WO2021149442A1

WO2021149442A1 - フラボノイド組成物

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Publication number: WO2021149442A1
Application number: PCT/JP2020/048083
Authority: WO
Inventors: 了士高▲柿▼
Original assignee: 株式会社萌芽プランツ
Priority date: 2020-01-20
Filing date: 2020-12-23
Publication date: 2021-07-29
Also published as: JP7392219B2; JP2021113169A; JP2023174959A

Abstract

老化による網膜色素上皮細胞の細胞死や網膜厚の減少を防止、抑制することができ、眼の不快な状態を防止、抑制または改善することができる、眼の老化予防剤を提供することを課題とする。解決手段として、ミリセチンおよびミリセチン配糖体から選択される１種以上を有効成分として含有する、眼の老化予防剤を提供する。

Description

フラボノイド組成物

　本発明は、ミリセチンおよびミリセチン配糖体を用いる、眼の老化予防剤および眼の老化予防用サプリメントに関する。

　老化による眼の疾患、視力低下は加齢による眼に関するＱＯＬを大きく損なう。代表的な眼の疾患である加齢黄斑変性症は、原因不明の難病であり、世界的に主要な失明原因の１つとされている。病態は、網膜色素上皮細胞の機能異常であるが、網膜の黄斑部が変性することにより、視野の中心部分がぼけたり、歪んで見えたり、中心が見えなくなったり、暗くなる等の症状を引き起こす疾患である。
　網膜色素上皮細胞の機能異常は、加齢すなわち老化によるものであるため、多くの場合、加齢黄斑変性症は高齢者に見られる疾患である。網膜色素上皮細胞の老化のメカニズムについては未だに不明な部分が多く、現在の医療技術では、発症してしまった患者に対して進行を遅らせる以外に治療手段はなく、一度発症してしまうと根本的に治療する方法がない疾患である。従って、加齢黄斑変性症は発症させないこと、すなわち、予防が重要な疾患である。
　また、加齢黄斑変性症は、紫外線が網膜色素上皮細胞を細胞死させる、若しくは網膜厚の減少を促進するため、引き起こされる眼病であるともいわれている。紫外線の特定の波長が、眼の水晶体や網膜にダメージを与え、結果として、眼疾患や眼の老化を促進させると考えられている。

　この加齢黄斑変性症については、多くの薬剤や治療法が提案されている。例えば、特許文献１には、イソキノリン骨格を有する化合物が、スペルミジンにより誘発される網膜色素上皮細胞死を抑制することが記載されており、当該化合物を有効成分とする網膜色素上皮細胞保護剤が提案されている。さらに、特許文献２には、Ｓ－アリル－Ｌ－システインが、網膜色素上皮細胞内に蓄積し、光により酸化して網膜色素上皮細胞を損傷させる物質の酸化を抑制する機能を有することが記載されており、Ｓ－アリル－Ｌ－システインを有効成分とする、眼疾患予防または治療組成物が提案されている。
　一方、加齢黄斑変性症は予防が重要であることからも、不快な症状が発現する以前の健康な状態から、手軽に摂取できる予防剤が望まれている。　

特開２０１５－２２９６７１号公報特表２０１５－５２８８２５号公報

　本発明は、上記のような状況を鑑みてなされたものであり、老化による網膜色素上皮細胞の細胞死や網膜厚の減少を防止、抑制することができ、眼の不快な状態を防止、抑制または改善することができる、眼の老化予防剤を提供することを課題としている。

　本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、ミリセチンやその配糖体に、老化による網膜色素上皮細胞の細胞死や網膜厚の減少を防止、抑制または改善する作用を有することを見出し、本発明を完成するに至った。

　本発明は、具体的には次の事項を要旨とする。
　１．ミリセチンおよびミリセチン配糖体から選択される１種以上を有効成分として含有する、眼の老化予防剤。
　２．ミリセチンおよび／またはミリシトリンを有効成分として含有することを特徴とする、１．に記載の眼の老化予防剤。
　３．１．または２．に記載の眼の老化予防剤を含有する、眼の老化予防用サプリメント。

