WO2021206218A1 - 마이크로니들 패치를 이용한 최소 침습적 아토피 피부염 검사 방법 및 마이크로니들 패치를 포함하는 최소 침습적 아토피 검사 키트 - Google Patents

마이크로니들 패치를 이용한 최소 침습적 아토피 피부염 검사 방법 및 마이크로니들 패치를 포함하는 최소 침습적 아토피 검사 키트 Download PDF

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microneedle
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skin
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김정동
이근호
이광훈
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Definitions

  • the present invention relates to a minimally invasive atopic dermatitis testing method using a microneedle patch and a minimally invasive atopic dermatitis testing kit comprising a microneedle patch.
  • Drugs and physiologically active substances are generally administered orally in tablet form or capsule form, but many drugs cannot be effectively delivered by the above administration method alone for reasons such as digestion or absorption in the gastrointestinal tract or loss by the liver mechanism. In addition, some drugs cannot effectively diffuse across the intestinal mucosa. For example, patient compliance is also a problem in critically ill patients who have to take drugs at specific time intervals or cannot take drugs.
  • Another common technique for the delivery of drugs and bioactive substances is the use of conventional needles. While this method is more effective than oral administration, there are problems in causing pain at the injection site, local damage to the skin, bleeding, and disease infection at the injection site.
  • Transdermal administration using a patch has fewer side effects, high patient compliance, and easy to maintain a constant blood concentration of the drug.
  • microneedles In order to solve the above problems, various microstructures including microneedles have been developed. As the material of the microneedle, metal and various polymer materials were used. Recently, biodegradable polymer materials have been in the spotlight as a material for microneedles.
  • a representative method is a method using a mold.
  • a microstructure that is, a microneedle, is formed by first manufacturing a mold having the shape of the microstructure to be formed by applying the semiconductor manufacturing process in an intaglio, pouring the microstructure material into the mold to solidify it and then removing it.
  • the present applicant has obtained a number of patents at home and abroad for the manufacturing method of the blow tension method as a new manufacturing method that can replace the molding method of manufacturing a microstructure.
  • the blow tension method after spotting a viscous biocompatible polymer material on the bottom layer of a patch located on a substrate or the bottom layer before bonding to the patch, before bonding to the bottom layer or patch of a patch located on another substrate Spotting or omitting the same biocompatible polymer material on the bottom layer, inverting the other substrate and approaching the spotted biocompatible polymer material so that it finally comes into contact, and then measuring the relative distance between the two substrates Spaced apart so that the contacted biocompatible polymer material is stretched, and after this tensioning process is completed, blown is performed to fix the shape in the tensioned state, and cut the middle part to apply the same microstructure on two different substrates.
  • a method for forming a structure after spotting a viscous biocompatible polymer material on the bottom layer of a patch located on a substrate or the
  • microstructure as a means of delivering the above drugs and physiologically active substances and a method for manufacturing the same were briefly described.
  • the present applicant has reached the present invention and intends to propose to utilize the microstructure for a new purpose rather than the delivery of drugs and physiologically active substances. It is to utilize a microstructure, that is, a patch containing microneedles, for minimally invasive atopic dermatitis examination.
  • Atopic dermatitis is an inflammatory skin disease accompanied by itching. It is the most representative allergic disease along with allergic rhinitis and bronchial asthma. It occurs frequently in infants and children with a prevalence of 10-30% in children, but recently atopic dermatitis in adults has been is increasing a lot.
  • As the main pathological mechanism of atopic dermatitis abnormality of the skin barrier, immunological abnormality, genetic predisposition, and environmental predisposition are involved. Abnormalities in the skin barrier are caused by a decrease in the synthesis of numerous biological factors related to the differentiation of skin keratinocytes, such as Filaggrin, and ceramide, an important component of skin barrier lipids, resulting in skin barrier failure, which causes skin dryness and itching.
  • Immunological abnormalities are caused by the complex action of innate and adaptive immune responses by cells such as dendritic cells, T cells, and other innate immune cells (mast cells, eosinophils, basophils, and neutrophils), resulting in TSLP, IL-4, IL
  • the immune response is induced by the secretion of various cytokines such as -13 and inflammatory substances such as chemokines.
  • cytokines such as -13
  • chemokines one of the most key cytokines for pathogenesis
  • cytokines for pathogenesis is IL-4 and IL-13.
  • Biologics drugs have been developed and widely used as new therapeutic agents for intractable atopic dermatitis, showing very good effects.
  • biopsy of the lesion site of atopic dermatitis is a method of analyzing biological factors related to atopic dermatitis in the tissue. This is the most common.
  • Figure 1 depicts such a biopsy.
  • a biopsy requires the skillful skill of an operating surgeon.
  • a feeling of rejection occurs because the pain of the patient is accompanied, and a scar at the biopsy site remains after the test.
  • a non-invasive stripping method using a tape for analyzing a skin specimen attached to the tape by attaching and detaching the tape to the lesion area has been proposed.
  • the material attached to the tape has a disadvantage in that it is limited to the stratum corneum.
  • atopic dermatitis is a skin disease caused by an immune system abnormality in the stratum corneum, epidermis, and dermis.
  • the tape stripping method can be used as a partial auxiliary method for the development of new drugs or the study of pathogenesis of atopic dermatitis, but it is difficult to obtain a complete result. Accordingly, the present inventor(s) obtains a skin specimen using a skin biopsy, tape stripping, and various types of microstructure patches, and has a skin specimen sufficient to replace a skin biopsy through stripping using a tape or microstructure patch. By confirming whether it is obtained, we want to confirm the usefulness of a collection method that can replace skin biopsy.
  • microstructure patches used in this study: an empty patch without microstructures, a hollow microstructure patch, and a soluble microstructure patch, which are control groups of the microstructure patch.
  • the blank patch which is a control group, consists only of a hydrocolloid patch, which is generally used mainly for wound healing.
  • the hollow microstructure patch has the advantage of being able to minimize pain and the risk of infection through a hole having a micro-sized cross-sectional area inside the microstructure, and at the same time enable drug delivery.
  • pharmaceutical grade hyaluronic acid component microneedles are formed on the hydrocolloid patch.
  • the manufacturing method of the microstructure patch includes the above-described mold method and the tensile method, and the microneedle of the hyaluronic acid component may be formed on the patch regardless of the manufacturing method.
  • the microstructure patches When these microstructure patches are applied on the skin, as shown in FIG. 2 , the microstructure penetrates the stratum corneum and enters the inside of the skin.
  • the present inventor(s) attaches the patch to the microstructure that has entered the inside of the skin for a sufficient time for various factors in the epidermis and dermis to be adsorbed, and then attempts to obtain a skin specimen from the removed patch.
  • the present inventor(s) through tissue biopsy, tape stripping, and comparative analysis between three types of microstructure patch methods, a novel minimally invasive method that can replace tissue biopsy for detection or expression level measurement of biomarkers important for pathogenesis We would like to present a method for testing atopic dermatitis.
  • An object of the present invention is to solve the problems of atopic dermatitis examination method of conventional tissue biopsy and tape stripping method.
  • Conventional tape stripping has a disadvantage in that the material attached to the tape is limited to the stratum corneum, and can only be used as an auxiliary test method, and does not provide complete results.
  • the minimally invasive atopic dermatitis examination method comprises a plurality of microneedles made of biodegradable polymer hyaluronic acid and having a solid structure, and a microneedle patch comprising a bottom layer on which the plurality of microneedles are formed.
  • a minimally invasive atopic dermatitis test kit comprises: equipment capable of quantitatively analyzing the amount of protein extracted from the skin of a subject; It includes a microneedle patch comprising a plurality of microneedles made of biodegradable polymer hyaluronic acid and having a solid structure, and a bottom layer on which the plurality of microneedles are formed.
  • equipment capable of quantitatively analyzing the amount of protein extracted from the skin of a subject includes a microneedle patch comprising a plurality of microneedles made of biodegradable polymer hyaluronic acid and having a solid structure, and a bottom layer on which the plurality of microneedles are formed.
  • the device reads the amount of interleukin-4 and interleukin-13 adsorbed to the microneedle surface of the microneedle patch.
  • the activity of atopic dermatitis is evaluated based on the readings of the amounts of interleukin-4 and interleukin-13.
  • an additional configuration may be further provided in the minimally invasive atopic dermatitis test method or the minimally invasive atopic dermatitis test kit method according to the present invention.
  • the problems of atopic dermatitis examination method of conventional tissue biopsy and tape stripping method can be solved.
  • Conventional tape stripping has a disadvantage in that the material attached to the tape is limited to the stratum corneum, and can only be used as an auxiliary test method, and does not provide complete results.
  • a new minimally invasive atopic dermatitis testing method and a minimally invasive atopic dermatitis testing kit may be provided.
  • FIG. 1 is a view showing a skin biopsy method of the prior art.
  • FIG. 2 is a diagram conceptually illustrating a skin biopsy method according to the present invention.
  • basic experiment 1 1) a blank patch without microneedles, 2) a metal solid microneedle, 3) a low molecular weight hyaluronic acid microneedle patch, 4) a high molecular weight hyaluronic acid micro The needle patch is shown.
  • FIG. 5 is a table showing the measurement results of length change before and after biopsy application of the low molecular weight hyaluronic acid microneedle patch and the high molecular weight hyaluronic acid microneedle patch among the four control groups of Basic Experiment 1.
  • FIG. 5 is a table showing the measurement results of length change before and after biopsy application of the low molecular weight hyaluronic acid microneedle patch and the high molecular weight hyaluronic acid microneedle patch among the four control groups of Basic Experiment 1.
  • basic experiment 2 is a table showing the results of another basic experiment (hereinafter referred to as "basic experiment 2").
  • the control used here is 1) a blank patch in which microneedles are not formed, 2) a low molecular weight hyaluronic acid microneedle patch, 3) High molecular weight hyaluronic acid microneedle patch, and each control group was applied to the skin for 5 seconds and 60 seconds for patients in their 20s and 60s, and then peeled off to measure Pro-Collagen 1 detection results.
  • FIG. 7 is a table showing the results of Pro-Collagen 1 detection results after the control group according to Basic Experiment 2 was applied to the skin for 10 seconds and 30 seconds, respectively, for a patient group in their 20s and a patient group in their 60s.
  • basic experiment 3 is a table showing the results of another basic experiment (hereinafter referred to as “basic experiment 3”).
  • the controls used here are 1) low molecular weight chitosan microneedle patch, 2) high molecular weight chitosan microneedle. patch, and each control group was applied to the skin for 5 seconds, 60 seconds and 300 seconds, and then peeled off to measure Pro-Collagen 1 detection results.
  • FIG. 9 is a photograph of three types of patches used in a clinical trial to verify the effect of the present invention.
  • 10 is a table showing a clinical trial promotion schedule.
  • 11 is a table summarizing information on clinical trial subjects.
  • FIG. 12 is a table showing the amount of protein adhered to four types of skin sample acquisition means: tape, blank patch, HA microneedle, and hollow needle.
  • 13 and 14 are graphs showing the results of confirming the expression levels of IL-13 and IFN-gamma, respectively, using a tape and a microneedle.
  • 15 is a table measuring the expression of IL-4 in a skin specimen obtained from clinical test subjects through an HA microneedle through an ELISA test.
  • 16 is a table measuring the expression of IL-13 in a skin specimen obtained from clinical test subjects through an HA microneedle through an ELISA test.
  • 17 is a table measuring the expression of IFN-gamma in skin samples obtained from clinical test subjects through the HA microneedle through the ELIAS test.
  • FIG. 2 is a diagram conceptually illustrating a skin biopsy method according to the present invention.
  • a commercially available microneedle patch under the product name “Therapass” is shown in the upper left of FIG. 2 .
