CN115369056B

CN115369056B - 一种分离乳酸菌的选择培养基及其在肠道乳酸菌分离中的应用

Info

Publication number: CN115369056B
Application number: CN202210746990.8A
Authority: CN
Inventors: 霍乃蕊; 杨茹洁; 陈丽琴; 张鑫鑫; 裴雯悦; 李宏全; 张婷; 李涌; 刘永强
Original assignee: Shanxi Agricultural University
Current assignee: Shanxi Agricultural University
Priority date: 2022-06-29
Filing date: 2022-06-29
Publication date: 2023-10-20
Anticipated expiration: 2042-06-29
Also published as: CN115369056A; ZA202208838B

Abstract

本发明属微生物技术领域，为解决乳酸菌选择性培养基研究少，缺乏针对分离基质中的微生物多样性不复杂等问题，提供一种分离乳酸菌的选择培养基及其在肠道乳酸菌分离中的应用。由基础MRS培养基中加入羊骨胶原短肽、抗生素与食品防腐剂；其中：羊骨胶原短肽的添加量为20 mg/L，所述抗生素为多粘菌素E硫酸盐，添加量为47 mg/L；所述食品防腐剂为山梨酸，添加量为1000 mg/L。菌落计数和鉴定结果与粪便微生物高通量测序结果一致。高通量测序结果中优势乳酸菌罗伊氏乳杆菌和格氏乳杆菌的相对丰度分别为0.226833%和0.0538%，二者之比为4.6，可从微生态区系复杂的基质中准确高效地分离乳酸菌。

Description

一种分离乳酸菌的选择培养基及其在肠道乳酸菌分离中的应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种分离乳酸菌的选择培养基及其在肠道乳酸菌分离中的应用。

背景技术

抗生素滥用会引发二重感染、耐药菌株及药物残留等一系列问题，给动物和人类健康以及环境造成严重威胁。我国已经禁止在饲料中添加抗生素，对养殖业提出了新的挑战，因而安全、有效、无副作用的抗生素替代品成为必然选择。

乳酸菌是可用于饲料添加的微生物，可抑制肠道病原菌的生长，维持肠道微生态平衡，增强动物的免疫力，提高生产性能，提高饲料转化率等，并且安全无污染、对动物和人体无毒副作用，因而成为抗生素替代的首要选择。

乳酸菌广泛存在于人和动物肠道、植物和果蔬表面、发酵食品（泡菜、酸菜）、大曲、酒醅和醋醅等发酵基质中。

肠道内乳酸菌可维持肠道微生态平衡，抑制病原菌定植，合成和分泌维生素B12，增强机体免疫功能。肠道定植是乳酸菌发挥益生作用的前提。在生产实践中，乳酸菌的益生效果差异很大，菌株定植的宿主特异性被认为是主要原因之一。由于寄主和肠道菌之间存在着特异性相互选择关系，理想的益生菌最好来自同源动物的肠道，所以不同养殖动物肠道乳酸菌的分离和改良育种显得非常重要。同样，在发酵工业中，外源乳酸菌尽管性能优良，但难以适应新的发酵基质和发酵环境，所以发酵环境中土著乳酸菌的分离和育种也十分必要。

然而，乳酸菌所处的肠道、自然发酵食品、大曲、酒醅、醋醅等发酵菌剂和发酵基质中的微生物类型很多，数量庞大，给乳酸菌分离工作带来严重挑战，因此需要设计一种乳酸菌专用选择培养基，在这种培养基上，酵母菌、霉菌等真菌不生长，革兰氏阴性菌不生长、非目标菌之外的革兰氏阳性菌也不生长，只有目标菌乳酸菌可以生长繁殖，形成菌落。

目前关于乳酸菌培养基的研究多集中于富集培养基和计数培养基，前者主要用于某一特定纯种乳酸菌的扩大培养，如保加利亚乳杆菌；嗜热链球菌；后者主要用于活性乳酸菌制品中的乳酸菌数量的真实计数。