　本発明のミリセチンおよびミリセチン配糖体から選択される１種以上を有効成分として含有する眼の老化予防剤は、網膜色素上皮細胞死や網膜厚の減少を防止または抑制することが出来るため、加齢黄斑変性症などの眼病予防効果を発揮する。また、本発明の眼の老化予防用サプリメントは、角膜や水晶体を通過した紫外線による網膜色素上皮細胞死や網膜厚の減少に起因する、自覚的または客観的な眼の不快な状態を防止、抑制または改善することができる。
　特に、最近では加齢による目の老化だけではなく、パソコン、スマートフォン、ゲーム機など紫外線を発生する機器の画面を長時間凝視することによる、紫外線による眼の障害が問題となっている。本発明の眼の老化予防用サプリメントは、角膜や水晶体を通過した紫外線による網膜色素上皮細胞死や網膜厚の減少に起因する、自覚的または客観的な眼の不快な状態を防止、抑制または改善することができる。
　一方、本発明の有効成分であるミリセチンやその配糖体は、食品添加物として認められており、ヒトに対して安全であり、長期間摂取しても弊害が想定しにくい。したがって、健康な人はもとより、老齢者や若齢者の年齢を問わず日常生活において摂取し得るサプリメントとしても有用である。
　これまで、ミリセチンやその配糖体が、ヒトの網膜色素上皮細胞死や網膜厚の減少を防止または抑制することに有用であることは知られておらず、このミリセチンやその配糖体が有する効果を見出したのは本発明者が初めてであり、格別顕著な効果である。

ＵＶ－Ｂ照射量の検討に関する予備試験結果を示す図である。ヒト網膜色素上皮細胞の細胞死抑制効果確認試験（ＵＶ－Ｂ）結果を示す図である。ＵＶ－Ａ照射量の検討に関する予備試験結果を示す図である。ヒト網膜色素上皮細胞の細胞死抑制効果確認試験（ＵＶ－Ａ）結果を示す図である。

　以下、本発明の眼の老化予防剤および眼の老化予防用サプリメントについて詳細に説明する。なお、本明細書において「眼」とは光を受容する感覚器全体を意味する。
　また、本発明において「眼の老化」とは、年齢の増加に伴う光を受容する感覚器全体の変化や機能の低下に加え、年齢に関係なく紫外線により引き起こされる網膜色素上皮細胞の障害、いわゆる紫外線による眼細胞の老化を意味する。年齢や紫外線への暴露頻度とともに、細胞の再生補充が減少してくるため、視覚機能の異常や維持能力が低下する。特に、視神経細胞は再生できないため、加齢による現象が顕著である。本発明における「眼の老化」の中でも、網膜色素上皮細胞の細胞死や網膜厚の減少は眼細胞の老化に伴い顕著に生じるものであり、解決すべき課題の１つである。
　紫外線は、波長の長さによってＵＶ－Ａ（紫外線Ａ波）、ＵＶ－Ｂ（紫外線Ｂ波）、ＵＶ－Ｃ（紫外線Ｃ波）の３つに分けられるが、ＵＶ－Ｃはオゾン層に吸収され地表には届かず、ヒトに悪影響をもたらすのはＵＶ－ＡとＵＶ－Ｂであることが知られている。本発明における紫外線は、このＵＶ－ＡとＵＶ－Ｂを意味する。

　本発明の眼の老化予防剤および眼の老化予防用サプリメントは、有効成分としてミリセチンおよびミリセチン配糖体から選択される１種以上を含有するものである。
　ミリセチンは、ぶどう、ベリーなどの果実、野菜、ヤマモモ、ワイン、イチョウの葉、お茶などに含まれるフラボノイドである、下記化学構造（Ａ）を有する天然フラボノールの１種である。

