WO2021172579A1 - 細胞処理剤 - Google Patents

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WO2021172579A1
WO2021172579A1 PCT/JP2021/007587 JP2021007587W WO2021172579A1 WO 2021172579 A1 WO2021172579 A1 WO 2021172579A1 JP 2021007587 W JP2021007587 W JP 2021007587W WO 2021172579 A1 WO2021172579 A1 WO 2021172579A1
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WO
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cells
cell
sulfated
alginic acid
suspended
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PCT/JP2021/007587
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Inventor
明郎 萩原
Original Assignee
株式会社彩
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0068—General culture methods using substrates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/70—Polysaccharides
    • C12N2533/74—Alginate
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2539/00—Supports and/or coatings for cell culture characterised by properties
    • C12N2539/10—Coating allowing for selective detachment of cells, e.g. thermoreactive coating

Definitions

  • the present invention relates to a cell treatment agent, and particularly for cells in tissues such as organs and tissues of a living body or cultured cells, cell detachment / suspension, dormancy, retention of viability, suppression of death, and suspension. Alternatively, it relates to a cell treatment agent used in the treatment of activation of dormant cells.
  • non-adhesive cells such as unicellular organisms, blood cells, and cancer cells
  • adhesive cells hereinafter, may be simply referred to as "cells"
  • the majority of cells, adhesive cells survive and proliferate.
  • the scaffold of the extracellular matrix that constitutes the body and in the culture substrate, it adheres to the wall of the culture vessel or the scaffold such as a predetermined carrier to survive, exert its function, or proliferate. ..
  • cells When such cells are used in research or medicine, they need to be detached from the scaffold and suspended without weakening them.
  • Non-Patent Document 1 for a surfactant method using a surfactant.
  • Non-Patent Document 2 A processing method for floating is known (Non-Patent Document 2).
  • surfactants and cell exfoliating enzymes used in these exfoliation / suspension treatments also digest important constituents of the cells themselves. Therefore, if the surfactant or cell exfoliating enzyme continues to act on the cells even after exfoliation / suspension, the suspended cells weaken and eventually die.
  • surfactants and cell exfoliating enzymes are cytotoxic. In order to prevent suspended cells from this cytotoxicity, after the cells are suspended, these suspended cells are separated from surfactants and cell exfoliating enzymes, or the separated cells are washed or treated with surfactants or enzymes. To eliminate the cytotoxic effects of surfactants and cell exfoliating enzymes.
  • Non-Patent Document 3 a method has been developed in which cells are detached and suspended by using a special polymer as a temperature-sensitive cell culture scaffold and heating a portion of this polymer to a certain temperature ().
  • this method is expensive using a special polymer, requires a special temperature control device, the temperature control is difficult and the result is not stable, and a three-dimensional and complicated device for culturing a large number of cells. It has been pointed out that it cannot be used in, and that it is impossible to exfoliate and suspend cells in tissues from living organs.
  • cells are generally transported and stored in a liquid for storing and transporting cells (preservation transport liquid), but at room temperature (normal temperature), cells weaken over time, so they are stored in a refrigerated or frozen state. Transport and return to room temperature before use.
  • cells especially cells that are currently in an undifferentiated or poorly differentiated state and have abundant ability to proliferate and regenerate and form tissues and organs in the future, undergo unnecessary differentiation when preserved, and the cells It may change to show properties different from the tissue / organ that you want to regenerate / form using. Maintaining an undifferentiated or poorly differentiated state by dormant cell function throughout the period of cell storage and suppressing this unnecessary differentiation is an important item in regenerative medicine. The means have not yet been established, and the establishment of the solution is desired.
  • alginic acid or alginate is used in the fields of foods, cosmetics, medical devices and the like.
  • a thickener an active ingredient of health food having an effect of inhibiting the absorption of cholesterol, in the cosmetic field, as a moisturizer, etc.
  • a constituent component of a base material for adhesive cell culture (patented). It is used as Document 1) and the like.
  • cells die when the cells in the tissue or the cultured cells are exfoliated and suspended from, for example, an organ or tissue of a living body or a culture medium of a living cell.
  • B Obtaining suspended cells in a state in which the viability of the cells is maintained at the time of exfoliation / suspension, that is, not reducing the viability of the cells. Desired.
  • cells especially cells that are currently in an undifferentiated or poorly differentiated state and have the ability to proliferate in the future and regenerate and form tissues and organs, dormant cell functions throughout the storage period to suppress unnecessary differentiation. However, it is necessary to maintain it in an undifferentiated or poorly differentiated state.
  • the adhered cells when the suspended and dormant cells are adhered to a living organ, a culture substrate, or the like, it is desired that the adhered cells can be easily adhered, and the adhered cells are activated. It is necessary to let it grow.
  • the exfoliated / suspended cells in order for the exfoliated / suspended cells to adhere to the scaffold which is the culture substrate such as the wall of the culture vessel or a predetermined carrier, that is, to "plant” such cells, the normal culture conditions are maintained. It must be kept in contact with the scaffold for 12 to 24 hours in the device. If the contact is poor, the cells cannot be planted on the scaffold. In particular, in order to implant cells in a specific local part of the living body, it is necessary to keep the cells in contact with the scaffold of the living body for 12 to 24 hours.
  • a scaffold such as a non-woven fabric is usually brought into contact with cells for 12 to 24 hours in vitro to adhere the cells to the scaffold of the non-woven fabric, and the scaffold to which the cells are adhered is desired locally in the living body. Is being planted in. However, there is a problem that such planting takes time and labor.
  • an object of the present invention is, for example, that it is possible to suppress the death of intracellular cells or cultured cells in a cell container containing an organ or tissue of a living body, a cell culture substrate, or the like, and its viability. ), For example, peeling / floating treatment, dormant treatment (not only enhancing the protective effect when dormant, but also suppressing unnecessary differentiation of cells to maintain undifferentiated / poorly differentiated state), storage and transportation. Safe and convenient method that can safely and easily perform protective treatment for, and floating or dormant cell activation treatment for planting dormant cells (for example, suspended cells, etc.) Is to provide a method that can be done in.
  • dormant treatment not only enhancing the protective effect when dormant, but also suppressing unnecessary differentiation of cells to maintain undifferentiated / poorly differentiated state
  • Safe and convenient method that can safely and easily perform protective treatment for, and floating or dormant cell activation treatment for planting dormant cells (for example, suspended cells, etc.)
  • the present inventor conducted a diligent study to solve the above-mentioned problems. As a result, it was found that the above-mentioned problems can be solved by using sulfated alginic acid.
  • the gist of the present invention is as follows.
  • a cell treatment agent containing sulfated alginic acid as an active ingredient (2) The cell treatment agent according to (1) above, wherein the sulfated alginic acid contains more than 10% of sulfated alginic acid in which a sulfate group is introduced into the carbon atom at the 6-position in the total sulfated alginic acid. (3) The cell treatment agent according to (1) or (2) above, which comprises at least one selected from a cell culture solution, an extracellular fluid replacement solution and a maintenance infusion solution.
  • the cell treatment agent according to any one of (1) to (3) above which is used for cell preservation for maintaining cells in an undifferentiated or poorly differentiated state.
  • the cell treatment agent according to any one of (1) to (3) and (5) to (7) above which is a liquid for cell preservation, tissue preservation or organ preservation.
  • a set for activating suspended or dormant cells which is a combination reagent of the cell treatment agent according to any one of (1) to (8) above and an activator containing a polyvalent cation. reagent.
  • sulfated alginic acid contains a pharmacologically acceptable salt thereof.
  • “Scaffold” means what is known in the art as one of the three elements of regenerative medicine. Adhesive cells, which make up most of the cells that make up a living body, need to be in a state of being adhered to a fixed base in order to exert their original functions (including proliferation). This foundation is called a “scaffold” in regenerative medicine. Adhesive cells cannot perform their original function when suspended in a liquid.
  • This scaffold can be an artificial scaffold or a natural scaffold.
  • An example of an artificial scaffold is a petri dish wall or the like in a base material for artificial cell culture such as a petri dish.
  • Living tissues and organs are composed of cells and extracellular matrix (including collagen fibers and proteoglycans) surrounding the cells. Adhesive cells exist by adhering to this extracellular matrix and exert their functions in vivo.
  • An example of a scaffold in a natural state is an extracellular matrix to which cells adhere in this biological tissue.
  • the three elements of regenerative medicine are "cells” that make up tissues and organs, “physiologically active substances” that are signal factors for the function of cells, and “scaffolding" for cells and physiologically active substances to move. ) ”.
  • “Dormancy” means that a cell has viability and stops or decreases the activity of proliferation, respiration / metabolism, and maintenance of differentiated state (stopping maintenance of differentiated state is a dedifferentiated state, that is, , Maintaining poorly differentiated or undifferentiated state), or stopping or reducing adhesion.
  • Protection against cells means to maintain viability, that is, to suppress the loss of the ability of cells to exert their functions and the death of cells.
  • Floating cell activation is the initiation of proliferation, respiration / metabolism, and maintenance of differentiation of floating cells in the above-mentioned "dormant" state or the above-mentioned “protection” state, or the above-mentioned “dormant”. It means to restore the adhesiveness, respiration / metabolism, and maintenance of differentiated state of floating cells in the state or the above-mentioned "protected” state.
  • dormant cell activation causes the proliferation, respiration, and metabolism of dormant cells, including non-suspended cells, again in the above-mentioned "sleeping" state or the above-mentioned "protection” state.
  • the Viability is not only the ability of a cell to survive without dying, but also the ability of the cell to exert its original function (including proliferative function, respiration / metabolism, and maintenance of differentiated state) in the living body. Means that you are holding.
  • cells in tissues or cultured cells in a cell container containing an organ or tissue of a living body or a cell culture base material can be suppressed from dying while maintaining viability.
  • Experimental Example 2-2-1 in a cell culture medium containing sulfated alginic acid for 5 days under normal culture conditions, that is, in a cell incubator (CO 2 incubator) at 37 ° C., carbon dioxide concentration 5%, and humidity 100%. It is a figure which showed the image
  • FIG. 5B is a diagram showing an image taken by a fluorescence microscope immediately before the start of culture in the experimental example of FIG. 5A.
  • the cell treatment agent according to the embodiment of the present invention contains sulfated alginic acid as an active ingredient.
  • Sulfated alginic acid is a compound in which a sulfate group is introduced into alginic acid.
  • This alginic acid is a linear polysaccharide composed of two types of monosaccharides, ⁇ -D-mannuronic acid and ⁇ -L-gluuronic acid, which are contained in various brown algae such as kelp and wakame seaweed all over the world. ..
  • Its structure consists of an M block consisting of 1,4-linked ⁇ - (1-4) -D-mannuronic acid, a G block consisting of 1,4-linked ⁇ - (1-4) -L-gluuronic acid, and It has a portion composed of MG blocks in which mannuronic acid and gluronic acid are alternately bonded by 1,4.
  • M / G ratio of alginic acid affects the cross-linking reaction (gelation) with divalent metal ions. More specifically, it is known that the G block is involved in gelation. This also applies to sulfated alginic acid.
  • a gel having a G ratio sufficient to obtain a gel having a desired hardness.
  • the hardness of such a gel can be adjusted by a conventionally known method. For example, since the content of M or G differs specifically depending on the type and site of seaweed, alginic acid having a different M / G ratio can be obtained by selecting and using an appropriate seaweed.
  • the sulfuric acid group of alginic acid can also be introduced by a conventionally known method.
  • Such alginic acids having different viscosity types are commercially available, and those that form a general viscous aqueous solution and those called low-viscosity types whose viscosity is adjusted to be lower than that of general ones (for example, Co., Ltd.) It is possible to use various products such as those made by Kimika, Kimika Algin ULV series, etc.).
  • the pharmacologically acceptable salt of sulfated alginic acid is one in which the hydrogen ions of the carboxyl group and sulfonic acid group of sulfated alginic acid are liberated and combined with cations.
  • cations may be those capable of forming a pharmacologically acceptable salt, and examples thereof include monovalent cations such as sodium ion, potassium ion, and ammonium ion.
  • the sulfate group of sulfated alginic acid is preferably introduced at the carbon atom at the 6-position from the viewpoint of high processing capacity for cells.
  • the amount introduced is preferably more than 10% of the total sulfated alginic acid.
  • the processing capacity tends to increase as the amount introduced is as large as 20% or more, 30% or more, 40% or more, 50% or more, 60% or more, 70% or more, and 80% or more.
  • the number of sulfate groups introduced per monosaccharide molecule that is, the degree of substitution (DS) is not particularly limited, but under the same other conditions, the processing capacity tends to increase as the DS increases.
  • the processing capacity may be adjusted according to the application target and the treatment content, the DS may be reduced and the amount of sulfated alginic acid added may be increased, or the DS may be increased and the sulfated alginic acid may be added, depending on the situation.
  • the amount can be reduced.
  • the detection limit is 0.00001 for DS.
  • the inventor confirmed that even if the DS is 0.00001 of sulfated alginic acid, good processing ability can be exhibited by adjusting the concentration of the added sulfated alginic acid.
  • the DS is preferably, for example, 0.5 or more, more preferably 0.7 or more, and 0.9. The above is more preferable. Further, when the concentration of sulfated alginic acid in the application target can be increased to some extent, the DS can be, for example, 0.00001 or more, provided that the desired processing capacity is exhibited.
  • the dosage form of the cell treatment agent is not particularly limited, and powdery, liquid, etc. can be appropriately determined by using an appropriate excipient according to various uses. In addition, various additives can be added as needed.
  • the cells when desired cells are cultured in a general cell culture solution and then the cells are administered into the body, the cells are separated from the cell culture solution, washed, and used for medical purposes contained in the cell culture solution. After removing various kinds of reagents that cannot be obtained, the obtained cells can be immersed in an extracellular fluid replacement solution, a maintenance infusion solution, or the like, and this can be administered into the body.
  • This extracellular fluid replacement fluid is a group of fluids having an electrolyte composition similar to that of the extracellular fluid that surrounds cells in the living body, and maintenance infusion fluid is required for humans to maintain life1. It is an infusion solution that is administered by adding nutrients such as sugar, protein (amino acid), and fat and micronutrients to the daily water content and electrolytes.
  • extracellular fluid replacement fluid or maintenance infusion is a medical liquid used as a solvent for injections of other active ingredients or for infusion of a single active ingredient, and its safety of administration into the body has been established. ..
  • extracellular fluid replacement fluid and maintenance infusion solution are used as excipients for cell treatment agents used when administering cells into the body in regenerative medicine because of the electrolyte composition and safety similar to the surrounding environment.
  • Examples of such extracellular fluid replenisher include so-called replenishment infusion solution used for the purpose of replenishing loss of extracellular fluid, and more specifically, Ringer's solution, Lactobacillus Ringer's solution, Ringer's acetate solution, Ringer's bicarbonate solution, and the like.
  • Maintenance infusions include, for example, sugar / electrolyte infusion preparations containing no amino acids, sugar / electrolyte / amino acid infusion preparations, sugar / electrolyte / amino acid / multivitamin liquid preparations, sugar / electrolyte / amino acids / multivitamin / trace element liquid preparations, sugars. -Electrolytes, amino acids, fat emulsions, etc. can be mentioned.
  • the viability of the cells is determined by such an operation. May decrease or become infected.
  • the present inventor has found that sulfated alginic acid has a cytoprotective effect even in an extracellular fluid replenisher solution as in a general cell culture solution. That is, by containing sulfated alginic acid, extracellular fluid replenisher, maintenance infusion, etc. can be used as a substitute for cell culture solution for storage and transportation, for example, and extracellular fluid replenisher for administration.
  • the cells can be immediately administered as they are immersed in the cells. Therefore, it is possible to prevent a decrease in viability and a risk of infection due to transfer of cells from the culture solution to a so-called extracellular fluid replacement solution, maintenance infusion solution, or the like.
  • the above-mentioned cell treatment agent can be used as a reagent in a predetermined dosage form containing sulfated alginic acid as an active ingredient, it can be applied to a culture medium, a culture substrate such as a culture container or a cell carrier, or a living tissue such as a living organ.
  • a culture medium such as a culture container or a cell carrier
  • a living tissue such as a living organ.
  • the cultured cells grown on the scaffold of the culture base material or the scaffold of the living tissue can be detached from the scaffold of the culture base material or the scaffold of the living tissue and suspended.
  • the tissue cells of the living tissue can be detached from the scaffold (living organ or the like) of the living tissue and suspended. Therefore, the cell treatment agent can be suitably used for cell detachment / suspension.
  • the above-mentioned cell treatment agent stops the proliferation or adheres to the cells in the tissue of the living tissue, the scaffold of the culture base material, and the cultured cells of the scaffold of the living tissue while maintaining good viability. It is possible to maintain an undifferentiated / poorly differentiated state without stopping or differentiating cells, that is, it can be put to sleep. Therefore, it can be suitably used as a cell treatment agent for cell dormancy for resting those cells. Due to this dormant action, the cells stop their growth, but when the conditions are met, they are awakened, reattached to the culture medium and living tissue, and can start to grow.
