WO2021225011A1 - 生理活性物質が均一に分散されたマイクロスフェアー及びそれを含有する徐放性製剤 - Google Patents

生理活性物質が均一に分散されたマイクロスフェアー及びそれを含有する徐放性製剤 Download PDF

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眞一 榎村
加永子 荒木
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Definitions

  • the present invention relates to a microsphere in which a physiologically active substance is uniformly dispersed and a sustained release preparation containing the same.
  • the present invention particularly relates to a microsphere containing a lactic acid / glycolic acid copolymer (PLGA) or polylactic acid (PLA) in which a physiologically active substance is uniformly dispersed as a main component, and a sustained-release preparation containing the same.
  • PLGA lactic acid / glycolic acid copolymer
  • PLA polylactic acid
  • microspheres or nanospheres have been attracting attention as sustained release preparations such as pharmaceuticals containing physiologically active substances.
  • the microsphere usually refers to a preparation having a particle size of about 1 ⁇ m to 150 ⁇ m, and a smaller preparation having a particle size of less than 1 ⁇ m is called a nanosphere.
  • the bioactive substance can be encapsulated in a biodegradable synthetic polymer or a natural polymer to continuously release the bioactive substance locally, or the targeting of the bioactive substance to a tissue, etc. It can be performed.
  • a sustained release microsphere preparation that gradually releases a physiologically active substance at a constant rate
  • a preparation in which biodegradable polymers, physiologically active substances, additives, solvents, etc. are appropriately controlled is required. ..
  • the initial release amount of the physiologically active substance and the release rate during the subsequent release period should be appropriately controlled for physiology. It is necessary to continuously release the active substance in vivo for a certain period of time.
  • lactic acid-glycolic acid copolymer Polylactide-co-glycolic acid Acid, PLGA
  • PLA polylactic acid
  • the biodegradation rate differs depending on the proportion of glycolic acid, molecular weight, water affinity, etc., the desired release period can be adjusted by these (Patent Document 1).
  • the particle size of the microsphere and the physiological activity in the microsphere are to be controlled.
  • the state of dispersion of the substance is relevant.
  • the particle size of the microsphere has a problem of yield, it can be adjusted to the target particle size by an operation such as filtration.
  • the dispersed state of the physiologically active substances in the microspheres is only uniform and has not been confirmed.
  • PLGA or PLA microspheres can be produced by, for example, a submerged drying method, a spray drying method, a spray freeze drying method, a drying method using a supercritical fluid step, a double emulsification method, or the like.
  • the most common production method among these is that when the physiologically active substance is lipophilic, PLGA or PLA and the physiologically active substance are dissolved or dispersed in an organic solvent and mixed with an aqueous solution in which polyvinyl alcohol (PVA) is dissolved.
  • PVA polyvinyl alcohol
  • Patent Document 1 describes a method for producing a sustained-release microsphere containing a biodegradable polymer such as PLGA and a peptide drug by a spray drying method, a spray freeze drying method, or a drying method using a supercritical fluid step. It is disclosed. However, it is not described how much the particle size of the sustained release microspheres varies, whether the peptide drug is uniformly dispersed in the sustained release microspheres, or whether a uniform one can be obtained. ..
  • Patent Document 2 PLGA fine particles are dried by an in-liquid method using a mixed solvent consisting of a halide hydrocarbon and a non-miscible organic solvent having a drug solubility of 0.3% (W / V) or more.
  • the method of manufacture is disclosed. It is described that the particle size (median diameter) of the fine particles obtained in Production Examples 1 and 2 was 14 and 16 ⁇ m, but the dispersed state of the drug in the fine particles is not described.
  • Patent Document 3 discloses PLGA nanoparticles containing a drug. These nanoparticles are mainly for targeting to a specific tissue, and are nanoparticles having a size of several tens to several hundreds of nm that can pass through minute holes in capillaries. However, Patent Document 3 does not describe microspheres of 1 ⁇ m or larger, which are much larger than these nanoparticles. Further, even by using the technique of Patent Document 3, those skilled in the art could not produce microspheres having a particle size of 1 ⁇ m or more.
  • Patent Document 4 discloses a preparation that releases leuprorelin acetate, which is a luteinizing hormone-releasing hormone derivative, by subcutaneous injection over a period of about one to several months.
  • the formulation has a problem that the particle size distribution of the particle size is very wide, from 1 ⁇ m to 400 ⁇ m. Therefore, Patent Document 5 proposes a method for producing a microsphere in which a physiologically active substance is encapsulated in a polymer for a carrier by a double emulsification method as a method for solving this problem.
  • the leuprorain acetate-containing microspheres obtained in Examples 1 to 5 do not describe the dispersed state of the drug in the particles.
  • Patent Document 6 discloses a microsphere that reduces chronic pain for at least 28 days (672 hours).
  • the microsphere contains a biodegradable polymer and a local anesthetic (physiologically active substance), about 75% of the local anesthetic is released by about 72 hours, and about 80-90% of the local anesthetic is about 120. Released by the time. This suggests that the distribution of local anesthetics in the microspheres is not uniform but biased outwards in the microspheres. From the SEM (scanning electron microscope) image of the cross section of the microsphere shown in FIG. 2, the dispersed state of the local anesthetic cannot be confirmed.
  • Patent Document 7 discloses a microsphere having a core-shell structure in which the core contains aripiprazole in a solid state and a shell containing a biodegradable polymer covers the surface of the core.
  • the microspheres of Patent Document 7 are not those in which the physiologically active substance is uniformly dispersed in the microspheres. Further, in the electron micrograph of the cross section of the microsphere obtained in the example shown in FIG. 5, the dispersed state of aripiprazole cannot be confirmed in the shell.
  • Japanese Unexamined Patent Publication No. 2005-035994 Japanese Unexamined Patent Publication No. 2005-015476 Japanese Patent No. 4856752 Japanese Patent No. 2653255 Japanese Unexamined Patent Publication No. 2014-224114 Japanese Unexamined Patent Publication No. 2016-069378 Special Table 2010-531303
  • Biodegradable polymer microspheres having an average volume reference particle size of 1 ⁇ m or more and 150 ⁇ m or less have a release period unless the distribution of physiologically active substances (sometimes referred to as drugs) in the microspheres is controlled. Cannot be realized as designed. For example, if the bioactive substance is biased near the surface of the microsphere, a large amount of the bioactive substance is released from the microsphere in the early stage after administration, which causes a problem of initial burst. On the contrary, if the bioactive substance is biased toward the center of the microsphere, or if it is in a state like a core shell, it cannot be continuously released from the initial stage. Therefore, it is desirable that the fine particles of the physiologically active substance are uniformly dispersed. In a dispersed state in which large lumps of bioactive substances are scattered, it cannot be continuously released from the initial stage. Similarly, if vacancies are not controlled, similar problems will occur in the release of bioactive substances.
  • the release rate and release profile When actually investigating the pharmacokinetics using small animals such as rats, there may be many variations in the release rate and release profile, and it is often concluded that the cause is individual differences in rats and the like. However, if the dispersed state of the bioactive substance in the microsphere is uniform, most of the variation is further improved, the decomposition rate is controlled by the type and molecular weight of PLGA, and the release of the bioactive substance from the microsphere is also designed. It can be realized as it is.
  • FIG. 1 shows 1.88 mg (manufactured by Takeda Pharmaceutical Company Limited) for injection of a microcapsule type sustained release preparation Leuprin (registered trademark) corresponding to the long-term sustained release type microcapsules of the LH-RH derivative described in Patent Document 4. )
  • Leuprin registered trademark
  • This preparation contains various particles from large particles to small particles. A typical particle of about 6 ⁇ m is selected, and an SEM (scanning electron microscope) image of a cross section of the particle is shown in FIG. ..
  • the large dispersion indicated by the arrow in the figure is vacant, which can be seen by confirming the edge effect in the image and by SEM-EDS (Energy Dispersive X-ray Spectrometer).
  • SEM-EDS Electronic X-ray Spectrometer
  • the SEM cross-sectional image of FIG. 2 is divided into 6 parts (areas 1 to 6) on the image, and a pixel range is obtained using commercially available image processing analysis software iTEM (TEM camera control, image analysis software, manufactured by EMIS).
  • image processing analysis software iTEM TEM camera control, image analysis software, manufactured by EMIS.
  • the edge portion was emphasized to optimize the contrast.
  • binarization processing is performed, noise removal and low-contrast particle enhancement processing are performed in the image processing, and then the edge portion is emphasized after the averaging processing in the pixel range of 3 ⁇ 3 again. .. Based on FIG.
  • the subject of the present invention is that the initial release amount of the physiologically active substance and the release rate during the subsequent release period are appropriately controlled, and the physiologically active substance can be continuously released in the living body for a certain period of time. To provide fairs.
  • the present inventors have found that the coefficient of variation of the area ratio of the bioactive substance in the 6-divided region of the image of the microsphere observed with an electron microscope is 0.35 or less.
  • the bioactive substance is uniformly dispersed in the microsphere, there are no non-uniform pores, and the initial release amount of the physiologically active substance and the release rate during the subsequent release period are appropriately controlled.
  • the present invention has been completed by finding that a physiologically active substance can be continuously released in a living body for a certain period of time. That is, the present invention is as follows.
  • the first aspect of the present invention is a microsphere containing a lactic acid / glycolic acid copolymer (PLGA) or polylactic acid (PLA) in which a physiologically active substance is uniformly dispersed as a main component.
  • the average volume particle size of the microspheres is 1 ⁇ m to 150 ⁇ m or less.
  • a cross-sectional observation sample obtained by cutting the microsphere was prepared, the cross-section observation sample was observed with an electron microscope at a magnification at which the physiologically active substance in the microsphere could be confirmed, and the cross-sectional observation image of the electron microscope was divided into 6 parts.
  • the microsphere is characterized in that the coefficient of variation of the ratio calculated in the above is 0.35 or less.
  • the second aspect of the present invention is the microsphere according to [1], wherein the bioactive substance is a lipophilic bioactive substance.
  • the third aspect of the present invention is the microsphere according to [1] or [2], wherein the dispersed average volume reference particle size of the physiologically active substance is 5 nm to 500 nm.
  • the fourth aspect of the present invention is described in any one of [1] to [3], wherein the content of the physiologically active substance in the microsphere is 0.35 to 1.5% by mass.
  • Microsphere [5]
  • a fifth aspect of the present invention is a sustained release preparation containing the microspheres according to any one of [1] to [4].
  • the initial release amount of the physiologically active substance and the release rate during the subsequent release period are appropriately controlled, and the physiologically active substance can be continuously released in the living body for a certain period of time.
  • FIG. 6 is an SEM image of a cross section of a microsphere containing no physiologically active substance of Reference Example 1.
  • An example of a method for dividing a microsphere is shown.
  • (A) is divided into 6 parts on a concentric circle.
  • (B) is divided into 6 in the vertical direction.
  • (C) is divided into 6 parts in the circumferential direction.
  • 6 is an SEM image of a cross section of the microsphere of Example 1.
  • the cross-sectional image of FIG. 6-1 is divided into six, and the ratio (s / A) ⁇ of the region area (A) of each divided region and the total cross-sectional area (s) of the physiologically active substance contained in the region (s / A) ⁇ . It is an image that has been binarized in order to obtain 100 (%).
  • 6 is an SEM image of a cross section of the microsphere of Example 3. This is an image obtained by enlarging the cross-sectional image of FIG. 7-1 and performing binarization processing. 6 is an SEM image of a cross section of the microsphere of Example 4.
  • the cross-sectional image of FIG. 8-1 is divided into six, and the ratio (s / A) ⁇ of the region area (A) of each divided region and the total cross-sectional area (s) of the physiologically active substance contained in the region (s / A) ⁇ . It is an image that has been binarized in order to obtain 100 (%).
  • the cross-sectional image of Comparative Example 1 is divided into 6 parts, and the ratio (s / A) ⁇ 100 of the area area (A) of each divided area and the total cross-sectional area (s) of the physiologically active substance contained in the area. It is an image that has been binarized in order to obtain (%). It is an SEM image of the cross section of the microsphere of Comparative Example 2. 6 is an SEM image of a cross section of the microsphere of Comparative Example 3. It is an SEM image of the cross section of the microsphere of Comparative Example 4.
  • the microsphere of the present invention is a microsphere containing a lactic acid / glycolic acid copolymer (PLGA) or polylactic acid (PLA) in which a physiologically active substance is uniformly dispersed as a main component.
  • An average volume particle size of the sphere is 1 ⁇ m to 150 ⁇ m or less, a cross-sectional observation sample obtained by cutting the microsphere is prepared, and the cross-sectional observation sample is subjected to an electron microscope at a magnification equal to or higher than that at which a physiologically active substance in the microsphere can be confirmed.
  • the image observed and observed under the electron microscope is divided into 6 parts, and the ratio (s /) of the region area (A) of each divided region to the total cross-sectional area (s) of the physiologically active substance contained in the region.
  • A) ⁇ 100 (%) is calculated, and the coefficient of variation of the ratio calculated in the six regions is 0.35 or less, which is a microsphere.
  • the coefficient of variation of the above ratio becomes large.
  • the coefficient of variation of the above ratio is 0.35 or less, the dispersion of the physiologically active substance is uniform.
  • the coefficient of variation of the area ratio of the physiologically active substance to the area of each region in each region of the microsphere divided into six is 0.35 or less, preferably 0. It is 25 or less, more preferably 0.20 or less.
  • the initial release amount of the physiologically active substance and the release rate during the subsequent release period are appropriately controlled, and the physiologically active substance can be continuously released in the living body for a certain period of time.
  • the method for confirming the dispersed state of the physiologically active substance in the microsphere is described below. It can be carried out by observing the cross section of the microsphere with an electron microscope at a magnification at which the dispersed fine particles of the physiologically active substance can be clearly confirmed.
  • the electron microscope include a transmission electron microscope (TEM) using transmitted electrons as an information source and a scanning electron microscope (SEM) for detecting secondary electrons (backscattered electrons).
  • TEM transmission electron microscope
  • SEM scanning electron microscope
  • the fine structure of nanospheres and the like can be observed with a transmission electron microscope. Specifically, first, a thin film such as gold, platinum, or a platinum-palladium alloy is coated on a microsphere.
  • a cross-section observation sample of a microsphere was prepared by irradiating the sample with a focused ion beam using a FIB device and cutting out a structure at a desired position inside the sample.