　ミリセチンは、強い抗酸化作用を有することが知られている他、抗がん、アルツハイマー病の予防及び治療、抗炎症、糖尿病の予防及び治療などの様々な効果があることが報告されている化合物である。
　本発明におけるミリセチン配糖体とは、ミリセチンにガラクトース、グルコース、キシロース、アラビノース、ラムノース、フラクトース、マンノース、アピオースなどの糖類が単糖の形で結合している化合物や、任意の組み合わせで２個以上結合したオリゴ糖、例えば、ルチノースなどの形で結合している化合物、さらに、糖分子の一部に窒素原子を持つアミノ糖や酸構造を持つグルクロン酸などの糖酸が結合した化合物を意味する。
　また、本発明における有効成分として、ミリセチンまたはミリシトリンに脂肪酸、リン酸、有機酸、没食子酸などのポリフェノール類、アミノ酸などがエステル結合などにより結合した誘導体も有用である。
　本発明におけるミリセチン配糖体としては、ミリセチン３－Ｏ－ガラクトシド、ミリセチン３－Ｏ－グルコシド、ミリセチン３－Ｏ－キシロ－ピラノシド、ミリセチン３－Ｏ－アラビノ－ピラノシド、ミリセチン３－Ｏ－アラビノ－フラノシド、ミリセチン３－Ｏ－ラムノシド（ミリシトリン）が好ましく、中でも、ミリセチン３－Ｏ－ラムノシド（ミリシトリン）がより好ましい。

　ミリシトリンは、ミリセチンのラムノース配糖体であり、下記化学構造（Ｂ）を有する化合物である。

　ミリシトリンは、ヤマモモの樹皮、実、葉に含まれており、ヤマモモ樹皮から抽出・精製したものが「ヤマモモ抽出物」として市販されており、無水物換算９５．０～１０５．０％純度のミリシトリンを含有する「ヤマモモ抽出物」の名称で、食品添加物として食品添加物公定書に収載されている。
　本発明におけるミリシトリンは、ヤマモモ樹皮を水または水溶性溶媒（例えば、エタノールなど）または酸性／アルカリ性水溶性溶媒等により、室温から１００℃程度の加温状態において抽出し、これを精製することにより得ることができる。また、本発明におけるミリシトリンは、食品添加物として市販されている「ヤマモモ抽出物」を使用しても良い。
　本発明におけるミリセチンは、ミリセチンの配糖体であるミリシトリンを塩酸等で加水分解することにより得ることもできる。

　後述する実施例において詳細に説明するが、本発明のミリセチンやその配糖体は、紫外線ＵＶ－ＡおよびＵＶ－Ｂによる網膜色素上皮細胞の細胞死を抑制する効果を発揮することが明らかとなった。一方、４－クロメノン骨格が４－クロマノン骨格である点でのみミリセチンと相違するアンペロプシン（ジヒドロミリセチン）や、アンペロプシンのベンゼン環上のヒドロキシ基の１つが水素に置換されたタキシフォリンは、活性酸素消去能など抗酸化力が強いにもかかわらず、紫外線による網膜色素上皮細胞の細胞死を抑制する効果が認められなかった。このような、化学構造上の僅かな違いによるミリセチンとアンペロプシン（ジヒドロミリセチン）やタキシフォリンとの、網膜色素上皮細胞の細胞死に対する抑制効果の違いは、今回初めて明らかになったことであり、網膜色素上皮細胞の紫外線による細胞死抑制効果は抗酸化力の強さとは連動しない非常に興味深い結果である。
　また、本発明における参考例であるが、ブルーベリーエキスも、ミリセチンやその配糖体と同様に、紫外線ＵＶ－ＡおよびＵＶ－Ｂによる網膜色素上皮細胞の細胞死を抑制する効果を発揮することが確認された。さらに、ルテオリニジンは、紫外線ＵＶ－Ａによる網膜色素上皮細胞の細胞死を抑制する効果を発揮することが確認された。

