WO2021210798A1 - 글라이신 수송체를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌질환 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

글라이신 수송체를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌질환 치료용 약학적 조성물 Download PDF

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김영수
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    • C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Definitions

  • compositions for the treatment of degenerative brain disease comprising a glycine transporter as an active ingredient.
  • Degenerative brain disease is a disease in which degenerative changes appear in the nerve cells of the central nervous system, causing various symptoms such as impairment of motor and sensory functions, and inhibition of higher-order functions such as memory, learning, and computational reasoning.
  • Representative diseases include Alzheimer's disease, Parkinson's disease, and memory disorders.
  • Degenerative brain disease is characterized by rapid or slow progression of necrosis or apoptosis, resulting in neuronal cell death. Therefore, an understanding of the mechanism of neuronal death should be made for the prevention, control and development of treatments for central nervous system diseases.
  • senile plaque a peptide aggregate called senile plaque, which causes synaptic dysfunction and neuronal cell death.
  • the main component of these senile plaques is amyloid-beta with a length of 40-42 amino acids.
  • Amyloid-beta monomers are prone to self-assemble into oligomers, protofibrils and beta-sheet-rich fibers, and are associated with the pathogenesis of neurotoxicity.
  • amyloid-beta plaques Although the correlation between amyloid-beta plaques and neurotoxicity has not yet been clearly elucidated, self-assembly of amyloid-beta into intermediate oligomers or aggregates is believed to be associated with the pathogenesis of cranial nerve diseases such as Alzheimer's disease.
  • the present inventors have completed the present invention for the treatment of degenerative brain diseases by inhibiting amyloid-beta plaque production.
  • One aspect is to provide a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of degenerative brain diseases comprising a glycine transporter protein, a fragment thereof, or a nucleic acid molecule encoding them as an active ingredient.
  • Another aspect is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating degenerative brain disease, comprising a vector including a nucleic acid molecule encoding a glycine transporter protein or a fragment thereof as an active ingredient.
  • Another aspect is to provide a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of degenerative brain diseases, comprising cells transformed with a vector containing a nucleic acid molecule encoding a glycine transporter protein or a fragment thereof as an active ingredient. .
  • Another aspect is to provide a method for preventing or treating degenerative brain disease, comprising administering a glycine transporter protein, a fragment thereof, or a nucleic acid molecule encoding them to a subject in need thereof.
  • Another aspect is to provide a use of a glycine transporter protein, a fragment thereof, or a nucleic acid molecule encoding them in the preparation of a composition for preventing or treating degenerative brain disease.
  • One aspect provides a glycine transporter protein, a fragment thereof, or a pharmaceutical composition for preventing or treating degenerative brain disease comprising a nucleic acid molecule encoding them as an active ingredient.
  • the glycine transporter is a neurotransmitter transporter, and may terminate glycine signal transmission by reabsorbing glycine from the synaptic cleft back to the presynaptic neuron. Accordingly, in one embodiment, the glycine receptor may promote intracellular transport of extracellular glycine.
  • the glycine transporter may be GlyT1 (Glycine Transporter-1), and the GlyT1 may include the polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.
  • polynucleotide is a polymer of deoxyribonucleotides or ribonucleotides that exist in single-stranded or double-stranded form. It encompasses RNA genomic sequences, DNA (gDNA and cDNA) and RNA sequences transcribed therefrom, and may include analogs of natural polynucleotides unless otherwise specified.
  • the polynucleotide may include not only a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of the glycine transporter protein, but also a sequence complementary to the sequence.
  • the complementary sequence includes not only perfectly complementary sequences, but also substantially complementary sequences, which under stringent conditions known in the art, for example, a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of the protein. It refers to a sequence capable of hybridizing with the nucleotide sequence of
  • the pharmaceutical composition in one embodiment, is a pharmaceutical composition.
  • the aggregation level of the amyloid-beta or tau protein may refer to the amount (concentration) of amyloid-beta aggregates or tau protein aggregates or the ratio of amyloid-beta aggregates or tau protein aggregates to total amyloid-beta or total tau protein. .
  • the phosphorylation level of the tau protein may mean an amount (concentration) of phosphorylated tau protein or a ratio of phosphorylated tau protein to the total tau protein.
  • Human amyloid-beta is a peptide molecule containing about 36-43 amino acids, a major component of amyloid plaques expressed in the brain of Alzheimer's patients, and is known to be involved in the pathogenesis of Alzheimer's disease.
  • the amyloid-beta peptide molecule may be obtained by cleaving amyloid precursor protein (APP); UniProtKB P05067) with beta secretase and gamma secretase.
  • Amyloid-beta peptide molecules aggregate to form neurotoxic oligomers, causing degenerative brain disease.
  • the Tau protein is composed of four parts: an N-terminal overhang, a proline aggregation domain, a microorganelle binding domain and a C-terminus (Mandelkow et al., Acta. Neuropathol., 103, 26- 35, 1996), it is known that abnormal hyperphosphorylation or modification of tau in neurons of the central nervous system causes degenerative brain diseases such as Parkinson's disease and tauopathy.
  • the aggregation of the amyloid-beta may be due to glycine. Accordingly, the glycine transporter may inhibit aggregation of amyloid-beta.
  • degenerative brain disease refers to all diseases related to degenerative changes in the brain, in particular, all diseases (brain diseases) that can be caused by factors such as aggregation of amyloid-beta in the brain and/or brain neurons. It is used to describe inclusively.
  • the degenerative brain disease is dementia, Alzheimer's disease, Parkinson's disease, Huntington's disease, mild cognitive impairment, cerebral amyloid angiopathy, Down syndrome, amyloid stroke, systemic Amyloid disease, Dutch type amyloidosis, Niemann-Pick disease, senile dementia, amyotrophic lateral sclerosis, Spinocerebellar Atrophy, Tourette's Syndrome, Friedrich's ataxia ( Friedrich ⁇ s Ataxia, Machado-Joseph's disease, Lewy Body Dementia, Dystonia, Progressive Supranuclear Palsy, and Frontotemporal Dementia ) may be selected from the group consisting of, but is not limited thereto, and any disease may be a target as long as it is a disease caused by aggregation of amyloid-beta.
  • the "normal” may be an individual who does not have the above-defined “degenerative brain disease” among individuals of the same type as the subject to which the pharmaceutical composition is applied, or brain tissue or brain cells (brain neurons) isolated and/or cultured from the subject. .
  • AAV adeno-associated virus
  • the nucleotide sequence encoding the glycine transporter or fragment thereof has, for example, at least 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 100% identity to SEQ ID NO: 1
  • a nucleotide sequence having a wherein the protein encoded by the nucleotide sequence substantially retains the functional activity of the protein represented by SEQ ID NO: 1.
  • Another aspect provides a cell transformed with the AAV vector.
  • compositions for preventing or treating degenerative brain disease comprising a vector including a nucleic acid molecule encoding a glycine transporter protein or a fragment thereof as an active ingredient.
  • the vector may be any one selected from the group consisting of a plasmid vector, a cosmid vector, a bacteriophage vector, an adenoviral vector, a retroviral vector, and an adeno-associated viral vector, but is not limited thereto.
  • the adeno-associated viral vector may be any one selected from the group consisting of AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10 and AAV11, but is not limited thereto.
  • the present invention may provide an AAV vector comprising a nucleotide sequence encoding a glycine transporter or a fragment thereof.
  • the AAV vector is in the form of an AAV particle.
  • Methods for making and modifying viral vectors and viral vector particles, such as those derived from AAV, are well known in the art.
  • An AAV vector may comprise an AAV genome or a fragment or derivative thereof.
  • the AAV genome is a polynucleotide sequence, which encodes the functions necessary for the production of AAV particles. These functions include those that act in the replication and packaging cycle of AAV in host cells, including encapsidation of the AAV genome into AAV particles.
  • Naturally occurring AAVs are replication-deficient and depend on the provision of in-trans helper functions to complete replication and packaging cycles.
  • the AAV genome may be in single-stranded form, either positive or negative-sense, or alternatively may be in double-stranded form. The use of the double-stranded form allows to bypass the DNA replication step in the target cell, thus accelerating transgene expression.
  • the AAV genome may be from any naturally derived serotype, isolate or clade of AAV.
  • the AAV genome may be the complete genome of a naturally occurring AAV.
  • naturally occurring AAVs can be classified according to various biological systems.
  • AAVs are referred to in terms of their serotypes.
  • Serotypes correspond to variant subspecies of AAV, which, because of the expression profile of the capsid surface antigen, have unique reactivity that can be used to distinguish them from other variant subspecies.
  • viruses with a particular AAV serotype do not cross-react efficiently with neutralizing antibodies specific for any other AAV serotype.
  • AAV serotypes include recombinant serotypes such as AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10 and AAV11, and also recently identified Rec2 and Rec3 in the primate brain. Any of these AAV serotypes may be used in the present invention.
  • AAV may also be referred to in reference to a clade or clone. It refers to a phylogenetic relationship of naturally occurring AAVs and typically refers to a phylogenetic group of AAVs that can be traced back to a common ancestor and includes all of its descendants. Additionally, AAV may be referred to in reference to a particular isolate, ie, a genetic isolate of a particular AAV found in nature. The term genetic isolate defines a distinct population recognizable at the genetic level by describing a population of AAVs that have undergone limited genetic admixture with other naturally occurring AAVs.
  • the adeno-associated virus (AAV) vector is prepared by introducing materials capable of making a virus into a specific cell, and the expression vector containing the nucleic acid according to the present invention is prepared by a method known in the art, for example, but not limited thereto.
  • AAV adeno-associated virus
  • an expression vector is prepared by inserting a glycine transporter into AAV, the vector is transduced into packaging cells, and the transduced packaging cells are cultured and filtered to obtain an AAV solution, which is then used
  • the glycine transporter gene can be introduced into the cells by infecting cells such as brain cells, nerve cells and/or neural progenitor cells.
  • the vector including AAV may refer to a means for expressing a target gene in a host cell.
  • the vector includes elements for expression of a target gene, and may include an origin of replication, a promoter, an operator, a transcription termination sequence, and the like, into the genome of a host cell. Appropriate enzymatic sites (eg, restriction enzyme sites) for introduction of and/or ribosome binding sites (RBS) for translation into selectable markers and/or proteins to confirm successful introduction into host cells, IRES (Internal Ribosome Entry Site) and the like may be additionally included.
  • the vector may further include a transcriptional control sequence (eg, enhancer, etc.) other than the promoter.