  • the cells in order to store and transport the cells, the cells can be temporarily dormant to stop the activity of the cells and resume the activity at a desired time. It is also an effective cell treatment agent in that it can be made to grow.
  • the above-mentioned cell treatment agent can retain cells in an undifferentiated or poorly differentiated state, cell preservation that enables regeneration and formation of tissues / organs exhibiting desired properties after awakening from a dormant state. It is also suitable for use.
  • the above-mentioned cell treatment agent has a cytoprotective action of suppressing the death of cells in tissues or cultured cells in a cell container including a culture container, a storage container, etc. or a living tissue by maintaining viability. .. Therefore, the cell treatment agent can be used in place of FBS or human serum, which has been conventionally used as having a protective action to prevent cell death. Therefore, it is possible to safely prevent cell death and protect cells without using FBS or human serum.
  • This cell treatment agent having a cytoprotective effect is suitable, for example, when storing and transporting cells.
  • a cell treatment agent containing extracellular fluid replacement fluid or maintenance infusion as an excipient and sulfated alginic acid as an active ingredient can protect cells even during storage and transportation. It is available and can be administered immediately as it is, which contributes to the safety and convenience of medical treatment.
  • the agent for the cell treatment agent can function as, for example, for cell dormancy and cell protection as described above, or for cell preservation for holding cells in an undifferentiated or poorly differentiated state, the agent for the cell treatment agent.
  • the shape is liquid, it is suitable as a liquid for preserving cells, tissues or organs.
  • a cell culture solution, an extracellular fluid replacement solution, a maintenance infusion solution, or the like as the dosage form.
  • the cell culture solution applicable to various uses is not particularly limited, and a general serum-free cell culture solution, a general FBS-added cell culture solution, or the like is selected and adopted depending on the use or the like. be able to.
  • Sulfated alginic acid which is the active ingredient of the above-mentioned cell treatment agent, has an effect of exfoliating and suspending cells, and has an effect of putting cells to sleep, but is an activator containing sulfated alginic acid and polyvalent cations.
  • Coexistence activates suspended cells and non-suspended dormant cells, such as the ability of suspended cells to adhere and the ability of dormant cells to awaken from a dormant state (eg, proliferative ability). The inventor has found that it activates.
  • the polyvalent cations contained in the activator can bind to sulfated alginic acid as a cross-linking agent to form a hydrophilic, non-fluid gel just like the extracellular matrix. Therefore, for example, when an activator containing a polyvalent cation is added to a culture solution of cells suspended in a liquid such as a culture solution containing sulfated alginic acid, a polyvalent metal ion or the like is added. At the same time that the adhesive ability of suspended cells can be activated by cations, it is possible to easily form a state in which they are adhered to a gelled alginic acid scaffold that has been cross-linked by polyvalent cations.
  • dormant cells in order to awaken dormant cells by polyvalent cations, if they are cultured under predetermined conditions, they will be in a dormant state (for example, a growth arrest state which is a phenomenon of dormancy) due to the action of sulfated alginic acid.
  • the cells are awakened and can initiate both reattachment and reproliferation.
  • cell treatment agent containing sulfated alginic acid in combination with an activator containing polyvalent cations, cells are detached, introduced into a floating state or a dormant state, and vice versa. Not only certain suspended cells but also adherent and dormant cells can be activated.
  • the adhesive ability of suspended cells is a phenomenon opposite to the above-mentioned detachment and suspension of cells, and the cells adhered to clustered cell groups or scaffolds from the isolated cell state, or clustered. It is the transformation from cells to cells that adhere to the scaffold.
  • the ability of cells to cause this adhesion is called the adhesive ability of cells, and the transition from a state in which the adhesive ability is lowered to a state in which the adhesive ability is restored is said to be activated.
  • Whether or not the adhesive ability of the suspended cells was activated is determined by counting the number of adhered cells after the culture medium containing the suspended cells was allowed to stand for a period during which the cells could sufficiently adhere to the scaffold, and compared with the control. It can be evaluated by doing.
  • the proliferative ability of cells is called the proliferative ability to cause cell division and increase the number of cells, and the transition from a state in which the proliferative ability is reduced or stopped in a dormant state to a state in which the proliferative ability is restored is proliferated. Noh is said to have been activated. Whether or not the proliferative capacity of the dormant cells is activated can be evaluated, for example, by counting the number of cells after culturing the culture solution containing the dormant cells under predetermined conditions and comparing with the control. ..
  • Sulfated alginic acid has the effect of exfoliating and suspending adherent cells from the scaffold, and at the same time, the detached and suspended cells tend to be in a dormant state. However, depending on the type of cells and various conditions, the cells may not be detached or suspended, but may be in a dormant state. That is, the adhering cells may be dormant.
  • the activator By coexisting the activator with sulfated alginic acid, cells once dormant by sulfated alginic acid can be activated regardless of whether or not the cells are suspended.
  • the activator is not particularly limited as long as it contains polyvalent cations, can activate suspended cells or dormant cells, and can be safely applied to a living body or the like. However, from the viewpoint of further promoting the activation of suspended cells or dormant cells, those capable of gelling sulfated alginic acid are preferable. Examples of such an activator include polycations such as chitosan, aqueous solutions containing polycations such as aluminum ions, iron ions, magnesium ions and calcium ions, chelating preparations for polyvalent cations, and aluminum compounds.
  • Solids producing water-insoluble polyvalent cations such as powders of iron compounds, magnesium compounds and calcium compounds, and cloth pieces impregnating or supporting these polyvalent cation feeders on the surface.
  • the calcium ion source include water-soluble calcium chloride and water-insoluble calcium phosphate.
  • the calcium ion feeder include chelated calcium and the like.
  • the cloth include gauze formed of biocompatible fibers applicable to a living body.
  • the amount to be added when applied to various uses can be appropriately determined according to the application target, the composition of sulfated alginic acid, and the like.
  • the concentration of sulfated alginic acid in the culture solution is preferably 0.001 to 50 mg / ml, more preferably 0.05 to 40 mg / ml.
  • the concentration is ml, more preferably 0.1 to 20 mg / ml, the above-mentioned various actions tend to be easily exhibited.
  • 0.001 mg / ml or more when used as a dormant action, it is preferably 0.001 mg / ml or more, more preferably 0.00625 mg / ml or more.
  • a cell detachment / suspension action when used as a cell detachment / suspension action, it is preferably 0.01 to 50 mg / ml.
  • a cytoprotective action when used as a cytoprotective action, it is preferably 0.0001 to 10 mg / ml.
  • the above-mentioned cell treatment agent and set reagent can be applied to various cells, and are suitable for, for example, living cells derived from plants, humans, and animals other than humans.
  • sodium alginate manufactured by Fuji Film Wako Pure Chemical Industries, Ltd., special grade reagent
  • sulfur trioxide pyridine complex are stirred in dimethylformamide (40 ° C., 12 hours) to introduce a sulfate group into alginic acid, and then sulfated alginic acid.
  • DS degree of substitution
  • alginate was converted into H-type by an ion exchange resin column, and then neutralized with pyridine so as to be easily dissolved in a solvent to form a pyrimidium salt.
  • This was dissolved in N, N-dimethylformamide and dehydrated and condensed with sulfuric acid using dicyclohexylcarbodiimide at 0 ° C. for 60 minutes to introduce a sulfuric acid group into the carbon atom at the 6-position.
  • the obtained sulfated alginic acid (hereinafter, may be referred to as "6-sulfate group alginic acid”) has a sufficient amount of sulfate groups introduced with a degree of substitution (DS) of 0.9 per monosaccharide molecule. rice field.
  • the introduction to the carbon atom at the 6-position was 80% or more, and the introduction to the 2-position was 20% or less. It was confirmed that.
  • the sulfated alginate A having a degree of substitution per monosaccharide molecule of 1.7 or more is used to remove the sulfate group introduced into the carbon atom at the 6-position.
  • a method for obtaining sulfated alginate C More specifically, the pyridinium salt of sulfated alginate A and N-methyl-N-trimethylsilyltrifluoroacetamide obtained in Production Example 1 were heated in pyridine to introduce a sulfate group into the carbon atom at the 6-position. was specifically removed to obtain sulfated alginate C.
  • the obtained sulfated alginate C had a sufficient amount of sulfate groups introduced with a degree of substitution (DS) of 0.9 per monosaccharide molecule. Further, when the carbon atom into which the sulfuric acid group was introduced was examined by the method described later, it was confirmed that the introduction of the sulfuric acid group into the carbon atom at the 6-position was 10% or less.
  • ⁇ Sulfate group-introduced carbon atom site and sulfate group introduction ratio> The site of the carbon atom into which the sulfate group was introduced and the ratio of the sulfate group in the sulfated alginic acid are known as "Yoshida T., et al., Synthesis and structural analysis of curdlan sulfate with a potent inhibitory effect of AIDS virus". infection. Macromolecules 23, 3717-3722 (1990) ”and“ Yamagaki T., et al., NMR Spectroscopic Analysis of Sulfated fJ-l, 3-Xylan and Sulfation Stereochemistry. Biosci. Biotech.
  • Table 1 shows the above-mentioned evaluation results of the sulfated alginic acid obtained in Production Examples 1 to 3.
  • Example 1 Cell detachment / suspension action Chinese hamster fibroblasts were used as mesenchymal cells, and rat corneal epithelial cells were used as epithelial cells.
  • a serum-free cell culture medium containing 10% of FBS or the like (hereinafter, may be referred to as "ordinary FBS-added cell culture medium") is prepared, and the above-mentioned fibroblasts or corneal epithelial cells are added thereto. It was added at a concentration of 10 6 cells / ml, normal cell culture conditions (37 ° C., 100% humidity, carbon dioxide concentration of 5%) and incubated for 24 hours at, adhered to sufficiently culture dishes walls cultured cells ..
  • sulfated alginic acid is suitable as a cell treatment agent for cell detachment / suspension that detaches and suspends cells.
  • Example 2 Dormant action of suspended cells and replantation and proliferation after awakening ⁇ Experimental Example 2-1>
  • Experimental Example 1 it was examined whether the cells exfoliated and suspended using the exchange solution of 1 mg / ml sulfated alginates A to C had no difference in cell life or death as compared with the conventional trypsin method.
  • the trypan blue excretion test which is a usual method for confirming the survival of cells, is described in the well-known literature "Denizot F., et al., Rapid colorimetric assay for cell growth and survival. Modifications to the tetrazolium dye procedure giving improved sensitivity and reliability. J. Immunol. Methods, 89, 271-277 (1986) ”.
  • CytoRed-stained live cell red fluorescence observation method which enables observation of living cells under a fluorescence microscope in a stereoscopic field, is described in the well-known literature "Ishiyama M., et al., A resorufin derivative as a fluorogenic indicator for cell viability, Anal. Sci., 15, 1025-1028 (1999) ”. From these tests, the viable cell rate (number of viable cells ⁇ total number of cells ⁇ 100%) of cells exfoliated and suspended by sulfated alginate B was determined. In addition, as a comparative control, the viable cell rate (survival rate) of cells exfoliated and suspended by the trypsin method was determined and compared.
  • the trypsin method was carried out in the usual manner, that is, as follows, instead of the aqueous solution of sulfated alginic acid of Experimental Example 1.
  • the cell culture solution in the cell culture vessel was sucked up and discarded, and the cell surface was washed with about half the amount of PBS ( ⁇ ) (Ca 2+ / Mg 2+ -free PBS) used for the culture.
  • ⁇ PBS
  • 1 mL of 0.2% trypsin / EDTA solution was spread in the container on the cell surface of 25 cm 2 to allow trypsin to act, and then the excess trypsin solution was removed.
  • This culture vessel was incubated in a CO 2 incubator for 2 minutes under normal conditions (37 ° C., carbon dioxide concentration 5%, humidity 100%), and cell detachment was confirmed. Then, when using a serum-free cell culture medium, trypsin was inactivated with a trypsin inhibitor. Also. In the case of FBS-added cell culture medium, trypsin was inactivated by adding FBS-added cell culture medium. Floating cells were obtained in the same manner as in Experimental Example 1 except for the above operations. The obtained suspended cells were subjected to a cell survival confirmation test.
  • Table 3 shows the results of exfoliated and suspended cells and comparative controls using a 1 mg / ml exchange solution of sulfated alginate B.
  • the viable cell rate of cells determined by the trypan blue excretion test and the live / dead assay is 95 to 106% in the cells exfoliated and suspended by the trypsin method when the viable cell rate (average) is 100%. there were.
  • the viable cell rate when exfoliated with sulfated alginate B was 101% on average as compared with the case where the average by the trypsin method was 100%, and the range was also distributed between 95 and 106%. It was equivalent to the trypsin method.
  • the cells exfoliated and suspended with sulfated alginic acid are the same safe method for cell survival as compared with the conventional trypsin method.
  • Example 2-2 After removing and inactivating trypsin, the cells exfoliated and suspended by the trypsin method are transferred to an FBS-added cell culture medium and cultured under normal culture conditions (37 ° C., humidity 100%, carbon dioxide gas concentration 5%). It is known that suspended cells adhere to the inner wall of a culture vessel as a scaffold within 12 to 24 hours, and when this is cultured for 5 to 7 days, the cells proliferate exponentially.
  • Example 2-2-1 The cells exfoliated and suspended by sulfated alginic acid were cultured in FBS-added cell culture medium containing the same concentration of sulfated alginic acid under normal conditions for 5 days in advance. It is a standard method for microscopic observation and comparison of viable cell numbers to see if the cells have floated and the number of cells has not increased at all for these 5 days, that is, whether the cells have stopped growing and are dormant. It was confirmed by comparing the cell numbers by the MTT assay method (Gerlier D., et al., Use of MTT colorimetric assay to measure cell activation. J. Immunol. Methods. 94, 57-63. (1986)).
  • the cells remained floating and clustered in the same manner (Fig. 1), and the number of cells did not increase. (Table 4) was found. That is, it was confirmed that in the sulfated alginic acid-containing cell culture medium, the suspended cells stopped proliferating while having viability, and were dormant in the suspended state.
  • Example 2-2-2 The study was conducted according to the experimental schema shown in FIG.
  • a control group the same number of cells suspended by the trypsin method (which were not previously cultured for 5 days) were transferred into a normal FBS-added cell culture medium and cultured under normal conditions for 7 days. rice field.
  • the cell culture of this control group was a normal cell culture, and the cells proliferated and the number of cells increased remarkably in 7 days.
  • Example 2-2-3 Applying the colonization inhibition test described in ISO 10993-5 (Biological evaluation of medical devices Part 5: Tests for in vitro cytotoxicity), the concentration of sulfated alginic acid when suspended cells reattach and proliferate from a dormant state investigated.
  • the experimental method is as follows. The cells used in the experiment were the same two types as in Experimental Example 1.
  • sulfated alginic acid concentration is the same as the starting concentration 10-0.1 mg / ml) to 100-fold dilution (ie dilution 1%, sulfated alginic acid is 1% of the starting concentration 0.
  • the sulfated alginic acid concentration was adjusted in a state of being diluted in each step from 1 to 0.001 mg / ml).
  • the cells were cultured in the cell culture solution adjusted to this state for 7 days under normal culture conditions (37 ° C., humidity 100%, carbon dioxide gas concentration 5%). For these cells (experimental group), it was observed whether cell replantation and cell proliferation occur normally as in Comparative Control 1 and Comparative Control 2 described later.
  • the degree of cell proliferation was determined by determining the number of colonies formed after 7 days, and comparatively examined by a method similar to the above-mentioned colonization inhibition test.
  • a petri dish culture solution containing cells adhered to a petri dish in an FBS-added cell culture solution was added to an FBS-added cell culture solution containing 10 to 0.1 mg / ml sulfated alginate B.
  • the cells once suspended by the replacement were used, and then the cell culture solution was replaced with a normal (that is, not containing sulfated alginic acid) FBS-added cell culture solution, and then a normal FBS-added cell culture solution was further added.
  • the same operation as the step dilution of the experimental group was performed. After this operation, cells were cultured for 7 days under normal culture conditions (37 ° C., humidity 100%, carbon dioxide gas concentration 5%).
  • Comparative Control 2 cells suspended by the usual trypsin method were used. These cells were also transferred into a normal FBS-added cell culture medium and cultured for 7 days under normal culture conditions (37 ° C., humidity 100%, carbon dioxide gas concentration 5%). For Comparative Controls 1 and 2, it was confirmed that cell replantation and cell proliferation occur as usual. In addition, cell proliferation was determined by determining the number of colonies formed after 7 days, and comparatively examined by a method similar to the above-mentioned colonization inhibition test. As a result, Comparative Control 2 was used as a reference for a 100% colony formation rate.