　本発明における「眼の老化」の１つである、網膜色素上皮細胞の細胞死および網膜厚の減少は、疾患とまではいえないが視覚機能が低下した不快な状態を引き起こす。視覚機能が低下した不快な状態には、老化による眼の疲れ、紫外線などによる眼精疲労、奥行きの認識力が衰える、見える範囲が狭くなる、物が暗く見える、光の変化に対する瞳孔の反応が遅くなる等が含まれる。網膜色素上皮細胞の細胞死および網膜厚の減少は、悪化すると緑内障、加齢黄斑変性症、網膜剥離、中途失明等の眼疾患をも引き起こす。
　本発明の眼の老化予防剤および眼の老化予防用サプリメントは、このような網膜色素上皮細胞の細胞死や網膜厚の減少を抑制するため、上述のような網膜色素上皮細胞の細胞死および網膜厚の減少が引き起こす、視覚機能が低下した不快な状態を防止または改善することができるだけでなく、緑内障、加齢黄斑変性症、網膜剥離、中途失明等の眼疾患をも防止することができるという、顕著な効果を発揮する。
　網膜色素上皮細胞の細胞死および網膜厚の減少は、紫外線などの光刺激により誘発され得るものであり、本発明の眼の老化予防剤および眼の老化予防用サプリメントは、紫外線による網膜色素上皮細胞の細胞死や網膜厚の減少を抑制することができる。

　本発明の眼の老化予防剤は、ヒトを含む哺乳動物に投与あるいは摂取させることにより、その効果を発揮させることができる。例えば、本発明の眼の老化予防剤の投与または摂取により、紫外線などの光刺激による網膜色素上皮細胞の細胞死を抑制することができる。また、本発明の眼の老化予防剤の投与または摂取により、紫外線などの光刺激による網膜厚の減少を抑制し、適正な網膜厚を維持することができる。
本発明の眼の老化予防剤は、ヒトのみならず、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ等の家畜、さらに、イヌ、ネコ等のペットなどに対しても効果を発揮する。

　本発明の眼の老化予防剤は、医薬品、医薬部外品、食品、飼料（ペットフードを含む）などの形態で提供することができる。すなわち、本発明の眼の老化予防剤は医薬組成物を含む。本発明の眼の老化予防剤は、経口投与または点眼による投与が挙げられるが、経口投与する形態が好ましい。経口投与に適した製剤形としては、顆粒剤、散剤、錠剤（糖衣錠を含む）、丸剤、カプセル剤、シロップ剤、乳剤、懸濁剤が挙げられる。これらの製剤は、当分野で通常行われている手法により、薬学上許容される製剤助剤を用いて製剤化することができる。薬学上許容される製剤助剤としては、賦形剤、結合剤、希釈剤、添加剤、香料、緩衝剤、増粘剤、着色剤、安定剤、乳化剤、分散剤、懸濁化剤、防腐剤等が挙げられる。
さらに、本発明の眼の老化予防剤は、食品組成物、すなわち飲食品を含む。該食品組成物は、眼の不快な状態の防止、抑制または改善に用いることができる。対象となる飲食品の種類は、本発明の眼の老化予防剤の有効成分の効果が阻害されないものであれば特に限定されない。また、食品組成物にはサプリメントが含まれ、サプリメントの製剤形は限定されず、他の機能性成分、例えば、ルテイン、ゼアキサンチンなどのキサントフィル類やβカロテンなどのカロチノイド類、シアニンジンやデルフィニジンをアグリコンとするアントシアニン類、クロロフィルを含む緑葉類、没食子酸やカテキンなどのポリフェノール類、ケルセチンやルテオリンなどのフラボノイド類、オレイン酸、リノレン酸などの脂肪酸を構成成分とする油脂類等も含んでいてもよい。本発明の眼の老化予防剤としては、サプリメントとして用いる形態が好適である。

　本発明の眼の老化予防用サプリメントの摂取量は、通常、有効成分であるミリセチンやその配糖体を、１人１日あたり１～１０００ｍｇ、好ましくは５～６００ｍｇ、より好ましくは２０～２５０ｍｇであり、適宜増減できる摂取は、通常１日以上、好ましくは１週間以上、より好ましくは１カ月以上継続することが適している。
本発明の眼の老化予防用サプリメントは、摂取開始時からの期間において、自覚的または客観的な眼の不快な状態を防止、抑制または改善することができ有用である。

