WO2021162243A1 - T 세포 내 표적 위치로의 t 세포 수용체 삽입을 위한 재조합벡터 및 이를 이용한 t 세포 내 표적 위치로의 t 세포 수용체 삽입용 조성물 - Google Patents

T 세포 내 표적 위치로의 t 세포 수용체 삽입을 위한 재조합벡터 및 이를 이용한 t 세포 내 표적 위치로의 t 세포 수용체 삽입용 조성물 Download PDF

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tcr
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aavs1
cell
gene
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PCT/KR2021/000076
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김용섭
이희진
신하림
허선희
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재단법인 아산사회복지재단
울산대학교 산학협력단
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    • C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses

Definitions

  • the present invention relates to a recombinant vector for insertion of a T cell receptor (TCR) into a target location in a T cell, and a composition for inserting the T cell receptor into a target location in a T cell using the same.
  • TCR T cell receptor
  • TCR T cell receptor
  • T cells have a unique combination of TCR alpha and beta, and when cells are lysed for sequencing, the unique combination of alpha and beta is broken. Therefore, it is a very complicated and difficult process to find alpha and beta pairing, and after finding it, the process of manufacturing a structure of the alpha and beta combination and delivering it into the cell to confirm the efficacy It is also very complicated.
  • a method for producing a current TCR pair is as follows. 1) A method of independently manufacturing alpha TCR and beta TCR and inserting the two structures into a cell, and 2) a method of linking alpha TCR and beta TCR to one structure and inserting it into a cell. Although the method of 2) is efficient in terms of intracellular delivery, the process of manufacturing the construct is complicated.
  • the method of delivering a TCR pair into a cell is as follows. 1) A method of producing a plasmid and delivering it in the form of a plasmid into a cell, 2) a method of inserting it into the genome of a cell using a lentivirus/retrovirus, 3) a method of inserting it into the genome of a cell using a transposon, 4) This is a method of inserting into a target position of the genome in a cell using gene scissors (CRISPR-Cas9).
  • CRISPR-Cas9 gene scissors
  • Another object of the present invention is to provide a composition for TCR insertion into an AAVS1 target site in T cells using the CRISPR-Cas9 system.
  • Another object of the present invention is to provide a method of inserting a TCR into an AAVS1 target site in a T cell in vitro using the CRISPR-Cas9 system.
  • the present invention provides a Left Homology Arm (LHA) fragment gene, a T cell receptor ⁇ (TCR ⁇ ) variable region fragment gene, and a TCR ⁇ constant region fragment gene of the AAVS1 target site.
  • LHA Left Homology Arm
  • TCR ⁇ T cell receptor ⁇
  • TCR ⁇ constant region fragment gene of the AAVS1 target site.
  • 2A self-cleaving peptide (self-cleaving peptide) gene, TCR ⁇ variable region fragment gene, TCR ⁇ constant region fragment gene and AAVS1 T cell comprising a Right Homology Arm (RHA) fragment gene in order Provided are a recombinant vector for TCR insertion into an AAVS1 target site and a recombinant strain transformed with the recombinant vector.
  • the present invention provides a composition for TCR insertion into an AAVS1 target site in T cells, comprising the recombinant vector, Cas9 protein, and a guide RNA (gRNA) targeting AAVS1.
  • a composition for TCR insertion into an AAVS1 target site in T cells comprising the recombinant vector, Cas9 protein, and a guide RNA (gRNA) targeting AAVS1.
  • gRNA guide RNA
  • the present invention comprises the steps of transducing the recombinant vector, the Cas9 protein, and a guide RNA (gRNA) targeting AAVS1 into T cells; And it provides a method of inserting a TCR into an AAVS1 target site in a T cell in vitro, comprising the step of selecting a transfectant in which the TCR is inserted at the AAVS1 target position from among the transfected T cells.
  • gRNA guide RNA
  • the present invention relates to a recombinant vector for insertion of a T cell receptor (TCR) into a target location in T cells and a composition for T cell receptor insertion into a target location in T cells using the same, in particular, four A gene scissors (CRISPR-Cas9) system for constructing a recombinant vector containing a homologous recombination template combining constructs, and using this to efficiently insert a TCR pair into a target position in a cell is about
  • CRISPR-Cas9 A gene scissors
  • FIG. 1 shows a schematic diagram of a common construct 1 and a common construct 1 for constructing a homologous recombination template including a TCR pair for TCR pair insertion into a target position in T cells.
  • Figure 2 shows the overall schematic diagram of the homologous recombination template (homologous recombination template) including the TCR pair for insertion of the TCR pair into the target position in the T cell.
  • V ⁇ TCR ⁇ variable region
  • V ⁇ TCR ⁇ variable region
  • C ⁇ TCR ⁇ constant region
  • C ⁇ TCR ⁇ constant region.
  • Figure 3 shows a schematic diagram of the Gibson assembly gene recombination method.