选择性培养基主要是通过抑制或杀灭杂菌来分离目标菌，有关乳酸菌选择性培养基设计研究较少。现有研究针对的非目标微生物比较单一或者十分明确，分离基质中的微生物多样性不是很复杂；常用的抑制剂为抗生素，通过单用或复配来实现。

发明内容

本发明为了解决目前乳酸菌选择性培养基研究少，缺乏针对分离基质中的微生物多样性不复杂等问题，提供了一种分离乳酸菌的选择培养基及其在肠道乳酸菌分离中的应用。

本发明由如下技术方案实现的：一种分离乳酸菌的选择培养基，由基础MRS培养基中加入羊骨胶原短肽、抗生素与食品防腐剂；其中：羊骨胶原短肽的添加量为20 mg/L，所述抗生素为多粘菌素E硫酸盐，添加量为47 mg/L；所述食品防腐剂为山梨酸，添加量为1000mg/L。

所述的分离乳酸菌的选择培养基在肠道乳酸菌分离中的应用。

前期研究结果表明，羊骨胶原短肽可促进乳酸菌的生长繁殖，并且对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌等致病菌表现出一定的抑菌效果。为了减少抗生素对乳酸菌形成耐药性胁迫，进一步提高乳酸菌形成率，将抗生素剂量降低到适当水平，在MRS培养基中补充羊骨胶原短肽。

本发明所提供的培养基可用于微生物区系复杂基质中乳酸菌的分离，羊骨胶原短肽-抗生素-食品防腐剂联用，对MRS培养基进行改良。羊骨胶原短肽的添加量为2%（20 mg/L)，其作用为促进乳酸菌生长，抑制杂菌，降低抗生素添加量，减少抗生素对微生物造成的选择压力；所用抗生素为多粘菌素E硫酸盐，添加量为47 mg/L，其作用为抑制大肠杆菌和沙门氏菌等革兰氏阴性菌。防腐剂为山梨酸，添加量为1000 mg/L，其作用为抑制芽孢杆菌、酵母菌和金黄色葡萄球菌等革兰氏阳性菌。

当用此培养基分离猪粪便中的乳酸菌时，菌落计数和鉴定结果与粪便微生物高通量测序结果一致。在种水平，不仅分离到优势乳酸菌罗伊氏乳杆菌（61株）和格氏乳杆菌（14株），二者之比为4.36，还分离到丰度极低在高通量测序结果中没有显示的淀粉乳杆菌（6株）和乳酸肠球菌（1株）。高通量测序结果中优势乳酸菌罗伊氏乳杆菌和格氏乳杆菌的相对丰度分别为0.226833%和0.0538%，二者之比为4.6，可见该选择性培养基可从微生态区系复杂的基质中准确高效地分离乳酸菌。

附图说明

图1为各受试菌在MRS培养基中的生长情况；图中：Bacillus licheniformis为地衣芽孢杆菌；Bacillus natto为纳豆芽孢杆菌；S.aureus为金黄色葡萄球菌；Lactobacillus acidophilus为嗜酸乳杆菌；Lactobacillus reuteri为罗伊氏乳杆菌；Saccharomyces cerevisiae为酿酒酵母；E. coli为大肠杆菌；Salmonella为沙门氏菌；beer yeast为啤酒酵母；

图2为各受试微生物在10^-5稀释度时在MRS琼脂平板上的菌落形成情况；图中：A 乳酸菌混菌液； B 酵母菌混菌液；C 芽孢杆菌混菌液；D 革兰氏阴性菌混菌液；E 金黄色葡萄球菌；

图3为各种杂菌和乳酸菌在山梨酸MRS平板上的菌落形成情况；图中：A为山梨酸0mg/L；B为山梨酸1000mg/L；C为山梨酸 2000 mg/L；1为乳酸菌混菌液；2为芽孢杆菌混菌液；3为金黄色葡萄球菌；4为酵母菌混菌液；

图4为受试革兰氏阴性菌在含多粘菌素E硫酸盐MRS平板上的生长情况；图中：A，B，C，D为多粘菌素E硫酸盐分别为0 mg/L、32 mg/L、64 mg/L和128 mg/L；1，2，3分别代表乳酸菌混菌液（罗伊氏乳杆菌和嗜酸乳杆菌）、大肠杆菌和沙门氏菌；