  • the polynucleotide sequence encoding the protein may be operably linked to a promoter.
  • operatively linked refers to a functional association between a nucleotide expression control sequence, such as a promoter sequence, and another nucleotide sequence, whereby the control sequence controls the transcription and/or translation of the other nucleotide sequence. will be regulated
  • the recombinant vector may be an expression vector capable of stably expressing the glycine transporter protein in a host cell.
  • the expression vector may be a conventional vector used to express a foreign protein in plants, animals or microorganisms in the art.
  • the recombinant vector can be constructed through various methods known in the art.
  • the vector may refer to an expression vector for gene therapy.
  • the viral vector may refer to a viral vector capable of delivering a therapeutic gene or genetic material to a desired cell, tissue and/or organ.
  • gene therapy refers to a method of normalizing the function by inserting a normal gene into a cell having a genetic abnormality or providing a new function in order to treat various genetic diseases caused by a genetic abnormality.
  • the recombinant vector or recombinant cell of the present invention can prevent or treat degenerative brain disease by expressing the glycine transporter gene.
  • compositions for the prevention or treatment of degenerative brain disease comprising a cell transformed with a vector containing a nucleic acid molecule encoding a glycine transporter protein or a fragment thereof as an active ingredient.
  • transformation refers to a change in the genetic properties of an organism by DNA given from the outside, that is, when DNA, which is a type of nucleic acid extracted from a cell of a certain lineage of an organism, is introduced into a living cell of another lineage. may mean a phenomenon in which the genotype changes by entering the cell.
  • the transformed cell may be a stem cell, a progenitor cell, or an animal cell, but is not limited thereto.
  • the stem cells may be specifically embryonic stem cells, adult stem cells or induced pluripotent stem cells (induced pluripotent stem cell, iPS), but is not limited thereto, and stem cells differentiated from the stem cells, such as embryonic stem Cell-derived mesenchymal stem cells, induced pluripotent stem cells-derived mesenchymal stem cells, and may include all of the induced pluripotent stem cell-derived neural stem cells.
  • the cells may be autologous or heterologous, or allogeneic or xenogenic.
  • treatment refers to alleviation or amelioration of pathological symptoms, reduction of the site of disease, delay or alleviation of disease progression, amelioration, alleviation or stabilization of disease state or symptoms, partial or complete recovery, prolongation of survival, or other It is used in the meaning of including all beneficial treatment results and the like.
  • prevention is used to include all mechanisms and/or effects that act on a subject not having a specific disease to prevent the onset of the specific disease, delay the onset of the disease, or reduce the incidence of the disease.
  • composition may refer to a molecule or compound that confers some beneficial effect upon administration to a subject.
  • Advantageous effects include enabling diagnostic decisions; amelioration of a disease, symptom, disorder or condition; reducing or preventing the onset of a disease, symptom, disorder or condition; and responding to a disease, symptom, disorder or condition in general.
  • the pharmaceutical composition in addition to the active ingredient, a pharmaceutically acceptable carrier, excipient, diluent, filler, extender, wetting agent, disintegrant, emulsifier (surfactant), lubricant, sweetener, flavoring agent, suspending agent, preservative, etc. It may further include one or more adjuvants selected from the group consisting of.
  • the adjuvant may be appropriately adjusted according to the dosage form to which the pharmaceutical composition is applied, and one or more of all adjuvants that can be commonly used in the pharmaceutical field may be selected and used.
  • the pharmaceutically acceptable carrier is commonly used for drug formulation, and includes saline, sterile water, Ringer's solution, buffered saline, dextrose solution, maltodextrin solution, glycerol, ethanol, liposomes, and these components.
  • saline sterile water
  • Ringer's solution buffered saline
  • dextrose solution maltodextrin solution
  • glycerol glycerol
  • liposomes and these components.
  • One or more of the components may be mixed and used, and other conventional additives such as antioxidants, buffers, and bacteriostats may be added as needed.
  • diluents, dispersants, surfactants, binders, and lubricants may be additionally added to form injectable formulations such as aqueous solutions, suspensions, emulsions, pills, capsules, granules or tablets, and may act specifically on target organs.
  • a target organ-specific antibody or other ligand may be used in combination with the carrier. Furthermore, it can be preferably formulated according to each disease or component using an appropriate method in the art or a method disclosed in Remington's Pharmaceutical Science (recent edition), Mack Publishing Company, Easton PA). have.
  • the effective amount of the active ingredient or the pharmaceutical composition may be administered orally or parenterally during clinical administration, and may be used in the form of a general pharmaceutical formulation.
  • Parenteral administration may mean administration through a route other than oral administration, such as rectal, intravenous, peritoneal, muscle, arterial, transdermal, nasal, inhalation, ocular, or subcutaneous administration.
  • the pharmaceutical composition may be formulated in a dosage form to protect the active ingredient from degradation in the stomach or to coat the active ingredient in order to prevent degradation of the active ingredient in the stomach.
  • the pharmaceutical composition of the present invention when used as a pharmaceutical, it may further contain one or more active ingredients exhibiting the same or similar function.
  • the term "active ingredient” may mean a physiologically active substance used in which the substance mentioned herein achieves the pharmacological activity (eg, treatment of degenerative brain disease) mentioned herein. and, it is distinguished from administering the above substances alone, in combination with other substances, or additionally administering the substances to treat the diseases mentioned herein. That is, the glycine transporter protein, a fragment thereof, or a nucleic acid molecule encoding them, a vector containing the nucleic acid molecule, and cells transformed with a vector containing the nucleic acid molecule are effective alone for the direct therapeutic effect of degenerative brain disease. It may be administered as a component.
  • the pharmaceutical composition may be in the form of a solution, suspension, syrup, or emulsion in an aqueous or oily medium, or may be formulated in the form of a powder, powder, granule, tablet or capsule, and additionally a dispersant or stabilizer for formulation. can do.
  • a diluent or excipient such as a filler, an extender, a binder, a wetting agent, a disintegrant, a surfactant, etc. which are usually used when formulating the pharmaceutical composition.
  • Formulations for parenteral administration may include sterile aqueous solutions, non-aqueous solutions, suspensions, emulsions, freeze-dried preparations, and suppositories.
  • Non-aqueous solvents and suspensions may include propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, and injectable esters such as ethyl oleate.
  • As the base of the suppository Witepsol, macrogol, Tween 61, cacao butter, liulinji, glycerogelatin, etc. may be used.
  • the pharmaceutical composition can be used by mixing with various pharmaceutically acceptable carriers such as physiological saline or organic solvents, and carbohydrates such as glucose, sucrose or dextran, ascorbic acid (Ascorbic acid) to increase stability or absorption acid) or Glutathione, Antioxidants, Chelating agents, Small Molecular Proteins or other Stabilizers may be used as pharmaceuticals.
  • various pharmaceutically acceptable carriers such as physiological saline or organic solvents, and carbohydrates such as glucose, sucrose or dextran, ascorbic acid (Ascorbic acid) to increase stability or absorption acid) or Glutathione, Antioxidants, Chelating agents, Small Molecular Proteins or other Stabilizers may be used as pharmaceuticals.
  • the pharmaceutical composition may be administered in a pharmaceutically effective amount.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is to be prepared in consideration of the effective amount range, and the unit dosage form formulated in this way is a specialized dosing method according to the judgment of an expert who monitors or observes the administration of the drug as needed and the individual needs. It may be used or administered several times at regular time intervals.
  • the dosage of the pharmaceutical composition may be 1 ug/kg/day to 1,OOO mg/kg/day, but is not limited thereto.
  • the daily or single dose may be formulated as one preparation in a unit dose form, formulated in an appropriate amount, or prepared by internalizing in a multi-dose container.
  • the subject may be a mammal, such as a human, cow, horse, pig, dog, sheep, goat, or cat.
  • the subject may be an individual in need of treatment of degenerative brain disease.
  • the active ingredient of the present invention is a recombinant vector
  • it may specifically contain 0.01 to 500 mg, more specifically 0.1 to 300 mg, and in the case of a recombinant virus containing the recombinant vector, specifically 10 3 ⁇ It may contain 10 12 IU (10 to 10 10 PFU), and more specifically, 10 5 to 10 10 IU, but is not limited thereto.
  • the active ingredient of the present invention is a cell, it may specifically contain 10 3 to 10 8 , more specifically, 10 4 to 10 7 , but is not limited thereto.
  • the effective dose of the composition of the present invention is 0.05 to 12.5 mg/kg of recombinant vector, 10 7 to 10 11 virus particles (10 5 to 10 9 IU)/kg, in case of recombinant virus per kg body weight, in the case of cells.
  • 10 2 to 10 5 cells / kg it may be administered 1 to 3 times a day.
  • the composition is not necessarily limited thereto, and may vary depending on the condition of the patient and the degree of onset.
  • Another aspect is the glycine transporter protein, fragment thereof or a nucleic acid molecule encoding them, a vector comprising the nucleic acid molecule, and the nucleic acid molecule to an individual in need of inhibition and/or degradation of the amyloid-beta aggregation. It provides a method for inhibiting aggregation and/or degradation of amyloid-beta, comprising administering a pharmaceutically effective amount comprising a cell transformed with a vector as an active ingredient. The method may further include, prior to the administering, identifying a subject in need of inhibition and/or degradation of amyloid-beta aggregation.
  • the glycine transporter protein a fragment thereof or a nucleic acid molecule encoding them, a vector comprising the nucleic acid molecule, the nucleic acid molecule It provides a method for inhibiting tau protein degradation (and/or aggregation inhibition) and/or tau protein phosphorylation, comprising administering a pharmaceutically effective amount comprising a cell transformed with a vector containing a cell as an active ingredient.
  • the method may further include, prior to the administering, identifying a subject in need of tau protein degradation (and/or aggregation inhibition) and/or tau protein phosphorylation inhibition.
  • the glycine transporter protein, a fragment thereof, or a nucleic acid molecule encoding them, a vector containing the nucleic acid molecule, or a vector containing the nucleic acid molecule is transformed into an individual in need of the prevention and/or treatment of the degenerative brain disease It provides a method for preventing and/or treating degenerative brain disease, comprising administering a pharmaceutically effective amount comprising cells as an active ingredient. The method may further include, prior to the administering, identifying an individual in need of prevention and/or treatment of degenerative brain disease.