  • the preferred particle size of the fine particles of the physiologically active substance dispersed in the base material of PLGA or PLA is several tens of nm to several hundreds of nm, but may be several ⁇ m.
  • the observation magnification of an electron microscope is about 2500 to several hundred thousand times or more. Further, when a high magnification is used in which the entire microsphere cannot be observed, the observed parts may be joined to observe the entire microsphere.
  • the cross-sectional image When the cross-sectional image is divided into six, for example, as shown in FIGS. 5A to 5C, the cross-sectional image may be divided into six concentrically, or may be divided into six in the vertical or horizontal direction, and the circumference passing through the center. It may be divided into 6 in the direction. It is preferable to take a division method that remarkably shows the segregated state of the physiologically active substance. For example, when dividing into six concentrically (FIG. 5A), it is essential to divide the radius into six equal parts from the center point of the maximum diameter of the cross section of the microsphere and divide the microsphere into six equal parts. When dividing in the vertical direction or the horizontal direction (FIG. 5B), it is essential to divide into 6 at equal intervals.
  • the cross-sectional observation sample can be stained with ruthenium tetroxide, osmium tetroxide, phosphotungstic acid, uranyl acetate, iodine or the like. It is also possible to identify a bioactive substance by comparison with a microsphere that does not contain a bioactive substance. When it is difficult to obtain contrast in the cross-sectional observation image of the electron microscope, the staining method is effective.
  • the sample may be embedded with a resin, or a microtome may be used to create a cross section of the microsphere.
  • the calculation of the cross-sectional area is not particularly limited, but it is preferable to use commercially available image processing analysis software. As commercially available image processing analysis software, various types of software such as Image-Pro Plus (manufactured by Media Cybernetics) and iTEM (TEM camera control, image analysis software, manufactured by EMSIS) can be used.
  • PLGA is a lactic acid / glycolic acid copolymer having a structural unit derived from lactic acid and a structural unit derived from glycolic acid.
  • PLA is a polymer of lactic acid.
  • PLGA may contain other biodegradable macromolecules such as polylactide (PLA), polyglycolide (PGA).
  • PLA polylactide
  • PGA polyglycolide
  • the molar ratio (L: G) of the structural unit (L) derived from lactic acid and the structural unit (G) derived from glycolic acid in PLGA is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the purpose. However, it is preferably 1:99 to 99: 1, more preferably 25:75 to 99: 1, further preferably 30:70 to 90:10, and particularly preferably 50:50 to 85:15. Moreover, PLA alone can be used. In order to realize a uniformly dispersed state of the physiologically active substance, the selection of this molar ratio is important, and the selection of the molecular weight of PLGA or PLA is also important.
  • the PLGA used in the microspheres of the present invention can be produced, for example, by heating lactic acid and glycolic acid under a weak reduced pressure using an ion exchange resin as a catalyst and performing condensation polymerization. At that time, lactide may be used instead of lactic acid.
  • PLGA may be a commercially available product. As a commercially available product, for example, it can be purchased from Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Taki Chemical Co., Ltd., Evonik Rohm GmbH, Merck, Sigma-Aldrich, and the like.
  • the content of PLGA or PLA in the microsphere of the present invention is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose, but is preferably 1% by mass or more, and more preferably 30% by mass or more and 95% by mass or less. It is preferable, and 50% by mass or more and 90% by mass or less is particularly preferable.
  • the microspheres of the present invention include PLGA or PLA and bioactive substances. Further, if necessary, it contains a dispersant and other components. Physiologically active substances, dispersants, other components and the like are dispersed in the microspheres and in the base material of PLGA or PLA.
  • the physiologically active substance contained in the microspheres of the present invention is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. Examples thereof include pharmaceutical compounds, functional food compounds and functional cosmetic compounds.
  • the microsphere containing the pharmaceutical compound can be suitably used as, for example, a sustained release pharmaceutical preparation.
  • the bioactive substance includes both a lipophilic bioactive substance and a hydrophilic bioactive substance.
  • a lipophilic bioactive substance is mentioned as a preferable bioactive substance.
  • the lipophilic physiologically active substance means, for example, a substance having a logP value of 3 or more in the water / octanol partition coefficient, and a physiologically active substance not included in the lipophilic physiologically active substance is classified as a hydrophilic physiologically active substance.
  • the water / octanol partition coefficient can be measured according to the JISZ7260-107 (2000) flask shaking method.
  • the physiologically active substance is not particularly limited as long as a sustained release preparation is desired, and can be appropriately selected depending on the intended purpose.
  • the physiologically active substance includes any form such as a salt and a hydrate.
  • Physiologically active substances are uniformly dispersed in the microspheres of the present invention.
  • the uniform dispersion of the bioactive substance in the microsphere can be controlled by the content of the bioactive substance with respect to the total amount of the microsphere.
  • the preferable content of the physiologically active substance varies depending on the physiologically active substance, but is, for example, 0.1 to 3% by mass, preferably 0.3 to 2% by mass, based on the total amount of the microspheres. It is more preferably 0.35 to 1.5% by mass, and even more preferably 0.5 to 1.25% by mass.
  • the average volume reference particle size of the dispersed fine particles of the physiologically active substance is preferably 5 nm to 500 nm, more preferably 10 nm to 400 nm, and further preferably 20 nm to 200 nm.
  • Dispersants can be used to disperse the bioactive substance.
  • the dispersant may be a low molecular weight dispersant or a high molecular weight dispersant polymer.
  • a low molecular weight dispersant means a compound having a weight average molecular weight of less than 15,000, and a high molecular weight dispersant polymer contains repeated covalent bonds between one or more monomers and has a weight average molecular weight of less than 15,000. Means more than 15,000 compounds.
  • the low molecular weight dispersant is not particularly limited as long as it is acceptable for pharmaceutical compounds, functional food compounds, functional cosmetic compounds, etc., and can be appropriately selected according to the purpose. Specific examples thereof include lipids, sugars, cyclodextrins, amino acids, organic acids, and other components. These may be used alone or in combination of two or more.
  • the lipids are not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose.
  • medium-chain or long-chain monoglycerides may be appropriately selected depending on the intended purpose.
  • medium-chain or long-chain monoglycerides may be appropriately selected depending on the intended purpose.
  • diglycerides or triglycerides may be appropriately selected depending on the intended purpose.
  • phospholipids eg, soybean oil, avocado oil, squalane oil).
  • vegetable oils eg, soybean oil, avocado oil, squalane oil.
  • Sesame oil olive oil, corn oil, rapeseed oil, saflower oil, sunflower oil, etc.
  • fish oil seasoning oil
  • water-insoluble vitamins fatty acids, and mixtures thereof, and derivatives thereof.
  • the saccharide is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose.
  • glucose, mannose, idose, galactose, fucose, ribose, xylose, lactose, sucrose, maltoce, trehalose, turanose, raffinose and maltotriose examples thereof include ose, acarbose, water-soluble cellulose, synthetic cellulose, sugar alcohol, glycerin, sorbitol, lactitol, maltotriose, mannitol, xylose, erythritol, or polyol, or derivatives thereof. These may be used alone or in combination of two or more.
  • the other ingredients are not particularly limited and can be appropriately selected according to the purpose, but those that can be conventionally used in medicine are preferable.
  • the average volume reference particle size of the microspheres of the present invention is 1 ⁇ m or more and 150 ⁇ m or less, preferably 10 ⁇ m or more and 100 ⁇ m or less, and more preferably 20 ⁇ m or more and 75 ⁇ m or less.
  • the average volume reference particle size can be measured using a laser diffraction type particle size distribution measuring device.
  • the average volume reference particle size exceeds 150 ⁇ m, the problem of initial burst occurs due to the heteroscedasticity of the physiologically active substance in the microsphere, and the problem of initial burst occurs, and aggregation and sedimentation are likely to occur. Will also be difficult. If it is smaller than 1 ⁇ m, the problem of initial burst occurs remarkably.
  • the initial release amount of the physiologically active substance and the release rate during the subsequent release period are appropriately controlled, and the physiologically active substance can be continuously released in the living body for a certain period of time.
  • sustained release preparation Using the microspheres of the present invention, a sustained release preparation containing microspheres can be prepared.
  • the sustained release preparation of the present invention appropriately controls the initial release amount of the physiologically active substance and the release rate during the subsequent release period, and continuously releases the physiologically active substance for a certain period of time in the living body, effectively as a drug. Can show a physical effect.
  • the sustained release preparation of the present invention can be easily administered as an injection and an implant, or as a transdermal agent, directly into lesions such as intramuscular, subcutaneous, blood vessels, organs, joint cavities, and tumors. It can also be administered as various other pharmaceutical forms.
  • a dispersant Teween 80, HCO-60, carboxymethyl cellulose, sodium alginate, etc.
  • a preservative methylparaben, propylparaben, etc.
  • an isotonic agent chloride
  • the method for producing a microsphere of the present invention includes at least a particle forming step, and may further include a filtration sterilization step, a good solvent removing step, and other steps, if necessary.
  • the particle forming step is a plurality of processes described in JP-A-2009-132871 or JP-A-2011-189348, which are arranged so as to be close to each other and which can be separated from each other, and at least one of them rotates relative to the other. It is preferable to use a particle processing apparatus in which particle processing is performed between the surfaces.
  • the particle forming step includes, for example, a solution of PLGA or PLA and a physiologically active substance obtained by dissolving or dispersing PLGA or PLA and a physiologically active substance in a good solvent of PLGA or PLA using the above-mentioned particle processing apparatus.
  • microspheres of the present invention It is carried out by precipitating the microspheres of the present invention by continuously adding a solution containing a poor solvent of PLGA or PLA to prepare emulsified particles and removing a good solvent from the prepared particles.
  • “dispersion” means that the physiologically active substance is dispersed in a good solvent of PLGA or PLA as a solid, that the physiologically active substance is emulsified in a good solvent of PLGA or PLA, and that the hydrophilic physiologically active substance is aqueous. It includes forming a w / o emulsion containing the solution and a good solvent of PLGA or PLA, and the like.
  • the solution of PLGA or PLA and the physiologically active substance is not particularly limited as long as it is a solution in which PLGA or PLA and the physiologically active substance are dissolved or dispersed in a good solvent of PLGA or PLA, and is appropriately selected according to the purpose. be able to.
  • the good solvent is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. Examples thereof include halogenated aliphatic hydrocarbons, aliphatic esters, alcohols, ketones, ethers and acetonitrile. Examples of the halogenated aliphatic hydrocarbon include dichloromethane, chloroform, carbon tetrachloride, chloroethane, 2,2,2-trichloroethane and the like.
  • Examples of the aliphatic ester include ethyl acetate, propyl acetate, butyl acetate and the like.
  • Examples of the alcohol include alcohols having low solubility in water such as benzyl alcohol, phenyl alcohol, and n-butanol.
  • Examples of the ketone include ketones having 3 to 6 carbon atoms (for example, acetone, methyl ethyl ketone, methyl isobutyl ketone, cyclohexanone, etc.).
  • Examples of the ether include ethers having 2 to 6 carbon atoms (for example, dimethyl ether, methyl ethyl ether, diethyl ether, etc.).
  • a solvent having a low solubility in water from the viewpoint of the content of the physiologically active substance and the purpose of preventing the initial burst.
  • Preferred good solvents include halogenated aliphatic hydrocarbons, ketones, and mixed solvents thereof, and more preferably dichloromethane, acetone, and mixed solvents thereof. Further, these may be used individually by 1 type, or may be used in combination of 2 or more type.
  • the particle size can be controlled by changing the solvent type and the mixing amount.
  • a good solvent means a solvent having a high solubility of PLGA or PLA
  • a poor solvent means a solvent having a low solubility of PLGA or PLA or an insoluble solvent.
  • the good solvent and the poor solvent are selected so that the physiologically active substance in the microsphere does not segregate or generate coarse particles or aggregates, respectively.
  • the good solvent and the poor solvent can be defined by, for example, the mass of PLGA or PLA that can be dissolved in 100 g of the solvent at 25 ° C.
  • the good solvent is preferably a solvent that dissolves 0.1 g or more of PLGA or PLA, more preferably 0.2 g or more, and further preferably 0.5 g or more.
  • the poor solvent is preferably a solvent that dissolves PLGA or PLA in an amount of 0.05 g or less, more preferably 0.02 g or less, and further preferably 0.01 g or less.
  • the poor solvent is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose, but water is preferable.
  • the content of PLGA or PLA in the solution of PLGA or PLA and the bioactive substance depends on the good solvent, the particle size of the target microsphere, and the bioactive substance uniformly in the microsphere. It can be varied to be dispersed.
  • the content of PLGA or PLA is, for example, 1 to 30% by mass, preferably 3 to 20% by mass, and more preferably 5 to 15% by mass.
  • the content of the physiologically active substance in the PLGA or PLA solution can be appropriately changed according to the purpose, pharmacological effect, etc., and so that the physiologically active substance in the microspheres is uniformly dispersed.
  • a stabilizer may be added to the antisolvent.
  • the stabilizer is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose.
  • polyvinyl alcohol (PVA), polyvinylpyrrolidone (PVP), carboxymethylcellulose (CMC), hydroxypropylcellulose (HPC), hydroxypropylmethylcellulose (HPMC), lecithin, polysorbate 80 and the like can be mentioned, with polyvinyl alcohol (PVA) being preferred. ..
  • the concentration of the stabilizer to be added is preferably 0.01 to 20% by mass, and more preferably 5% by mass or less.
  • Preferred poor solvents include, for example, an aqueous PVA solution.
  • the solution containing PLGA or PLA and a physiologically active substance and a solution containing a poor solvent are those in which a stirrer of various shapes such as rod-shaped, plate-shaped, and propeller-shaped is rotated in a tank, or are rotated relative to the stirrer. It is desirable to prepare using a preparation device such as a rotary disperser that realizes uniform mixing by applying a shearing force to the fluid, such as one provided with a screen. As a preferred example of the rotary disperser, the stirrer disclosed in Japanese Patent No. 5147091 can be applied.
  • the bioactive substances in the microspheres it is necessary to completely mix the PLGA or PLA solution and the poor solvent. For complete mixing, it is necessary to aim for homogenization at least at the molecular level, and inadequate mixing causes a non-uniform dispersion state.
  • the rotary disperser may be a batch type or a continuous type.
  • the fluid may be continuously supplied to and discharged from the stirring tank, or may be performed using a continuous mixer without using the stirring tank.
  • the stirring energy can be appropriately controlled by using a known stirring machine or stirring means.