  • the present invention relates to a left homology arm (LHA) fragment gene of the AAVS1 target site, a T cell receptor ⁇ (TCR ⁇ ) variable region fragment gene, a TCR ⁇ constant region fragment gene, a 2A self-cleaving peptide ( Self-cleaving peptide) gene, TCR ⁇ variable region fragment gene, TCR ⁇ constant region fragment gene, and a Right Homology Arm (RHA) fragment gene of the AAVS1 target site.
  • LHA left homology arm
  • TCR ⁇ T cell receptor ⁇
  • TCR ⁇ constant region fragment gene a 2A self-cleaving peptide ( Self-cleaving peptide) gene
  • TCR ⁇ variable region fragment gene TCR ⁇ constant region fragment gene
  • RHA Right Homology Arm
  • the recombinant vector for TCR insertion into the AAVS1 target site in the T cell may additionally include a marker gene for selection of TCR-inserted cells, more preferably, the marker gene for selection of TCR-inserted cells It may be a puromycin resistance gene (PuroR) or a dihydrofolate reductase double mutant (DHFRdm) gene, but is not limited thereto.
  • a marker gene for selection of TCR-inserted cells may be a puromycin resistance gene (PuroR) or a dihydrofolate reductase double mutant (DHFRdm) gene, but is not limited thereto.
  • the LHA fragment gene at the AAVS1 target site may be represented by SEQ ID NO: 1
  • the RHA fragment gene at the AAVS1 target site may be represented by SEQ ID NO: 2, but is not limited thereto.
  • the TCR ⁇ variable region fragment gene may be represented by SEQ ID NO: 3, and the TCR ⁇ variable region fragment gene may be represented by SEQ ID NO: 4, but is not limited thereto.
  • the TCR ⁇ constant region fragment gene may be represented by SEQ ID NO: 5
  • the TCR ⁇ constant region fragment gene may be represented by SEQ ID NO: 6, but is not limited thereto.
  • the 2A self-cleaving peptide gene may be one represented by SEQ ID NO: 7, but is not limited thereto.
  • AAVS1 is an adeno-associated virus integration site 1 (Adeno-Associated Virus Integration Site 1), located on human chromosome 19.
  • vector refers to a self-replicating DNA molecule used to carry a clonal gene (or another piece of clonal DNA).
  • recombinant vector refers to a recombinant DNA molecule comprising a desired coding sequence and an appropriate nucleic acid sequence essential for expressing a coding sequence operably linked to a specific host organism.
  • the recombinant vector may preferably comprise one or more selectable markers.
  • the marker is a nucleic acid sequence having a characteristic that can be selected by a conventional chemical method, and includes all genes that can distinguish transformed cells from non-transformed cells. Examples include puromycin, methotrexate (MTX), ampicillin, kanamycin, geneticin (G418), bleomycin, hygromycin, chloramphenic. (Chloramphenicol), but there is an antibiotic resistance gene, but is not limited thereto, and can be appropriately selected by those skilled in the art.
  • the present invention provides a recombinant strain transformed with the recombinant vector.
  • the present invention provides a composition for TCR insertion into an AAVS1 target site in T cells, comprising the recombinant vector, Cas9 protein, and a guide RNA (gRNA) targeting AAVS1.
  • a composition for TCR insertion into an AAVS1 target site in T cells comprising the recombinant vector, Cas9 protein, and a guide RNA (gRNA) targeting AAVS1.
  • gRNA guide RNA
  • the gRNA targeting AAVS1 may be one represented by SEQ ID NO: 8, but is not limited thereto.
  • the present invention comprises the steps of transducing the recombinant vector, the Cas9 protein, and a guide RNA (gRNA) targeting AAVS1 into T cells; And it provides a method of inserting a TCR into an AAVS1 target site in a T cell in vitro, comprising the step of selecting a transfectant in which the TCR is inserted at the AAVS1 target position from among the transfected T cells.
  • gRNA guide RNA
  • the step of selecting the transfectant having the TCR inserted at the AAVS1 target position among the transfected T cells may be selected by treatment with puromycin or methotrexate (MTX), but is not limited thereto. it is not
  • the gRNA targeting AAVS1 may be one represented by SEQ ID NO: 8, but is not limited thereto.
  • the gene scissors (CRISPR/Cas9) system used in the present invention is emerging as a genome engineering tool that can be applied to bacteria and eukaryotes.
  • Cas9 has an endonuclease function that cuts target DNA determined by gRNA.
  • Cas9-induced double-strand break (DSB) occurs at a specific sequence that is anterior to the protospacer adjacent motif (PAM) designated by gRNA. Transformation with a guide RNA and a Cas9 expression vector along with a donor DNA having a homologous sequence enables high-efficiency gene editing by a homologous repair (HR) mechanism.
  • HR homologous repair
  • Transfection of the recombinant vector, Cas9 protein, and gRNA targeting AAVS1 used in the present invention into T cells may be carried out by a commonly used transformation method. Typically, it is carried out using an electroporation method or the like.
  • PuroR can be selected using puromycin, and DHFRdm can be selected using methotrexate (MTX) drugs.
