. 2019. Diversity and Functional Properties of LacticAcid Bacteria Isolated From Wild Fruits and Flowers Present in Northern0 Argentina; Saguibo., et al. 2019. Identification and characterization of lactic acid bacteria isolated from some medicinal and/or edible Philippine plants).
JP2019122296A describe un método para aislar bacterias ácido lácticas desde la raíz de una planta denominada kudzu ( Pueraria Montana var. lobata) y también se divulgan métodos para la producción de yogurt utilizando dichas bacterias ácido lácticas como cultivos iniciadores. El 5 método descrito incluye una etapa de enriquecimiento utilizando un medio de cultivo para Bacterias Ácido Lácticas, sin embargo solo se hace referencia a que este medio de cultivo es estándar y no se divulgan sus componentes. Las muestras son crecidas en el medio de cultivo que contiene cicloheximida y luego se crecen entre 25°C y 37°C por entre 24 y 48 horas. Luego, el cultivo enriquecido es plaqueado en una placa de agar BCP 0 CN109337838A divulga un método que describe una preparación de productos acuáticos y métodos de preparación de los mismos. El método de preparación se refiere a una fermentación a partir de una muestra de agua obtenida desde un medio de cultivo en donde viven animales acuáticos. El medio de cultivo utilizado fue MRS (Peptona 1 %; extracto de carne 0,5%, extracto de levadura 0,4%, glucosa 2%, Tween 800,1 %, fosfato dipotásico 0,2%,5 acetato de sodio 0,5%, citrato triamonio 0,2%, sulfato de magnesio 0,02%, sulfato de manganeso 0,005%, pH 6,2. Las muestras fueron incubadas en dicho medio de cultivo a 37°C por entre 24 y 48h.
KR20180072225A divulga un método de aislamiento de Bacterias Ácido Lácticas desde kéfir, el cual comprende inocular las muestras de este alimento en medio de cultivo MRS y0 posteriormente crecer dichos cultivos bajo condiciones de anaerobiosis estricta a 37°C por 48 horas. Tras el crecimiento se seleccionan las Bacterias Ácido Lácticas en una primera aproximación por su forma de colonia y luego se seleccionan por el test de gram y test de la catalasa. Se indica que las colonias seleccionadas fueron pasadas por diferentes pasajes en placas selectivas hasta obtener cultivos puros.
US2017360052A1 describe un protocolo de aislamiento de bacterias ácidos lácticas desde un alimento llamado Nuruk y muestras relacionadas. El protocolo incluye una primera ruptura de la muestra para después crecerlas en medio MRS suplementado con cicloheximida 0,01 % y 5 SBD (maltosa 2%, extracto de levadura 0,3%, extracto de levadura fresco 1 ,5%, Tween 80 0,03%, peptona de caseína 0,6%, pH 5,6. Las condiciones de crecimiento son 37°C por 48 horas.
Ruiz Rodríguez., et al., describe un protocolo de aislamiento de Bacterias Ácido Lácticas desde frutas salvajes y desde flores. El protocolo de aislamiento y selección de este tipo de 0 bacterias incluye: (1) Suspensión de las muestras en agua peptonada 0,1%, (2) Diluciones seriadas y crecimiento en agar MRS suplementado con fructosa 2% o glucosa 2%, (3) Incubación a 37°C por entre 24 y 72 horas en condiciones anaeróbicas, (4) Detección de bacterias ácido lácticas usando carbonato de calcio, y (5) Selección de LAB por características morfológicas y actividad catalasa. 5 Saguibo., et al, describe un protocolo de aislamiento de bacterias ácido lácticas desde plantas medicinales y comestibles de Filipinas. El protocolo de aislamiento y selección de este tipo de bacterias incluye: (1) Suspensión de las muestras en agua peptonada 0,1%, (2) Diluciones seriadas y crecimiento en agar MRS suplementado con fructosa 2% o glucosa 2%, (3) Incubación a 30°C por entre 24 y 72 horas en condiciones anaeróbicas, (4) Detección de0 bacterias ácido lácticas usando Carbonato de calcio, y (5) Selección de LAB por características morfológicas y actividad catalasa.
Si bien algunos de los documentos del estado de la técnica describen por separado algunos de las etapas y condiciones del método desarrollados por los inventores, no se enseña ningún método que comprenda cada una de las etapas y elementos técnicos descritos en el presente5 documento.