  • the stirring energy is described in detail in Japanese Patent Application Laid-Open No. 04-114725 by the present applicant.
  • the stirring method in the present invention is not particularly limited, but it can be carried out by using various shearing type, friction type, high pressure jet type, ultrasonic type and other stirring machines, melting machines, emulsifying machines, dispersers, hojinizers and the like. ..
  • Ultra Talux manufactured by IKA
  • Polytron manufactured by Kinematica
  • TK Homo Mixer manufactured by Primix
  • Ebara Milder manufactured by Ebara Corporation
  • TK Homomic Line Flow manufactured by Primix
  • Colloid Mill Shainko Environment
  • Continuous emulsifiers such as Solution
  • slasher manufactured by Nippon Coke Industries
  • trigonal wet pulverizer manufactured by Mitsui Miike Kakoki
  • Cavitron manufactured by Eurotech
  • fine flow mill manufactured by Pacific Kiko
  • Claremix M
  • -Batch type or continuous dual-purpose emulsifiers such as (manufactured by Technique) and Claremix Dissolver (manufactured by M-Technique) can be mentioned.
  • the stirring process is provided with a stirring blade that rotates at high speed, a screen is provided on the outside of the stirring blade, and a stirrer that discharges fluid as a jet flow from the opening of the screen, particularly the above-mentioned Cumix (the above-mentioned Mariemix). It is desirable to use M-Technique) or Clairemix Dissolver (M-Technique).
  • the contact pressure is preferably 20 g / cm 2 to 250 g / cm 2 .
  • the contact pressure is lower than 20 g / cm 2 , the thin film is not stable and the particle size distribution becomes wide. It was found that if the contact pressure is higher than 250 g / cm 2, it becomes difficult to adjust the target particle size. More preferably, 50 g / cm 2 to 200 g / cm 2 is mentioned, and more preferably 80 g / cm 2 to 150 g / cm 2 is mentioned.
  • each of the microspheres formed by contacting the solution of PLGA or PLA and the physiologically active substance with the solution containing the poor solvent is preferable to put a solution containing a poor solvent in advance in the solution discharge liquid recovery tank and stir gently. By performing stirring, coalescence of microspheres can be further suppressed.
  • a rotary disperser is preferable, and a Clairemix dissolver (manufactured by M-Technique) is preferable. It is not particularly limited as long as it can flow the whole gently. If the stirring is strong, the emulsified particles of PLGA or PLA may be broken, the distribution width may be widened, and the dispersed state of the physiologically active substance may be disrupted.
  • the particle forming step can be suitably carried out according to the above description, and microspheres can be produced.
  • the physiologically active substance is a hydrophilic physiologically active substance
  • the hydrophilic physiologically active substance is dispersed in a good solvent of PLGA or PLA by using, for example, a dispersant, so that the particle formation step is carried out in the same manner. Fear can be manufactured.
  • the physiologically active substance is a hydrophilic physiologically active substance
  • the hydrophilic physiologically active substance is dissolved in an aqueous solvent such as water together with a stabilizer as necessary, and PLGA or PLA is added to a good solvent of PLGA or PLA.
  • the w / o emulsion prepared by mixing with the dissolved solution may be used as a solution of PLGA or PLA and a physiologically active substance, and the particle forming step may be carried out using the particle processing apparatus. can.
  • an intermittent shaking method for the preparation of the w / o emulsion, an intermittent shaking method, a propeller type stirrer, a method using a mixer using a turbine type stirrer, a colloid mill method, a homogenizer method, and an ultrasonic irradiation method can be used.
  • a solution of PLGA or PLA and a physiologically active substance which is the w / o emulsion
  • a solution containing a poor solvent of PLGA or PLA are continuously added to the w / o / w emulsion.
  • microspheres of the present invention It is carried out by precipitating the microspheres of the present invention by producing emulsified particles as a whole and removing a good solvent from the produced particles.
  • This microsphere can be used as it is, but it can also be solidified by adding excipients (mannitol, sorbitol, lactose, glucose, etc.), redispersing, and then freeze-drying or spray-drying.
  • This solidified microsphere can be used to obtain a more stable sustained release injection by adding distilled water for injection or an appropriate dispersion medium at the time of use.
  • the solution containing the poor solvent can be filtered and sterilized using a hydrophilic filter, and the solution of PLGA or PLA and a physiologically active substance can be filtered and sterilized using a hydrophobic filter.
  • the pore size of the filter used for filtration is preferably 0.1 ⁇ m to 0.45 ⁇ m, more preferably 0.2 ⁇ m.
  • the above-mentioned filtration sterilization filter is not particularly limited and can be appropriately selected according to the purpose.
  • hydrophilic filters such as polyvinylidene fluoride (PVDF) and polyether sulfone can be mentioned.
  • PVDF polyvinylidene fluoride
  • polyether sulfone For filtration sterilization of solutions of PLGA or PLA and bioactive substances, hydrophobic filters such as polytetrafluoroethylene (PTFE) can be mentioned.
  • PTFE polytetrafluoroethylene
  • the material is not limited to the materials described here, and it is necessary to select the material according to the adsorption of the drug and the solvent type.
  • the good solvent is removed from the emulsified particles containing PLGA or PLA and a physiologically active substance.
  • the good solvent removal step is not particularly limited as long as the good solvent can be removed from the liquid containing the emulsified particles in a state where the physiologically active substances in the microspheres are uniformly dispersed, and is appropriately suitable according to the purpose. You can choose.
  • the good solvent is evaporated from the liquid by at least one of heating the liquid with stirring, flowing a gas such as nitrogen on the liquid surface of the liquid, and depressurizing the liquid. Examples thereof include a method of removing the liquid, and preferably, a gas such as nitrogen is allowed to flow on the surface of the liquid.
  • the good solvent In order to maintain a uniformly dispersed state of the bioactive substance in the microsphere, it is often preferable to remove the good solvent early, but in some cases it is better to remove it slowly.
  • Examples of the time for removing the good solvent include 30 minutes to 12 hours, preferably 1 to 10 hours, and more preferably 1 to 5 hours.
  • the temperature at which the good solvent is removed depends on the type of the good solvent. It is necessary to observe the cross section of the microspheres from high temperature to low temperature near the boiling point of a good solvent and carry out at an appropriate temperature. At the time of removing a good solvent, if the concentration of PLGA or PLA is low, the volume change of the particles is large, and it is often seen that the physiologically active substances dispersed at that time are aggregated, so caution is required.
  • the particle size of the microsphere is 1 ⁇ m to 150 ⁇ m or less and the physiologically active substance in the microsphere is in a uniformly dispersed state. That is, a cross-sectional observation sample obtained by cutting the particles of the microsphere is prepared, the physiologically active substance in the microsphere is observed with an electron microscope at a magnification equal to or higher than that of the microsphere, and the cross-sectional image is divided into 6 regions.
  • the area ratio of the physiologically active substance in the 6-divided region is defined as the ratio (s / A) ⁇ 100 (%) of the area (A) and the total cross-sectional area (s) of the physiologically active substance contained in the region.
  • Microspheres having a coefficient of variation of 0.35 or less can be produced.
  • Reference Example 1 In Reference Example 1, microspheres (PLGA fine particles) containing no physiologically active substance were prepared. By observing the cross sections of the microspheres of Examples and Comparative Examples with SEM images using the microspheres of Reference Example 1 as an index, the dispersed state of the physiologically active substances in the microspheres of Examples and Comparative Examples was confirmed below.
  • Ion-exchanged water was added so that polyvinyl alcohol (PVA, EG-40P, manufactured by Nippon Synthetic Chemical Industry Co., Ltd.) was 1.5% by mass, and dissolved using a high-speed rotary disperser Clairemix (manufactured by M-Technique). An aqueous PVA solution was obtained. Then, filtration was performed with a hydrophilic PVDF membrane filter ( ⁇ 47, manufactured by Merck). A PVA aqueous solution was placed in advance in a tank for collecting PLGA emulsified particles, and the mixture was stirred to the extent that the liquid level moved.
  • PVA polyvinyl alcohol
  • EG-40P manufactured by Nippon Synthetic Chemical Industry Co., Ltd.
  • the prepared PLGA solution and PVA aqueous solution were mixed using the particle processing apparatus described in JP-A-2011-189348.
  • the particle processing apparatus described in JP-A-2011-189348 is the apparatus described in FIG. 25 of the same publication, in which the second introduction port d20 is a ring-shaped disk at the center of the processing surface 2. It has a concentric ring shape surrounding the opening, and has a disk diameter of 75 mm.
  • the prepared PVA aqueous solution was introduced between the first introduction section d1 and the treatment surfaces 1 and 2 at 0.02 MPaG, 65 mL / min, 30 ° C., and the treatment section 10 was rotated at 2000 rpm.
  • the prepared PLGA solution was introduced from the second introduction section d2 between the treatment surfaces 1 and 2 at 0.65 MPaG, 20 mL / min, 30 ° C., and the PVA aqueous solution and the PLGA solution were mixed in a forced thin film.
  • PLGA emulsified particles containing dichloromethane were prepared between the treatment surfaces 1 and 2.
  • a fluid containing PLGA emulsified particles between the treatment surfaces 1 and 2 (hereinafter referred to as PLGA emulsified particle dispersion) was discharged from the treatment surfaces 1 and 2 of the particle processing apparatus.
  • the discharged PLGA emulsified particle dispersion was recovered in a recovery tank.
  • the discharged liquid was stirred using a clear mix dissolver (manufactured by M-Technique) at a peripheral speed of 4.7 m / sec, and argon gas was blown onto the liquid surface for 3.5 hours. Then, dichloromethane was removed to obtain a suspension containing PLGA fine particles (PLGA fine particle suspension).
  • the average volume-based particle diameter of the obtained PLGA fine particles was 34.0 ⁇ m, and typical particles were frozen in liquid nitrogen, a FIB cross section was prepared, and an SEM image (FIG. 4) was observed.
  • Example 1 ⁇ Preparation of PLGA and bioactive substance solutions and PVA aqueous solution> Dichloromethane (Kanto Kagaku) so that the lactic acid / glycolic acid copolymer (Resomer RG752H, manufactured by Ebonic) is 10% by mass and the physiologically active substance is curcumin (manufactured by Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Wako Special Grade) is 0.5% by mass.
  • the prepared solution of PLGA and the physiologically active substance and the aqueous solution of PVA were mixed in the same manner as in Reference Example 1 using the particle processing apparatus described in JP-A-2011-189348. Specifically, the prepared PVA aqueous solution was introduced between the first introduction section d1 and the treatment surfaces 1 and 2 at 0.0 MPaG, 50 mL / min, 25 ° C., and the treatment section 10 was rotated at 5000 rpm.
  • the prepared solution of PLGA and the physiologically active substance was introduced from the second introduction part d2 between the treatment surfaces 1 and 2 at 0.3 MPaG, 16 mL / min, 25 ° C., and the PVA aqueous solution and the PLGA and the physiologically active substance were introduced.
  • a fluid containing the emulsified particles of PLGA and the physiologically active substance (hereinafter referred to as the emulsified particle dispersion of PLGA and the physiologically active substance) between the treatment surfaces 1 and 2 was discharged from the processing surfaces 1 and 2 of the particle processing apparatus.
  • the PLGA and the emulsified particle dispersion of the physiologically active substance for collecting the discharged PLGA and the emulsified particle dispersion of the physiologically active substance were collected in a recovery tank pressure-held at 0.03 MPaG.
  • the discharged liquid was stirred with a Clairemix dissolver (manufactured by M-Technique) at a peripheral speed of 4.7 m / sec, and argon gas was blown onto the liquid surface for 3.5 hours.
  • Dichloromethane and acetone were removed by stirring to obtain a suspension containing microspheres (microsphere suspension).
  • the average volume reference particle diameter of the obtained microspheres was 7.5 ⁇ m, and typical particles were frozen in liquid nitrogen, a FIB cross section was prepared, and an SEM image (FIG. 6-1) was observed.
  • FIG. 6-2 shows an image in which the cross section of the particle is divided into 6 parts (regions 1 to 6) at every 60 degrees around the center point of the maximum diameter on the image.
  • the coefficient of variation at (%) was 0.161.
  • Example 2 A suspension containing microspheres was prepared in the same manner as in Example 1 except that polylactic acid (Resomer R202H) was used instead of the lactic acid / glycolic acid copolymer (Resomer RG504, manufactured by Evonik).
  • the average volume reference particle diameter of the obtained microspheres was 7.3 ⁇ m, and typical particles were frozen in liquid nitrogen, a FIB cross section was prepared, and an SEM image was observed.
  • Example 3 Add dichloromethane (manufactured by Kanto Kagaku) to 13% by mass of lactic acid / glycolic acid copolymer (Resomer RG504, manufactured by Ebony) and 1.0% by mass of progesterone (manufactured by Sigma Aldrich) as a physiologically active substance. It was dissolved using a rotary disperser Clairemix Dissolver (manufactured by M-Technique) to obtain a solution of PLGA and a physiologically active substance. Then, filtration was performed with a 0.2 ⁇ m air vent filter ( ⁇ 62, manufactured by Merck & Co., Ltd.). The PVA aqueous solution was prepared in the same manner as in Reference Example 1. An aqueous PVA solution was placed in advance in a tank for collecting emulsified particles of PLGA and a physiologically active substance, and the mixture was stirred to the extent that the liquid level moved.
  • dichloromethane manufactured by Kanto Kagaku
  • the prepared solution of PLGA and the physiologically active substance and the aqueous solution of PVA were mixed in the same manner as in Reference Example 1 using the particle processing apparatus described in JP-A-2011-189348. Specifically, the prepared PVA aqueous solution was introduced between the first introduction section d1 and the treatment surfaces 1 and 2 at 0.0 MPaG, 50 mL / min, 30 ° C., and the treatment section 10 was rotated at 1700 rpm.
  • the prepared solution of PLGA and the physiologically active substance was introduced from the second introduction part d2 between the treatment surfaces 1 and 2 at 0.35 MPaG, 16 mL / min, 30 ° C., and the PVA aqueous solution and the PLGA and the physiologically active substance were introduced.
  • a fluid containing the emulsified particles of PLGA and the physiologically active substance (hereinafter referred to as the emulsified particle dispersion of PLGA and the physiologically active substance) between the treatment surfaces 1 and 2 was discharged from the processing surfaces 1 and 2 of the particle processing apparatus.