  • MTX methotrexate
  • each TCR type has a different nucleotide sequence, and has a size of about 300 to 500 bp.
  • a proof experiment for the present invention was performed for a TCR pair called MART-1, and for this, gene synthesis was performed for the MART-1 TCR alpha variable region (399bp) and the MART-1 TCR beta variable region (393bp). .
  • each of TCR alpha and beta is a long nucleotide sequence of about 700bp to 1kb, so there are difficulties in acquisition and gene synthesis (high cost, low efficiency), and after TCR pair structure production
  • the verification stage also costs a lot of money and effort.
  • a common structure 1/2 was prepared in advance to enable synthesis or acquisition of the minimum nucleotide sequence that needs to be changed for TCR pair production.
  • the gene recombination method called Gibson assembly used in the present invention is a technology that can be easily cloned without a common restriction enzyme cleavage region as an already commercialized gene recombination method. Instead of overhangs generated by restriction enzymes, a homology sequence of about 15 bp is required.
  • overlapping nucleotide sequences are required between structures to be connected to each other (orange, red, and sky blue), and this overlapping nucleotide sequence can be additionally added when preparing a DNS insert.
  • the four purified constructs were mixed with Gibson assembly reagent, and after reaction at 50°C for 15 minutes, E. coli transformation was performed. As a result of the actual transformation, it was possible to form E. coli colonies with very high efficiency and secure the completed construct (FIG. 4).
  • PCR primers used for the construction of the construct of the present invention are shown in Table 1.
  • TCR ⁇ _V_F TAGAGCGCTGCCACC (sequence added to a specific variable region sequence) TCR ⁇ _V_R GGTTCTGGGTTCTGGAT (sequence added to a specific variable region sequence) TCR ⁇ _V_F GGAGAATCCTGGCCCA (sequence added to a specific variable region sequence) TCR ⁇ _V_R CATTTCTCAGATCCTC (sequence added to a specific variable region sequence) mC1-T2A-F GAGCTCGGTACCCGGATCCAGAACCCAGAACCT mC1-T2A-R CTTGCATGCCTGCAGTGGGCCAGGATTCTCC
  • a guide RNA (gRNA) targeting AAVS1 and a plasmid expressing Cas9 were transferred to Jurkat cells together with the MART-1 TCR construct by electroporation.
  • the delivered AAVS1 target gRNA and Cas9 cause a DNA double-strand break of the AAVS1 locus, which is the target site, and MART-1 TCR gene insertion occurs at this site using a MART-1 TCR homologous recombination template.
  • puromycin or MTX was treated for about 1 week to select only the cells into which the MART-1 TCR pair was inserted. It was confirmed and the functionality of the actual MART-1 TCR was confirmed.
  • T2 cells having a peptide reactive to MART-1 TCR were prepared (T2 cells presenting MART-1 peptide), and inoculated in a 96-well plate (1 ⁇ 10 5 cells/wells/200ul). After 24 hours, MART-1 TCR-inserted Jurkat cells were mixed together and cultured. After 24 hours, the supernatant was spin-down in each well, and then the supernatant was collected and an ELISA experiment for IFN-gamma was performed.

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Abstract

본 발명은 T 세포 내 표적 위치로의 T 세포 수용체(T cell receptor; TCR) 삽입을 위한 재조합벡터 및 이를 이용한 T 세포 내 표적 위치로의 T 세포 수용체 삽입용 조성물에 관한 것으로서, 상세하게는 4개의 컨스트럭트(construct)를 조합한 상동 재조합 주형(homologous recombination template)을 포함하는 재조합벡터를 제작하고, 이를 이용하여 효율적으로 세포 내 표적 위치에 TCR pair를 삽입하기 위한 유전자 가위(CRISPR-Cas9) 시스템에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 가변 영역(Variable region)을 최소화한 컨스트럭트를 제작하여, 가변 영역 제작 및 획득 단계에서 비용을 절감하고, 높은 효율로 제작할 수 있으며, Gibson assembly 라는 기존의 방법을 적용함으로써 기존 대비 매우 빠른 속도로(single-reaction) 표적 위치에 TCR pair를 삽입할 수 있는 컨스트럭트를 제작할 수 있다.

Description

T 세포 내 표적 위치로의 T 세포 수용체 삽입을 위한 재조합벡터 및 이를 이용한 T 세포 내 표적 위치로의 T 세포 수용체 삽입용 조성물
본 발명은 T 세포 내 표적 위치로의 T 세포 수용체(T cell receptor; TCR) 삽입을 위한 재조합벡터 및 이를 이용한 T 세포 내 표적 위치로의 T 세포 수용체 삽입용 조성물에 관한 것이다.
T 세포 수용체(T cell receptor; TCR) 레퍼토리(repertoire)는 종양, 자가면역질환, 감염질환을 포함하는 많은 질병에 영향을 주는 것을 알려져 있다. 이에, TCR 레퍼토리를 규명하는 것은 과학적으로 매우 흥미로운 과제일 뿐 아니라 임상적 유용성에 있어서도 우선시 되어야 할 일이나, TCR 조합의 다양성 때문에 이에 대한 연구는 쉽지 않다.