  • Another aspect is a degenerative brain comprising, as an active ingredient, a glycine transporter protein, a fragment thereof or a nucleic acid molecule encoding them, a vector including the nucleic acid molecule, and cells transformed with the vector including the nucleic acid molecule as an active ingredient It provides health functional food for preventing or improving diseases.
  • Another aspect is cognitive impairment comprising, as an active ingredient, a glycine transporter protein, a fragment thereof, or a nucleic acid molecule encoding them, a vector comprising the nucleic acid molecule, and a cell transformed with a vector comprising the nucleic acid molecule Provides health functional food for prevention or improvement of memory or improvement of memory.
  • the term “cognition” may be a mental activity or process of gaining knowledge and understanding through thinking, experience, and sensation. These may include processes such as knowledge, attention, memory and working memory, judgment and evaluation, reasoning and computation, problem solving and decision-making, and understanding and generation of language.
  • the cognitive impairment is a category of mental health disorders that mainly affect learning, memory, perception and problem solving, and may include amnesia, dementia and delirium.
  • the improvement of memory may refer to improving storage, retention and recollection of memories as a result of damage to neuroanatomical structures. It may also mean improving memory impairments (including Alzheimer's disease) that may be progressive.
  • the health functional food is a food manufactured using raw materials or ingredients (hereinafter, 'functional raw materials') that are easily deficient in daily meals or have a useful function for the human body, and maintain health or prevent certain diseases or symptoms and / or any food that helps to improve, there is no particular restriction on the form of the final product.
  • the health functional food may be selected from the group consisting of various foods, beverage compositions, food additives, and the like, but is not limited thereto.
  • the content of the active ingredient contained in the health functional food is not particularly limited, depending on the type of food, desired use, etc., for example, 0.0001 to 99% by weight, 0.0001 to 95% by weight, 0.0001 to 90% by weight of the total food weight %, 0.0001 to 80% by weight, 0.0001 to 50% by weight, 0.001 to 99% by weight, 0.001 to 95% by weight, 0.001 to 90% by weight, 0.001 to 80% by weight, 0.001 to 50% by weight, 0.01 to 99% by weight, 0.01 to 95% by weight, 0.01 to 90% by weight, 0.01 to 80% by weight, 0.01 to 50% by weight, 0.1 to 99% by weight, 0.1 to 95% by weight, 0.1 to 90% by weight, 0.1 to 80% by weight, 0.1 to 50% by weight, 0.1 to 30% by weight, 0.1 to 10% by weight, 1 to 99% by weight, 1 to 95% by weight, 1 to 90% by weight, 1 to 80% by weight, 1 to 50% by weight, 1 to 30% by weight
  • the health functional food includes various nutrients, vitamins, minerals (electrolytes), flavoring agents such as synthetic or natural flavoring agents, coloring agents, thickeners (cheese, chocolate, etc.), pectic acid or its salts, alginic acid or salts thereof, It may further contain at least one selected from the group consisting of organic acids, protective colloidal thickeners, pH adjusters, stabilizers, preservatives, glycerin, alcohols, carbonation agents used in carbonated beverages, and the like.
  • the proportion of these additives is generally selected from 0.001 to about 20 parts by weight per 100 parts by weight of the total health functional food, but is not limited thereto.
  • composition comprising, as an active ingredient, a glycine transporter protein, a fragment thereof, or a nucleic acid molecule encoding them, a vector including the nucleic acid molecule, and cells transformed with a vector including the nucleic acid molecule according to an aspect, excellent amyloid -In addition to being able to achieve the inhibitory and/or decomposition effect of beta aggregation, it also decomposes (and/or inhibits aggregation) tau protein, inhibits hyperphosphorylation of tau protein, and has excellent blood-brain barrier permeability, so By making it possible to work successfully, it can be usefully applied for the prevention and/or treatment of various degenerative brain diseases related to amyloid-beta aggregation, tau protein aggregation, and/or hyperphosphorylated tau protein.
  • FIG. 1 is a tissue staining photograph showing the result of confirming the expression of GlyT1 in the brain tissue of a patient with Alzheimer's disease, and shows that the expression of GlyT1 is significantly lower in the brain region of the patient where plaques are accumulated in the hippocampus and frontal lobe compared to the control group of a normal person.
  • Figure 2 is a tissue staining photograph showing the result that the formation of amyloid-beta plaques is significantly increased by the inhibition of GlyT1 in transformed Alzheimer's dementia animals (APP/PS1 TG) in which amyloid plaques are not yet sufficiently formed.
  • GlyT2 inhibition shows that GlyT1 is specifically involved in the formation of amyloid-beta plaques as no increase in plaques is observed.
  • FIG. 3 is a tissue staining photograph showing the results of confirming the degradation of amyloid-beta plaques in transformed Alzheimer's disease animals (APP/PS1 TG) using Thioflavin S staining. Amyloid-beta aggregation by administration of AAV-GlyT1 show the decomposition effect.
  • Figure 4 is a graph showing the results of confirming the degradation of amyloid-beta plaques in transformed Alzheimer's dementia animals (APP / PS1 TG) using Thioflavin S staining, the amyloid-beta aggregation degradation effect by AAV-GlyT1 administration show;
  • the total area of amyloid-beta plaques in the cortex of the brain hemisphere and the hippocampus was significantly higher in the group administered with AAV-GlyT1 compared to TG mice administered with AAV-GFP, a negative control. shows that the value decreases.
  • Example 1 Confirmation of reduced expression of GlyT1 in brain tissue of Alzheimer's dementia patients
  • Post-mortem brain tissue of Alzheimer's dementia patients was confirmed in the frontal lobe and hippocampus of the dementia patient group and the normal control group received from the Seoul National University Brain Bank (Table 1).
  • Five tissues of the Alzheimer's dementia patient group (AD) and 5 normal controls (Non-AD) were obtained and tested by obtaining tissues of different age and sex, respectively.
  • Immunohistochemical staining was performed by sectioning the fixed brain tissue prepared in Example 1.1. to a thickness of 30 ⁇ m. The fixed tissue was reacted with 0.5% Thioflavin S solution for 10 minutes to stain A ⁇ plaques. In addition, the tissue was stained using the GlyT1 antibody. After washing twice with 50% ethanol and once with DPBS, the stained tissue was mounted on a slide glass and observed with a laser scanning confocal microscope.
  • mice Transgenic mice (APP/PS1 TG; Alzheimer's disease animal model; B6C3-Tg(APPswe, PSEN1dE)85Dbo/Mmjax) and wild-type mice were derived from Jackson Laboratory (Bar Harbor, Maine, USA).
  • APP/PS1 TG mice were crossed with wild-type mice and maintained as double hemizygotes. All genotypes were confirmed through PCR analysis using tail DNA according to standard PCR conditions of Jackson Laboratory. Mice were housed 1 per plastic cage in an animal cage, maintained at 21 ⁇ 1° C. by alternating light and dark cycles of 12 hours, and freely ingested food and water.
  • GlyT1 inhibitor (LY2365109 hydrochloride) and GlyT2 inhibitor (N-Arachidonylglycine) were orally administered daily for 4 weeks at a concentration of 10 mg/kg/day, respectively, to 7-month-old transgenic mice that had not yet sufficiently produced amyloid-beta plaques.
  • mice were anesthetized using 2% avertine (20 mg/g, i.p.). The mice were perfused with 0.9% NaCl and the brain was excised. The hemibrains were fixed overnight in 4% paraformaldehyde (pH 7.4) at 4°C.
  • Immunohistochemical staining was performed by sectioning the fixed brain tissue prepared in Example 2.3. to a thickness of 30 ⁇ m. The fixed tissue was reacted with 0.5% Thioflavin S solution for 10 minutes to stain A ⁇ plaques. After washing twice with 50% ethanol and washing once with DPBS, the stained tissue was mounted on a slide glass and observed with a laser scanning confocal microscope.
  • Example 3 Confirmation of amyloid plaque reduction effect by AAV-GlyT1 administered in cisterna magna in APP/PS1 TG mice
  • mice Transgenic mice (APP/PS1 TG; Alzheimer's disease animal model; B6C3-Tg(APPswe, PSEN1dE)85Dbo/Mmjax) and wild-type mice were derived from Jackson Laboratory (Bar Harbor, Maine, USA).
  • APP/PS1 TG mice were crossed with wild-type mice and maintained as double hemizygotes. All genotypes were confirmed through PCR analysis using tail DNA according to standard PCR conditions of Jackson Laboratory. Mice were housed 1 per plastic cage in an animal cage, maintained at 21 ⁇ 1° C. by alternating light and dark cycles of 12 hours, and freely ingested food and water.
  • AAV (AAV-GlyT1) expressing the glycine transporter (GlyT1) of SEQ ID NO: 1 was recombined according to the production method of Vigene Biosciences (Rockville, MD, USA).
  • the expression vector was prepared by inserting the GlyT1 gene into AAV having the AAV9 serotype, and then transducing the vector into packaging cells, culturing the transduced packaging cells, and filtering them to contain AAV particles. A solution was obtained, which was concentrated and purified. Then, AAV-GlyT1 was administered as cisterna magna to 5-month-old APP/PS1 TG mice at a concentration of 5 x 10 10 VP (viral particles) or 1.5 x 10 11 VP. The control group received 5 ⁇ 10 10 VP of AAV-GFP.
  • mice were anesthetized using 2% avertine (20 mg/g, i.p.). The mice were perfused with 0.9% NaCl and the brain was excised. The hemibrains were fixed overnight in 4% paraformaldehyde (pH 7.4) at 4°C.
  • Immunohistochemical staining was performed by sectioning the fixed brain tissue prepared in Example 1.3. to a thickness of 30 ⁇ m. The fixed tissue was reacted with 0.5% Thioflavin S solution for 10 minutes to stain A ⁇ plaques. After washing twice with 50% ethanol and washing once with DPBS, the stained tissue was mounted on a slide glass and observed with a laser scanning confocal microscope.
  • Example 4 Confirmation of cognitive function improvement effect by AAV-GlyT1 administered in cisterna magna in APP/PS1 TG mice
  • mice Transgenic mice (APP/PS1 TG; Alzheimer's disease animal model; B6C3-Tg(APPswe, PSEN1dE)85Dbo/Mmjax) and wild-type mice were derived from Jackson Laboratory (Bar Harbor, Maine, USA). These APP/PS1 TG mice were crossed with wild-type mice and maintained as double hemizygotes. All genotypes were confirmed through PCR analysis using tail DNA according to standard PCR conditions of Jackson Laboratory. Mice were housed 1 per plastic cage in an animal cage, maintained at 21 ⁇ 1° C. by alternating light and dark cycles of 12 hours, and freely ingested food and water.