　以下、本発明の眼の老化予防剤の調整例や、紫外線ＵＶ－ＢおよびＵＶ－Ａによる網膜色素上皮細胞の細胞死抑制評価等により、本発明をさらに詳しく説明するが、本発明は、これらの例に限定されるものではない。

＜ミリシトリンの調整＞
　チップ状のヤマモモ樹皮（１００ｇ）に、水１，０００ｍＬを加えて、５０℃で穏やかに撹拌しながら１時間の抽出作業を行い、濾別により固液分離して水溶性画分を除去した。残ったヤマモモ樹皮にエタノール５００ｍＬを加えて、７０℃で抽出作業を行い、抽出液が熱い状態で濾別により固液分離した。抽出液を濃縮し、エタノールを留去して水置換後加水し、２００ｍＬの水溶液状態抽出液を２０℃以下の温度下において１０時間以上静置し、不溶化した沈殿物を濾別し、ミリシトリン（７．６ｇ、純度９８．７％（無水物換算））を得た。

＜予備試験：ＵＶ－Ｂ照射量の検討＞
　網膜色素上皮細胞に照射する紫外線量を決めるために、予備試験を行った。
　使用した細胞と培地の詳細は以下のとおりである。
（１）使用細胞と培地
　細胞；ヒト網膜色素上皮細胞株（ＡＲＰＥ－１９）（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ－
　　　　２３０２）
　増殖培地；ＤＭＥＭ：Ｆ－１２／１０％ＦＢＳ／１％ＰＳ
　試験培地；ＤＭＥＭ：Ｆ－１２／１％ＰＳ
（２）予備試験方法
　細胞を、増殖培地を用いて９６穴プレートに播種（10,000cells/well/0.1 mL）し、二酸化炭素インキュベーター内（５％ＣＯ_２、３７℃）で１日培養した。新たな試験培地に交換して、さらに６時間培養した。次いで、ＵＶ－Ｂ照射装置を使用して、ＵＶ－Ｂ強度が約１５００μＷ／ｃｍ^２（紫外線強度計を使用して強度測定）のＵＶ－Ｂを、０秒、４０秒、８０秒、１２０秒、１６０秒、２００秒、１２００秒間照射（ＵＶ－Ｂ照射量＝０、６０、１２０、１８０、２４０、３００、１８００ｍＪ）した。照射後２４時間培養した後、生細胞数測定試薬（ＳＦ、ナカライテスク社製）を１０％添加した試験培地に交換し、二酸化炭素インキュベーター内で培養した。３０分後および９０分後に吸光度（測定波長：４５０ｎｍ、参照波長：６３０ｎｍ）をプレートリーダーで測定し、６０分間の吸光度変化量を算出することで、相対細胞生存率（％）を測定した。試験は６回行い、吸光度はその平均値を使用した。
（３）予備試験結果データ
　予備試験結果を、下記表１と図１に示す。

（４）予備試験結果からの結論
　表１および図１の結果より、ＵＶ－Ｂ照射量０～１２０ｍＪの範囲では、ＵＶ－Ｂ照射量に比例して細胞生存率（％）が低下したが、ＵＶ－Ｂ照射量１８０ｍＪ以上では、細胞生存率（％）の減少率が鈍化することが確認された。この結果より、ヒト網膜色素上皮細胞の細胞死抑制確認試験におけるＵＶ－Ｂ照射量は、１８０ｍＪで実施することとした。

