WO2021148684A1 - Composiciones biopesticidas que comprenden extractos vegetales y su uso fitosanitario - Google Patents

Composiciones biopesticidas que comprenden extractos vegetales y su uso fitosanitario Download PDF

Info

Publication number
WO2021148684A1
WO2021148684A1 PCT/ES2020/070037 ES2020070037W WO2021148684A1 WO 2021148684 A1 WO2021148684 A1 WO 2021148684A1 ES 2020070037 W ES2020070037 W ES 2020070037W WO 2021148684 A1 WO2021148684 A1 WO 2021148684A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
biopesticidal
composition according
cinnamaldehyde
biopesticidal composition
cinnamomum
Prior art date
Application number
PCT/ES2020/070037
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Félix GARCIA MORENO
Efrén REMESAL GONZÁLEZ
Luis Fernando JULIO TORRES
Omar SANTANA MÉRIDAS
María MARTÍN BEJERANO
Salvador GIMÉNEZ GARCÍA
Original Assignee
Kimitec Biogroup, S.L.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Kimitec Biogroup, S.L. filed Critical Kimitec Biogroup, S.L.
Priority to JP2022544148A priority Critical patent/JP7522200B2/ja
Priority to BR112022013069A priority patent/BR112022013069A2/pt
Priority to PCT/ES2020/070037 priority patent/WO2021148684A1/es
Priority to MX2022008447A priority patent/MX2022008447A/es
Priority to KR1020227028849A priority patent/KR20220143042A/ko
Priority to AU2020424969A priority patent/AU2020424969A1/en
Priority to ES202290052A priority patent/ES2926555B2/es
Publication of WO2021148684A1 publication Critical patent/WO2021148684A1/es
Priority to US17/864,268 priority patent/US20220354128A1/en
Priority to ZA2022/08521A priority patent/ZA202208521B/en

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N65/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing material from algae, lichens, bryophyta, multi-cellular fungi or plants, or extracts thereof
    • A01N65/40—Liliopsida [monocotyledons]
    • A01N65/48—Zingiberaceae [Ginger family], e.g. ginger or galangal
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01P—BIOCIDAL, PEST REPELLANT, PEST ATTRACTANT OR PLANT GROWTH REGULATORY ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR PREPARATIONS
    • A01P7/00—Arthropodicides
    • A01P7/04—Insecticides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N25/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators, characterised by their forms, or by their non-active ingredients or by their methods of application, e.g. seed treatment or sequential application; Substances for reducing the noxious effect of the active ingredients to organisms other than pests
    • A01N25/26—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators, characterised by their forms, or by their non-active ingredients or by their methods of application, e.g. seed treatment or sequential application; Substances for reducing the noxious effect of the active ingredients to organisms other than pests in coated particulate form
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N35/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic compounds containing a carbon atom having two bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. aldehyde radical
    • A01N35/02—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic compounds containing a carbon atom having two bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. aldehyde radical containing aliphatically bound aldehyde or keto groups, or thio analogues thereof; Derivatives thereof, e.g. acetals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N37/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic compounds containing a carbon atom having three bonds to hetero atoms with at the most two bonds to halogen, e.g. carboxylic acids
    • A01N37/10—Aromatic or araliphatic carboxylic acids, or thio analogues thereof; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N49/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators, containing compounds containing the group, wherein m+n>=1, both X together may also mean —Y— or a direct carbon-to-carbon bond, and the carbon atoms marked with an asterisk are not part of any ring system other than that which may be formed by the atoms X, the carbon atoms in square brackets being part of any acyclic or cyclic structure, or the group, wherein A means a carbon atom or Y, n>=0, and not more than one of these carbon atoms being a member of the same ring system, e.g. juvenile insect hormones or mimics thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N65/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing material from algae, lichens, bryophyta, multi-cellular fungi or plants, or extracts thereof
    • A01N65/08—Magnoliopsida [dicotyledons]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N65/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing material from algae, lichens, bryophyta, multi-cellular fungi or plants, or extracts thereof
    • A01N65/08—Magnoliopsida [dicotyledons]
    • A01N65/20—Fabaceae or Leguminosae [Pea or Legume family], e.g. pea, lentil, soybean, clover, acacia, honey locust, derris or millettia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N65/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing material from algae, lichens, bryophyta, multi-cellular fungi or plants, or extracts thereof
    • A01N65/08—Magnoliopsida [dicotyledons]
    • A01N65/22—Lamiaceae or Labiatae [Mint family], e.g. thyme, rosemary, skullcap, selfheal, lavender, perilla, pennyroyal, peppermint or spearmint
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N65/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing material from algae, lichens, bryophyta, multi-cellular fungi or plants, or extracts thereof
    • A01N65/08—Magnoliopsida [dicotyledons]
    • A01N65/24—Lauraceae [Laurel family], e.g. laurel, avocado, sassafras, cinnamon or camphor
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • the invention falls within the field of Agriculture and Plant Biotechnology; and more specifically in the field of biopesticides derived from plant materials and particularly within the field of biochemical biopesticides that comprise natural substances such as extracts and fatty acids that control pests and diseases.
  • Plants constitute a natural factory of chemical substances with biopesticidal activity, derived mainly from secondary metabolism and as a consequence of millions of years of coevolution between plants and pests. These substances are characterized by belonging to different chemical classes, which results in a great multifunctionality. Among them are: terpenes, sterols, alkaloids, polyphenols (flavones, isoflavones, coumarins, lignans, iridoids, phenylpropanoids), glucosinolates, isothiocyanates, fatty acids, esters and essential oils.
  • ESAs essential oils
  • EAs essential oils
  • Plant Oils obtained mainly from aromatic, medicinal and / or condiment plants through different distillation and / or extraction processes with low polarity solvents including CO2 (supercritical extraction).
  • EAs constitute the most volatile part of numerous plant species, fundamentally belonging to the Lamiaceae family, and comprise complex mixtures of monoterpenes, sesquiterpenes and aromatic compounds. These compounds, without a doubt, are the natural components most used in the development of biopesticides. Papers that refer to the application of EPAs as "potential" biopesticides for the control of pests and diseases occupy more than 70% of the total scientific publications on plant protection compounds derived from plants. However, 95% of these publications only deal with studies at the laboratory level and very few refer to real possibilities for scaling up. (Green Pesticides Handbook. Essential Oils for Pest Control. ISBN: 13: 978-1-4987-5938-0, 2017).
  • the present invention overcomes the limitations existing in the state of the art. It consists in the development of new biopesticidal compositions that can be used in the phytosanitary treatment of fly pests, mainly of the whitefly complex (Hemiptera: Aleyrodidae).
  • the biopesticidal compositions of the invention are at the same time easily obtainable, scalable and effective; equaling and / or exceeding the efficacy of chemical synthesis products and / or products of natural origin currently used in conventional and organic agricultural systems.
  • they have the advantage of attenuating the development of cross-resistance, not presenting phytotoxicity and being respectful with the environment.
  • Conventional insecticides contain one or two active molecules obtained by chemical synthesis and generally belonging to the same chemical group or closely related groups. These molecules affect in a very specific way a single point of action (target site) of the target. This specificity of action on a common receptor is the main cause of the appearance of cross-resistance with the consequent loss of efficacy (IRAC, 2019; https://bit.ly/33t9FF8). Likewise, most of the natural solutions on the market come from plant extracts where those containing between 3-5 active molecules predominate, with the consequent risk of resistance development.
  • compositions claimed in this invention have a complex chemical composition. They have in common a synergistic bioactive nucleus made up of active molecules belonging to widely divergent chemical classes. Said complexity is directly associated with the multifunctionality of the formulation in terms of modes of action and overall efficacy. Chemically different molecules can affect the same mode of action (eg, repellency) by acting on different receptors (sites of action). In these cases, the risk of developing cross-resistance is almost nil.
  • the formulations contain secondary plant metabolites that normally exist in nature and exhibit a rapid degradation rate.
  • Requiem® (Bayer): Contains approximately 25% of Chenopodium ambrosioides extract components, specifically a mixture of ⁇ -terpinene, p-cymene and limonene.
  • Pre-VAM® (Oro Agri SA. Ltd.): Contains between 6-10% orange oil (Orange oil) with a limonene content greater than 90%.
  • Pirecris® (SEIPASA): Contains 2% natural pyrethrins.
  • Agroneem TM (Ajay Bio Tech India Limited Body Join). It contains azadirachtin, the main component of Neem oil (Azadirachta indica).
  • compositions disclosed in the present invention have clear advantages over such formulations as regards:
  • Table 1 shows a comparison of the advantages of the disclosed compositions compared to formulations of a similar nature.
  • Pre-VAM® (Oro Agri SA. Ltd.) is a natural formulation composed of orange oil and approved for use as a phytosanitary in the USA, Canada, Europe and other countries. Despite its effectiveness, it has several disadvantages compared to the compositions claimed in this invention. The majority presence in its composition of a single ingredient (more than 95% d-limonene) with a proposed mechanism of action, increases the risk of the appearance of resistance. Furthermore, the high volatility and instability of orange oil make its application difficult in open field conditions (Green Pesticides Handbook. Essential oil for pest control. Chapter 15. Orange oil.
  • Biopesticidal compositions or biopesticidal compositions or phytosanitary compositions are terms that are used interchangeably herein. They can be defined as any biological entity, living or of natural origin, including by-products and / or chemical substances derived from them; that controls / regulates everything that we call plague and / or plant disease.
  • essential oils, oleoresins, aqueous, alcoholic or hydroalcoholic extracts are products obtained from the root or rhizomes of Zingiberoff ⁇ cinale Roscoe. These products can be crude products as they are obtained from their extraction process or they can be fractions thereof that can be obtained by a fractionation directed by chromatographic methods, liquid-liquid separation, evaporation, crystallization or distillation. Furthermore, these products can be pure substances or mixtures of substances.
  • Source of cinnamaldehyde herein includes any mixture of compounds which includes cinnamaldehyde or from which cinnamaldehyde can be obtained.
  • bioactive core equates to "first component”.
  • active elements equates to “active ingredients”.
  • encapsulating agent equates to "encapsulating matrix.”
  • Fluid application broth or solution refers to the dilute biopesticidal composition ready for application.
  • Additional substances and coformulants are terms that are used interchangeably herein. They refer to inert substances that can be part of the pesticidal composition and whose objective is to increase its effectiveness. Examples of these substances are adjuvants, dispersing agents, penetrating agents, emulsifiers, stabilizers, flavors, antifoams and / or preservatives.
  • Pure compounds refers to any natural compound that acts as a second active component in the biopesticide composition and that can be obtained by a synthetic process, as part of a semi-purified fraction or isolated in its pure state from natural sources that contain it.
  • the technical problem solved by the present invention is the development of biopesticidal compositions used in the phytosanitary treatment of pests included in the group of whiteflies.
  • the compositions comprise a bioactive core (consisting of an essential oil, oleoresin, aqueous, alcoholic or hydroalcoholic extract of the root or rhizomes of Zingiber officinale and cinnamaldehyde or a source of cinnamaldehyde).
  • a bioactive core consisting of an essential oil, oleoresin, aqueous, alcoholic or hydroalcoholic extract of the root or rhizomes of Zingiber officinale and cinnamaldehyde or a source of cinnamaldehyde.
  • the present invention discloses a biopesticidal composition
  • a biopesticidal composition comprising a synergistic bioactive core formed by: essential oil, oleoresin, aqueous, alcoholic or hydroalcoholic extract of the root or rhizomes of Zingiber officinale Roscoe and - cinnamaldehyde or a source of cinnamaldehyde.
  • the concentration,% w / w (% w / w) of each component in the bioactive nucleus is in the following ranges: essential oil, oleoresin, aqueous, alcoholic or hydroalcoholic extract from the root or rhizomes of Zingiber officinale Roscoe: 0, 1-99.9% (w / w), preferably 10-90% (w / w), more preferably 20-80% (w / w), still more preferably 30-70% (w / w) and more preferably 40-60% (w / w) and cinnamaldehyde or a cinnamaldehyde source: 0.1-99, 9% (w / w), preferably 10-90% (w / w), more preferably 20-80% (w / w), even more preferably 30-70% (w / w) and more preferably 40-60% (p / p).
  • Cinnamaldehyde can be the trans isomer, cis or the mixture of isomers.
  • Cinnamaldehyde as a component of the bioactive core is obtained as:
  • the source of cinnamaldehyde as a component of the bioactive core can be extracts / essential oils of plant species that contain it, preferably of the genus Cinnamomum sp.
  • Significant examples of species of this genus that contain cinnamaldehyde are: C. verum. (synonymy Cinnamomum zeylanicum), C. cassia, C. lourestory, C. burmannii, C. tamala, C. osmophloeum, C. bejolghota, C. dubium, C. rivulomm, C. citriodomm and C. camphora.
  • the cinnamaldehyde and / or the cinnamaldehyde source can be used in free form and / or encapsulated in an encapsulating agent.
  • the encapsulating agent can be selected from: maltodextrins, cyclodextrins, lecithins, vegetable oils and / or silica excipients, the latter comprising silica gel (silica gel), colloidal silica and silicon dioxides, preferably cyclodextrins are used.
  • the encapsulated form of the cinnamaldehyde source increases its biological activity and favors the controlled release of the active ingredient or element.
  • the biopesticidal compositions further comprise a second component.
  • This second component can be one or more elements or active ingredients.
  • the active ingredient as the second component can be selected from one or more of: botanical extracts or fractions of the extracts, extract obtained from fermented microorganisms or fractions of said extracts, pure compounds selected from geranial (citral A), neral (citral B ), saponins, benzyl alcohol, benzyl benzoate, benzyl acetate, eugenol, 1,8-cineole, thymol, geraniol, geranyl acetate and fatty acids, selected from: saturated short and long chain, preferably long chain and unsaturated and fatty acid derivatives (eg methylated, fatty acid methyl esters, FAME, “fatty acid methyl ester”) more preferably long chain saturated fatty acids and / or unsaturated fatty acids and lecithin, preferably from egg, sunflower, rapes
  • the botanical extract can be selected from: aqueous, alcoholic and hydroalcoholic extracts and / or essential oils.
  • the origin of the botanical extract can be selected from agroindustrial residues, bulbs, seeds, leaves, follicles, flowers and / or complete aerial part from plants belonging to the following genera: Allium sp., Angelica sp., Annona sp., Artemisia sp., Camm sp., Cass / a sp., Chenopodium sp., Citrus sp., Coffea sp., Crccus sp., Turmeric sp., Cyamopsis sp., Cymbopogon sp., Cytisus sp., Eucalyptus sp., Eurycoma sp., Ficus sp., Foeniculum sp., Fumaria sp., Geranium sp., Ginkgo sp., Helianthus sp., Hyssopus sp., Jatropha sp., Lavandula
  • Ocimum sp. Olea sp., Papa ver sp., Pelargononium sp., Persea sp., Petroselinum sp., Pimpinella sp., Prunus sp., Quassia sp., Retama sp., Rheum sp., Rosmarinus sp., Salvia sp., Satureja sp., Schoenocaulon sp., Syzygium sp., Trigonella sp., Thymus sp.
  • Vitis sp. preferably the species: Allium sativum, Angelica archangelica, Annona cherimola, Artemisia absinthium, Camm carvi, Cassia angustifolia, Cassia senna, Chenopodium ambmsioides, Citrus aurantium, Citrus lemon, Citms sinensis, Coffea arabica, Crocus corsivus, Crocus , Crocus speciosus, Crocus vemus, Aromatic turmeric, Turmeric loriga, Cymbopogon citratus, Cyamopsis tetragonoloba, Cymbopogon flexuosus, Cymbopogon martinii, Cymbopogon nardus, Cytisus scoparius, Eucalyptus camaldulensis, Eucalyptus, Eucalyptus globulis, Eucalyptus globulisinalia, Eucalyptus
  • Pinpinella anisum Pinpinella anisum
  • Prunus tigrsica Quassia amara
  • Retama monosperma Retama monosperma
  • Rheum rhabarbarum Rheum officinale
  • Rosmarinus officinalis Rosmarinus officinalis
  • Salvia lavandulifolia Salvia off ⁇ cinalis
  • Satureja montana Schoenocaulon officinale
  • Syzygium aromaticum Trigonella foenum-graecum
  • Thymus vulgaris Thymus zygis and Vitis vinifera.
  • Microorganism ferments refer to the fermentation extract or liquid (pure or previously extracted with an organic solvent) resulting from the fermentation process of a microorganism (fungus or bacteria) in the presence of a plant substrate and once the living microorganism has been eliminated by means of a pasteurization process.
  • the extract obtained from the ferment of microorganisms can be selected from extracts obtained from the fermentation of a substrate with Bacillus sp., Pseudomonas sp., Trichoderma sp., Corynebacterium sp. and Aspergillus sp, preferably: Aspergillus niger, Trichoderma harzianum, Bacillus thuringiensis, Pseudomonas fluorescens, Bacillus amyloliquefaciens, Corynebacterium eff ⁇ ciens and Bacillus subtilis.
  • the fermentation substrate can be chosen from agro-industrial residues, bulbs, seeds, leaves, follicles, flowers and / or complete aerial part from plants belonging to the following genera: Zingiber sp., Citrus sp., Cyamopsis sp., Crocus sp. ., Helianthus sp., Petroselinum sp., Papaver sp., Rheum sp., Salvia sp., Retama sp., Lavandula sp., Prunus sp., Persea sp., Turmeric sp. and Thymus sp, preferably: Agaricus bisporus, Cyamopsis tetragonoloba, Helianthus annus, Citrus x sinensis and Glycine max.
  • the pure compounds can be obtained from one (s) of the following sources: for the citral, geranial and neral isomers, the species included in the genera Cymbopogon sp. [ex. C. citratus, C. martinii, C. flexuosus, C. winterianus, C. nardus), among others], Litsea sp. (eg L cubeba, L citrate., among others), Aloysia sp. (eg A. citrodora, among others), Odmun sp. (eg O. gratissimum, among others), Melissa sp. (eg M. off ⁇ cinalis, among others) and Citrus sp.
  • Cymbopogon sp. eg L cubeba, L citrate., among others
  • Aloysia sp. eg A. citrodora, among others
  • Odmun sp. eg O. gratissimum,
  • Cinnamomum sp. for eugenol those included in the genus Cinnamomum sp. [ex. C. verum (syn., Cinnamomum zeylanicum), C. cassia, C. citriodorum, C. camphora, among others], Syzygium sp. (eg S. aromaticum, among others), Turmeric sp. (eg C. longa, among others), Zingiber sp. (eg Z. officinale, among others) and Ocimum sp. (eg O. tenuif ⁇ orum, among others), for saponins the species included in the genera Cyamopsis sp. (eg C. verum (syn., Cinnamomum zeylanicum), C. cassia, C. citriodorum, C. camphora, among others], Syzygium sp. (eg S. aromaticum, among others), Turmeric sp. (e
  • Quillaja sp. eg Q. saponaria, among others
  • Trigonella sp. eg T. foenum-graceum, among others
  • Saponaria sp. S. off ⁇ cinalis, among others
  • Crocus sp. eg C. sativus, among others
  • Yucca sp. eg Y. schidigera, among others
  • Beta sp. ex.
  • B. vulgaris, among others Hederá sp. (eg H. helix, among others), Polygala sp. and Primrose sp.
  • benzyl alcohol those included in the genera Cinnamomum sp. (eg C. cassia) and Jasminum sp. (eg J. grandiflorum, among others), for 1.8 cineole (Eucalyptol) the species included in the genera Eucalyptus sp. (eg E. globulus, E. camaldulensis, among others), Salvia sp. (eg S. officinalis, S. fructicosa, among others), Thymus sp. (eg T. vulgaris, T. zlgys, T. capitatus, among others), Turmeric sp. (ex.
  • Rosmarinus sp. eg R. officinalis, among others
  • Artemisia sp. eg A. vulgaris, among others
  • Cymbopogon sp. eg C. citratus, C. martini, C. flexuosus, C. winterianus, C. nardus, among others
  • Geranium sp. G. pretense, G. macrorrhizum, among others
  • Pelargonium sp. eg P.