图5为各种杂菌和乳酸菌在复配选择性培养基上的菌落形成情况；图中：A为杂菌混菌液（改良MRS）；B为乳酸菌混菌液（普通）；C为所有受试菌株混菌液（改良MRS）；D为所有受试菌混菌液（普通MRS）；

图6为猪粪便样品中部分革兰氏阳性菌在乳酸菌选择平板上形成的菌落；

图7为部分革兰氏阳性菌菌体形态；图中：R30，R3，R10，R21，R23为罗伊氏乳杆菌；R11格氏乳杆菌；R55为乳酸肠球菌；R33为淀粉乳杆菌；

图8为分离的部分革兰氏阳性菌16s rDNA PCR产物电泳结果；图中1：DNA marker;2-23:依次为R3、R5、R10、R11、R21、R23、R33、R55等革兰氏阳性菌16srDNA的PCR产物；

图9为48株猪源性罗伊氏乳杆菌16S rDNA系统发育树；

图10为在界、门、纲、目、科、属水平上的猪肠道微生物物种分布堆叠图；图中：A1、A2和A3分别代表不同的猪只；乳酸菌的分类地位Domain(bacteria),Phylum(firmicutes),

Class(Bacilli),Order(Lactobacillales),Family(Lactobacillaceae),Genus(Lactobacillus)；

图11为在种水平物种丰度热图（左）和堆叠图（右）；

图12为在种水平的物种丰度总堆积图和相对丰度值。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例；基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

除非另有定义，所有在此使用的技术和科学术语，和本发明所属领域内的技术人员所通常理解的意思相同，在此公开引用及他们引用的材料都将以引用的方式被并入。

本领域技术人员意识到的通过常规实验就能了解到的描述的特定实施方案的等同技术，都将包含在本申请中。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的仪器设备，如无特殊说明，均为实验室常规仪器设备；下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为由常规生化试剂商店购买得到的。

一、材料

1、受试菌株：罗伊氏乳杆菌、嗜酸乳杆菌，纳豆芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、酿酒酵母、啤酒酵母、大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌，均为山西农业大学动物医学学院卫检实验室保藏菌株。

2、培养基：MRS肉汤培养基（MRS Broth），生产批号20201110，购自青岛海博生物技术有限公司，配方为：蛋白胨10g,牛肉膏10g, 酵母粉5g, K₂HPO₄2g, 柠檬酸二铵2g, 乙酸钠5g,葡萄糖20g,吐温80mL,MgSO₄·7H₂O 0.58g,MnSO₄4H₂O 0.25g,(琼脂15~20g),蒸馏水1000mL。NB营养肉汤培养基（Nurient Broth），生产批号814G031，购自北京索莱宝科技有限公司；麦芽汁营养肉汤培养基（Malt Extract Broth），生产批号1023N031，购自北京索莱宝科技有限公司。

3、试剂：山梨酸（AR级；99%，生产批号RH195498）和多粘菌素E硫酸盐（USP级；19000U/mg，生产批号E2013080）购自联硕生物有限公司。羊骨胶原短肽（含98.78%蛋白，90.78%分子量≤1000 Da的肽，6.89%羟脯氨酸，锡盟肽好，内蒙古）；细菌16S rDNA通用引物27F（5’AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG 3’）和1492R（5’TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACT T 3’）由上海生工合成。

二、方法

1、受试菌株稀释度确定：芽孢杆菌、大肠杆菌和沙门氏菌用NB营养肉汤培养基活化，酵母菌用麦芽汁肉汤培养基活化，在各自相应液体培养基中培养至对数生长期后，稀释制备10^-4、10^-5、10^-6菌悬液，各吸取100 μL涂布于MRS平板，每个稀释度3个重复，37℃培养48h，根据菌落形成情况选取合适的稀释浓度。