  • This product is a high molecular weight hyaluronic acid microneedle patch with a molecular weight of 1000 kDa, which is marketed and sold by the applicant company.
  • the microneedle patch applied to the skin is shown, and more specifically, the microneedle of the patch has penetrated to the dermal layer of the skin.
  • a representative technical idea of the present invention is conceptually shown in which a biopsy is performed by using the protein in the skin that is buried in the microneedle of the patch.
  • bio-mining is used to mean extracting proteins in the skin of a subject for a biopsy.
  • FIG. 3 shows four control groups of Basic Experiment 1 performed by the present inventor(s) with respect to the minimally invasive skin biopsy method closely related to the concept of the present invention prior to the clinical trial related to the test method for atopic dermatitis.
  • the first group was a blank patch in which microneedles were not formed.
  • the second group is solid microneedles made of metal.
  • the third group is low molecular weight hyaluronic acid microneedle patches.
  • the molecular weight of hyaluronic acid used in the low molecular weight hyaluronic acid microneedle patch was 110 kDa.
  • the fourth group is high molecular weight hyaluronic acid microneedle patches.
  • the molecular weight of hyaluronic acid used in the high molecular weight hyaluronic acid microneedle patch was 1000 kDa.
  • 4 is a table showing the results of the Pro-Collagen 1 detection test for the 30-year-old patient group and the 60-year-old patient group using the four control groups described above.
  • ELISA ELISA
  • the microneedle component of the currently commercialized microneedle patch is biocompatible and biodegradable polymer material is the trend.
  • Biocompatible material means a material that is not toxic to the human body and is chemically inert.
  • biodegradable material refers to a material that can be decomposed by body fluids, enzymes or microorganisms in a living body.
  • biodegradable materials it is known that the lower the molecular weight, the faster the dissolution rate in the living body, and the higher the molecular weight, the slower the dissolution rate in the living body.
  • biocompatible polymers the following materials are known as biocompatible polymers:
  • Hyaluronic acid hyaluronic acid; HA), gelatin (gelatin), chitosan (chitosan), collagen (collagen), alginic acid, pectin, carrageenan, chondroitin (sulfate), dextran (sulfate), polylysine (polylysine), carboxymethyl titin, Fibrin, agarose, pullulan, cellulose, polyvinylpyrrolidone (PVP), polyethylene glycol (PEG), polyvinyl alcohol (PVA), hydroxypropyl cellulose (HPC), hydroxyethyl cellulose (HEC), hydroxy Propylmethylcellulose (HPMC), sodium carboxymethylcellulose, polyalcohol, gum arabic, alginate, cyclodextrin, dextrin, glucose, fructose, starch, trehalose, glucose, maltose, lactose, lactulose, fructose, turanose, Mellitose, melezitose
  • the protein can be extracted and attached to the biocompatible microneedle structure during the process of entering the dermal layer of the patch and maintaining it after entry.
  • the low-molecular-weight hyaluronic acid microneedle has a relatively fast dissolution rate even if the protein of the living body is attached to the surface. It was analyzed that the experimental result of FIG. 4 was obtained for this reason. The results supporting this are shown in FIG. 6 .
  • FIG. 5 is a table showing the measurement results of length change before and after biopsy application of the low molecular weight hyaluronic acid microneedle patch and the high molecular weight hyaluronic acid microneedle patch among the four control groups described above.
  • the microneedles of the 110 kDa low molecular weight hyaluronic acid microneedle patch showed a reduction in length of approximately 30% while attached to the human skin.
  • the microneedle of the 1000 kDa high molecular weight hyaluronic acid microneedle patch showed only about 10% reduction in length while attached to the skin.
  • Example 2 It supports the fact that it is the cause of the experimental results shown in FIG. 4 .
  • the skin adhesion time of each control group was 5 minutes. Accordingly, the present inventors found the need to perform experiments for different lengths of time by reducing the adhesion time to the skin by less than 5 minutes, and planned an experiment (Experiment 2) different from the above-described basic experiment (Experiment 1).
  • FIG. 6 is a table showing the results of the basic experiment 2 different from the basic experiment 1 described above.
  • the controls used here are 1) a blank patch without microneedles, 2) a low molecular weight hyaluronic acid microneedle patch, 3) a high molecular weight It is a hyaluronic acid microneedle patch, and each control group was applied to the skin for 5 seconds and 60 seconds for patients in their 20s and 60s, and then peeled off to measure Pro-Collagen 1 detection results.
  • the molecular weight of the low molecular weight hyaluronic acid and the molecular weight of the high molecular weight hyaluronic acid are the same as in the case of Basic Experiment 1.
  • the applicant's commercially available microneedle patch As the low molecular weight hyaluronic acid microneedle patch, the applicant's commercially available microneedle patch was used, and as the high molecular weight hyaluronic acid microneedle patch, the applicant's commercially available microneedle patch for medical device use (trade name: "Therapass”) was used.
  • the solid microneedle made of a metal material was not used as a control in this example because the biological protein extraction performance was significantly insufficient.
  • FIG. 7 is a table showing the results of Pro-Collagen 1 detection results after the control group according to Basic Experiment 2 was applied to the skin for 10 seconds and 30 seconds, respectively, for a patient group in their 20s and a patient group in their 60s.
  • the biopsy performance of the microneedle patch can be significantly exhibited.
  • the technical significance of the experiment of FIG. 7 is evaluated to confirm that the needle patch exhibits the same biopsy performance as the high molecular weight microneedle patch.
  • Chitosan like hyaluronic acid, is a biocompatible polymer, but it is not biodegradable. Chitosan is a material that is processed so that chitin contained in crustaceans can be easily absorbed by the human body. It has been proven effective in terms of skin cell activation and is widely used as a cosmetic ingredient, and is also used as a component of a microneedle patch for skin care purposes.
  • Control 8 is a table showing the results of Basic Experiment 3, wherein the controls used here are 1) a low molecular weight chitosan microneedle patch, 2) a high molecular weight chitosan microneedle patch, and each control group is 5 seconds, 60 seconds and After being applied to the skin for 300 seconds, it was peeled off and the detection result of Pro-Collagen 1 was measured.
  • the molecular weight of low molecular weight chitosan 1 is 50 to 100 kDa.
  • the molecular weight of high molecular weight chitosan 2 is 250 to 350 kDa.
  • the expression of Pro-Collagen I was confirmed after 5 seconds, 1 minute, and 5 minutes of attachment to the 20-year-old patient group.
  • the present inventors say that chitosan, which is one of the biocompatible polymer materials, can also exert a protein extraction function for a biopsy like hyaluronic acid.
  • Various other biocompatible polymer materials other than hyaluronic acid and chitosan exemplified in the present specification can be seen to be sufficiently open to become a candidate group for microneedle patch materials for minimally invasive skin biopsy.
  • Figure 9 is a photograph of three types of patches used in a clinical trial to verify the effect of the present invention.
  • the blank patch on the left side of FIG. 9 consists only of a hydrocolloid material patch, and a needle structure is not formed thereon.
  • the hollow patch in the middle is a microneedle commercially available from INCYTO, and has a structure in which a hole having a micro-sized cross-sectional area is formed in the center of a long and thin metal needle.
  • HA hyaluronic acid
  • Therapass a commercially available microneedle patch under the product name "Therapass” is shown.
  • This product is a high molecular weight hyaluronic acid microneedle patch with a molecular weight of 1000 kDa, which is marketed and sold by the applicant company.
  • the target number of subjects for this clinical trial was 20 patients with atopic dermatitis (forearm).
  • the study period was 5 months after IRB approval.
  • the research method is as follows.
  • FIG. 10 is a table showing a clinical trial promotion schedule. As described above, clinical trials were conducted for 5 months after IRB. After recruiting the test subjects, tissue biopsy, D-squame tape stripping, blank patch, HA microneedle, and hollow needle patch were applied to the subjects at week 0 of visit, and proteins were isolated from each of the detection means. At the 2nd week of visit, the blank patch, the HA microneedle, and the hollow needle patch were applied to the subjects, and the protein was isolated from each of the detection means. Finally, the amount of isolated protein was quantified, and ELISA was performed for IL-4, IL-13, and IFN-gamma, and data were analyzed.
  • FIG. 11 is a table summarizing information on clinical trial subjects.
  • the table of FIG. 11 shows the gender, age, and the course of symptoms after 2 weeks of the test subjects participating in this clinical trial (the notation in the table of "sl improved" for the course of patient No. 10 is slightly improved, that is, slightly improved. mean elapsed time). Except for Fail, a total of 20 test subjects were enrolled and conducted the study. Subjects No. 4, No. 5, No. 7, No. 16, No. 20, and No. 26, indicated to be distinguishable from other subjects in the table of FIG. 11 , refused to attach and detach the second patch and were excluded from the test subject.
  • FIG. 12 is a table showing the amount of protein adhered to four types of skin sample acquisition means: tape, blank patch, HA microneedle, and hollow needle.
  • the obtained skin specimen was quantified for protein through BCA assay.
  • the tape, blank patch, hyaluronic acid microneedle, and hollow needle were all applied to the patients.
  • a blank patch, a hyaluronic acid microneedle and a hollow needle were provided to the patients except for the tape.
  • tape, blank patch, and hyaluronic acid microneedle were applied except for the hollow needle.
  • the amount of quantified protein can be confirmed in the graph of FIG. 12 (normal individuals are not included in the IRB).
  • the NET OD (absorbance) value which is the y-axis, was calculated as 'OD value of protein obtained through a skin specimen' - 'OD value of blank state of each patch'. From the results of protein quantification, it was confirmed that little protein was extracted from the blank patch or hollow needle patch compared to the tape or hyaluronic acid microneedle patch. Through this, it was confirmed that a blank patch or a hollow needle is not suitable for target factor detection using a non-invasive method.
  • IL-4, IL-13 and IFN-gamma were confirmed in tissue biopsies and specimens obtained with tape and microneedle from normal subjects and patients with atopic dermatitis.
  • tissue biopsy RNA was collected and the expression levels of IL-4, IL-13 and IFN-gamma were confirmed through qRT-PCR test.
  • RNA was collected and the expression levels of IL-4, IL-13 and IFN-gamma were confirmed through qRT-PCR test.
  • the expression of the above targets was not confirmed in both normal individuals and patients with atopic dermatitis in the specimens using the tape, but IL-13 in the specimens using the microneedle patch compared to the normal subjects in the patients with atopic dermatitis. and IFN-gamma expression levels were confirmed to be high.
  • FIGS. 15 to 17 The expression of IL-4, IL-13, and IFN-gamma in the obtained specimen was measured through ELISA test. The results are shown in FIGS. 15 to 17 .
  • 15 is a table measuring the expression of IL-4 in a skin specimen obtained from clinical test subjects through an HA microneedle through an ELISA test.
  • 16 is a table measuring the expression of IL-13 in a skin specimen obtained from clinical test subjects through an HA microneedle through an ELISA test.
  • 17 is a table measuring the expression of IFN-gamma in skin samples obtained from clinical test subjects through the HA microneedle through the ELIAS test.
  • the OD value of IL-4 at week 0 in patient 1 was 0.021.
  • the OD value of IL-4 at week 2 was 0.044.
  • the OD value of IL-4 at week 0 in patient 2 was 0.029.
  • the OD value of IL-4 at week 2 was 0.012.
  • the OD value of IL-4 at week 0 in patient 3 was 0.026.
  • the OD value of IL-4 at week 2 was 0.017.
  • the OD value of IL-4 at week 0 in patient 6 was 0.053.
  • the OD value of IL-4 at week 2 was 0.043.
  • the OD value of IL-4 at week 0 in patient 8 was 0.025.
  • the OD value of IL-4 at week 2 was 0.021.
  • the OD value of IL-4 at week 0 in patient 9 was 0.072.
  • the OD value of IL-4 at week 2 was 0.141.