＜ヒト網膜色素上皮細胞の細胞死抑制効果確認試験：ＵＶ－Ｂ＞
（１）試験検体について
　ヒト網膜色素上皮細胞の細胞死抑制効果確認試験において、試験検体として以下の物質を使用した。
　ミリシトリン：上記ヤマモモ樹皮抽出物を使用
　ミリセチン（東京化成工業社製試薬）
　タキシフォリン（東京化成工業社製試薬）
　アンペロプシン（東京化成工業社製試薬）
　ブルーベリーエキス（機能性表示食品関与成分グレード）
（２）試験方法について
　上記予備試験と同じヒト網膜色素上皮細胞を、増殖培地を用いて９６穴プレートに播種（10,000cells/well/0.1 mL）し、二酸化炭素インキュベーター内（５％ＣＯ_２、３７℃）で１日培養した。上記試験検体は、試験培地に１ｍｇ／ｍＬとなるように溶解し、０．２２μｍＰＶＤＦ（ポリフッ化ビニリデン）フィルターを用いて濾過減菌した後、試験培地で希釈（３濃度＝０．００１．０．０１．０．１ｍｇ／ｍＬ）したものを調製し、培地交換後、６時間培養して試験検体前処理を行った。そして試験検体前処理を行わない細胞も、試験培地で培地交換を行い、同様に培養した。次いで、ＵＶ－Ｂ照射装置を使用して、ＵＶ－Ｂ強度が約１５００μＷ／ｃｍ^２（紫外線強度計を使用して強度測定）のＵＶ－Ｂを１２０秒照射（ＵＶ－Ｂ照射量：１８０ｍＪ）した。ＵＶ－Ｂ非照射群は、ＵＶ－Ｂ照射時間を０秒とした。
　照射後２４時間培養した後、生細胞数測定試薬（ＳＦ）１０％を添加した試験培地に交換して、二酸化炭素インキュベーター内で培養した。３０分後および９０分後に吸光度（測定波長：４５０ｎｍ、参照波長：６３０ｎｍ）をプレートリーダーで測定し、６０分間の吸光度変化量を算出することで、相対細胞生存率（％）を測定した。試験は５回行い、吸光度はその平均値を使用した。
　なお、ヒト網膜色素上皮細胞が上記試験検体（３濃度）添加培地において細胞死しないことは、別途試験において確認した。

（３）細胞死抑制効果確認試験（ＵＶ－Ｂ）結果データについて
　細胞死抑制効果確認試験結果を、下記表２と図２に示す。
　ＵＶ－Ｂ非照射群とＵＶ－Ｂ照射群との差は、スチューデントのｔ検定により有意差があることが確認された。これを図２に表記（「＃＃」：ｐ＜０．０１）した。また、ＵＶ－Ｂ照射群における試験検体非添加群と試験検体添加群との差は、ダネット検定値より、ｐ＜０．０５は「＊」、ｐ＜０．０１は「＊＊」とし、これを表２と図２に表記した。

（４）細胞死抑制効果確認試験（ＵＶ－Ｂ）結果について
　表２および図２の結果より、ミリセチン０．１ｍｇ／ｍＬとその配糖体であるミリシトリン０．１ｍｇ／ｍＬ処理群において、紫外線ＵＶ－Ｂによるヒト網膜色素上皮細胞の細胞生存率を有意に向上させ得ることが明らかとなった。特に、ヒト網膜色素上皮細胞の細胞生存率の向上率はミリシトリンが最も高いことが確認された。
　一方、その化学構造がミリセチンと酷似するアンペロプシン（ジヒドロミリセチン）やタキシフォリンは、試験検体非添加群と有意差は認められず、紫外線ＵＶ－Ｂによるヒト網膜色素上皮細胞の細胞死を抑制し得ないことが確認された。上述のとおり、アンペロプシン（ジヒドロミリセチン）とミリセチンは、４－クロマノン骨格と４－クロメノン骨格である点でのみ相違する化合物であり、タキシフォリンはアンペロプシンのベンゼン環上のヒドロキシ基の１つが水素に置換された化合物であるが、紫外線によるヒト網膜色素上皮細胞の細胞死に対する抑制効果に、大きな相違があることが上記試験により明らかとなった。
　また、本発明における参考例ながら、ブルーベリーエキス０．１ｍｇ／ｍＬ処理群においても、紫外線ＵＶ－Ｂによるヒト網膜色素上皮細胞の細胞生存率が有意に向上し、老化による網膜色素上皮細胞の細胞死や網膜厚の減少を防止、抑制することができ、眼の不快な状態を防止、抑制または改善できることが確認された。