  • hirsutum, among others for fatty acids are the species included in the genera Persea sp. (eg P. americana, among others), Glycine sp. (eg G. max, among others), Helianthus sp. (eg H. annuus, among others), Olea sp. (eg Olea europaea) and other oilseeds, total synthesis, semisynthesis or biomimetic synthesis of the pure compound and / or analogues by means of structure activity relationship studies (SAR) and
  • filamentous fungi such as Aspergillus sp., bacteria and insects in biotransformation and / or bioconversion processes.
  • Lecithin is selected from:
  • the second component can be used in free or encapsulated form.
  • the concentration of the second component in the biopesticidal composition is combined with the bioactive core, in the following concentration range, weight / total volume of the composition: 1-30% (w / v), preferably 5-25% (w / v) and even more preferably 10-20% (w / v).
  • the biopesticidal compositions can also comprise at least one inert substance that can be selected from: adjuvants, emulsifiers, dispersants, flavorings, preservatives, defoamers, thixotropic agents, encapsulation matrices, fatty acids, phospholipids, and mixtures thereof.
  • the adjuvants can be organosilicon compounds from the group of organosiloxanes.
  • Thixotropic agents can be carboxymethyl cellulose, sodium carboxymethyl cellulose, microcrystalline cellulose and other cellulose derivatives, preferably rubber and gel.
  • the encapsulation matrices can be selected from: maltodextrins, ci el od extrins, lecithins, vegetable oils and / or silica excipients, the latter comprising silica gel (silica gel), colloidal silica and silicon dioxides, preferably cyclodextrins are used.
  • the biopesticidal composition comprises the bioactive core, lecithin and optionally other substances mentioned as second components and / or inert substances.
  • the biopesticidal composition is selected from the biopesticidal compositions that comprise:
  • the present invention also relates to a final application broth or solution comprising the biopesticidal composition defined above diluted with a solvent, preferably aqueous and more preferably water.
  • the concentration of each component of the bioactive core in the final application broth is in the range: essential oil, oleoresin, aqueous, alcoholic or hydroalcoholic extract of the root or rhizomes of Zingiber officinale Roscoe: 0.01-0.99% (p / v), preferably 0.05-0.95% (w / v), preferably 0.1-0.9% (w / v), more preferably 0.2-0.8% (w / v), even more preferably 0.3-0.7% (w / v) and more preferably 0.4-0.6% (w / v) and cinnamaldehyde or a source of cinnamaldehyde: 0.01-0.99% (p / v), preferably 0.05-0.95% (w / v), preferably 0.1-0.9% (w / v), more preferably 0.2-0.8% (w / v), even more preferably 0.3-0.7% (w / v) and more preferably 0.4-0.6% (w / v).
  • the selected plant species present great biodiversity and sustainability in cultivation, guaranteeing the availability of the starting material.
  • obtaining the extract, as a component of some biopesticidal compositions constitutes an alternative to the recovery of a plant material with very little or no commercial value and that is managed as waste in the processing of the agri-food industry.
  • the optimized extraction and formulation process disclosed is clean, fast, efficient and easily scalable, which results in a reduction in the final cost of the product in the market.
  • An additional object of the invention constitutes the process for obtaining the biopesticidal composition of the invention, which comprises the mixture in an aqueous medium of the components of the bioactive core:
  • the essential oil, oleoresin, aqueous, alcoholic or hydroalcoholic extract of Zingiber officinale Roscoe can be obtained by maceration, percolation, decoction, infusion, hydrodistillation- Clevenger; extraction assisted by ultrasound, by microwaves, by supercritical fluids; Soxhlet type extraction, extrusion, steam distillation (direct, indirect, through pressure and / or vacuum) or solvent extraction (hot or cold) and preferably in a multifunctional dispersion system with a colloid mill.
  • the source of cinnamaldehyde can be obtained by distilling a species of those indicated above that contains it. Cinnamaldehyde can be encapsulated prior to the formation of the bioactive core.
  • the biopesticidal compositions are obtained from the ordered mixture and in specific proportions, of the synergistic bioactive core, at least one secondary component and / or at least one inert substance. They are subsequently added to the mixture, in an orderly manner, and with a stirring period after the addition of each component.
  • the mixing of the components of the bioactive core is carried out at a speed in the range between 500 and 4000 rpm, preferably between 1500 and 3000 rpm.
  • the mixture is carried out in an aqueous medium.
  • the temperature of the mixture is between 20 and 40 ° C, preferably between 24 and 35 ° C and for a period between 30 and 120 minutes, preferably 40 and 100 minutes.
  • the process for preparing the biopesticidal compositions can be carried out in the apparatus or reactors commonly used to carry out these tasks in the technical field.
  • a further object of the invention constitutes the use of biopesticidal compositions for the control of fly pests.
  • whiteflies preferably those belonging to the genera Bemisia sp. "Complex" (biotypes), Dialeurodes sp., Trialeurodes sp. Encarsia sp., Aleurolobus sp., Aleurothr ⁇ xus sp., Aleurodicus sp., Aleyrodes sp., Parabemisia sp., Paraleyrodes sp., Orchamoplatus sp., Siphoninus sp. and Tetraleurodes sp.
  • Complex biotypes
  • Dialeurodes sp. Trialeurodes sp. Encarsia sp.
  • Aleurolobus sp. Aleurothr ⁇ xus sp.
  • Aleurodicus sp. Aleurodicus sp.
  • Aleyrodes sp. Parabemisia sp.
  • the elements of the biopesticidal compositions act in a synergistic, additive, polyvalent and / or potentiating way.
  • Biopesticides have a prolonged effect through a controlled release mechanism.
  • the biopesticidal composition can be used:
  • biopesticides can be applied individually or in combination with other phytosanitary products or pest and disease control systems.
  • phytosanitary products or pest control systems we mean any type of insecticides, nematicides, acaricides, fungicides, bactericides, herbicides, plant growth regulators, elicitors, fertilizers, soil conditioners, and baits, among others.
  • the application of the biopesticide composition can be by foliar spraying.
  • the applications of the biopesticidal compositions are carried out in agricultural crops for food and non-food use, be it conventional, organic or ecological agriculture, preferably in horticultural, extensive and ornamental crops and gardening, as well as parks and sports facilities.
  • the applications are made in greenhouses and in open fields, as well as gardens and green areas of sports and recreational facilities.
  • the dose of the biopesticide composition can increase or decrease according to the type of formulation, type and intensity of attack of the pest to be controlled, cultivation and country of use.
  • Mode of action refers to the specific physical and / or biochemical interaction through which a biopesticide produces its effect.
  • microassays in vitro and in vivo developed and / or adapted from the scientific literature were used (for example, choice vs. non-choice tests, direct spraying, ingestion toxicity, bioassay with Y-tube olfactometer, priming bioassays, microscopy, etc.).
  • the following bioassays are preferably performed:
  • Settling inhibition tests The objective is to evaluate the effect of different doses of the substance on the behavior (settlement) of fly adults. White. It is based on the flies' preference for treated and untreated plants located in the same entomological box (choice trials) or in different (no choice).
  • Oviposition inhibition tests The objective is to evaluate the effect of different doses of the substance on the egg laying of adult whiteflies. It is based on the flies' preference for ovipositing on treated and untreated plant surfaces located in the same entomological box (choice trials) or in different (no choice).
  • Spatial repellency tests The objective is to measure the ability of the substance to inhibit the preference of whitefly adults for its host plant (olfactometer tests).
  • Mode of action 1 Direct contact ("knock down” effect).
  • the mechanisms of action involved in this mode of action are:
  • Mode of action 2 Action on the olfactory and taste receptors of the fly.
  • the mechanisms of action involved in this mode of action are:
  • Anti-food effect Inhibition of feeding through the interaction of the components of the formula with the taste receptors.
  • Repellent effect Strong repellent effect through the controlled release of encapsulated volatile components and their interaction with olfactory receptors.
  • Inhibition of oviposition It considerably reduces the laying of eggs through the interaction of the components of the formula with the chemoreceptors of the adult.
  • the mechanisms and modes of action of each of the elements of the bioactive nucleus are summarized in Table 2.
  • the ingredients of the bioactive core have a complex chemical composition associated with a great multifunctionality in terms of mechanisms of action.
  • the combination of the proposed mechanisms of action determine the efficacy of the bioactive core and minimize the risk of cross-resistance. This efficacy is enhanced with the addition of at least one second active component, as well as inert coformulants (substances) that contribute to increasing the stability of the formulation and favor the controlled release of the active ingredients.
  • Figure 2 Diagram of the steam distillation process.
  • Figure 3 Flow diagram of the fermentation process.
  • Figure 4 Scheme of a biodirected chemical fractionation.
  • Figure 5 Design of an in vitro contact mortality test.
  • Figure 6 Microscopic observation of whitefly adults in contact mortality tests. A: destabilization of cell membranes, B: blockage of tracheal spiracles (asphyxia).
  • Figure 7 “Y” olfactometer designed for spatial repellency tests.
  • Figure 8 Experimental design of the in planta feeding inhibition tests.
  • Figure 9 Isobolographic analysis of the interaction between the bioactive core components.
  • FIG. 10 Chromatogram (GC-MS-MS) of the essential oil of Cinnamomum zeylanicum pure (A) and encapsulated (B).
  • Figure 11 Dose-response curve of bioactive core elements for contact mortality (% M).
  • Figure 12 Dose-response curve of bioactive core elements for settlement inhibition (% SI).
  • Figure 13 Dose-response curve of the elements of the bioactive nucleus for the inhibition of egg laying (% IO).
  • Figure 14 Gibbs Triangle Methodology for the study of synergistic, potentiating and / or cooperative mixtures.
  • the upper triangle shows the number of synergistic combinations generated between components A, B and C.
  • the lower triangle represents the proportion of each of the ingredients A, B and C in the combination.
  • Figure 15 Experimental design and distribution of experimental and sample plots in the test of the composition WF_F4 against whitefly in eggplant.
  • bioactive nucleus comprises 10.5% of hydroalcoholic extract of roots / rhizomes of Zingiberoff ⁇ cinale and 15% of essential oil of Cinnamomum verum J. Presl. (syn., C. zeylanicum Blume), as a source of cinnamaldehyde (CAS 8015-91-6) in water.
  • the essential oil can be incorporated freely (as 100% essential oil) and / or partially or totally encapsulated with an encapsulating agent.
  • the encapsulating agent is ⁇ -cyclodextrin.
  • the mixing of the elements of the bioactive core is carried out in a stainless steel reactor ( Figure 1) with a total capacity of 650 liters and a useful capacity of 560 liters. It is equipped with a double jacket through which a heat exchanger fluid circulates to control the temperature inside the tank through a PT100 sensor.
  • the reactor is equipped with two stirrers: a central disk stirrer type cowles (maximum speed 1500 rpm) and a high speed emulsifier (3000 rpm, ultra-turrax type) located at the bottom of the reactor. Both agitators are independently controlled to achieve specific speed and rotation control for each ingredient and moment during the mixing process.
  • the reactor is connected to a vacuum pump that is used to eliminate air bubbles that form in the product and prevent the formation of gas-liquid interfaces. It also presents an inert gas injection system to avoid work in the presence of oxygen and thus avoid oxidative processes. Finally, the reactor has a CIP (“cleaning in place”) type cleaning system for automatic cleaning.
  • CIP cleaning in place
  • Each biopesticide composition is formulated according to a specific mixing order according to the nature of the active elements and coformulants that compose it.
  • the elements of the bioactive core are used in the final composition in two ways:
  • the procedure consists of the following general stages: a. Selection of raw materials ⁇ Active elements
  • Table 3 includes several examples of biopesticidal compositions disclosed within the framework of this patent.
  • An example of the procedure for obtaining each of the variants is detailed below. This process is extensive for the rest of the compositions that are listed in Table 3 (MxM14, MxM15, MxM22, MxM19, MxM12, MxM16 and MxM25).
  • composition M1 a biopesticidal composition
  • bioactive nucleus 7.5% of hydroalcoholic extract of Z officinale and 10% of essential oil of C. verum as a source of cinnamaldehyde
  • 17.5 % soy lecithin CAS: 8002-43-5
  • Biopesticidal composition formed by the bioactive nucleus and extract of Persea americana as the second component.
  • the bioactive nucleus (7.5% of hydroalcoholic extract of Z officinale and 5% of Cinnamaldehyde (CAS 104-55-2), as a source of cinnamaldehyde) are mixed with 20% of hydroalcoholic extract of Persea americana (second component), to form composition M2 (Table 3).
  • Biopesticidal composition formed by the bioactive nucleus + inert substances.
  • the bioactive nucleus (12.5% of hydroalcoholic extract of Z officinale and 12.5% of essential oil of C. verum, as a source of cinnamaldehyde) are mixed with a 10% of a silicone derivative of the organosiloxane type (adjuvant), to form the composition M3 (Table 3).
  • composition M4 a biopesticidal composition
  • bioactive nucleus 1% of hydroalcoholic extract of Z officinaie and 12.5% of essential oil of C. verum, as a source of cinnamaldehyde
  • composition M4 Second components
  • Biopesticidal composition formed by the bioactive core, soy lecithin, inert substances and / or a second active component.
  • the bioactive core (7.5% hydroalcoholic extract of Z. off ⁇ cinale and 16.0% essential oil of C. verum, as a source of cinnamaldehyde) are mixed with 17.5% lecithin soybean (second component with emulsifier and enhancer function), 13% of an organosilicon adjuvant and 10% of a polymeric adjuvant that acts as a dispersing agent.
  • lecithin soybean second component with emulsifier and enhancer function
  • 13% of an organosilicon adjuvant 13%
  • 10% of a polymeric adjuvant that acts as a dispersing agent 13% of the essential oil of C. verum is added in free form
  • 3% of the essential oil of C. verum is added encapsulated in 10% of ⁇ -cyclodextrin to form the composition WF_F4 y (Table 3 ).
  • bioactive nucleus 7 of hydroalcoholic extract of Z. officinale and 2.5% of essential oil of C. cassia, as a source of cinnamaldehyde
  • bioactive nucleus 7 of hydroalcoholic extract of Z. officinale and 2.5% of essential oil of C. cassia, as a source of cinnamaldehyde
  • hydroalcoholic extract of Persea americana 10% Cymbopogon citratus essential oil
  • soy lecithin second component with emulsifier and enhancer function
  • the extract of P. americana and essential oil of C. citratus are also considered as second components.
  • the bioactive core 3% hydroalcoholic extract of Z. officinale and 2.5% essential oil of C. verum, as a source of cinnamaldehyde
  • the bioactive core 3% hydroalcoholic extract of Z. officinale and 2.5% essential oil of C. verum, as a source of cinnamaldehyde
  • 7% hydroalcoholic extract of Persea americana 47.7% Aspergillus niger ferment, 17.5% soy lecithin and inert substances.
  • the extract of P. americana and the fermentation product of Aspergillus and the lecithin are considered as second components.
  • the elements of the bioactive core, second components, and the rest of the inert substances are carefully added in a certain order, adjusting the temperature and rotation variables of each stirrer as detailed. in Table 11.
  • composition MxM5 In an example of a biopesticidal composition, the bioactive nucleus (1% of hydroalcoholic extract of Z. officinale and 0.5% of essential oil of C. verum, as a source of cinnamaldehyde) are mixed with 12.5% of citral , 20% benzyl benzoate, 17.5% soy lecithin (enhancing emulsifier) and inert substances. In this particular case, the pure compounds citral and benzyl benzoate are considered second components. Taking into account the characteristics of the reactor described in example 1, the elements of the bioactive core, the second components, and the inert substances are carefully added in a certain order, adjusting the temperature and rotation variables of each stirrer as detailed in the Table 12. Example 3. Methodology for obtaining the second components
  • the plant material described in Example 2 is subjected to different extraction processes to obtain the second components, both those that make up the bioactive core and those that are used as the second component.
  • Aqueous, alcoholic and / or hydroalcoholic extracts For the aqueous extraction, water is used. In the case of alcoholic extraction, an extraction with solvents is used, preferably ethanol, isopropanol or alcohol. benzylic.
  • the extraction method is chosen between maceration (cold or hot, standing or stirred), infusion, percolation, decoction, reflux, ultrasound, microwave, Soxhlet and, preferably, an extraction using an advanced technology of multifunctional dispersion with a colloid mill, whose working principle is a rotor / stator system.
  • the chemical profiles of the extracts are determined by Gas Chromatography coupled to Mass Spectrometry (GC-MS-MS) and Liquid Chromatography coupled to Mass Spectrometry (LC-MS-MS).
  • the oils are obtained by hydrodistillation, maceration in apolar solvents (eg acetone, hexane, dichloromethane, petroleum ether), extraction using supercritical fluids and preferably by steam distillation according to the methodologies described in the European Pharmacopoeia (Ph. Eur. 8.0, 2013, ISBN: 978-92-871- 7525-0, 3513 pp.) Under the UNE EN ISO 9001: 215 certification.
  • the chemical profiles of essential oils are determined by Gas Chromatography coupled to Mass Spectrometry (GC -MS). A typical diagram of the steam distillation process is shown in Figure 2.
  • the solid dry citrus residues (peels, peels, pulp), the original plant material selected from those mentioned in examples 1-2 and / or residues from the extraction process of these are subjected to a fermentation process and subsequent extraction.
  • the raw material in a percentage between 10-15%, is incubated in water with one of the different selected microorganisms (Bacillus sp., Pseudomonas sp., Trichoderma sp. And Aspergillus sp.) For 120h at 28 ° C. -30 ° C in a F3-100 thermistor (Bionet, Murcia, Spain).
  • the mixture is pumped (by vacuum) to a sieve (42 microns) that separates the solid particles from the liquid.
  • the liquid part is stored and used for new encapsulation processes and / or as water in the formulation processes.
  • the solids are spread on 1 cm thick stainless steel trays and dried at a controlled temperature of 35 ° C for another 24 hours until reaching a humidity of 12%, being ready to use in the formulation process of the biopesticidal compositions.
  • the preparation of the final application broth or solution is carried out by diluting the claimed biopesticidal composition in at least one solvent, preferably water.
  • the amount of diluent and amount of dilution depends on the type of culture, volume of broth required, species of fly, and the level of infestation / damage at the time of application.
  • the application broth will be made by following the following steps: • Condition the pH (5-7) and the hardness of the water (soft).
  • premix • Perform a premix in a determined volume of solvent (eg 1/3 of the deposit) of the product (s) that make up the formulation. In the case of more than one product, the solid formulations are added first and then the liquid ones.
  • the premixes will be made under agitation according to the specifications and characteristics of each tank for the preparation of the broth owned by the end user. The duration of the premix will depend on the conditions of each user and the number of elements that make up the final broth.
  • the disclosed biopesticidal compositions are diluted in a range of 50 to 10,000 times. Examples of dilutions of the preparations shown in Examples 1 and 2 are shown below.
  • Example 1 shows an example of a biopesticidal composition (see composition M0, Table 3) that only contains the bioactive core.
  • Table 13 shows some examples of the final concentration of the elements in the final broth when applying different dilution factors.
  • Example 2 shows different examples of biopesticidal compositions comprising the bloactive core.
  • biopesticidal composition M1 (Table 3, Example 2.1) which contains the bloactive nucleus and the lecithin.
  • Table 14 shows some examples of the final concentration of the elements in the final broth when applying different dilution factors.
  • biopesticidal composition M2 (Table 3, Example 2.2) which contains the bloactive core and a second component.
  • Table 15 shows some examples of the final concentration of the elements in the final broth when applying different dilution factors.
  • biopesticidal composition M3 (Table 3, Example 2.3) which contains the bloactive nucleus and inert substances.
  • Table 16 shows some examples of the final concentration of the elements in the final broth by applying different dilution factors.
  • biopesticidal composition M4 (Table 3, Example 2.4) containing the bioactive core and two second components.
  • Table 17 shows some examples of the final concentration of the elements in the final broth when applying different dilution factors.
  • biopesticidal composition WF_F4 (Table 3, Example 2.5.1) which contains the bioactive core, soy lecithin and inert substances.
  • Table 18 shows some examples of the final concentration of the elements in the final broth when applying different dilution factors.