  • the OD value of IL-4 at week 0 in patient 10 is 0.065.
  • the OD value of IL-4 at week 2 was 0.093.
  • the OD value of IL-4 at week 0 in patient 11 was 0.012.
  • the OD value of IL-4 at week 2 was 0.098.
  • the OD value of IL-4 at week 0 in patient 12 was 0.053.
  • the OD value of IL-4 at week 2 was 0.095.
  • the OD value of IL-4 at week 0 in patient 13 was 0.026.
  • the OD value of IL-4 at week 2 was 0.022.
  • the OD value of IL-4 at week 0 in patient 14 was 0.029.
  • the OD value of IL-4 at week 2 was 0.027.
  • the OD value of IL-4 at week 0 in patient 15 is 0.034.
  • the OD value of IL-4 at week 2 was 0.025.
  • the OD value of IL-4 at week 0 in patient 17 was 0.036.
  • the OD value of IL-4 at week 2 was 0.027.
  • the OD value of IL-4 at week 0 in patient 18 was 0.038.
  • the OD value of IL-4 at week 2 was 0.025.
  • the OD value of IL-4 at week 0 in patient 19 was 0.023.
  • the OD value of IL-4 at week 2 was 0.021.
  • the OD value of IL-4 at week 0 in patient 21 was 0.026.
  • the OD value of IL-4 at week 2 was 0.052.
  • the OD value of IL-4 at week 0 in patient 22 was 0.012.
  • the OD value of IL-4 at week 2 was 0.038.
  • the OD value of IL-4 at week 0 in patient 23 was 0.031.
  • the OD value of IL-4 at week 2 was 0.017.
  • the OD value of IL-4 at week 0 in patient 24 is 0.035.
  • the OD value of IL-4 at week 2 was 0.028.
  • the OD value of IL-4 at week 0 in patient 25 is 0.025.
  • the OD value of IL-4 at week 2 was 0.024.
  • the Net OD value of IL-13 at Week 0 in Patient 1 was 0.0027.
  • the Net OD value of IL-13 at week 2 is 0.0017.
  • the Net OD value of IL-13 at week 0 in patient 2 was 0.0072.
  • Week 2 IL-13 has a Net OD value of 0.0002.
  • the Net OD value of IL-13 at week 0 in patient 3 was 0.0072.
  • the Net OD value of IL-13 at week 2 is 0.0017.
  • the Net OD value of IL-13 at week 0 in patient 6 was 0.0132.
  • the Net OD value of IL-13 at week 2 is 0.0077.
  • the Net OD value of IL-13 at week 0 in patient 8 was 0.0062.
  • the Net OD value of IL-13 at week 2 is 0.0059.
  • the Net OD value of IL-13 at week 0 in patient 9 was 0.0059.
  • the Net OD value of IL-13 at week 2 is 0.0069.
  • the Net OD value of IL-13 at week 0 in patient 10 was 0.0052.
  • the Net OD value of IL-13 at week 2 is 0.0059.
  • the Net OD value of IL-13 at week 0 in patient 11 was 0.0052.
  • the Net OD value of IL-13 at week 2 is 0.0052.
  • the Net OD value of IL-13 at week 0 in patient 12 was 0.0022.
  • the Net OD value of IL-13 at week 2 is 0.0062.
  • the Net OD value of IL-13 at week 0 in patient 13 was 0.0132.
  • the Net OD value of IL-13 at week 2 is 0.0067.
  • the Net OD value of IL-13 at week 0 in patient 14 was 0.0072.
  • the Net OD value of IL-13 at week 2 is 0.0069.
  • the Net OD value of IL-13 at week 0 in patient 15 was 0.0037.
  • the Net OD value of IL-13 at week 2 is 0.0042.
  • the Net OD value of IL-13 at week 0 in patient 17 was 0.0042.
  • the Net OD value of IL-13 at week 2 is 0.0037.
  • the Net OD value of IL-13 at week 0 in patient 18 was 0.0027.
  • Week 2 IL-13 has a Net OD value of 0.0032.
  • the Net OD value of IL-13 at week 0 in patient 19 was 0.0059.
  • the Net OD value of IL-13 at week 2 is 0.0049.
  • the Net OD value of IL-13 at week 0 in patient 21 was 0.0065.
  • the Net OD value of IL-13 at week 2 is 0.0082.
  • the Net OD value of IL-13 at week 0 in patient 22 was 0.0102.
  • the Net OD value of IL-13 at week 2 is 0.0102.
  • the Net OD value of IL-13 at week 0 in patient 23 was 0.0079.
  • the Net OD value of IL-13 at week 2 is 0.0079.
  • the Net OD value of IL-13 at week 0 in patient 24 was 0.0137.
  • the Net OD value of IL-13 at week 2 is 0.0092.
  • the Net OD value of IL-13 at week 0 in patient 25 was 0.0502.
  • the Net OD value of IL-13 at week 2 is 0.0082.
  • the Net OD value of IFN-gamma at week 0 in patient 1 was 0.0220.
  • the net OD value of IFN gamma at week 2 was 0.0380.
  • the Net OD value of IFN-gamma at week 0 and week 0 in patient 2 was -0.0005.
  • the net OD value of IFN gamma at week 2 was 0.0410.
  • the Net OD value of IFN-gamma at week 0 in patient 3 was 0.0015.
  • the net OD value of IFN gamma at week 2 was -0.0045.
  • the Net OD value of IFN-gamma at week 0 in patient 6 was 0.0350.
  • the net OD value of IFN gamma at week 2 was 0.0140.
  • the Net OD value of IFN-gamma at week 0 in patient 8 was 0.0395.
  • the net OD value of IFN gamma at week 2 was 0.0340.
  • the Net OD value of IFN-gamma at week 0 in patient 9 was 0.0345.
  • the net OD value of IFN gamma at week 2 was 0.0640.
  • the Net OD value of IFN-gamma at week 0 in patient 10 was 0.0145.
  • the net OD value of IFN gamma at week 2 was 0.0320.
  • the net OD value of IFN-gamma at week 0 in patient 11 was 0.0515.
  • the net OD value of IFN gamma at week 2 was 0.0465.
  • the Net OD value of IFN-gamma at week 0 in patient 12 was 0.0295.
  • the net OD value of IFN gamma at week 2 was 0.0340.
  • the net OD value of IFN-gamma at week 0 in patient 13 was 0.0410.
  • the net OD value of IFN gamma at week 2 was 0.0340.
  • the Net OD value of IFN-gamma at week 0 in patient 14 was 0.0380.
  • the net OD value of IFN gamma at week 2 was 0.0615.
  • the net OD value of IFN-gamma at week 0 in patient 15 was 0.0455.
  • the net OD value of IFN gamma at week 2 was 0.0560.
  • the Net OD value of IFN-gamma at week 0 in patient 17 was 0.0310.
  • the net OD value of IFN gamma at week 2 was 0.0390.
  • the net OD value of IFN-gamma at week 0 in patient 18 was 0.0405.
  • the net OD value of IFN gamma at week 2 was 0.0275.
  • the Net OD value of IFN-gamma at week 0 in patient 19 was 0.0510.
  • the net OD value of IFN gamma at week 2 was 0.0415.
  • the Net OD value of IFN-gamma at week 0 in patient 21 was 0.0285.
  • the net OD value of IFN gamma at week 2 was 0.0000.
  • the Net OD value of IFN-gamma at week 0 in patient 22 was 0.0160.
  • the net OD value of IFN gamma at week 2 was 0.0255.
  • the net OD value of IFN-gamma at week 0 in patient 23 was 0.0140.
  • the net OD value of IFN gamma at week 2 was 0.0260.
  • the Net OD value of IFN-gamma at week 0 in patient 24 was 0.0230.
  • the net OD value of IFN gamma at week 2 was 0.0320.
  • the net OD value of IFN-gamma at week 0 in patient 25 was 0.0365.
  • the net OD value of IFN gamma at week 2 was 0.0285.
  • the present inventor(s) confirmed the correlation between the expression of the target protein in the skin specimen obtained using the hyaluronic acid microneedle patch and the clinical course of atopic dermatitis through statistical analysis (SPSS). The results are shown in FIGS. 18 to 20 .
  • the X-axis of the graph shown in the upper part of FIGS. 18 to 20 represents the clinical course.
  • the Y-axis of these graphs represents changes in IL-4, IL-13 and IFN-gamma ('target expression level at 2 weeks - 'target expression level at week 0'), respectively.
  • IL-4, IL-13 and IFN-gamma 'target expression level at 2 weeks - 'target expression level at week 0'
  • atopic dermatitis test kit which consists of a microneedle patch formed of biodegradable polymer hyaluronic acid and equipment capable of quantitative analysis of proteins obtained from human skin
  • the evaluation of the atopic dermatitis activity may be automatically performed by a functional unit that may be included in the atopic dermatitis test kit according to an embodiment of the present invention.
  • the functional unit includes a storage unit that stores data on the correlation between the interleukin-4 and interleukin-13 amounts obtained from the quantitative analysis equipment and the correlation between these and atopic dermatitis activity, and the quantitative An interface unit that transmits data from analysis equipment, a comparison determination unit that compares and determines the data stored in the storage and data transmitted from the quantitative analysis equipment to generate information on atopic dermatitis activity, and the comparison determination unit It may be configured to include a display unit on which information is displayed.

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Abstract

본 발명은 최소 침습적 아토피 피부염 검사 방법에 관한 것이다. 본 발명의 일 실시예에 따른 최소 침습적 아토피 피부염 검사 방법은, 생분해성 고분자 히알루론산으로 이루어지고 중실 구조인 복수개의 마이크로니들과, 상기 복수개의 마이크로니들이 형성된 바탕이 되는 바닥층을 포함하는 마이크로니들 패치를 대상체의 피부에 적용하는 단계와; 상기 마이크로니들 패치를 대상체의 피부에 부착한 상태에서 소정 시간 유지하는 단계와; 상기 소정 시간 경과 후 상기 마이크로니들 패치를 대상체의 피부로부터 분리하여 정량 검사에 투입하는 단계와; 상기 정량 검사 단계에서 상기 마이크로니들 패치의 마이크로니들 표면에 흡착된 인터루킨-4 및 인터루킨-13의 양을 판독하는 단계와; 상기 인터루킨-4 및 인터루킨-13의 양의 판독을 기초로 아토피 피부염의 활성도를 평가하는 단계를 포함한다.

Description

마이크로니들 패치를 이용한 최소 침습적 아토피 피부염 검사 방법 및 마이크로니들 패치를 포함하는 최소 침습적 아토피 검사 키트
본 발명은 마이크로니들 패치를 이용한 최소 침습적 아토피 피부염 검사 방법 및 마이크로니들 패치를 포함하는 최소 침습적 아토피 검사 키트에 관한 것이다.
질병의 치료를 위한 수많은 약물 및 생리활성물질 등이 개발되었지만 약물 및 생리활성물질을 신체 내로 전달함에 있어서, 생물학적 장벽(biological barrier, 예를 들어 피부, 구강점막 및 뇌-혈관 장벽 등) 통과 문제 및 약물 전달의 효율 문제는 여전히 개선되어야 할 점으로 남아 있다.
약물 및 생리활성물질은 일반적으로 정제제형 또는 캡슐제형으로 경구투여 되지만, 수 많은 약물들이 위장관에서 소화 또는 흡수되거나 간의 기전에 의하여 소실되는 등의 이유로 상기와 같은 투여 방법만으로는 유효하게 전달될 수 없다. 게다가, 몇몇 약물들은 장의 점막을 통과하여 유효하게 확산 될 수 없다. 예컨대, 특정 시간 간격으로 약물을 복용해야 하거나, 약을 복용할 수 없는 중환자의 경우 등에는 환자의 순응도 역시 문제가 된다.