2、山梨酸添加剂量的确定：MRS培养基高压灭菌后，冷却至50℃左右，加入山梨酸，制备不同浓度的抑菌平板。将各受试菌株的对数培养期菌液稀释至10^-5（OD₆₅₀约为0.382-0.774），吸取等量的罗伊氏乳杆菌和嗜酸乳杆菌稀释液并混匀，即为乳酸菌混菌液；同法制备芽孢杆菌混菌液和酵母菌混菌液。将各混菌液及金黄色葡萄球菌稀释液分别涂布含不同浓度山梨酸（0 mg/L、1000 mg/L、2000 mg/L）的MRS平板，菌落计数，观察对各种杂菌的抑菌效果，计算乳酸菌的菌落形成率。计算公式如下：乳酸菌菌落形成率（%）=（选择平板上的菌落数/普通平板上的菌落数）×100%。

3、多粘菌素添加剂量的确定：方法同山梨酸添加剂量的确定，受试菌为革兰氏阴性菌大肠杆菌和沙门氏菌、多粘菌素E硫酸盐的添加浓度为32 mg/L、64 mg/L和128 mg/L。

4、选择性培养基的优化：设计3因素3水平正交试验，对MRS普通培养基中羊骨胶原短肽、山梨酸、硫酸多粘菌素E硫酸盐的添加量进行优化，各因素各水平剂量及试验设计详见表2。

5、乳酸菌选择性培养基效果检验：MRS肉汤培养基中添加2%羊骨胶原短肽和1.5%的琼脂粉，冷却至50℃左右，添加终浓度分别为1000 mg/L的山梨酸和47mg/L的硫酸多粘菌素，制备乳酸菌选择性平板备用。

配置乳酸菌混菌液，将其涂布于普通MRS平板；配置非目标菌（杂菌）混菌液并涂布选择性（改良MRS）平板，观察菌落生成情况；将乳酸菌混菌液与非目标菌（杂菌）混菌液再次混合，分别涂布于选择性平板和普通MRS平板，计数菌落，并计算乳酸菌菌落形成率。

6、猪粪便中乳酸菌的分离：取1g健康猪的粪便样品，用灭菌生理盐水制成10^-4、10^-5、10^-6稀释液，各取100μL涂布于选择平板，37℃培养24-48 h，同时，将粪便悬液涂在普通MRS平板上作对照。从菌落数为30-300的稀释度平板上挑取所有单菌落，接种于MRS肉汤过夜培养，反复纯化2-3次，获得菌落纯菌株，命名为R1，R2，R3，R4……，-20℃甘油保存。

7、乳酸菌鉴定：通过菌落形态和16s rDNA序列对分离菌株进行鉴定。收集菌体，提取基因组DNA，建立PCR反应体系并按程序进行扩增反应，PCR反应体系与反应条件如表1所示，产物用2%的琼脂糖凝胶电泳，UVP凝胶成像系统观察并送上海生物工程有限公司测序，利用Chromas Pro对序列进行拼接，拼接好的完整序列在NCBI进行Blast，并与GenBank基因库中已知细菌核酸序列进行同源性比较，鉴定种属并构建系统发育树。

表1 PCR扩增反应体系和反应条件

8、粪便样品16S rDNA高通量测序：每头猪取3份等质量新鲜粪便，混匀制备成粪便样品，将来自3头健康猪的3份粪便样品（各1g）干冰条件下送往广州基迪奥生物科技有限公司，提取粪便细菌总DNA，对16S rRNA基因 v3-v4 区进行扩增测序，将纯化后的扩增产物（即扩增子）连接测序接头，构建测序文库，Illumina上机测序^[65]。将各样本序列进行质量控制过滤后，获得操作分类单元（operational taxonomic units，OTU），基于OTU序列开展物种注释、物种组成分析。

三、结果

1、受试菌在MRS平板上的生长情况，图1为各受试菌在MRS培养基中的生长情况，由图1可知，所有受试菌株在MRS平板上均生长良好，说明MRS平板不仅适合乳酸菌生长，也适合酵母菌、革兰氏阴性菌、芽孢杆菌、其他革兰氏阳性菌如金黄色葡萄球菌的生长，因此需要对MRS培养基进行改良，使其能够抑制乳酸菌以外的杂菌生长。