  • biopesticidal composition ADI-23 (Table 3, Example 2.5.2) that contains the bioactive core, three other second components, and inert substances.
  • Table 19 shows some examples of the final concentration of the elements in the final broth when applying different dilution factors.
  • biopesticidal composition PW-1.5 (Table 3, Example 2.5.3) that contains the bioactive nucleus, three other active elements (one of them is derived from a fermentation process), and inert substances.
  • Table 20 shows some examples of the final concentration of the elements in the final broth when applying different dilution factors.
  • Example of dilutions of the composition ADI-23 (bioactive core + 3 second components + inert substances) Table 20.
  • Example of dilutions of the composition PW-1.5 (bioactive core + 3 second components + inert substances)
  • biopesticidal composition MxM5 (Table 3, Example 2.5.4) that contains the bioactive core, two second components (pure compounds and soy lecithin) and inert substances.
  • Table 21 shows some examples of the final concentration of the elements in the final broth when applying different dilution factors.
  • Example 6 General protocols for laboratory tests
  • the pest species that were used as biological targets to perform most of the efficacy trials and mechanisms of action are detailed in Table 22.
  • the targets were selected taking into account the economic importance of their incidence on horticultural crops, the development of resistance to synthetic insecticides, their capacity transmission of viruses, as well as their widespread use as study models for the management of related pests belonging to the group of whiteflies.
  • test protocols were developed in order to discriminate between the different modes and mechanisms of action of the tested substances.
  • the bioactive nucleus Zingiber off ⁇ cinale + cinnamaldehyde source
  • the different biopesticidal compositions object of this invention were evaluated in efficacy tests against pests selected. For them, in vitro tests were carried out in petri dishes and in vivo using reproducible plant models.
  • the essays are divided into three large groups:
  • Effect on the behavior of the fly They determine the effect on the control of the whitefly of a product in the medium and long term (24h-7 days) through the interaction with the receptors of taste and smell.
  • Antifeedant effects (antifeedants, deterrents):
  • the objective of the trial is to evaluate the effect of different doses of the substance to be tested on the mortality of adult whitefly, by topical application.
  • the test is carried out in plastic jars with a screw cap 10 cm high and 5 cm in diameter.
  • a 2 cm 2 hole is drilled in the center of the lid and covered with a fine cloth with a pore length of 0.77 x 0.27 mm (longitudinal: transverse).
  • a leaf disk (5.7 cm 2 ) is cut from the host plant (Phaseolus vuigaris) and placed (bundle down) on the bottom of the pot previously coated with a 1 cm thick layer of agar (12 % in water p / v) that, in addition to support, provides the necessary humidity to the disc during the duration of the test (24 hours).
  • Figure 5 In each boat 15 adult individuals previously captured with an entomological aspirator are introduced (Figure 5).
  • the jar with the flies is incubated for one minute at 4 ° C in order to momentarily decrease the mobility of the pest and facilitate its settlement on the disk at the base of the jar.
  • the substance to be treated bioactive core, biopesticide composition, reference products
  • the cans are kept in a heated chamber with the same conditions described for fly breeding.
  • Each adult mortality trial consists of 20 cans (replicas) for each of the treatments and 20 cans (replicas) for the control (water). In turn, each of the trials is replicated 3 times in time.
  • the different combinations of the bioactive core (Table 3) are tested at an initial concentration between 0.01-0.5% of the application broth.
  • the biopesticidal compositions (Table 3) and reference products are applied in the recommended dose range (between 1-5 ml of formulation / Liter of water).
  • the number of live and dead flies is counted with the help of a stereoscopic magnifying glass.
  • the count is carried out serially at 2, 4, 6, 8, 16 and 24 hours after applying the treatment.
  • the fly is considered dead when it does not show any signs of mobility when touched with an entomological brush.
  • Mortality is expressed in% with respect to the control and the data were corrected using the Abbott formula: where,
  • Asphyxia is proposed as the primary mechanism of action.
  • biopesticidal compositions concentrations, organisms and more specific details used for each particular experiment are explained.
  • a Y-tube olfactometer with three arms (“arms”) is used as shown in Figure 7.
  • Two plastic cans with a 10 cm high screw cap were prepared. and 5 cm in diameter.
  • a 2 cm 2 hole is drilled in the center of the lid and covered with a fine cloth with a pore length of 0.77 x 0.27 mm (longitudinal: transverse).
  • a leaf disc (5.7 cm 2 ) is cut from the host plant (Phaseolus vulgaris) and placed (bundle down) on the bottom of the pot previously coated with a 1 cm thick layer of agar (12 % in water p / v) that, in addition to support, provides the necessary humidity to the disc during the duration of the test (24 hours).
  • one of the cans treated with the substance to be tested (biopesticide composition) to be tested was placed and in the other an identical can with a disc treated with water (control). Flies are released through the lower arm.
  • the experiment is incubated in climate-controlled walk-in chambers under the following environmental conditions: 22 ° C ⁇ 1 ° C, 60-70% relative humidity and a photoperiod of 16: 8 hours (light: dark).
  • 3 olfactometers were used that were considered as replicas. After 24h, the flies settled in the treatment and in the control were counted and the repellency index (% RI) was calculated for each substance tested using the following formula:
  • T Number of live flies within the treated chamber (settled on the treated disc and / or on the walls of the pot)
  • biopesticidal compositions concentrations, organisms and more specific details used for each particular experiment are explained.
  • One of the plants is treated with the solution to be tested (bioactive nucleus, biopesticide composition) and the other with water (control), with a portable diffuser; ensuring good product coverage on both sides of the sheet. Both plants (treated and control) are placed in the same entomological box. Subsequently, a pot with 100 adult whitefly individuals is placed at a point equidistant between the two plants, at the base of the box. In Figure 8 you can see the experimental design.
  • each repellency test consists of 5 boxes (replicas) for each of the variants analyzed. At the end of the test (24 hours) the number of living individuals settled in the treated and control plant is counted. In addition, the number of dead individuals is counted on both surfaces in the same way as in the mortality tests.
  • the settlement inhibition index (% SI) is calculated according to the following formula: where,
  • This test determines the effect of the different substances on the laying of adult pest eggs in treated and control host plants (Phaseolus vulgaris) placed in the same box (choice tests).
  • C number of eggs deposited in the control.
  • the data were analyzed using the Wilconxon multiple range nonparametric test (p ⁇ 0.05), using the IBM® SPSS Statistics® statistical package. Treatments with a percent inhibition of settlement (> 60%) were selected for dose-response studies. The dose at which 50% of the desired effect occurs (EC 50 ) was calculated using a probit regression analysis based on the log-dose pro bit.
  • Table 24 shows the insecticidal (mortality) and antifeedant (repellency and oviposition inhibition) activity of the claimed bioactive nucleus and its components against whitefly.
  • the efficacy results of the individual elements that make up the core are presented at two concentrations:
  • synergistic effect in the control of flies belonging to the group of whiteflies memory, repellency and inhibition of oviposition
  • synergy is defined from a mathematical point of view as the interaction between two or more components in a mixture in such a way that:
  • compositions that have different mechanisms of action.
  • the synergistic effects must be studied against a known mechanism of action assuming linearity in the response.
  • there are different applications of synergistic combinations in the field of phytomedicine Physicalmedicine, Vol. 8 (5), pp. 401-409. 2001
  • in pesticidal compositions Neth. J. PlantPath. 70, 1964; US005837652A, ES 2 153503 T3
  • the synergistic effect that is achieved in the mixture with respect to the individual components is manifested in two ways: Significant increase in activity for each of the individual mechanisms of action: mortality-repellency-oviposition.
  • E It is the expected percentage of effectiveness of the mixture of elements (A) and (B) at determined doses.
  • X It is the percentage of effectiveness of the ingredient (A) at a given dose.
  • Y It is the percentage of effectiveness of the ingredient (B) at a given dose.
  • Figure 9 shows the graph of ⁇ sobólas with the EC 50 values calculated from the observed values (dotted line) and the expected additive values (solid black line) for a series of combinations of the components that make up the synergistic core. (see values in Table 25).
  • the straight line connecting the EC 50 of the individual components contains all possible combinations between them that would produce an additive effect (isobole).
  • the points represent the experimental EC 50 of each of the combinations.
  • the interaction profile (A + B) can be observed where a concave curve appears (characteristic of synergy), indicating that with low doses of both compounds (with respect to the effective doses of the elements separately) a high mortality is obtained.
  • the observed value as represented in Table 23 is 74.3% mortality, significantly higher than the expected value, denoting the existence of a synergy.
  • the repellent activity is due to the presence of volatile compounds that interact with the chemoreceptors of flies. Due to their volatile nature, these compounds have a very short-term efficacy that is lost after hours. Furthermore, its low solubility in water and its tendency to oxidation with light make its formulation complex. The formation of complexes with cyclodextrins (encapsulation) is one of the most used technologies for the protection and controlled release of this type of substances.
  • biopesticidal compositions disclosed herein have at least one encapsulated component, ensuring controlled release of the active ingredient.
  • encapsulation has been carried out using the coprecipitation method due to its encapsulation efficiency (> 60%) and its ease of scaling.
  • b-cyclodextrin (W 7) was preferably selected as the matrix.
  • the process was carried out as detailed in Example 4. An encapsulation percentage of 80% was obtained. The encapsulation efficiency from the chemical point of view was followed by gas chromatography analysis coupled to mass spectrometry (GC-MS). In Figure 10 the chromatographic monitoring (GC-MS) of the process is shown. The encapsulation process favors the retention of some bioactive components of the extract and their controlled release.
  • Table 26 shows the activity of the free and encapsulated C. verum essential oil (taken as an example of cinnamaldehyde source) on the behavior (repellency and oviposition inhibition) of the whitefly (Bemisia tabaci).
  • Encapsulation with b-cyclodextrin (W 7) according to the methodology proposed in Example 4 presented the best results in efficacy and controlled release.
  • Example 11 Definition of the mechanisms of action attributed to the bioactive nucleus The objective of this example is to demonstrate the individual contribution of the elements to the mechanisms of action of the bioactive nucleus to achieve the final effect on the control of the whitefly.
  • Table 27 shows the insecticidal activity against whiteflies of different concentrations of the individual components of the bioactive nucleus (hydroalcoholic extract of roots / rhizomes of Z. off ⁇ cinale and essential oil of leaves of C. verum as a source of cinnamaldehyde) and the OM composition (biopesticidal composition formed by the bioactive nucleus, Table 3). effect, 95% confidence (lower, upper limit); * p ⁇ 0.05, Wilcoxon paired test; MO composition as detailed in Table 3.
  • Figures 11, 12 and 13 show the dose-response curves of the elements of the bioactive nucleus for contact mortality, inhibition of settlement and inhibition of oviposition, respectively.
  • the hydroalcoholic extract of Z officinale has a very marked contribution to the effect of contact mortality, while the essential oil of C. verum leaves (source of cinnamaldehyde) contributes more to the antifeedant effects (inhibition of settlement and oviposition inhibition), as summarized in Table 2.
  • lecithin as an activity enhancer of the biopesticidal composition and in particular of the bioactive core is disclosed.
  • Table 28 shows, by way of illustration and not limitation, the efficacy against whitefly of one of the combinations of the bioactive nucleus with the soy lecithin used in the biopesticidal compositions.
  • the combination "33" corresponds to the combination A + B + C in a ratio of 3: 3: 3 (see Gibbs triangle) that corresponds to the following concentrations in the application broth: A: 0.02%, B: 0.06% , C: 0.07%.
  • Table 29 shows the activity against whitefly of all biopesticidal compositions (Table 3) and reference products used as positive controls for comparative purposes. All the biopesticidal compositions have a high efficacy in the control of whitefly, statistically significant when compared with the control. The compositions show similar and / or superior efficacy to the reference products (chemical and natural) that currently exist on the market for the control of whitefly.
  • Table 30 shows the direct repellency effect of the bioactive core (MO composition of Table 3). The methodology used is detailed in Example 6.4. As can be seen, the bioactive nucleus shows a powerful repellent effect against whitefly adults.
  • Example 15 Effect of the composition WF_F4 on the population dynamics of whitefly in a greenhouse test 15.1. Background
  • Almer ⁇ a has the highest concentration of greenhouses worldwide and is one of the main horticultural suppliers in Europe.
  • the cultivation of aubergine represents around 5% of the greenhouse area in Almer ⁇ a.
  • Whiteflies (Bemicia tabaci and Trialeurodes vaporariorum) are considered the main pests that attack this crop.
  • the area selected for the test is considered representative for carrying out an efficacy test of this type.
  • Figure 15 shows a graphic representation of the design and spatial distribution of the experimental plots.
  • Application scheme Table 33 details the characteristics of the application. A single application was made.
  • Table 34 shows the efficacy variables and sampling times.
  • the data collection dates were the following:
  • DAA-1 08/07/19 (One day after application)
  • each sampling 4 plants were randomly selected and 3 leaves of each plant were sampled. The number of adults was determined by counting the live flies on both surfaces (upper side and underside) of the selected leaf. In the case of the eggs, from each leaf sampled, 2 cm 2 discs were taken and the eggs were counted with the help of a stereoscopic magnifying glass.
  • Ta Number of adults / eggs in treatment after application
  • Tb Number of adults / eggs in the treatment before application
  • Ca Number of adults / eggs in the control after application
  • Cb Number of adults / eggs in the control before application.
  • Tables 35 and 36 show the corrected efficacy of the WF_F4 composition and reference products on the number of adults and whitefly eggs, respectively.
  • the data obtained show a clear efficacy of the product in the control of whitefly.
  • the composition WF_F4 shows very significant levels of reduction in the number of whitefly adults and eggs up to 6 days after application.
  • the results obtained with the WF_F4 composition were clearly superior to the efficiencies of both the chemical and natural reference products.

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Agronomy & Crop Science (AREA)
  • Natural Medicines & Medicinal Plants (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pest Control & Pesticides (AREA)
  • Insects & Arthropods (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
  • Medicines Containing Plant Substances (AREA)
  • Cosmetics (AREA)
  • Catching Or Destruction (AREA)

Abstract

Una composición biopesticida que comprende un núcleo bioactivo sinérgico, formado por: aceite esencial, oleorresina, extracto acuoso, alcohólico o hidroalcohólico de raíz o rizomas de Zingiber officinale Roscoe y cinamaldehído o fuente de cinamaldehído. Dicha composición puede llevar al menos un componente secundario y/o sustancias inertes. La presente memoria también se refiere al procedimiento para la obtención de la misma, así como su uso en agricultura, parques e instalaciones deportivas contra plagas pertenecientes al grupo de la mosca blanca.

Description

COMPOSICIONES BIOPESTICIDAS QUE COMPRENDEN EXTRACTOS VEGETALES Y
SU USO FITOSANITARIO
CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se engloba dentro del campo de la Agricultura y la Biotecnología Vegetal; y más concretamente en el sector de los biopesticidas derivados de materiales vegetales y particularmente dentro del campo de los biopesticidas bioquímicos que comprenden sustancias naturales como extractos y ácidos grasos que controlan plagas y enfermedades.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
El empleo masivo de fitosanitarios químicos en el sector agrícola, fundamentalmente para la protección pro y post-cosecha, constituye una de las principales fuentes de residuos tóxicos en la cadena alimentaria. El aumento de la población mundial está directamente relacionado con un Incremento de la producción agrícola para satisfacer la demanda de alimentos. En la actualidad, el uso de fitosanitarios y fertilizantes sintéticos constituyen las principales herramientas disponibles para la protección de los cultivos y su correcta nutrición y desarrollo. Sin embargo, el uso excesivo de estos productos químicos ha llevado al desarrollo de resistencias en las plagas, a la contaminación del medio ambiente, toxicidad en otros organismos y riesgos para la salud humana. Las multinacionales químicas (agricultura convencional) hacen frente a una plaga, enfermedad o problema nutricional mediante la aplicación de productos basados en la síntesis química de moléculas individuales de alta persistencia y con un único mecanismo de acción específico. Esto provoca la rápida aparición de resistencias cruzadas (plagas y enfermedades) o pérdidas de eficacia (fertilizantes) del producto, además del impacto negativo sobre el medio ambiente y la salud humana.
Los graves problemas derivados del uso intensivo de pesticidas químicos han producido un endurecimiento de la legislación sobre el uso de este tipo de compuestos (ej. directiva 2009/128/EC). Es por ello que, ante los requerimientos de seguridad alimentarla cada vez más restrictivos impuestos por las legislaciones vigentes unido a las propias exigencias del mercado y los consumidores, se ha desarrollado una necesidad creciente en desarrollar nuevos bioproductos destinados a la protección de cultivos.
En este sentido, el desarrollo de productos de protección vegetal de origen natural (bioplaguicidas) ofrece una alternativa real con alta multifuncionalidad asociada a una composición química variada y compleja, retardando o impidiendo la aparición de resistencias cruzadas en las plagas y enfermedades; principal problema, técnicamente demostrado, asociado al uso continuado de productos de síntesis.
La gran mayoría de los bioplaguicidas desarrollados y comercializados hasta el momento todavía tienen limitaciones importantes relacionadas con la falta de disponibilidad de una materia prima procedente de fuentes renovables y que a vez sea abundante, barata, homogénea, trazable y rica en principios activos sanos y efectivos.
Los metabolitos secundarios de microorganismos (hongos, bacterias, levaduras), extractos de origen vegetal (plantas, algas, subproductos agroindustriales) y compuestos químicos derivados de las mismas son, sin duda, las fuentes más estudiadas y abundantes de materias primas para el desarrollo de biopesticidas.
Las plantas constituyen una fábrica natural de sustancias químicas con actividad bioplaguicida, derivadas fundamentalmente del metabolismo secundario y como consecuencia de millones de años de coevolución entre las plantas y las plagas. Estas sustancias se caracterizan por pertenecer a diversas clases químicas lo que deriva en una gran multifuncionalidad. Entre ellas se encuentran: terpenos, esteróles, alcaloides, polifenoles (flavonas, isoflavonas, cumarinas, lignanos, iridoides, fenilpropanoides), glucosinolatos, isotiocianatos, ácidos grasos, ésteres y aceites esenciales.
Una especial mención merecen los aceites esenciales (AEs) obtenidos mayoritariamente a partir de plantas aromáticas, medicinales y/o condimentarías mediante diferentes procesos de destilación y/o extracción con solventes de baja polaridad incluido el CO2 (extracción supercrítica). Los AEs constituyen la parte más volátil de numerosas especies vegetales fundamentalmente pertenecientes a la familia Lamiaceae y comprenden mezclas complejas de monoterpenos, sesquiterpenos y compuestos aromáticos. Estos compuestos, sin duda, son los componentes naturales más empleados en el desarrollo de bioplaguicidas. Los trabajos que refieren la aplicación de los AEs como “potenciales” biopesticidas para el control de plagas y enfermedades ocupan más del 70% del total de las publicaciones científicas sobre compuestos de protección vegetal derivados de plantas. Sin embargo, el 95% de estas publicaciones sólo versan sobre estudios a nivel de laboratorio y muy pocos se refieren a posibilidades reales de escalado. ( Green Pesticides Handbook. Essential Oils for Pest Control. ISBN: 13: 978-1-4987-5938-0, 2017).
La presente invención supera las limitaciones existentes en el estado de la técnica. Consiste en el desarrollo de nuevas composiciones biopesticidas que puedan ser utilizadas en el tratamiento fitosanitario de plagas de moscas, principalmente del complejo de las moscas blancas (Hemiptera: Aleyrodidae). Las composiciones biopesticidas de la invención son al mismo tiempo fácilmente obtenibles, escalables y eficaces; igualando y/o superando la eficacia de los productos de síntesis química y/o productos de origen natural empleados actualmente en sistemas agrícolas convencionales y orgánicos. Además, presentan la ventaja de atenuar el desarrollo de las resistencias cruzadas, no presentar fitotoxicidad y ser respetuosos con el medio ambiente.