T 세포는 고유의 TCR 알파(alpha), 베타(beta)의 조합을 가지고 있으며, 서열분석을 위해 세포를 용해시키면 고유의 알파(alpha), 베타(beta) 조합이 깨지게 된다. 따라서 알파(alpha), 베타(beta) 페어링(paring)을 찾는 것은 매우 복잡하고 어려운 과정이며, 찾은 후에 알파(alpha), 베타(beta) 조합의 구조물을 제작하여 세포 내에 전달하여 효능을 확인하는 과정도 매우 복잡하다.
현재 TCR pair를 제작하는 방법은 다음과 같다. 1) 알파 TCR과 베타 TCR을 독립적으로 제작하여 두 구조물을 각각 세포에 넣는 방법과, 2) 알파 TCR과 베타 TCR을 한 구조물에 연결하여 제작하여 세포에 넣는 방법이다. 2)의 방법이 세포 내 전달 측면에서 효율적이나, 컨스트럭트(Construct)를 제작하는 과정이 복잡하다.
현재 TCR pair를 세포 내에 전달하는 방법은 다음과 같다. 1) 플라스미드로 제작하여 세포 내에 플라스미드 형태로 전달하는 방법, 2) 렌티바이러스/레트로바이러스를 이용하여 세포 내 유전체에 삽입하는 방법, 3) 트랜스포존(Transposon)을 이용하여 세포 내 유전체에 삽입하는 방법, 4) 유전자가위(CRISPR-Cas9)를 이용하여 세포 내 유전체의 표적 위치에 삽입하는 방법이다. 1)의 경우에는 세포 내에서 일시적으로 발현되는 한계가 있고, 2) 및 3)의 경우에는 세포 내에서 지속적으로 발현되나, 유전체 내에 무작위로 삽입되기 때문에 다른 유전자의 발현을 방해해 부작용이 발생할 우려가 있다. 4)의 경우에는 전달 효율이 낮다는 단점이 있다.
이에, TCR pair 삽입을 위한 컨스트럭트를 효과적으로 제작하면서도, TCR pair를 세포 내로 전달시 다른 유전자에 대한 방해 없이, 전달 효율을 높힐 수 있는 방법의 개발이 요구되고 있다.
본 발명의 목적은 T 세포 내 AAVS1 표적 위치로의 TCR 삽입을 위한 재조합벡터를 제공하는 데에 있다.
본 발명의 다른 목적은 CRISPR-Cas9 시스템을 이용한 T 세포 내 AAVS1 표적 위치로의 TCR 삽입용 조성물을 제공하는 데에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 CRISPR-Cas9 시스템을 이용하여 시험관 내에서(in vitro) T 세포 내 AAVS1 표적 위치로 TCR을 삽입하는 방법을 제공하는 데에 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 AAVS1 표적 위치의 왼쪽 상동성 암(Left Homology Arm; LHA) 단편 유전자, T 세포 수용체 α(T cell receptor α; TCRα) 가변 영역 단편 유전자, TCRα 불변 영역 단편 유전자, 2A 자가-절단 펩타이드(self-cleaving peptide) 유전자, TCRβ 가변 영역 단편 유전자, TCRβ 불변 영역 단편 유전자 및 AAVS1 표적 위치의 오른쪽 상동성 암(Right Homology Arm; RHA) 단편 유전자를 순서대로 포함하는 T 세포 내 AAVS1 표적 위치로의 TCR 삽입을 위한 재조합벡터 및 상기 재조합벡터로 형질전환된 재조합 균주를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합벡터, Cas9 단백질 및 AAVS1을 표적으로 하는 가이드 RNA(guide RNA; gRNA)를 포함하는 T 세포 내 AAVS1 표적 위치로의 TCR 삽입용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합벡터, Cas9 단백질 및 AAVS1을 표적으로 하는 가이드 RNA(guide RNA; gRNA)를 T 세포 내로 형질전달시키는 단계; 및 상기 형질전달된 T 세포들 중에서 AAVS1 표적 위치에 TCR이 삽입된 형질전달체를 선별하는 단계를 포함하는, 시험관 내에서(in vitro) T 세포 내 AAVS1 표적 위치로 TCR을 삽입하는 방법을 제공한다.
본 발명은 T 세포 내 표적 위치로의 T 세포 수용체(T cell receptor; TCR) 삽입을 위한 재조합벡터 및 이를 이용한 T 세포 내 표적 위치로의 T 세포 수용체 삽입용 조성물에 관한 것으로서, 상세하게는 4개의 컨스트럭트(construct)를 조합한 상동 재조합 주형(homologous recombination template)을 포함하는 재조합벡터를 제작하고, 이를 이용하여 효율적으로 세포 내 표적 위치에 TCR pair를 삽입하기 위한 유전자 가위(CRISPR-Cas9) 시스템에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 가변 영역(Variable region)을 최소화한 컨스트럭트를 제작하여, 가변 영역 제작 및 획득 단계에서 비용을 절감하고, 높은 효율로 제작할 수 있으며, Gibson assembly 라는 기존의 방법을 적용함으로써 기존 대비 매우 빠른 속도로(single-reaction) 표적 위치에 TCR pair를 삽입할 수 있는 컨스트럭트를 제작할 수 있다.