  • FIG. 3 is one of the diagrams showing the results of the colony formation inhibition test, in which an FBS-added cell culture solution containing a sulfated alginate B having an starting concentration of 0.1 mg / ml was used as an FBS-added cell containing no sulfated alginate.
  • the cells were serially diluted with a culture solution, and as a result, the sulfated alginate B having an initial concentration of 0.1 mg / ml was diluted to obtain a culture solution containing various concentrations of sulfated alginate B, and the cells were cultured for 7 days.
  • the results of the colony formation rate experiment in the case are shown.
  • FIG. 3 is one of the diagrams showing the results of the colony formation inhibition test, in which an FBS-added cell culture solution containing a sulfated alginate B having an starting concentration of 0.1 mg / ml was used as an FBS-added cell containing no sulfated alg
  • the solution dilution (%) on the horizontal axis indicates the dilution of sulfated alginate B when the concentration of sulfated alginate B at the starting concentration of 0.1 mg / ml is 100%.
  • the black-painted triangular ( ⁇ ) mark and the continuous line are the results of Comparative Control 1. Further, the colony formation rate of 100% is a reference point based on the result of Comparative Control 2 as 100%.
  • the black-painted rhombus ( ⁇ ) mark and continuous lines are in FBS-added cell culture medium containing sulfated alginate B at a starting concentration of 0.1 mg / ml and then gradually diluted. It shows the colony formation rate of the cells (experimental group) cultured for 7 days in.
  • the sulfated alginate concentration was 0.00625 mg / ml (that is, the starting concentration of sulfated alginate B was 100%).
  • the cells did not adhere and the colony formation rate was 6 to 14%, which did not proliferate.
  • the sulfated alginic acid concentration was 0.001 mg / ml, the cells adhered within 24 hours as usual, and the colony formation rate also surged to 90% or more, which is normal as in Comparative Control 1. It was found that it proliferated as it was.
  • Table 6A shows the results of colonization 50% inhibitory concentration.
  • sulfated alginic acids A to B the relationship between the colony forming rate and the concentration of sulfated alginic acid shown in FIG. 3 was determined, and the colony forming 50% inhibitory concentration was calculated from the obtained relationship.
  • the colonization 50% inhibitory concentration was between 0.00625 mg / ml and 0.001 mg / ml.
  • Similar experimental results were observed for sulfated alginate A and sulfated alginate C.
  • the 50% inhibition concentration of colonization in both cases was in the interval of 0.01 to 0.00625 mg / ml.
  • the cells exfoliated and suspended with sulfated alginates A to C can be transferred to a normal FBS-added cell culture medium and cultured under normal conditions (Comparative Control 1), or the concentrations of sulfated alginates A to C can be concentrated.
  • Comparative Control 1 Comparative Control 1
  • concentrations of sulfated alginates A to C can be concentrated.
  • the cells were temporarily put to rest by changing the culture medium to the FBS-added cell culture medium.
  • normal (that is, not containing sulfated alginic acid) FBS-added cell culture solution is added to this cell culture solution, and each from sulfated alginic acid concentration (starting concentration is 1-fold dilution) to 1000-fold dilution.
  • the sulfated alginate concentration was adjusted to a stepwise diluted state.
  • the cells were cultured in the cell culture solution adjusted to this state for 7 days under normal culture conditions (37 ° C., humidity 100%, carbon dioxide gas concentration 5%). For these cells (experimental group), it was observed whether cell proliferation occurred normally as in Comparative Controls 1-2 and 1-3 and Comparative Control 2-2. In addition, the degree of cell proliferation was determined by determining the number of colonies formed after 7 days, and comparatively examined by a method similar to the above-mentioned colonization inhibition test.
  • a petri dish culture solution containing cells adhered to a petri dish in an FBS-added cell culture solution was used as 1 mg / ml sulfated alginate A-3 or 0.1 mg / ml sulfated alginate A.
  • the cells that had been dormant once were used by replacing the culture solution with an FBS-added cell culture solution containing FBS, and then the cell culture solution was replaced with a normal (that is, not containing sulfated alginic acid) FBS-added cell culture solution. After this operation, cells were cultured for 7 days under normal culture conditions (37 ° C., humidity 100%, carbon dioxide gas concentration 5%).
  • Comparative Control 1-3 cells once dormant with 0.1 mg / ml sulfated alginate A were used as in Comparative Control 1-2, and then this cell culture medium was subjected to normal concentration of 20 mg / ml. After transferring to an FBS-added cell culture medium containing sodium alginate (that is, non-sulfated alginic acid), the cells were cultured under normal culture conditions (37 ° C., humidity 100%, carbon dioxide gas concentration 5%) for 7 days. rice field.
  • normal culture conditions 37 ° C., humidity 100%, carbon dioxide gas concentration 5%
  • comparative control 2-2 cells suspended by the usual trypsin method were used. These cells were also transferred into a normal FBS-added cell culture medium and cultured for 7 days under normal culture conditions (37 ° C., humidity 100%, carbon dioxide gas concentration 5%). It was also confirmed that cell proliferation occurred normally in Comparative Controls 1-2, 1-3, and 2-2. In addition, cell proliferation was determined by determining the number of colonies formed after 7 days, and comparatively examined by a method similar to the above-mentioned colonization inhibition test. As a result, Comparative Control 2-2 was used as a reference for a 100% colony formation rate.
  • the cells cultured in the normal FBS-added cell culture medium are cells in which sulfated alginate A-3 or sulfated alginate A (Comparative Control 1-2) is also suspended by the conventional trypsin method (Comparative Control 2).
  • both -2) and cells cultured in FBS-added cell culture medium containing 20 mg / ml of normal sodium alginate as comparative control 1-3 the cells formed colonies as usual, and the number of colonies formed in both was increased. No difference was observed, and the colony formation rate of Comparative Controls 1-2 and 1-3 was close to the baseline of 100%.
  • the sulfated alginate concentration was 0.05 mg / ml (that is, 5% when the starting concentration of sulfated alginate was 100%).
  • the colony formation rate was 10% or less, the cells did not proliferate, and the cells were in a dormant state.
  • the sulfated alginate concentration was 0.0005 mg / ml (that is, the starting concentration of 0.1 mg / ml of sulfated alginic acid was 100%).
  • the colony formation rate was 10% or less, the cells did not proliferate, and the cells were in a dormant state.
  • Table 6B shows the results of colonization 50% inhibitory concentration.
  • the colonization 50% inhibition concentration was calculated by the method described above.
  • the colonization 50% inhibitory concentration of sulfated alginate A-3 was between 0.05 mg / ml and 0.01 mg / ml.
  • the colonization 50% inhibitory concentration (that is, the concentration exhibiting a cell dormancy effect) was between 0.0005 mg / ml and 0.0001 mg / ml.
  • sulfated alginate A-3 exhibits a dormant effect of inhibiting cell growth on B-16 melanoma hypermetastatic strain at a concentration between 0.05 mg / ml and 0.01 mg / ml, while If it is transferred to a normal FBS-added cell culture solution and cultured under normal conditions (Comparative Control 1-2), or if the concentration of sulfated alginate A-3 is diluted to a concentration of 0.01 mg / ml or less, It was found that it awakened from dormancy and proliferated.
  • the concentration showing this cell dormancy effect is between 0.0005 mg / ml and 0.0001 mg / ml, and at a concentration lower than that, the cells awaken from dormancy and proliferate. Started. From these results, the effect of stopping cell proliferation and causing cell dormancy differs depending on the cell type, but sulfated even if the degree of sulfate group substitution (DS) per monosaccharide molecule and the concentration of sulfated alginic acid differ.
  • DS degree of sulfate group substitution
  • Arginic acid was considered to exert the cell dormancy effect of sulfated alginic acid in a wide range of sulfate group substitution degrees. On the other hand, it was found that ordinary alginic acid having no sulfate group has no effect of stopping cell proliferation and causing cell dormancy even at a concentration of 20 mg / ml.
  • the suspended cells can be put into a dormant state, and at the same time, cultured under normal culture conditions. By doing so, it was found that the floating cells can be awakened and reattached to the scaffold to proliferate. It was also found that the suspended cells can be awakened, reattached, and proliferated by lowering the concentration of sulfated alginic acid to a predetermined range or less.
  • Example 3-1 Cell protective effect of sulfated alginic acid ⁇ Experimental Example 3-1> [Experimental Example 3-1-1]
  • solutions used for storing and transporting cells for example, (a) a normal serum-free cell culture solution containing no FBS and (b) sulfated alginates A to C are 0.01, 0.05, 1 and 10 mg /, respectively.
  • a normal FBS-added cell culture solution was prepared by adding (c) 10% FBS to the serum-free cell culture solution, which was added to the serum-free cell culture solution so as to have a concentration of ml.
  • the average survival rate of sulfated alginic acid was highest at a concentration of 1 mg / ml, and the cytoprotective effect decreased at higher or lower concentrations, but the effect was from 0.01 mg / ml.
  • the sulfated alginate B has an excellent cytoprotective effect at any concentration as compared with the sulfated alginates A and C.
  • Example 3-1-2 B-16 melanoma cells were used as cells, and sulfated alginates A, A-2, A-3, and A-4 were used as sulfated alginic acid, and serum-free cell culture was performed so as to have the concentrations shown in Table 7B, respectively.
  • the viability of the cells was determined in the same manner as in Experimental Example 3-1-1 except that the one added to the solution was used, and the proportion of viable cells was determined and compared.
  • sulfated alginate A but also sulfated alginate A-2 having a lower DS, lower sulfated alginate A-3, and even lower sulfated alginate A-4 can increase the sulfated alginate concentration in the adjusting solution. It has been shown that a cytoprotective effect is exhibited in the presence of an increased and sufficient concentration of sulfate groups. Furthermore, it was found that the effect differs depending on the type of cell used in that case.
  • alginate A-4 Similar to the cytoprotective effect when left at room temperature for 24 hours, not only sulfated alginate A, but also sulfated alginate A-2 with lower DS, lower sulfated alginate A-3, and even lower sulfuric acid. It was shown that alginate A-4 also exhibits a cytoprotective effect if the concentration of sulfated alginic acid in the adjusting solution is increased and a sufficient concentration of sulfate groups is present. Furthermore, it was found that the effect differs depending on the type of cell used in that case.
  • sulfated alginic acid can suppress cell death to the same extent as FBS and has a cell protective effect regardless of its viscosity type (degree of polymerization) even when cells are left under predetermined conditions. I understand that. That is, it was found that sulfated alginic acid can replace FBS and the serum of the person himself / herself. When the preserved cells are cultured under normal culture conditions in this way, they reattach and proliferate in the same manner as shown in Experimental Example 2.
  • Example 3-4 Cytoprotective effect of sulfated alginic acid in extracellular fluid replenisher
  • Rat corneal cells were used as cells. Experiments were conducted using the most common Lactated Ringer's solution (Lactringer's injection, Fuso Pharmaceutical Co., Ltd.) as an extracellular fluid replacement solution.
  • Example 4 Floating cell activating action by a combination of sulfated alginic acid and an activator ⁇ Experimental Example 4-1>
  • the experiment was carried out using the same two types of cells as in Experimental Example 1 and the sulfated alginates A to C obtained in the production example.
  • an activator of sulfated alginic acid a calcium chloride aqueous solution as a calcium ion solution, a cloth piece impregnated with a calcium ion feeder or supported on the surface, and a calcium phosphate powder were used.
  • a chelated calcium preparation was used as the calcium feeder.
  • the sulfated alginic acid in the culture solution was reacted with the activator by a method of slowly pouring a cell culture medium containing sulfated alginic acid containing cells suspended by the sulfated alginic acid.
  • the treatment was carried out in the same manner as described above except that a calcium ion source was not used as a comparative control. That is, the same treatment was carried out using a piece of cloth in which distilled water was used instead of 5% calcium chloride, calcium phosphate powder was not used, and a calcium ion feeder was impregnated and not supported on the surface.
  • FIG. 4A shows a fluorescence microscope imaging of an experimental example using Chinese hamster fibroblasts, suspended cells obtained using sulfated alginate B, and calcium phosphate powder as an activator. It is a figure. In FIG. 4A, the entire image pickup is red, and in the drawing, the stronger the red, the whiter the image.
  • FIG. 4B is a diagram showing imaging with a comparative fluorescence microscope in which an experiment was conducted under the same conditions as the experimental example showing imaging in FIG. 4A, except that calcium phosphate powder was not used. In FIG. 4B, the entire image is black.
  • Example 4-2 It was examined whether or not the reattached cells obtained in Experimental Example 4-1 proliferate. That is, the sulfated alginate gel itself to which the cells are adhered, and the calcium phosphate powder and cloth pieces to which innumerable living cells are adhered via the gelled sulfated alginic acid are ordinary (that is, do not contain sulfated alginic acid). ) The cells were transferred to an FBS-added cell culture medium and cultured under normal culture conditions for 4 days. This was observed by CytoRed-stained live cell red fluorescence observation method and compared with the state at the start of culture.
  • FIG. 5A is the same as in Experimental Example 4-1. Using suspended cells of Chinese hamster fibroblasts obtained by using sulfated alginate B, a cloth piece carrying a calcium feeder is used as an activator.
  • FIG. 5 (b) is a diagram showing imaging of a fluorescence microscope after culturing for 4 days
  • FIG. 5 (b) is a diagram showing imaging of a fluorescence microscope immediately before the start of culturing.
  • the portion corresponding to the fiber constituting the cloth piece is red, and in the drawing, the stronger the red is, the whiter it is.
  • the suspended cells can be immediately adhered to the scaffold, adhered and easily recovered, and thereafter. It was found that the cells proliferated by culturing under normal culture conditions. That is, the exfoliated and suspended cells are added to the cell culture solution to which sulfated alginic acid has been added to allow the sulfated alginic acid and the suspended cells to coexist, and further, the activator is allowed to coexist with the sulfated alginic acid to form sulfuric acid.
  • alginic acid is gelled by an activator, suspended cells are captured by the gelled sulfated alginic acid.
  • the dormant suspended cells are awakened by the sulfated alginic acid, the adhesion of the suspended cells to the gel-like carrier of the sulfated alginic acid is promoted, and the growth is started.
  • the sulfated alginic acid and the activator in combination, it is possible to obtain a set reagent capable of satisfactorily activating the suspended cells.
  • Example 5 Cell dormancy effect of sulfated alginic acid (maintenance of undifferentiated state) The cell dormancy effect of sulfated alginic acid was examined using the effect of maintaining the undifferentiated state of cells and suppressing differentiation as an index.
  • As cells undifferentiated rat subcutaneous fat-derived mesenchymal stem cells (hereinafter referred to as "ADSCs") (MSA01C manufactured by Cosmo Bio Co., Ltd.) were used.
  • ADSCs undifferentiated rat subcutaneous fat-derived mesenchymal stem cells
  • Adipose Tissue-developed Mesenchymal Stem Cell (hereinafter referred to as "AMSC") Growth Medium, Rat (manufactured by Cosmo Bio Co., Ltd., MSA-GM) was used as the cell culture medium, and in the 10% FBS-added group.
  • AMSC Growth Medium and Rat with FBS added to 10% were used, and in the sulfated alginic acid-added group, AMSC Growth Medium and Rat with sulfated alginic acid added to 2.5 mg / ml were added to the cells. It was used as a storage solution. After adding these to ADSCs so that each of 10 5 cells / ml, and allowed to stand for 48 hours at refrigerated conditions of 4 ° C..
  • the positive rates of the two undifferentiated markers were significantly higher in the sulfated alginate-added group than in the 10% FBS-added group and the non-added control group.
  • the positive rates of the three differentiation markers were all clearly lower in the sulfated alginate-added group than in the 10% FBS-added group and the non-added control group.
  • sulfated alginic acid causes the cells to dormant in an undifferentiated state
  • FBS which also has a cytoprotective effect
  • a normal non-added cell culture medium do not differentiate and suppress the cells. It was revealed that it suppresses differentiation.
  • sulfated alginic acid can easily realize exfoliation and suspension of cells, dormancy, and cell protection, and since it has no cytotoxicity, it awakens from a dormant state. Then, re-adhesion and re-proliferation can be easily realized. Furthermore, by combining sulfated alginic acid with an activator, it becomes possible to freely control the recovery of suspended cells, cell adhesion and resumption of proliferation (planting).