Los insecticidas convencionales contienen una o dos moléculas activas obtenidas por síntesis química y generalmente pertenecientes al mismo grupo químico o grupos muy relacionados. Dichas moléculas afectan de forma muy específica un único punto de acción ( target site) de la diana. Esta especificidad de acción sobre un receptor común es la principal causa de la aparición de resistencias cruzadas con la consiguiente pérdida de eficacia (IRAC, 2019; https://bit.ly/33t9FF8). De igual forma, la mayoría de las soluciones naturales presentes en el mercado provienen de extractos vegetales donde predominan mayoritariamente las que contienen entre 3-5 moléculas activas, con el consiguiente riesgo de desarrollo de resistencias.
En el caso de los biopesticidas, la complejidad de su composición química (varias moléculas pertenecientes a diferentes grupos químicos) permite que ejerzan su acción a través de diferentes mecanismos de acción y por consiguiente minimicen la aparición de resistencias e incrementen su eficacia a largo plazo.
Las composiciones que se reivindican en esta invención presentan una composición química compleja. Tienen en común un núcleo sinérgico bioactivo constituido por moléculas activas pertenecientes a clases químicas muy divergentes. Dicha complejidad está directamente asociada a la multifuncionalidad del formulado en cuanto a modos de acción y eficacia global. Moléculas químicamente diferentes pueden incidir sobre el mismo modo de acción (por ejemplo, repelencia) actuando sobre receptores (sitios de acción) diferentes. En estos casos, el riesgo de desarrollo de resistencias cruzadas es casi nulo.
El Comité de Acción para la Resistencia a los Insecticidas (IRAC, 2019; https : //bit. Iy/33t9 F F8) recomienda “las alternancias, secuencias o rotaciones de compuestos con diferentes mecanismos de acción (MdA) para el manejo sostenible y eficaz de la aparición de resistencias cruzadas”. En el caso de los insecticidas químicos y aquellos biopesticidas de composición química muy simple (con predominio de una determinada molécula); implicaría alternar diferentes productos (diferentes químicos de síntesis y/o productos de síntesis con biopesticidas) con mecanismos de acción diferentes. En el caso de las composiciones de la presente invención, esto no sería necesario ya que la alternancia de mecanismos de acción estaría garantizada por la gran variedad de moléculas diferentes que componen la fórmula. No existe en el arte previo ni en el mercado de los biopesticidas una composición como la que se divulga en la presente invención, en la que la formulación final a escala comercial exhiba un efecto sinérgico, cooperativo y/o potenciador que permita:
Reducir las dosis de los principios activos y por consiguiente la carga de formulado a utilizar.
Actuar mediante más de un mecanismo de acción que combine efectos físicos (mortalidad por contacto y efecto volteo) y efectos sobre los quimiorreceptores que controlan la conducta alimentaria y fisiológica de la mosca blanca (antialimentarios, repelentes e inhibidores de la oviposición).
La liberación controlada de los principios activos.
Eliminar o minimizar la aparición de resistencias cruzadas frente a plagas del grupo de las moscas blancas debido a su naturaleza y multifuncionalidad.
Etiquetar el producto como “residuo cero”, según legislación vigente. Las formulaciones contienen metabolitos secundarios de plantas que normalmente existen en la naturaleza y presentan una tasa de degradación rápida.
Eliminar los plazos de seguridad.
Etiquetar el producto como “safe". Los seres humanos y organismos beneficiosos (“ non-target’ ) han estado expuestos de forma natural a los metabolitos secundarios que componen las formulaciones divulgadas.
Ejemplos relevantes de formulaciones comerciales que entran en la clasificación de insecticidas de origen natural son:
• Réquiem® (Bayer): Contiene aproximadamente un 25% de componentes del extracto de Chenopodium ambrosioides, específicamente una mezcla de α-terpineno, p-cimeno y limoneno.
• Pre-VAM® (Oro Agri SA. Ltd.): Contiene entre un 6-10% de aceite de naranja ( Orange oil) con un contenido de limoneno mayor del 90%.
• Pirecris® (SEIPASA): Contiene un 2% de piretrinas naturales.
• Agroneem™ (Ajay Bio Tech India Limited Body Incorpórate). Contiene azadiractina, componente principal del aceite de Neem ( Azadirachta indica ).
Estas formulaciones han demostrado su efectividad para el control de diferentes plagas de mosca blanca. Sin embargo, las composiciones divulgadas en la presente invención presentan ventajas claras con respecto a dichas formulaciones en lo relativo a:
• Identidad química. • Tipo y alternancia de mecanismos de acción (MdAs).
• Manejo de resistencias cruzadas (MR).
• Eficacia.
En la Tabla 1 (elaboración propia) se muestra una comparativa de las ventajas de las composiciones divulgadas frente a formulaciones de naturaleza similar.
Figure imgf000007_0001
Referencias: 1 US 2013/0331462 A1
2 Green Pesticides Handbook. Essential oil for pest control. Chapter 2. Commercialization of insecticides based on essential oil. Nollet & Singh, Eds. CRC Press, ISBN: 13: 978-1-4987- 5938-0.
3 Green Pesticides Handbook. Essential oil for pest control. Chapter 15. Orange oil. Nollet & Singh, Eds. CRC Press, ISBN: 13: 978-1-4987-5938-0.
4 ES2444991 A1.
5 Journal of Agricultural Science and Technology A 6 (2016) 77-91. Sin embargo, existen diferencias y distinciones entre los biopesticidas que determinan su éxito frente a los productos de síntesis y su prevalencia en el mercado. Pre-VAM® (Oro Agri SA. Ltd.) es una formulación natural compuesta por aceite de naranja y aprobada para uso como fitosanitario en USA, Canadá, Europa y otros países. A pesar de su eficacia, presenta varias desventajas comparado con las composiciones que se reivindican en esta invención. La presencia mayoritaria en su composición de un solo ingrediente (más del 95% de d-limoneno) con un mecanismo de acción propuesto, aumenta el riesgo de la aparición de resistencias. Además, la alta volatilidad e inestabilidad del aceite de naranja hacen difícil su aplicación en condiciones de campo abierto (Green Pesticides Handbook. Essential oil for pest control. Chapter 15. Orange oil. Nollet & Singh, Eds. CRC Press, ISBN: 13: 978-1 -4987-5938-0) . Por otro lado, formulados como Pirecris® y Agroneem™, además de una composición química simple, actúan mediante mecanismos de acción tóxicos a nivel del sistema nervioso (Pirecris®) o enzimas digestivas (Agroneem™). Esto aumenta la probabilidad de efectos sobre organismos beneficiosos (“ non-target ’) a la vez que el riesgo de aparición de resistencias es mayor.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
Los siguientes términos de la invención se definen a continuación de forma detallada.
“Composiciones bioplaguicidas o composiciones biopesticidas o composiciones fitosanitarias” son términos que se usan indistintamente en la presente memoria. Pueden definirse como toda entidad biológica, viva o de origen natural incluyendo los subproductos y/o sustancias químicas que de ellos se deriven; que controle/regule todo aquello que denominamos plaga y/o enfermedad de las plantas.
“Extracto crudo, extracto vegetal o extracto botánico” son términos que se usan indistintamente en la presente memoria.
Cualquiera de las alternativas mencionadas en la reivindicación 1: “aceites esenciales, oleorresinas, extractos acuosos, alcohólicos o hidroalcohólicos” son productos obtenidos de la raíz o rizomas de Zingiberoffícinale Roscoe. Estos productos pueden ser productos crudos tal como se obtienen de su proceso de extracción o pueden ser fracciones de de los mismos que se pueden obtener mediante un fraccionamiento dirigido por métodos cromatográficos, separación líquido-líquido, evaporación, cristalización o destilación. Además, estos productos pueden ser sustancias puras o mezclas de sustancias.
“Fuente de cinamaldehído” en la presente memoria incluye cualquier mezcla de compuestos entre los que se encuentra cinamaldehído o de la cual se pueda obtener cinamaldehído. En la presente memoria “núcleo bioactivo” equivale a “primer componente”.
En la presente memoria “elementos activos” equivale a “ingredientes activos”.
En la presente memoria “agente encapsulante” equivale a “matriz encapsulante”.
“Caldo o solución de aplicación final” se refiere a la composición biopesticida diluida lista para su aplicación.
“Sustancias adicionales y coformulantes” son términos que se usan indistintamente en la presente memoria. Se refieren a sustancias inertes que pueden formar parte de la composición pesticida y cuyo objetivo es incrementar su eficacia. Ejemplos de estas sustancias son adyuvantes, agentes dispersantes, agentes penetrantes, emulsionantes, estabilizantes, aromatizantes, antiespumantes y/o conservantes.
“compuestos puros” se refiere a cualquier compuesto natural que actúe como segundo componente activo en la composición bioplaguicida y que puede ser obtenido por un proceso de síntesis, como parte de una fracción semipurificada o aislado en estado puro de las fuentes naturales que lo contengan.
Cualquier otro término empleado en la presente memoria tendrá el significado habitual del sector de la técnica al que se refiere la presente invención.
El problema técnico que resuelve la presente invención es el desarrollo de composiciones biopesticidas utilizadas en el tratamiento fitosanitario de plagas incluidas en el grupo de las moscas blancas. Las composiciones comprenden un núcleo bioactivo (formado por un aceite esencial, oleorresina, extracto acuoso, alcohólico o hidroalcohólico de raíz o rizomas de Zingiber officinale y cinamaldehído o una fuente de cinamaldehído). Además, se ha encontrado que los componentes del núcleo bioactivo sorprendentemente presentan un efecto potenciador y/o cooperativo en la actividad anti moscas frente al complejo de las moscas blancas.
De esta forma, la presente invención divulga una composición biopesticida que comprende un núcleo bioactivo sinérgico formado por: aceite esencial, oleorresina, extracto acuoso, alcohólico o hidroalcohólico de raíz o rizomas de Zingiber officinale Roscoe y - cinamaldehído o una fuente de cinamaldehído.
La concentración, % peso/peso (% p/p) de cada componente en el núcleo bioactivo, se encuentra en los siguientes intervalos: aceite esencial, oleorresina, extracto acuoso, alcohólico o hidroalcohólico de raíz o rizomas de Zingiber officinale Roscoe: 0,1-99,9% (p/p), preferentemente 10-90% (p/p), más preferentemente 20-80% (p/p), aún más preferentemente 30-70% (p/p) y más preferentemente 40-60% (p/p) y cinamaldehído o una fuente de cinamaldehído: 0,1-99,9% (p/p), preferentemente 10- 90% (p/p), más preferentemente 20-80% (p/p), aún más preferentemente 30-70% (p/p) y más preferentemente 40-60% (p/p).
El cinamaldehído puede ser el isómero trans, cis o la mezcla de los isómeros.
El cinamaldehído como componente del núcleo bioactivo se obtiene como:
- compuesto con alto grado de pureza (≥ 95%) aislado/purificado a partir de especies del género Cinnamomun sp. que lo contengan,
- compuesto con alto grado de pureza (≥ 95%) obtenido por síntesis total, semisíntesis o síntesis biomimética y
- compuesto producido por cualquier organismo (ej. hongos filamentosos como Aspergillus sp., bacterias e insectos) en procesos de biotransformación y/o bioconversión.
La fuente de cinamaldehído como componente del núcleo bioactivo puede ser extractos/aceites esenciales de especies vegetales que lo contengan, preferentemente del género Cinnamomum sp. Ejemplos significativos de especies de este género que contienen cinamaldehído son: C. verum. (sinonimia Cinnamomum zeylanicum), C. cassia, C. loureirii, C. burmannii, C. tamala, C. osmophloeum, C. bejolghota, C. dubium, C. rivulomm, C. citriodomm y C. camphora.
El cinamaldehído y/o la fuente de cinamaldehído se puede emplear de forma libre y/o encapsulada en un agente encapsulante.
El agente encapsulante se puede seleccionar entre: maltodextrinas, ciclodextrinas, lecitinas, aceites vegetales y/o excipientes de sílice, estos últimos comprenden gel de sílice (sílica gel), sílice coloidal y dióxidos de silicio, preferentemente se emplean ciclodextrinas.
La forma encapsulada de la fuente de cinamaldehído, Incrementa su actividad biológica y favorece la liberación controlada del ingrediente o elemento activo.
En una realización adicional de la invención las composiciones biopesticidas comprenden además un segundo componente. Este segundo componente puede ser uno o más elementos o ingredientes activos. El ingrediente activo como segundo componente se puede seleccionar entre uno o más de: extractos botánicos o fracciones de los extractos, extracto obtenido partir de fermentados de microorganismos o fracciones de dichos extractos, compuestos puros seleccionados entre geranial (citral A), neral (citral B), saponinas, alcohol bencílico, benzoato de bencilo, acetato de bencilo, eugenol, 1,8-cineol, timol, geraniol, acetato de geranilo y ácidos grasos, seleccionados entre: saturados de cadena corta y larga preferentemente los de cadena larga e insaturados y derivados de ácidos grasos (por ejemplo, metilados, ásteres metílicos de ácidos grasos, FAME, “fatty acid methyl ester”) más preferentemente ácidos grasos saturados de cadena larga y/o ácidos grasos insaturados y lecitina, preferentemente de huevo, girasol, colza, maíz, algodón, cacahuete o soja.
El extracto botánico se puede seleccionar entre: extractos acuosos, alcohólicos e hidroalcohólicos y/o aceites esenciales.
El origen del extracto botánico se puede seleccionar entre residuos agroindustriales, bulbos, semillas, hojas, folículos, flores y/o parte aérea completa a partir de plantas pertenecientes a los siguientes géneros: Allium sp., Angélica sp., Annona sp., Artemisia sp., Camm sp., Cass/a sp., Chenopodium sp., Citrus sp., Coffea sp., Crccus sp., Cúrcuma sp., Cyamopsis sp., Cymbopogon sp., Cytisus sp., Eucalyptus sp., Eurycoma sp., Ficus sp., Foeniculum sp., Fumaria sp., Geranium sp., Ginkgo sp., Helianthus sp., Hyssopus sp., Jatropha sp., Lavandula sp., Mentha sp., Moringa sp., Nigella sp., Ocimum sp., Olea sp., Papa ver sp., Pelargononium sp., Persea sp., Petroselinum sp., Pimpinella sp., Prunus sp., Quassia sp., Retama sp., Rheum sp., Rosmarinus sp., Salvia sp., Satureja sp., Schoenocaulon sp., Syzygium sp., Trigonella sp., Thymus sp. y Vitis sp., preferentemente las especies: Allium sativum, Angélica archangelica, Annona cherimola, Artemisia absinthium, Camm carvi, Cassia angustifolia, Cassia senna, Chenopodium ambmsioides, Citrus aurantium, Citrus limón, Citms sinensis, Coffea arabica, Crocus corsicus, Crocus sativus, Crocus speciosus, Crocus vemus, Cúrcuma aromática, Cúrcuma loriga, Cymbopogon citratus, Cyamopsis tetragonoloba, Cymbopogon flexuosus, Cymbopogon martinii, Cymbopogon nardus, Cytisus scoparius, Eucalyptus camaldulensis, Eucalyptus globulus, Eurycoma longifolia, Ficus carica, Fumaria offícinalis, Foeniculum vulgare, Geranium macmrrhizum, Ginkgo biloba, Helianthus annuus, Helianthus tuberosum, Hyssopus offícinalis, Jatmpha curcas, Lavandula angustifolia, Lavanda x intermedia, Lavandula luisieri, Mentha piperita, Mentha spicata, Moringa oleífera, Nigella sativa, Odmum basilicum, Olea europaea, Papaver rhoeas, Papaver somniferum, Pelargonium citriodorum, Pelargonium graveolens, Persea americana, Persea indica, Petroselinum sativum (sin. P. crispum), Pinpinella anisum, Prunus pérsica, Quassia amara, Retama monosperma, Retama sphaerocarpa, Rheum rhabarbarum, Rheum officinale, Rosmarinus officinalis, Salvia lavandulifolia, Salvia offícinalis, Satureja montana, Schoenocaulon officinale, Syzygium aromaticum, Trigonella foenum-graecum, Thymus vulgaris, Thymus zygis y Vitis vinífera.
Los fermentos de microorganismos se refieren al extracto o líquido de fermentación (puro o previamente extraído con un disolvente orgánico) resultante del proceso de fermentación de un microorganismo (hongo o bacteria) en presencia de un sustrato vegetal y una vez eliminado el microrganismo vivo mediante un proceso de pasteurización.
El extracto obtenido a partir del fermento de microorganismos se puede seleccionar entre extractos obtenidos a partir de la fermentación de un sustrato con Bacillus sp., Pseudomonas sp., Trichoderma sp., Corynebacterium sp. y Aspergillus sp, preferentemente: Aspergillus niger, Trichoderma harzianum, Bacillus thuringiensis, Pseudomonas fluorescens, Bacillus amyloliquefaciens, Corynebacterium effíciens y Bacillus subtilis.
El sustrato de fermentación se puede escoger entre residuos agroindustríales, bulbos, semillas, hojas, folículos, flores y/o parte aérea completa a partir de plantas pertenecientes a los siguientes géneros: Zingiber sp., Citrus sp., Cyamopsis sp., Crocus sp., Helianthus sp., Petroselinum sp., Papaver sp., Rheum sp., Salvia sp., Retama sp., Lavandula sp., Prunus sp., Persea sp., Cúrcuma sp. y Thymus sp, preferentemente: Agaricus bisporus, Cyamopsis tetragonoloba, Helianthus annus, Citrus x sinensis y Glycine max.
Los compuestos puros se pueden obtener de alguna(s) de las siguientes fuentes: para los Isómeros del citral, geranial y neral, las especies incluidas en los géneros Cymbopogon sp. [ej. C. citratus, C. martinii , C. flexuosus, C. winterianus, C. nardus), entre otras], Litsea sp. (ej. L cubeba, L citrate., entre otras), Aloysia sp. (ej. A. citrodora, entre otras), Odmun sp. (ej. O. gratissimum, entre otras), Melissa sp. (ej. M. offícinalis, entre otras) y Citrus sp. para eugenol las incluidas en el género Cinnamomum sp. [ej. C. verum (sin., Cinnamomum zeylanicum), C. cassia, C. citriodorum, C. camphora, entre otras], Syzygium sp. (ej. S. aromaticum, entre otras), Cúrcuma sp. (ej. C. longa, entre otras), Zingiber sp. (ej. Z. officinale, entre otras) y Ocimum sp. (ej. O. tenuifíorum, entre otras), para saponinas las especies incluidas en los géneros Cyamopsis sp. (ej. C. tetragonoloba, entre otras), Quillaja sp. (ej. Q. saponaria, entre otras), Trigonella sp. (ej. T. foenum-graceum, entre otras), Saponaria sp. (S. offícinalis, entre otras), Crocus sp. (ej. C. sativus, entre otras), Yucca sp. (ej. Y. schidigera, entre otras), Beta sp. (ej.
B. vulgaris, entre otras), Hederá sp. (ej. H. hélix, entre otras), Polygala sp. y Prímula sp. Para alcohol bencílico las incluidas en los géneros Cinnamomum sp. (ej. C. cassia) y Jasminum sp. (ej. J. grandiflorum, entre otras), para 1,8 cineol (Eucaliptol) las especies incluidas en los géneros Eucalyptus sp. (ej. E. globulus, E. camaldulensis, entre otras), Salvia sp. (ej. S. officinalis, S. fructicosa, entre otras), Thymus sp. (ej. T. vulgaris, T. zlgys, T. capitatus, entre otras), Cúrcuma sp. (ej.
C. loriga, entre otras), Rosmarinus sp. (ej. R. officinalis, entre otras), Artemisia sp. (ej. A. vulgaris, entre otras), para geraniol las incluidas en los géneros Rosa sp. (ej. R. damascena, R. alba, R. gallica, entre oirás), Cymbopogon sp. (ej. C. citratus, C. martini, C. flexuosus, C. winterianus, C. nardus, entre otras), Geranium sp. (G. pretense, G. macrorrhizum, entre otras), Pelargonium sp. (ej. P. hirsutum, entre otras), para ácidos grasos son las especies incluidas en los géneros Persea sp. (ej. P. americana, entre otras), Glycine sp. (ej. G. max, entre otras), Helianthus sp. (ej. H. annuus, entre otras), Olea sp. (ej. Olea europaea) y otras oleaginosas, síntesis total, semisíntesis o síntesis biomimética del compuesto puro y/o análogos mediante estudios de relación estructura actividad (SAR) y
- producido por cualquier organismo seleccionado entre hongos filamentosos como Aspergillus sp., bacterias e insectos en procesos de biotransformación y/o bioconversión.