  • AAV-GlyT1 prepared in the same manner as in 1.2 above was administered as cisterna magna to 5-month-old APP/PS1 TG mice at a concentration of 5 x 10 10 VP or 1.5 x 10 11 VP.
  • the control group received 5 ⁇ 10 10 VP of AAV-GFP.
  • the Y-shaped maze was evaluated using a maze frame made by placing three identical arms of 40 cm in length (15 cm in wall height) at an angle of 120 degrees.
  • This experiment is a behavioral experiment using the instinctive search habit of rodents, and it is a method based on the high possibility of exploring new areas.
  • the arm that was searched just before was remembered, and the higher the value of memory was, the more it did not enter the same arm.
  • a search time of 8 minutes per individual is provided, and the final result is expressed as a spontneous alteration (%) value.
  • the Y-maze test was conducted at 12 weeks after AAV-GlyT1 was administered to the transformed Alzheimer's dementia animal (APP/PS1 TG) as shown in FIG. It was confirmed that the spontaneous alteration (%) value measured relative frequency was improved close to that of the positive control group (WT, Veh) compared to the negative control group (TG, AAV-GFP).

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Abstract

글라이신 수송체를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌질환 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로, 일 양상에 따른 글라이신 수송체 단백질, 이의 단편 또는 이들을 암호화하는 핵산 분자, 상기 핵산 분자를 포함하는 벡터, 상기 핵산 분자를 포함하는 벡터로 형질전환된 세포를 유효성분으로 포함하는 조성물에 의하면, 우수한 아밀로이드-베타의 응집의 억제 및/또는 분해 효과를 달성할 수 있을 뿐만 아니라, 타우 단백질을 분해 (및/또는 응집 억제)하고, 타우 단백질의 과인산화를 억제하며, 혈뇌장벽 투과능이 우수하므로 뇌조직에 성공적으로 작용 가능하도록 하여, 아밀로이드-베타 응집, 타우 단백질 응집, 및/또는 과인산화된 타우 단백질과 관련된 다양한 퇴행성 뇌질환의 예방 및/또는 치료에 유용하게 적용될 수 있다.

Description

글라이신 수송체를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌질환 치료용 약학적 조성물
글라이신 수송체를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌질환 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
퇴행성 뇌질환은 중추신경계의 신경세포에 퇴행성 변화가 나타나면서 운동 및 감각기능의 손상, 기억, 학습, 연산 추리 등의 고차적 원인 기능의 저해와 같은 여러 가지 증상을 유발하는 질환이다. 대표적인 질환으로는 알츠하이머 질환 (Alzheimer's disease), 파킨슨 질환 (Parkinson's disease) 및 기억장애 등이 있다. 퇴행성 뇌질환은 급격히 혹은 천천히 진행되는 괴사 (necrosis)나 아폽토시스 (apoptosis)에 의한 신경세포의 사멸이 나타난다. 따라서 신경세포의 사멸기전에 대한 이해는 중추신경계 질환의 예방, 조절 및 치료법 개발을 위하여 이루어져야 한다.
한편, 퇴행성 뇌질환인 알츠하이머의 중요한 병리적 특징은 노인성 플라크 (senile plaque)라고 불리는 펩티드 응집체의 형성이며, 이는 시냅스 기능장애 및 신경세포의 사멸을 유발한다. 이러한 노인성 플라크의 주성분은 40-42 아미노산 길이의 아밀로이드-베타 (amyloid-beta)이다. 아밀로이드-베타 단량체는 올리고머, 원섬유 (protofibril) 및 베타-시트가 풍부한 섬유로 자가조립 (self-assemble)되기 쉽고, 신경 독성의 발병과 관련이 있다.
아밀로이드-베타 플라크와 신경 독성 사이의 상관관계에 대해서는 아직 명확히 밝혀진 바가 없지만, 아밀로이드-베타의 중간 올리고머 또는 응집체로의 자가 조립은 알츠하이머병과 같은 뇌신경 질환의 발병과 관련된 것으로 여겨지고 있다.
따라서, 본 발명자들은 아밀로이드-베타 플라크 생성을 억제하여 퇴행성 뇌질환의 치료를 위한 본 발명을 완성하였다.
일 양상은 글라이신 수송체 (glycine transporter) 단백질, 이의 단편 또는 이들을 암호화하는 핵산 분자를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
다른 양상은 글라이신 수송체 (glycine transporter) 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 벡터를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 글라이신 수송체 (glycine transporter) 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 벡터로 형질전환된 세포를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 글라이신 수송체 (glycine transporter) 단백질, 이의 단편 또는 이들을 암호화하는 핵산 분자를 그를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 퇴행성 뇌질환을 예방 또는 치료하는 방법을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 글라이신 수송체 (glycine transporter) 단백질, 이의 단편 또는 이들을 암호화하는 핵산 분자를 퇴행성 뇌질환 예방 또는 치료용 조성물의 제조에 사용하기 위한 용도를 제공하는 것이다.
일 양상은 글라이신 수송체 (glycine transporter) 단백질, 이의 단편 또는 이들을 암호화하는 핵산 분자를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 글라이신 수송체는 신경 전달물질 수송체로서, 시냅스 틈에서 다시 시냅스 전 뉴런으로 글라이신을 재흡수시킴으로써 글라이신 신호 전달을 종결시키는 것일 수 있다. 이에 따라, 일 구체예에 있어서, 상기 글라이신 수용체는 세포 외 글라이신의 세포 내의 수송을 촉진하는 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 글라이신 수송체는 GlyT1 (Glycine Transporter-1)인 것일 수 있고, 상기 GlyT1은 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 것일 수 있다.
본 명세서에서 용어 "폴리뉴클레오티드 (polynucleotide)"는 단일가닥 또는 이중가닥 형태로 존재하는 디옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드의 중합체이다. RNA 게놈 서열, DNA (gDNA 및 cDNA) 및 이로부터 전사되는 RNA 서열을 포괄하며, 특별하게 다른 언급이 없는 한 천연의 폴리뉴클레오티드의 유사체를 포함할 수 있다.
상기 폴리뉴클레오티드는 상기 글라이신 수송체 단백질의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열뿐만 아니라, 그 서열에 상보적인 (complementary) 서열도 포함하는 것일 수 있다. 상기 상보적인 서열은 완벽하게 상보적인 서열뿐만 아니라, 실질적으로 상보적인 서열도 포함하며, 이는 당업계에 공지된 엄격 조건 (stringent conditions) 하에서, 예를 들어, 상기 단백질의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 서열과 혼성화될 수 있는 서열을 의미한다.
일 구체예에 있어서, 상기 약학적 조성물은,
(1) 아밀로이드-베타의 응집 수준이 퇴행성 뇌질환을 갖지 않는 정상보다 높거나 높을 위험이 있는 개체;
(2) 타우 단백질의 응집 수준이 퇴행성 뇌질환을 갖지 않는 정상보다 높거나 높을 위험이 있는 개체;
(3) 타우 단백질의 인산화 수준이 퇴행성 뇌질환을 갖지 않는 정상보다 높거나 높을 위험이 있는 개체; 및
(4) 상기 (1) 내지 (3) 중 1 가지 이상에 해당하는 개체에게 투여하기 위한 것일 수 있다.
상기 아밀로이드-베타 또는 타우 단백질의 응집 수준은 아밀로이드-베타 응집체 또는 타우 단백질 응집체의 양 (농도) 또는 전체 아밀로이드-베타 또는 전체 타우 단백질에 대한 아밀로이드-베타 응집체 또는 타우 단백질 응집체의 비율을 의미할 수 있다.
상기 타우 단백질의 인산화 수준은 인산화된 타우 단백질의 양 (농도) 또는 전체 타우 단백질에 대한 인산화된 타우 단백질의 비율을 의미할 수 있다.
인간 아밀로이드-베타 (amyloid-beta)는 약 36-43개 아미노산을 포함하는 펩타이드 분자로서, 알츠하이머 환자의 뇌에서 발현되는 아밀로이드 플라크의 주된 성분으로, 알츠하이머병의 발병에 관여하는 것으로 알려져 있다. 상기 아밀로이드-베타 펩타이드 분자는 아밀로이드 전구체 단백질 (amyloid precursor protein (APP); UniProtKB P05067)을 베타 세크레타제 (beta secretase)와 감마 세크레타제 (gamma secretase)로 절단하여 얻어지는 것일 수 있다. 아밀로이드-베타 펩타이드 분자는 응집하여 신경세포 독성 올리고머를 형성하여, 퇴행성 뇌질환을 유발한다.
상기 타우 (Tau) 단백질은 N-말단 돌출 부분, 프롤린 (proline) 응집 도메인, 미세소기관 결합 도메인 및 C-말단의 4부분으로 구성되어 있으며(Mandelkow et al., Acta. Neuropathol., 103, 26-35, 1996), 중추신경계의 신경세포 속에서 타우가 비정상적으로 과인산화되거나 변형되는 경우 파킨슨병, 타우병증 (tauopathy)과 같은 퇴행성 뇌질환을 유발한다고 알려져 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 아밀로이드-베타의 응집은 글라이신 (glycine)에 의한 것일 수 있다. 이에 따라, 상기 글라이신 수송체는 아밀로이드-베타의 응집을 억제하는 것일 수 있다.
본 명세서에서 용어 "퇴행성 뇌질환"은 뇌의 퇴행성 변화와 관련된 모든 질환, 특히, 뇌 및/또는 뇌신경세포에서의 아밀로이드-베타의 응집 등의 요인에 의하여 유발될 수 있는 모든 질환 (뇌질환)을 포괄적으로 기재하기 위하여 사용된다. 일 구체예에서, 상기 퇴행성 뇌질환은 치매, 알츠하이머병 (Alzheimer's disease), 파킨슨 병, 헌팅턴 병, 경도인지장애 (mild cognitive impairment), 대뇌 아밀로이드 맥관병증, 다운증후근, 아밀로이드성 뇌졸증 (stroke), 전신성 아밀로이드병, 더취(Dutch)형 아밀로이드증, 니만-픽병, 노인성 치매, 근위축성 측삭경화증 (amyotrophic lateral sclerosis), 척수소뇌성 운동실조증 (Spinocerebellar Atrophy), 뚜렛 증후군 (Tourette`s Syndrome), 프리드리히 보행실조 (Friedrich`s Ataxia), 마차도-조셉 병 (Machado-Joseph`s disease), 루이 소체 치매 (Lewy Body Dementia), 근육긴장이상 (Dystonia), 진행성 핵상 마비 (Progressive Supranuclear Palsy) 및 전두측두엽 치매 (Frontotemporal Dementia)으로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니고, 아밀로이드-베타의 응집에 기인한 질병이라면 어느 질병이라도 대상이 될 수 있다.