  • the PLGA and the emulsified particle dispersion of the physiologically active substance for collecting the discharged PLGA and the emulsified particle dispersion of the physiologically active substance were collected in a recovery tank pressure-held at 0.02 MPaG.
  • the solvent removal step was carried out in the same manner as in Examples 1 and 2, and the average volume reference particle diameter of the obtained microspheres was 34.8 ⁇ m. Typical particles were frozen in liquid nitrogen, and then a FIB cross section was prepared. , SEM image (Fig. 7-1) was observed.
  • the observed SEM image was image-analyzed by the same method as in Examples 1 and 2.
  • the enlarged SEM cross section after the binarization treatment is shown in FIG. 7-2.
  • X 100 (%) had a coefficient of variation of 0.056.
  • Example 4 Dichloromethane (Kanto) so that lactic acid / glycolic acid copolymer (Resomer RG504, manufactured by Ebonic) is 13% by mass and Probucol (manufactured by Fujifilm Wako Pure Chemicals, biochemical) is 1.0% by mass as a physiologically active substance. (Chemical) was added and dissolved using a high-speed rotary disperser Clairemix Dissolver (manufactured by M-Technique) to obtain a solution of PLGA and a physiologically active substance. Then, filtration was performed with a 0.2 ⁇ m air vent filter ( ⁇ 62, manufactured by Merck & Co., Ltd.).
  • the PVA aqueous solution was prepared in the same manner as in Reference Example 1. An aqueous PVA solution was placed in advance in a tank for collecting emulsified particles of PLGA and a physiologically active substance, and the mixture was stirred to the extent that the liquid level moved.
  • the solvent removal step was carried out in the same manner as in Examples 1 to 3, and the average volume reference particle diameter of the obtained microspheres was 32.5 ⁇ m. Typical particles were frozen in liquid nitrogen, and then a FIB cross section was prepared. , SEM image (Fig. 8-1) was observed.
  • the observed SEM image was image-analyzed by the same method as in Examples 1 to 3.
  • the SEM cross section after the binarization process is shown in FIG. 8-2.
  • X 100 (%) had a coefficient of variation of 0.235.
  • Example 1 In the same manner as in Example 4, PLGA and an emulsified particle dispersion of a physiologically active substance were prepared as a particle forming step. Next, as a solvent removal step, dichloromethane was removed in the air over 42 hours while stirring the recovered discharge liquid using a Clairemix dissolver (manufactured by M-Technique) at a peripheral speed of 4.7 m / sec. A suspension containing spheres (microsphere suspension) was obtained. The average volume reference particle diameter of the obtained microspheres was 31.8 ⁇ m, and typical particles were frozen in liquid nitrogen, a FIB cross section was prepared, and an SEM image was observed.
  • a solvent removal step dichloromethane was removed in the air over 42 hours while stirring the recovered discharge liquid using a Clairemix dissolver (manufactured by M-Technique) at a peripheral speed of 4.7 m / sec. A suspension containing spheres (microsphere suspension) was obtained. The average volume reference particle diameter of the obtained microspheres was 31.8 ⁇
  • the observed SEM image was image-analyzed by the same method as in Examples 1 to 3.
  • the SEM cross section after the binarization process is shown in FIG.
  • the ratio of the region area (A) of each region obtained by dividing the radius into 6 equal parts from the center point of the maximum diameter and dividing it into 6 concentrically and the total cross-sectional area (s) of the bioactive substance contained in the region (s).
  • the coefficient of variation at s / A) ⁇ 100 (%) was 0.468.
  • Example 2 Comparative Example 2 With the same formulation as in Example 4, the dissolution of PLGA and the drug was changed to stirring for 10 minutes with a propeller-type stirrer (manufactured by Three-One Motor), and the particle formation step and the solvent removal step were performed under the same conditions as in Example 4.
  • a suspension containing microspheres The average volume reference particle diameter of the obtained microspheres was 29.8 ⁇ m, and typical particles were frozen in liquid nitrogen, a FIB cross section was prepared, and an SEM image (FIG. 10) was observed.
  • the observed SEM image is image-analyzed by the same method as in Examples 1 to 4, and is included in the region area (A) of each region divided into 6 at every 60 degrees centering on the center point of the maximum diameter and the region.
  • the coefficient of variation at the ratio (s / A) ⁇ 100 (%) to the total cross-sectional area (s) of the physiologically active substance was 0.357.
  • Dichloromethane (made by Fujifilm Wako Pure Chemical Co., Ltd., Wako Special Grade) is made up of 5.0% by mass of lactic acid / glycolic acid copolymer (Resomer RG504, manufactured by Ebony) and 0.25% by mass of curcumin (manufactured by Fujifilm Wako Pure Chemical Co., Ltd., Wako Special Grade) as a physiologically active substance.
  • the particle formation step and the solvent removal step were carried out under the same conditions as in Example 1 to prepare a suspension containing microspheres.
  • the average volume reference particle diameter of the obtained microspheres was 6.8 ⁇ m, and typical particles were frozen in liquid nitrogen, a FIB cross section was prepared, and an SEM image (FIG. 11) was observed.
  • the observed SEM image is image-analyzed by the same method as in Examples 1 to 4, and is included in the region area (A) of each region divided into 6 at every 60 degrees centering on the center point of the maximum diameter and the region.
  • the coefficient of variation in the ratio (s / A) ⁇ 100 (%) with the total cross-sectional area (s) of the physiologically active substance was 0.386.
  • the particle formation step and the solvent removal step were carried out under the same conditions as in Example 3 to obtain a suspension containing microspheres.
  • the average volume reference particle diameter of the obtained microspheres was 21.6 ⁇ m, and typical particles were frozen in liquid nitrogen, a FIB cross section was prepared, and an SEM image (FIG. 12) was observed.
  • the observed SEM image is image-analyzed by the same method as in Examples 1 to 4, and is included in the region area (A) of each region divided into 6 at every 60 degrees centering on the center point of the maximum diameter and the region.
  • the coefficient of variation at the ratio (s / A) ⁇ 100 (%) to the total cross-sectional area (s) of the physiologically active substance was 1.094.
  • Table 1 shows some of the conditions of Examples 1 to 4, Comparative Examples 1 to 4, and Reference Example 1 (PLGA only).
  • Table 2 shows the area ratio%, standard deviation, average value, and coefficient of variation (CV value) of Examples 1 to 4 and Comparative Examples 1 to 4 and Leuprorelin's typical particle size microspheres in each region.
  • the coefficient of variation of the area ratio occupied by the physiologically active substance in each region in the particles is 0.35 or less regardless of whether PLGA or PLA is used.