La lecitina se selecciona entre:
- Lecitina sólida,
- Lecitina líquida o fluida y
- Lecitina hidrolizada o parcialmente hidrolizada.
El segundo componente se puede emplear de forma libre o encapsulada.
La concentración del segundo componente en la composición biopesticida se combina con el núcleo bioactivo, en el siguiente intervalo de concentraciones peso / volumen total de la composición: 1-30% (p/v), preferentemente 5-25% (p/v) y aún más preferentemente 10-20% (p/v).
Las composiciones biopesticidas pueden comprender además al menos una sustancia inerte que puede ser seleccionada entre: adyuvantes, emulsionantes, dispersantes, aromatizantes, conservantes, antiespumantes, agentes tixotrópicos, matrices de encapsulación, ácidos grasos, fosfolípidos y mezclas de ellos.
Los adyuvantes pueden ser organosiliconados del grupo de los organosiloxanos.
Los agentes tixotrópicos pueden ser carboximetilcelulosa, carboximetilcelulosa sódica, celulosa microcristalina y otros derivados de la celulosa preferentemente goma y gel.
Las matrices de encapsulación se pueden seleccionar entre: maltodextrinas, ci el od extrinas, lecitinas, aceites vegetales y/o excipientes de sílice, estos últimos comprenden gel de sílice (sílica gel), sílice coloidal y dióxidos de silicio, preferentemente se emplean ciclodextrinas.
En una realización particular de la invención la composición biopesticida comprende el núcleo bioactivo, lecitina y opcionalmente otras sustancias mencionadas como segundos componentes y/o sustancias inertes.
En una realización particular de la invención la composición biopesticida se selecciona entre las composiciones biopesticidas que comprenden:
Zingiber officinale y Cinnamomum verum,
Zingiber officinale, Cinnamomum verum y lecitina de soja,
Zingiber officinale, E-cinamaldehído y Persea americana,
Zingiber officinale, Cinnamomum verum y derivado siliconado tipo organosiloxano,
Zingiber officinale, Cinnamomum verum, extracto hidroalcohólico de Satureja montana y lecitina de soja,
Zingiber officinale, Cinnamomum verum, lecitina de soja, derivado siliconado tipo organosiloxano, b-ciclodextrina y adyuvante polimérico,
Zingiber officinale, Cinnamomum cassia, Persea americana, Cymbopogon citratus, lecitina de soja, Tween-80, derivado siliconado tipo organosiloxano, carboximentilcelulosa, b-ciclodextrina y adyuvante polimérico,
Zingiber officinale, Cinnamomum verum, Persea americana, Aspergillus sp, lecitina de soja, derivado siliconado tipo organosiloxano y adyuvante polimérico,
Zingiber officinale, Cinnamomum cassia, Mentha piperita, lecitina de soja, derivado siliconado tipo organosiloxano y adyuvante polimérico,
Zingiber officinale, Cinnamomum cassia, Cassia angustifolia, lecitina de soja, derivado siliconado tipo organosiloxano y adyuvante polimérico, Zingiber officinale, Cinnamomum cassia, Trigonella foenum-graecum, acetato de bencilo, lecitina de soja, derivado siliconado tipo organosiloxano y adyuvante polimérico,
Zingiber officinale, Cinnamomum verum, citral, benzoato de bencilo, lecitina de soja, derivado siliconado tipo organosiloxano y adyuvante polimérico,
Zingiber officinale, Cinnamomum verum, acetato de bencilo, geraniol, lecitina de soja, derivado siliconado tipo organosiloxano y adyuvante polimérico,
Zingiber officinale, Cinnamomum verum, Papaver somniferum, lecitina de soja, derivado siliconado tipo organosiloxano y adyuvante polimérico,
Zingiber officinale, Cinnamomum verum, aceite esencial de Satureja montana , extracto de Satureja montana, lecitina de soja, derivado siliconado tipo organosiloxano y adyuvante polimérico, y
Zingiber officinale, E-cinamaldehído, acetato de geranilo, lecitina de soja, derivado siliconado tipo organosiloxano y adyuvante polimérico.
La presente invención se refiere también a un caldo o solución final de aplicación que comprende la composición biopesticida definida anteriormente diluida con un disolvente, preferentemente acuoso y más preferentemente agua.
La concentración de cada componente del núcleo bioactivo en el caldo de aplicación final se encuentra en el intervalo: aceite esencial, oleorresina, extracto acuoso, alcohólico o hidroalcohólico de raíz o rizomas de Zingiber officinale Roscoe: 0,01-0,99% (p/v), preferentemente 0,05-0,95% (p/v), preferentemente 0,1 -0,9% (p/v), más preferentemente 0,2-0, 8% (p/v), aún más preferentemente 0,3-0, 7% (p/v) y más preferentemente 0,4-0, 6% (p/v) y cinamaldehído o una fuente de cinamaldehído: 0,01-0,99% (p/v), preferentemente 0,05-0,95% (p/v), preferentemente 0,1 -0,9% (p/v), más preferentemente 0,2-0, 8% (p/v), aún más preferentemente 0,3-0, 7% (p/v) y más preferentemente 0,4-0, 6% (p/v).
Las principales ventajas técnicas de las composiciones biopesticidas divulgadas son:
Presentan una alta eficacia y especificidad en el control de moscas y a dosis más bajas comparadas con:
Los elementos activos (extractos, aceites, moléculas) individuales teniendo en cuenta tanto los valores obtenidos dentro de esta invención como los reportados en el estado de la técnica. Otros compuestos y/o formulaciones naturales y sintéticas de reconocida actividad.
Presentan modos de acción múltiples y no tóxicos frente a moscas (contacto- antialimentario-repelencia-oviposición).
Eliminan y/o retardan la aparición de resistencias cruzadas.
Las especies seleccionadas de plantas presentan gran biodiversidad y sostenibilidad en el cultivo, garantizando la disponibilidad del material de partida.
En el caso de los activos, no se espera que sean tóxicos para humanos y animales ni para plantas, teniendo en cuenta:
Su ocurrencia en la naturaleza.
Sus usos alimentarios y farmacológicos.
Historial de exposición natural a los seres humanos y medio ambiente.
En algunos casos, la obtención del extracto, como componente de algunas composiciones biopesticidas constituye una alternativa a la valorización de un material vegetal con muy escaso o nulo valor comercial y que se gestiona como residuo en el procesado de la industria agroalimentaria.
El proceso de extracción y formulación optimizado que se divulga es limpio, rápido, eficiente y fácilmente escalable lo que redunda en una reducción del coste final del producto en el mercado.
Un objeto adicional de la invención constituye el procedimiento de obtención de la composición biopesticida de la invención que comprende la mezcla en medio acuoso de los componentes del núcleo bioactivo:
- aceite esencial, oleorresina, extracto acuoso alcohólico o hidroalcohólico de raíz o rizomas de Zingiber officinale Roscoe y
- cinamaldehído o fuente de cinamaldehído.
En una etapa previa al procedimiento de obtención del núcleo bioactivo, el aceite esencial, oleorresina, extracto acuoso, alcohólico o hidroalcohólico de Zingiber officinale Roscoe se puede obtener mediante maceración, percolación, decocción, infusión, hidrodestilación- Clevenger; extracción asistida por ultrasonidos, por microondas, por fluidos supercríticos; extracción tipo Soxhlet, extrusión, destilación por arrastre de vapor (directa, indirecta, a presión y/o a vacío) o extracción con disolventes (en caliente o frío) y preferentemente en un sistema de dispersión multifuncional con molino coloidal.
Por otro lado, la fuente de cinamaldehído se puede obtener mediante la destilación de una especie de las indicadas anteriormente que lo contenga. El cinamaldehído puede ser encapsulado previamente a la formación del núcleo bioactivo.
Es necesario seguir un orden determinado de adición de los componentes, al agua primero se añade el aceite esencial, oleorresina, extracto acuoso alcohólico o hidroalcohólico de raíz o rizomas de Zingiber officinale Roscoe y después el cinamaldehído o fuente de cinamaldehído (Ejemplo 1).
Opcionalmente, las composiciones biopesticidas se obtienen de la mezcla ordenada y en proporciones específicas, del núcleo bioactivo sinérgico, al menos un componente secundario y/o al menos una sustancia inerte. Se añaden posteriormente a la mezcla, de forma ordenada, y con un periodo de agitación tras la adición de cada componente.
La mezcla de los componentes del núcleo bioactivo se realiza a una velocidad comprendida en el intervalo entre 500 y 4000 rpm, preferentemente entre 1500 y 3000 rpm. La mezcla se realiza en medio acuoso.
La temperatura de la mezcla se encuentra entre los 20 y 40°C, preferentemente entre 24 y 35°C y durante un periodo comprendido entre 30 y 120 minutos, preferentemente 40 y 100 minutos.
El procedimiento de preparación de las composiciones biopesticidas se puede realizar en los aparatos o reactores habitualmente empleados para la realización de estas tareas en el campo de la técnica.
Un objeto adicional de la invención constituye el uso de composiciones biopesticidas para el control de plagas de moscas.
Particularmente el grupo de la mosca blanca, preferentemente las pertenecientes a los géneros Bemisia sp. “complex” (biotipos), Dialeurodes sp., Trialeurodes sp. Encarsia sp., Aleurolobus sp., Aleurothríxus sp., Aleurodicus sp., Aleyrodes sp., Parabemisia sp., Paraleyrodes sp.,Orchamoplatus sp., Siphoninus sp. y Tetraleurodes sp.
Los elementos de las composiciones biopesticidas actúan de forma sinérgica, aditiva, polivalente y/o potenciadora.
Los biopesticidas tienen un efecto prolongado mediante un mecanismo de liberación controlada. La composición biopesticida se puede usar:
- de manera preventiva y/o
- curativa, hasta condiciones de alta infestación con peligro de pérdida del cultivo.
Adicionalmente, los biopesticidas se pueden aplicar individualmente o en combinación con otros productos fitosanitarios o sistemas de control de plagas y enfermedades.
Por otros productos fitosanitarios o sistemas de control de plagas se entiende cualquier tipo de insecticidas, nematicidas, acaricidas, fungicidas, bactericidas, herbicidas, reguladores del crecimiento de la planta, elicitores, fertilizantes, acondicionadores del suelo, y cebos entre otros.
La aplicación de la composición biopesticida puede ser mediante aspersión foliar.
En otra realización particular las aplicaciones de las composiciones biopesticidas se realizan en cultivos agrícolas de uso alimentario y no alimentario, ya sea agricultura convencional, orgánica o ecológica, preferentemente en cultivos hortícolas, extensivos y ornamentales y jardinería, así como parques e instalaciones deportivas.
En otra realización particular las aplicaciones se realizan en invernadero y en campo abierto, así como jardines y áreas verdes de instalaciones deportivas y recreativas.
La dosis de la composición biopesticida, puede aumentar o disminuir según el tipo de formulación, tipo e intensidad de ataque de la plaga a controlar, cultivo y país de uso.
Mecanismos y definición de los modos de acción
El modo de acción se refiere a la interacción física y/o bioquímica específica a través de la cual un biopesticida produce su efecto.
Para determinar los modos y mecanismos de acción se emplearon un conjunto de microensayos (in vitro e in vivo) desarrollados y/o adaptados de la literatura científica (por ejemplo, ensayos de elección vs. no elección, pulverización directa, toxicidad por ingestión, bioensayo con olfatómetro de tubo en Y, bioensayos de priming , microscopía, etc.). Preferentemente se realizan los siguientes bioensayos:
• Ensayos de mortalidad por contacto: El objetivo es evaluar el efecto de diferentes dosis de la sustancia sobre la mortalidad de adultos y estados inmaduros de la mosca blanca mediante aplicación tópica.
Ensayos de inhibición del asentamiento: El objetivo es evaluar el efecto de diferentes dosis de la sustancia sobre el comportamiento (asentamiento) de adultos de mosca blanca. Se basa en la preferencia de las moscas por plantas tratadas y no tratadas localizadas en la misma caja entomológica (ensayos de elección) o en diferentes (no elección).
• Ensayos de inhibición de la oviposición: El objetivo es evaluar el efecto de diferentes dosis de la sustancia sobre la puesta de huevos de adultos de mosca blanca. Se basa en la preferencia para ovipositar de las moscas en superficies de plantas tratadas y no tratadas localizadas en la misma caja entomológica (ensayos de elección) o en diferentes (no elección).
• Ensayos de repelencia espacial: El objetivo es medir la capacidad de la sustancia para inhibir la preferencia de adultos de mosca blanca por su planta huésped (ensayos en olfatómetros).
En los protocolos de ensayo se tuvo en cuenta lo siguiente:
• Se ensayan cada uno de los elementos activos de las composiciones biopesticidas por separado y combinaciones entre ellos.
• Se ensayan cada una de las composiciones biopesticidas.
• Para cada uno de los elementos que componen las composiciones divulgadas, y para cada una de las composiciones biopesticidas se realizaron ensayos de dosis- respuesta y se calculó la EC/LC50 (dosis a la que se produce el 50% del efecto estudiado).
Teniendo en cuenta los resultados obtenidos se concluye que los elementos activos y/o composiciones biopesticidas evaluadas actúan mediante dos modos de acción principales:
Modo de acción 1: Contacto directo (efecto “knock down"). Los mecanismos de acción involucrados en este modo de acción son:
Bloqueo de las vías respiratorias de las moscas (muerte por asfixia).
Destrucción de la capa de cera del exoesqueleto (muerte por deshidratación).
Desestructuración de la membrana celular (shock osmótico).
Modo de acción 2: Acción sobre los receptores olfatorios y del gusto de la mosca. Los mecanismos de acción involucrados en este modo de acción son:
Efecto antialimentario: Inhibición de la alimentación mediante la interacción de los componentes del formulado con los receptores del gusto. Efecto repelente: Fuerte efecto repelente mediante la liberación controlada de los componentes volátiles encapsulados y su Interacción con los receptores olfativos.
Inhibición de la oviposición: Reduce considerablemente la puesta de huevos mediante la interacción de los componentes del formulado con los quimiorreceptores del adulto.
Los mecanismos y modos de acción de cada uno de los elementos del núcleo bioactivo se resumen en la Tabla 2.
Figure imgf000020_0001
Los ingredientes del núcleo bioactivo presentan una composición química compleja asociada a una gran multifuncionalidad en cuanto a mecanismos de acción. La combinación de los mecanismos de acción propuestos (físicos y conductuales) determinan la eficacia del núcleo bioactivo y minimizan el riesgo de aparición de resistencias cruzadas. Esta eficacia se ve potenciada con la adición de, al menos, un segundo componente activo, así como coformulantes (sustancias) inertes que contribuyen al aumento de la estabilidad del formulado y favorecen la liberación controlada de los ingredientes activos.
Breve descripción del contenido de las figuras Figura 1 : Reactor de formulación.
Figura 2: Diagrama del proceso de destilación por arrastre de vapor. Figura 3: Diagrama de flujo del proceso de fermentación.
Figura 4: Esquema de un fraccionamiento químico biodirigido.
Figura 5: Diseño de un ensayo in vitro de mortalidad por contacto.
Figura 6: Observación al microscopio de adultos de mosca blanca en ensayos de mortalidad por contacto. A: Desestabilización de membranas celulares, B: Bloqueo de los espiráculos traqueales (asfixia). Figura 7: Olfatómetro en “Y” diseñado para los ensayos de repelencia espacial.
Figura 8: Diseño experimental de los ensayos de inhibición de la alimentación in planta.
Figura 9: Análisis isobolográfico de la interacción entre los componentes de núcleo bioactivo.
Figura 10: Cromatograma (GC-MS-MS) del aceite esencial de Cinnamomum zeylanicum puro (A) y encapsulado (B).
Figura 11: Curva de dosis-respuesta de los elementos del núcleo bioactivo para la mortalidad por contacto (%M).
Figura 12: Curva de dosis-respuesta de los elementos del núcleo bioactivo para la inhibición del asentamiento (%SI). Figura 13: Curva de dosis-respuesta de los elementos del núcleo bioactivo para la inhibición de la puesta de huevos (%IO).
Figura 14: Metodología del Triángulo de Gibbs para el estudio de mezclas sinérgicas, potenciadoras y/o cooperativas. El triángulo superior muestra el número de combinaciones sinérgicas generadas entre los componentes A, B y C. El triángulo inferior representa la proporción de cada uno de los ingredientes A, B y C en la combinación.
Figura 15: Diseño experimental y distribución de parcelas experimentales y de muestro en el ensayo de la composición WF_F4 frente a mosca blanca en berenjena.
EJEMPLOS Las siguientes figuras, diagramas, tablas y ejemplos se muestran a título ilustrativo y no limitativos de la presente invención.
Ejemplo 1. Obtención del núcleo bioactivo
En la Tabla 3 se incluyen varios ejemplos de composiciones biopesticidas divulgadas en el marco de esta patente. En un ejemplo específico el núcleo bioactivo (ver composición M0, Tabla 3) comprende un 10,5% de extracto hidroalcohólico de raíces/rizomas de Zingiberoffícinale y un 15% de aceite esencial de Cinnamomum verum J. Presl. (sin., C. zeylanicum Blume), como fuente de cinamaldehído (CAS 8015-91-6) en agua. El aceite esencial puede ir incorporado de forma libre (como 100% aceite esencial) y/o parcial o totalmente encapsulado con un agente encapsulante. En un ejemplo específico el agente encapsulante es β-ciclodextrina. El proceso de obtención, siguiendo las etapas generales descritas anteriormente, se detalla a continuación:
La mezcla de los elementos del núcleo bioactivo se lleva a cabo en un reactor de acero inoxidable (Figura 1) con una capacidad total de 650 litros y una capacidad útil de 560 litros. Está dotado de una doble camisa por la que circula un fluido intercambiador de calor para el control de la temperatura dentro del tanque a través de un sensor PT100. El reactor está equipado con dos agitadores: un agitador central de disco tipo cowles (velocidad máxima de 1500 rpm) y un emulsionador de alta velocidad (3000 rpm, tipo ultra-turrax) ubicado en el fondo del reactor. Ambos agitadores se controlan de forma independiente para lograr una velocidad y control de la rotación específica para cada ingrediente y momento durante el proceso de mezclado. Además, el reactor está conectado a una bomba de vacío que se emplea para eliminar las burbujas de aire que se forman en el producto y prevenir la formación de interfaces gas-líquido. También presenta un sistema de inyección de gas inerte para evitar el trabajo en presencia de oxígeno y así evitar procesos oxidativos. Por último, el reactor cuenta con un sistema de limpieza tipo CIP (“ cleaning in place ”) para la limpieza automática.
Teniendo en cuenta las características del reactor (Figura 1), los elementos del núcleo bioactivo se añaden cuidosamente en un determinado orden, ajustando la temperatura y variables de rotación de cada agitador según se detalla en la Tabla 4.
Figure imgf000023_0001
Figure imgf000024_0001
Figure imgf000025_0001
Ejemplo 2. Obtención de composiciones biopesticidas
Cada composición biopesticida se formula de acuerdo con un orden de mezclado específico según la naturaleza de los elementos activos y coformulantes que la componen. Los elementos del núcleo bioactivo se emplean en la composición final de dos formas:
(1) Se incluyen individualmente y en el orden correspondiente durante el proceso de formulación de la composición biopesticida.
(2) Se premezcla y posteriormente se añaden al formulado final en la proporción y orden correspondiente dependiendo de la composición biopesticida.