상기 "정상"은 상기 약학적 조성물의 적용 개체와 동종의 개체 중에서 상기 정의한 "퇴행성 뇌질환"을 갖지 않는 개체 또는 상기 개체로부터 분리 및/또는 배양된 뇌조직 또는 뇌세포 (뇌신경세포)일 수 있다.
다른 양상은 글라이신 수송체 (glycine transporter) 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 아데노 관련 바이러스(AAV) 벡터를 제공한다.
상기 글라이신 수송체 또는 이의 단편을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은, 예를 들어, 서열번호 1과 적어도 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 단백질은 서열번호 1로 표시되는 단백질의 기능적 활성을 실질적으로 보유한다.
또 다른 양상은 상기 AAV 벡터로 형질 전환된 세포를 제공한다.
또 다른 양상은 글라이신 수송체 (glycine transporter) 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 벡터를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
일 구체예에 있어서, 상기 벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파아지 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 아데노-연관 바이러스 벡터로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 아데노-연관 바이러스 벡터는 AAV1,　AAV2,　AAV3,　AAV4,　AAV5,　AAV6,　AAV7,　AAV8,　AAV9,　AAV10 및　AAV11로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
구체적으로, 본 발명은 글라이신 수송체, 이의 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 AAV 벡터를 제공하는 것일 수 있다. 바람직하게는, AAV 벡터는 AAV 입자의 형태이다. 바이러스 벡터 및 바이러스 벡터 입자, 예를 들어, AAV로부터 유래되는 것들을 제조하고 변형시키는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다.
AAV 벡터는 AAV 게놈 또는 이의 단편 또는 유도체를 포함할 수 있다. AAV 게놈은 폴리뉴클레오티드 서열이며, 이는 AAV 입자의 생산에 필요한 기능을 인코딩한다. 이러한 기능은 AAV 게놈을 AAV 입자로 캡시드화하는 것을 포함하여, 숙주 세포에서 AAV의 복제 및 패키징 사이클에서 작용하는 것들을 포함한다. 자연 발생 AAV는 복제-결핍성이며 복제 및 패키징 사이클을 완료하기 위해 인 트랜스 (in trans) 헬퍼 기능의 제공에 의존한다. AAV 게놈은 양성 또는 음성-센스의 단일-가닥 형태이거나, 대안적으로 이중-가닥 형태일 수 있다. 이중-가닥 형태의 사용은 표적 세포에서 DNA 복제 단계를 우회할 수 있게 하므로, 트랜스진 발현을 가속시킬 수 있다.
AAV 게놈은 AAV의 임의의 자연적으로 유래된 혈청형, 분리물 또는 클레드 (clade)로부터 비롯될 수 있다. 따라서, AAV 게놈은 자연 발생 AAV의 완전한 게놈일 수 있다. 당업계에 공지된 바와 같이, 자연에서 발생하는 AAV는 다양한 생물학적 시스템에 따라 분류될 수 있다. 일반적으로, AAV는 이들의 혈청형에 관하여 지칭된다. 혈청형은 AAV의 변이체 아종에 상응하는데, 이는 캡시드 표면 항원의 발현 프로파일 때문에, 다른 변이체 아종으로부터 이를 구별하는데 사용될 수 있는 독특한 반응성을 가지고 있다. 전형적으로, 특정 AAV 혈청형을 갖는 바이러스는 임의의 다른 AAV 혈청형에 특이적인 중화 항체와 효율적으로 교차-반응하지 않는다. AAV 혈청형은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10 및 AAV11, 및 또한 최근에 영장류 뇌에서 확인된 Rec2 및 Rec3과 같은 재조합 혈청형을 포함한다. 이러한 임의의 AAV 혈청형은 본 발명에 사용될 수 있다.
AAV는 또한 클레드 또는 클론에 관하여 지칭될 수 있다. 이것은 자연적으로 유래된 AAV의 계통발생학적 관계를 지칭하며, 전형적으로 공통 조상으로 거슬러 올라갈 수 있는 AAV의 계통발생학적 그룹을 지칭하고, 이의 모든 자손을 포함한다. 추가로, AAV는 특정 분리물, 즉, 자연에서 발견되는 특정 AAV의 유전적 분리물에 관하여 지칭될 수 있다. 용어 유전적 분리물은 다른 자연 발생 AAV와 제한된 유전적 혼합을 겪은 AAV의 집단을 기술함으로써 유전적 수준에서 인지 가능한 별개의 집단을 정의한다.
당업자는 이들의 공통된 일반적인 지식에 기초하여 본 발명에 사용하기 위한 AAV의 적절한 혈청형, 클레드, 클론 또는 분리물을 선택할 수 있다.
상기 아데노 관련 바이러스 (AAV) 벡터는 특정 세포에 바이러스를 만들 수 있는 재료들을 도입하여 제작된 것이고, 본 발명에 따른 핵산을 포함하는 발현 벡터는 당업계에 공지된 방법, 예를 들어 이에 한정되지는 않으나, 일시적 형질감염 (transient transfection), 미세주사, 형질도입 (transduction), 세포융합, 칼슘 포스페이트 침전법, 리포좀 매개된 형질감염 (liposome-mediated transfection), DEAE 덱스트란-매개된 형질감염 (DEAE Dextran- mediated transfection), 폴리브렌-매개된 형질감염 (polybrene-mediated transfection), 전기침공법 (electroporation), 유전자 총 (gene gun) 및 세포 내로 핵산을 유입시키기 위한 다른 공지의 방법에 의해 세포 내로 도입할 수 있다. 예를 들어, 글라이신 수송체를 AAV에 삽입하여 발현벡터를 제작한 후, 이 벡터를 포장 (packaging) 세포에 형질도입하고, 형질도입된 포장세포를 배양한 후 여과하여 AAV 용액을 얻고, 이를 이용하여 뇌세포, 신경세포 및/또는 신경전구세포 등의 세포를 감염시킴으로써 세포에 글라이신 수송체 유전자를 도입할 수 있다.
AAV를 포함한 상기 벡터는 숙주 세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 수단을 의미하는 것일 수 있다. 상기 벡터는 목적 유전자 발현을 위한 요소 (elements)를 포함하는 것으로, 복제원점 (replication origin), 프로모터, 작동 유전자 (operator), 전사 종결 서열 (terminator) 등을 포함할 수 있고, 숙주 세포의 게놈 내로의 도입을 위한 적절한 효소 부위 (예컨대, 제한 효소 부위) 및/또는 숙주 세포 내로의 성공적인 도입을 확인하기 위한 선별 마커 및/또는 단백질로의 번역을 위한 리보좀 결합 부위 (ribosome binding site; RBS), IRES (Internal Ribosome Entry Site) 등을 추가로 포함할 수 있다. 상기 벡터는 상기 프로모터 이외의 전사 조절 서열 (예를 들어, 인핸서 등)을 추가로 포함할 수 있다.
상기 재조합 벡터에서 상기 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 프로모터에 작동적으로 연결되는 것일 수 있다. 용어 "작동적으로 연결된 (operatively linked)"은 프로모터 서열과 같은 뉴클레오티드 발현 조절 서열과 다른 뉴클레오티드 서열 사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 뉴클레오티드 서열의 전사 및/또는 해독을 조절하게 된다.
상기 재조합 벡터는, 숙주 세포 내에서 안정적으로 상기 글라이신 수송체 단백질을 발현시킬 수 있는, 발현용 벡터일 수 있다. 상기 발현용 벡터는 당업계에서 식물, 동물 또는 미생물에서 외래의 단백질을 발현하는 데 사용되는 통상의 것을 사용할 수 있다. 상기 재조합 벡터는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있다.
또한, 상기 벡터는 유전자 치료용 발현벡터를 의미하는 것일 수 있다. 이에 따라, 상기 바이러스 벡터는 원하는 세포, 조직 및/또는 기관으로 치료 유전자 또는 유전물질을 전달할 수 있는 바이러스 벡터를 의미하는 것일 수 있다. 상기 용어 "유전자 치료 (gene therapy)"는 유전자 이상에 의하여 유발되는 각종 유전병을 치료하기 위하여, 유전자 이상이 있는 세포에 정상 유전자를 삽입하거나 새로운 기능을 제공하여 그의 기능을 정상화시키는 방법을 의미하는 것일 수 있다. 이에 따라, 본 발명의 재조합 벡터 혹은 재조합 세포는 글라이신 수송체 유전자를 발현함으로써 퇴행성 뇌질환을 예방 또는 치료할 수 있다.
또 다른 양상은 글라이신 수송체 (glycine transporter) 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 벡터로 형질전환된 세포를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 명세서에서 용어 "형질전환"은 외부로부터 주어진 DNA에 의하여 생물의 유전적인 성질이 변하는 것으로, 즉 생물의 어떤 계통의 세포에서 추출된 핵산의 일종인 DNA를 다른 계통의 살아있는 세포에 도입했을 때 DNA가 그 세포에 들어가서 유전형질이 변화하는 현상을 의미하는 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 형질전환된 세포는 줄기세포, 전구세포 또는 동물세포일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 줄기세포는 구체적으로 배아줄기세포, 성체줄기세포 또는 유도만능줄기세포 (induced pluripotent stem cell, iPS)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 상기 줄기세포에서 분화된 줄기세포, 예컨대 배아줄기세포 유래의 중간엽줄기세포, 유도만능줄기세포 유래의 중간엽줄기세포, 유도만능줄기세포 유래의 신경줄기세포 등을 모두 포함하는 것일 수 있다. 또한, 상기 세포는 자가 (autologous) 또는 타가, 또는 동종이계 (allogenic) 또는 이종 (Xenogenic) 세포일 수 있다.
본 명세서에서 용어 "치료"는 병적 증상의 경감 또는 개선, 질환의 부위의 감소, 질환 진행의 지연 또는 완화, 질환 상태 또는 증상의 개선, 경감 또는 안정화, 부분적 또는 완전한 회복, 생존의 연장, 기타 다른 이로운 치료 결과 등을 모두 포함하는 의미로 사용된다. 용어 "예방"은 특정 질병을 갖지 않는 대상에게 작용하여 상기 특정 질병이 발병하지 않도록 하거나, 그 발병 시기를 늦추거나, 발병 빈도를 낮추는 모든 기작 및/또는 효과를 포함하는 의미로 사용된다.