약물 및 생리활성물질의 전달에 있어서 또 다른 일반적인 기술은 종래의 주사바늘(needle)을 이용하는 것이다. 이 방법은 경구 투여에 비하여 효과적인 반면에, 주사부위에서의 통증 수반 및 피부의 국부적 손상, 출혈 및 주사부위에서의 질병 감염 등을 야기하는 문제점이 있다.
상기 경구 투여 및 피하 주사의 문제점을 해결하기 위하여 패치제를 통한 경피 투여 방법이 이용된다. 패치제를 사용한 경피 투여는 부작용이 적고 환자의 순응도가 높으며 약물의 혈중 농도를 일정하게 유지하기 용이하다.
상기와 같은 문제점들을 해결하기 위하여 마이크로니들(microneedle)을 포함하는 여러 가지 마이크로 구조체들이 개발되었다. 마이크로니들의 재질로는 금속 및 다양한 고분자 물질이 사용되었다. 최근에는 마이크로니들의 재질로서 생분해성 고분자 물질이 각광을 받고 있다.
생분해성 재질의 마이크로 구조체를 제작하기 위한 방법으로서 대표적인 것은 몰드를 이용한 방식이다. 반도체 제조공정을 응용하여 형성하고자 하는 마이크로 구조체의 형태를 음각으로 갖춘 몰드를 먼저 제작하고 이러한 몰드에 마이크로 구조체 재료를 부어 응고시킨 후 떼어내면 마이크로 구조체, 즉 마이크로니들이 형성된다.
본 출원인은 이러한 몰딩 방식의 마이크로 구조체 제작 방법을 대체할 수 있는 새로운 제작 방법으로서 송풍인장방식의 제작 방법에 대하여 국내외에 다수의 특허권을 획득한 바 있다. 송풍인장방식을 간단히 설명하면, 점성을 띈 생체친화성 고분자 물질을 기판 상에 위치한 패치의 바닥층 또는 패치에 결합되기 전의 바닥층에 스팟팅한 후 다른 기판 상에 위치한 패치의 바닥층 또는 패치에 결합되기 전의 바닥층에 동일한 생체친화성 고분자 물질을 스팟팅하거나 이를 생략하고, 상기 다른 기판을 반전시키고 상기 스팟팅된 생체친화성 고분자 물질쪽으로 접근시켜 최종적으로는 접촉되도록 하고, 그 이후 두 기판 사이의 상대적인 거리를 이격시켜 접촉된 점성을 가진 생체친화성 고분자 물질이 늘어나도록 하고, 이러한 인장 공정이 완료된 후 송풍을 실시하여 인장된 상태에서 형태가 고정되도록 하고 중간 부분을 절단하여 두 개의 다른 기판 상에 각각 동일한 마이크로 구조체가 형성되도록 하는 방법이다.
이상 약물 및 생리활성물질 전달 수단으로서 마이크로 구조체의 기술적 의미와 이를 제작하기 위한 방법 등에 대하여 간략히 설명하였다. 본 출원인은 본 발명에 이르러 마이크로 구조체를 약물 및 생리활성물질의 전달이 아닌 새로운 용도로 활용하는 것을 제안하고자 한다. 그것은 마이크로 구조체, 즉 마이크로니들을 포함하는 패치를 최소 침습적 아토피 피부염(Atopic Dermatitis) 검사에 활용하는 것이다.
아토피 피부염은 가려움을 동반하는 염증성 피부질환으로, 알레르기성 비염, 기관지 천식과 함께 가장 대표적인 알레르기성 질환으로 어린이에서는 10-30%의 유병율로 유아와 소아에서 많이 발생하지만, 최근 성인에서의 아토피 피부염이 많이 증가하고 있다. 아토피 피부염의 주된 병리기전으로 피부장벽의 이상, 면역학적 이상, 유전적 소인, 환경적인 소인 등이 관여한다. 피부장벽의 이상은 Filaggrin 등의 피부 각질 형성 세포 분화에 관련되는 수많은 생물학적 인자와 피부장벽 지질의 중요한 요소인 세라마이드의 합성이 감소됨으로써 피부장벽의 이상이 초래되고, 이로 인해 피부 건조증 및 가려움증이 유발된다. 면역학적 이상은 수지상 세포, T 세포, 기타 선천 면역 세포(비만 세포, 호산구, 호염고, 호중구)와 같은 세포들에 의한 선천, 적응 면역 반응이 복합적으로 작용하게 되어, TSLP, IL-4, IL-13과 같은 다양한 cytokines 및 chemokines과 같은 염증 반응 물질들이 분비됨으로써 면역 반응이 야기되며, 그 중 병인에 가장 핵심적인 사이토카인의 하나가 IL-4와 IL-13으로 최근 이 표지자를 타겟으로 한 많은 바이오로직스 약제들이 개발되어 난치성 아토피 피부염의 새로운 치료제로 널리 사용되고 있으며 매우 우수한 효과를 보이고 있다.
상기와 같은 아토피 피부염의 발병기전과 관련된 수많은 생물학적 물질들의 변화를 관찰하는 것이 새로운 치료 약물의 개발과 연관되어 있다. 이러한 아토피 피부염의 새로운 발병 기전을 발굴하고 치료에 대한 효과 판정, 예후에 대한 예측 검사, 새로운 치료제의 발굴 등을 위해서는 아토피 피부염의 병변 부위를 생검하여 조직 내 아토피 피부염과 연관된 생물학적 인자 등을 분석하는 방법이 가장 보편적이다. 도 1은 이러한 생검에 대하여 도시하고 있다. 그런데, 생검은 집도의의 숙련된 기술이 필요하다. 또한, 환자의 고통이 수반되기에 거부감이 발생하고, 시험 후 생검 부위의 흉터가 남는 단점이 있다. 이러한 이유 등으로 실제 인체에서 일일이 이러한 인자들을 검출하기에 큰 어려움이 있고, 신기술이나 신약 개발에 장애가 되고 있다. 이러한 단점을 개선하고자, 병변 부위에 테이프를 탈부착하여 테이프에 붙어 나온 피부 가검물을 분석하는 테이프를 이용한 비침습적 스트리핑 방법이 제시되었다. 그러나, 테이프에 붙어 나오는 물질은 각질층으로 한정된다는 단점을 가지고 있다. 반면, 아토피 피부염은 각질층, 표피, 진피 층에서의 면역체계 이상으로 인해 발생하는 피부 질환이므로 생검과 같이 표피와 진피 모두에서 조직의 채취가 중요하다. 그러므로 테이프 스트리핑 방법은 아토피 피부염의 신약개발이나 발병기전의 연구를 위한 일부 보조적인 방법으로 사용할 수는 있으나, 완전한 결과를 얻기는 어렵다. 이에 본 발명자(들)는 피부 생검, 테이프 스트리핑 및 여러 종류의 마이크로 구조체 패치를 이용하여 피부 가검물을 획득하고, 테이프 혹은 마이크로 구조체 패치를 이용한 스트리핑을 통해 피부 생검을 대체할 수 있을 정도의 피부 가검물이 획득되는지를 확인하여, 피부 생검을 대체할 수 있는 채취 방법의 유용성을 확인하고자 한다.
이러한 연구에 사용된 마이크로 구조체 패치는 총 세 종류로, 마이크로 구조체 패치의 대조군인 마이크로 구조체가 없는 공패치와 중공형 마이크로 구조체 패치, 그리고 용해성 마이크로 구조체 패치이다. 대조군인 공패치는 일반적으로 상처 치유에 주로 사용되는 하이드로콜로이드 패치로만 구성되어 있다. 중공형 마이크로 구조체 패치는 마이크로 구조체 내부의 마이크로 사이즈의 단면적을 가지는 구멍을 통해 통증과 감염 위험성을 최소화 할 수 있고, 동시에 약물전달이 가능하다는 장점을 갖는다. 용해성 마이크로 구조체 패치에서는 하이드로콜로이드 패치 상에 의약품 등급의 히알루론산 성분 마이크로니들이 형성된다. 마이크로 구조체 패치의 제조 방법에는 상술한 몰드 방식과 인장 방식 등이 있는데, 제조 방법을 가리지 않고 패치 상에 히알루론산 성분의 마이크로니들이 형성되는 것이면 된다. 피부 위에 이러한 마이크로 구조체 패치들을 적용하면, 도 2에 도시한 바와 같이, 마이크로 구조체는 각질층을 투과하여 피부 내부까지 진입하게 된다. 본 발명자(들)는 피부 내부까지 진입한 마이크로 구조체에 표피, 진피 층에 있는 여러 인자들이 흡착될 수 있는 충분한 시간 동안 패치를 부착하고, 이후 떼어낸 패치에서 피부 가검물을 획득하고자 한다. 이후, 본 발명자(들)는 조직 생검, 테이프 스트리핑, 세 종류의 마이크로 구조체 패치 방법들 간의 비교 분석을 통해, 병인에 중요한 바이오마커의 검출이나 발현양 측정에 조직 생검을 대체할 수 있는 새로운 최소 침습적 아토피 피부염 검사 방법을 제시하고자 한다.
본 발명은 종래의 조직 생검, 테이프 스트리핑 방식의 아토피 피부염 검사 방법의 문제점을 해결하기 위한 것을 목적으로 한다.
종래의 조직 생검은 집도의의 숙련된 기술이 필요하고, 환자의 고통이 수반되기에 거부감이 발생하고, 시험 후 생검 부위의 흉터가 남는 단점이 있다.
종래의 테이프 스트리핑은 테이프에 붙어 나오는 물질이 각질층으로 한정되어, 단지 보조적인 검사 방법으로 사용될 수 있을 뿐, 완전한 결과를 제공하지 못한다는 단점이 있다.
본 발명의 목적은, 기존 조직 생검 대비 고통이 거의 없고, 흉터도 남지 않고, 환자의 사용 편의성을 높일 수 있음과 동시에, 각질층 내부의 피부 인자를 채취함으로써 기존의 테이프 스트리핑 대비 분석 결과의 신뢰성을 높일 수 있는 새로운 최소 침습적 아토피 피부염 검사 방법 및 최소 침습적 아토피 피부염 검사 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 일 실시예에 따른 최소 침습적 아토피 피부염 검사 방법은, 생분해성 고분자 히알루론산으로 이루어지고 중실 구조인 복수개의 마이크로니들과, 상기 복수개의 마이크로니들이 형성된 바탕이 되는 바닥층을 포함하는 마이크로니들 패치를 대상체의 피부에 적용하는 단계와; 상기 마이크로니들 패치를 대상체의 피부에 부착한 상태에서 소정 시간 유지하는 단계와; 상기 소정 시간 경과 후 상기 마이크로니들 패치를 대상체의 피부로부터 분리하여 정량 검사에 투입하는 단계와; 상기 정량 검사 단계에서 상기 마이크로니들 패치의 마이크로니들 표면에 흡착된 인터루킨-4 및 인터루킨-13의 양을 판독하는 단계와; 상기 인터루킨-4 및 인터루킨-13의 양의 판독을 기초로 치료에 따른 아토피 피부염의 활성도를 측정하는 단계를 포함한다.
본 발명의 일 실시예에 따른 최소 침습적 아토피 피부염 검사 키트는, 대상체의 피부로부터 추출된 단백질의 양을 정량 분석할 수 있는 장비와; 생분해성 고분자 히알루론산으로 이루어지고 중실 구조인 복수개의 마이크로니들과, 상기 복수개의 마이크로니들이 형성된 바탕이 되는 바닥층을 포함하는 마이크로니들 패치를 포함한다. 상기 마이크로니들 패치가 대상체의 피부에 적용되고, 소정 시간 유지 후 분리된 상태에서, 상기 마이크로니들 패치의 마이크로니들 표면에 흡착된 대상체의 단백질이 상기 장비에 의하여 정량 분석된다. 상기 장비는 상기 마이크로니들 패치의 마이크로니들 표면에 흡착된 인터루킨-4 및 인터루킨-13의 양을 판독한다. 상기 인터루킨-4 및 인터루킨-13의 양의 판독을 기초로 아토피 피부염의 활성도가 평가된다.