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Abstract

硫酸化アルギン酸を有効成分として含む細胞処理剤、及び、該当細胞処理剤と、多価陽イオンを含む賦活化剤との組み合わせ試薬である、浮遊化又は休眠化細胞活性化用セット試薬により、例えば生体の臓器や組織又は細胞培養基材等を含む細胞容器内の組織内細胞又は培養細胞に対して、その死滅を抑制可能としてバイアビリティ（Viability）を保持しつつ、例えば、剥離・浮遊化処理、休眠処理、保存運搬のための保護処理等、を安全かつ簡便に行うことが可能な手法、及び、休眠状態の細胞（例えば、浮遊化細胞等）を植え付けるための浮遊化又は休眠化細胞活性化処理を安全かつ簡便に行うことが可能な手法を提供することができる。

Description

細胞処理剤
　本発明は、細胞処理剤に関し、特に、例えば生体の臓器や組織等の組織内細胞又は培養細胞に対して、細胞剥離・浮遊化、休眠、バイアビリティ（Viability）の保持、死滅抑制、浮遊化あるいは休眠化細胞の活性化の処理を行う際に用いられる細胞処理剤に関するものである。
　単細胞生物や血球細胞や癌細胞などの特殊な細胞（非接着系細胞）を除き、大多数の細胞である接着系細胞（以下、単に「細胞」と称する場合がある。）が生存・増殖する場合には、体内では体を構成する細胞外マトリックスの足場、また、培養基材では、培養容器の壁や所定の担体などの足場に接着して生存し、機能を発揮したり増殖などを行う。このような細胞を研究や医療に使用する場合、細胞を弱らさずに足場から剥離し、浮遊化する必要がある。
　その剥離・浮遊化の操作には、界面活性剤やトリプシンのような細胞剥離酵素の細胞剥離作用を利用することが一般的である。例えば、生体臓器から細胞を剥離・浮遊化して細胞だけを採取する場合には、細胞剥離酵素や界面活性剤のような細胞剥離剤で細胞を足場に接着させている成分を消化処理し、細胞を剥離浮遊化して、生体臓器から細胞を洗い出して採集する処理方法が知られている（界面活性剤を用いる界面活性剤法について非特許文献１参照）。また、培養中の細胞を所定の足場から剥離して浮遊化するには、培養容器にトリプシンのような細胞剥離剤を含む液を加えて細胞剥離剤を培養細胞に作用させて、細胞を剥離浮遊化する処理方法が知られている（非特許文献２）。
　しかし、これらの剥離・浮遊化処理に用いられる界面活性剤や細胞剥離酵素は、細胞自身の重要な構成成分も消化する。そのため、剥離・浮遊化の後も界面活性剤や細胞剥離酵素をそのまま細胞に作用させ続けると、浮遊化された細胞は弱り、やがて死滅してしまう。このように、界面活性剤や細胞剥離酵素は細胞毒性を有している。浮遊化された細胞をこの細胞毒性から防ぐために、細胞を浮遊化した後はこれらの浮遊化細胞を界面活性剤や細胞剥離酵素と分離し、あるいは分離した細胞を洗浄したり界面活性剤や酵素を不活性化させて界面活性剤や細胞剥離酵素の細胞毒性作用を除去する。しかし、このような細胞毒性を有する細胞剥離剤を用いて処理する以上、細胞は浮遊化の過程で一定程度死滅していくのを避けられない。また、浮遊化細胞を研究や医療に用いるには、剥離・浮遊化の際に細胞が弱らずにバイアビリティ（Viability）を維持可能なようにすることが求められる。
　このような現状に対して、温度感受性の細胞培養足場として特殊なポリマーを用い、このポリマーの部分をある一定の温度まで加熱することにより、細胞を剥離・浮遊化する方法が開発されている（非特許文献３）。しかし、この方法は、特殊なポリマーを用いて高価であること、特殊な温度調節装置を要すること、温度調節等が困難で結果が安定しないこと、多量の細胞を培養する立体的で複雑な装置では使用できないこと、生体臓器から組織内細胞を剥離・浮遊化させることは不可能であること、等が指摘されている。
　また、細胞を研究や医療に使用する場合、細胞を安全に保管や運搬をする必要がある。この場合、一般に、細胞を保存、運搬する液（保存運搬液）に入れて、運搬・保管されるが、室温（常温）では、細胞は時間単位で弱っていくため、冷蔵や冷凍状態で保管運搬し、使用時には常温に戻して使用する。
　その冷蔵状態や常温化の過程においても、細胞は時間と伴にバイアビリティ（Viability）が低下し、死滅していく。この細胞死を防止して細胞のバイアビリティ（Viability）を保つ細胞保護の目的で、従来から、細胞を保存運搬する液内に１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）或いは本人の血清を添加混合する方法が行われている。ウシ胎児血清（ＦＢＳ）あるいは本人の血清を混合すると、これを混合しない場合に比較して、飛躍的に細胞のバイアビリティ（Viability）が高くなること（細胞保護効果）が知られている（非特許文献４～６）。
　しかし、ＦＢＳや本人血清の添加は、生物製剤であること、感染、アレルギー、操作性や倫理面で多くの問題が指摘されている。その一方、ＦＢＳや自己血清を十分に代替する物質は知られていないのが現状である。
　また、細胞、特に未分化や低分化の状態に現在はあって、将来には増殖して組織や臓器を再生・形成する能力に富む細胞は、保存されると不要な分化を行い、その細胞を用いて再生・形成させたい組織・臓器とは別の性質を示すように変化してしまう場合がある。細胞を保存しておく期間を通して細胞機能を休眠させて、この不要な分化を抑制することにより未分化や低分化の状態を維持することは、再生医療を実施する場合の重要項目であるが、その手段はいまだ確立されておらず、その解決手段の確立が望まれている。
　ところで、従来、アルギン酸又はアルギン酸塩は、例えば、食品、化粧品、医療機器等の分野で使用されている。食品分野では、増粘剤、コレステロールの吸収を妨げる効果を有する健康食品の有効成分等として、化粧品分野では、保湿剤等として、医療機器分野では、接着性細胞培養用基材の構成成分（特許文献１）等として使用されている。
特表２００２－５３６９７４号公報
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　前述したように、例えば生体の臓器や組織等、又は、生体細胞の培養基材から、組織内細胞、又は、培養細胞を剥離・浮遊化する処理を行う場合、（ａ）細胞が死滅するのを抑制すること、（ｂ）剥離・浮遊化する際に、細胞のバイアビリティ（Viability）が維持された状態の浮遊化細胞を得ること、すなわち、細胞のバイアビリティ（Viability）を低下させないことが求められる。
　また、細胞を保存運搬する場合、保存運搬する細胞に再びその機能を良好に発揮させるには、保存運搬される細胞のバイアビリティ（Viability）を低下させることなく、細胞の死滅を防止するように保護する必要がある。
　また、細胞、特に未分化や低分化の状態に現在はあって、将来増殖して組織や臓器を再生・形成する能力を持つ細胞を、保存期間を通じて細胞機能を休眠させて不要な分化を抑制し、未分化や低分化の状態に維持する必要がある。
　また、浮遊化させて休眠状態にある細胞を、生体臓器や培養基材等に接着させる際には、容易に接着させることが可能であることが望まれており、接着させた細胞を活性化させて増殖させる必要がある。
　しかし、例えば剥離・浮遊化させた細胞が、培養容器の壁や所定の担体等の培養基材である足場に接着する、即ちそのような細胞を「植え付ける」には、通常の培養条件を保った装置内に１２時間から２４時間、足場に接触した状態で静置させた状態を保たなければならない。もし接触が悪ければ、細胞は足場に植え付けることが出来ない。特に生体の特定の局所の部位に細胞を植え付けるには、細胞を１２時間から２４時間、生体の足場に接触させた状態が保たれることが必要である。
　この目的で、通常は不織布などの足場を生体外で１２時間から２４時間細胞と接触させて不織布の足場に細胞を接着させておき、この細胞が接着している足場ごと生体内の所望の局所に植え付けることが行われている。しかし、このような植え付けには時間と手間がかかるという問題がある。
　そこで、本発明の目的は、例えば生体の臓器や組織又は細胞培養基材等を含む細胞容器内の組織内細胞又は培養細胞に対して、その死滅を抑制可能で、かつ、そのバイアビリティ（Viability）を保持しつつ、例えば、剥離・浮遊化処理、休眠処理（休眠させると保護効果が高まるばかりでなく、細胞の不要な分化を抑制して未分化・低分化状態が維持できる）、保存運搬のための保護処理等、を安全かつ簡便に行うことが可能な手法、及び、休眠状態の細胞（例えば、浮遊化細胞等）を植え付けるための浮遊化又は休眠化細胞活性化処理を安全かつ簡便に行うことが可能な手法を提供することにある。
　本発明者は、前述の課題解決のために鋭意検討を行った。その結果、硫酸化アルギン酸を用いることで、前述の課題が解決可能であることを見出した。本発明の要旨は、以下のとおりである。
　（１）硫酸化アルギン酸を有効成分として含む細胞処理剤。
　（２）前記硫酸化アルギン酸が、６位の炭素原子に硫酸基が導入されている硫酸化アルギン酸を硫酸化アルギン酸全体中１０％より多く含む前記（１）記載の細胞処理剤。
　（３）細胞培養液、細胞外液補充液及び維持輸液から選択される少なくとも一種を含む前記（１）又は（２）に記載の細胞処理剤。
　（４）培養細胞を生体組織の足場若しくは培養基材の足場から、又は、生体組織の組織内細胞を生体組織の足場から、剥離し、浮遊させる細胞剥離・浮遊化用である前記（１）～（３）の何れかに記載の細胞処理剤。
　（５）組織内細胞又は培養細胞を休眠させるための前記（１）～（３）の何れかに記載の細胞処理剤。
　（６）組織内細胞又は培養細胞のバイアビリティ（Viability）を保持し死滅を抑制する細胞保護用である前記（１）～（３）の何れかに記載の細胞処理剤。
　（７）細胞を未分化又は低分化の状態に保持するための細胞保存用である前記（１）～（３）の何れかに記載の細胞処理剤。
　（８）細胞保存用、組織保存用又は臓器保存用の液体である前記（１）～（３）、（５）～（７）の何れかに記載の細胞処理剤。
　（９）前記（１）～（８）の何れかに記載の細胞処理剤と、多価の陽イオンを含む賦活化剤との組み合わせ試薬である、浮遊化又は休眠化細胞の活性化用セット試薬。
　ここで、「硫酸化アルギン酸」には、その薬理学上許容される塩が含まれる。
　「足場」とは、再生医療の三要素の一つとして本技術分野において知られているものを意味する。
　生体を構成する細胞の大部分を占める接着系細胞は、本来の機能（増殖を含む）を発揮するには、細胞は固定した土台に接着した状態であることが必要である。この土台を再生医学では「足場」と称する。接着系細胞は、液体中に浮遊した状態では本来の機能を発揮することができない。この足場は、人工的な足場の場合と自然状態の足場がある。人工的な足場の例は、シャーレなどのような人工の細胞培養用の基材では、シャーレの壁等が該当する。また、人工的繊維等に細胞を担持・接着させた形で、体外の細胞を体内に植え込む場合の、細胞を担持する繊維等が足場に該当する。
　生体の組織や臓器（以下、「生体組織」とも称する。）は、細胞と細胞の周囲を取り囲む細胞外マトリックス（コラーゲン線維やプロテオグリカンなどが含まれる）により構成されている。接着系細胞は、この細胞外マトリックスに接着して存在し、生体内でその機能を発揮している。自然状態の足場の例としては、この生体組織内で細胞が接着している細胞外マトリックスが該当する。
　尚、再生医療の三要素とは、組織や臓器を構成する「細胞」、細胞の働きのシグナル因子である「生理活性物質」、細胞や生理活性物質が身動きをとるための「足場（スキャホールド）」を指す。
　「休眠」とは、細胞が、バイアビリティ（Viability）を有しつつ、増殖や呼吸・代謝や分化状態維持の活動性を停止あるいは低下すること（分化状態維持の停止とは脱分化状態、即ち、低分化や未分化の状態の維持でもある）、或いは、接着を停止あるいは低下することを意味する。
　細胞に対する「保護」とは、バイアビリティ（Viability）を保持する、すなわち細胞の機能を発揮出来る能力の喪失や細胞の死滅を抑制することを意味する。
　浮遊化細胞活性化とは、前述の「休眠」の状態又は前述の「保護」の状態の浮遊化細胞の増殖や呼吸・代謝や分化状態維持を開始させること、或いは、前述の「休眠」の状態又は前述の「保護」の状態の浮遊化細胞の接着性や呼吸・代謝や分化状態維持を回復させることを意味する。また、休眠化細胞活性化は浮遊化していない細胞も含めて、休眠している細胞を、再び、前述の「休眠」の状態又は前述の「保護」の状態の細胞の増殖や呼吸・代謝や分化状態維持を開始させる、或いは、前述の「休眠」の状態又は前述の「保護」の状態の細胞の接着性や呼吸・代謝や分化状態維持を回復させることを意味し、後述する「覚醒」と同義である。
　前記バイアビリティ（Viability）とは、細胞が単に死なないで生存しているだけではなく、その細胞が生体内で本来の機能（増殖機能や呼吸・代謝や分化状態維持を含む）を発揮出来る能力を保持していることを意味する。
　本発明によれば、例えば生体の臓器や組織又は細胞培養基材等を含む細胞容器内の組織内細胞又は培養細胞に対して、その死滅を抑制可能としてバイアビリティ（Viability）を保持しつつ、例えば、剥離・浮遊化処理、休眠処理、保存運搬のための保護処理等、を安全かつ簡便に行うことが可能な手法、及び、休眠状態の細胞（例えば、浮遊化細胞等）を植え付けるための浮遊化又は休眠化細胞活性化処理を安全かつ簡便に行うことが可能な手法を提供することができる。
実験例２－２－１において、硫酸化アルギン酸を含有する細胞培養液中で５日間通常の培養条件すなわち３７℃、炭酸ガス濃度５％、湿度１００％の細胞培養器（ＣＯ２インキュベーター）内で培養した後の細胞を示す顕微鏡の撮像を示した図である。 実験例２－２－２で行う実験シェーマを示した図である。 実験例２－２－３における、コロニー形成阻害試験の結果を示した図である。 （ａ）実験例４－１において、チャイニーズハムスター線維芽細胞を用い、後述する硫酸化アルギン酸Ａを用いて得られた浮遊化細胞を用い、リン酸カルシウム粉末を賦活化剤として用いた実験例の、蛍光顕微鏡の撮像を示した図である。（ｂ）リン酸カルシウム粉末を用いない以外は、図４（ａ）の撮像を示す実験例と同じ条件で実験を行った比較対照の蛍光顕微鏡の撮像を示した図である。 （ａ）実験例４－２において、チャイニーズハムスター線維芽細胞を用い、後述する硫酸化アルギン酸Ａを用いて得られた浮遊化細胞を用い、カルシウム供給体を担持した布片を賦活化剤として用いた実験例の４日間培養後の蛍光顕微鏡の撮像を示した図である。図５（ｂ）は、図５（ａ）の実験例において、培養開始直前の蛍光顕微鏡の撮像を示した図である。
　本発明の実施形態に係る細胞処理剤は、硫酸化アルギン酸を有効成分として含む。
　硫酸化アルギン酸は、アルギン酸に硫酸基が導入された化合物である。このアルギン酸は、コンブやワカメなどの世界中の様々な褐藻類に含まれるβ－Ｄ－マンヌロン酸とα－Ｌ－グルロン酸の２種類の単糖を構成成分とした直線状の多糖類である。その構造は、１，４結合したβ－（１－４）－Ｄ－マンヌロン酸からなるＭブロック、１，４結合したα－（１－４）－Ｌ－グルロン酸からなるＧブロック、及び、マンヌロン酸とグルロン酸が交互に１，４結合したＭＧブロックによって構成される部分を有する。アルギン酸のＭ／Ｇ比は、２価の金属イオンとの架橋反応（ゲル化）に影響することが知られている。より詳細には、Ｇブロックがゲル化に関与していることが知られている。このことは、硫酸化アルギン酸についても当てはまる。したがって、後述するように硫酸化アルギン酸をゲル化させるには、所望の硬さのゲルが得られる程度のＧの比率のものを用いるのが好ましい。このようなゲルの硬さの調整は従来公知の方法で行うことができる。例えば、海藻の種類や部位によってＭ又はＧの含有率が特異的に異なることから、適切な海藻を選択して使用することで、Ｍ／Ｇ比の異なるアルギン酸を得ることができる。アルギン酸の硫酸基の導入も従来公知の方法により行うことができる。また、アルギン酸は水に溶解すると滑らかな粘りのある水溶液（コロイド溶液）となり、この水溶液の粘性（粘度）はアルギン酸の重合度に比例し、重合度が大きいほど水溶液の粘度が高くなることが知られている。この点は硫酸化アルギン酸についても同様である。このような粘度型の異なるアルギン酸は市販されており、一般的な粘りのある水溶液を形成するもの、粘度が一般的なものより低く調整された低粘度型と称されるもの（例えば、株式会社キミカ製、キミカアルギン　ＵＬＶ　シリーズ等）等、各種のものを用いることが可能である。