용어 "약학적 조성물"은, 대상체로의 투여 시에 몇몇 유리한 효과를 부여하는 분자 또는 화합물을 지칭할 수 있다. 유리한 효과는 진단적 결정을 가능하게 하는 것; 질병, 증상, 장애 또는 병태의 개선; 질병, 증상, 장애 또는 질환의 발병의 감소 또는 예방; 및 일반적으로 질병, 증상, 장애 또는 병태의 대응을 포함할 수 있다.
상기 약학적 조성물은, 상기 유효성분에 더하여, 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제, 희석제, 충진제, 증량제, 습윤제, 붕해제, 유화제 (계면활성제), 윤활제, 감미제, 향미제, 현탁제, 보존제 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 보조제를 추가로 포함할 수 있다. 상기 보조제는 상기 약학적 조성물이 적용되는 제형에 따라 적절히 조절될 수 있으며, 약제학 분야에서 통상적으로 사용될 수 있는 모든 보조제들 중에서 하나 이상 선택하여 사용할 수 있다. 일 구체예에서, 상기 약학적으로 허용 가능한 담체는 약물의 제제화에 통상적으로 이용되는 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있으며, 표적 기관에 특이적으로 작용할 수 있도록 표적 기관 특이적 항체 또는 기타 리간드를 상기 담체와 결합시켜 사용할 수 있다. 더 나아가 당해 기술분야의 적정한 방법으로 또는 레밍턴의 문헌(Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.
상기 유효성분의 유효량 또는 상기 약학적 조성물은 임상투여시 경구 또는 비경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다. 비경구 투여는 직장, 정맥, 복막, 근육, 동맥, 경피, 비강 (Nasal), 흡입, 안구 또는 피하와 같은 경구 이외의 투여경로를 통한 투여를 의미할 수 있고, 병변부위 국소 투여 등으로 투여할 수 있다. 경구 투여시, 상기 약학적 조성물은 활성 성분이 위에서의 분해되지 않도록 하기 위하여 활성 성분을 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호 가능한 제형으로 제형화될 수 있다. 본 발명의 상기 약학적 조성물을 의약품으로 사용하는 경우, 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다.
또한, 본 명세서에서 용어 "유효성분"은 본 명세서에서 언급된 물질이 본 명세서에서 언급된 약리학적 활성 (예를 들면, 퇴행성 뇌질환 치료)을 달성하기 위해 사용되는 생리활성 물질을 의미하는 것일 수 있고, 이는 본 명세서에서 언급된 질병을 치료하기 위해 상기 물질을 단독 투여 하거나, 다른 물질과 함께 병용 투여, 또는 부가적으로 투여하는 것과는 구분된다. 즉, 상기 글라이신 수송체 단백질, 이의 단편 또는 이들을 암호화하는 핵산 분자, 상기 핵산 분자를 포함하는 벡터, 상기 핵산 분자를 포함하는 벡터로 형질전환된 세포는 퇴행성 뇌질환의 직접적인 치료 효과를 위한 단독의 유효성분으로 투여되는 것일 수 있다.
상기 약학적 조성물은 수성 또는 유성 매질중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 등의 형태로 제제화될 수 있으며, 제제화를 위하여 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다. 상기 약학적 조성물을 제제화할 경우에 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜 (Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (Witepsol), 마크로골, 트윈 (Tween) 61, 카카오지, 리우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
상기 약학적 조성물은 생리식염수 또는 유기용매와 같이 약제로 허용된 여러 전달체 (Carrier)와 혼합하여 사용될 수 있고, 안정성이나 흡수성을 증가시키기 위하여 글루코스, 수크로스 또는 덱스트란과 같은 탄수화물, 아스코르브산 (Ascorbic acid) 또는 글루타치온 (Glutathione)과 같은 항산화제 (Antioxidants), 킬레이트화제 (Chelating agents), 저분자 단백질 또는 다른 안정화제 (Stabilizers)들이 약제로 사용될 수 있다.
상기 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있다. 그 투여 용량에 특별한 제약은 없고, 체내 흡수도, 체중, 환자의 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 변화될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 유효량 범위를 고려하여 제조하도록 하며, 이렇게 제형화된 단위 투여형 제제는 필요에 따라 약제의 투여를 감시하거나 관찰하는 전문가의 판단과 개인의 요구에 따라 전문화된 투약법을 사용하거나 일정 시간 간격으로 수회 투여될 수 있다. 약학적 조성물의 투여량은 1일 1 ug/kg/일 내지 1,OOO mg/kg/일일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 1일 또는 1회 투여량은 단위 용량 형태로 하나의 제제로 제제화되거나, 적절하게 분량하여 제제화되거나, 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다.
상기 개체는 포유동물, 예를 들면, 사람, 소, 말, 돼지, 개, 양, 염소, 또는 고양이일 수 있다. 상기 개체는 퇴행성 뇌질환의 치유를 필요로 하는 개체일 수 있다.
본 발명의 유효성분이 재조합 벡터인 경우 구체적으로 0.01 내지 500 mg을 함유할 수 있고, 보다 구체적으로 0.1 내지 300 mg을 함유할 수 있으며, 상기 재조합 벡터를 포함하는 재조합 바이러스의 경우, 구체적으로 103~1012 IU (10 내지 1010 PFU)를 함유할 수 있고, 좀 더 구체적으로는 105 내지 1010 IU를 함유할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 유효성분이 세포인 경우, 구체적으로 103 내지 108개를 함유할 수 있고, 좀 더 구체적으로 104 내지 107개를 함유할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 조성물의 유효 용량은 체중 1㎏당 재조합 벡터의 경우에는 0.05 내지 12.5 ㎎/㎏, 재조합 바이러스의 경우에는 107 내지 1011 바이러스 입자 (105 내지 109 IU)/㎏, 세포의 경우에는 103 내지 106 세포/㎏일 수 있고, 구체적으로 재조합 벡터의 경우에는 0.1 내지 10 ㎎/㎏, 재조합 바이러스의 경우에는 108 내지 1010 입자 (106 내지 108 IU)/㎏, 세포의 경우에는 102 내지 105세포/㎏일 수 있으며, 일일 1 내지 3회 투여할 수 있다. 상기 조성은 반드시 이에 제한되는 것은 아니고, 환자의 상태 및 발병 정도에 따라 변할 수 있다.
또 다른 양상은 상기 아밀로이드-베타 응집을 억제 및/또는 분해를 필요로 하는 개체에게 상기 글라이신 수송체 단백질, 이의 단편 또는 이들을 암호화하는 핵산 분자, 상기 핵산 분자를 포함하는 벡터, 상기 핵산 분자를 포함하는 벡터로 형질전환된 세포를 유효성분으로 포함하는 약학적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 아밀로이드-베타 응집 억제 및/또는 분해 방법을 제공한다. 상기 방법은, 상기 투여하는 단계 이전에, 아밀로이드-베타 응집 억제 및/또는 분해를 필요로 하는 개체를 확인하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기 타우 단백질 분해 (및/또는 응집 억제) 및/또는 타우 단백질 인산화 억제를 필요로 하는 개체에게 상기 글라이신 수송체 단백질, 이의 단편 또는 이들을 암호화하는 핵산 분자, 상기 핵산 분자를 포함하는 벡터, 상기 핵산 분자를 포함하는 벡터로 형질전환된 세포를 유효성분으로 포함하는 약학적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 타우 단백질 분해 (및/또는 응집 억제) 및/또는 타우 단백질 인산화 억제 방법을 제공한다. 상기 방법은, 상기 투여하는 단계 이전에, 타우 단백질 분해 (및/또는 응집 억제) 및/또는 타우 단백질 인산화 억제를 필요로 하는 대상을 확인하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기 퇴행성 뇌질환의 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 개체에게 상기 글라이신 수송체 단백질, 이의 단편 또는 이들을 암호화하는 핵산 분자, 상기 핵산 분자를 포함하는 벡터, 상기 핵산 분자를 포함하는 벡터로 형질전환된 세포를 유효성분으로 포함하는 약학적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 퇴행성 뇌질환의 예방 및/또는 치료 방법을 제공한다. 상기 방법은, 상기 투여하는 단계 이전에, 퇴행성 뇌질환의 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 개체를 확인하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
또 다른 양상은 글라이신 수송체 (glycine transporter) 단백질, 이의 단편 또는 이들을 암호화하는 핵산 분자, 상기 핵산 분자를 포함하는 벡터, 상기 핵산 분자를 포함하는 벡터로 형질전환된 세포를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 개선용 건강기능성 식품을 제공한다.
또 다른 양상은 글라이신 수송체 (glycine transporter) 단백질, 이의 단편 또는 이들을 암호화하는 핵산 분자, 상기 핵산 분자를 포함하는 벡터, 상기 핵산 분자를 포함하는 벡터로 형질전환된 세포를 유효성분으로 포함하는 인지 장애의 예방 또는 개선 또는 기억력 개선용 건강기능성 식품을 제공한다.
본 명세서에서 용어 "인지"는 사고, 경험 및 감각을 통해 지식과 이해를 얻는 정신적 활동 또는 과정일 수 있다. 여기에는 지식, 주의, 기억 및 작업 기억, 판단 및 평가, 추론 및 계산, 문제 해결 및 의사 결정, 언어의 이해 및 생성과 같은 과정이 포함될 수 있다. 상기 인지 장애는 학습, 기억, 지각 및 문제 해결에 주로 영향을 끼치는 정신 건강 장애의 범주로서, 기억상실증, 치매 및 섬망 (delirium)을 포함할 수 있다.
상기 기억력 개선은 신경해부학적 구조의 손상의 결과, 기억의 저장, 보유 및 재수집을 개선하는 것을 의미할 수 있다. 또한, 진행성일 수 있는 (알츠하이머병을 포함함) 기억력 장애를 개선하는 것을 의미할 수 있다.