  • the distribution of bioactive substances in the particles was uniform.
  • Comparative Example 3 although the particle purification step and the solvent removal step had the same conditions as in Example 1, when the PLGA concentration was lowered, the uniformity in the particles was lowered, and the area ratio occupied by the physiologically active substances in each region was reduced.
  • the coefficient of variation increased to 0.386.
  • Example 4 and Comparative Example 1 the particle size of the fine particles of the physiologically active substance changes due to the difference in the drying conditions and the drying time, and when the drying time is long, the uniformity of the physiologically active substance distributed in the particles decreases.
  • the coefficient of variation of the area ratio occupied by the bioactive substances in each region increased to 0.468.
  • Comparative Examples 3 and 4 in which the concentrations of PLGA and the drug were lowered as compared with Examples, the shrinkage rate at the time of drying became large, the physiologically active substances in the particles were biased, and the area occupied by the physiologically active substances in each region. The coefficient of variation of the ratio exceeded 0.35.
  • the present invention provides a microsphere in which the initial release amount of a physiologically active substance and the release rate during the subsequent release period are appropriately controlled, and the physiologically active substance can be continuously released in a living body for a certain period of time. be able to.

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Abstract

本出願において、生理活性物質が均一に分散された乳酸・グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）又はポリ乳酸（ＰＬＡ）を主成分とするマイクロスフェアーであって、前記マイクロスフェアーの平均体積基準粒子径が１μｍ以上１５０μｍ以下であり、前記マイクロスフェアーを切断した断面観察試料を作成し、前記断面観察試料をマイクロスフェアー中の生理活性物質を確認できる倍率以上で電子顕微鏡観察し、前記電子顕微鏡断面観察した像を６分割し、分割した各々の領域の領域面積（Ａ）とその領域に含まれる前記生理活性物質の断面積の総和（ｓ）との比率（ｓ／Ａ）×１００（％）を算出して、６つの領域における算出された前記比率の変動係数が０．３５以下であることを特徴とするマイクロスフェアーが提供される。本発明のマイクロスフェアーは、生理活性物質の初期放出量とその後の放出期間中の放出速度が適切に制御され、生理活性物質を生体内で一定期間、継続して放出することができる。

Description

生理活性物質が均一に分散されたマイクロスフェアー及びそれを含有する徐放性製剤
　本発明は、生理活性物質が均一に分散されたマイクロスフェアー及びそれを含有する徐放性製剤に関する。本発明は、特に、生理活性物質が均一に分散された乳酸・グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）又はポリ乳酸（ＰＬＡ）を主成分とするマイクロスフェアー及びそれを含有する徐放性製剤に関する。
　生理活性物質を含有する医薬品等の徐放性製剤等として、最近、マイクロスフェアー又はナノスフェアーが注目されている。マイクロスフェアーとは、通常、粒子径が１μｍから１５０μｍ程度の製剤をいい、それよりも小さい１μｍ未満の製剤をナノスフェアーと呼ばれる。これらは、例えば、生理活性物質を生分解性の合成高分子又は天然高分子に内包させて、局所で生理活性物質を持続的に放出することができ、又は組織への生理活性物質のターゲッティング等を行うことができる。
　生理活性物質を一定の速度で徐々に放出する徐放性マイクロスフェアー製剤には、例えば、生分解性高分子、生理活性物質、添加剤、溶媒等が適切に制御された製剤が必要である。徐放性マイクロスフェアー製剤が生体内で一定期間、有効に薬理学的効果を示すためには、生理活性物質の初期放出量とその後の放出期間中の放出速度を適切に制御して、生理活性物質を生体内で一定期間、継続して放出することが必要である。
　その生理活性物質の放出速度を決定する重要な因子の一つに生分解性高分子の種類がある。特に最も広く用いられる乳酸・グリコール酸共重合体（Ｐｏｌｙｌａｃｔｉｄｅ－ｃｏ－ｇｌｙｃｏｌｉｄｅ　Ａｃｉｄ，ＰＬＧＡ）、及び乳酸の重合体であるポリ乳酸（ＰＬＡ）は、その物理化学的特性、例えば構成成分である乳酸とグリコール酸の割合、分子量、水親和性等で生体分解速度が異なるため、これらによって、所望の放出期間となるように調整することができる（特許文献１）。
　更に、それに加えて、生理活性物質の初期放出量異常（初期バースト）を抑え、放出期間中の放出速度を一定に制御するためには、マイクロスフェアーの粒子径とマイクロスフェアー中の生理活性物質の分散状態が関係する。マイクロスフェアーの粒子径は、歩留まりの問題があるが、ろ過などの操作で目的とする粒子径に合わせこむことができる。しかし、マイクロスフェアー中の生理活性物質の分散状態は、ただ一様とされており確認されていない。
　ＰＬＧＡ又はＰＬＡのマイクロスフェアーは、例えば、液中乾燥法、噴霧乾燥法、噴霧凍結乾燥法、超臨界流体工程を用いた乾燥法、二重乳化法等を用いて製造することができる。これらの中で最も一般的な製造方法は、生理活性物質が親油性である場合、ＰＬＧＡ又はＰＬＡ及び生理活性物質を有機溶媒に溶解又は分散させ、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）を溶解した水溶液に混合させてエマルション化し、エマルションから脱溶媒を行う液中乾燥法である。
　特許文献１には、ＰＬＧＡ等の生分解性高分子とペプチド薬物を含む徐放性マイクロスフェアーを、噴霧乾燥法、噴霧凍結乾燥法又は超臨界流体工程を用いた乾燥法で製造する方法が開示されている。しかし、徐放性マイクロスフェアーの粒子径がどの程度ばらついているか、徐放性マイクロスフェアー中にペプチド薬物が均一に分散されているか、均一なものが得られるかについては、記載されていない。
　特許文献２には、ハロゲン化物炭化水素、及び薬物の溶解度が０．３％（Ｗ／Ｖ）以上である非水混和性有機溶媒からなる混合溶媒を用いて、ＰＬＧＡ微粒子を液中乾燥法により製造する方法が開示されている。製造例１及び２で得られた微粒子の粒子径（メディアン径）が１４及び１６μｍであったことが記載されているが、微粒子中の薬物の分散状態については、記載されていない。
　特許文献３には、薬物を含むＰＬＧＡナノ粒子が開示されている。これらのナノ粒子は、主として特定組織へのターゲッティングのためのものであり、そこで毛細血管の微小な穴を通り抜けることができる数十～数百ｎｍ程度のナノ粒子である。しかし、特許文献３には、これらのナノ粒子よりも遥かに大きい１μｍ以上のマイクロスフェアーについては、記載されていない。また、特許文献３の技術を用いても、当業者は、粒子径が１μｍ以上のマイクロスフェアーを製造することはできなかった。
　特許文献４には、皮下注射することで黄体形成ホルモン放出ホルモン誘導体であるリュープロレリン酢酸塩を約１ヶ月から数ヶ月にわたって放出する製剤が開示されている。同製剤には粒子径の粒度分布が１μｍから４００μｍと非常に広いことの問題がある。そこで、特許文献５では、この問題を解決する方法として、二重乳化法により担体用高分子内に生理活性物質が封入されたマイクロスフェアーを製造する方法が提案されている。しかし、実施例１～５で得られたリュープロレイン酢酸塩含有マイクロスフェアーは、粒子中の薬物の分散状態については、記載されていない。
　特許文献６には、少なくとも２８日間（６７２時間）、慢性の痛みを軽減するマイクロスフェアーが開示されている。同マイクロスフェアーは、生分解性ポリマー及び局所麻酔剤（生理活性物質）を含み、局所麻酔剤の約７５％が約７２時間までに放出され、局所麻酔剤の約８０～９０％が約１２０時間までに放出される。このことから、マイクロスフェアー中の局所麻酔剤の分布はマイクロスフェアー中に均一ではなく外側に偏っていることが示唆される。図２に記載されたマイクロスフェアーの断面のＳＥＭ（走査型電子顕微鏡）画像からは、局所麻酔剤の分散状態は、確認できない。
　特許文献７には、コアが固体状のアリピプラゾールを含有し、生分解性ポリマーを含むシェルがコアの表面を被覆したコアシェル構造のマイクロスフェアーが開示されている。このように、特許文献７のマイクロスフェアーは、マイクロスフェアー中に生理活性物質が均一に分散されたものではない。また、図５に記載された実施例で得られたマイクロスフェアーを切断した断面の電子顕微鏡写真では、シェル中には、アリピプラゾールの分散状態が、確認できない。
特開２００５－０３５９９４号公報 特開２００５－０１５４７６号公報 特許４８５６７５２号公報 特許２６５３２５５号公報 特開２０１４－２２４１１４号公報 特開２０１６－０６９３７８号公報 特表２０１０－５３１３０３号公報
　平均体積基準粒子径が１μｍ以上１５０μｍ以下である生分解性高分子マイクロスフェアーは、マイクロスフェアー中の生理活性物質（薬物と表記する場合もある）の分布が制御されていなければ、放出期間を設計通りに実現することができない。例えば、マイクロスフェアーの表面近くに生理活性物質が偏っていれば、投与後初期にマイクロスフェアーから多量の生理活性物質が放出され、初期バーストの問題が発生する。逆に、マイクロスフェアーの中心部に生理活性物質が偏っていれば、又はコアシェルの様な状態であれば、初期から持続的に放出することができない。故に、微粒子の生理活性物質が均一に分散された状態が望ましい。大きな塊の生理活性物質が点在するような分散状態では、初期から持続的に放出することはできない。同様に、空孔の制御がなされていなければ、生理活性物質の放出において同様な問題が発生する。
　実際にラット等の小動物を用いて薬物動態を調べた際、放出速度や放出プロファイルにバラつきが多く発生することがあり、その原因としてラット等の個体差であると結論付けることが多い。しかし、マイクロスフェアー中の生理活性物質の分散状態が均一であれば、バラつきの多くがより改善され、ＰＬＧＡの種類や分子量で分解速度が制御されマイクロスフェアーからの生理活性物質の放出も設計通りに実現できる。
　マイクロスフェアー中に生理活性物質が均一に分散されていることが、生理活性物質を生体内で一定期間継続して放出するための絶対条件である。しかし、現状では均一の分散について探索がされていない。マイクロスフェアーの粒子径は、ナノ粒子と違って大きいため、一般に均一化が難しい。そこで、マイクロスフェアー中の生理活性物質の分散状態を確認する必要がある。そのためには、マイクロスフェアーの粒子を切断した断面観察試料を作成し、マイクロスフェアー中の生理活性物質を確認できる倍率以上で電子顕微鏡観察し、その分散状態を確認することが、容易に実施することができ、確実である。
　図１は、特許文献４に記載されるＬＨ－ＲＨ誘導体の長期徐放型マイクロカプセルに相当する、マイクロカプセル型徐放性製剤リュープリン（登録商標）注射用１．８８ｍｇ（武田薬品工業株式会社製）の電子顕微鏡写真である。
　本製剤には、大きな粒子から小さな粒子までいろいろ含まれるが、その代表的な粒子である約６μｍの粒子を選択して、その粒子の断面のＳＥＭ（走査型電子顕微鏡）画像が図２である。図中の矢印で示す大きな分散体は、空孔であることが、画像でのエッジ効果の確認によって、またＳＥＭ－ＥＤＳ（エネルギー分散型Ｘ線分光器）よって分かる。図３は、図２のＳＥＭ断面画像を画像上で６分割（領域１～領域６）し、市販の画像処理解析ソフトｉＴＥＭ（ＴＥＭカメラ制御、画像解析ソフトウェア、ＥＭＳＩＳ社製）を用いてピクセル範囲３×３で平均化処理後に、エッジ部分を強調する処理を行い、コントラストの最適化を行った。その後、２値化処理を行い、画像処理でノイズ除去及びコントラストの低い粒子の強調処理を行った後に、再度ピクセル範囲３×３で平均化処理後にエッジ部分を強調する処理を行った画像である。図３に基づいて、分割した各々の領域の領域面積（Ａ）とその領域に含まれる前記生理活性物質の断面積の総和（ｓ）との比率（ｓ／Ａ）×１００（％）の変動係数を求めたところ、１．０６であった。この様に実施することで、粒子断面から生理活性物質の分散状態を確認することができる。この変動係数が０．３５を超えており、粒子中に分散された生理活性物質が均一でない分散状態であるために、本製剤では放出期間中の放出速度を適切に制御することができない。
　そこで、本発明の課題は、生理活性物質の初期放出量とその後の放出期間中の放出速度が適切に制御され、生理活性物質を生体内で一定期間、継続して放出することができるマイクロスフェアーを提供することにある。
　本発明者らは、上記課題を解決するべく鋭意検討した結果、マイクロスフェアーの電子顕微鏡断面観察した像の６分割した領域における生理活性物質の面積比率の変動係数が０．３５以下であるマイクロスフェアーであることによって、生理活性物質がマイクロスフェアー中に均一に分散され、不均一な空孔がなく、生理活性物質の初期放出量とその後の放出期間中の放出速度が適切に制御され、生理活性物質を生体内で一定期間、継続して放出することができることを見出して、本発明を完成した。すなわち、本発明は以下の通りである。
　［１］本発明の第１の態様は、生理活性物質が均一に分散された乳酸・グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）又はポリ乳酸（ＰＬＡ）を主成分とするマイクロスフェアーであって、
　前記マイクロスフェアーの平均体積粒子径が１μｍ～１５０μｍ以下であり、
　前記マイクロスフェアーを切断した断面観察試料を作成し、前記断面観察試料をマイクロスフェアー中の生理活性物質を確認できる倍率以上で電子顕微鏡観察し、前記電子顕微鏡断面観察した像を６分割し、分割した各々の領域の領域面積（Ａ）とその領域に含まれる前記生理活性物質の断面積の総和（ｓ）との比率（ｓ／Ａ）×１００（％）を算出して、６つの領域における算出された前記比率の変動係数が０．３５以下であることを特徴とするマイクロスフェアーである。