이외에도 추가적인 구성이 본 발명에 따른 최소 침습적 아토피 피부염 검사 방법 또는 최소 침습적 아토피 피부염 검사 키트법에 더 제공될 수 있다.
본 발명에 따르면, 종래의 조직 생검, 테이프 스트리핑 방식의 아토피 피부염 검사 방법의 문제점이 해결될 수 있다.
종래의 조직 생검은 집도의의 숙련된 기술이 필요하고, 환자의 고통이 수반되기에 거부감이 발생하고, 시험 후 생검 부위의 흉터가 남는 단점이 있다.
종래의 테이프 스트리핑은 테이프에 붙어 나오는 물질이 각질층으로 한정되어, 단지 보조적인 검사 방법으로 사용될 수 있을 뿐, 완전한 결과를 제공하지 못한다는 단점이 있다.
본 발명에 따르면, 기존 조직 생검 대비 고통이 거의 없고, 흉터도 남지 않고, 환자의 사용 편의성을 높일 수 있음과 동시에, 각질층 내부의 피부 인자를 채취함으로써 기존의 테이프 스트리핑 대비 분석 결과의 신뢰성을 높일 수 있는 새로운 최소 침습적 아토피 피부염 검사 방법 및 최소 침습적 아토피 피부염 검사 키트가 제공될 수 있다.
도 1은 종래기술의 피부 생체 검사 방법을 도시하는 도면이다.
도 2는 본 발명에 따른 피부 생체 검사 방법을 개념적으로 도시하는 도면이다.
도 3은 아토피 피부염의 검사 방법 관련 임상 시험에 앞서 본 발명의 개념과 밀접하게 관련된 최소 침습적 피부 생체 검사 방법에 대하여 본 발명자(들)가 수행한 실험(이하, "기초 실험1"이라고 함)에서의 네 가지의 대조군을 도시하는 도면으로서, 1) 마이크로니들이 형성되지 않은 공패치, 2) 금속 재질의 중실(solid) 마이크로니들, 3) 저분자량 히알루론산 마이크로니들 패치, 4) 고분자량 히알루론산 마이크로니들 패치를 도시한다.
도 4는 기초 실험1의 네 가지의 대조군을 사용하여 30대 연령 환자군과 60대 연령 환자군에 대하여 Pro-Collagen 1 검출 시험한 결과를 도시하는 표이다.
도 5는 기초 실험1의 네 가지의 대조군 중 저분자량 히알루론산 마이크로니들 패치와 고분자량 히알루론산 마이크로니들 패치의 생체 검사 적용 전후의 길이 변화 측정 결과를 도시한 표이다.
도 6은 다른 기초 실험(이하, "기초 실험2"라고 함)의 결과를 도시한 표로서, 여기서 사용된 대조군은 1) 마이크로니들이 형성되지 않은 공패치, 2) 저분자량 히알루론산 마이크로니들 패치, 3) 고분자량 히알루론산 마이크로니들 패치며, 각각의 대조군은 20대 연령 환자군과 60대 연령 환자군에 대하여 5초와 60초 동안 피부에 적용된 후 떼어져 Pro-Collagen 1 검출 결과가 측정되었다.
도 7은 기초 실험2에 따른 대조군이 20대 연령 환자군과 60대 연령 환자군에 대하여 각각 10초와 30초 동안 피부에 적용된 후 떼어져 Pro-Collagen 1 검출 결과가 측정된 결과를 도시한 표이다.
도 8은 또 다른 기초 실험("이하, "기초 실험3"이라고 함)의 결과를 도시한 표로서, 여기서 사용된 대조군은 1) 저분자량의 키토산 마이크로니들 패치, 2) 고분자량의 키토산 마이크로니들 패치며, 각각의 대조군은 5초, 60초 및 300초 동안 피부에 적용된 후 떼어져 Pro-Collagen 1 검출 결과가 측정되었다.
도 9는 본 발명의 효과를 검증하기 위한 임상 시험에 사용된 세 종류의 패치를 촬영한 사진들이다.
도 10은 임상 시험 추진 일정을 표시한 표이다.
도 11은 임상 시험 대상자에 관한 정보를 정리한 표이다.
도 12는 테이프, 공패치, HA 마이크로니들, 중공형 니들의 네 종류 피부 검체 획득 수단들에 부착된 단백질의 양을 표시한 표이다.
도 13과 도 14는 테이프와 마이크로니들을 사용하여 각각 IL-13과 IFN-gamma의 발현양을 확인한 결과를 도시한 그래프이다.
도 15는 HA 마이크로니들을 통하여 임상 시험 대상자들로부터 획득한 피부 가검물 내 IL-4의 발현을 ELISA 시험을 통하여 측정한 표이다.
도 16은 HA 마이크로니들을 통하여 임상 시험 대상자들로부터 획득한 피부 가검물 내 IL-13의 발현을 ELISA 시험을 통하여 측정한 표이다.
도 17은 HA 마이크로니들을 통하여 임상 시험 대상자들로부터 획득한 피부 가검물 내 IFN-gamma의 발현을 ELIAS 시험을 통하여 측정한 표이다.
도 18은 HA 마이크로니들을 통하여 임상 시험 대상자들로부터 획득한 피부 가검물 내 IL-4의 발현과 아토피 피부염 임상 경과와의 상관관계를 통계분석(SPSS)을 통하여 확인한 결과를 도시한다.
도 19는 HA 마이크로니들을 통하여 임상 시험 대상자들로부터 획득한 피부 가검물 내 IL-13의 발현과 아토피 피부염 임상 경과와의 상관관계를 통계분석(SPSS)을 통하여 확인한 결과를 도시한다.
도 20은 HA 마이크로니들을 통하여 임상 시험 대상자들로부터 획득한 피부 가검물 내 IFN-gamma의 발현과 아토피 피부염 임상 경과와의 상관관계를 통계분석(SPSS)을 통하여 확인한 결과를 도시한다.
후술하는 본 발명에 대한 상세한 설명은, 본 발명이 실시될 수 있는 특정 실시예를 예시로서 도시하는 첨부 도면을 참조한다. 이러한 실시예는 당업자가 본 발명을 실시할 수 있기에 충분하도록 상세히 설명된다. 본 발명의 다양한 실시예는 서로 다르지만 상호 배타적일 필요는 없음이 이해되어야 한다. 후술하는 상세한 설명은 한정적인 의미로서 행하여지는 것이 아니며, 본 발명의 범위는 특허청구범위의 청구항들이 청구하는 범위 및 그와 균등한 모든 범위를 포괄하는 것으로 받아들여져야 한다.
이하에서는, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 본 발명을 용이하게 실시할 수 있도록 하기 위하여, 본 발명의 여러 바람직한 실시예에 관하여 첨부된 도면을 참조하여 상세히 설명하기로 한다.
최소 침습적 피부 생체 검사 방법에 관한 기초 실험 결과
도 2는 본 발명에 따른 피부 생체 검사 방법을 개념적으로 도시하는 도면이다.
도 2의 좌측 상단에는 제품명 "Therapass"인 시판 중인 마이크로니들 패치가 도시되어 있다. 이 제품은 본 출원인 회사에서 시장에 출시하여 판매 중인 제품으로서, 분자량이 1000kDa인 고분자량 히알루론산 마이크로니들 패치다. 도 2의 좌측 하단에는 이러한 마이크로니들 패치가 피부에 적용된 모습이 도시되어 있으며, 보다 구체적으로는 패치의 마이크로니들이 피부의 진피층까지 침투된 모습을 도시한다. 도 2의 우측 부분에는 피부염 환자에게 마이크로니들 패치가 적용된 후 패치의 마이크로니들에 묻어나온 피부 내 단백질을 활용하여 생체 검사를 실시하는 본 발명의 대표적인 기술적 사상이 개념적으로 도시되어 있다. 여기에 표시된 용어인 바이오 마이닝(Bio-Mining)은 생체 검사를 위하여 대상체 피부 내의 단백질을 캐낸다는 의미로 사용되었다.
도 3은 아토피 피부염의 검사 방법 관련 임상 시험에 앞서 본 발명의 개념과 밀접하게 관련된 최소 침습적 피부 생체 검사 방법에 대하여 본 발명자(들)가 수행한 기초 실험1의 네 가지의 대조군을 도시하고 있다. 이 네 가지의 대조군 중 제1 군은 마이크로니들이 형성되지 않은 공패치다. 제2 군은 금속 재질의 중실(solid) 마이크로니들이다. 제3 군은 저분자량 히알루론산 마이크로니들 패치다. 저분자량 히알루론산 마이크로니들 패치에 사용된 히알루론산 분자량은 110kDa이다. 제4 군은 고분자량 히알루론산 마이크로니들 패치다. 고분자량 히알루론산 마이크로니들 패치에 사용된 히알루론산 분자량은 1000kDa이다.
도 4는 상술한 네 가지의 대조군을 사용하여 30대 연령 환자군과 60대 연령 환자군에 대하여 Pro-Collagen 1 검출 시험한 결과를 도시하는 표이다.
도 4의 x축에는 공패치, 저분자량 히알루론산 패치와 고분자량 히알루론산 패치가 표시되어 있다. y축은 검출된 Pro-Collagen 1의 단위 부피당 질량이 밀리리터 당 피코그램의 단위로 표시되어 있다. 네 가지 대조군 중 금속 재질의 중실(solid) 마이크로니들은 표시되지 않았다. 그 이유는 단백질 정량 자체가 전혀 되지 않았기 때문이다. 도 4에 표시된 "ELISA"는 항체나 항원에 효소를 표지하고 효소의 활성을 측정하여 항원-항체 반응의 강도와 그 양을 정량적으로 측정하는 방법으로서 현대 생명공학에서 이용되고 있는 방법을 일컬는다. 이 방법은 본 발명의 실험 전반에 사용되었다.
도 4의 표에서 주의 깊게 보아야 하는 것은 제1 대조군인 공패치와의 실질적인 차별성 여부이다. 공패치는 본 발명의 출원 이전에 존재하던 종래기술로서, 검출 결과가 공패치와 실질적으로 차별화되지 않는다면 본 발명이 생체 검출 효과 향상에 이바지하는 바가 없다는 것이기 때문이다. 도 4의 결과를 보면, 저분자량(110kDa) 히알루론산 패치에서의 Pro-Collagen 1 검출량은 공패치의 경우와 실질적으로 차별화되지 않았다. 그러나, 고분자량(1000kDa) 히알루론산 패치에서에서의 Pro-Collagen 1 검출량은 공패치 및 저분자량 히알루론산 패치의 경우와 대비하여 현격히 늘어났음을 알 수 있다.