Específicamente, ningún documento descrito en el estado del arte describe un método que permita obtener aislados de BALs, cuando estos se encuentren en una concentración inferior al 4% de microorganismos en una muestra determinado, ni tampoco ninguno de dichos documentos enseña que la microaerófilia y la utilización del ácido sórbico, son condiciones0 críticas para poder aislar exitosamente este tipo de bacterias en muestras complejas.
Se mantiene entonces como problema de la técnica, la inexistencia de métodos eficientes para el aislamiento de BALs desde muestras complejas, siendo estas definidas como aquellas muestras en las cuales las bacterias ácido lácticas están en una concentración inferior al 4% en relación al total.
RESUMEN DE LA INVENCIÓN
5 La presente invención corresponde a un método microbiológico que permite el crecimiento, aislamiento e identificación de bacterias ácido lácticas desde muestras en donde las BALs se encuentran en una baja concentración, en donde dicho método comprende las siguientes etapas: (1) Fermentación, (2) Siembra en agar MRS, (3) Incubación en atmósfera microaerofílica, y (4) Selección de colonias y siembra por agotamiento. 0 BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1. Evaluación de las condiciones, Fermentación previa y Presencia de Ácido Sórbico en el medio de cultivo, sobre el crecimiento y aislamiento de Bacterias Ácido Lácticas.
Se visualizan cuatro grupos de cultivos en placas de Petri con agar MRS extendido 5 provenientes de muestras complejas. Aquí se combinan dos variables, Fermentación previa y Presencia de Ácido Sórbico en el medio, que generaron cuatro condiciones diferentes (1- No Fermentación + Ácido Sórbico; 2- No Fermentación + No Ácido Sórbico; 3- Fermentación + Ácido Sórbico, 4- Fermentación + No Ácido Sórbico), siendo la mejoría 3, Fermentación previa + Ácido Sórbico. Esta última combinación exhibió más crecimiento de colonias de putativas0 BALs que las otras y al mismo tiempo mostró mucho menos crecimiento de microorganismos indeseables u oportunistas. La imagen central exhibe las cuatro condiciones diferentes: 1- cuadrante izquierdo superior, siembras a partir de muestra no fermentada en medio enriquecido con ácido sórbico; 2- cuadrante derecho superior, cultivos provenientes de muestra no fermentada y medio no enriquecido con ácido sórbico; 3- cuadrante izquierdo5 inferior, placas sembradas a partir de muestras fermentadas y medio enriquecido con ácido sórbico; 4- cuadrante derecho inferior, cultivos sembrados desde muestra fermentada, en medio no enriquecido con ácido sórbico. Cuadro izquierdo superior con borde amarillo: ampliación de una placa de la condición 3, donde se visualizan innumerables colonias de pequeño diámetro y manchas oscuras en el agar, producto de la disolución del CaCC>3 del0 medio, indicando la presencia de BALs. Cuadro izquierdo inferior con borde rojo: ampliación de placa de la condición 3 donde se visualizan alrededor de una decena de colonias redondas, pequeñas, con halo de dilución alrededor, revelando presencia de BALs. Cuadro derecho con borde naranja: ampliación de una placa totalmente cubierta por colonias grandes, irregulares y de aspecto globuloso, no es posible visualizar presencia de BALs.
Figura 2. Resumen de protocolo desarrollado en la presente invención para el 5 aislamiento de BALs desde muestras complejas.
Se muestra un cronograma de etapas del Protocolo de Aislamiento de Bacterias Ácido Lácticas a partir de muestras complejas.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
En un primer aspecto, la presente invención corresponde a un nuevo método que permite el 0 aislamiento de BALs desde muestra complejas, el cual comprende las siguientes etapas:
1 . Fermentación: Se incuba la muestra en una solución de peptona estéril al 0,1 %, a 25- 37°C por 24-48 horas máximo.
2. Siembra en agar MRS: Se realizan diluciones seriadas desde el paso 1 , y estas se 5 siembran en un agar MRS enriquecido con ácido sórbico al 0,2% y CaC03 al 1 %, y el medio se ajusta a pH 5,8.