＜予備試験：ＵＶ－Ａ照射量の検討＞
　網膜色素上皮細胞に照射する紫外線量を決めるために、予備試験を行った。
　細胞と培地は、上記「ＵＶ－Ｂ照射量の検討」と同じものを使用した。
（１）予備試験方法
　細胞を、増殖培地を用いて９６穴プレートに播種（10,000cells/well/0.1 mL）し、二酸化炭素インキュベーター内（５％ＣＯ_２、３７℃）で１日培養した。新たな増殖培地に交換し、６時間培養した。その後各穴（ウェル）をＤＰＢＳ（Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline）に交換した後、ＵＶ－Ａ照射装置を使用して、ＵＶ－Ａ強度が約３０ｍＷ／ｃｍ^２／秒（紫外線強度計を使用して強度測定）のＵＶ－Ａを、０分、３分、６分、９分、１２分、１５分、１８分、２１分間照射（積算ＵＶ－Ａ照射量＝０、５．４、１０．８、１６．２、２１．６、２７．０、３２．４、３７．８Ｊ）した。照射後、増殖培地１００μＬに交換し、二酸化炭素インキュベーター内で２４時間培養した。
　生細胞数測定試薬（ＳＦ）を１０％添加した増殖培地に交換し、二酸化炭素インキュベーター内で培養した。３０分後および９０分後に吸光度（測定波長：４５０ｎｍ、参照波長：６３０ｎｍ）をプレートリーダーで測定し、６０分間の吸光度変化量を算出することで、相対細胞生存率（％）を測定した。試験は６回行い、吸光度はその平均値を使用した。
（２）予備試験結果データ
　予備試験結果を、下記表３と図３に示す。

（３）予備試験結果からの結論
　表３および図３の結果より、ＵＶ－Ａ照射量０～１６．２Ｊの範囲では、ＵＶ－Ａ照射量に比例して細胞生存率（％）が低下し、ＵＶ－Ａ照射量２１．６Ｊ以上では、細胞がほぼ死滅した。この結果より、ヒト網膜色素上皮細胞の細胞死抑制確認試験におけるＵＶ－Ａ照射量は、５．４Ｊで実施することとした。

＜ヒト網膜色素上皮細胞の細胞死抑制効果確認試験：ＵＶ－Ａ＞
（１）試験検体について
　ヒト網膜色素上皮細胞の細胞死抑制効果確認試験において、試験検体として以下の物質を使用した。
　ミリシトリン：上記ヤマモモ樹皮抽出物を使用
　ルテオリニジン（富士フイルム和光純薬社製試薬）
　ブルーベリーエキス（機能性表示食品関与成分グレード）
　これら試験検体は、上記「予備試験：ＵＶ－Ａ照射量の検討」と同じ増殖培地及びＤＰＢＳに１ｍｇ／ｍＬとなるよう溶解し、０．２２μｍＰＶＤＦ（ポリフッ化ビニリデン）フィルターを用いて濾過滅菌した後、増殖培地あるいはＤＰＢＳで希釈して終濃度０．００１、０．０１、０．１ｍｇ／ｍＬの３濃度となるよう調製した。
（２）試験方法について
　上記「予備試験：ＵＶ－Ａ照射量の検討」と同じヒト網膜色素上皮細胞を、増殖培地を用いて９６穴プレートに播種（10,000cells/well/0.1 mL）し、二酸化炭素インキュベーター内（５％ＣＯ_２、３７℃）で１日培養した。試験検体添加培地に交換して、６時間培養した。次に、各穴（ウェル）を試験検体添加ＤＰＢＳに交換し、ＵＶ－Ａ照射装置を使用して、ＵＶ－Ａ強度が約３０ｍＷ／ｃｍ^２／秒（紫外線強度計を使用して強度測定）のＵＶ－Ａを３分照射（ＵＶ－Ａ照射量：５．４Ｊ）した。ＵＶ－Ａ非照射群は、ＵＶ－Ａ照射時間を０秒とした。
　照射後、試験物質添加培地１００μＬに交換し、二酸化炭素インキュベーター内で２４時間培養した。
　生細胞数測定試薬（ＳＦ）１０％添加した増殖培地に交換して、二酸化炭素インキュベーター内で育成した。３０分後および９０分後に吸光度（測定波長：４５０ｎｍ、参照波長：６３０ｎｍ）をプレートリーダーで測定し、６０分間の吸光度変化量を算出することで、相対細胞生存率（％）を測定した。試験は４回行い、吸光度はその平均値を使用した。
　なお、ヒト網膜色素上皮細胞が上記試験検体（３濃度＝０．００１．０．０１．０．１ｍｇ／ｍＬ）添加培地において細胞死しないことは、別途試験において確認した。