상기 건강 기능성 식품은 일상 식사에서 결핍되기 쉬운 영양소나 인체에 유용한 기능을 가진 원료나 성분 (이하, '기능성 원료')을 사용하여 제조한 식품으로, 건강을 유지하거나 소정의 질병 또는 증상을 예방 및/또는 개선하는데 도움을 주는 모든 식품을 의미하며, 최종 제품 형태에는 특별한 제한이 없다. 예컨대, 상기 건강 기능성 식품은 각종 식품, 음료 조성물, 식품 첨가제 등으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 건강 기능성 식품에 함유된 유효성분의 함량은 식품의 형태, 소망하는 용도 등에 따라 적절하게 특별한 제한이 없으며, 예컨대, 전체 식품 중량의 0.0001 내지 99 중량%, 0.0001 내지 95 중량%, 0.0001 내지 90 중량%, 0.0001 내지 80 중량%, 0.0001 내지 50 중량%, 0.001 내지 99 중량%, 0.001 내지 95 중량%, 0.001 내지 90 중량%, 0.001 내지 80 중량%, 0.001 내지 50 중량%, 0.01 내지 99 중량%, 0.01 내지 95 중량%, 0.01 내지 90 중량%, 0.01 내지 80 중량%, 0.01 내지 50 중량%, 0.1 내지 99 중량%, 0.1 내지 95 중량%, 0.1 내지 90 중량%, 0.1 내지 80 중량%, 0.1 내지 50 중량%, 0.1 내지 30 중량%, 0.1 내지 10 중량%, 1 내지 99 중량%, 1 내지 95 중량%, 1 내지 90 중량%, 1 내지 80 중량%, 1 내지 50 중량%, 1 내지 30 중량%, 1 내지 10 중량%, 10 내지 99 중량%, 10 내지 95 중량%, 10 내지 90 중량%, 10 내지 80 중량%, 10 내지 50 중량%, 10 내지 30 중량%, 25 내지 99 중량%, 25 내지 95 중량%, 25 내지 90 중량%, 25 내지 80 중량%, 25 내지 50 중량%, 25 내지 30 중량%, 40 내지 99 중량%, 40 내지 95 중량%, 40 내지 90 중량%, 40 내지 80 중량%, 40 내지 50 중량%, 50 내지 99 중량%, 50 내지 95 중량%, 50 내지 90 중량%, 50 내지 80 중량%, 60 내지 99 중량%, 60 내지 95 중량%, 60 내지 90 중량%, 또는 60 내지 80 중량%일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 건강 기능성 식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물 (전해질), 합성 풍미제 또는 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제, 중진제 (치즈, 초콜릿등), 펙트산 또는 그의 염, 알긴산 또는 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 추가로 함유할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 전체 건강 기능성 식품 100 중량부 당 0.001 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 발명에 대해 기술한 용어 및 방법 등은 각 발명들 간에 동일하게 적용된다.
일 양상에 따른 글라이신 수송체 단백질, 이의 단편 또는 이들을 암호화하는 핵산 분자, 상기 핵산 분자를 포함하는 벡터, 상기 핵산 분자를 포함하는 벡터로 형질전환된 세포를 유효성분으로 포함하는 조성물에 의하면, 우수한 아밀로이드-베타의 응집의 억제 및/또는 분해 효과를 달성할 수 있을 뿐만 아니라, 타우 단백질을 분해 (및/또는 응집 억제)하고, 타우 단백질의 과인산화를 억제하며, 혈뇌장벽 투과능이 우수하므로 뇌조직에 성공적으로 작용 가능하도록 하여, 아밀로이드-베타 응집, 타우 단백질 응집, 및/또는 과인산화된 타우 단백질과 관련된 다양한 퇴행성 뇌질환의 예방 및/또는 치료에 유용하게 적용될 수 있다.
도 1은 알츠하이머성 치매 환자의 뇌 조직에서 GlyT1의 발현을 확인한 결과를 나타낸 조직 염색 사진으로, 정상인 대조군에 비해 해마 및 전두엽에서 플라크가 축적된 환자 뇌 부위에서 GlyT1의 발현이 현저히 낮음을 보여준다.
도 2는 아밀로이드 플라크가 아직 충분히 형성되지 않은 형질 전환된 알츠하이머성 치매 동물 (APP/PS1 TG)에서 GlyT1의 억제에 의해 아밀로이드-베타 플라크의 형성이 현저히 증가되는 결과를 나타낸 조직 염색 사진으로, 대조군인 GlyT2 억제는 플라크의 증가가 관찰되지 않는 것으로 보아 GlyT1이 특이적으로 아밀로이드-베타 플라크의 형성에 관여함을 보여준다.
도 3은 형질 전환된 알츠하이머성 치매 동물 (APP/PS1 TG)에서 아밀로이드-베타 플라크의 분해를 Thioflavin S 염색을 이용하여 확인한 결과를 나타낸 조직 염색 사진으로, AAV-GlyT1의 투여에 의한 아밀로이드-베타 응집 분해 효과를 보여준다.
도 4는 형질 전환된 알츠하이머성 치매 동물 (APP/PS1 TG)에서 아밀로이드-베타 플라크의 분해를 Thioflavin S 염색을 이용하여 확인한 결과를 나타낸 그래프로, AAV-GlyT1 투여에 의한 아밀로이드-베타 응집 분해 효과를 보여준다; 뇌 반구의 대뇌 피질 (cortex) 부위와 해마 (hippocampus)에서의 아밀로이드-베타 플라크의 총 면적을 구한 값으로 음성대조군인 AAV-GFP를 투여한 TG mouse와 비교하여 AAV-GlyT1의 투여군에서 유의미하게 상기 값이 감소하는 것을 보여준다.
도 5는 형질 전환된 알츠하이머성 치매 동물 (APP/PS1 TG)에서 AAV-GlyT1을 투여한 후 12주째 Y-maze test (Y자 미로 평가)를 실시한 결과이고, 실험동물이 주변의 단서를 파악하여 순차적으로 미로를 들어가는 상대적 빈도를 측정한 spontaneous alteration (%)을 나타낸 값으로, 음성대조군인 AAV-GFP 투여 그룹에 비해 양성대조군인 WT-Veh 에 가깝게 기억력의 수치가 향상됨을 보여준다.
이하에서는 실시예를 들어 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하고자 하나, 이는 예시적인 것에 불과할 뿐 본 발명의 범위를 제한하고자 함이 아니다. 아래 기재된 실시예들은 발명의 본질적인 요지를 벗어나지 않는 범위에서 변형될 수 있음은 당 업자들에게 있어 자명하다.
실시예 1: 알츠하이머성 치매 환자의 뇌 조직에서GlyT1 발현 감소 확인
1.1. 사람 뇌 조직 준비
알츠하이머성 치매 환자의 사후 뇌 조직은 서울대학교 뇌은행에서 분양 받은 치매 환자군과 정상인 대조군의 전두엽 및 해마에서 확인하였다(표 1). 알츠하이머성 치매 환자군 (AD) 5개, 정상인 대조군 (Non-AD) 5개씩으로 각각 나이와 성별이 다른 조직을 얻어서 실험하였다.
Block #
(region)		 Sex Age
AD A17-12 F 75
A17-26 F 85
A18-2 F 75
A18-3 M 80
A18-15 F 93
Non-AD A18-10 M 56
A17-17 M 74
A18-17 M 75
A19-3 M 78
A19-7 M 71
A18-11 F 74
1.2. 면역 조직 화학 염색
상기 실시예 1.1.에서 준비한 고정된 뇌 조직을 30μm의 두께로 절편을 제작하여 면역조직화학 염색을 수행하였다. 상기 고정된 조직을 0.5% Thioflavin S 용액에 10분간 반응하여 Aβ 플라크를 염색하였다. 또한 GlyT1 항체를 이용하여 조직을 염색하였다. 50% 에탄올로 2회 세척 및 DPBS로 1회 세척을 진행한 후, 슬라이드 글라스에 염색한 조직을 마운팅하여 레이저 스캐닝 공초점 현미경으로 관찰하였다.
그 결과, 도 1의 정상인 및 알츠하이머 환자 뇌 조직의 면역 조직 화학 염색 결과, 해마 및 전두엽에서 플라크가 축적된 알츠하이머 환자 뇌 부위에서 GlyT1의 발현이 정상 대조군과 비교하여 현저히 낮음을 확인하였다.
실시예 2: APP/PS1 TG 마우스에서 GlyT1 및 GlyT2 억제에 의한 형질전환 마우스의 병리 관찰
2.1. APP/PS1 TG 마우스 모델 준비
형질 전환 마우스 (APP/PS1 TG; 알츠하이머병 동물모델; B6C3-Tg(APPswe,PSEN1dE)85Dbo/Mmjax) 및 야생형 마우스는 Jackson Laboratory (Bar Harbor, Maine, USA)로부터 유래하였다. APP/PS1 TG 마우스는 야생형 마우스와 교차하여 이중 반접합체 (double hemizygotes)로 유지되었다. 모든 유전자형은 Jackson Laboratory의 표준 PCR 조건에 따라 꼬리 DNA (tail DNA)를 이용한 PCR 분석을 통해 확인되었다. 마우스는 동물 사육실에서 플라스틱 케이지 당 1 마리씩 수용되어, 12시간의 명암 사이클을 번갈아가면서 21±1℃로 유지되었고, 음식물과 물을 자유롭게 섭취하였다.
2.2. 마우스 모델에 GlyT1 및 GlyT2 억제제 투여
GlyT1 억제제 (LY2365109 hydrochloride)와 GlyT2 억제제 (N-Arachidonylglycine)를 아직 아밀로이드-베타 플라크가 충분히 생성되지 않은 7개월령 형질 전환 마우스에 각각 10 mg/kg/day 농도로 4주간 매일 경구투여 하였다.
2.3. 뇌조직 샘플 준비
마우스를 2% 아베르틴 (20 mg/g, i.p.)을 사용하여 마취했다. 상기 마우스를 0.9% NaCl로 관류시키고 뇌를 절제하였다. 상기 hemibrains은 4℃에서 4% 파라포름알데히드 (pH 7.4)에서 밤새 고정시켰다.
2.4. 면역 조직 화학 염색
상기 실시예 2.3.에서 준비한 고정된 뇌 조직을 30μm의 두께로 절편을 제작하여 면역조직화학 염색을 수행하였다. 상기 고정된 조직을 0.5% Thioflavin S 용액에 10분간 반응하여 Aβ 플라크를 염색하였다. 50% 에탄올로 2회 세척 및 DPBS로 1회 세척을 진행한 후, 슬라이드 글라스에 염색한 조직을 마운팅하여 레이저 스캐닝 공초점 현미경으로 관찰하였다.