3. Incubación en atmósfera microaerofílica: Se incuban las placas en una atmósfera con una concentración de 02 inferior al 15%, a 37°C por 48 horas. 0
4. Selección de colonias y siembra por agotamiento: Se seleccionan las colonias redondeadas, convexas y que presente un halo de dilución a su alrededor, y se realiza siembra por agotamiento hasta obtener cultivos puros.
En una realización preferida, el primer paso del método corresponde a la inoculación de la 5 muestra desde la cual se van a aislar las BALs en una solución de peptona estéril al 0,1 % p/v.
En una realización preferida más específica la muestra es seleccionada del grupo que consiste en: muestra de suelo, muestra de sedimentos de ríos, muestra de sedimento marino, muestra de agua dulce, muestra de agua salada y muestra vegetal.
En una realización aún más específica la muestra vegetal puede corresponderá partes de las0 plantas tales como: tallo, hojas y flores.
En otra realización preferida si la muestra vegetal es de la endosfera (parte interna de la planta), la parte exterior de la muestra a inocular se debe desinfectar (preferiblemente con etanol), luego la muestra se debe cortar en condiciones de esterilidad y finalmente la muestra se inocula en la solución de peptona estéril.
En una realización preferida, las muestras de la etapa de fermentación son crecidas por un 5 período de tiempo entre 24 horas y un máximo de 48 horas.
En una realización preferida aún más específica, la muestras en la etapa de fermentación son crecidas por entre 30 y alrededor de 48 horas.
En otra realización específica, las muestras en la etapa de fermentación son crecidas a una temperatura entre 25°C y 40°C. 0 En una realización aún más específica, las muestras en la etapa de fermentación son crecidas a 37°C.
En una segunda modalidad, un alícuota desde la etapa de fermentación es sembrada en el agar MRS.
En otra realización preferida, el medio de cultivo MRS tiene la siguiente composición: Peptona 5 1%; extracto de carne 0,5%, extracto de levadura 0,4%, glucosa 2%, Tween 80 0,1 %, fosfato dipotásico 0,2%, acetato de sodio 0,5%, citrato triamonio 0,2%, sulfato de magnesio 0,02%, sulfato de manganeso 0,005%.
En una realización preferida más específica el medio MRS está suplementado con ácido sórbico en una concentración de entre el 0,1 % al 0,5%. 0 En una realización más específica la concentración de ácido sórbico es 0,2%.
En una realización adicional el medio MRS es suplementado con una concentración de carbonato de calcio (CaC03) de entre el 0,1 % al 2%.
En otra realización más específica la concentración de CaC03 es de alrededor del 1%.
En otra realización el medio MRS es suplementado con ácido sórbico al 0,2%, y con CaC035 al 1 %.
En una tercera realización adicional el agar MRS inoculado con la muestra fermentada (derivada de los pasos 1 y 2) es crecida en una atmósfera microaerofílica. En una realización más específica la concentración de 02 dentro de la atmosfera microaerofílica es de entre 0,2% a 20,9%.
En una realización preferida más específica la concentración de oxígeno dentro de la atmósfera microaerofílica es de entre un 8% a un 20%.
5 En una realización preferida aún más específica la concentración de oxígenos es de alrededor de un 15%, preferiblemente un 15%.
En una realización preferida, la incubación en microaerófilia es por un período de tiempo entre 48 horas y 72 horas.
En una realización preferida aún más específica, la incubación en microaerófilia es por período 0 entre alrededor de 48 y alrededor de 72 horas.
En otra realización específica, la incubación en microaerófilia es a una temperatura entre 25°C y 40°C.
En una realización aún más específica, la incubación en microaerófilia son crecidas a 37°C.
En una cuarta realización, tras el período de incubación en microaerófilia las colonias son 5 observadas macromorfológicamente y se seleccionan para caracterizaciones posteriores aquellas que presente un halo de dilución a su alrededor, y que su colonia sea redondeada, convexa. Las colonias seleccionadas se siembran por agotamiento, sembrando dichas colonias en agar MRS y luego dichas placas inoculadas se crecen en condiciones microaerofílicas como se mencionó anteriormente. 0 En un último paso adicional, las colonias puras de BALs obtenidas son crecidas en medio de cultivo MRS líquido, y luego son almacenadas en una solución de glicerol 25% a bajas temperaturas (preferiblemente -20 y/o -80).