　［２］本発明の第２の態様は、前記生理活性物質が親油性生理活性物質である、［１］に記載のマイクロスフェアーである。
　［３］本発明の第３の態様は、分散された前記生理活性物質の平均体積基準粒子径が５ｎｍ～５００ｎｍである、［１］又は［２］に記載のマイクロスフェアーである。
　［４］本発明の第４の態様は、前記マイクロスフェアー中の前記生理活性物質の含有量が０．３５～１．５質量％である、［１］～［３］のいずれかに記載のマイクロスフェアーである。
　［５］本発明の第５の態様は、［１］～［４］のいずれかに記載のマイクロスフェアーを含有する徐放性製剤である。
　本発明のマイクロスフェアーによって、生理活性物質の初期放出量とその後の放出期間中の放出速度が適切に制御され、生理活性物質を生体内で一定期間、継続して放出することができる。
リュープリン（登録商標）注射用１．８８ｍｇ（武田薬品工業株式会社製）のＳＥＭ（走査型電子顕微鏡）画像である。 リュープリン（登録商標）注射用１．８８ｍｇ（武田薬品工業株式会社製）の代表的な粒子の断面のＳＥＭ（走査型電子顕微鏡）画像である。 図２の断面画像を６分割し、分割した各々の領域の領域面積（Ａ）とその領域に含まれる前記生理活性物質の断面積の総和（ｓ）との比率（ｓ／Ａ）×１００（％）を求めるために２値化処理した画像である。 参考例１の生理活性物質を含まないマイクロスフェアーの断面のＳＥＭ画像である。 マイクロスフェアーの分割方法の例を示す。（Ａ）は同心円上に６分割したものである。（Ｂ）は縦方向に６分割したものである。（Ｃ）は円周方向に６分割したものである。 実施例１のマイクロスフェアーの断面のＳＥＭ画像である。 図６－１の断面画像を６分割し、分割した各々の領域の領域面積（Ａ）とその領域に含まれる前記生理活性物質の断面積の総和（ｓ）との比率（ｓ／Ａ）×１００（％）を求めるために２値化処理した画像である。 実施例３のマイクロスフェアーの断面のＳＥＭ画像である。 図７－１の断面画像を拡大し、２値化処理した画像である。 実施例４のマイクロスフェアーの断面のＳＥＭ画像である。 図８－１の断面画像を６分割し、分割した各々の領域の領域面積（Ａ）とその領域に含まれる前記生理活性物質の断面積の総和（ｓ）との比率（ｓ／Ａ）×１００（％）を求めるために２値化処理した画像である。 比較例１の断面画像を６分割し、分割した各々の領域の領域面積（Ａ）とその領域に含まれる前記生理活性物質の断面積の総和（ｓ）との比率（ｓ／Ａ）×１００（％）を求めるために２値化処理した画像である。 比較例２のマイクロスフェアーの断面のＳＥＭ画像である。 比較例３のマイクロスフェアーの断面のＳＥＭ画像である。 比較例４のマイクロスフェアーの断面のＳＥＭ画像である。
１．マイクロスフェアー
　本発明のマイクロスフェアーは、生理活性物質が均一に分散された乳酸・グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）又はポリ乳酸（ＰＬＡ）を主成分とするマイクロスフェアーであって、前記マイクロスフェアーの平均体積粒子径が１μｍ～１５０μｍ以下であり、前記マイクロスフェアーを切断した断面観察試料を作成し、前記断面観察試料をマイクロスフェアー中の生理活性物質を確認できる倍率以上で電子顕微鏡観察し、前記電子顕微鏡断面観察した像を６分割し、分割した各々の領域の領域面積（Ａ）とその領域に含まれる前記生理活性物質の断面積の総和（ｓ）との比率（ｓ／Ａ）×１００（％）を算出して、６つの領域における算出された前記比率の変動係数が０．３５以下であることを特徴とするマイクロスフェアーである。
　表層又は中心部に生理活性物質が偏析するか、あるいは粗大粒子や凝集体又は大きな空孔等があれば、上記比率の変動係数が大きくなる。上記比率の変動係数が０．３５以下であればと生理活性物質の分散が均一である。本発明に係るマイクロスフェアーは、上記マイクロスフェアーの断面を６分割した各領域内において、各領域面積に対する生理活性物質が占める面積比率の変動係数が０.３５以下であり、好ましくは０．２５以下、より好ましくは０．２０以下である。
　本発明のマイクロスフェアーによって、生理活性物質の初期放出量とその後の放出期間中の放出速度が適切に制御され、生理活性物質を生体内で一定期間、継続して放出することができる。
＜マイクロスフェアーの断面の観察＞
　マイクロスフェアー中の生理活性物質の分散状態の確認方法について以下に述べる。
　分散された生理活性物質の微粒子を明確に確認できる倍率で、マイクロスフェアーの断面を電子顕微鏡で観察することで実施することができる。電子顕微鏡は、透過電子を情報源にした透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）と二次電子（反射電子）を検出する走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）等がある。観察する試料に合わせて選択するが、ナノスフェアーなどは、透過型電子顕微鏡の方が微細構造を観察できる。具体的には、先ず金や白金、白金パラジウム合金等の薄膜をマイクロスフェアーにコートする。実施例では、オスミウムを用いてコートしている。次にマイクロスフェアーを液体窒素によって凍結させる。凍結後、ＦＩＢ（集束イオンビーム：Ｆｏｃｕｓｅｄ　Ｉｏｎ　Ｂｅａｍ）により断面を作成する。すなわち、ＦＩＢ装置を用いて、集束したイオンビームを試料に照射し、試料内部の所望位置の構造を切り出すことで、マイクロスフェアーの断面観察試料を作製した。ＰＬＧＡ又はＰＬＡの母材中に分散された生理活性物質の微粒子の好ましい粒子径は数１０ｎｍ～数１００ｎｍであるが、数μｍの場合もある。この大きさの分散微粒子を確認できる電子顕微鏡の観察倍率でマイクロスフェアーの断面全体を観察する。通常、電子顕微鏡の観察倍率は２５００倍から数十万倍程度以上である。また、マイクロスフェアー全体を観察できない高い倍率を用いた場合、観察された部分を繋ぎ合わして全体を観察してもよい。
　断面画像を６分割にする際、例えば、図５のＡ～Ｃに示すように、同心円状に６分割してもよく、縦方向又は横方向に６分割してもよく、中心を通る円周方向に６分割しても構わない。生理活性物質の偏析状態を顕著に示す分割方法を取ることが好ましい。例えば、同心円状に６分割する場合（図５Ａ）は、マイクロスフェアーの断面の最大直径の中心点から半径を６等分して同心円状に分割が必須である。縦方向又は横方向に分割する場合（図５Ｂ）は、等間隔に６分割が必須である。上記の最大直径と平行に又は垂直、いずれかの方向に６分割が必須である。中心を通る円周方向に６分割する場合（図５Ｃ）は、上記の最大直径の中心点を中心にして６０度ごとに６分割が必須である。生理活性物質の構成元素にもよるが、マイクロスフェアーの断面をＥＤＳ（エネルギー分散型Ｘ線分光器）を用いて元素分析を行うことができ、空孔かそうでないかも確認できる。空孔の場合は生理活性物質の面積に積算してはならない。ＥＤＳ検出元素が入っていない場合、断面観察試料を四酸化ルテニウムや四酸化オスミウム、リンタングステン酸、酢酸ウラニル、ヨウ素などを用いて染色することもできる。また、生理活性物質が入っていないマイクロスフェアーとの比較により、生理活性物質を特定することもできる。電子顕微鏡断面観察画像にコントラストが得にくい場合、染色法が有効である。上述は一例であり試料を樹脂で包埋したり、マイクロスフェアーの断面作成にミクロトームを用いたりしても構わない。
　また、断面積の算出は、特に方法は問わないが、市販の画像処理解析ソフトを用いることが好ましい。市販の画像処理解析ソフトとしては、Ｉｍａｇｅ－Ｐｒｏ Ｐｌｕｓ（Ｍｅｄｉａ Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ社製)やｉＴＥＭ（ＴＥＭカメラ制御、画像解析ソフトウェア、ＥＭＳＩＳ社製）等、多種類のものを用いることができる。
＜ＰＬＧＡ及びＰＬＡ＞
　ＰＬＧＡは、乳酸に由来する構成単位と、グリコール酸に由来する構成単位とを有する乳酸・グリコール酸共重合体である。ＰＬＡは乳酸の重合体である。ＰＬＧＡは、ポリラクチド（Ｐｏｌｙｌａｃｔｉｄｅ，ＰＬＡ）、ポリグリコリド（Ｐｏｌｙｇｌｙｃｏｌｉｄｅ、ＰＧＡ）等の他の生体分解性高分子を含んでいてもよい。本明細書に記載したＰＬＧＡは一例として記載したものであり、記載されたものに制限されるものではない。
　ＰＬＧＡにおける、乳酸に由来する構成単位（Ｌ）と、グリコール酸に由来する構成単位（Ｇ）とのモル比率（Ｌ：Ｇ）としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、１：９９～９９：１が好ましく、２５：７５～９９：１がより好ましく、３０：７０～９０：１０が更に好ましく、５０：５０～８５：１５が特に好ましい。また、ＰＬＡだけでも使用できる。生理活性物質の均一な分散状態を実現するためには、このモル比率の選択が重要であり、ＰＬＧＡ又はＰＬＡの分子量の選択も同様に重要である。
　本発明のマイクロスフェアーに用いられるＰＬＧＡは、例えば、乳酸とグリコール酸とを、イオン交換樹脂を触媒として弱い減圧下に加熱し、縮合重合させることにより製造することができる。その際、乳酸に代えて、ラクチドを用いてもよい。ＰＬＧＡは、市販品であってもよい。市販品としては、例えば、富士フイルム和光純薬工業（株）、多木化学（株）、Ｅｖｏｎｉｃ　Ｒｏｈｍ　ＧｍｂＨ社、Ｍｅｒｃｋ社、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社等から購入することができる。
　本発明のマイクロスフェアーにおけるＰＬＧＡ又はＰＬＡの含有量は、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、１質量％以上が好ましく、３０質量％以上９５質量％以下が更により好ましく、５０質量％以上９０質量％以下が特に好ましい。
＜マイクロスフェアー＞
　本発明のマイクロスフェアーには、ＰＬＧＡ又はＰＬＡ及び生理活性物質が含まれる。更に必要に応じて、分散剤、その他の成分を含有する。マイクロスフェアー中、ＰＬＧＡ又はＰＬＡの母材中に、生理活性物質、分散剤、その他の成分等が分散されている。
［生理活性物質］
　本発明のマイクロスフェアーに含まれる生理活性物質としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、医薬化合物、機能性食品化合物、機能性化粧品化合物等が挙げられる。医薬化合物を含むマイクロスフェアーは、例えば、徐放性医薬製剤として好適に用いることができる。生理活性物質には、親油性生理活性物質及び親水性生理活性物質のいずれもが含まれる。好ましい生理活性物質として親油性生理活性物質が挙げられる。親油性生理活性物質は、例えば、水／オクタノール分配係数のｌｏｇＰ値が３以上である物質を意味し、親油性生理活性物質に含まれない生理活性物質は、親水性生理活性物質に分類される。水／オクタノール分配係数は、ＪＩＳＺ７２６０－１０７（２０００）フラスコ振とう法に準拠して測定することができる。生理活性物質は、徐放性製剤が望まれるものであれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。生理活性物質には、塩、水和物等のいずれの形態も包含される。
　本発明のマイクロスフェアー中に生理活性物質が均一に分散している。その構成を取ることで、生理活性物質の初期放出量とその後の放出期間中の放出速度が適切に制御され、生理活性物質を生体内で一定期間、継続して放出することができる。マイクロスフェアー中に生理活性物質が均一に分散していることは、マイクロスフェアー全量に対する生理活性物質の含有量で制御することができる。生理活性物質の好ましい含有量としては、生理活性物質によっても変化するが、マイクロスフェアー全量に対して、例えば、０．１～３質量％が挙げられ、好ましくは０．３～２質量％が挙げられ、より好ましくは０．３５～１．５質量％が挙げられ、更により好ましくは０．５～１．２５質量％が挙げられる。
　分散された生理活性物質の微粒子の平均体積基準粒子径は、５ｎｍ～５００ｎｍが好ましく、より好ましくは１０ｎｍ～４００ｎｍが挙げられ、更に好ましくは２０ｎｍ～２００ｎｍが挙げられる。
［分散剤］
　生理活性物質を分散させるために、分散剤を用いることができる。分散剤としては、低分子量の分散剤であってもよく、高分子量の分散剤ポリマーであってもよい。低分子量の分散剤とは、重量平均分子量が１５，０００未満の化合物を意味し、高分子量の分散剤ポリマーとは、１つ以上のモノマーの間に繰り返しの共有結合を含み、重量平均分子量が１５，０００以上の化合物を意味する。
　低分子量の分散剤としては、医薬化合物、機能性食品化合物、機能性化粧品化合物等に許容されるものであれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。具体的には、脂質類、糖類、シクロデキストリン類、アミノ酸類、有機酸類、その他の成分等が挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
　脂質類としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、中鎖又は長鎖のモノグリセリド、ジグリセリド又はトリグリセリド、リン脂質、植物油（例えば、大豆油、アボカド油、スクアレン油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油、ナタネ油、サフラワー油、ヒマワリ油等）、魚油、調味油、水不溶性ビタミン、脂肪酸、及びこれらの混合物を含み、これらの誘導体などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
　糖類としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、グルコース、マンノース、イドース、ガラクトース、フコース、リボース、キシロース、ラクトース、スクロース、マルトース、トレハロース、ツラノース、ラフィノース、マルトトリオース、アカルボース、水溶性セルロース、合成セルロース、糖アルコール、グリセリン、ソルビトール、ラクチトール、マルチトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、若しくはポリオール、又はこれらの誘導体などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
　その他の成分としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、従来、医薬に使用できるものが好ましい。
＜平均体積基準粒子径＞
　本発明のマイクロスフェアーの平均体積基準粒子径は、１μｍ以上１５０μｍ以下であり、１０μｍ以上１００μｍ以下が好ましく、２０μｍ以上７５μｍ以下がより好ましい。平均体積基準粒子径は、レーザー回折式粒度分布測定装置を用いて測定することができる。本発明においては、平均体積基準粒子径が、１５０μｍを超えると、マイクロスフェアー内の生理活性物質の分散不均一性によって初期バーストの問題が発生し、凝集や沈降し易くなり、後工程の処理も難しくなる。１μｍより小さくなると著しく初期バーストの問題が発生する。
　本発明のマイクロスフェアーによって、生理活性物質の初期放出量とその後の放出期間中の放出速度が適切に制御され、生理活性物質を生体内で一定期間、継続して放出することができる。
２．徐放性製剤
　本発明のマイクロスフェアーを用いて、マイクロスフェアーを含有する徐放性製剤を調製することができる。本発明の徐放性製剤によって、生理活性物質の初期放出量とその後の放出期間中の放出速度が適切に制御され、生理活性物質を生体内で一定期間、継続して放出し、有効に薬理学的効果を示すことができる。
　本発明の徐放性製剤は、そのまま筋肉内、皮下、血管、臓器、関節腔、腫瘍などの病巣等に容易に注射剤及び埋め込み剤として、又は経皮剤として投与することができる。その他種々の製剤形態として投与することもできる。例えば、本発明の徐放性製剤を注射剤とするには、分散剤（Ｔｗｅｅｎ８０、ＨＣＯ－６０、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム等）、保存剤（メチルパラベン、プロピルパラベン等）、等張化剤（塩化ナトリウム、マンニトール、ソルビトール、ブドウ糖等）などと共に水性懸濁剤とするか、大豆油、ゴマ油、コーン油などの植物油と共に分散して油性懸濁剤として、徐放性注射剤とする。