　薬理学上許容される硫酸化アルギン酸の塩は、硫酸化アルギン酸のカルボキシル基、スルホン酸基の水素イオンが遊離し、陽イオンと結合したものである。このような陽イオンとしては、薬理学上許容され得る塩を形成可能なものであればよく、例えば、ナトリウムイオン、カリウムイオン、アンモニウムイオン等の１価の陽イオンが挙げられる。
　硫酸化アルギン酸の硫酸基の導入部位は、細胞に対する各種処理能力の高さの観点から、６位の炭素原子に導入されているものが好ましい。また、その導入量としては、硫酸化アルギン酸全体中１０％より多いのが好ましい。導入量は、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上と多いほど処理能力が高くなる傾向にある。また、硫酸基の単糖一分子当たりの導入数即ち置換度（ＤＳ）は、特に限定はないが、他の条件が同じ場合は、ＤＳが多くなるほど処理能力が高くなる傾向にある。もっとも、適用対象や処理内容等に応じて処理能力を調整すればよいため、状況に応じて、ＤＳを小さくし、硫酸化アルギン酸の添加量を増やしたり、ＤＳを大きくし、硫酸化アルギン酸の添加量を小さくしたりすることができる。発明者が確認したところによると、例えば、後述する方法でＤＳを測定した場合の検出限界は、ＤＳが０．００００１あった。また、発明者は、このＤＳが０．００００１の硫酸化アルギン酸を用いても、添加する硫酸化アルギン酸の濃度を調整することで、良好な処理能力を発揮できることを確認した。したがって、適用対象中の硫酸化アルギン酸濃度をある程度低く抑えつつ、処理能力を確保する必要がある場合は、ＤＳは、例えば、０．５以上が好ましく、０．７以上がより好ましく、０．９以上がさらに好ましい。また、適用対象中の硫酸化アルギン酸濃度をある程度高くすることができる場合は、所望の処理能力が発揮されることを条件に、ＤＳは、例えば、０．００００１以上とすることができる。
　細胞処理剤の剤形は特に限定はなく、各種の用途に応じて適切な賦形剤を用いて、粉状、液状等適宜決定することができる。また、必要に応じて、各種の添加剤を添加することもできる。
　例えば、所望の細胞を一般的な細胞培養液で培養した後、細胞を体内へ投与する場合は、その細胞培養液から細胞を分離、洗浄して、細胞培養液に含まれる医療用には用いられない多種類の試薬を除去した後、得られた細胞を細胞外液補充液や維持輸液等に浸漬させ、これを体内へ投与することができる。この細胞外液補充液は、生体内で細胞の周囲を取り囲む細胞外液に類似する電解質組成等を持つ液の一群であり、維持輸液は、ヒトが生命を維持するために必要とされる１日の水分量と電解質に、糖、タンパク質（アミノ酸）、脂肪などの栄養素や微量栄養素を加味して投与される輸液である。この細胞外液補充液や維持輸液は、他の有効成分の注射液の溶媒として、あるいはそれ単体の点滴注射等に用いられる医療用液体であり、体内への投与の安全性が確立されている。このように、細胞周囲環境に類似した電解質組成等と安全性のために、再生医療において細胞を体内に投与する際に用いられる細胞処理剤の賦形剤として、細胞外液補充液や維持輸液は好適である。このような細胞外液補充液は、例えば、細胞外液の喪失を補充する目的で使用される所謂補充輸液が挙げられ、より具体的には、リンゲル液、乳酸リンゲル液、酢酸リンゲル液、重炭酸リンゲル液、ハルトマン液、生理食塩水、代用血漿剤、血漿製剤等が挙げられる。このうち、代用血漿剤や血漿製剤のようにヒト由来のものではない補充輸液等が望ましい。維持輸液は、例えば、アミノ酸を含まない糖・電解質輸液製剤、糖・電解質・アミノ酸輸液製剤、糖・電解質・アミノ酸・総合ビタミン液製剤、糖・電解質・アミノ酸・総合ビタミン・微量元素液製剤、糖・電解質・アミノ酸・脂肪乳剤等が挙げられる。
　ところで、前述のように一般的な細胞培養液から細胞を分離、洗浄後に所謂細胞外液補充液に浸漬させて細胞処理剤を調製する場合、このような操作により、細胞のバイアビリティ（Viability）の低下や感染の可能性がある。一方、本発明者は、硫酸化アルギン酸は、細胞外液補充液の中においても、一般的な細胞培養液中と同様に、細胞保護作用を有することを見出している。つまり、硫酸化アルギン酸を含むことで、細胞外液補充液や維持輸液等は、例えば保管運搬の際の細胞培養液の代替として用いることが可能であり、投与する際には細胞外液補充液中に浸したそのままの状態で直ちに細胞の投与が可能である。このため、培養液から所謂細胞外液補充液や維持輸液等に細胞を移し替えることによるバイアビリティ（Viability）の低下や感染の危険を防止することができる。
　前述の細胞処理剤は、硫酸化アルギン酸を有効成分として含む所定剤形の試薬として用いることができるため、培養液、培養容器や細胞の担体等の培養基材、生体の臓器等の生体組織に試薬を添加、塗布することで、（ａ）培養基材の足場又は生体組織の足場に増殖させた培養細胞を、培養基材の足場又は生体組織の足場から剥離させ、浮遊化させることができ、また、（ｂ）生体組織の組織内細胞を、生体組織の足場（生体臓器等）から剥離させ、浮遊化させることができる。したがって、当該細胞処理剤は、細胞剥離・浮遊化用として好適に用いることができる。
　前述の細胞処理剤は、生体組織の組織内細胞や、培養基材の足場や生体組織の足場の培養細胞を、そのバイアビリティ（Viability）を良好に保ちつつ、増殖を停止させたり、接着を停止させたり、細胞を分化させずに未分化・低分化の状態を維持することができる、即ち、休眠させることができる。そのため、それら細胞を休眠させるための細胞休眠用の細胞処理剤として好適に用いることができる。この休眠作用により、細胞は、その増殖は停止するものの、条件が整えば覚醒し、培養基材や生体組織に再接着し、増殖を開始することができる状態になっている。そのため、細胞を保存、運搬するために、一時的に休眠させて細胞の活動を停止させ、所望の時期に活動を再開させることができる点、剥離浮遊化処理により得られる浮遊化細胞をそのまま休眠させることができる点でも有効な細胞処理剤である。また、前述の細胞処理剤は、細胞を未分化又は低分化の状態で保持可能なため、休眠状態から覚醒させた後、所望の性質を示す組織・臓器の再生・形成を可能とする細胞保存用としても好適である。
　前述の細胞処理剤は、培養容器や保管容器等を含む細胞容器内や生体組織内の組織内細胞又は培養細胞がバイアビリティ（Viability）を保持させて死滅するのを抑制する細胞保護作用を有する。そのため、従来、細胞死を防止する保護作用を有するものとして用いられていたＦＢＳやヒトの血清に替えて、当該細胞処理剤を用いることができる。したがって、ＦＢＳやヒトの血清を用いることなく、安全に細胞の死滅を防止して細胞を保護することができる。この細胞保護作用を有する細胞処理剤は、例えば、細胞を保存運搬する際に好適である。特に、前述のように、賦形剤としての細胞外液補充液や維持輸液と有効成分としての硫酸化アルギン酸とを含む細胞処理剤は、保存運搬の際にも細胞を保護することが可能であり、かつ、そのまま直ちに投与が可能であり、医療の安全性や利便性に資するところ非常に大である。
　細胞処理剤は、例えば、前述のように細胞休眠用、細胞保護用として、或いは、細胞を未分化又は低分化の状態で保持するための細胞保存用として機能し得るため、細胞処理剤の剤形が液体の場合は、細胞、組織又は臓器の保存用の液体として好適である。この場合は、剤形は、細胞培養液、細胞外液補充液や維持輸液等を用いるのが好ましい。尚、各種の用途に適用可能な細胞培養液は、特に限定はなく、用途等に応じて、一般的な無血清細胞培養液や、一般的なＦＢＳ添加細胞培養液等を選択して採用することができる。
　前述の細胞処理剤の有効成分である硫酸化アルギン酸は、細胞を剥離・浮遊化する効果を示す一方、細胞を休眠させる効果を示すが、硫酸化アルギン酸と多価の陽イオンを含む賦活化剤を共存させると、浮遊化細胞や浮遊化していない休眠化細胞を活性化すること、例えば、浮遊化した細胞の接着能や、休眠化した細胞の休眠状態からの覚醒（例えば、増殖能等）を活性化することを発明者は見出した。賦活化剤に含まれる多価の陽イオンは、架橋剤として硫酸化アルギン酸に結合し、丁度細胞外マトリックスのような親水性で非流動性のゲルを形成し得る。そのため、例えば、硫酸化アルギン酸を含む培養液等の液体中で浮遊化された細胞の培養液等に多価の陽イオンを含む賦活化剤を加えると、２価の金属イオン等の多価の陽イオンにより浮遊化細胞の接着能を活性化することができると同時に、多価の陽イオンにより架橋されてゲル化した硫酸化アルギン酸の足場に接着させた状態を容易に形成することができる。更に、多価の陽イオンにより休眠状態にある休眠化細胞を覚醒させるため、所定の条件で培養すれば、硫酸化アルギン酸の作用により休眠状態（例えば休眠の一現象である増殖停止状態）であった細胞が覚醒し、再接着と再増殖を共に開始することができる。このように、前述の硫酸化アルギン酸を含む細胞処理剤と多価の陽イオンを含む賦活化剤とを組み合わせて用いることで、細胞の剥離、浮遊化や休眠状態への導入、およびその逆である浮遊化細胞のみならず、接着状態で休眠状態の細胞も活性化させることができる。この多価の陽イオンの細胞接着能活性化作用、休眠細胞の覚醒作用と硫酸化アルギン酸のゲル化の相互関係は良くわかっていないが、硫酸化アルギン酸と多価の陽イオンを組み合わせたものは、細胞の剥離、浮遊化や休眠状態への導入、これらとは逆の作用である、細胞の接着や休眠化細胞の覚醒をコントロールするためのセット試薬として好適である。
　ここで、浮遊化した細胞の接着能とは、前述の細胞の剥離、浮遊化とは逆の現象で、単離細胞状態からクラスター化した細胞群や足場へ接着した細胞、或いは、クラスター化した細胞から足場に接着した細胞へと変化することである。細胞がこの接着を起こす能力を細胞の接着能と称し、接着能の低下した状態から接着能の回復した状態へ移行することを接着能が活性化したという。浮遊化細胞の接着能が活性化したか否は、例えば、浮遊化細胞が含まれる培養液を、細胞が十分に足場に接着できる期間静置した後の接着細胞数をカウントし、対照と比較することで評価することができる。また、細胞の増殖能とは、細胞分裂を起こして細胞数を増加させる能力を増殖能と称し、休眠状態で増殖能が低下又は停止した状態から増殖能が回復した状態へ移行することを増殖能が活性化したという。休眠化細胞の増殖能が活性化したか否かは、例えば、休眠化細胞が含まれる培養液を所定条件で培養した後の細胞数をカウントし、対照と比較することで評価することができる。
　尚、硫酸化アルギン酸は接着細胞を足場から剥離、浮遊化する作用を示すと同時に、剥離、浮遊化された細胞は休眠状態になる傾向にある。しかし、細胞の種類及び各種の条件によっては、細胞の剥離、浮遊化は起こしていないが、休眠状態にある場合がある。すなわち、接着している細胞が休眠状態にある場合もある。賦活化剤を硫酸化アルギン酸と共存させることにより、細胞が浮遊化しているか否かにかかわらず、一旦硫酸化アルギン酸により休眠状態になった細胞を活性化することができる。
　賦活化剤としては、多価の陽イオンを含み、浮遊化細胞又は休眠化細胞を活性化することが可能であり、かつ、安全に生体等に適用可能なものであれば、特に限定はないが、浮遊化細胞又は休眠化細胞の活性化をより促進させる観点からは、硫酸化アルギン酸をゲル化させ得るものが好ましい。このような賦活化剤としては、例えば、キトサンの様なポリカチオン、アルミニウムイオン、鉄イオン、マグネシウムイオンやカルシウムイオン等の多価陽イオンを含む水溶液や多価陽イオンのキレート化製剤、アルミニウム化合物、鉄化合物、マグネシウム化合物やカルシウム化合物の粉末などの水不溶性の多価陽イオンを生ずる固体、これらの多価陽イオン供給体を含侵あるいは表面に担持させた布片等が挙げられる。カルシウムイオン源としては、例えば、水溶性の塩化カルシウム、水不溶性のリン酸カルシウム等が挙げられる。カルシウムイオン供給体としては、例えば、キレート化カルシウム等が挙げられる。布帛は、生体に適用可能な生体適合性のある繊維で形成されたガーゼ等が挙げられる。
　各種の用途に適用する際の添加量は、適用対象、硫酸化アルギン酸の構成等、に応じて適宜決定することができる。例えば、ＤＳが０．９の硫酸化アルギン酸を培養液に適用する場合は、硫酸化アルギン酸の培養液中の濃度が、好ましくは０．００１～５０ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは０．０５～４０ｍｇ／ｍｌ、さらに好ましくは０．１～２０ｍｇ／ｍｌとすることで、前述の各種の作用を奏しやすい傾向にある。例えば、休眠作用として用いる場合は、好ましくは０．００１ｍｇ／ｍｌ以上、より好ましくは０．００６２５ｍｇ／ｍｌ以上である。また、細胞剥離・浮遊化作用として用いる場合は、好ましくは０．０１～５０ｍｇ／ｍｌである。細胞保護作用として用いる場合は、好ましくは、０．０００１～１０ｍｇ／ｍｌである。
　前述の細胞処理剤及びセット試薬は各種の細胞に適用可能であり、例えば、植物、ヒト、ヒト以外の動物に由来する生体細胞に好適である。
　以下、実施例に基づき、本発明の実施形態について詳細に説明する。以下に示す例では、細胞培養容器又は保管容器内の細胞に対する各種の効果を検証したものであるが、これらに限らず、生体組織内の細胞やスフェロイド化した細胞にも同様の効果を示すものであることは勿論のことである。
（製造例１：硫酸化アルギン酸Ａの製造）
　アルギン酸に、ランダムに硫酸基を導入した硫酸化アルギン酸（硫酸化アルギン酸Ａ）を、公知文献「Whistler R L., et al., Sulfates. Edited by Whistle RL., et al., Methods in Carbohydrate Chemistry. Vol. II, 298-303. Academic Press (New York) (1963)」に記載の方法に従って作製した。即ち、アルギン酸ナトリウム（富士フィルム和光純薬株式会社製、試薬特級）と三酸化硫黄ピリジン錯体をジメチルホルムアミド中で撹拌（４０℃、１２時間）してアルギン酸へ硫酸基を導入した後、硫酸化アルギン酸を析出させ、これを希水酸化ナトリウム水溶液で中和・溶解の後、７２時間透析したものを凍結乾燥して硫酸化アルギン酸Ａを調製した。これを精製蒸留水等に溶解して所定の濃度に調整して使用した。得られた硫酸化アルギン酸Ａは、後述の物性評価で単糖分子あたり置換度（ＤＳ）が０．９と十分量の硫酸基が導入されたものであることを確認した。
（製造例１－２：硫酸化アルギン酸Ａ－２の製造）
　反応温度と時間を後述する置換度となるように調整し、アルギン酸ナトリウムと三酸化硫黄ピリジン錯体をジメチルホルムアミド中で撹拌した以外は、製造例１と同様にして、所定の置換度の硫酸化アルギン酸Ａ－２を得た。硫酸化アルギン酸Ａ－２のＤＳは、後述の物性評価で０．００１であることを確認した。
（製造例１－３：硫酸化アルギン酸Ａ－３の製造）
　反応温度と時間を後述する置換度となるように調整し、アルギン酸ナトリウムと三酸化硫黄ピリジン錯体をジメチルホルムアミド中で撹拌した以外は、製造例１と同様にして、所定の置換度の硫酸化アルギン酸Ａ－３を得た。硫酸化アルギン酸Ａ－３のＤＳは、後述の物性評価で０．０００１であることを確認した。
（製造例１－４：硫酸化アルギン酸Ａ－４の製造）