En una realización preferida adicional se utiliza un medio crio preservante para el almacenamiento de las bacterias ácido lácticas aisladas, el cual puede comprender glicerol o5 sacarosa.
En una realización preferida adicional el glicerol o sacarosa pueden estar en una concentración de entre un 10% y un 50%, preferiblemente un 30%.
En el contexto de la presente invención se entiende como parte del conocimiento de un experto los métodos microbiológicos estándar y de manejo de microorganismos, para poder reproducir la invención. En los Ejemplos que se acompañan posteriormente en este documento, se muestran métodos representativos que buscan ilustrar la presente invención, pero no limitar su alcance.
5 EJEMPLOS DE APLICACIÓN
Ejemplo 1 : Evaluación de ácido sórbico para el crecimiento y aislamiento de bacterias ácido lácticas desde muestras complejas
Como primera aproximación para desarrollar un método robusto para el aislamiento de bacterias ácido lácticas desde muestras con una baja concentración de BALs (inferior al 4%), 0 se evaluó la adición de ácido sórbico al agar MRS. El ácido sórbico se emplea como inhibidor de la microbiota competidora de las BALs, impidiendo su proliferación (Reuter et al., 1985). De esta manera las bacterias oportunistas que están en mayor número y tienen una tasa de crecimiento más acelerada, no agotan los nutrientes del medio, ni el espacio en la placa; quedando estos nutrientes disponibles para las BALs. Las condiciones evaluadas se muestran5 en la siguiente tabla:
Tabla 1. Condiciones resultantes de la evaluación de la fermentación y la adición de ácido sórbico sobre el crecimiento de BALs.
Figure imgf000009_0001
Cuando el medio de cultivo es enriquecido con ácido sórbico, se manifiestan diferencias0 importantes del crecimiento microbiano en las placas cultivadas para obtener BALs. Esto es debido a que este compuesto impide la proliferación de microorganismos indeseados. Lo cual se puede apreciar en la Figura 1 , donde se visualizan un conjunto de placas con MRS enriquecido o no, con ácido sórbico y donde algunas de estas fueron sembradas a partir de muestras fermentadas previamente, dando lugar a 4 condiciones diferentes.
5 En los cuadrantes que reflejan las condiciones 1 y 2 se observan crecimientos microbianos provenientes de muestras frescas. En ambos casos se observan escasas colonias, sin embargo, para la condición 2 donde el medio no fue enriquecido con ácido sórbico, se puede apreciar la presencia de microorganismos oportunistas. Similar a esto tenemos las condiciones 3 y 4, donde la diferencia con respecto a las condiciones anteriores radica en que 0 las muestras antes de sembrarlas fueron fermentadas. Entonces tenemos un resultado muy parecido; pero incrementado producto de la fermentación previa que sufrieron las muestras. En el cuadrante 4, se visualizan placas totalmente cubiertas por bacterias oportunistas, en su contraste el cuadrante 3 que fue enriquecido con ácido sórbico, exhibe placas con muchas colonias con morfología de putativas BALs y muy poco o nulo crecimiento de microorganismos 5 oportunistas (casi nulo).
Las BALs son de lento crecimiento y elevados requerimientos nutricionales, por tanto, si se requiere aislarlas desde muestras complejas donde abundan microorganismos con una tasa de crecimiento mayor, es preciso agregar un antimicrobiano que limite el crecimiento de estos. De esta manera no agotan los nutrientes y el espacio del medio, antes de que las BALs0 puedan prosperar. Por otra parte, la fermentación previa contribuye a las probabilidades de éxito del aislamiento de las BALs, pues aumenta el número de microorganismos con respecto a la muestra fresca. Hay que tener en cuenta que en muestras complejas estas se encuentran en una muy baja proporción con respecto a la microbiota general.