도 1은 T 세포 내 표적 위치에의 TCR pair 삽입을 위해 TCR pair를 포함하는 상동 재조합 주형(homologous recombination template) 제작을 위한 공통 컨스트럭트 1 및 공통 컨스트럭트 1의 모식도를 나타낸다.
도 2는 T 세포 내 표적 위치에의 TCR pair 삽입을 위해 TCR pair를 포함하는 상동 재조합 주형(homologous recombination template) 제작 전체 모식도를 나타낸다. Vα: TCRα 가변 영역(variable region), Vβ: TCRβ 가변 영역(variable region), Cα: TCRα 불변 영역(constant region), Cβ: TCRβ 불변 영역(constant region).
도 3은 Gibson assembly 유전자 재조합 방법의 모식도를 나타낸다.
도 4는 MART-1 TCR pair 상동 재조합 주형(homologous recombination template) 제작 과정 중, MART-1 TCR 컨스트럭트의 E.coli 형질전환 후 확보한 사진이다.
도 5는 본 발명에 따라 표적위치로 삽입된 MART-1 TCR의 기능성을 확인한 결과를 나타낸다.
본 발명은 AAVS1 표적 위치의 왼쪽 상동성 암(Left Homology Arm; LHA) 단편 유전자, T 세포 수용체 α(T cell receptor α; TCRα) 가변 영역 단편 유전자, TCRα 불변 영역 단편 유전자, 2A 자가-절단 펩타이드(self-cleaving peptide) 유전자, TCRβ 가변 영역 단편 유전자, TCRβ 불변 영역 단편 유전자 및 AAVS1 표적 위치의 오른쪽 상동성 암(Right Homology Arm; RHA) 단편 유전자를 순서대로 포함하는 T 세포 내 AAVS1 표적 위치로의 TCR 삽입을 위한 재조합벡터를 제공한다.
바람직하게는, 상기 T 세포 내 AAVS1 표적 위치로의 TCR 삽입을 위한 재조합벡터는 TCR 삽입 세포 선별을 위한 마커 유전자를 추가적으로 포함할 수 있으며, 보다 바람직하게는, 상기 TCR 삽입 세포 선별을 위한 마커 유전자는 퓨로마이신 저항성 유전자(puromycin resistance gene; PuroR) 또는 디하이드로폴레이트 환원효소 이중 돌연변이(dihydrofolate reductase double mutant; DHFRdm) 유전자일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
바람직하게는, 상기 AAVS1 표적 위치의 LHA 단편 유전자는 서열번호 1로 표시되고, 상기 AAVS1 표적 위치의 RHA 단편 유전자는 서열번호 2로 표시되는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
바람직하게는, 상기 TCRα 가변 영역 단편 유전자는 서열번호 3으로 표시되고, 상기 TCRβ 가변 영역 단편 유전자는 서열번호 4로 표시되는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
바람직하게는, 상기 TCRα 불변 영역 단편 유전자는 서열번호 5로 표시되고, 상기 TCRβ 불변 영역 단편 유전자는 서열번호 6으로 표시되는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
바람직하게는, 상기 2A 자가-절단 펩타이드(self-cleaving peptide) 유전자는 서열번호 7로 표시되는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, "AAVS1"은 아데노-관련 바이러스 삽입 사이트 1(Adeno-Associated Virus Integration Site 1)로서, human chromosome 19 상에 위치한다.
본 발명에 있어서, "벡터"는 클론유전자(또는 클론 DNA의 다른 조각)를 운반하는데 사용되는 스스로 복제되는 DNA분자를 의미한다.
본 발명에서 있어서, “재조합 벡터”는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동 가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 재조합 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 수 있다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질 전환된 세포를 비 형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 퓨로마이신(puromycin), 메토트렉세이트(methotrexate; MTX), 앰피실린(Ampicillin), 카나마이신(Kanamycin), 제네티신(Geneticin; G418), 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(Hygromycin), 클로람페니콜(Chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 당업자에 의해 적절히 선택 가능하다.
또한, 본 발명은 상기 재조합벡터로 형질전환된 재조합 균주를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합벡터, Cas9 단백질 및 AAVS1을 표적으로 하는 가이드 RNA(guide RNA; gRNA)를 포함하는 T 세포 내 AAVS1 표적 위치로의 TCR 삽입용 조성물을 제공한다.