마이크로니들 패치의 성분이 되는 히알루론산의 분자량에 따라 어떻게 이와 같이 현격한 결과의 차별성이 나타나는 것인지에 대하여 본 발명자들은 실험을 지속하며 그 원인을 분석하였고, 그 원인을 분자량의 차이에 따른 피부 내로의 용해 속도에서 찾았다. 현재 상용화되고 있는 마이크로니들 패치의 마이크로니들 성분은 생체적합성이며 생분해성 고분자 물질이 대세이다. "생체적합성 물질"이란 인체에 독성이 없고 화학적으로 불활성인 물질을 의미한다. 그리고, "생분해성 물질"은 생체 내에서 체액, 효소 또는 미생물등에 의해서 분해될 수 있는 물질을 의미한다. 또한, 생분해성 물질들 중에서는 분자량이 작을수록 생체내로의 용해 속도가 빨라지고 분자량이 클수록 생체내로의 용해 속도가 느려지는 경향성이 알려져 있다. 한편, 생체적합성 고분자(biocompatible polymer)로는 다음과 같은 물질들이 알려져 있다:
히알루론산(hyaluronicacid; HA), 젤라틴(gelatin), 키토산(chitosan), 콜라겐(collagen), 알긴산, 펙틴, 카라기난, 콘드로이틴(설페이트), 덱스트란(설페이트), 폴리라이신(polylysine), 카르복시메틸티틴, 피브린, 아가로스, 풀루란, 셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈(PVP), 폴리에틸렌글리콜(PEG), 폴리비닐알콜(PVA), 히드록시프로필셀룰로스(HPC), 히드록시에틸셀룰로스(HEC), 히드록시프로필메틸셀룰로스(HPMC), 나트륨카르복시메틸셀룰로스, 폴리알콜, 아라비아검, 알기네이트, 시클로덱스트린, 덱스트린, 포도당, 과당, 녹말, 트레할로스, 글루코스, 말토스, 락토스, 락툴로스, 프럭토스, 투라노스, 멜리토스, 멜레지토스, 덱스트란, 소르비톨, 크실리톨, 팔라티니트, 폴리락트산(polylactic acid), 폴리글리콜산(polyglycolic acid), 폴리에틸렌옥사이드, 폴리아크릴산, 폴리아크릴아마이드, 폴리메타아크릴산, 폴리말레인산, 폴리에틸렌글리콜-폴리에스터공중합체(poly(ethyleneglycol)/polyester), 키토산-글리세롤포스페이트(Chitosan/glycerol phosphate), 폴리포스파젠(Polyphosphazene), 폴리카프로락톤 (Polycaprolactone), 폴리카르보네이트(Polycarbonate), 폴리에틸렌글리콜-폴리프로필렌글리콜(Poly(ethylene glycol)/poly(propylene glycol), 폴리시아노아크릴레이트 (Polycyanoacrylate), 폴리오르소에스터(Polyorthoester), 폴리하이드록시에틸메타크릴아미드락테이트 (Poly(N-(2-hydroxyethyl) methacrylamide-lactate), 폴리프로필렌포스페이트 (Poly(propylene phosphate) 등.
마이크로니들 패치를 피부에 부착하면 패치의 마이크로니들이 피부의 진피층까지 진입하는 과정에서 그리고 진입 후 유지되는 과정에서 생체적합성 마이크로니들 구조에 단백질이 달라붙었다가 추출될 수 있다. 그런데, 저분자량의 히알루론산 마이크로니들은 생체의 단백질이 그 표면에 달라붙더라도 용해 속도가 상대적으로 빨라 장시간 피부에 부착하는 경우 그 자신이 용해되면서 표면에 붙은 단백질이 유실될 수 있다. 이러한 원인으로 도 4의 실험 결과가 얻어진 것으로 분석되었다. 이를 뒷받침하는 결과가 도 6에 도시되어 있다.
도 5는 상술한 네 가지의 대조군 중 저분자량 히알루론산 마이크로니들 패치와 고분자량 히알루론산 마이크로니들 패치의 생체 검사 적용 전후의 길이 변화 측정 결과를 도시한 표이다.
도 5의 결과에 따르면, 110kDa의 저분자량 히알루론산 마이크로니들 패치의 마이크로니들은 인체의 피부에 부착되어 있는 동안 대략 30%의 길이 감소를 보였다. 한편, 1000kDa의 고분자량 히알루론산 마이크로니들 패치의 마이크로니들은 피부에 부착되어 있는 동안 대략 10%만의 길이 감소를 보였다. 이러한 실험 결과는 저분자량의 히알루론산 마이크로니들은 생체의 단백질이 그 표면에 달라붙더라도 용해 속도가 상대적으로 빨라 장시간 피부에 부착하는 경우 그 자신이 용해되면서 표면에 붙은 단백질이 유실될 수 있으며, 이것이 도 4에 도시된 실험 결과의 원인이라는 점을 뒷받침한다. 도 4 내지 도 5에 도시된 제1 실시예의 실험에서 각 대조군의 피부 부착 시간은 5분이었다. 이에, 본 발명자들은 피부로의 부착 시간을 5분보다 줄여 각기 다른 시간 길이 동안 실험을 수행할 필요를 발견하였고, 상술한 기초 실험(실험1)과는 다른 실험(실험2)을 기획하였다.
도 6은 상술한 기초 실험1과 다른 기초 실험2의 결과를 도시한 표로서, 여기서 사용된 대조군은 1) 마이크로니들이 형성되지 않은 공패치, 2) 저분자량 히알루론산 마이크로니들 패치, 3) 고분자량 히알루론산 마이크로니들 패치이며, 각각의 대조군은 20대 연령 환자군과 60대 연령 환자군에 대하여 5초와 60초 동안 피부에 적용된 후 떼어져 Pro-Collagen 1 검출 결과가 측정되었다. 저분자량 히알루론산의 분자량 및 고분자량 히알루론산의 분자량은 기초 실험1의 경우와 동일하다. 저분자량 히알루론산 마이크로니들 패치로서는 본 출원인이 시판 중인 미용 용도의 마이크로니들 패치가 사용되었으며, 고분자량 히알루론산 마이크로니들 패치로서는 본 출원인이 시판 중인 의료기기 용도의 마이크로니들 패치(상품명: "Therapass")가 사용되었다. 기초 실험1의 실험 결과 금속 재질의 중실 마이크로니들은 생체 단백질 추출 성능이 크게 미흡하였으므로, 본 실시예에서 대조군으로 사용하지 않았다.
도 6의 실험 결과로부터 다음의 사실을 알 수 있다. 첫째, 5초의 부착 시간에서는 마이크로니들 패치의 공패치 대비 유의미한 결과 향상을 기대할 수 없다. 둘째, 60초의 부착 시간에서는 마이크로니들 패치들(저분자량 및 고분자량)이 공패치 대비 현격히 뛰어난 생체 단백질 추출 성능을 보인다. 셋째, 60초의 부착 시간에서도 고분자량 마이크로니들 패치의 생체 단백질 추출 성능이 저분자량 마이크로니들 패치의 생체 단백질 추출 성능보다 뛰어나다. 본 발명자들은 도 6의 실험 결과를 토대로 부착 시간이 5초를 초과하고 60초보다는 짧은 시간대에 대하여 추가적인 결과를 얻기 위하여 도 7의 실험을 추가적으로 진행하였다.
도 7은 기초 실험2에 따른 대조군이 20대 연령 환자군과 60대 연령 환자군에 대하여 각각 10초와 30초 동안 피부에 적용된 후 떼어져 Pro-Collagen 1 검출 결과가 측정된 결과를 도시한 표이다.
공패치의 경우에는 10초 부착시나 30초 부착시나 결과의 유의미한 변화가 없었고, 도 7의 표에는 30초 부착시의 결과만 표기하였다. 도 7의 결과로부터 알 수 있는 사실은 다음과 같다. 첫째, 10초의 부착 시간으로도 공패치 대비 대폭 향상된 마이크로니들 패치들(저분자량 및 고분자량)의 생체 단백질 추출 성능을 확인 가능하다. 둘째, 10초의 부착 시간에서는 저분자량 마이크로니들 패치와 고분자량 마이크로니들 패치의 단백질 추출 성능이 대동소이하다. 셋째, 30초의 부착 시간에서는 고분자량 마이크로니들 패치의 단백질 추출 성능이 저분자량 마이크로니들 패치의 단백질 추출 성능을 눈에 띄게 능가한다.
10초 이상의 부착 시간을 유지하는 경우 마이크로니들 패치의 생체 검사 성능이 유의미하게 발휘될 수 있다는 점, 저분자량 마이크로니들이 피부로 용해될 정도의 시간이 경과하기 전인 10초 정도의 부착 시간에서는 저분자량 마이크로니들 패치가 고분자량 마이크로니들 패치와 대동소이한 생체 검사 성능을 보인다는 점을 확인한 것에 도 7의 실험의 기술적 의의가 있다고 평가된다.
마지막으로 본 발명자들은 히알루론산 외에 다른 생체적합성 고분자물질로 이루어진 마이크로니들 패치가 생체 검사 용도로 활용되기에 적합한지 알아보기 위하여 키토산 재질의 마이크로니들 패치를 사용하여 도 9의 실험(기초 실험3)을 진행하였다. 키토산은 히알루론산과 마찬가지로 생체적합성 고분자 물질이긴 하지만, 생분해성은 아니다. 키토산은 갑각류에 함유되어 있는 키틴을 인체에 흡수가 쉽도록 가공한 물질로서, 노폐해진 세포를 활성화하여 노화를 억제하고 면역력을 강화시켜 주는 효과가 알려져 있다. 피부 세포의 활성화 측면에서도 효과가 입증되어 화장품 성분 물질로 널리 사용되고 있으며, 피부 미용 목적의 마이크로니들 패치의 성분으로도 사용되고 있다.
도 8은 기초 실험3의 결과를 도시한 표로서, 여기서 사용된 대조군은 1) 저분자량의 키토산 마이크로니들 패치, 2) 고분자량의 키토산 마이크로니들 패치며, 각각의 대조군은 5초, 60초 및 300초 동안 피부에 적용된 후 떼어져 Pro-Collagen 1 검출 결과가 측정되었다.
도 8의 실험에서 저분자량 키토산1의 분자량은 50 내지 100kDa이다. 고분자량 키토산2의 분자량은 250 내지 350kDa이다. 20대 연령 환자군에 대하여 5초, 1분, 5분 부착 후 Pro-Collagen I의 발현을 확인하였다. 도 8에 표시한 실시예3의 실험 결과로부터 본 발명자들은 생체적합성 고분자 물질 중 하나인 키토산도 히알루론산과 마찬가지로 생체 검사를 위한 단백질 추출 기능을 발휘할 수 있다는 점이다. 본 명세서에 예시한 히알루론산과 키토산 이외의 다양한 다른 생체적합성 고분자 물질들도 최소 침습적 피부 생체검사를 위한 마이크로니들 패치 재질의 후보군이 될 가능성은 충분히 열려 있다고 볼 수 있다.
새로운 아토피 피부염 검사 방법에 관한 연구 결과(임상 시험의 수행)
먼저, 도 9는 본 발명의 효과를 검증하기 위한 임상 시험에 사용된 세 종류의 패치를 촬영한 사진들이다.
도 9의 좌측의 공패치는 하이드로콜로이드 재질 패치로만 구성되고, 그 위에 니들 구조가 형성되어 있지 않다. 가운데의 중공형 패치는 INCYTO사에서 상업적으로 시판 중인 마이크로니들로서, 가늘고 긴 금속 재질 니들의 중앙에 마이크로 사이즈의 단면적을 갖는 구멍이 형성된 구조이다. 우측의 히알루론산(HA) 마이크로니들 패치로서는 제품명 "Therapass"인 시판 중인 마이크로니들 패치가 도시되어 있다. 이 제품은 본 출원인 회사에서 시장에 출시하여 판매 중인 제품으로서, 분자량이 1000kDa인 고분자량 히알루론산 마이크로니들 패치이다.
본 임상 시험의 목표 대상자 수는 아토피 피부염 환자 20명(전완부)로 하였다. 연구기간은 IRB 승인 후 5개월 간으로 하였다. 연구 방법은 다음과 같다.