El procedimiento consta de las siguientes etapas generales: a. Selección de las materias primas ■ Elementos activos
- Núcleo bioactivo (primer componente)
- Segundo (s) componente (s) ■ Sustancias inertes
- Emulsionante
- Adyuvante
- Estabilizante
- Conservante
- Encapsulante
- Aromatizante
- Antiespumante b. Encapsulación (si procede) del (los) ingrediente (s) activo (s) c. Formulación (mezcla de los ingredientes)
En la Tabla 3 se incluyen varios ejemplos de composiciones biopesticidas divulgadas en el marco de esta patente. A continuación, se detalla un ejemplo del procedimiento de obtención de cada una de las variantes (composiciones M1, M2, M3, M4, WF_F4, ADI-23, PW-1.5 y MxM5). Este proceso es extensivo para el resto de las composiciones que se relacionan en la Tabla 3 (MxM14, MxM15, MxM22, MxM19, MxM12, MxM16 y MxM25).
2.1 Composición biopesticida formada por el núcleo bioactivo + lecitina como segundo componente
En un ejemplo de composición biopesticida (ver composición M1, Tabla 3) el núcleo bioactivo (7,5% de extracto hidroalcohólico de Z officinale y 10% de aceite esencial de C. verum como fuente de cinamaldehído) se mezclan con un 17,5% de lecitina de soja (CAS: 8002-43-5) como agente emulsionante y potenciador de la actividad, para formar la composición M1 (Tabla 3).
Teniendo en cuenta las características del reactor descritas en el ejemplo 1, los elementos del núcleo bioactivo y la lecitina de soja se añaden cuidosamente en un determinado orden, ajustando la temperatura y variables de rotación de cada agitador según se detalla en la Tabla 5.
Figure imgf000026_0001
2.2 Composición biopesticida formada por el núcleo bioactivo y extracto de Persea americana como segundo componente. En un ejemplo de composición biopesticida (ver composición M2, Tabla 3) el núcleo bioactivo (7,5% de extracto hidroalcohólico de Z officinale y 5% de Cinamaldehído (CAS 104-55-2), como fuente de cinamaldehído) se mezclan con un 20% de extracto hidroalcohólico de Persea americana (segundo componente), para formar la composición M2 (Tabla 3).
Teniendo en cuenta las características del reactor descritas en el ejemplo 1, los elementos del núcleo bioactivo y el segundo componente (extracto hidroalcohólico de P. americana) se añaden cuidosamente en un determinado orden, ajustando la temperatura y variables de rotación de cada agitador según se detalla en la Tabla 6.
Figure imgf000027_0001
2.3 Composición biopesticida formada por el núcleo bioactivo + sustancias inertes. En un ejemplo de composición biopesticida (ver composición M3, Tabla 3) el núcleo bioactivo (12,5% de extracto hidroalcohólico de Z officinale y 12,5% de aceite esencial de C. verum, como fuente de cinamaldehído) se mezclan con un 10% de un derivado siliconado del tipo organosiloxano (adyuvante), para formar la composición M3 (Tabla 3).
Teniendo en cuenta las características del reactor descritas en el ejemplo 1, los elementos del núcleo bioactivo y el adyuvante (derivado organosiliconado) se añaden cuidosamente en un determinado orden, ajustando la temperatura y variables de rotación de cada agitador según se detalla en la Tabla 7.
Figure imgf000028_0001
2.4 Composición biopesticida formada por el núcleo bioactivo y dos segundos componentes.
En un ejemplo de composición biopesticida (ver composición M4, Tabla 3) el núcleo bioactivo (1 % de extracto hidroalcohólico de Z officinaie y 12,5% de aceite esencial de C. verum, como fuente de cinamaldehído) se mezclan con un 20% de extracto hidroalcohólico de Satureja montana y un 17,5% de lecitina de soja (segundos componentes) para formar la composición M4 (Tabla 3).
Teniendo en cuenta las características del reactor descritas en el ejemplo 1, los elementos del núcleo bioactivo y el adyuvante (derivado organosiliconado) se añaden cuidosamente en un determinado orden, ajustando la temperatura y variables de rotación de cada agitador según se detalla en la Tabla 8.
Figure imgf000029_0001
2.5 Composición biopesticida formada por el núcleo bioactivo, lecitina de soja, sustancias inertes y/o un segundo componente activo.
2.5.1. Composición WF F4
En un ejemplo de composición biopesticida, el núcleo bioactivo (7,5% de extracto hidroalcohólico de Z. offícinale y 16,0% de aceite esencial de C. verum, como fuente de cinamaldehído) se mezclan con un 17,5% de lecitina de soja (segundo componente con función de emulsionante y potenciador), un 13% de un adyuvante organosiliconado y un 10% de un adyuvante polimérico que actúa como agente dispersante. En este caso particular, un 13% del aceite esencial de C. verum se añade en forma libre un 3% del aceite esencial de C. verum se añade encapsulado en un 10% de β-ciclodextrina para formar la composición WF_F4 y (Tabla 3).
Teniendo en cuenta las características del reactor descritas en el ejemplo 1, los elementos del núcleo bioactivo, la lecitina de soja y el resto de las sustancias inertes se añaden cuidosamente en un determinado orden, ajustando la temperatura y variables de rotación de cada agitador según se detalla en la Tabla 9.
Figure imgf000030_0001
2.5.2. Composición ADI-23
En un ejemplo de composición biopesticida, el núcleo bioactivo (7% de extracto hidroalcohólico de Z. officinale y 2,5% de aceite esencial de C. cassia, como fuente de cinamaldehído) se mezclan con un 13,5% de extracto hidroalcohólico de Persea americana, un 10% de aceite esencial de Cymbopogon citratus, un 17,5% de lecitina de soja (segundo componente con función de emulsionante y potenciador) y sustancias inertes. En este caso particular, el extracto de P. americana y aceite esencial de C. citratus también se consideran como segundos componentes.
Teniendo en cuenta las características del reactor descritas en el ejemplo 1, los elementos del núcleo bioactivo, los segundos componentes, y el resto de las sustancias inertes se añaden cuidosamente en un determinado orden, ajustando la temperatura y variables de rotación de cada agitador según se detalla en la Tabla 10.
Figure imgf000031_0001
2.5.3. Composición PW-1.5
En un ejemplo de composición biopesticida, el núcleo bioactivo (3% de extracto hidroalcohólico de Z. officinale y 2,5% de aceite esencial de C. verum, como fuente de cinamaldehído) se mezclan con un 7% de extracto hidroalcohólico de Persea americana, un 47,7% de fermento de Aspergillus niger, un 17,5% de lecitina de soja y sustancias inertes. En este caso particular, el extracto de P. americana y el producto de fermentación de Aspergillus y la lecitina se consideran como segundos componentes. Teniendo en cuenta las características del reactor descritas en el ejemplo 1, los elementos del núcleo bioactivo, segundos componentes, y el resto de las sustancias inertes se añaden cuidosamente en un determinado orden, ajustando la temperatura y variables de rotación de cada agitador según se detalla en la Tabla 11.
Figure imgf000032_0001
2.5.4. Composición MxM5 En un ejemplo de composición biopesticida, el núcleo bioactivo (1% de extracto hidroalcohólico de Z. officinale y 0,5% de aceite esencial de C. verum, como fuente de cinamaldehído) se mezclan con un 12,5% de citral, un 20% de benzoato de bencilo, un 17,5% de lecitina de soja (emulsionante potenciador) y sustancias inertes. En este caso particular, los compuestos puros citral y benzoato de bencilo se consideran segundos componentes. Teniendo en cuenta las características del reactor descritas en el ejemplo 1, los elementos del núcleo bioactivo, los segundos componentes, y las sustancias inertes se añaden cuidosamente en un determinado orden, ajustando la temperatura y variables de rotación de cada agitador según se detalla en la Tabla 12.
Figure imgf000033_0001
Ejemplo 3. Metodología de obtención de los segundos componentes
El material vegetal descrito en el Ejemplo 2 se somete a diferentes procesos de extracción para obtener los segundos componentes, tanto los que componen el núcleo bioactivo como los que se emplean como segundo componente.
A) Extractos acuosos, alcohólicos v/o hidroalcohólicos Para la extracción acuosa se emplea agua. En el caso de la extracción alcohólica se emplea una extracción con disolventes, preferentemente etanol, isopropanol o alcohol bencílico. El método de extracción se elige entre maceración (frío o caliente, en reposo o agitada), infusión, percolación, decocción, reflujo, ultrasonido, microondas, Soxhlet y, preferentemente, una extracción mediante una tecnología avanzada de dispersión multifuncional con molino coloidal, cuyo principio de funcionamiento es un sistema de rotor/ estator. Los perfiles químicos de los extractos se determinan mediante Cromatografía de Gases acoplada a Espectrometría de Masas (GC-MS-MS) y Cromatografía Líquida acoplada a Espectrometría de Masas (LC-MS-MS).
B) Aceites esenciales
Los aceites se obtienen mediante hidrodestilación, maceración en disolventes apolares (ej. acetona, hexano, diclorometano, éter de petróleo), extracción mediante fluidos supercríticos y preferentemente mediante destilación por arrastre de vapor según las metodologías descritas en la Farmacopea Europea (Ph. Eur. 8.0, 2013, ISBN: 978-92-871- 7525-0, 3513 pp.) bajo la certificación UNE EN ISO 9001: 215. Los perfiles químicos de los aceites esenciales se determinan mediante Cromatografía de Gases acoplada a Espectrometría de Masas (GC-MS). En la Figura 2 se muestra un diagrama típico del proceso de destilación por arrastre de vapor.
C. Fermentación
Los residuos sólidos secos de cítricos (cortezas, cáscaras, pulpa), el material vegetal original seleccionado entre los citados en los ejemplos 1-2 y/o residuos del proceso de extracción de estos se someten a un proceso de fermentación y posterior extracción. Para ello, la materia prima, en un porcentaje entre el 10-15%, se incuba en agua con uno de los diferentes microorganismos seleccionados ( Bacillus sp., Pseudomonas sp., Trichoderma sp. y Aspergillus sp.) durante 120h a28°C-30°C en un termentador F3-100 (Bionet, Murcia, España). Tras la incubación, el fermentado se centrifuga a 5000rpm durante 5 min (Hitachi Himac CR22N) y filtrado a través de un filtro de malla o tela. El líquido resultante queda listo para ser empleado en la formulación. El proceso general se detalla en el diagrama de flujo de la Figura 3.
D. Fraccionamiento químico biodirigido
En el marco de esta invención se realiza un fraccionamiento químico guiado por bioensayos de los extractos acuosos, alcohólicos y/o hidroalcohólicos que lo requieran. Para ello se emplean técnicas de extracción/separación convencionales y avanzadas de amplio conocimiento en la literatura especializada. Entre ellas podemos citar: extracción líquido- líquido, cromatografía líquida de vacío (VLC), cromatografía en columna (CC), cromatografía en fase sólida (ej. Sílice, Sephadex), cromatografía líquida preparativa de alta resolución (pHPLC) y fluidos supercríticos. Un ejemplo concreto de la obtención de una fracción bioactiva a partir del extracto de Persea americana se describe en la Figura
4. Ejemplo 4. Proceso de encapsulación del Cinamaldehído
Este proceso es válido tanto para la forma encapsulada de la fuente de cinamaldehído en el núcleo bioactivo como para cualquier forma encapsulada del segundo componente de la composición biopesticida.
En proceso de encapsulación se lleva a cabo en un reactor idéntico al descrito en el ejemplo 1 (Figura 1).
A continuación, se describe el proceso de encapsulación de C. verum como fuente de cinamaldehído. Para ello, se añaden 450 litros de agua en el reactor a 25°C. Posteriormente se incorpora lentamente 45 Kg de β-ciclodextrina (agente encapsulante) y se mantiene durante 30 minutos en agitación vigorosa (agitador Turrax a 3000 rpm y agitador Cowles a 1000 rpm). A continuación, el agitador Turrax se detiene y el agitador Cowles se ajusta a 500 rpm, añadiéndose lentamente 20 Kg de aceite esencial de C. verum. La mezcla se mantiene en esas condiciones de agitación durante 2 horas. Pasado este tiempo la mezcla se extrae del reactor y se deja reposar a 10°C durante 24 horas en un tanque de acero inoxidable acondicionado para este propósito. Posteriormente la mezcla se bombea (mediante vacío) hasta un tamiz (42 micrones) que separa las partículas sólidas del líquido. La parte líquida se almacena y se emplea para nuevos procesos de encapsulación y/o como agua en los procesos de formulación. Los sólidos se extienden en bandejas de acero inoxidable de 1 cm de grosor y se secan a temperatura controlada de 35°C durante otras 24 horas hasta alcanzar una humedad del 12%, estando listo para utilizar en el proceso de formulación de las composiciones biopesticidas.
Ejemplo 5. Dilución de las composiciones biopesticidas
De acuerdo con el número de productos que vayan a componer la mezcla se realiza una secuencia de mezclado específica para evitar incompatibilidades. La preparación del caldo o solución de aplicación final se realiza diluyendo la composición biopesticida reivindicada en al menos un disolvente, preferentemente agua. La cantidad de diluyente y magnitud de la dilución depende del tipo de cultivo, volumen de caldo requerido, especie de mosca y el nivel de infestación/daño en el momento de la aplicación. Como regla general el caldo de aplicación se realizará siguiendo los siguientes pasos: • Acondicionar el pH (5-7) y la dureza del agua (blanda).
• Realizar una premezcla en un volumen determinado de disolvente (ej. 1/3 del depósito) del (los) producto (s) que integre (n) la formulación. En caso de más de un producto se añaden primero las formulaciones sólidas y posteriormente las líquidas. Las premezclas se harán en agitación de acuerdo con las especificaciones y características de cada tanque de preparación del caldo que posea el usuario final. La duración del premezclado dependerá de las condiciones de cada usuario y del número de elementos que componen el caldo final.
• Añadir coadyuvante seleccionado (si procede). · Completar el depósito con la cantidad de disolvente adecuado según la dosis y mantener la agitación.
Las composiciones biopesticidas divulgadas se diluyen en un rango entre 50 y 10000 veces. A continuación, se muestran ejemplos de diluciones de las preparaciones mostradas en los ejemplos 1 y 2.
5.1. Diluciones de la composición mostrada en el Ejemplo 1.
En el ejemplo 1 se muestra un ejemplo de composición biopesticida (ver composición M0, Tabla 3) que sólo contiene el núcleo bioactivo. En la Tabla 13 se muestran algunos ejemplos de la concentración final de los elementos en el caldo final al aplicar diferentes factores de dilución.
Figure imgf000036_0001
5.2. Diluciones de las composiciones mostradas en el Ejemplo 2. En el ejemplo 2 se muestran diferentes ejemplos de composiciones biopesticidas que comprenden el núcleo bloactivo.
Un ejemplo es la composición biopesticida M1 (Tabla 3, Ejemplo 2.1) que contiene el núcleo bloactivo y la lecitina. En la Tabla 14 se muestran algunos ejemplos de la concentración final de los elementos en el caldo final al aplicar diferentes factores de dilución.
Figure imgf000037_0001
Otro ejemplo es la composición biopesticida M2 (Tabla 3, Ejemplo 2.2) que contiene el núcleo bloactivo y un segundo componente. En la Tabla 15 se muestran algunos ejemplos de la concentración final de los elementos en el caldo final al aplicar diferentes factores de dilución.
Figure imgf000037_0002
Otro ejemplo es la composición biopesticida M3 (Tabla 3, Ejemplo 2.3) que contiene el núcleo bloactivo y sustancias inertes. En la Tabla 16 se muestran algunos ejemplos de la concentración final de los elementos en el caldo final al aplicar diferentes factores de dilución.
Figure imgf000038_0001
Otro ejemplo es la composición biopesticida M4 (Tabla 3, Ejemplo 2.4) que contiene el núcleo bioactivo y dos segundos componentes. En la Tabla 17 se muestran algunos ejemplos de la concentración final de los elementos en el caldo final al aplicar diferentes factores de dilución.
Figure imgf000038_0002
Otro ejemplo es la composición biopesticida WF_F4 (Tabla 3, Ejemplo 2.5.1) que contiene el núcleo bioactivo, lecitina de soja y sustancias inertes. En la Tabla 18 se muestran algunos ejemplos de la concentración final de los elementos en el caldo final al aplicar diferentes factores de dilución.
Figure imgf000038_0003
Figure imgf000039_0001
Otro ejemplo es la composición biopesticida ADI-23 (Tabla 3, Ejemplo 2.5.2) que contiene el núcleo bioactivo, otros tres segundos componentes, y sustancias inertes. En la Tabla 19 se muestran algunos ejemplos de la concentración final de los elementos en el caldo final al aplicar diferentes factores de dilución.
Otro ejemplo es la composición biopesticida PW-1.5 (Tabla 3, Ejemplo 2.5.3) que contiene el núcleo bioactivo, otros tres elementos activos (uno de ellos es derivado de un proceso de fermentación), y sustancias inertes. En la Tabla 20 se muestran algunos ejemplos de la concentración final de los elementos en el caldo final al aplicar diferentes factores de dilución.
-38-
Tabla 19. Ejemplo de diluciones de la composición ADI-23 (núcleo bioactivo + 3 segundos componentes + sustancias inertes)
Figure imgf000040_0002
Tabla 20. Ejemplo de diluciones de la composición PW-1.5 (núcleo bioactivo + 3 segundos componentes + sustancias inertes)
Figure imgf000040_0001
Otro ejemplo es la composición biopesticida MxM5 (Tabla 3, Ejemplo 2.5.4) que contiene el núcleo bioactivo, dos segundos componentes (compuestos puros y lecitina de soja) y sustancias inertes. En la Tabla 21 se muestran algunos ejemplos de la concentración final de los elementos en el caldo final al aplicar diferentes factores de dilución.
Figure imgf000041_0001
Ejemplo 6. Protocolos generales de ensayos de laboratorio
6.1. Especies de moscas dianas
Las especies de plaga que se utilizaron como dianas biológicas para realizar la mayoría de los ensayos de eficacia y mecanismos de acción se detallan en la Tabla 22.
Figure imgf000041_0002
Las dianas se seleccionaron teniendo en cuenta la importancia económica de su incidencia sobre cultivos hortícolas, el desarrollo de resistencia a insecticidas de síntesis, su capacidad de transmisión de virus, así como su empleo generalizado como modelos de estudio para el manejo de plagas relacionadas pertenecientes al grupo de las moscas blancas.
6.2. Cría v mantenimiento de las dianas biolóaicas Para establecer las poblaciones se muestrearon diferentes poblaciones de adultos de cada una de las especies (Tabla 22). Las poblaciones son representativas de diferentes invernaderos de la provincia de Almería dónde existe una de las mayores concentraciones de cultivos bajo plástico. El “pool” representativo de cada una de las dianas se estableció sobre una de sus plantas huésped ( Phaseolus vulgaris L). La población establecida se mantuvo en cámaras climatizadas tipo “walk-in" en las siguientes condiciones ambientales: 22°C ± 1°C, 60-70 % de humedad relativa y un fotoperiodo de 16:8 horas (luz:oscuridad).
6.3. Productos de referencia
En los diferentes bioensayos que se describen a continuación se Incluyeron diferentes productos recomendados para el control de la mosca blanca y que se comercializan actualmente en el mercado (Tabla 23). El objetivo es emplearlos como controles positivos de la eficacia de las composiciones biopesticidas que se reivindican en esta invención.
Figure imgf000042_0001
6.4. Microensavos (in vitro e in vivo) de control de mosca blanca
Los protocolos de ensayo se desarrollaron con la finalidad de discriminar entre los diferentes modos y mecanismos de acción de las sustancias ensayadas. El núcleo bioactivo ( Zingiber offícinale + fuente de cinamaldehído) así como las diferentes composiciones biopesticidas objeto de esta invención, se evaluaron en ensayos de eficacia frente a las plagas seleccionadas. Para ellos se realizaron ensayos in vitro en placas petri e in vivo empleando modelos reproducibles en planta.
Descripción general de los tipos de ensayos de uso de las composiciones empleados en el marco de esta invención.
Los ensayos se dividen en tres grandes grupos:
Mortalidad por contacto: Determina la capacidad insecticida frente a mosca blanca de un producto a corto y medio plazo (0-24 h) mediante aplicación tópica. En este caso discriminamos entre dos mecanismos de acción:
• Efecto sobre la cutícula y membranas de la mosca (shock osmótico).