En la figura 1 las fotos que están ampliadas y rotuladas con R, son siembras provenientes de5 la Rizosfera, que no es más que el suelo adherido a la raíz de la planta; pero no contempla la raíz, solo el suelo que la rodea. Entonces como ejemplo, para dos placas sembradas con exactamente las mismas condiciones, provenientes de Rizosfera, a una dilución 104, con la única diferencia que una tenía el medio enriquecido con ácido sórbico y otra no, fueron observadas 10 UFC de putativas BALs para el primer caso, sin embargo, para el cultivo en0 que no se adicionó el ácido sórbico fue observada la placa totalmente cubierta (Incontables UFC) de bacterias competidoras. Por otra parte, la placa sembrada proveniente de una alícuota de 50 pL de la dilución de 10 2 en medio con ácido Sórbico fueron contadas aproximadamente 288 UFC, putativas BALs (Figura 1). Para visualizar aún mejor el efecto técnico superior de las condiciones especificas utilizadas en el protocolo actual, a continuación se muestra una tabla resumen (Tabla 2) donde se evidencian los resultados negativos de los protocolos que se utilizaron de manera anterior (P1-P4) al protocolo utilizado con éxito en la presente metodología (P6). Estos protocolos se 5 generaron a partir de diferentes modificaciones que iniciaron en el protocolo Tradicional y finalmente dieron lugar al protocolo exitoso (P6). Las identificaciones se realizaron por comparación de secuencias del gen 16S rRNA con las secuencias de Genbank por BLASTN y también por análisis proteómico realizado mediante MALDI-Toff.
Sumado a lo anterior, en la siguiente Tabla 3, se muestra un resumen de cada una de las 0 condiciones ensayadas para cada uno de dichos protocolos (P1-P6).
Tabla 2. Identificaciones de aislados resultantes de diferentes protocolos modificados para el aislamiento de bacterias de ácido láctico, basadas en la secuenciación parcial del gen 16S rRNA y la comparación con las secuencias de Genbank por BLASTN y análisis proteómico mediante MALDI-Toff.
Figure imgf000011_0001
Figure imgf000012_0001
Figure imgf000013_0001
Tabla 3. Listado de protocolos modificados realizados durante el estudio con descripción de sus respectivas condiciones y la referencia principal que sirvió de base para ajustar uno o más de ellos.
Figure imgf000013_0002
Figure imgf000014_0001

Claims

REIVINDICACIONES
1 . Método de crecimiento y aislamiento de bacterias ácido lácticas (BALs) en muestras complejas, CARACTERIZADO porque comprende cuatro etapas: a) Fermentación;
5 b) Inoculación de un medio agar MRS suplementado con Carbonato de Calcio
(CaC03) y ácido sórbico, con una alícuota obtenida en a); c) Cultivar las placas inoculadas de la etapa b) en condiciones de microaerofilia; y d) Selección de colonias mediante inspección visual, y siembra por agotamiento en agar MRS bajo condiciones de microaerofilia. 0
2. El método de producción de acuerdo a la reivindicación 1 , CARACTERIZADO porque la etapa de fermentación consiste en inocular una muestra en una solución de peptona estéril al 0,1%, a una temperatura de entre 25°C-37°C por entre 24 y 48 horas. 5
3. El método de producción de las reivindicaciones 1 o 2, CARACTERIZADO porque la cepa en la etapa de fermentación la temperatura es de 37°C y el tiempo de incubación es 48 horas.
4. El método de producción de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3,0 CARACTERIZADO porque en la etapa b) se realizan diluciones seriadas utilizando las muestras obtenidas desde el paso a), y estas se siembran en un agar MRS enriquecido con ácido sórbico y CaC03, y el medio se ajusta a pH 5,8.
5. El método de producción de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4,5 CARACTERIZADO porque la concentración de ácido sórbico es 0,2% y la concentración de CaC03 es 1%.
6. El método de producción de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, CARACTERIZADO porque en la etapa c) las placas son incubadas en una atmósfera0 con una concentración de 02 inferior al 15%, a 37°C por 48 horas.
7. El método de producción de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, CARACTERIZADO porque en la etapa d) las colonias de bacterias ácidos lácticas son seleccionadas de acuerdo a sus características macromorfológicas. 5
8. Método de producción de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, CARACTERIZADO porque en la etapa d) las características analizadas de las colonias son la forma redondeada y convexa de la colonia, y que también presenten un halo de dilución a su alrededor.
9. Método de producción de acuerdo con la reivindicación 8, CARACTERIZADO porque una vez que son seleccionadas las colonias en la etapa d) estas son purificadas mediante siembra por agotamiento en agar MRS con las mismas características usadas anteriormente.
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