바람직하게는, 상기 AAVS1을 표적으로 하는 gRNA는 서열번호 8로 표시되는 것을 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 상기 재조합벡터, Cas9 단백질 및 AAVS1을 표적으로 하는 가이드 RNA(guide RNA; gRNA)를 T 세포 내로 형질전달시키는 단계; 및 상기 형질전달된 T 세포들 중에서 AAVS1 표적 위치에 TCR이 삽입된 형질전달체를 선별하는 단계를 포함하는, 시험관 내에서(in vitro) T 세포 내 AAVS1 표적 위치로 TCR을 삽입하는 방법을 제공한다.
바람직하게는, 상기 형질전달된 T 세포들 중에서 AAVS1 표적 위치에 TCR이 삽입된 형질전달체를 선별하는 단계는 퓨로마이신(puromycin) 또는 메토트렉세이트(methotrexate; MTX)로 처리하여 선별할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
바람직하게는, 상기 AAVS1을 표적으로 하는 gRNA는 서열번호 8로 표시되는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용된 유전자 가위(CRISPR/Cas9) 시스템은 박테리아와 진핵생물에 적용시킬 수 있는 유전체 엔지니어링 도구로써 떠오르고 있다. Cas9은 gRNA에 의해 결정된 타겟 DNA를 절단하는 엔도뉴클라아제(endonuclease) 기능을 가지고 있다. Cas9에 의한 이중나선 절단(double-strand break; DSB)은 gRNA가 지정하는 protospacer adjacent motif (PAM)의 앞쪽 서열인 특정 서열에 일어난다. 상동성 서열을 지닌 공여 DNA와 함께 가이드 RNA와 Cas9 발현 벡터로 형질전환시키면, 상동성 수리(HR; homologous repair) 기작에 의해 높은 효율로 유전자 교정이 가능하다.
본 발명에서 사용된 상기 재조합벡터, Cas9 단백질 및 AAVS1을 표적으로 하는 gRNA를 T 세포 내로 형질전달하는 방식은 통상적으로 이용되는 형질 전환 방법에 의해 실시될 수 있다. 대표적으로 전기천공법(electroporation) 등을 이용하여 실시한다.
이하에서는 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
< 실시예 1> TCR pair를 포함하는 재조합 벡터 제작
유전자가위를 기반으로 한 상동 재조합(Homologous Recombination) 또는 상동성 지정 복구(Homology directed repair)를 통한 T 세포 내 표적 위치에의 TCR pair 삽입을 위해 TCR pair를 포함하는 상동 재조합 주형(homologous recombination template) 제작이 필요하고 이를 효율적으로 제작하는 것이 핵심이다. TCR pair 삽입을 위한 상동 재조합 주형(homologous recombination template)을 효율적으로 제작하기 위해서는 아래와 같이 4 가지의 컨스트럭트가 필요하다(도 1 및 도 2)
1) 공통 컨스트럭트 1
pUC19 플라스미드 기반으로 아래의 구성물을 포함하고 있다.
a. 표적위치 삽입을 위한 상동성 암(Homology arm) (AAVS1 locus, 왼쪽 800bp, 오른쪽 820bp 총 1.62kb)
b. 유전자 발현을 위한 프로모터(promoter)
c. TCR pair 삽입 유전자 재조합을 위한 제한효소 사이트 (XhoI)
d. Mouse TCR 베타(beta) 불변 영역(constant region)
e. 2A 자가-절단 펩타이드(self-cleaving peptide)
f. TCR 삽입 세포 선별을 위한 마커 [퓨로마이신 저항성 유전자(puromycin resistance gene; PuroR) 또는 디하이드로폴레이트 환원효소 이중 돌연변이(dihydrofolate reductase double mutant; DHFRdm)]
g. mRNA 발현 종결을 위한 BGH poly A
* PuroR은 퓨로마이신(puromycin), DHFRdm은 메토트렉세이트(methotrexate; MTX) 약물을 이용한 선별이 가능하다.
2) 공통 컨스트럭트 2
pUC19 플라스미드 기반으로 아래의 구성물을 포함하고 있다.
a. Mouse TCR 알파(alpha) 불변 영역(constant region)
b. 2A 자가-절단 펩타이드(self-cleaving peptide)
3) TCR 알파(alpha) 가변 영역(variable region)
4) TCR 베타(beta) 가변 영역(variable region)
3) 및 4)의 경우 TCR 종류마다 다른 염기서열을 가지며, 약 300~500bp 정도의 크기를 가진다. 상기 가변 영역(variable region)을 획득하는 방법은 몇 가지 보고된 사례가 있고 그 방법을 적용할 수 있다. 본 발명에서는 MART-1이라는 TCR pair에 대하여 본 발명에 대한 증명 실험을 진행하였고, 이를 위해 MART-1 TCR 알파 가변 영역(399bp) 및 MART-1 TCR 베타 가변 영역 (393bp)은 유전자 합성을 진행하였다.