• Efecto sobre los órganos respiratorios de la mosca (asfixia).
Efecto sobre la conducta de la mosca: Determinan el efecto sobre el control de la mosca blanca de un producto a medio y largo plazo (24h-7días) mediante la interacción con los receptores del gusto y olfato.
• Repelencia espacial ( true repellents)·. La mosca se aleja de la zona tratada sin entrar en contacto directo con la sustancia (receptores olfativos).
• Irritantes ( Landing inhibitors)·. La mosca se aleja de la zona tratada después de entrar en contacto directo con la sustancia (receptores gustativos y olfativos).
Efectos antialimentarios ( antifeedants , deterrents ):
• Inhibición de la alimentación: La mosca entra en contacto con el producto, pero no se alimenta y termina alejándose del área tratada (receptores gustativos).
• Inhibición de la oviposición: La mosca entra en contacto con la zona tratada, pero se inhibe la puesta de huevos (receptores olfativos y gustativos).
A continuación, se describen las metodologías empleadas para cada uno de los ensayos propuestos.
Mortalidad por contacto
El objetivo del ensayo es evaluar el efecto de diferentes dosis de la sustancia a ensayar sobre la mortalidad de adultos de mosca blanca, mediante aplicación tópica.
El ensayo se realiza en botes de plástico con tapa de rosca de 10 cm de altura y 5 cm de diámetro. En el centro de la tapa se perfora un orificio de 2 cm2 que se cubre con una fina tela con longitud de poro 0.77 x 0.27 mm (longitudinal:transversal). Se corta un disco de hoja (5,7 cm2) de la planta huésped ( Phaseolus vuigaris) y se coloca (con el haz hacia abajo) en el fondo del bote previamente recubierto con una capa de agar de 1 cm de espesor (12% en agua p/v) que además de soporte, brinda la humedad necesaria al disco durante la duración del ensayo (24 horas). En cada bote se introducen 15 individuos adultos previamente capturados con un aspirador entomológico (Figura 5). El bote con las moscas se incuba durante un minuto a 4°C con el objetivo de disminuir momentáneamente la movilidad de la plaga y facilitar su asentamiento sobre el disco en la base del bote. Posteriormente, la sustancia a tratar (núcleo bioactivo, composición biopesticida, productos de referencia) se asperja uniformemente sobre las moscas asentadas en el fondo del bote empleando un difusor portátil. Una vez aplicado el producto los botes se mantienen en una cámara climatizada con las mismas condiciones descritas para la cría de la mosca. Cada ensayo de mortalidad en adultos consta de 20 botes (réplicas) para cada uno de los tratamientos y 20 botes (réplicas) para el control (agua). A su vez, cada uno de los ensayos se replica 3 veces en el tiempo.
Las diferentes combinaciones del núcleo bioactivo (Tabla 3) se ensayan a una concentración inicial entre 0,01-0,5% del caldo de aplicación. Las composiciones biopesticidas (Tabla 3) y productos de referencia, se aplican en el intervalo de dosis recomendadas (entre 1-5 mi de formulado/Litro de agua). Al final del ensayo (24 horas) se procede a contar el número de moscas vivas y muertas con ayuda de una lupa estereoscópica. En el caso de la determinación del efecto “ knock-down ” o volteo, el conteo se realiza de forma seriada a las 2, 4, 6, 8, 16 y 24 horas después de aplicado el tratamiento. La mosca se considera muerta cuando no muestra ningún signo de movilidad al tocarla con un pincel entomológico. La mortalidad se expresa en % con respecto al control y los datos se corrigieron empleando la fórmula de Abbott:
Figure imgf000044_0001
donde,
X= Porcentaje (%) de mortalidad en el tratamiento e Y= Porcentaje (%) de mortalidad en el control
Los datos se compararon mediante Análisis de Varianza (ANOVA, p<0.05) y la prueba LSD ( post hoc test) para verificar las diferencias entre las medias. Para ello, se empleó el paquete estadístico IBM® SPSS Statistics®. En caso de no normalidad de los datos se aplicará la prueba no paramétrica de rangos múltiples de Wilconxon (p<0,05). Los tratamientos con un porcentaje de mortalidad significativo (>70%) se seleccionan para estudios de dosis- respuesta. La dosis a la que se produce el 50% del efecto deseado (EC50) se calcula mediante un análisis de regresión probit basado en el logaritmo de la dosis ( Log-dose probit). Las moscas muertas se observan detenidamente al microscopio con el objetivo de diferenciar el mecanismo por el cual se produce la mortalidad (Figura 6). En el marco de esta invención los mecanismos se diferenciaron de la siguiente forma:
Mosca muerta que conserva su forma y estructura intacta con un leve color amarillento: Se propone la asfixia como mecanismo de acción primario.
Mosca muerta que ha perdido su forma y estructura (desintegrado y/o aplastado) con un color marrón: Se propone un shock osmótico por desintegración de la membrana/cutícula como mecanismo de acción primario.
En los ejemplos de realización posteriores se explican las composiciones biopesticidas, concentraciones, organismos y detalles más concretos empleados para cada experimento particular.
Efectos sobre la conducta de la mosca: Repelencia directa
Para los estudios de repelencia directa se empleó la metodología del olfatómetro.
En los estudios referidos en esta memoria se emplea un olfatómetro de tres brazos (“ arms ”) en Y ( Y-tube ) tal como se muestra en la Figura 7. Se prepararon dos botes de plástico con tapa de rosca de 10 cm de altura y 5 cm de diámetro. En el centro de la tapa se perfora un orificio de 2 cm2 que se cubre con una fina tela con longitud de poro 0.77 x 0.27 mm (longitudinal:transversal). Se corta un disco de hoja (5,7 cm2) de la planta huésped ( Phaseolus vulgaris) y se coloca (con el haz hacia abajo) en el fondo del bote previamente recubierto con una capa de agar de 1 cm de espesor (12% en agua p/v) que además de soporte, brinda la humedad necesaria al disco durante la duración del ensayo (24 horas).
En uno de los brazos superiores se colocó uno de los botes tratado con la sustancia a ensayar (composición biopesticida) a probar y en el otro un bote idéntico con un disco tratado con agua (control). Por el brazo inferior se liberan las moscas. El experimento se incuba en cámaras climatizadas tipo “walk-in" en las siguientes condiciones ambientales: 22°C ± 1°C, 60-70 % de humedad relativa y un fotoperiodo de 16:8 horas (luz:oscuridad). En cada ensayo se emplearon 3 olfatómetros que se consideraron como réplicas. Después de 24h se procede a contar las moscas asentadas en el tratamiento y en el control y se calcula el índice de repelencia (%RI) para cada sustancia ensayada empleando la siguiente fórmula:
Figure imgf000045_0001
Donde, T: Número de moscas vivas dentro de la cámara tratada (asentados sobre el disco tratado y/o en las paredes del bote)
C: Número de moscas vivas dentro de la cámara control (asentados sobre el disco control y/o en las paredes del bote) Las medias de los %RI se analizaron mediante la prueba no paramétrica de rangos múltiples de Wilconxon (Wilconxon signed-rank-test) (p<0,05), empleando el paquete estadístico IBM® SPSS Statistics®.
En los ejemplos de realización posteriores se explican las composiciones biopesticidas, concentraciones, organismos y detalles más concretos empleados para cada experimento particular.
Efectos sobre la conducta de la mosca: Efectos antialimentarios (Repelencia indirecta)
En el marco de esta invención hemos considerado como antialimentario cualquier sustancia que actúe sobre la conducta de la mosca inhibiendo su alimentación, asentamiento y oviposición. La inhibición del asentamiento se considera como un efecto de repelencia indirecta.
Bioensayos de inhibición del asentamiento in planta (choice).
Este tipo de ensayo determina el efecto de las sustancias ensayadas sobre el asentamiento de adultos de mosca blanca en plantas huésped ( Phaseolus vulgaris). Se basa en la preferencia de los adultos por plantas huésped tratadas y control colocadas en la misma caja. Para el desarrollo del bioensayo se diseñaron cajas entomológicas de metacrilato rectangulares de 50x35 cm (alto x ancho) con tapa en la parte superior. En la tapa se practica un orificio de ventilación de 25 cm de diámetro cubierto con una malla con longitud de poro 0,77 x 0,27 mm (longitudinal: transversal). Se preparan dos macetas idénticas cada una con planta huésped en estadio de 2 hojas totalmente desarrolladas (el resto de las hojas laterales y apicales se eliminaron). Una de las plantas se trata con la solución a ensayar (núcleo bioactivo, composición biopesticida) y la otra con agua (control), con un difusor portátil; asegurándose una buena cobertura del producto en ambas caras de la hoja. Ambas plantas (tratadas y control) se colocan en la misma caja entomológica. Posteriormente se coloca un bote con 100 individuos adultos de mosca blanca en un punto equidistante entre las dos plantas, en la base de la caja. En la Figura 8 se puede observar el diseño experimental.
Posteriormente, se procede a tapar la caja y se incubaron en una cámara climatizada con las mismas condiciones descritas anteriormente. Cada ensayo de repelencia consta de 5 cajas (réplicas) para cada una de las variantes analizadas. Al final del ensayo (24 horas) se procede a contar el número de individuos vivos asentados en la planta tratada y control. Además, se cuenta el número de individuos muertos en ambas superficies de la misma forma que en los ensayos de mortalidad. Con estos datos se calcula el índice de inhibición del asentamiento (%SI) según la siguiente fórmula:
Figure imgf000047_0001
donde,
T: Moscas asentadas en las plantas tratadas
C: Moscas asentadas en las plantas control Los datos se analizaron mediante la prueba no paramétrica de rangos múltiples de Wilconxon (p<0,05), empleando el paquete estadístico IBM® SPSS Statistics® Los tratamientos con un porcentaje de inhibición del asentamiento (>60%) se seleccionaron para estudios de dosis- respuesta. La dosis a la que se produce el 50% del efecto deseado (EC50) se calculó mediante un análisis de regresión probit basado en el logaritmo de la dosis ( Log-dose probit ). En los ejemplos de realización posteriores se explican las composiciones biopesticidas, concentraciones, organismos y detalles más concretos empleados para cada experimento particular.
Bloensavos de inhibición de la oviposición
Este ensayo determina el efecto de las diferentes sustancias sobre la puesta de huevos de adultos de la plaga en plantas huésped ( Phaseolus vulgaris) tratadas y control colocadas en la misma caja (ensayos de elección).
El experimento se lleva a cabo en cajas entomológicas de metacrilato y se procede de la misma forma que en los bioensayos de inhibición del asentamiento in planta (Figura 8). Al finalizar el experimento se retiran los adultos asentados en los folíolos y se cuentan los huevos en una lupa estereoscópica. Con los datos obtenidos se calcula el índice de Inhibición de la Oviposición (%IO) de acuerdo con la siguiente fórmula:
Figure imgf000047_0002
donde, T= número de huevos depositados en el tratamiento y
C= número de huevos depositados en el control. Los datos se analizaron mediante la prueba no paramétrica de rangos múltiples de Wilconxon (p<0,05), empleando el paquete estadístico IBM® SPSS Statistics®. Los tratamientos con un porcentaje de inhibición del asentamiento (>60%) se seleccionaron para estudios de dosis- respuesta. La dosis a la que se produce el 50% del efecto deseado (EC50) se calculó mediante un análisis de regresión probit basado en el logaritmo de la dosis ( Log-dose pro bit).
En los ejemplos de realización posteriores se explican las composiciones biopesticidas, concentraciones, organismos y detalles más concretos empleados para cada experimento particular. Ejemplo 7. Protocolo general de ensayos de campo
Los protocolos de ensayos de campo (campo abierto) y semicampo (inveradero) para la evaluación de la actividad, sobre el control de la mosca blanca, de las composiciones biopesticidas de la presente memoria se diseñan de acuerdo con las directrices de la OEPP/EPPO (i OEPP/EPPO Bulletin, 2012, 42 (3), 367-381 ). En los ejemplos de realización posteriores se explica detalladamente el diseño experimental en cada uno de los ensayos particulares.
Ejemplo 8. Actividad biopesticida y efectos sinérgicos del núcleo bioactivo
En la Tabla 24 se muestra la actividad insecticida (mortalidad) y antialimentaria (repelencia e inhibición de la oviposición) del núcleo bioactivo reivindicado y sus componentes frente a mosca blanca. Se presentan los resultados de eficacia de los elementos individuales que componen el núcleo a dos concentraciones:
• La mayor corresponde a la dosis máxima a la cual se ensaya el ingrediente durante el proceso de screening.
• La menor corresponde a una de las dosis (% p/v) a las que puede encontrase el ingrediente en el caldo de aplicación final.
En el caso de núcleo bioactivo, cuando se combinan los elementos en determinadas proporciones [(A)+(B)], se presenta la dosis (% p/v) a la que se encuentra el núcleo en el caldo de aplicación final. En todas las dianas y para todos los mecanismos de acción estudiados, se observó que la eficacia conseguida con el núcleo bioactivo era mayor de lo esperado y superaba, sorprendentemente, los niveles obtenidos cuando se aplicaban los elementos por separado. Esto confirma la existencia de un efecto sinérgico y/o potenciador de la mezcla (Ejemplo 9). Dicho efecto se manifiesta de la siguiente forma: • Incremento significativo de la actividad para cada uno de los mecanismos de acción individuales: mortalidad-repelencia-oviposición.
• Disminución significativa de las dosis efectivas de eficacia de la mezcla comparado con las que se utilizan en los componentes individualmente.
Figure imgf000049_0001
Ejemplo 9. Demostración del efecto sinérgico del núcleo bioactivo
Una de las principales ventajas de esta invención es el efecto sinérgico en el control de moscas pertenecientes al grupo de las moscas blancas (mortalidad, repelencia e inhibición de la oviposición) que se logra al combinar los elementos activos que conforman el núcleo bioactivo. En sentido estricto, la sinergia se define desde el punto de vista matemático como la interacción entre dos o más componentes en una mezcla de tal forma que:
Se obtiene un efecto mayor que el resultante de la suma de los efectos de los componentes individuales a la misma dosis en la que se encuentran en la mezcla (sinergia de potenciación).
Se obtiene un efecto igual al resultante de la adición de los efectos de los componentes individuales a la misma dosis en la que se encuentran en la mezcla (sinergia de adición).
Sin embargo, esta definición resulta muy difícil de aplicar en su sentido estricto en los siguientes casos:
Mezcla de extractos de plantas, debido a los diferentes efectos que se derivan de su compleja composición química, muchas veces no cuantificada.
Composiciones que tengan diferentes mecanismos de acción. Los efectos sinérgicos deben ser estudiados frente a un mecanismo de acción conocido asumiendo linealidad en la respuesta. Sin embargo, existen diferentes aplicaciones de combinaciones sinérgicas en el campo de la fitomedicina ( Phytomedicine , Vol. 8 (5), pp. 401-409. 2001) y en composiciones pesticidas (Neth. J. PlantPath. 70, 1964; US005837652A, ES 2 153503 T3). El efecto sinérgico que se logra en la mezcla con respecto a los componentes individuales se manifiesta de dos formas: Incremento significativo de la actividad para cada uno de los mecanismos de acción individuales: mortalidad-repelencia-oviposición.
Disminución significativa de las dosis efectivas de eficacia (EC50) de los elementos en la mezcla comparado con las dosis en las que se utilizan individualmente.
Para la demostración de los efectos sinérgicos en el marco de esta patente hemos empleado dos métodos:
(1) El método de las isobolas, uno de los más utilizados ya que es independiente del mecanismo de acción. La metodología se describe en ( Phytomedicine , Vol. 8(5), pp. 401-409. 2001).
(2) La metodología propuesta por Limpel (Proc. North. Weed Control Conf., v. 16, p. 48-53, 1962) que emplea la siguiente fórmula: donde,
Figure imgf000050_0001
E = Es el porcentaje esperado de eficacia de la mezcla de los elementos (A) y (B) a dosis determinadas.
X = Es el porcentaje de eficacia del ingrediente (A) a una dosis determinada.
Y = Es el porcentaje de eficacia del ingrediente (B) a una dosis determinada.
Demostración del efecto sinérgico del núcleo bioactivo frente a mosca blanca: a) Método de las ¡sobólas En la Tabla 25 se puede observar el efecto de diferentes combinaciones del núcleo bioactivo sobre la mortalidad de Bemisia tabaci en ensayos de aplicación tópica. Las dosis se refieren a la concentración del ingrediente (% p/v) en el caldo final de aplicación. En todos los casos, las diferentes combinaciones de los elementos tuvieron una mayor eficacia que los elementos por separado. A partir de estos resultados se calculó la EC50 para cada una de las combinaciones aplicando las siguientes diluciones:
• Dosis (A) + Dosis (B): equivale al %M expresado en la Tabla 25
• [Dosis (A) + Dosis (B)] /2
• [Dosis (A) + Dosis (B)] /4
• [Dosis (A) + Dosis (B)] /8 • [Dosis (A) + Dosis (B)] / 16
Figure imgf000051_0001
La Figura 9 muestra el gráfico de ¡sobólas con los valores de EC50 calculados a partir de los valores observados (línea de puntos) y los valores aditivos esperados (línea continua negra) para una serie de combinaciones de los componentes que conforman el núcleo sinérgico (ver valores en Tabla 25).
La línea recta que conecta las EC50 de los componentes individuales contiene todas las posibles combinaciones entre ellos que producirían un efecto aditivo (isobola). Los puntos representan las EC50 experimentales de cada una de las combinaciones. Se puede observar el perfil de interacción (A+B) donde aparece una curva cóncava (característico de sinergia), indicando que con dosis bajas de ambos compuestos (con respecto a las dosis efectivas de los elementos por separado) se obtiene una elevada mortalidad.
(b) Método de Limpel La metodología propuesta por Limpel ( Proc . North. Weed Control Corrí., v. 16, p. 48-53, 1962) emplea la fórmula descrita anteriormente (método de Limpel). Si tomamos los valores de la Tabla 24:
• X= 35.7 % (corresponde al porcentaje de mortalidad del Ingrediente A al 0.06%)
• Y= 2.3 % (corresponde al porcentaje de mortalidad del Ingrediente B al 0.024%) Sustituimos en la fórmula: E (valor esperado) = 35.7 + 2.2 - (35.7 x 2.2) /100 = 37.12 % de mortalidad
El valor observado según se representa en la Tabla 23 es de 74.3 % de mortalidad, significativamente superior al valor esperado, denotando la existencia de una sinergia.
Ejemplo 10. Liberación controlada de la fuente de cinamaldehído
En muchos casos la actividad repelente se debe a la presencia de compuestos volátiles que interactúan con los quimiorreceptores de las moscas. Debido a su naturaleza volátil, estos compuestos tienen una eficacia a muy corto plazo que se pierde al cabo de las horas. Además, su baja solubilidad en agua y su tendencia a la oxidación con la luz hacen compleja su formulación. La formación de complejos con ciclodextrinas (encapsulación) es una de las tecnologías más empleadas para la protección y liberación controlada de este tipo de sustancias.
Varias de las composiciones biopesticidas que se divulgan en esta memoria tienen, al menos un componente encapsulado, garantizando la liberación controlada del ingrediente activo. En esta invención la encapsulación se ha llevado a cabo usando el método de coprecipitación por su eficiencia de encapsulación (>60%) y su facilidad de escalado.
Teniendo en cuenta los resultados obtenidos (Tabla 26) se seleccionó preferentemente la b- ciclodextrina (W 7) como matriz. El proceso se realizó como se detalla en el Ejemplo 4. Se obtuvo un porcentaje de encapsulación del 80%. La eficacia de la encapsulación desde el punto de vista químico se siguió mediante análisis de cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas (GC-MS). En la Figura 10 se muestra el seguimiento cromatográfico (GC-MS) del proceso. El proceso de encapsulación favorece la retención de algunos componentes bioactivos del extracto y su liberación controlada.
En la Tabla 26, se muestra la actividad del aceite esencial de C. verum libre y encapsulado (tomado como ejemplo de fuente de cinamaldehído) sobre el comportamiento (repelencia e inhibición de la oviposición) de la mosca blanca ( Bemisia tabaci). La encapsulación con b- ciclodextrina (W 7) según la metodología propuesta en el Ejemplo 4 presentó los mejores resultados en eficacia y liberación controlada.