그 결과, 도 2의 아밀로이드-베타 플라크의 염색 이미지에 나타난 바와 같이, GlyT2 억제제를 투여한 마우스 (TG GlyT2 inhibitor)와 비교하였을 때, 상기 플라크 수 및 총 플라크 면적이 GlyT1 억제제 (TG, GlyT1 inhibitor)가 투여된 마우스에서 현저히 증가하는 것을 확인하였다. 이는 GlyT1이 특이적으로 아밀로이드-베타 플라크의 형성에 관여함을 나타낸다.
실시예 3: APP/PS1 TG 마우스에서 cisterna magna 내 투여된 AAV-GlyT1에 의한 아밀로이드 플라크 감소 효과 확인
3.1. APP/PS1 TG 마우스 모델 준비
형질 전환 마우스 (APP/PS1 TG; 알츠하이머병 동물모델; B6C3-Tg(APPswe,PSEN1dE)85Dbo/Mmjax) 및 야생형 마우스는 Jackson Laboratory (Bar Harbor, Maine, USA)로부터 유래하였다. APP/PS1 TG 마우스는 야생형 마우스와 교차하여 이중 반접합체 (double hemizygotes)로 유지되었다. 모든 유전자형은 Jackson Laboratory의 표준 PCR 조건에 따라 꼬리 DNA (tail DNA)를 이용한 PCR 분석을 통해 확인되었다. 마우스는 동물 사육실에서 플라스틱 케이지 당 1 마리씩 수용되어, 12시간의 명암 사이클을 번갈아가면서 21±1℃로 유지되었고, 음식물과 물을 자유롭게 섭취하였다.
3.2. 마우스 모델에 AAV (Adeno-associated virus)-GlyT1 투여
서열번호 1의 글라이신 수송체 (GlyT1)를 발현하는 AAV (AAV-GlyT1) 제작은 Vigene Biosciences (Rockville, MD, USA)의 제작 방법에 따라 재조합 하였다.
구체적으로, GlyT1 유전자를 AAV9 serotype을 갖는 AAV에 삽입하여 발현벡터를 제작한 후, 이 벡터를 포장 (packaging) 세포에 형질도입하고, 형질도입된 포장세포를 배양한 후 여과하여 AAV particles이 포함된 용액을 얻어 이를 농축 및 정제하였다. 그런 다음, AAV-GlyT1을 5개월령의 APP/PS1 TG 마우스의 cisterna magna로 5 x 1010 VP(viral particles) 또는 1.5 x 1011 VP의 농도로 단회 투여하였다. 대조군은 5 x 1010 VP의 AAV-GFP를 투여받았다.
3.3. 뇌조직 샘플 준비
마우스를 2% 아베르틴 (20 mg/g, i.p.)을 사용하여 마취했다. 상기 마우스를 0.9% NaCl로 관류시키고 뇌를 절제하였다. 상기 hemibrains은 4℃에서 4% 파라포름알데히드 (pH 7.4)에서 밤새 고정시켰다.
3.4. 면역 조직 화학 염색
상기 실시예 1.3.에서 준비한 고정된 뇌 조직을 30μm의 두께로 절편을 제작하여 면역조직화학 염색을 수행하였다. 상기 고정된 조직을 0.5% Thioflavin S 용액에 10분간 반응하여 Aβ 플라크를 염색하였다. 50% 에탄올로 2회 세척 및 DPBS로 1회 세척을 진행한 후, 슬라이드 글라스에 염색한 조직을 마운팅하여 레이저 스캐닝 공초점 현미경으로 관찰하였다.
그 결과, 도 3의 아밀로이드-베타 플라크의 염색 이미지와 도 4의 그래프에 나타난 바와 같이, 대조군 마우스 (TG-Veh)와 비교하였을 때, 상기 플라크 수 및 총 플라크 면적이 AAV-GlyT1이 투여된 마우스에서 현저히 감소하는 것을 확인하였다.
실시예 4: APP/PS1 TG 마우스에서 cisterna magna 내 투여된 AAV-GlyT1에 의한 인지기능 향상 효과 확인
4.1. APP/PS1 TG 마우스 모델 준비
형질 전환 마우스 (APP/PS1 TG; 알츠하이머병 동물모델; B6C3-Tg(APPswe,PSEN1dE)85Dbo/Mmjax) 및 야생형 마우스는 Jackson Laboratory (Bar Harbor, Maine, USA)로부터 유래하였다. 이러한 APP/PS1 TG 마우스는 야생형 마우스와 교차하여 이중 반접합체 (double hemizygotes)로 유지되었다. 모든 유전자형은 Jackson Laboratory의 표준 PCR 조건에 따라 꼬리 DNA (tail DNA)를 이용한 PCR 분석을 통해 확인되었다. 마우스는 동물 사육실에서 플라스틱 케이지 당 1 마리씩 수용되어, 12시간의 명암 사이클을 번갈아가면서 21±1℃로 유지되었고, 음식물과 물을 자유롭게 섭취하였다.
4.2. 마우스 모델에 AAV-GlyT1 투여
상기 1.2와 동일한 방법으로 제조된 AAV-GlyT1을 5개월령의 APP/PS1 TG 마우스의 cisterna magna로 5 x 1010 VP 또는 1.5 x 1011 VP의 농도로 단회 투여하였다. 대조군은 5 x 1010 VP의 AAV-GFP를 투여받았다.
4.3. Y-maze test (Y자 미로평가)
Y자 미로평가는 40cm의 길이 (벽의 높이 15cm)의 동일한 3개의 arm을 120도의 각도로 배치하여 만든 미로틀을 이용하였다. 이 실험은 설치류의 본능적인 탐색 습성을 이용한 행동실험이며, 새로운 영역을 탐색할 가능성이 높은 것에 착안한 방법이다. 바로 전에 탐색한 arm을 기억하여 동일한 arm에 들어가지 않을수록 높은 기억력의 수치를 나타내었다. 개체당 8분의 탐색시간을 제공하며, 최종 결과는 spontneous alteration (%) 값으로 표현되었다.
Spontaneous alteration (%)은 다음과 같은 수식으로 계산하였다.
[수식] Spontaneous alteration (%) = The number oftriplet /
(total arm entry-2)
행동 패턴의 분석은 SMART VIDEO TRACKING Software (Panlab, USA)을 이용하여 실시하였다. 실험에서 얻어진 모든 data는 mean ± Standard Error Mean (SEM)으로 표기하고, 비교 대상군인 약물 적용군간 비교와 약물 미적용군과 비교를 실시하여 student’s t-test로 군간 분석을 실시하였다.
그 결과, 도 5에서와 같이 형질 전환된 알츠하이머성 치매 동물 (APP/PS1 TG)에 AAV-GlyT1을 투여한 후 12주째 Y-maze test를 실시한 결과, 주변의 단서를 파악하여 순차적으로 미로를 들어가는 상대적 빈도를 측정한 spontaneous alteration (%) 값이 음성대조군 (TG, AAV-GFP)에 비해 양성대조군 (WT, Veh)에 가깝게 수치가 향상되는 것을 확인하였다.

Claims (14)

  1. 글라이신 수송체 (glycine transporter) 단백질, 이의 단편 또는 이들을 암호화하는 핵산 분자를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 글라이신 수송체는 GlyT1 (Glycine Transporter-1)인 것인 약학적 조성물.
  3. 청구항 2에 있어서, 상기 GlyT1는 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 약학적 조성물.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 글라이신 수용체는 세포 외 글라이신의 세포 내의 수송을 촉진하는 것인, 약학적 조성물.
  5. 청구항 1에 있어서, 다음 중에서 선택된 개체에게 투여하기 위한 것인, 약학적 조성물:
    (1) 아밀로이드-베타의 응집 수준이 퇴행성 뇌질환을 갖지 않는 정상보다 높거나 높을 위험이 있는 개체;
    (2) 타우 단백질의 응집 수준이 퇴행성 뇌질환을 갖지 않는 정상보다 높거나 높을 위험이 있는 개체;
    (3) 타우 단백질의 인산화 수준이 퇴행성 뇌질환을 갖지 않는 정상보다 높거나 높을 위험이 있는 개체; 및
    (4) 상기 (1) 내지 (3) 중 1 가지 이상에 해당하는 개체.
  6. 청구항 5에 있어서, 상기 아밀로이드-베타의 응집은 글라이신 (glycine)에 의한 것인, 약학적 조성물.
  7. 청구항 1에 있어서, 상기 퇴행성 뇌질환은 치매, 알츠하이머병 (Alzheimer's disease), 파킨슨 병, 헌팅턴 병, 경도인지장애 (mild cognitive impairment), 대뇌 아밀로이드 맥관병증, 다운증후근, 아밀로이드성 뇌졸증 (stroke), 전신성 아밀로이드병, 더취 (Dutch)형 아밀로이드증, 니만-픽병, 노인성 치매, 근위축성 측삭 경화증 (amyotrophic lateral sclerosis), 척수소뇌성 운동실조증 (Spinocerebellar Atrophy), 뚜렛 증후군 (Tourette`s Syndrome), 프리드리히 보행실조 (Friedrich`s Ataxia), 마차도-조셉 병 (Machado-Joseph`s disease), 루이 소체 치매 (Lewy Body Dementia), 근육긴장이상 (Dystonia), 진행성 핵상 마비 (Progressive Supranuclear Palsy) 및 전두측두엽 치매 (Frontotemporal Dementia) 으로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 약학적 조성물.
  8. 글라이신 수송체 (glycine transporter) 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 벡터를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  9. 청구항 8에 있어서, 상기 벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파아지 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 아데노-연관 바이러스 벡터로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것인, 약학적 조성물.
  10. 청구항 9에 있어서, 상기 아데노-연관 바이러스 벡터는 AAV1,　AAV2,　AAV3,　AAV4,　AAV5,　AAV6,　AAV7,　AAV8,　AAV9,　AAV10 및　AAV11로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것인, 약학적 조성물.
  11. 글라이신 수송체 (glycine transporter) 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 벡터로 형질전환된 세포를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  12. 청구항 11에 있어서, 상기 세포는 줄기세포, 전구세포 및 동물세포로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것인, 약학적 조성물.
  13. 글라이신 수송체 (glycine transporter) 단백질, 이의 단편 또는 이들을 암호화하는 핵산 분자를 그를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 퇴행성 뇌질환을 예방 또는 치료하는 방법.
  14. 글라이신 수송체 (glycine transporter) 단백질, 이의 단편 또는 이들을 암호화하는 핵산 분자를 퇴행성 뇌질환 예방 또는 치료용 조성물의 제조에 사용하기 위한 용도.
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