공통 컨스트럭트 1 및 2를 미리 만들어 사용하는 이유는 TCR 알파, 베타 각각이 700bp~1kb 정도의 긴 염기서열이기 때문에 획득 및 유전자 합성에 있어 어려움 (고비용, 저효율)이 있고, TCR pair 구조물 제작 후 검증하는 단계에서도 비용과 노력이 많이 들게 된다. 본 발명에서는 TCR pair 제작을 위해 변화가 필요한 최소한의 염기서열에 대한 합성 또는 획득을 할 수 있게 하기 위해 공통구조물 1/2를 미리 제작하였다.
한편, 본 발명에 사용한 Gibson assembly라 불리는 유전자재조합 방법은 이미 상용화된 유전자재조합법으로써 공통 제한효소 절단 영역이 없이도 클로닝이 손쉽게 가능한 기술이다. 제한효소에 의해 생성되는 overhang 대신 약 15bp 정도의 상동성 서열(homology sequence)이 필요하다.
도 3과 같이 서로 이어져야 하는 구조물들 간에 겹치는 염기서열(homology sequence)이 필요한데(주황색, 빨간색, 하늘색), 보통 DNS insert를 제작할 때 이 겹치는 염기서열을 추가로 넣어주면 된다. Vector와 insert를 각각 섞고 Gibson assembly enzyme mix와 함께 섞은 후 50도에서 약 15분간 반응을 진행하고 이 결과물을 바로 대장균(E.coli)에 형질전환(transformation) 하면 완성된다.
< 실시예 2> MART-1 TCR pair 상동 재조합 주형(homologous recombination template) 제작
MART-1 TCR α,β 각 가변 영역(variable region) 염기서열에 대한 유전자 합성을 진행하고 Gibson assembly를 위한 DNA 증폭 및 겹치는 염기서열 추가를 위해 PCR을 수행하였다. 공통 컨스트럭트 2는 필요한 부분만 PCR로 증폭하여 사용하였다. PCR을 통해 증폭한 Vα, Vβ, 공통 컨스트럭트 2는 정제하여 다음 단계에 사용하였다. 플라스미드 backbone으로 사용되는 공통 컨스트럭트 1은 Xho1 제한효소를 이용하여 선형화(linearization)를 수행하고 정제하였다.
정제한 4개의 컨스트럭트들은 Gibson assembly reagent와 섞고, 50도 15분 반응 후, E.coli 형질전환을 수행하였다. 실제 형질전환 수행 결과, 매우 높은 효율로 E.coli 콜로니를 형성하고 완성된 컨스트럭트를 확보할 수 있었다(도 4).
본 발명의 컨스트럭트 제작에 사용한 PCR 프라이머는 표 1에 기재하였다.
TCRα_V_F TAGAGCGCTGCCACC (특정 가변 영역 서열에 추가되는 서열)
TCRα_V_R GGTTCTGGGTTCTGGAT (특정 가변 영역 서열에 추가되는 서열)
TCRβ_V_F GGAGAATCCTGGCCCA (특정 가변 영역 서열에 추가되는 서열)
TCRβ_V_R CATTTCTCAGATCCTC (특정 가변 영역 서열에 추가되는 서열)
mC1-T2A-F GAGCTCGGTACCCGGATCCAGAACCCAGAACCT
mC1-T2A-R CTTGCATGCCTGCAGTGGGCCAGGATTCTCC
< 실시예 3> 완성된 MART-1 TCR pair의 상동 재조합 주형과 CRISPR - Cas9을 이용한 표적 위치( AAVS1 locus) 삽입
AAVS1을 표적하는 가이드 RNA(gRNA)와 Cas9을 발현하는 플라스미드를 MART-1 TCR 컨스트럭트과 함께 Jurkat 세포에 전기천공(electroporation) 방식을 이용하여 전달하였다. 전달된 AAVS1 표적 gRNA와 Cas9은 표적위치인 AAVS1 locus의 DNA 이중나선 절단(double strand break)을 일으키고, 이 위치에서 MART-1 TCR 상동 재조합 주형을 이용하여 MART-1 TCR 유전자 삽입이 일어난다. 천기천공을 진행한 3일 후부터 퓨로마이신(puromycin) 또는 MTX를 약 1주일간 처리하여 MART-1 TCR pair가 삽입된 세포만을 선별하고 선별된 세포를 이용하여 MART-1 TCR의 삽입 여부를 PCR을 통해 확인하고 실제 MART-1 TCR의 기능성을 확인하였다.
<실시예 4> MART-1 TCR의 기능성 확인
MART-1 TCR에 대한 반응성을 보이는 펩타이드를 보유한 T2 세포를 만들고 (T2 cells presenting MART-1 peptide), 96 웰 플레이트에 접종하였다(1×105 cells/wells/200ul). 24시간 후, MART-1 TCR 삽입 Jurkat 세포를 함께 섞어주고 배양을 진행하였다. 24시간 후, 각 웰에서 상등액을 스핀-다운(spin-down) 한 후, 상층액을 모아 IFN-gamma에 대한 ELISA 실험을 진행하였다. MART-1 TCR이 정상적으로 작동하여 T2 세포의 MART-1 펩타이드를 인식하면 면역반응이 일어나 IFN-gamma를 발현하고, 발현된 IFN-gamma는 얻어낸 상층액에 있으므로 IFN-gamma 항체를 이용한 ELISA assay를 통해 정량적으로 측정할 수 있었다. 그 결과 MART-1 TCR을 삽입한 세포(퓨로마이신 선별 또는 MTX 선별을 거친 세포)에서만 IFN-gamma 발현이 증가되는 것을 확인할 수 있었다(도 5).