（３）細胞死抑制効果確認試験（ＵＶ－Ａ）結果データについて
　細胞死抑制効果確認試験結果を、下記表４と図４に示す。
　ＵＶ－Ａ非照射群とＵＶ－Ａ照射群との差は、スチューデントのｔ検定により有意差があることが確認された。これを図４に表記（「＃＃」：ｐ＜０．０１）した。また、ＵＶ－Ａ照射群における試験検体非添加群と試験検体添加群との差は、ダネット検定値より、ｐ＜０．０５は「＊」、ｐ＜０．０１は「＊＊」とし、これを表４と図４に表記した。

（４）細胞死抑制効果確認試験（ＵＶ－Ａ）結果について
　表４および図４の結果より、ミリセチン配糖体であるミリシトリン０．１ｍｇ／ｍＬ処理群において、紫外線ＵＶ－Ａによるヒト網膜色素上皮細胞の細胞生存率を有意に向上させ得ることが明らかとなった。
　また、本発明における参考例ながら、ルテオリニジン０．１ｍｇ／ｍＬ処理群およびブルーベリーエキス０．１ｍｇ／ｍＬ処理群においても、紫外線ＵＶ－Ａによるヒト網膜色素上皮細胞の細胞生存率が有意に向上し、老化による網膜色素上皮細胞の細胞死や網膜厚の減少を防止、抑制することができ、眼の不快な状態を防止、抑制または改善できることが確認された。
　ＵＶ－ＡはＵＶ－Ｂよりエネルギー量は低いものの、ヒトの網膜などの体内の深い場所まで吸収されずに到達するため、ヒト網膜における紫外線障害では影響が大きいことが知られている。本発明の有効成分であるミリセチンおよびミリセチン配糖体であるミリシトリンをはじめ、ルテオリニジンやブルーベリーエキスは、ヒト網膜に対するＵＶ－ＢはもとよりＵＶ－Ａによる網膜色素上皮細胞死や網膜厚の減少を大きく抑制することができ、これらに起因する自覚的または客観的な眼の不快な状態を防止、抑制または改善に寄与することが、上記試験により確認された。

　ブルーベリーエキスを有効成分として含有することを特徴とする眼の老化予防剤。
　ブルーベリーエキスを有効成分として含有する、眼の老化予防用サプリメント。
　ルテオリニジンを有効成分として含有する、紫外線ＵＶ－Ａによる眼へのストレス回避剤。
　ルテオリニジンを有効成分として含有する、紫外線ＵＶ－Ａによる眼へのストレス回避用サプリメント。

　本発明の眼の老化予防剤および眼の老化予防用サプリメントは、紫外線ＵＶ－ＡおよびＵＶ－Ｂによる網膜色素上皮細胞の細胞死や網膜厚の減少を抑制することができるため、緑内障、加齢黄斑変性症、網膜剥離、中途失明等の眼疾患をも防止するなどの眼病予防効果を発揮する。また、自覚的または客観的な眼の不快な状態を防止、抑制または改善することができ有用である。
　本発明の有効成分であるミリセチンとその配糖体は、食品添加物として認められており、ヒトに対して安全であり、長期間摂取しても弊害が想定しにくい。したがって、健康な人はもとより、老齢者や若齢者の年齢を問わず日常的に摂取し得るサプリメントとしても有用である。

Claims

　ミリセチンおよびミリセチン配糖体から選択される１種以上を有効成分として含有する、眼の老化予防剤。
　ミリセチンおよび／またはミリシトリンを有効成分として含有することを特徴とする、請求項１に記載の眼の老化予防剤。
　請求項１または２に記載の眼の老化予防剤を含有する、眼の老化予防用サプリメント。