　反応温度と時間を後述する置換度となるように調整し、アルギン酸ナトリウムと三酸化硫黄ピリジン錯体をジメチルホルムアミド中で撹拌した以外は、製造例１と同様にして、所定の置換度の硫酸化アルギン酸Ａ－４を得た。硫酸化アルギン酸Ａ－４のＤＳは、後述の物性評価で定量測定限界の０．００００１であることを確認した。
（製造例１－５：硫酸化アルギン酸Ａ－５の製造）
　アルギン酸ナトリウム（富士フィルム和光純薬株式会社製、試薬特級）に替えて、低粘度型（低分子量型）のアルギン酸ナトリウム（共成製薬株式会社製）を用いた以外は、製造例１－２と同様にして、所定の置換度で、低粘度型の硫酸化アルギン酸Ａ－５を得た。硫酸化アルギン酸Ａ－５のＤＳは、後述の物性評価で０．００１であることを確認した。硫酸化アルギン酸Ａ－５の粘度は、１０％水溶液を用いて２０℃の環境温度で粘度計により測定したところ、２６ｍＰａ・ｓであった。
（製造例１－６：硫酸化アルギン酸Ａ－６の製造）
　アルギン酸ナトリウム（富士フィルム和光純薬株式会社製、試薬特級）に替えて、アルギン酸ナトリウム８０－１２０（富士フィルム和光和光純薬株式会社製、一級試薬）を用い、反応温度と時間を後述する置換度となるように調整した以外は、製造例１と同様にして、所定の置換度の硫酸化アルギン酸Ａ－６を得た。硫酸化アルギン酸Ａ－６のＤＳは、後述の物性評価で定量測定限界の０．２５であることを確認した。
（製造例２：硫酸化アルギン酸Ｂの製造）
　アルギン酸の６位の炭素原子に優先的に硫酸基が導入された硫酸化アルギン酸（硫酸化アルギン酸Ｂ）を、公知文献「Hoiberg CP., et al., Preparation of sulfate esters. Reactions of various alcohols, phenols, amines, mercaptans, and oximes with sulfuric acid and dicyclohexylcarbodiimide J. Am. Chem. Soc. 91. 4273-4278 (1969)」に記載の方法に従って作製した。即ち、先ずアルギン酸塩をイオン交換樹脂カラムによりＨ型とした後、溶媒に容易に溶解するようにピリジンで中和してピリミジウム塩の形にした。これをＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド中に溶解して、ジシクロヘキシルカルボジイミドを用いて、硫酸と０℃、６０分間、脱水縮合反応させ、６位の炭素原子に硫酸基を導入した。得られた硫酸化アルギン酸（以下、「６硫酸基アルギン酸」と称する場合がある。）は、単糖分子あたり置換度（ＤＳ）が０．９と十分量の硫酸基が導入されたものであった。また、得られた硫酸化アルギン酸Ｂについて、後述の方法で硫酸基が導入された炭素原子を調べたところ、６位の炭素原子への導入が８０％以上、２位への導入が２０％以下であることを確認した。
（製造例３：硫酸化アルギン酸Ｃの製造）
　６位の炭素原子以外に硫酸基が導入された硫酸化アルギン酸（硫酸化アルギン酸Ｃ）を、公知文献「Matsuo M., et al., A novel regioselective of polysaccharide sulfates: specific 6-O-desulfation with N,O-bis(trimethylsilyl)ace desulfation tamide, Carbohydr. Res., 241, 209-215 (1993)」に記載の方法に従って作製した。この方法は、製造例１で得られた硫酸化アルギン酸Ａのうち、単糖分子あたり置換度が１．７以上のものを用いて、６位の炭素原子に導入されている硫酸基を除去し、硫酸化アルギン酸Ｃを得る方法である。より具体的には、製造例１で得られた硫酸化アルギン酸Ａのピリジニウム塩とＮ－メチル－Ｎ－トリメチルシリルトリフルオロアセトアミドをピリジン中で加熱して、６位の炭素原子に導入された硫酸基を特異的に除くことで、硫酸化アルギン酸Ｃを得た。得られた硫酸化アルギン酸Ｃは、単糖分子あたり置換度（ＤＳ）が０．９と十分量の硫酸基が導入されたものであった。また、後述の方法で硫酸基が導入された炭素原子を調べたところ、６位の炭素原子への硫酸基の導入が１０％以下であることを確認した。
（評価）
＜置換硫酸基個数の決定＞
　葛西らの方法（葛西裕他, 硫酸化アルギン酸電解質膜の作成と電気化学的特性, 高分子論文集, 65,4,295-300,（2008））に準拠して、硫酸化アルギン酸中の置換された硫酸基の量を測定した。即ち、Ｘ線分析装置を用いて硫黄含有量を測定した。また、フーリエ変換赤外分光測定をＡＴＲ法により行い、Ｓ＝Ｏ伸縮振動とＳ－Ｏ伸縮振動に基づく新たな吸収ピークの有無を確認した。硫酸基の置換の程度は、単糖分子１個当たりの硫酸基の個数（平均値）すなわち置換度（ＤＳ）で表した。
＜硫酸基導入炭素原子の部位と硫酸基導入の割合＞
　硫酸基が導入された炭素原子の部位及び硫酸化アルギン酸中の硫酸基の割合は、公知文献である「Yoshida T.,et al., Synthesis and structural analysis of curdlan sulfate with a potent inhibitory effect of AIDS virus infection.  Macromolecules 23, 3717-3722 (1990)」及び「Yamagaki T., et al., NMR Spectroscopic Analysis of Sulfated fJ-l ,3-Xylan and Sulfation Stereochemistry.Biosci. Biotech. Biochem., 61 (8),1281-1285 (1997)」に記載の方法に準拠して測定した。即ち、１３－ＣＮＭＲと２次元ＮＭＲを用い、硫酸基が導入されている炭素原子部分が低磁場へシフトした所見等と、Ｈ－Ｈ　ＣＯＳＹスペクトルとＣ－Ｈ　ＣＯＳＹスペクトル等を基に硫酸基の導入部位と割合を決定した。
　製造例１～３で得られた硫酸化アルギン酸の前述の評価結果を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
（実験例１）細胞の剥離・浮遊化作用
　間葉系細胞としてチャイニーズハムスター線維芽細胞、上皮系細胞としてラット角膜上皮細胞を用いて実験を行った。濃度１０％のＦＢＳ等を無血清細胞培養液に加えたもの（以下、「通常のＦＢＳ添加細胞培養液」と称する場合がある。）を準備し、これに上記の線維芽細胞あるいは角膜上皮細胞を１０６Ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度で添加し、通常の細胞培養条件（３７℃、湿度１００％、炭酸ガス濃度５％）で２４時間培養して、培養細胞を十分に培養シャーレ壁に接着させた。その後に、これらの培養シャーレ内の細胞培養液を、濃度０．０１、０．１、１、１０、５０ｍｇ／ｍｌの製造例１～３で得られた硫酸化アルギン酸Ａ～Ｃの水溶液と交換し、引き続き通常条件で細胞培養した。比較対照として、硫酸化しない通常のアルギン酸の同濃度水溶液と交換したものを用いた。これらについて経時的に細胞の剥離浮遊化を観察した。９０％以上の細胞が剥離浮遊化した時点を細胞の剥離浮遊化と判定した。Ｎ＝４として行ったラット角膜上皮細胞の結果（平均値）を表２に示す。表２中、剥離浮遊化したものを「○」、剥離浮遊化しないものを「×」として示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　表２に示すように、硫酸化アルギン酸Ａ～Ｃは、いずれも濃度に依存して所定時間内に接着細胞を剥離浮遊化した。また、硫酸化アルギン酸Ｂのように、６位の炭素原子に優先的に硫酸基を導入したものは、非特異的に導入した硫酸化アルギン酸Ａ及び６位以外に優先的に導入した硫酸化アルギン酸Ｃに比べて、剥離浮遊化の効果が高かった。一方、通常のアルギン酸では、剥離浮遊化を認めなかった。
　チャイニーズハムスター線維芽細胞を用いた実験でも同様の結果が認められた。
　以上のように、硫酸化アルギン酸は、細胞を剥離し、浮遊化させる細胞剥離・浮遊化用の細胞処理剤として好適であることが分かる。
（実験例２）浮遊化細胞の休眠作用と覚醒後の再接着及び増殖
＜実験例２－１＞
　実験例１において１ｍｇ／ｍｌの硫酸化アルギン酸Ａ～Ｃの交換液を用いて剥離浮遊化された細胞が、従来のトリプシン法と比較して、細胞の生死に差異が無いかを検討した。細胞の生死を確認する通常の方法であるトリパンブルー排出試験は、公知文献である「Denizot F., et al., Rapid colorimetric assay for cell growth and survival. Modifications to the tetrazolium dye procedure giving improved sensitivity and reliability. J. Immunol. Methods,89,271-277 (1986)」に記載の方法に従って行った。また、蛍光顕微鏡下で生細胞を立体視野でも観察できるCytoRed染色生細胞赤色蛍光観察法は、公知文献である「Ishiyama M., et al., A resorufin derivative as a fluorogenic indicator for cell viability, Anal. Sci., 15,1025-1028 (1999)」に記載の方法に従って行った。これらの試験から、硫酸化アルギン酸Ｂにより剥離浮遊化した細胞の生細胞率（生細胞数÷細胞総数×１００％）を求めた。また、比較対照として、トリプシン法で剥離浮遊化した細胞の生細胞率（生存率）求めて、比較した。
　トリプシン法は、実験例１の硫酸化アルギン酸の水溶液に替えて、通常の方法、すなわち以下のようにして行った。
　細胞の培養容器内の細胞培養液を吸い取って捨て、培養に使用する量の約半量のＰＢＳ（－）（Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋不含有ＰＢＳ）で細胞表面を洗った。その後、２５ｃｍ２の細胞表面に対し１ｍＬの０．２％トリプシン／ＥＤＴＡ液を容器内に行きわたらせてトリプシンを作用させ、その後、余分なトリプシン液を除いた。この培養容器をＣＯ２インキュベーター内で２分間通常条件（３７℃、炭酸濃度５％、湿度１００％）でインキュベートし、細胞の剥離を確認した。その後、血清を含まない細胞培養液を使用する場合は、トリプシンインヒビターでトリプシンを不活性化した。また。ＦＢＳ添加細胞培養液する場合はＦＢＳ添加細胞培養液を加えてトリプシンを不活性化した。以上の操作以外は、実験例１と同様にして、浮遊化細胞を得た。得られた浮遊化細胞を、細胞の生死の確認試験に供した。
　１ｍｇ／ｍｌの硫酸化アルギン酸Ｂの交換液を用いて剥離浮遊化された細胞及び比較対照の結果を表３に示す。培養細胞はラット角膜上皮細胞で、Ｎ＝４の結果である。トリパンブルー排出試験とライブ／デッドアッセイで判定した細胞の生細胞率は、トリプシン法で剥離浮遊化した細胞では、生細胞率（平均）を１００％とした場合にその範囲は９５～１０６％であった。また硫酸化アルギン酸Ｂで剥離した場合の生細胞率は、トリプシン法での平均を１００％とした場合に比較して平均１０１％、またその範囲も９５～１０６％の間に分布していて、トリプシン法と同等であった。このように、硫酸化アルギン酸で剥離浮遊化された細胞は、従来法のトリプシン法に比較して細胞の生存に対して同等の安全な方法であることが判った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
＜実験例２－２＞
　トリプシン法で剥離浮遊化した細胞をトリプシン除去・不活性化の後にＦＢＳ添加細胞培養液中に移して通常の培養条件下（３７℃、湿度１００％、炭酸ガス濃度５％）で培養すれば、浮遊化細胞は１２時間から２４時間以内に培養容器の内壁を足場として接着し、これを５～７日間培養すると、細胞は指数関数的に増殖することが知られている。硫酸化アルギン酸で剥離浮遊化された細胞を同じ濃度の硫酸化アルギン酸を含有するＦＢＳ添加細胞培養液中で５日間の長期に亘り培養した後にも、この浮遊化細胞を、硫酸化アルギン酸を含まないＦＢＳ添加細胞培養液中で培養すれば、上記のトリプシン法で剥離浮遊化してトリプシン除去・不活性化の後にＦＢＳ添加細胞培養液中で培養した細胞と同様に培養容器の内壁に接着し、増殖するか否かを以下のようにして検討した。以下の実験例２－２－１、２－２－２では、いずれもラット角膜上皮細胞を用いて行った。
［実験例２－２－１］
　硫酸化アルギン酸により剥離浮遊化した細胞をあらかじめ５日間、同じ濃度の硫酸化アルギン酸を含有するFBS添加細胞培養液中で通常の条件下で培養した。この５日間、細胞は浮遊化して全く細胞数は増加していないか否か、即ち、細胞増殖を停止して休眠しているか否かを、顕微鏡観察および生細胞数を比較する標準法であるMTTアッセイ法（Gerlier D., et al., Use of MTT colorimetric assay to measure cell activation. J. Immunol. Methods. 94, 57-63.(1986)）による細胞数比較により確認した。
　検討結果を図１と表４に示す。表４は、硫酸化アルギン酸Ｂの濃度が１ｍｇ／ｍｌの細胞培養液を用い、Ｎ＝４の結果である。５日間の硫酸化アルギン酸含有細胞培養液中での通常培養の前後では、細胞は同じように浮遊化しクラスターを形成した状態を保って変化せず（図１）、また細胞数も増加していない（表４）ことがわかった。すなわち、硫酸化アルギン酸含有細胞培養液の中では、浮遊化細胞はバイアビリティ（Viability）を有しつつ増殖を停止し、浮遊状態で休眠していることが確認された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
［実験例２－２－２］
　図２に示す実験シェーマに従って検討を行った。比較対照群として、トリプシン法で浮遊化させた同数の細胞（これは予め５日間培養したものではない）を、通常のＦＢＳ添加細胞培養液内に移して７日間通常の条件下で培養を行った。この比較対照群の細胞培養は通常の細胞培養であり、７日間に細胞は増殖して細胞数は著しく増加した。
　実験群として、硫酸化アルギン酸Ｂ含有ＦＢＳ添加細胞培養液中で５日通常の条件下で培養された細胞を、その後に通常の（すなわち硫酸化アルギン酸を含まない）ＦＢＳ添加細胞培養液内に移して、７日間通常の培養条件で培養を行った。比較対照群及び実験群について、この７日間の培養後に増殖細胞数をＭＴＴアッセイ法により比較検討し、両者の増殖能を比較検討した。
　結果を表５に示す。実験群も、比較対照群も、いずれも通常のＦＢＳ添加細胞培養液中で通常の培養条件で培養を開始し、２４時間以内に培養容器の内壁の足場に接着した。そして、７日間通常の培養条件で培養を行った後、比較対照群の生細胞数の平均を１００％とした場合、実験群の生細胞数は平均１０４％（範囲：１００～１１０％）であった。これは、実験群の細胞も、通常の培養条件で培養すると、比較対照群の細胞と同様に足場へ接着し、比較対照群の場合と同等以上に著しく増殖したことを示している。
　つまり、硫酸化アルギン酸で剥離浮遊化された浮遊化細胞は、５日間の長期に亘り硫酸アルギン酸含有細胞培養液中に浮遊状態で通常の条件下で培養されても（実験群）、トリプシン法で剥離浮遊化後に直ちに通常の培養条件で培養した細胞（比較対照群）と同様に、細胞培養容器へ再接着し、増殖することが判った。
　このように、硫酸化アルギン酸を用いて細胞を剥離浮遊化し、硫酸化アルギン酸存在下、細胞培養液中で静置しても、従来の一般的処理の場合と同様に、再接着し、増殖させることが可能であることから、硫酸化アルギン酸を用いる細胞の剥離浮遊化は、細胞毒性がなく、かつ、浮遊化細胞を休眠させることが可能であることが分かる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　硫酸化アルギン酸Ｂに替えて、硫酸化アルギン酸Ａ、Ｃを用いて同様の実験を行った同様の実験結果を認めた。