1) 0주차
- 조직검사: 3mm 조직검사
- 테이프 스트리핑: D-Squame disk 테이프로 스트리핑 15회 시행
- 단백질 추출: SDS를 이용하여 테이프 또는 마이크로니들 패치의 단백질 추출
2) 2주차
- 3종의 마이크로니들 패치 검사: 3종의 마이크로니들 패치 5분 부착 후 떼어냄
- 단백질 추출: SDS를 이용하여 테이프 또는 마이크로니들 패치의 단백질 추출
이와 같이 0주차와 2주차에 각각 대상자에 대한 검사를 실시하고 그 검사 결과를 임상적 경과와 비교함으로써 검사 방법의 임상적 유용성을 확인하였다. 이러한 확인에 있어서, 단백질 정량은 BCA assay를 통한 단백질 정량으로 실시하였고, ELISA 측정을 실시하여 IL-4, IL-13, IFN-gamma의 정량화를 실시하였다. 통계분석 기법으로는 SPSS를 사용하였다.
도 10은 임상 시험 추진 일정을 표시한 표이다. 상술한 바와 같이, IRB 후 5개월 간 임상 시험이 진행되었다. 시험 대상자를 모집한 후 방문 0주차에 조직 생검, D-squame tape stripping, 공패치, HA 마이크로니들, 중공형 니들 패치가 대상자들에 적용되었으며, 검출 수단 각각으로부터 단백질이 분리되었다. 방문 2주차에는 공패치, HA 마이크로니들, 중공형 니들 패치가 대상자들에 적용되었으며, 검출 수단 각각으로부터 단백질이 분리되었다. 최종적으로, 분리된 단백질 양에 대한 정량이 이루어졌고, IL-4, IL-13, IFN-gamma에 대한 ELISA 진행이 이루어졌고, 데이터가 분석되었다.
도 11은 임상 시험 대상자에 관한 정보를 정리한 표이다. 도 11의 표는 본 임상 시험에 참여한 시험 대상자의 성별, 나이, 2주 후 증상의 경과를 보여주고 있다(10번 환자의 경과에 대한 "sl improved"의 표 상의 표기는 slightly improved, 즉 약간 호전된 경과를 의미함). Fail을 제외하고 총 20명의 시험 대상자가 등록되어 연구 진행하였다. 도 11의 표에서 다른 대상자들과 구별 가능하도록 표시된, 4번, 5번, 7번, 16번, 20번 및 26번 대상자는 2차 패치 탈부착을 거부하여 시험 대상자로부터 제외하였다.
0주차에는 전완부 조직 생검, 테이프 스트리핑 및 3종의 마이크로니들 패치를 이용하여 피부 가검물을 획득하였고, 2주차에는 3종의 마이크로니들 패치를 이용하여 피부 가검물을 획득하였다. 획득한 가검물은 60 mm dish에 담아 즉시 연구실에서 SDS 용액을 이용하여 단백질을 추출하였고 섭씨 영하 80도에서 보관하였다.
도 12는 테이프, 공패치, HA 마이크로니들, 중공형 니들의 네 종류 피부 검체 획득 수단들에 부착된 단백질의 양을 표시한 표이다. 획득한 피부 가검물은 BCA assay를 통해 단백질 정량 하였다. 0주차에 테이프, 공패치, 히알루론산 마이크로니들, 중공형 니들이 모두 환자들에게 적용되었다. 2주 후에는 테이프를 제외하고 공패치, 히알루론산 마이크로니들 및 중공형 니들이 환자들에게 제공되었다. 정상인에게는 중공형 니들을 제외하고 테이프, 공패치, 히알루론산 마이크로니들이 적용되었다.
정량된 단백질량은 도 12의 그래프에서 확인 가능하다(정상인은 IRB에 포함되어 있지 않음). 도 12의 그래프에서 y축인 NET OD(흡광도) 값은 '피부 가검물을 통해 획득한 단백질의 OD 값' - '각 패치의 Blank 상태의 OD 값'으로 구하였다. 단백질 정량 결과를 통해, 공패치 또는 중공형 니들 패치에서는 테이프나 히알루론산 마이크로니들 패치에 비해 단백질이 거의 추출되지 않음을 확인하였다. 이를 통해, 비침습적 방법을 이용한 타겟 인자 검출을 위해서는 공패치나 중공형 니들은 적합하지 않음을 확인하였다.
정상인과 아토피피부염 환자에서 조직생검, 테이프와 마이크로니들로 획득한 가검물에서 IL-4, IL-13과 IFN-gamma의 발현양을 확인하였다. 조직생검의 경우 RNA를 채취하여 qRT-PCR 시험을 통해 IL-4, IL-13과 IFN-gamma의 발현양을 확인하였고, 아토피피부염 환자의 샘플과는 달리 정상인에서는 위의 타겟들의 발현이 확인되지 않았다. 다음으로, 테이프와 마이크로니들의 경우 단백질을 채취하여 ELISA 시험을 통해 IL-13과 IFN-gamma의 발현양을 확인하였다. 도 13과 도 14에 도시된 바와 같이, 테이프를 이용한 가검물에서는 정상인과 아토피피부염 환자 모두에서 위의 타겟들의 발현이 확인되지 않았지만, 마이크로니들 패치를 이용한 가검물에서는 정상인에 비해 아토피피부염 환자에서 IL-13과 IFN-gamma의 발현양이 높게 확인되었다.
획득한 가검물 내 IL-4, IL-13, IFN-gamma의 발현은 ELISA 시험을 통하여 측정하였다. 그 결과가 도 15 내지 도 17에 도시된다. 도 15는 HA 마이크로니들을 통하여 임상 시험 대상자들로부터 획득한 피부 가검물 내 IL-4의 발현을 ELISA 시험을 통하여 측정한 표이다. 도 16은 HA 마이크로니들을 통하여 임상 시험 대상자들로부터 획득한 피부 가검물 내 IL-13의 발현을 ELISA 시험을 통하여 측정한 표이다. 도 17은 HA 마이크로니들을 통하여 임상 시험 대상자들로부터 획득한 피부 가검물 내 IFN-gamma의 발현을 ELIAS 시험을 통하여 측정한 표이다.
도 15 내지 도 17의 측정 결과를 통하여 아토피 피부염 환자의 0주차와 2주차 방문 시 히알루론산 마이크로니들 패치를 이용하여 획득한 피부 가검물 내 타겟 단백질 양의 변화가 확인되었다.
보다 구체적으로, 도 15의 측정 결과를 아래에 설명한다.
1번 환자 0주차 IL-4의 OD 수치는 0.021이다. 2주차 IL-4의 OD 수치는 0.044이다.
2번 환자 0주차 IL-4의 OD 수치는 0.029이다. 2주차 IL-4의 OD 수치는 0.012이다.
3번 환자 0주차 IL-4의 OD 수치는 0.026이다. 2주차 IL-4의 OD 수치는 0.017이다.
6번 환자 0주차 IL-4의 OD 수치는 0.053이다. 2주차 IL-4의 OD 수치는 0.043이다.
8번 환자 0주차 IL-4의 OD 수치는 0.025이다. 2주차 IL-4의 OD 수치는 0.021이다.
9번 환자 0주차 IL-4의 OD 수치는 0.072이다. 2주차 IL-4의 OD 수치는 0.141이다.
10번 환자 0주차 IL-4의 OD 수치는 0.065이다. 2주차 IL-4의 OD 수치는 0.093이다.
11번 환자 0주차 IL-4의 OD 수치는 0.012이다. 2주차 IL-4의 OD 수치는 0.098이다.
12번 환자 0주차 IL-4의 OD 수치는 0.053이다. 2주차 IL-4의 OD 수치는 0.095이다.
13번 환자 0주차 IL-4의 OD 수치는 0.026이다. 2주차 IL-4의 OD 수치는 0.022이다.
14번 환자 0주차 IL-4의 OD 수치는 0.029이다. 2주차 IL-4의 OD 수치는 0.027이다.
15번 환자 0주차 IL-4의 OD 수치는 0.034이다. 2주차 IL-4의 OD 수치는 0.025이다.
17번 환자 0주차 IL-4의 OD 수치는 0.036이다. 2주차 IL-4의 OD 수치는 0.027이다.
18번 환자 0주차 IL-4의 OD 수치는 0.038이다. 2주차 IL-4의 OD 수치는 0.025이다.
19번 환자 0주차 IL-4의 OD 수치는 0.023이다. 2주차 IL-4의 OD 수치는 0.021이다.
21번 환자 0주차 IL-4의 OD 수치는 0.026이다. 2주차 IL-4의 OD 수치는 0.052이다.
22번 환자 0주차 IL-4의 OD 수치는 0.012이다. 2주차 IL-4의 OD 수치는 0.038이다.
23번 환자 0주차 IL-4의 OD 수치는 0.031이다. 2주차 IL-4의 OD 수치는 0.017이다.
24번 환자 0주차 IL-4의 OD 수치는 0.035이다. 2주차 IL-4의 OD 수치는 0.028이다.
25번 환자 0주차 IL-4의 OD 수치는 0.025이다. 2주차 IL-4의 OD 수치는 0.024이다.
보다 구체적으로, 도 16의 측정 결과를 아래에 설명한다.
1번 환자 0주차 IL-13의 Net OD 수치는 0.0027이다. 2주차 IL-13의 Net OD 수치는 0.0017이다.
2번 환자 0주차 IL-13의 Net OD 수치는 0.0072이다. 2주차 IL-13의 Net OD 수치는 0.0002이다.
3번 환자 0주차 IL-13의 Net OD 수치는 0.0072이다. 2주차 IL-13의 Net OD 수치는 0.0017이다.
6번 환자 0주차 IL-13의 Net OD 수치는 0.0132이다. 2주차 IL-13의 Net OD 수치는 0.0077이다.
8번 환자 0주차 IL-13의 Net OD 수치는 0.0062이다. 2주차 IL-13의 Net OD 수치는 0.0059이다.
9번 환자 0주차 IL-13의 Net OD 수치는 0.0059이다. 2주차 IL-13의 Net OD 수치는 0.0069이다.
10번 환자 0주차 IL-13의 Net OD 수치는 0.0052이다. 2주차 IL-13의 Net OD 수치는 0.0059이다.
11번 환자 0주차 IL-13의 Net OD 수치는 0.0052이다. 2주차 IL-13의 Net OD 수치는 0.0052이다.
12번 환자 0주차 IL-13의 Net OD 수치는 0.0022이다. 2주차 IL-13의 Net OD 수치는 0.0062이다.
13번 환자 0주차 IL-13의 Net OD 수치는 0.0132이다. 2주차 IL-13의 Net OD 수치는 0.0067이다.
14번 환자 0주차 IL-13의 Net OD 수치는 0.0072이다. 2주차 IL-13의 Net OD 수치는 0.0069이다.
15번 환자 0주차 IL-13의 Net OD 수치는 0.0037이다. 2주차 IL-13의 Net OD 수치는 0.0042이다.
17번 환자 0주차 IL-13의 Net OD 수치는 0.0042이다. 2주차 IL-13의 Net OD 수치는 0.0037이다.
18번 환자 0주차 IL-13의 Net OD 수치는 0.0027이다. 2주차 IL-13의 Net OD 수치는 0.0032이다.
19번 환자 0주차 IL-13의 Net OD 수치는 0.0059이다. 2주차 IL-13의 Net OD 수치는 0.0049이다.
21번 환자 0주차 IL-13의 Net OD 수치는 0.0065이다. 2주차 IL-13의 Net OD 수치는 0.0082이다.
22번 환자 0주차 IL-13의 Net OD 수치는 0.0102이다. 2주차 IL-13의 Net OD 수치는 0.0102이다.
23번 환자 0주차 IL-13의 Net OD 수치는 0.0079이다. 2주차 IL-13의 Net OD 수치는 0.0079이다.
24번 환자 0주차 IL-13의 Net OD 수치는 0.0137이다. 2주차 IL-13의 Net OD 수치는 0.0092이다.
25번 환자 0주차 IL-13의 Net OD 수치는 0.0502이다. 2주차 IL-13의 Net OD 수치는 0.0082이다.