2、各受试菌稀释度的确定：各受试微生物在10^-5稀释度时在MRS琼脂平板上的菌落形成情况如图2所示，当各菌液的稀释倍数为10^-5时，菌落多为彼此分离的单菌落，便于后续平板计数。

3、山梨酸添加剂量的筛选：各种杂菌和乳酸菌在山梨酸MRS平板上的菌落形成情况如图3所示，当山梨酸添加量为1000 mg/L时，对芽孢杆菌、酵母菌和金黄色葡萄球菌的抑菌率可达到100%，乳酸菌菌落平均数为122个，而在对照平板（不添加山梨酸）上的平均菌落数为151个，乳酸菌的菌落形成率为86.1%。当山梨酸的添加浓度为2000mg/L时，乳酸菌的菌落形成率仅为51.0%，所以本研究初步确定山梨酸的添加量为1000 mg/L。

4、多粘菌素E硫酸盐剂量的确定：受试革兰氏阴性菌在含多粘菌素E硫酸盐MRS平板上的生长情况如图4所示，结果显示：当硫酸多粘菌素的添加量为32 mg/L时，可完全抑制大肠杆菌的的生长，添加量为64 mg/L时完全抑制沙门氏菌的生长。64 mg/L的添加量对乳酸菌生长影响不大，菌落形成率为86.8%，因此确定多粘菌素E硫酸盐的添加量为64 mg/L。

5、乳酸菌选择性培养基的优化：羊骨胶原短肽可促进乳酸菌的生长繁殖，并且对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌等致病菌表现出一定的抑菌效果。为了减少抗生素对乳酸菌形成耐药性的胁迫，进一步提高乳酸菌形成率，将多粘菌素E硫酸盐的含量降低到适当水平，在MRS培养基中补充羊骨胶原短肽，开展正交试验，优化剂量。结果如如表2所示，可以看出，A₃B₃C₂是最优组合，即羊骨胶原短肽的添加量为20 mg/L,山梨酸添加量为1000 mg/L，多粘菌素E硫酸盐添加量为47 mg/L，选择性培养基上既无杂菌生长，并且乳酸菌菌落形成率最大（92.7%）。从极值（R_j）可以判断，羊骨胶原短肽添加量对乳酸菌形成率影响最大，且呈正相关趋势；其次为多粘菌素添加量，乳酸菌菌落形成率随着添加量的增加有下降趋势，山梨酸添加量影响最小。

表2 乳酸菌选择培养基抑制剂（mg/L）优化正交试验L₉(3³)设计及结果

+表示有杂菌生长，-表示无杂菌生长。

6、验证试验：将所有非目标受试菌（杂菌）等体积混合，涂布于含2%羊骨胶原短肽（20 mg/L）、1000 mg/L山梨酸和47 mg/L多粘菌素E硫酸盐的选择培养基上，结果如图5所示，平板上无菌落生成（A）。目标菌（乳酸菌）混菌液在普通MRS平板平板上的菌落平均数为154个（B）；非目标菌和目标菌的混菌液在选择性（改良MRS）平板上的平均菌落数为138个（C），而在普通MRS平板上多不可计数（D），乳酸菌的菌落形成率为89.6%。

7、猪粪便中乳酸菌的分离及形态特征：将10^-2稀释度的猪粪便悬液涂布于常规MRS平板，由图6中左上图可以看出，平板上菌体类型多样，且不可计数。粪样涂布于选择平板，共分离纯化到96株菌，通过革兰氏染色排除掉14株革兰氏阴性菌。观察82株G⁺菌的菌落形态和细胞形态，部分结果如图6所示，尽管R3、R10、R21和R23后来均被鉴定为罗伊氏乳杆菌，但它们的菌落大小、色泽、透明度、表面特征等存在明显差异。格氏乳杆菌（R11）3.0 mm左右，菌落偏大，乳白色，呈放射状，扁圆形，边缘整齐，表面粗糙。乳酸肠球菌（R55）菌落偏小，直径2.0 mm，乳白色，不透明，圆形隆起，边缘整齐，表面光滑。淀粉乳杆菌（R33）直径3.0 mm左右，菌落中等大小，乳白色，近半透明，扁平形，边缘整齐，表面粗糙。