［実験例２－２－３］
　ＩＳＯ　１０９９３－５（Biological evaluation of medical devices Part 5: Tests for in vitro cytotoxicity）に記載のコロニー形成阻害試験を応用し、浮遊化細胞が休眠状態から再び接着し増殖する際の硫酸化アルギン酸の濃度について検討した。実験方法は以下のとおりである。尚、実験に使用した細胞は、実験例１と同じ２種とした。
　ＦＢＳ添加細胞培養液中でシャーレに接着させた細胞を容れたシャーレの培養液を、開始濃度１０～０．１ｍｇ／ｍｌの硫酸化アルギン酸Ｂを含むＦＢＳ添加細胞培養液に培養液を替えることにより細胞を一旦浮遊化した。次に、この細胞培養液中に通常の（つまり硫酸化アルギン酸を含有しない）ＦＢＳ添加細胞培養液を加えて、硫酸化アルギン酸濃度（開始濃度１０～０．１ｍｇ／ｍｌ）を１倍希釈（すなわち希釈なし＝希釈度１００％、硫酸化アルギン酸濃度は開始濃度と同じ濃度１０～０．１ｍｇ／ｍｌ）から１００倍希釈（すなわち希釈度１％、硫酸化アルギン酸は開始濃度の１％の濃度０．１～０．００１ｍｇ／ｍｌ）までの各段階に希釈した状態に硫酸化アルギン酸濃度を調整した。この状態に調整した細胞培養溶液中で、７日間通常の培養条件（３７℃、湿度１００％、炭酸ガス濃度５％）で細胞の培養を行った。
　これらの細胞（実験群）について、細胞の再接着と細胞増殖が、後述の比較対照１や比較対照２と同様に通常のように起こるか否かを観察した。また、細胞増殖の程度は、７日後にコロニーを形成した数を求め、前述のコロニー形成阻害試験に準じた方法で比較検討した。
　比較対照１として、ＦＢＳ添加細胞培養液中でシャーレに接着させた細胞を容れたシャーレの培養液を、１０～０．１ｍｇ／ｍｌの硫酸化アルギン酸Ｂを含むＦＢＳ添加細胞培養液に培養液を替えることにより一旦浮遊化した細胞を用い、次に、この細胞培養液を通常の（つまり硫酸化アルギン酸を含有しない）ＦＢＳ添加細胞培養液に替えた後、更に通常のＦＢＳ添加細胞培養液を加えて、実験群の段階希釈と同様の操作を行った。この操作の後、７日間通常の培養条件（３７℃、湿度１００％、炭酸ガス濃度５％）で細胞の培養を行った。
　また、比較対照２として、通常のトリプシン法で浮遊化させた細胞を用いた。この細胞も通常のＦＢＳ添加細胞培養液内に移して、７日間通常の培養条件（３７℃、湿度１００％、炭酸ガス濃度５％）で培養を行った。比較対照１、２についても、細胞の再接着、細胞増殖が通常のように起こることを確認した。また、細胞増殖は、７日後にコロニーを形成した数を求め、前述のコロニー形成阻害試験に準じた方法で比較検討した。これによって比較対照２をコロニー形成率１００％の基準とした。
　結果を図３及び表６Ａに示す。図３はコロニー形成阻害試験の結果を示した図の一つであり、開始濃度０．１ｍｇ／ｍｌの硫酸化アルギン酸Ｂを含有するＦＢＳ添加細胞培養液を、硫酸化アルギン酸を含まないＦＢＳ添加細胞培養液で段階希釈して、その結果、開始濃度０．１ｍｇ／ｍｌの硫酸化アルギン酸Ｂが希釈されて様々な濃度の硫酸化アルギン酸Ｂを含有する培養液となった中で７日間培養された場合のコロニー形成率実験の結果を示している。図３中、横軸の溶液希釈度（％）は、開始濃度０．１ｍｇ／ｍｌの硫酸化アルギン酸Ｂの濃度を１００％とした場合の硫酸化アルギン酸Ｂの希釈度を示しており、例えば溶液希釈度１０％は硫酸化アルギン酸Ｂの開始濃度０．１ｍｇ／ｍｌの１０％の硫酸化アルギン酸Ｂ濃度＝０．０１ｍｇ／ｍｌを意味する。黒塗りの三角（▲）のマークと連続線で示すものは、比較対照１の結果である。またコロニー形成率１００％は比較対照２の結果を１００％とした基準点である。黒塗り菱形（◆）のマークと連続線で示すものは、０．１ｍｇ／ｍｌの開始濃度を１００％としてそれから段階的に希釈された濃度の硫酸化アルギン酸Ｂを含有するＦＢＳ添加細胞培養液中で７日間培養された細胞（実験群）のコロニー形成率を示したものである。
　図３に示すように、通常のＦＢＳ添加細胞培養液中で培養した細胞は、硫酸化アルギン酸Ｂにより浮遊化した細胞（比較対照１、実験群）も、また通常法のトリプシン法で浮遊化させた細胞（比較対照２）も、細胞は通常の通り２４時間以内に接着しコロニー形成を形成し、両者のコロニー形成数には差異を認めなかった（比較対照１のコロニー形成率は１００％の基線に近い）。
　硫酸化アルギン酸Ｂを細胞培養液で希釈した場合（実験群）は、硫酸化アルギン酸濃度が０．００６２５ｍｇ／ｍｌ（つまり開始濃度０．１ｍｇ/ｍｌの硫酸化アルギン酸Ｂを１００％とした場合の６．２５％＝０．００６２５ｍｇ/ｍｌ）以上では、細胞は接着せずコロニー形成率も６～１４％と増殖もしなかった。しかし硫酸化アルギン酸濃度が０．００１ｍｇ／ｍｌであった場合には、細胞は通常と同じく２４時間以内に接着し、かつコロニー形成率も９０％以上に急上昇して、比較対照１と同様に通常とおりに増殖することが判った。
　硫酸化アルギン酸Ｂに替えて、硫酸化アルギン酸Ａ、Ｃを用いた場合でも同様の実験結果を認めた。
　表６Ａに、コロニー形成５０％阻害濃度の結果を示す。硫酸化アルギン酸Ａ～Ｂについて、図３に示す、コロニー形成率と硫酸化アルギン酸の濃度との関係を求め、得られた関係から、コロニー形成５０％阻害濃度を算出した。その結果、硫酸化アルギンＢではコロニー形成５０％阻害濃度は０．００６２５ｍｇ／ｍｌから０．００１ｍｇ／ｍｌの間であった。硫酸化アルギン酸Ａと硫酸化アルギン酸Ｃも、同様の実験結果を認めた。両者のコロニー形成５０％阻害濃度は、０．０１～０．００６２５ｍｇ／ｍｌの区間であった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　以上より、硫酸化アルギン酸Ａ～Ｃで剥離浮遊化された細胞は、通常のＦＢＳ添加細胞培養液内に移して通常条件下で培養したり（比較対照１）、硫酸化アルギン酸Ａ～Ｃの濃度が、０．０１～０．００６２５ｍｇ／ｍｌの範囲まで希釈されれば、休眠から覚醒して、足場に再び接着し、増殖することがわかった。
［実験例２－２－４］
　ＩＳＯ　１０９９３－５（Biological evaluation of medical devices Part 5: Tests for in vitro cytotoxicity）に記載のコロニー形成阻害試験を応用し、硫酸化アルギン酸により休眠状態になっている細胞（硫酸化アルギン酸による細胞の浮遊化と休眠は必ずしも同じでは無く、より高濃度では浮遊化するがより低濃度では休眠状態になっても浮遊化しない）が休眠状態から覚醒して再び増殖を開始する硫酸化アルギン酸の濃度について検討した。実験方法は、［実験例２－２－３］と概ね同様、以下のとおりである。尚、実験に使用した細胞は、マウスＢ－１６悪性黒色腫の高転移株を用いた。
　ＦＢＳ添加細胞培養液中でシャーレに接着させた細胞を容れたシャーレの培養液を、開始濃度１ｍｇ／ｍｌの硫酸化アルギン酸Ａ－３、または開始濃度０．１ｍｇ／ｍｌの硫酸化アルギン酸Ａを含むＦＢＳ添加細胞培養液に培養液を替えることにより、細胞を一旦休眠化した。次に、この細胞培養液中に通常の（つまり硫酸化アルギン酸を含有しない）ＦＢＳ添加細胞培養液を加えて、硫酸化アルギン酸濃度（開始濃度を１倍希釈とする）から１０００倍希釈までの各段階に希釈した状態に硫酸化アルギン酸濃度を調整した。この状態に調整した細胞培養溶液中で、７日間通常の培養条件（３７℃、湿度１００％、炭酸ガス濃度５％）で細胞の培養を行った。
　これらの細胞（実験群）について、細胞増殖が、比較対照１－２、１－３や比較対照２－２と同様に通常のように起こるか否かを観察した。また、細胞増殖の程度は、７日後にコロニーを形成した数を求め、前述のコロニー形成阻害試験に準じた方法で比較検討した。
　比較対照１－２として、ＦＢＳ添加細胞培養液中でシャーレに接着させた細胞を容れたシャーレの培養液を、１ｍｇ／ｍｌの硫酸化アルギン酸Ａ－３あるいは０．１ｍｇ／ｍｌの硫酸化アルギン酸Ａを含むＦＢＳ添加細胞培養液に培養液を替えることにより一旦休眠化した細胞を用い、次に、この細胞培養液を通常の（つまり硫酸化アルギン酸を含有しない）ＦＢＳ添加細胞培養液に替えた。この操作の後、７日間通常の培養条件（３７℃、湿度１００％、炭酸ガス濃度５％）で細胞の培養を行った。
　比較対照１－３として、比較対照１－２と同じように０．１ｍｇ／ｍｌの硫酸化アルギン酸Ａにより一旦休眠化した細胞を用い、次に、この細胞培養液を濃度２０ｍｇ／ｍｌの通常のアルギン酸ナトリウム（つまり硫酸化されていないアルギン酸）を含むＦＢＳ添加細胞培養液中に移した後、７日間通常の培養条件（３７℃、湿度１００％、炭酸ガス濃度５％）で細胞の培養を行った。
　比較対照２－２として、通常のトリプシン法で浮遊化させた細胞を用いた。この細胞も通常のＦＢＳ添加細胞培養液内に移して、７日間通常の培養条件（３７℃、湿度１００％、炭酸ガス濃度５％）で培養を行った。比較対照１－２、１－３、２－２についても、細胞増殖が通常のように起こることを確認した。また、細胞増殖は、７日後にコロニーを形成した数を求め、前述のコロニー形成阻害試験に準じた方法で比較検討した。これによって比較対照２－２をコロニー形成率１００％の基準とした。
　通常のＦＢＳ添加細胞培養液中で培養した細胞は、硫酸化アルギン酸Ａ－３あるいは硫酸化アルギン酸Ａ（比較対照１－２）も、また通常法のトリプシン法で浮遊化させた細胞（比較対照２－２）も、比較対照１－３として通常のアルギン酸ナトリウム２０ｍｇ／ｍｌを含有するＦＢＳ添加細胞培養液中で培養した細胞も、細胞は通常の通りコロニー形成を形成し、両者のコロニー形成数には差異を認めず、比較対照１－２、１－３のコロニー形成率は１００％の基線に近かった。
　硫酸化アルギン酸Ａ－３を細胞培養液で希釈した場合（実験群）は、硫酸化アルギン酸濃度が０．０５ｍｇ／ｍｌ（つまり開始濃度１ｍｇ／ｍｌの硫酸化アルギン酸を１００％とした場合の５％＝０．０５ｍｇ）以上の濃度ではコロニー形成率は１０％以下で、増殖もせず細胞は休眠状態であった。しかし、硫酸化アルギン酸Ａ－３の濃度がより低く０．０１ｍｇ／ｍｌ（つまり開始濃度１ｍｇ／ｍｌの硫酸化アルギン酸を１００％とした場合の１％＝０．０１ｍｇ／ｍｌ）では、コロニー形成率は９０％以上に急上昇して、比較対照１－２と同様に通常とおりに増殖することが判った。
　また、硫酸化アルギン酸Ａを細胞培養液で希釈した場合（実験群）は、硫酸化アルギン酸濃度が０．０００５ｍｇ／ｍｌ（つまり開始濃度０．１ｍｇ／ｍｌの硫酸化アルギン酸を１００％とした場合の０．５％＝０．０００５ｍｇ）以上の濃度ではコロニー形成率は１０％以下で、増殖もせず細胞は休眠状態であった。しかし、硫酸化アルギン酸Ａの濃度がより低く０．０００１ｍｇ／ｍｌ以下では、コロニー形成率は９０％以上に急上昇して、比較対照１－２と同様に通常とおりに増殖することが判った。
　表６Ｂに、コロニー形成５０％阻害濃度の結果を示す。コロニー形成５０％阻害濃度を既述の方法で算出した。その結果、硫酸化アルギン酸Ａ－３ではコロニー形成５０％阻害濃度は０．０５ｍｇ／ｍｌから０．０１ｍｇ／ｍｌの間であった。また、硫酸化アルギン酸Ａではコロニー形成５０％阻害濃度（すなわち細胞休眠効果を示す濃度）は０．０００５ｍｇ／ｍｌから０．０００１ｍｇ／ｍｌの間であった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　以上より、硫酸化アルギン酸Ａ－３は０．０５ｍｇ／ｍｌから０．０１ｍｇ／ｍｌの間までの濃度ではＢ－１６黒色腫高転移株に対して細胞増殖を阻止する休眠効果を示し、一方、通常のＦＢＳ添加細胞培養液内に移して通常条件下で培養したり（比較対照１－２）、硫酸化アルギン酸Ａ－３の濃度が、０．０１ｍｇ／ｍｌ以下の濃度まで希釈されれば、休眠から覚醒して、増殖することがわかった。また硫酸化アルギン酸Ａの場合は、この細胞休眠効果を示す濃度は０．０００５ｍｇ／ｍｌから０．０００１ｍｇ／ｍｌまでの間の濃度であり、それ以下の濃度では細胞は休眠から覚醒して増殖が始まった。これらの結果から、細胞の種類によっても細胞増殖を止めて細胞休眠を生ずる効果は異なるが、単糖分子あたりの硫酸基の置換度（ＤＳ）や硫酸化アルギン酸の濃度が異なっても、硫酸化アルギン酸は、幅広い硫酸基置換度の範囲で硫酸化アルギン酸の細胞休眠効果を発揮すると考えられた。一方、硫酸基を全く持たない通常のアルギン酸は、２０ｍｇ／ｍｌの濃度でも細胞増殖を止めて細胞休眠を生ずる効果は無いことが判った。
　以上のように、実験例２－２から、硫酸化アルギン酸を用いて細胞を剥離・浮遊化させることで、浮遊化細胞を休眠状態にすることが可能であると同時に、通常の培養条件で培養することで、浮遊化細胞を覚醒させ、足場に再接着して増殖することが可能であることが分かった。また、浮遊化細胞は、硫酸化アルギン酸濃度を所定範囲以下にすることで、覚醒させ、再接着、増殖させることが可能であることが分かった。
（実験例３）硫酸化アルギン酸による細胞保護効果
＜実験例３－１＞
［実験例３－１－１］
　実験例１と同じ２種の細胞を用いて実験を行った。細胞を例えば保存運搬する際に用いる液として、（ａ）ＦＢＳを含まない通常の無血清細胞培養液、（ｂ）硫酸化アルギン酸Ａ～Ｃがそれぞれ０．０１、０．０５、１、１０ｍｇ／ｍｌの濃度となるように無血清細胞培養液に添加したもの、（ｃ）１０％ＦＢＳを無血清細胞培養液に加えた通常のＦＢＳ添加細胞培養液を準備した。これらの細胞培養液に、細胞を通常の細胞剥離浮遊化法であるトリプシン法で浮遊化したものを、１０６Ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度で加え、そのまま常温（２２℃）の部屋の中に２４時間放置し、細胞の生死を判定し、生細胞の割合（平均生存率）を求めて比較検討した。細胞の生死は、実験例２－１と同様のトリパンブルー排出試験とＣｙｔｏＲｅｄ染色生細胞赤色蛍光観察法で判定した。
　表７Ａに、ラット角膜上皮細胞を用い、Ｎ＝４の結果を示す。表７Ａに示すように、硫酸化アルギン酸の平均生存率は、濃度１ｍｇ／ｍｌが最も高く、濃度がより高くても低くても細胞保護効果は低下したが、その効果は０．０１ｍｇ／ｍｌから１０ｍｇ／ｍｌの濃度では通常使用される１０％ＦＢＳ添加培と概ね同等がそれ以上であった。また、硫酸化アルギン酸Ｂでは、硫酸化アルギン酸Ａ、Ｃと比較してどの濃度でも優れた細胞保護効果を有していることが分かる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
［実験例３－１－２］
　細胞として、Ｂ－１６黒色腫細胞を用い、硫酸化アルギン酸として、硫酸化アルギン酸Ａ、Ａ－２、Ａ－３、Ａ－４を用い、それぞれ表７Ｂに示す濃度になるように無血清細胞培養液に添加したものを用いた以外は、実験例３－１－１と同様にして、細胞の生死を判定し、生細胞の割合を求めて比較検討した。表７Ｂに、Ｎ＝４の結果を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　硫酸化アルギン酸ＡのみならずＤＳがそれよりも低い硫酸化アルギン酸Ａ－２や、より低い硫酸化アルギン酸Ａ－３や、さらに低い硫酸化アルギン酸Ａ－４でも、調整液中の硫酸化アルギン酸濃度を高めて十分な硫酸基の濃度が存在すれば、細胞保護効果を示すことが示された。更にその場合に用いられる細胞の種類によってもその効果が異なることが判った。すなわち硫酸化アルギン酸の細胞保護効果の発現濃度は、細胞の種類によっても異なるものの、広範囲な硫酸化置換度の硫酸化アルギン酸が細胞保護効果を示すことが判った。
＜実験例３－２＞
［実験例３－２－１］
　常温、２４時間放置する条件に替えて、４℃で１２０時間冷蔵状態に放置した以外は、実験例３－１－１と同様にして実験を行った。結果を表８Ａに示す。表８Ａは、チャイニーズハムスター線維芽細胞を用い、Ｎ＝４の結果である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