３．マイクロスフェアーの製造方法
＜マイクロスフェアーの製造工程＞
　本発明のマイクロスフェアーの製造方法は、粒子形成工程を少なくとも含み、更に必要に応じて、ろ過滅菌工程、良溶媒除去工程、その他の工程等を含んでもよい。
［粒子形成工程］
　粒子形成工程は、特開２００９－１３２８７１号公報又は特開２０１１－１８９３４８号公報に記載の接近離反可能な対向して配設された、少なくとも一方が他方に対して相対的に回転する複数の処理用面の間で粒子化処理がなされる粒子化処理装置を用いることが好ましい。粒子形成工程は、例えば、前記の粒子化処理装置を用いて、ＰＬＧＡ又はＰＬＡの良溶媒にＰＬＧＡ又はＰＬＡ及び生理活性物質を溶解又は分散させて得られるＰＬＧＡ又はＰＬＡ及び生理活性物質の溶液と、ＰＬＧＡ又はＰＬＡの貧溶媒を含む溶液とを連続投入して、乳化粒子を作製し、作製された粒子から良溶媒を除去することによって、本発明のマイクロスフェアーを析出させることで実施される。ここで、「分散」とは、生理活性物質を固体のまま、ＰＬＧＡ又はＰＬＡの良溶媒に分散させること、生理活性物質をＰＬＧＡ又はＰＬＡの良溶媒に乳化させること、親水性生理活性物質の水性溶液とＰＬＧＡ又はＰＬＡの良溶媒を含むｗ／ｏエマルションを形成させること等を含む。
　ＰＬＧＡ又はＰＬＡ及び生理活性物質の溶液としては、ＰＬＧＡ又はＰＬＡの良溶媒にＰＬＧＡ又はＰＬＡ及び生理活性物質が溶解又は分散している溶液であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。良溶媒としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ハロゲン化脂肪族炭化水素、脂肪族エステル、アルコール、ケトン、エーテル、アセトニトリルなどが挙げられる。ハロゲン化脂肪族炭化水素としては、例えば、ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素、クロロエタン、２，２，２－トリクロロエタンなどが挙げられる。脂肪族エステルとしては、例えば、酢酸エチル、酢酸プロピル、酢酸ブチルなどが挙げられる。アルコールとしては、例えば、ベンジルアルコール、フェニルアルコール、ｎ－ブタノール等の水への溶解度が低いアルコールが挙げられる。ケトンとしては、例えば、炭素数３～６のケトン（例えば、アセトン、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン、シクロヘキサノン等）などが挙げられる。エーテルとしては、例えば、炭素数２～６のエーテル（例えば、ジメチルエーテル、メチルエチルエーテル、ジエチルエーテル等）などが挙げられる。水への溶解度が低い溶媒を選択するほうが、生理活性物質の含有量の観点や初期バーストを防止する目的では好ましい。好ましい良溶媒として、ハロゲン化脂肪族炭化水素、ケトン、及びこれらの混合溶媒が挙げられ、より好ましくはジクロロメタン、アセトン及びこれらの混合溶媒が挙げられる。また、これらは、１種類単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。溶媒種や混合量を変化させることにより粒子径を制御することができる。
　良溶媒とは、ＰＬＧＡ又はＰＬＡの溶解度が大きい溶媒を意味し、貧溶媒とは、ＰＬＧＡ又はＰＬＡの溶解度が小さい又は溶解しない溶媒を意味する。良溶媒及び貧溶媒は、それぞれマイクロスフェアー中の生理活性物質が偏析したり粗大粒子や凝集体を発生させないものを選択する。また、良溶媒及び貧溶媒は、例えば、２５℃における溶媒１００ｇに溶解し得るＰＬＧＡ又はＰＬＡの質量で規定することができる。本発明において、良溶媒は、ＰＬＧＡ又はＰＬＡを０．１ｇ以上溶解する溶媒であることが好ましく、より好ましくは０．２ｇ以上が挙げられ、更に好ましくは０．５ｇ以上が挙げられる。貧溶媒は、ＰＬＧＡ又はＰＬＡを０．０５ｇ以下しか溶解しない溶媒であることが好ましく、より好ましくは０．０２ｇ以下が挙げられ、更に好ましくは０．０１ｇ以下が挙げられる。貧溶媒としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、水が好ましい。
　ＰＬＧＡ又はＰＬＡ及び生理活性物質の溶液中のＰＬＧＡ又はＰＬＡの含有量は、良溶媒に応じて、目的とするマイクロスフェアーの粒子径に応じて、またマイクロスフェアー中に生理活性物質が均一に分散するように、変化させることができる。ＰＬＧＡ又はＰＬＡの含有量は、例えば、１～３０質量％が挙げられ、好ましくは３～２０質量％が挙げられ、より好ましくは５～１５質量％が挙げられる。ＰＬＧＡ又はＰＬＡ溶液中の生理活性物質の含有量は、目的、薬理効果等に応じて、またマイクロスフェアー中の生理活性物質が均一に分散されているように、適宜変化させることができる。
　作製したマイクロスフェアーの安定性を更に確保するため、貧溶媒に安定剤を加えてもよい。安定剤としては、特に制限は無く、目的に応じて適宜選択することができる。例えば、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、レシチン、ポリソルベート８０等が挙げられ、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）が好ましい。また、添加する安定剤の濃度は好ましくは０．０１～２０質量％が挙げられ、５質量％以下であることがより好ましい。好ましい貧溶媒としては、例えば、ＰＶＡ水溶液などが挙げられる。
　ＰＬＧＡ又はＰＬＡ及び生理活性物質の溶液並びに貧溶媒を含む溶液は、棒状、板状、プロペラ状等の種々の形状の撹拌子を槽内で回転させるものや、撹拌子に対して相対的に回転するスクリーンを備えたものなど、流体にせん断力を加えるなどして、均質な混合を実現する回転式分散機などの調製装置を用いて調製されることが望ましい。回転式分散機の好ましい例としては、特許第５１４７０９１号に開示されている撹拌機を適用することができる。マイクロスフェアー中の生理活性物質が均一に分散するためには、ＰＬＧＡ又はＰＬＡ溶液と貧溶媒を完全混合する必要がある。完全混合のために、少なくとも分子レベルでの均一化を目指す必要があり、混合が不十分であることが不均一な分散状態の原因になる。
　回転式分散機はバッチ式で行うものであっても、連続式で行うものであってもよい。連続式で行う場合には、撹拌槽に対する流体の供給と排出とを連続的に行うものであってもよく、撹拌槽を用いずに連続式のミキサーを用いて行うものであってもよく、公知の撹拌機や撹拌手段を用い、適宜撹拌エネルギーを制御することができる。なお、撹拌エネルギーに関しては、本出願人による特開平０４－１１４７２５号公報に詳述されている。本発明における撹拌の方法は特に限定されないが、各種せん断式、摩擦式、高圧ジェット式、超音波式などの撹拌機や溶解機、乳化機、分散機、ホジナイザーなどを用いて実施することができる。一例としては、ウルトラタラックス（ＩＫＡ製）、ポリトロン（キネマティカ製）、ＴＫホモミキサー（プライミクス製）、エバラマイルダー（荏原製作所製）、ＴＫホモミックラインフロー（プライミクス製）、コロイドミル（神鋼環境ソリューション製）、スラッシャー（日本コークス工業製）、トリゴナル湿式微粉砕機（三井三池化工機製）、キャビトロン（ユーロテック製）、ファインフローミル（太平洋機工製）などの連続式乳化機、クレアミックス（エム・テクニック製）、クレアミックスディゾルバー（エム・テクニック製）などのバッチ式又は連続両用乳化機が挙げられる。また、撹拌処理は、高速回転する撹拌翼を備えたものであって、撹拌翼の外側にスクリーンを備え、スクリーンの開口から流体がジェット流となって吐出する撹拌機、特に上記のクレアミックス（エム・テクニック製）やクレアミックスディゾルバー（エム・テクニック製）を用いることが望ましい。
　前記の粒子化処理装置において、回転する処理用面の停止時の接面圧を調整することにより、ＰＬＧＡ又はＰＬＡ微粒子の粒子径及び粒子径分布の制御が可能である。本発明者による実験の結果、接面圧は、好ましくは２０ｇ／ｃｍ２～２５０ｇ／ｃｍ２である。接面圧が２０ｇ／ｃｍ２より低い場合には薄膜が安定せず、粒子径分布が広くなる。接面圧が２５０ｇ／ｃｍ２より高いと目的としている粒子径の調整が難しくなることが判明した。より好ましくは５０ｇ／ｃｍ２～２００ｇ／ｃｍ２が挙げられ、さらに好ましくは８０ｇ／ｃｍ２～１５０ｇ／ｃｍ２が挙げられる。
　ＰＬＧＡ又はＰＬＡ及び生理活性物質の溶液と貧溶媒を含む溶液とが接することで形成されるマイクロスフェアーのそれぞれが合着することを防ぐことが好ましい。その合着を防ぐ方法としては、溶液吐出液回収タンクに予め貧溶媒を含む溶液を入れておき、緩やかに撹拌しておくことが好ましい。撹拌を行うことにより、マイクロスフェアーの合着がより抑制できる。撹拌については、回転式分散機が好ましく、クレアミックスディゾルバー（エム・テクニック製）が望ましい。全体を緩やかに流動させることができるものであれば特に限定するものではない。撹拌が強いと、ＰＬＧＡ又はＰＬＡの乳化粒子が壊れ、分布幅が広くなり、生理活性物質の分散状態が崩れる可能性がある。
　生理活性物質が親油性生理活性物質である場合、上記の説明に従って、粒子形成工程を好適に実施することができ、マイクロスフェアーを製造することができる。生理活性物質が親水性生理活性物質である場合、親水性生理活性物質を例えば分散剤を用いて、ＰＬＧＡ又はＰＬＡの良溶媒に分散させることで、同様に粒子形成工程を実施して、マイクロスフェアーを製造することができる。
　また、生理活性物質が親水性生理活性物質である場合、親水性生理活性物質を、必要に応じて安定剤と共に水等の水性溶媒に溶解させて、ＰＬＧＡ又はＰＬＡの良溶媒にＰＬＧＡ又はＰＬＡを溶解させた溶液と共に混合することで調製されるｗ／ｏエマルションを、ＰＬＧＡ又はＰＬＡ及び生理活性物質の溶液として用い、前記の粒子化処理装置を用いて、前記の粒子形成工程を実施することもできる。ｗ／ｏエマルションの調製には、断続振とう法、プロペラ型撹拌機、タービン型撹拌機を用いるミキサーによる方法、コロイドミル法、ホモジナイザー法、超音波照射法を用いることができる。前記の粒子化処理装置を用いて、このｗ／ｏエマルションであるＰＬＧＡ又はＰＬＡ及び生理活性物質の溶液と、ＰＬＧＡ又はＰＬＡの貧溶媒を含む溶液とを連続投入して、ｗ／ｏ／ｗエマルションとして乳化粒子を作製し、作製された粒子から良溶媒を除去することによって、本発明のマイクロスフェアーを析出させることで実施される。このマイクロスフェアーをそのまま用いることもできるが、さらに賦形剤（マンニトール、ソルビトール、ラクトース、ブドウ糖等）を加えて、再分散した後、凍結乾燥又は噴霧乾燥して固形化することもできる。この固形化したマイクロスフェアーは、使用時に、注射用蒸留水又は適当な分散媒を加えることで、より安定した徐放性注射剤が得ることができる。
［ろ過滅菌工程］
　必要に応じて、粒子形成工程の前に、調製されたＰＬＧＡ又はＰＬＡ及び生理活性物質の溶液並びに貧溶媒を含む溶液の無菌ろ過を行うことも好ましい。貧溶媒を含む溶液は親水性フィルターを用いて、ＰＬＧＡ又はＰＬＡ及び生理活性物質の溶液は疎水性フィルターを用いてろ過滅菌することができる。ろ過に用いるフィルターの孔径は０．１μｍ～０．４５μｍが好ましく、０．２μｍがより好ましい。
　前記のろ過滅菌フィルターとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。例えば、貧溶媒を含む溶液の滅菌ろ過のためには、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）やポリエーテルサルフォン等の親水性フィルターが挙げられる。ＰＬＧＡ又はＰＬＡ及び生理活性物質の溶液のろ過滅菌のためには、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）などの疎水性フィルターが挙げられる。ここに記載している材質に限定されるものではなく、薬物の吸着や溶媒種により選定を行う必要がある。
［良溶媒除去工程］
　良溶媒除去工程において、ＰＬＧＡ又はＰＬＡ及び生理活性物質を含む前記乳化粒子から良溶媒を除去する。良溶媒除去工程は、マイクロスフェアー中の生理活性物質が均一に分散した状態で、前記乳化粒子を含有する液から前記良溶媒を除去することができれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。例えば、撹拌しながら前記液を加熱すること、前記液の液面に窒素などのガスをフローすること、及び前記液を減圧させることの少なくともいずれかにより、前記良溶媒を蒸発させて前記液から除去する方法などが挙げられ、好ましくは前記液の液面に窒素などのガスをフローすることが挙げられる。マイクロスフェアー中の生理活性物質が均一に分散した状態を維持するようにするためには、良溶媒を早く除去することが好ましいことが多いが、ゆっくりと除去した方が良い場合もある。良溶媒を除去する時間としては、例えば、３０分間～１２時間が挙げられ、好ましくは１～１０時間が挙げられ、より好ましくは１～５時間が挙げられる。
　また、良溶媒除去時の温度は、良溶媒の種類による。良溶媒の沸点付近の高温から低温まで、マイクロスフェアーの断面観察をし、適正な温度で実施する必要がある。良溶媒除去の際、ＰＬＧＡ又はＰＬＡの濃度が低い場合、粒子の体積変化が大きく、その際にせっかく分散していた生理活性物質が凝集してしまうことが多く見受けられるので注意が必要である。
［その他の工程］
　その他の工程としては、例えば、溶媒組成調製、分級工程、粒子洗浄工程などが挙げられる。通常、分級工程において粗粉カットや微粉カットが行われるが、本発明において製造した粒子は、実質的に分級工程を行う必要はなくなる。但し、念のため分級工程を含んでおいても構わない。
　上記の製造方法によって、マイクロスフェアーの粒子径が１μｍ～１５０μｍ以下となり、マイクロスフェアー中の生理活性物質が均一な分散状態であるマイクロスフェアーを製造することができる。すなわち、マイクロスフェアーの粒子を切断した断面観察試料を作成し、マイクロスフェアー中の生理活性物質を確認できる倍率以上で電子顕微鏡観察し、断面画像を６分割し、分割した各々の領域の領域面積（Ａ）とその領域に含まれる前記生理活性物質の断面積の総和（ｓ）との比率（ｓ／Ａ）×１００（％）として、６分割した領域内における生理活性物質の占める面積比率の変動係数が０．３５以下であるマイクロスフェアーを製造することができる。
　以下、本発明の実施例について説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。
（参考例１）
　参考例１で、生理活性物質を含まないマイクロスフェアー（ＰＬＧＡ微粒子）を作製した。参考例１のマイクロスフェアーを指標に用いて、実施例及び比較例のマイクロスフェアーの断面をＳＥＭ画像で観察することで、実施例及び比較例のマイクロスフェアー中の生理活性物質の分散状態を、以下で確認した。
＜ＰＬＧＡ溶液とＰＶＡ水溶液の調製＞
　乳酸・グリコール酸共重合体（Ｒｅｓｏｍｅｒ　ＲＧ５０４，エボニック製）が１３質量％なるようにジクロロメタン（関東化学製）を加え、高速回転式分散機クレアミックスディゾルバー（エム・テクニック製）を用いて溶解させ、ＰＬＧＡ溶液を得た。その後、０．２μｍのベントフィルター（φ６２，メルク製）でろ過を行った。ポリビニルアルコール（ＰＶＡ，ＥＧ－４０Ｐ，日本合成化学工業製）が１．５質量％となるようにイオン交換水を加え、高速回転式分散機クレアミックス（エム・テクニック製）を用いて溶解させ、ＰＶＡ水溶液を得た。その後、親水性ＰＶＤＦメンブレンフィルター（φ４７，メルク製）でろ過を行った。ＰＬＧＡ乳化粒子を回収するタンクに予めＰＶＡ水溶液を入れ、液面が動く程度に撹拌を行った。
＜マイクロスフェアー（ＰＬＧＡ微粒子）の調製＞