보다 구체적으로, 도 17의 측정 결과를 아래에 설명한다.
1번 환자 0주차 IFN-gamma의 Net OD 수치는 0.0220이다. 2주차 IFN gamma의 Net OD 수치는 0.0380이다.
2번 환자 0주차 0주차 IFN-gamma의 Net OD 수치는 -0.0005 이다. 2주차 IFN gamma의 Net OD 수치는 0.0410이다.
3번 환자 0주차 IFN-gamma의 Net OD 수치는 0.0015이다. 2주차 IFN gamma의 Net OD 수치는 -0.0045이다.
6번 환자 0주차 IFN-gamma의 Net OD 수치는 0.0350이다. 2주차 IFN gamma의 Net OD 수치는 0.0140이다.
8번 환자 0주차 IFN-gamma의 Net OD 수치는 0.0395이다. 2주차 IFN gamma의 Net OD 수치는 0.0340이다.
9번 환자 0주차 IFN-gamma의 Net OD 수치는 0.0345이다. 2주차 IFN gamma의 Net OD 수치는 0.0640이다.
10번 환자 0주차 IFN-gamma의 Net OD 수치는 0.0145이다. 2주차 IFN gamma의 Net OD 수치는 0.0320이다.
11번 환자 0주차 IFN-gamma의 Net OD 수치는 0.0515이다. 2주차 IFN gamma의 Net OD 수치는 0.0465이다.
12번 환자 0주차 IFN-gamma의 Net OD 수치는 0.0295이다. 2주차 IFN gamma의 Net OD 수치는 0.0340이다.
13번 환자 0주차 IFN-gamma의 Net OD 수치는 0.0410이다. 2주차 IFN gamma의 Net OD 수치는 0.0340이다.
14번 환자 0주차 IFN-gamma의 Net OD 수치는 0.0380이다. 2주차 IFN gamma의 Net OD 수치는 0.0615이다.
15번 환자 0주차 IFN-gamma의 Net OD 수치는 0.0455이다. 2주차 IFN gamma의 Net OD 수치는 0.0560이다.
17번 환자 0주차 IFN-gamma의 Net OD 수치는 0.0310이다. 2주차 IFN gamma의 Net OD 수치는 0.0390이다.
18번 환자 0주차 IFN-gamma의 Net OD 수치는 0.0405이다. 2주차 IFN gamma의 Net OD 수치는 0.0275이다.
19번 환자 0주차 IFN-gamma의 Net OD 수치는 0.0510이다. 2주차 IFN gamma의 Net OD 수치는 0.0415이다.
21번 환자 0주차 IFN-gamma의 Net OD 수치는 0.0285이다. 2주차 IFN gamma의 Net OD 수치는 0.0000이다.
22번 환자 0주차 IFN-gamma의 Net OD 수치는 0.0160이다. 2주차 IFN gamma의 Net OD 수치는 0.0255이다.
23번 환자 0주차 IFN-gamma의 Net OD 수치는 0.0140이다. 2주차 IFN gamma의 Net OD 수치는 0.0260이다.
24번 환자 0주차 IFN-gamma의 Net OD 수치는 0.0230이다. 2주차 IFN gamma의 Net OD 수치는 0.0320이다.
25번 환자 0주차 IFN-gamma의 Net OD 수치는 0.0365이다. 2주차 IFN gamma의 Net OD 수치는 0.0285이다.
본 발명자(들)는 히알루론산 마이크로니들 패치를 이용하여 획득한 피부 가검물 내 타겟 단백질의 발현과 아토피 피부염 임상 경과와의 상관 관계를 통계분석(SPSS)를 통해 확인하였다. 그 결과가 도 18 내지 도 20에 도시된다.
상기 상관 관계의 통계분석을 위하여, 본 발명자(들)는 병변의 임상 경과에 따라 차등적인 점수를 부여하였다. 증세가 현저히 악화되었거나 다소 악화된 것으로 임상적 판단이 내려진 12번과 15번 환자에 대해서는 -1점, 15번 이외의 모든 환자에 대해서는 1점을 부여하였다. 도 11의 표의 최우측에 표시된 2주 후 임상 경과를 보면, 12번 환자의 경우 "so so + 두드러기" 증상이 표시되어 있고 증세가 다소 악화된 것으로 임상적 판단이 내려졌다. 15번 환자의 경우 "aggravated"로 표시되어 있고 증세가 현저히 악화된 것으로 임상적 판단이 내려졌다. 나머지 환자의 경우 증세가 유지되거나 좋아지는 것으로 임상적 판단이 내려졌다.
도 18 내지 도 20의 상부에 도시된 그래프의 X축은 임상 경과를 나타낸다. 이 그래프들의 Y축은 각각 IL-4, IL-13 및 IFN-gamma의 변화량('2주차에서의 타겟 발현량' - '0주차에서의 타겟 발현량')을 나타낸다. 통계분석 결과 아토피 피부염 임상 경과와 IL-4 및 IL-13의 변화량 간의 유의한 상관관계를 확인하였다(p<0.05). 또한, 통계분석 결과 아토피 피부염 임상 경과와 IFN-gamma의 변화량 사이에는 상관관계가 없음이 확인되었다. 이를 통해, 비침습적 방법(히알루론산 마이크로니들 패치의 적용)을 이용한 타겟인자 검출의 임상적 유용성을 검증하였다. 정리하면, 아토피 증상 완화된 환자에게서 인터루킨-4와 인터루킨-13의 검출양이 감소되었고, 아토피 증상이 악화된 환자에게서 인터루킨-4와 인터루킨-13의 검출양이 증가한 사실을 확인하였고, 이로부터 조직생검과 같은 침습적 시술 없이 생분해성 고분자 히알루론산 마이크로니들을 인체에 부착하였다가 떼어낸 후 병인에 중요한 바이오마커의 발현양 변화를 측정함으로써 의사를 포함한 의료진의 임상적 판단을 개입시키지 않고서도 신뢰성 있는 아토피 피부염의 활성도 측정이 가능하게 되었다.
아울러, 생분해성 고분자 히알루론산으로 형성되는 마이크로니들 패치와 인체의 피부로부터 얻어진 단백질의 정량 분석이 가능한 장비로 구성되는 본 발명의 일 실시예에 따른 최소 침습적 아토피 피부염 검사 키트를 활용하면, 의료인의 의학적 지식 또는 경험에 의존하지 않고 미리 결정된 수치와 정량 분석 장비에 의하여 얻어진 인터루킨-4 및 인터루킨-13의 양에 관한 수치를 단순 비교함으로써 아토피 피부염의 활성도를 용이하고 정확하게 평가할 수 있다. 상기한 아토피 피부염의 활성도 평가는 본 발명의 일 실시예에 따른 아토피 피부염 검사 키트에 포함될 수 있는 기능부에 의하여 자동으로 수행될 수도 있다. 이러한 경우, 상기 기능부는, 정량 분석 장비로부터 얻어지는 인터루킨-4 및 인터루킨-13의 양에 관한 데이터와의 비교 대상이 되는, 이들과 아토피 피부염 활성도의 상관관계에 관한 데이터를 저장하는 저장부와, 정량 분석 장비로부터 데이터를 전달하는 인터페이스부와, 상기 저장소에 저장된 데이터와 상기 정량 분석 장비로부터 전달된 데이터를 비교 판단하여 아토피 피부염 활성도에 관한 정보를 생성하는 비교 판단부와, 상기 비교 판단부에서 생성된 정보가 표시되는 표시부를 포함하도록 구성될 수도 있다.
이상에서 본 발명이 구체적인 구성요소 등과 같은 특정 사항들과 한정된 실시예 및 도면에 의해 설명되었으나, 이는 본 발명의 보다 전반적인 이해를 돕기 위해서 제공된 것일 뿐, 본 발명이 상기 실시예들에 한정되는 것은 아니며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적인 지식을 가진 자라면 이러한 기재로부터 다양한 수정 및 변형을 꾀할 수 있다.
따라서, 본 발명의 사상은 상기 설명된 실시예에 국한되어 정해져서는 아니 되며, 후술하는 특허청구범위뿐만 아니라 이 특허청구범위와 균등하게 또는 등가적으로 변형된 모든 것들은 본 발명의 사상의 범주에 속한다고 할 것이다.

Claims (10)

  1. 생분해성 고분자 히알루론산으로 이루어지고 중실 구조인 복수개의 마이크로니들과, 상기 복수개의 마이크로니들이 형성된 바탕이 되는 바닥층을 포함하는 마이크로니들 패치를 대상체의 피부에 적용하는 단계와,
    상기 마이크로니들 패치를 대상체의 피부에 부착한 상태에서 소정 시간 유지하는 단계와,
    상기 소정 시간 경과 후 상기 마이크로니들 패치를 대상체의 피부로부터 분리하여 정량 검사에 투입하는 단계와,
    상기 정량 검사 단계에서 상기 마이크로니들 패치의 마이크로니들 표면에 흡착된 인터루킨-4 및 인터루킨-13의 양을 판독하는 단계와,
    상기 인터루킨-4 및 인터루킨-13의 양의 판독을 기초로 아토피 피부염의 활성도를 평가하는 단계를 포함하는,
    최소 침습적 아토피 피부염 검사 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 정량 검사는 ELISA 측정인,
    최소 침습적 아토피 피부염 검사 방법.
  3. 제2항에 있어서, 검출된 IFN-gamma의 양은 아토피 피부염의 활성도 평가에 고려되지 않는,
    최소 침습적 아토피 피부염 검사 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 소정 시간은 마이크로니들을 구성하는 히알루론산의 분자량에 따른 용해속도를 고려하여 사전에 결정되는,
    최소 침습적 아토피 피부염 검사 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 마이크로니들을 구성하는 히알루론산의 분자량이 저분자량에서 고분자량으로 갈수록 대상체의 피부로의 부착 시간을 길게 할 수 있고, 생체 검출 성능이 향상되는,
    최소 침습적 아토피 피부염 검사 방법.
  6. 대상체의 피부로부터 추출된 단백질의 양을 정량 분석할 수 있는 장비와,
    생분해성 고분자 히알루론산으로 이루어지고 중실 구조인 복수개의 마이크로니들과, 상기 복수개의 마이크로니들이 형성된 바탕이 되는 바닥층을 포함하는 마이크로니들 패치를 포함하고,
    상기 마이크로니들 패치가 대상체의 피부에 적용되고, 소정 시간 유지 후 분리된 상태에서, 상기 마이크로니들 패치의 마이크로니들 표면에 흡착된 대상체의 단백질이 상기 장비에 의하여 정량 분석되고,
    상기 장비는 상기 마이크로니들 패치의 마이크로니들 표면에 흡착된 인터루킨-4 및 인터루킨-13의 양을 판독하고,
    상기 인터루킨-4 및 인터루킨-13의 양의 판독을 기초로 아토피 피부염의 활성도가 평가되는,
    최소 침습적 아토피 피부염 검사 키트.
  7. 제6항에 있어서, 상기 장비에 의하여 ELISA 측정이 이루어지는,
    최소 침습적 아토피 피부염 검사 키트.
  8. 제7항에 있어서, 검출된 IFN-gamma의 양은 아토피 피부염의 활성도 평가에 고려되지 않는,
    최소 침습적 아토피 피부염 검사 키트.
  9. 제8항에 있어서, 상기 소정 시간은 마이크로니들을 구성하는 히알루론산의 분자량에 따른 용해속도를 고려하여 사전에 결정되는,
    최소 침습적 아토피 피부염 검사 키트.
  10. 제9항에 있어서, 상기 마이크로니들을 구성하는 히알루론산의 분자량이 저분자량에서 고분자량으로 갈수록 대상체의 피부로의 부착 시간을 길게 할 수 있고, 생체 검출 성능이 향상되는,
    최소 침습적 아토피 피부염 검사 키트.
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