　尚、細胞の種類を変えても、同様の結果であった。また、冷凍条件（マイナス３０℃）で、７日間保存後に解凍して用いても、同様の結果であった。
［実験例３－２－２］
　常温、２４時間放置する条件に替えて、４℃で１２０時間冷蔵状態に放置した以外は、実験例３－１－２と同様にして実験を行った。結果を表８Ｂに示す。表８Ｂは、Ｎ＝４の結果である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
　２４時間室温下に放置した時の細胞保護効果と同様に、硫酸化アルギン酸Ａのみならず、それよりＤＳが低い硫酸化アルギン酸Ａ－２や、より低い硫酸化アルギン酸Ａ－３や、さらに低い硫酸化アルギン酸Ａ－４でも、調整液中の硫酸化アルギン酸濃度を高めて十分な硫酸基の濃度が存在すれば、細胞保護効果を示すことが示された。更にその場合に用いられる細胞の種類によってもその効果が異なることが判った。すなわち硫酸化アルギン酸の細胞保護効果の発現濃度は、細胞の種類によっても異なるものの、広範囲な硫酸化置換度の硫酸基アルギン酸が細胞保護効果を示すことが判った。
＜実験例３－３＞
［実験例３－３－１］
　硫酸化アルギン酸として、硫酸化アルギン酸Ａ－５を用い、表９Ａに示す濃度になるように無血清細胞培養液に添加したものを用い、常温（２２℃）の部屋の中に２４時間及び１２０時間放置した以外は、実験例３－１－１と同様にして、細胞の生死を判定し、生細胞の割合を求めて比較検討した。表９Ａに、Ｎ＝３の結果を示す。細胞の種類はラット角膜上皮細胞である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
［実験例３－３－２］
　常温（２２℃）、２４時間放置する条件に替えて、４℃で２４時間及び１２０時間冷蔵状態に放置した以外は、実験例３－３－１と同様にして実験を行った。結果を表９Ｂに示す。表９Ｂは、Ｎ＝３の結果である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
　以上のように、硫酸化アルギン酸は、その粘度型（重合度）によらず、所定条件で細胞を放置した場合でも、ＦＢＳと同等以上に細胞の死滅を抑制可能であり、細胞保護効果があること分かる。つまり、硫酸化アルギン酸は、ＦＢＳや本人の血清に代替し得るものであることが分かった。尚、このようにして保存後の細胞を通常の培養条件で培養すると、実験例２で示したのと同様に、再接着し、増殖する。
＜実験例３－４＞細胞外液補充液中での硫酸化アルギン酸の細胞保護作用
［実験例３－４－１］
　細胞はラット角膜細胞を用いた。細胞外液補充液として最も一般的な乳酸リンゲル液（ラクトリンゲル注射液、扶桑薬品株式会社）を用いて実験を行った。（ａ）ＦＢＳを含まない乳酸リンゲル液単独、（ｂ）硫酸化アルギン酸Ａ又は硫酸化アルギン酸Ｂを０．５、２．５、５ｍｇ／ｍｌの濃度となるように乳酸リンゲル液に添加したもの、（ｃ）１０％ＦＢＳを乳酸リンゲル液中に加えたもの（以下、１０％ＦＢＳ添加乳酸リンゲル液）を準備した。これらの液に、細胞を通常の細胞剥離浮遊化法であるトリプシン法で浮遊化したものを、１０６Ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度で加え、そのまま常温（２２℃）の部屋の中に２４時間放置し、細胞の生死を判定し、生細胞の割合を求めて比較検討した。細胞の生死は、実験例２－１と同様のトリパンブルー排出試験とＣｙｔｏＲｅｄ染色生細胞赤色蛍光観察法で判定した。結果を表１０Ａに示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
［実験例３－４－２］
　細胞はチャイニーズハムスター線維芽細胞を用い、常温、２４時間放置する条件に替えて、４℃で１２０時間、冷蔵状態で放置した以外は、実験例３－４－１と同様にして実験を行った。結果を表１０Ｂに示す。表１０Ｂは、Ｎ＝３の結果である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
　尚、冷凍条件（マイナス３０℃）で、７日間保存後に解凍して用いても、同様の結果であった。
　表１０Ａ、Ｂに示すように、硫酸化アルギン酸を含むことで、細胞外液補充液を用いても、１０％ＦＢＳを添加した場合と同等以上に細胞の死滅を抑制可能であり、細胞保護効果があること分かった。つまり、硫酸化アルギン酸を添加することで、培養液に代替して細胞外液補充液を使用可能であることがわかった。尚、このようにして保存後の細胞を通常の培養条件で培養すると、実験例２で示したのと同様に、再接着し、増殖する。
（実験例４）硫酸化アルギン酸と賦活化剤の組み合わせによる浮遊化細胞活性化作用
＜実験例４－１＞
　実験例１と同じ２種の細胞、及び、製造例で得られた硫酸化アルギン酸Ａ～Ｃを用いて実験を行った。また、硫酸化アルギン酸の賦活化剤として、カルシウムイオン溶液として塩化カルシウム水溶液、カルシウムイオン供給体を含侵あるいは表面に担持させた布片、リン酸カルシウム粉末を用いた。ここではカルシウム供給体としてはキレート化されたカルシウム製剤を用いた。
　１ｍｇ／ｍｌの硫酸化アルギン酸水溶液により浮遊化した１０６Ｃｅｌｌｓ／ｍｌの細胞を容れた１ｍｇ／ｍｌの硫酸化アルギン酸を含むＦＢＳ添加細胞培養液を緩徐に撹拌しつつ、この中にカルシウムイオン溶液として５％塩化カルシウム液を少量ずつ滴下する方法、若しくは、（ａ）リン酸カルシウム粉末又は（ｂ）カルシウムイオン供給体を含侵若しくは表面に担持させた布片（３ｍｍ×３ｍｍ）を、培養シャーレ内に静置し、硫酸化アルギン酸により浮遊化した細胞を容れた硫酸化アルギン酸を含む細胞培養液を緩徐に注ぐ方法で、培養液中の硫酸化アルギン酸と賦活化剤を反応させた。
　比較対照としてカルシウムイオン源を用いない以外は前述と同様に処理した。即ち、５％塩化カルシウムに替えて蒸留水を用いる、リン酸カルシウム粉末を使用しない、カルシウムイオン供給体を含侵及び表面に担持させていない布片を用いて、同様に処理した。
　前述の操作を行った後に、１分以内に浮遊化されている細胞が足場に接着するか否かを検討した。細胞の接着の判定は、培養液を新しい同じ培養液に入れ替えることにより細胞を緩徐に洗浄して細胞が洗い流されるかを顕微鏡下に観察し、更に、蛍光顕微鏡下で生細胞を立体視野でも観察できるCytoRed染色生細胞赤色蛍光観察法を使った生細胞赤色蛍光観察により接着細胞の観察を行った。
　結果を図４（ａ）、（ｂ）に示す。図４（ａ）は、チャイニーズハムスター線維芽細胞を用い、硫酸化アルギン酸Ｂを用いて得られた浮遊化細胞を用い、リン酸カルシウム粉末を賦活化剤として用いた実験例の、蛍光顕微鏡の撮像を示した図である。図４（ａ）は、撮像全体が赤色を呈しており、図面上では赤色が強いほど白色を呈する。図４（ｂ）は、リン酸カルシウム粉末を用いない以外は、図４（ａ）の撮像を示す実験例と同じ条件で実験を行った比較対照の蛍光顕微鏡の撮像を示した図である。図４（ｂ）は、撮像全体が真黒を呈している。
　実験の結果、カルシウムイオン溶液として５％塩化カルシウム液を滴下した場合も、リン酸カルシウム粉末、若しくは、カルシウムイオン供給体を含侵又は表面に担持させた布片をシャーレ内に入れた場合も、１分以内に硫酸化アルギン酸がゲル化した。ゲル化したアルギン酸には細胞が接着しているのが認められた。またリン酸カルシウム粉末を置いたシャーレ底の表面（図４（ａ））やカルシウムイオン供給体を含侵あるいは表面に担持させた布片の表面は、ゲル化した硫酸化アルギン酸を介して無数の生細胞が付着しているのが、生細胞赤色蛍光観察により赤く染まって観察された。これらの細胞は、穏やかに洗浄しても洗い流されることはなかった。一方、比較対照のリン酸カルシウム粉末を置いていないシャーレ（図４（ｂ））やカルシウムイオン供給体を担持させていない布片では、繊維が赤く染まって観察されることは無く、生細胞の接着が無いことが分かった。
　尚、硫酸化アルギン酸、細胞、賦活化剤の種類によらず、図４（ａ）に示す結果と同様に、蛍光顕微鏡の撮像は、撮像全体が赤色を呈した。
＜実験例４－２＞
　実験例４－１で得られた再接着している細胞が増殖するか否かを検討した。即ち、細胞が接着している硫酸化アルギン酸ゲル自体や、ゲル化した硫酸化アルギン酸を介して無数の生細胞が接着しているリン酸カルシウム粉末や布片を、通常の（すなわち硫酸化アルギン酸を含まない）ＦＢＳ添加細胞培養液中に移して、通常の培養条件で４日間培養した。これをCytoRed染色生細胞赤色蛍光観察法により観察し、培養開始時の状態と比較した。
　結果を図５（ａ）、（ｂ）に示す。図５（ａ）は、実験例４－１と同じで、硫酸化アルギン酸Ｂを用いて得られたチャイニーズハムスター線維芽細胞の浮遊化細胞を用い、カルシウム供給体を担持した布片を賦活化剤として用いた実験例の４日間培養後の蛍光顕微鏡の撮像を示した図であり、図５（ｂ）は、培養開始直前の蛍光顕微鏡の撮像を示した図である。図５（ａ）、（ｂ）は、布片を構成する繊維に対応する部分が赤色を呈しており、図面上では赤色が強いほど白色を呈する。
　実験の結果、カルシウムイオン溶液として５％塩化カルシウム液を滴下した場合も、リン酸カルシウム粉末、若しくは、カルシウムイオン供給体を含侵又は表面に担持させた布片をシャーレ内に入れた場合も、培養前に比較して、培養後はその表面が赤色に強く発光する蛍光が認められ、硫酸化アルギン酸を介して接着している細胞が増殖しているのが確認された。図５（ａ）に示すように、４日間の培養期間に細胞が増殖して生細胞数が多いので赤色蛍光が強いのに対して、図５（ｂ）に示すように、培養直前で生細胞数がまだ十分には多くないので赤色蛍光は弱いことが分かる。
　尚、硫酸化アルギン酸、細胞、賦活化剤の種類によらず、図５（ａ）、（ｂ）に示す結果と同様に、蛍光顕微鏡の撮像は、培養開始前に比べて４日間培養後は、布片を構成する繊維部分が強い赤色を呈した。
　このように、硫酸化アルギン酸を、カルシウムイオンを含む賦活化剤でゲル化することにより、浮遊化細胞を即座に足場に接着させ得ること、接着させて容易に回収出来ること、また、その後は、通常の培養条件で培養することで、増殖することが分かった。即ち、剥離浮遊化させた細胞を、硫酸化アルギン酸を添加した細胞培養液に添加して、硫酸化アルギン酸と浮遊化細胞とを共存させ、さらに、賦活化剤を硫酸化アルギン酸と共存させ、硫酸化アルギン酸が賦活化剤によりゲル化することで、ゲル化した硫酸化アルギン酸により浮遊化細胞が捕捉される。そして、前述のように硫酸化アルギン酸により休眠状態の浮遊化細胞が覚醒し、硫酸化アルギン酸のゲル状の担体に浮遊化細胞の接着が促進され、増殖を開始することになる。このように、硫酸化アルギン酸と賦活化剤とを組み合わせて用いることで、浮遊化細胞を良好に活性化させることが可能なセット試薬とすることができる。
（実験例５）硫酸化アルギン酸による細胞休眠効果（未分化状態維持）
　硫酸化アルギン酸による細胞休眠効果を、細胞の未分化状態のままで維持して分化を抑制する効果を指標にして検討した。細胞としては未分化状態のラット皮下脂肪由来間葉系幹細胞（以下、「ＡＤＳＣｓ」と称する）（コスモバイオ株式会社製、ＭＳＡ０１Ｃ）を用いた。
　無添加対照群では細胞培養液としてＡｄｉｐｏｓｅ　Ｔｉｓｓｕｅ－ｄｅｒｉｖｅｄ　Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ　（以下、「ＡＭＳＣ」と称する。）　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｍｅｄｉｕｍ，　Ｒａｔ（コスモバイオ株式会社製、ＭＳＡ－ＧＭ）を用い、１０％ＦＢＳ添加群ではＡＭＳＣ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｍｅｄｉｕｍ，　ＲａｔにＦＢＳを１０％となるように添加したものを用い、硫酸化アルギン酸添加群ではＡＭＳＣ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｍｅｄｉｕｍ，　Ｒａｔに硫酸化アルギン酸を２．５ｍｇ／ｍｌとなるように添加したものを細胞保存用液として用いた。これらにＡＤＳＣｓをそれぞれ１０５個／ｍｌとなるように添加した後、４℃の冷蔵条件下で４８時間静置した。これらの細胞を通常のトリプシン法を用いて剥離浮遊化し、これらの細胞の分化の程度をフローサイトメトリーにより評価・比較した。方法は、Masoumeh Fakhr Taha, Vahideh HedayatiIsolation, “identification and multipotential differentiation of mouse adipose tissue-derived stem cells” Tissue and Cell 42 (2010) 211-216に記載の方法に準じた。評価は、未分化マーカーとしてＣＤ２９及びＣＤ４４を、また間葉系細胞への分化マーカーとしてＣＤ１１ｂ、ＣＤ３１及びＣＤ４５を指標とした。結果を表１１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
　表１１に示すように、２種類の未分化マーカー（ＣＤ２９及びＣＤ４４）の陽性率は、硫酸化アルギン酸添加群は、１０％ＦＢＳ添加群や無添加対照群に比較して、顕著に高かった。他方３種類の分化マーカー（ＣＤ１１ｂ、ＣＤ３１及びＣＤ４５）の陽性率は、硫酸化アルギン酸添加群は、１０％ＦＢＳ添加群や無添加対照群に比較して、全て明らかに低かった。このように硫酸化アルギン酸は、同じように細胞保護効果があるＦＢＳ、通常の無添加の細胞培養液が細胞を分化させて抑制しないのに対して、細胞を未分化の状態のまま休眠させて分化を抑制することが明らかとなった。
　以上、実験例１～５で示されるように、硫酸化アルギン酸は、細胞の剥離浮遊化、休眠化、細胞保護、が簡単に実現可能であり、しかも、細胞毒性がないため、休眠状態から覚醒して再接着、再増殖も簡単に実現可能である。さらに、硫酸化アルギン酸と、賦活化剤と組み合わせることで、浮遊化細胞の回収、細胞の接着と増殖の再開（植え付け）とを自由に制御することが可能になる。そのため、非常に簡便かつ安全な細胞剥離浮遊化、保管輸送（特に、ＦＢＳ、人の血清等に替わる細胞保護剤として）、植え付けに用いる細胞処理剤及び賦活化剤とのセット試薬として極めて有効である。
 
 

Claims (9)

  1. 　硫酸化アルギン酸を有効成分として含む細胞処理剤。
  2. 　前記硫酸化アルギン酸が、６位の炭素原子に硫酸基が導入されている硫酸化アルギン酸を硫酸化アルギン酸全体中１０％より多く含む請求項１記載の細胞処理剤。
  3. 　細胞培養液、細胞外液補充液及び維持輸液から選択される少なくとも一種を含む１又は２に記載の細胞処理剤。
  4. 　培養細胞を生体組織の足場若しくは培養基材の足場から、又は、生体組織の組織内細胞を生体組織の足場から、剥離し、浮遊させる細胞剥離・浮遊化用である請求項１～３の何れか一項に記載の細胞処理剤。
  5. 　組織内細胞又は培養細胞を休眠させるための請求項１～３の何れか一項に記載の細胞処理剤。
  6. 　組織内細胞又は培養細胞のバイアビリティ（Viability）を保持し死滅を抑制する細胞保護用である請求項１～３の何れか一項に記載の細胞処理剤。
  7. 　細胞を未分化又は低分化の状態に保持するための細胞保存用である請求項１～３の何れか一項に記載の細胞処理剤。
  8. 　細胞保存用、組織保存用又は臓器保存用の液体である請求項１～３、５～７の何れか一項に記載の細胞処理剤。
  9. 　請求項１～８の何れか一項に記載の細胞処理剤と、多価の陽イオンを含む賦活化剤との組み合わせ試薬である、浮遊化又は休眠化細胞活性化用セット試薬。
     
     
     
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