光学显微镜下，82株革兰氏阳性菌菌株均具有乳酸菌的典型特征，无芽孢，呈短杆状（R30）、长杆状（R3）、球状（R55），有的呈链状排列（R21，R3，R30），有的呈栅栏状排列（R11），部分结果如图7所示。

8、革兰氏阳性菌株的16S rDNA鉴定结果：部分革兰氏阳性菌株的l6S rDNA的PCR扩增结果如图8所示，将测序结果同已公布的16 SrDNA序列进行同源性比对，在82株革兰氏阳性菌株中，有61株与MN038048（Lactobacillus reuteriDSM 20016 ^T）的同源性大于97.5%，判定为罗伊氏乳杆菌。

对分离的61株罗伊氏乳杆菌的16S rDNA序列进一步分析，其中13株序列完全相同，因此被认定为同一菌株，与其他48株菌构建的系统发育树如图9所示，可知，48株罗伊氏乳杆菌分布于A、B、C、D四群和一个单独的菌株3-25，其中A群15株，B群10株，C群7株，D群15株。

在82株革兰氏阳性菌株，有14株菌株与KM056281（Lactobacillus gasseri DMBCT6 ¹）的同源性均大于97.5%，在系统发育树上与格氏乳杆菌在一条分支线上，判定为格氏乳杆菌。有6株与MT946905的同源性均大于97.5%，鉴定为淀粉乳杆菌。有1株菌株与MW721243的同源性均大于97.5%，判定为乳酸肠球菌。

9、猪粪便16S rDNA高通量测序结果：为了验证本研究设计的乳酸菌选择培养基对乳酸菌分离的有效性和准确性，对分离源（健康猪的粪便）中的乳酸菌进行高通量测序。通过测序质控筛选后，选择97%相似度的OTU，对样品进行物种组成分析。

由图10可知，猪肠道微生物群落中，乳酸菌所在的真细菌界（Bacteria）、厚壁菌门Firmicutes占优势，分别占微生物总量的99.42%（界）和56.79%（门）。乳酸菌所在的芽孢杆菌纲（Bacilli）占肠道菌群的10.78%，在丰度上，低于Clostridia和Bacteroidia；所在的乳杆菌目（Lactobacillales）占肠道菌群的13.72%，在丰度上，低于Clostridialles和Bacteroidales。乳酸菌是乳杆菌（Lactobacillaceae）科，乳杆菌属（Lactobacillus）的一类细菌，在高通量测序分析结果中，应该在other部分，可见其丰度很低，为非优势科属。

由图11可知，在高通量测序分析结果中，种水平上检测到了罗伊氏乳杆菌和格氏乳杆菌，且罗伊氏乳杆菌的含量远远高于格氏乳杆菌，二者是猪肠道优势乳酸菌。

由图12可知，猪粪便中高通量测序均检测到的罗伊氏乳杆菌和格氏乳杆菌的相对丰度分别为0.226833%和0.0538%，二者之比为4.6。选择培养基的分离结果为罗伊氏乳杆菌61株，格氏乳杆菌14株，比例为4.36，二者非常接近，可见本发明所设计的乳酸菌选择性培养基准确性高，并且还分离到了高通量测序结果中没有报告的淀粉乳杆菌和乳酸肠球菌。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims

1.一种分离乳酸菌的选择培养基，其特征在于：由基础MRS培养基中加入羊骨胶原短肽、抗生素与食品防腐剂；其中：羊骨胶原短肽的添加量为20mg/L，所述抗生素为多粘菌素E硫酸盐，添加量为47mg/L；所述食品防腐剂为山梨酸，添加量为1000mg/L，所述羊骨胶原短肽为锡盟肽好的羊骨胶原短肽，所述羊骨胶原短肽含98.78%蛋白，90.78%分子量≤1000Da的肽，6.89%羟脯氨酸。

2.权利要求1所述的分离乳酸菌的选择培养基在肠道乳酸菌分离中的应用。