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (13)

  1. AAVS1 표적 위치의 왼쪽 상동성 암(Left Homology Arm; LHA) 단편 유전자, T 세포 수용체 α(T cell receptor α; TCRα) 가변 영역 단편 유전자, TCRα 불변 영역 단편 유전자, 2A 자가-절단 펩타이드(self-cleaving peptide) 유전자, TCRβ 가변 영역 단편 유전자, TCRβ 불변 영역 단편 유전자 및 AAVS1 표적 위치의 오른쪽 상동성 암(Right Homology Arm; RHA) 단편 유전자를 순서대로 포함하는 T 세포 내 AAVS1 표적 위치로의 TCR 삽입을 위한 재조합벡터.
  2. 제1항에 있어서, 상기 T 세포 내 AAVS1 표적 위치로의 TCR 삽입을 위한 재조합벡터는 TCR 삽입 세포 선별을 위한 마커 유전자를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 T 세포 내 AAVS1 표적 위치로의 TCR 삽입을 위한 재조합벡터.
  3. 제2항에 있어서, 상기 TCR 삽입 세포 선별을 위한 마커 유전자는 퓨로마이신 저항성 유전자(puromycin resistance gene; PuroR) 또는 디하이드로폴레이트 환원효소 이중 돌연변이(dihydrofolate reductase double mutant; DHFRdm) 유전자인 것을 특징으로 하는 T 세포 내 AAVS1 표적 위치로의 TCR 삽입을 위한 재조합벡터.
  4. 제1항에 있어서, 상기 AAVS1 표적 위치의 LHA 단편 유전자는 서열번호 1로 표시되고, 상기 AAVS1 표적 위치의 RHA 단편 유전자는 서열번호 2로 표시되는 것을 특징으로 하는 T 세포 내 AAVS1 표적 위치로의 TCR 삽입을 위한 재조합벡터.
  5. 제1항에 있어서, 상기 TCRα 가변 영역 단편 유전자는 서열번호 3으로 표시되고, 상기 TCRβ 가변 영역 단편 유전자는 서열번호 4로 표시되는 것을 특징으로 하는 T 세포 내 AAVS1 표적 위치로의 TCR 삽입을 위한 재조합벡터.
  6. 제1항에 있어서, 상기 TCRα 불변 영역 단편 유전자는 서열번호 5로 표시되고, 상기 TCRβ 불변 영역 단편 유전자는 서열번호 6으로 표시되는 것을 특징으로 하는 T 세포 내 AAVS1 표적 위치로의 TCR 삽입을 위한 재조합벡터.
  7. 제1항에 있어서, 상기 2A 자가-절단 펩타이드(self-cleaving peptide) 유전자는 서열번호 7로 표시되는 것을 특징으로 하는 T 세포 내 AAVS1 표적 위치로의 TCR 삽입을 위한 재조합벡터.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 재조합벡터로 형질전환된 재조합 균주.
  9. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 재조합벡터, Cas9 단백질 및 AAVS1을 표적으로 하는 가이드 RNA(guide RNA; gRNA)를 포함하는 T 세포 내 AAVS1 표적 위치로의 TCR 삽입용 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 상기 AAVS1을 표적으로 하는 gRNA는 서열번호 8로 표시되는 것을 특징으로 하는 T 세포 내 AAVS1 표적 위치로의 TCR 삽입용 조성물.
  11. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 재조합벡터, Cas9 단백질 및 AAVS1을 표적으로 하는 가이드 RNA(guide RNA; gRNA)를 T 세포 내로 형질전달시키는 단계; 및
    상기 형질전달된 T 세포들 중에서 AAVS1 표적 위치에 TCR이 삽입된 형질전달체를 선별하는 단계를 포함하는, 시험관 내에서(in vitro) T 세포 내 AAVS1 표적 위치로 TCR을 삽입하는 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 형질전달된 T 세포들 중에서 AAVS1 표적 위치에 TCR이 삽입된 형질전달체를 선별하는 단계는 퓨로마이신(puromycin) 또는 메토트렉세이트(methotrexate; MTX)로 처리하여 선별하는 것을 특징으로 하는, 시험관 내에서(in vitro) T 세포 내 AAVS1 표적 위치로 TCR을 삽입하는 방법.
  13. 제11항에 있어서, 상기 AAVS1을 표적으로 하는 gRNA는 서열번호 8로 표시되는 것을 특징으로 하는, 시험관 내에서(in vitro) T 세포 내 AAVS1 표적 위치로 TCR을 삽입하는 방법.
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