　粒子形成工程として、調製したＰＬＧＡ溶液とＰＶＡ水溶液とを特開２０１１－１８９３４８号公報に記載の粒子化処理装置を用いて混合した。ここで特開２０１１－１８９３４８号公報に記載の粒子化処理装置とは、同公報の図２５に記載の装置であって、第２導入口ｄ２０がリング状ディスクである処理用面２の中央の開口を取り巻く同心円状の円環形状であるものであり、ディスク直径は７５ｍｍである。具体的には、調製されたＰＶＡ水溶液を第１導入部ｄ１から処理用面１、２間に、０．０２ＭＰａＧ、６５ｍＬ／分、３０℃で導入し、処理用部１０を２０００ｒｐｍで回転させながら、調製されたＰＬＧＡ溶液を第２導入部ｄ２から処理用面１、２間に、０．６５ＭＰａＧ、２０ｍＬ／分、３０℃で導入して、ＰＶＡ水溶液とＰＬＧＡ溶液とを強制薄膜中で混合し、処理用面１、２間においてジクロロメタンを含むＰＬＧＡ乳化粒子を作製した。処理用面１、２間におけるＰＬＧＡ乳化粒子を含む流体（以下、ＰＬＧＡ乳化粒子分散液）を粒子化処理装置の処理用面１、２間から吐出させた。吐出させたＰＬＧＡ乳化粒子分散液を、回収タンクに回収した。
　次に脱溶媒工程として、前記吐出液をクレアミックスディゾルバー（エム・テクニック製）を用いて周速度４．７ｍ／秒で撹拌しながら、アルゴンガスを液面に吹き付けるようフローして３．５時間かけてジクロロメタンを除去し、ＰＬＧＡ微粒子を含む懸濁液（ＰＬＧＡ微粒子懸濁液）を得た。得られたＰＬＧＡ微粒子の平均体積基準粒子径は３４．０μｍであり、代表的な粒子を液体窒素により凍結後、ＦＩＢ断面を作成し、ＳＥＭ画像（図４）を観察した。
　図４の通り、上記のＦＩＢ断面に粒子状の塊及び空孔がないことが確認された。また、参考例１のマイクロスフェアーの断面が、実施例及び比較例のマイクロスフェアーの断面の観察における指標として用いることができることが解った。
（実施例１）
＜ＰＬＧＡ及び生理活性物質の溶液とＰＶＡ水溶液の調製＞
　乳酸・グリコール酸共重合体（Ｒｅｓｏｍｅｒ　ＲＧ７５２Ｈ，エボニック製）が１０質量％に、生理活性物質としてクルクミン（富士フイルム和光純薬製，和光特級）が０．５質量％になるようにジクロロメタン（関東化学製）６４．５質量％とアセトン（関東化学製）２５質量％を加え、高速回転式分散機クレアミックスディゾルバー（エム・テクニック製）を用いて溶解させ、ＰＬＧＡ及び生理活性物質の溶液を得た。その後、０．２μｍのエアベントフィルター（φ６２，メルク製）でろ過を行った。ＰＶＡ水溶液は、参考例１と同様にして調製した。ＰＬＧＡ及び生理活性物質の乳化粒子を回収するタンクに予めＰＶＡ水溶液を入れ、液面が動く程度に撹拌を行った。
＜マイクロスフェアーの調製＞
　粒子形成工程として、参考例１と同様にして、調製されたＰＬＧＡ及び生理活性物質の溶液とＰＶＡ水溶液とを、特開２０１１－１８９３４８号公報に記載の粒子化処理装置を用いて混合した。具体的には、調製されたＰＶＡ水溶液を第１導入部ｄ１から処理用面１、２間に、０．０ＭＰａＧ、５０ｍＬ／分、２５℃で導入し、処理用部１０を５０００ｒｐｍで回転させながら、調製されたＰＬＧＡ及び生理活性物質の溶液を第２導入部ｄ２から処理用面１、２間に、０．３ＭＰａＧ、１６ｍＬ／分、２５℃で導入して、ＰＶＡ水溶液とＰＬＧＡ及び生理活性物質の溶液とを強制薄膜中で混合し、処理用面１、２間においてジクロロメタンを含むＰＬＧＡ及び生理活性物質の乳化粒子を作製した。処理用面１、２間におけるＰＬＧＡ及び生理活性物質の乳化粒子を含む流体（以下、ＰＬＧＡ及び生理活性物質の乳化粒子分散液）を粒子化処理装置の処理用面１、２間から吐出させた。吐出させたＰＬＧＡ及び生理活性物質の乳化粒子分散液を捕集するためのＰＬＧＡ及び生理活性物質の乳化粒子分散液を、０．０３ＭＰａＧで圧力保持した回収タンクに回収した。
　次に脱溶媒工程として、前記吐出液をクレアミックスディゾルバー（エム・テクニック製）を用いて周速度４．７ｍ／秒で撹拌しながら、アルゴンガスを液面に吹き付けるようフローして３．５時間かけてジクロロメタンとアセトンを除去し、マイクロスフェアーを含む懸濁液（マイクロスフェアー懸濁液）を得た。得られたマイクロスフェアーの平均体積基準粒子径は７．５μｍであり、代表的な粒子を液体窒素により凍結後、ＦＩＢ断面を作成し、ＳＥＭ画像（図６－１）を観察した。得られたＳＥＭ画像の粒子断面をｉＴＥＭ（ＴＥＭカメラ制御、画像解析ソフトウェア、ＥＭＳＩＳ社製）を用いてピクセル範囲３×３で平均化処理後に、エッジ部分を強調する処理を行い、コントラストの最適化を行った。その後、２値化処理を行い、画像処理でノイズ除去及びコントラストの低い粒子の強調処理を行った後に、再度ピクセル範囲３×３で平均化処理後にエッジ部分を強調する処理を行った。画像上で粒子断面を最大直径の中心点を中心にして６０度ごとに６分割（領域１～領域６）した画像を図６－２に示す。
　図６－２のクルクミン粒子のＦＩＢ断面における分割した各々の領域の領域面積（Ａ）とその領域に含まれる前記生理活性物質の断面積の総和（ｓ）との比率（ｓ／Ａ）×１００（％）における変動係数は０．１６１であった。
（実施例２）
　乳酸・グリコール酸共重合体（Ｒｅｓｏｍｅｒ　ＲＧ５０４，エボニック製）の代わりにポリ乳酸（Ｒｅｓｏｍｅｒ　Ｒ２０２Ｈ）を用いた以外は、実施例1と同様にして、マイクロスフェアーを含む懸濁液を調製した。得られたマイクロスフェアーの平均体積基準粒子径は７．３μｍであり、代表的な粒子を液体窒素により凍結後、ＦＩＢ断面を作成し、ＳＥＭ画像を観察した。
　観察したＳＥＭ画像を実施例１と同じ方法で画像解析を行ったところ、分割した各々の領域の領域面積（Ａ）とその領域に含まれる前記生理活性物質の断面積の総和（ｓ）との比率（ｓ／Ａ）×１００（％）における変動係数は０．２１４であった。
（実施例３）
　乳酸・グリコール酸共重合体（Ｒｅｓｏｍｅｒ　ＲＧ５０４，エボニック製）が１３質量％に、生理活性物質としてプロゲステロン（シグマアルドリッチ製）が１．０質量％になるようにジクロロメタン（関東化学製）を加え、高速回転式分散機クレアミックスディゾルバー（エム・テクニック製）を用いて溶解させ、ＰＬＧＡ及び生理活性物質の溶液を得た。その後、０．２μｍのエアベントフィルター（φ６２，メルク製）でろ過を行った。ＰＶＡ水溶液は、参考例１と同様にして調製した。ＰＬＧＡ及び生理活性物質の乳化粒子を回収するタンクに予めＰＶＡ水溶液を入れ、液面が動く程度に撹拌を行った。
＜マイクロスフェアーの調製＞
　粒子形成工程として、参考例１と同様にして、調製されたＰＬＧＡ及び生理活性物質の溶液とＰＶＡ水溶液とを、特開２０１１－１８９３４８号公報に記載の粒子化処理装置を用いて混合した。具体的には、調製されたＰＶＡ水溶液を第１導入部ｄ１から処理用面１、２間に、０．０ＭＰａＧ、５０ｍＬ／分、３０℃で導入し、処理用部１０を１７００ｒｐｍで回転させながら、調製されたＰＬＧＡ及び生理活性物質の溶液を第２導入部ｄ２から処理用面１、２間に、０．３５ＭＰａＧ、１６ｍＬ／分、３０℃で導入して、ＰＶＡ水溶液とＰＬＧＡ及び生理活性物質の溶液とを強制薄膜中で混合し、処理用面１、２間においてジクロロメタンを含むＰＬＧＡ及び生理活性物質の乳化粒子を作製した。処理用面１、２間におけるＰＬＧＡ及び生理活性物質の乳化粒子を含む流体（以下、ＰＬＧＡ及び生理活性物質の乳化粒子分散液）を粒子化処理装置の処理用面１、２間から吐出させた。吐出させたＰＬＧＡ及び生理活性物質の乳化粒子分散液を捕集するためのＰＬＧＡ及び生理活性物質の乳化粒子分散液を、０．０２ＭＰａＧで圧力保持した回収タンクに回収した。
　実施例１及び２と同じ方法で脱溶媒工程を行い、得られたマイクロスフェアーの平均体積基準粒子径は３４．８μｍであり、代表的な粒子を液体窒素により凍結後、ＦＩＢ断面を作成し、ＳＥＭ画像（図７－１）を観察した。
　観察したＳＥＭ画像を実施例１及び２と同じ方法で画像解析を行った。拡大して２値化処理後のＳＥＭ断面を図７－２に示す。最大直径の中心点を中心にして６０度ごとに６分割した各々の領域の領域面積（Ａ）とその領域に含まれる前記生理活性物質の断面積の総和（ｓ）との比率（ｓ／Ａ）×１００（％）における変動係数は０．０５６であった。
（実施例４）
　乳酸・グリコール酸共重合体（Ｒｅｓｏｍｅｒ　ＲＧ５０４，エボニック製）が１３質量％に、生理活性物質としてプロブコール（富士フイルム和光純薬製、生化学用）が１.０質量％になるようにジクロロメタン（関東化学製）を加え、高速回転式分散機クレアミックスディゾルバー（エム・テクニック製）を用いて溶解させ、ＰＬＧＡ及び生理活性物質の溶液を得た。その後、０．２μｍのエアベントフィルター（φ６２，メルク製）でろ過を行った。ＰＶＡ水溶液は、参考例１と同様にして調製した。ＰＬＧＡ及び生理活性物質の乳化粒子を回収するタンクに予めＰＶＡ水溶液を入れ、液面が動く程度に撹拌を行った。
　実施例１～３と同じ方法で脱溶媒工程を行い、得られたマイクロスフェアーの平均体積基準粒子径は３２．５μｍであり、代表的な粒子を液体窒素により凍結後、ＦＩＢ断面を作成し、ＳＥＭ画像（図８－１）を観察した。
　観察したＳＥＭ画像を実施例１～３と同じ方法で画像解析を行った。２値化処理後のＳＥＭ断面を図８－２に示す。最大直径の中心点を中心にして６０度ごとに６分割した各々の領域の領域面積（Ａ）とその領域に含まれる前記生理活性物質の断面積の総和（ｓ）との比率（ｓ／Ａ）×１００（％）における変動係数は０．２３５であった。
（比較例１）
　実施例４と同様にして、粒子形成工程として、ＰＬＧＡ及び生理活性物質の乳化粒子分散液を調製した。次に脱溶媒工程として、回収した吐出液をクレアミックスディゾルバー（エム・テクニック製）を用いて、周速度４．７ｍ／秒で撹拌しながら、大気中で４２時間かけてジクロロメタンを除去し、マイクロスフェアーを含む懸濁液（マイクロスフェアー懸濁液）を得た。得られたマイクロスフェアーの平均体積基準粒子径は３１．８μｍであり、代表的な粒子を液体窒素により凍結後、ＦＩＢ断面を作成し、ＳＥＭ画像を観察した。
　観察したＳＥＭ画像を実施例１～３と同じ方法で画像解析を行った。２値化処理後のＳＥＭ断面を図９に示す。最大直径の中心点から半径を６等分して同心円状に６分割した各々の領域の領域面積（Ａ）とその領域に含まれる前記生理活性物質の断面積の総和（ｓ）との比率（ｓ／Ａ）×１００（％）における変動係数は０．４６８であった。
（比較例２）
　実施例４と同じ処方で、ＰＬＧＡと薬物の溶解をプロペラ式の撹拌機（スリーワンモーター製）で１０分撹拌することに変更して、実施例４と同じ条件で粒子形成工程と脱溶媒工程を行って、マイクロスフェアーを含む懸濁液を調製した。得られたマイクロスフェアーの平均体積基準粒子径は２９.８μｍであり、代表的な粒子を液体窒素により凍結後、ＦＩＢ断面を作成し、ＳＥＭ画像（図１０）を観察した。
　観察したＳＥＭ画像を実施例１～４と同じ方法で画像解析を行い、最大直径の中心点を中心にして６０度ごとに６分割した各々の領域の領域面積（Ａ）とその領域に含まれる前記生理活性物質の断面積の総和（ｓ）との比率（ｓ／Ａ）×１００（％）における変動係数は０．３５７であった。
（比較例３）
　乳酸・グリコール酸共重合体（Ｒｅｓｏｍｅｒ　ＲＧ５０４，エボニック製）が５.０質量％に、生理活性物質としてクルクミン（富士フイルム和光純薬製，和光特級）が０．２５質量％になるようにジクロロメタン（関東化学製）６９．７５質量％とアセトン（関東化学製）２５質量％を加え、高速回転式分散機クレアミックスディゾルバー（エム・テクニック製）を用いて溶解させ、ＰＬＧＡ及び生理活性物質の溶液を得た。その後、０．２μｍのエアベントフィルター（φ６２，メルク製）でろ過を行った。ＰＶＡ水溶液は、参考例１と同様にして調製した。ＰＬＧＡ及び生理活性物質の乳化粒子を回収するタンクに予めＰＶＡ水溶液を入れ、液面が動く程度に撹拌を行った。
　実施例１と同じ条件で粒子形成工程と脱溶媒工程を行って、マイクロスフェアーを含む懸濁液を調製した。得られたマイクロスフェアーの平均体積基準粒子径は６．８μｍであり、代表的な粒子を液体窒素により凍結後、ＦＩＢ断面を作成し、ＳＥＭ画像（図１１）を観察した。
　観察したＳＥＭ画像を実施例１～４と同じ方法で画像解析を行い、最大直径の中心点を中心にして６０度ごとに６分割した各々の領域の領域面積（Ａ）とその領域に含まれる前記生理活性物質の断面積の総和（ｓ）との比率（ｓ／Ａ）×１００（％）は、における変動係数は０．３８６であった。
（比較例４）
　乳酸・グリコール酸共重合体（Ｒｅｓｏｍｅｒ　ＲＧ５０４，エボニック製）が５.０質量％に、生理活性物質としてプロゲステロン（シグマアルドリッチ製）が０．３質量％になるようにジクロロメタン（関東化学製）６９．５質量％とアセトン（関東化学製）２５質量％を加え、高速回転式分散機クレアミックスディゾルバー（エム・テクニック製）を用いて溶解させ、ＰＬＧＡ及び生理活性物質の溶液を得た。その後、０．２μｍのエアベントフィルター（φ６２，メルク製）でろ過を行った。ＰＶＡ水溶液は、参考例１と同様にして調製した。ＰＬＧＡ及び生理活性物質の乳化粒子を回収するタンクに予めＰＶＡ水溶液を入れ、液面が動く程度に撹拌を行った。
　実施例３と同じ条件で粒子形成工程と脱溶媒工程を行って、マイクロスフェアーを含む懸濁液を得た。得られたマイクロスフェアーの平均体積基準粒子径は２１．６μｍであり、代表的な粒子を液体窒素により凍結後、ＦＩＢ断面を作成し、ＳＥＭ画像（図１２）を観察した。
　観察したＳＥＭ画像を実施例１～４と同じ方法で画像解析を行い、最大直径の中心点を中心にして６０度ごとに６分割した各々の領域の領域面積（Ａ）とその領域に含まれる前記生理活性物質の断面積の総和（ｓ）との比率（ｓ／Ａ）×１００（％）における変動係数は１．０９４であった。
　表１に実施例１～４、比較例１～４及び参考例１（ＰＬＧＡのみ）の条件の一部を示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　表２に実施例１～４及び比較例１～４とリュープリンの代表的な粒子径のマイクロスフェアー各領域における面積比率％、標準偏差、平均値及び変動係数（ＣＶ値）を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　表１及び表２から分かる通り、実施例１と実施例２では、ＰＬＧＡとＰＬＡのいずれを用いても粒子内の各領域の生理活性物質の占める面積比率の変動係数は０．３５以下となり、粒子内の生理活性物質の分布は均一であった。比較例３では、粒子精製工程と脱溶媒工程は実施例１と同条件にも関わらず、ＰＬＧＡ濃度を低下させると粒子内の均一性が低下し、各領域の生理活性物質の占める面積比率の変動係数が０．３８６と大きくなった。
　実施例４と比較例１では、乾燥条件及び乾燥時間の違いにより、生理活性物質の微粒子の粒子径が変化し、乾燥時間が長いものでは粒子内に分布する生理活性物質の均一性が低下し、各領域の生理活性物質の占める面積比率の変動係数が０．４６８と大きくなった。実施例に比較してＰＬＧＡと薬物の濃度を下げた比較例３と４では、乾燥時の収縮率が大きくなり、粒子内の生理活性物質に偏りが生じ、各領域の生理活性物質の占める面積比率の変動係数が０．３５を上回った。
　本発明によって、生理活性物質の初期放出量とその後の放出期間中の放出速度が適切に制御され、生理活性物質を生体内で一定期間、継続して放出することができるマイクロスフェアーを提供することができる。

Claims (5)

  1. 　生理活性物質が均一に分散された乳酸・グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）又はポリ乳酸（ＰＬＡ）を主成分とするマイクロスフェアーであって、
    　前記マイクロスフェアーの平均体積粒子径が１μｍ以上１５０μｍ以下であり、
    　前記マイクロスフェアーを切断した断面観察試料を作成し、前記断面観察試料をマイクロスフェアー中の生理活性物質を確認できる倍率以上で電子顕微鏡観察し、前記電子顕微鏡断面観察した像を６分割し、分割した各々の領域の領域面積（Ａ）とその領域に含まれる前記生理活性物質の断面積の総和（ｓ）との比率（ｓ／Ａ）×１００（％）を算出して、６つの領域における算出された前記比率の変動係数が０．３５以下であることを特徴とするマイクロスフェアー。
  2. 　前記生理活性物質が親油性生理活性物質である、請求項１に記載のマイクロスフェアー。
  3. 　分散された前記生理活性物質の平均体積基準粒子径が５ｎｍ～５００ｎｍである、請求項１又は２に記載のマイクロスフェアー。
  4. 　前記マイクロスフェアー中の前記生理活性物質の含有量が０．３５～１．５質量％である、請求項１～３のいずれかに記載のマイクロスフェアー。
  5. 　請求項１～４のいずれかに記載のマイクロスフェアーを含有する徐放性製剤。
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