Figure imgf000052_0001
Figure imgf000053_0002
Ejemplo 11. Definición de los mecanismos de acción atribuidos al núcleo bioactivo El objetivo de este ejemplo es demostrar la contribución Individual de los elementos a los mecanismos de acción del núcleo bioactivo para lograr el efecto final sobre el control de la mosca blanca.
En la Tabla 27 se muestra la actividad Insecticida frente a mosca blanca de diferentes concentraciones de los componentes Individuales del núcleo bioactivo (extracto hidroalcohólico de raíces/rizomas de Z. offícinale y aceite esencial de hojas de C. verum como fuente de cinamaldehído) y la composición MO (composición biopesticida formada por el núcleo bioactivo, Tabla 3).
Figure imgf000053_0001
del efecto, 95% confianza (límite inferior, superior); * p < 0.05, Wilcoxon paired test; Composición MO según se detalla en Tabla 3.
En las figuras 11, 12 y 13 se muestran las curvas de dosis-respuesta de los elementos del núcleo bioactivo para la mortalidad por contacto, inhibición del asentamiento e inhibición de la oviposición, respectivamente. Como se puede observar el extracto hidroalcohólico de Z officinale tiene una contribución muy marcada en el efecto de mortalidad por contacto, mientras que el aceite esencial de hojas de C. verum (fuente de cinamaldehído) contribuye más a los efectos antialimentarios (inhibición del asentamiento e inhibición de la oviposición), tal y como se resume en la Tabla 2.
Ejemplo 12. Efecto potenciador y/o cooperativo de la lecitina
En el marco de esta invención se divulga el uso de la lecitina como potenciador de la actividad de la composición biopesticida y en particular del núcleo bioactivo.
Para el estudio de los efectos potenciadores y/o cooperativos se diseñaron diferentes combinaciones entre los elementos que componen el núcleo bioactivo y la lecitina de soja. Para el diseño de las combinaciones se escogieron concentraciones subletales de los diferentes componentes. Se empleó la metodología del Triángulo de Gibbs ( Triangle Screen Formulation Approach) como se muestra en la Figura 14.
En este ejemplo se estudian posibles combinaciones sinérgicas entre los componentes A (Extracto hidroalcohólico de raíces de Zingiber officinale), B (aceite esencial de hojas de C. verum) y C (Lecitina de soja) tomando como punto de partida sus concentraciones subletales de mortalidad por contacto frente a mosca blanca según Tabla 26. El triángulo superior muestra las diferentes combinaciones y el inferior las diferentes proporciones de cada combinación.
En la Tabla 28 se muestra, a título ilustrativo y no limitativo, la eficacia frente a mosca blanca de una de las combinaciones del núcleo bioactivo con la lecitina de soja empleada en las composiciones biopesticidas. La combinación “33” corresponde a la combinación A+B+C en una proporción de 3:3:3 (ver triangulo de Gibbs) que corresponde a las siguientes concentraciones en el caldo de aplicación: A:0.02%, B:0.06%, C: 0.07%.
Figure imgf000055_0001
Ejemplo 13. Validación de las composiciones biopesticidas frente a mosca blanca
En la Tabla 29 se muestra la actividad frente a mosca blanca de todas las composiciones biopesticidas (Tabla 3) y productos de referencia empleados como controles positivos con fines comparativos. Todas las composiciones biopesticidas presentan una alta eficacia en el control de la mosca blanca, estadísticamente significativa cuando se compara con el control. Las composiciones muestran eficacias similares y/o superiores a los productos de referencia (químicos y naturales) que actualmente existen en el mercado para el control de la mosca blanca.
Figure imgf000055_0002
Figure imgf000056_0001
Ejemplo 14. Efecto repelente (repelencia directa) del núcleo bioactivo frente a mosca blanca
En la Tabla 30 se muestra el efecto de repelencia directa del núcleo bioactivo (composición MO de la Tabla 3). La metodología empleada se detalla en el ejemplo 6.4. Como se puede observar el núcleo bioactivo muestra un potente efecto repelente frente a adultos de mosca blanca.
Figure imgf000056_0002
Ejemplo 15. Efecto de la composición WF_F4 sobre la dinámica poblacional de mosca blanca en ensayo de invernadero 15.1. Antecedentes
El estudio se llevó a cabo con el objetivo de evaluar la eficacia en invernadero de la composición WF_F4 (7.5% de extracto hidroalcohólico de raíces de Z. officinale y 16% de aceite esencial de hojas de C. verum) frente a mosca blanca en berenjena ( Solanum melongena). Como variables de eficacia se emplearon el efecto sobre la reducción del número de adultos y el número de huevos. El diseño experimental empleado fue bloques al azar con 7 tratamientos y 3 réplicas por tratamiento.
El ensayo se llevó a cabo en Roquetas de Mar (Almería, España) durante 2019. Almería tiene la más alta concentración de invernaderos a nivel mundial y es uno de los principales proveedores de hortícolas en Europa. El cultivo de berenjena representa alrededor del 5% del área de invernadero en Almería. Las moscas blancas ( Bemicia tabaci y Trialeurodes vaporariorum) se consideran las plagas principales que atacan este cultivo.
Por todo lo antes expuesto, el área seleccionada para el ensayo se considera representativa para llevar a cabo un ensayo de eficacia de este tipo.
15.2. Objetivos
• Evaluar la eficacia de la composición WF_F4 en la reducción de adultos de mosca blanca ( B . tabaci) en berenjena.
• Evaluar la eficacia de la composición WF_F4 en la reducción de huevos de mosca blanca ( B . tabaci) en berenjena.
• Comparar la eficacia de la composición WF_F4 con productos de referencia químicos y de origen natural.
• Evaluar la fitotoxicidad de la composición WF_F4 sobre el cultivo principal y su efecto sobre insectos beneficiosos ( non-target ).
15.3. Productos de referencia
Como controles positivos se emplearon tres productos comerciales de referencia empleados para el control de la mosca blanca (Tabla 31). Réquiem® es una formulación natural registrada en Estados Unidos y otros países.
Figure imgf000057_0001
15.4. Tratamientos
Los tratamientos y dosis empleados se detallan en la Tabla 32
Figure imgf000058_0001
15.5. Información general del ensayo
Sobre el cultivo
• Especie: Solanum melongena (Berenjena)
• Distancia entre plantas (m): 0.75
• Distancia entre filas (m): 3
• Densidad de plantación: 10000 plantas/ha
• Sistema de riego: Goteo
Sobre la parcela
• País: España
• Localidad: Roquetas de Mar (Almería)
• Código postal: 04740
• Coordenadas (N/W): 36,442272 / 2,515594
• Ancho de la parcela (m): 3
• Longitud de la parcela (m): 4
• Tamaño de la parcela experimental: 12 m2
• Réplicas: 3
• Tratamientos: 7
• Número de parcelas: 21
• Área de ensayo: 300 m2
15.6. Diseño experimental
Se empleó un diseño experimental de bloques al azar. En la Figura 15 se muestra una representación gráfica del diseño y la distribución espacial de las parcelas experimentales.
15.7. Esquema de aplicación En la Tabla 33 se detallan las características de la aplicación. Se realizó una sola aplicación.
Figure imgf000059_0001
15.8. Variables de eficacia v toma de datos
En la Tabla 34 se muestran las variables de eficacia y momentos de muestreo.
Figure imgf000059_0002
Las fechas de toma de dato fueron las siguientes:
1. DAA-0: 06/08/19 (Momento de la aplicación)
2. DAA-1 : 07/08/19 (Un día después de la aplicación)
3. DAA-3: 09/08/19 (Tres días después de la aplicación)
4. DAB-6: 12/08/19 (Seis días después de la aplicación)
En cada muestreo se seleccionaron 4 plantas al azar y se muestrearon 3 hojas de cada planta. El número de adultos se determinó contando las moscas vivas sobre ambas superficies (haz y envés) de la hoja seleccionada. En el caso de los huevos, de cada hoja muestreada, se tomaron discos de 2 cm2 y se contaron los huevos con ayuda de una lupa estereoscópica.
15.9. Efectos sobre el cultivo
Además de las variables de eficacia se tomaron los siguientes datos: • Porcentaje de área dañada por fitotoxicidad (si existe).
• Efecto visual (diagnóstico de oficio) sobre insectos beneficiosos ( non-target ). 15.10. Procesamiento de los datos v análisis estadístico Los datos (número de adultos y número de huevos por hoja) se expresaron como medias de 12 mediciones independientes en cada tratamiento y réplica. Los datos observados (medias) se expresaron con respecto al control empleando la fórmula de Henderson-Tilton que se expone a continuación:
Figure imgf000060_0001
donde,
Ta= Número de adultos/huevos en el tratamiento después de la aplicación
Tb= Número de adultos/huevos en el tratamiento antes de la aplicación
Ca= Número de adultos/huevos en el control después de la aplicación Cb= Número de adultos/huevos en el control antes de la aplicación.
Los valores corregidos de eficacia se compararon mediante Análisis de Varianza (ANOVA) simple (p<0.05). Para la comparación de medias se empleó la prueba post hoc de las mínimas diferencias significativas (LSD). En el análisis se empleó el paquete estadístico IBM® SPSS Statistics®.
15.11. Resultados y discusión
En las Tablas 35 y 36 se muestra la eficacia corregida de la composición WF_F4 y productos de referencia sobre el número de adultos y huevos de mosca blanca, respectivamente.
Figure imgf000060_0002
Figure imgf000061_0001
Los datos obtenidos muestran una clara eficacia del producto en el control de la mosca blanca. La composición WF_F4 muestra niveles muy significativos de reducción del número de adultos y huevos de mosca blanca hasta 6 días después de la aplicación. Los resultados obtenidos con la composición WF_F4 fueron claramente superiores a las eficacias de los productos de referencia tanto químicos como naturales.
No se detectaron síntomas de fitotoxicidad sobre el cultivo tratado con la composición WF_F4 ni con los productos de referencia a ninguna de las dosis ensayadas. Además, no se observaron efectos sobre la fauna beneficiosa a lo largo de todo el experimento.

Claims

REIVINDICACIONES
1. Una composición biopesticida que comprende un núcleo bioactivo sinérgico, formado por:
- aceite esencial, oleorresina, extracto acuoso, alcohólico o hidroalcohólico de raíz o rizomas de Zingiber offícinale Roscoe y
- cinamaldehído o fuente de cinamaldehído.
2. Una composición biopesticida según la reivindicación anterior, en la que la concentración, % peso /peso, de cada componente en el núcleo bioactivo se encuentra en los siguientes intervalos: aceite esencial, oleorresina, extracto acuoso, alcohólico o hidroalcohólico de raíz o rizomas de Zingiber offícinale Roscoe: 0,1-99,9%, preferentemente 10-90%, más preferentemente 20-80%, aún más preferentemente 30-70% y más preferentemente 40-60% y cinamaldehído o una fuente de cinamaldehído: 0,1-99,9%, preferentemente 10-90%, más preferentemente 20-80%, aún más preferentemente 30-70% y más preferentemente 40-60%.
3. Una composición biopesticida según la reivindicación anterior, en la que la fuente de cinamaldehído son extractos/aceites esenciales de especies vegetales que lo contengan, preferentemente del género Cinnamomum sp. más preferentemente: C. verum. -sinonimia., Cinnamomum zeylanicum-, C. cassia, C. loureirii, C. burmannii, C. tamala, C. osmophloeum, C. bejolghota, C. dubium, C. rivulorum, C. citriodorum y C. camphora.
4. Una composición biopesticida según la reivindicación anterior, en la que el cinamaldehído y/o la fuente de cinamaldehído está presente en forma libre y/o encapsulada en un agente encapsulante.
5. Una composición biopesticida según la reivindicación anterior, en la que el agente encapsulante se selecciona entre: maltodextrinas, ciclodextrinas, lecitinas, aceites vegetales y/o excipientes de sílice, estos últimos comprenden gel de sílice (sílica gel), sílice coloidal y dióxidos de silicio, preferentemente ciclodextrinas.
6. Una composición biopesticida según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la composición biopesticida comprende un segundo componente que es uno o más elementos activos seleccionados entre:
- extractos botánicos o fracciones de los mismos, extracto obtenido partir de fermentados de microorganismos o fracciones de los mismos, compuestos puros seleccionados entre geranial -citral A-, neral -citral B-, saponinas, alcohol bencílico, benzoato de bencilo, acetato de bencilo, eugenol, 1,8-cineol, timol, geraniol, acetato de geranilo y ácidos grasos, seleccionados entre: saturados de cadena corta y larga, preferentemente los de cadena larga, e insaturados y derivados de ácidos grasos, por ejemplo, metilados, ásteres metílicos de ácidos grasos, FAME, más preferentemente ácidos grasos saturados de cadena larga y/o ácidos grasos insaturados y lecitina, preferentemente de huevo, girasol, colza, maíz, algodón, cacahuete o soja.
7. Una composición biopesticida según la reivindicación anterior, en la que el extracto botánico se selecciona entre: extractos acuosos, alcohólicos e hidroalcohólicos y/o aceites esenciales.
8. Una composición biopesticida según la reivindicación anterior, en la que el extracto botánico se selecciona entre residuos agroindustriales, bulbos, semillas, hojas, folículos, flores y/o parte aérea completa a partir de plantas pertenecientes a los siguientes géneros: Allium sp., Angélica sp., Annona sp., Artemisia sp., Carum sp., Cassia sp., Chenopodium sp., Citrus sp., Coffea sp., Crocus sp., Cúrcuma sp., Cyamopsis sp., Cymbopogon sp., Cytisus sp., Eucalyptus sp., Eurycoma sp., Ficus sp., Foeniculum sp., Fumaria sp., Geranium sp., Ginkgo sp., Helianthus sp., Hyssopus sp., Jatropha sp., Lavandula sp., Mentha sp., Moringa sp., Nigella sp., Ocimum sp., Olea sp., Papa ver sp., Pelargononium sp., Persea sp., Petroselinum sp., Pimpinella sp., Prunus sp., Quassia sp., Retama sp., Rheum sp., Rosmarinus sp., Salvia sp., Satureja sp., Schoenocaulon sp., Syzygium sp., Trigonella sp., Thymus sp. y Vitis sp., preferentemente las especies; Allium sativum, Angélica archangelica, Annona cherimola, Artemisia absinthium, Carum carvi, Cassia angustifolia, Cassia senna, Chenopodium ambrosioides, Citrus aurantium, Citrus limón, Citrus sinensis, Coffea arabica, Crocus corsicus, Crocus sativus, Crocus speciosus, Crocus vernus, Cúrcuma aromática, Cúrcuma tonga, Cymbopogon citratus, Cyamopsis tetragonoloba, Cymbopogon flexuosus, Cymbopogon martinii, Cymbopogon nardus, Cytisus scoparius, Eucalyptus camaldulensis, Eucalyptus globulus, Eurycoma longifolia, Ficus carica, Fumaria officinalis, Foeniculum vulgare, Geranium macrorrhizum, Ginkgo biloba, Helianthus annuus, Helianthus tuberosum, Hyssopus officinalis, Jatropha curcas, Lavandula angustifolia, Lavanda x intermedia, Lavandula luisieri, Mentha piperita, Mentha spicata, Moringa oleífera, Nigella sativa, Ocimum basilicum, Olea europaea, Papaver rhoeas, Papaver somniferum, Pelargonium citriodorum, Pelargonium graveolens, Persea americana, Persea indica, Petroselinum sativum (sin. P. crispum), Pinpinella anisum, Prunus pérsica, Quassia amara, Retama monosperma, Retama sphaerocarpa, Rheum rhabarbarum, Rheum officinale, Rosmarinus officinalis, Salvia lavandulifolia, Salvia officinalis, Satureja montana, Schoenocaulon officinale, Syzygium aromaticum, Trigonella foenum- graecum, Thymus vulgaris, Thymus zygis y Vitis vinifera.
9. Una composición biopesticida según la reivindicación 6, en la que los extractos se seleccionan fermentos obtenidos a partir de la fermentación de un sustrato con Bacillus sp., Pseudomonas sp., Tríchoderma sp. Corynebacteríum sp. y Aspergillus sp, preferentemente: Aspergillus niger, Tríchoderma harzianum, Bacillus thuringiensis, Pseudomonas fluorescens, Bacillus amyloliquefaciens, Corynebacteríum efficiens y Bacillus subtilis.
10. Una composición biopesticida según la reivindicación anterior, en la que el sustrato de fermentación se selecciona entre residuos agroindustriales, bulbos, semillas, hojas, folículos, flores y/o parte aérea completa a partir de plantas pertenecientes a los siguientes géneros: Zingiber sp., Citrus sp., Cyamopsis sp., Crocus sp., Helianthus sp., Petroselinum sp., Papaver sp., Rheum sp., Salvia sp., Retama sp., Lavandula sp., Prunus sp., Persea sp., Cúrcuma sp. y Thymus sp, preferentemente: Agaricus bisporus, Cyamopsis tetragonoloba, Helianthus annus, Citrus x sinensis y Glycine max.
11. Una composición biopesticida según la reivindicación 6, en la que los compuestos puros se obtienen a partir de alguna(s) de las siguientes fuentes: para los isómeros del citral, geranial y neral, las especies incluidas en los géneros Cymbopogon sp. y Litsea sp., Aloysia sp., Ocimun sp., Melissa sp. y Citrus sp. para eugenol las especies incluidas en el género Cinnamomum sp., Syzygium sp., Cúrcuma sp., Zingiber sp. y Ocimum sp., para saponinas las especies incluidas en los géneros Cyamopsis sp., Quillaja sp., Trigonella sp., Saponaria sp., Crocus sp., Yucca sp., Beta sp., Hederá sp., Polygala sp. y Prímula sp., para alcohol bencílico las incluidas en los géneros Cinnamomum sp. y Jasminum sp., para 1 ,8 cineol (Eucaliptol) las especies incluidas en los géneros Eucalyptus sp., Salvia sp., Thymus sp., Cúrcuma sp., Rosmarinus sp., Artemisia sp., para geraniol las incluidas en los géneros Rosa sp., Cymbopogon sp., Geranium sp., y Pelargonium sp., para ácidos grasos son las especies incluidas en los géneros Persea sp., Glycine sp., Helianthus sp., Olea sp. y otras oleaginosas, síntesis total, semi-síntesis o síntesis biomimética del compuesto puro y/o análogos mediante estudios de relación estructura actividad (SAR) y - producido por cualquier organismo seleccionado entre hongos filamentosos como Aspergillus sp., bacterias e insectos en procesos de biotransformación y/o bioconversión.
12. Una composición biopesticida según la reivindicación 6, en la que la lecitina se selecciona entre: lecitina de soja sólida, lecitina de soja líquida o fluida y lecitina de soja hidrolizada o parcialmente hidrolizada.
13. Una composición biopesticida según una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 12, en la que el segundo componente se emplea de forma libre o encapsulada.
14. Una composición biopesticida según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el segundo componente en la composición biopesticida se combina con el núcleo bioactivo, en el siguiente intervalo de concentraciones peso/volumen total de la composición: 1-30%, preferentemente 5-25% y aún más preferentemente 10-20%.
15. Una composición biopesticida según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la composición biopesticida comprende al menos una sustancia inerte que se selecciona entre adyuvantes, emulsionantes, dispersantes, aromatizantes, conservantes, antiespumantes, agentes tixotrópicos, matrices de encapsulación, ácidos grasos, fosfolípidos y mezclas de ellos.
16. Una composición biopesticida según la reivindicación anterior, en la que los adyuvantes son compuestos organosiliconados del grupo de los organosiloxanos.
17. Una composición biopesticida según la reivindicación 15, en la que los agentes tixotrópicos se seleccionan entre carboximetilcelulosa, carboximetilcelulosa sódica, celulosa microcristalina y otros derivados de la celulosa preferentemente goma y gel.
18. Una composición biopesticida según la reivindicación 15, en la que las matrices de encapsulación se seleccionan entre maltodextrinas, ciclodextrinas, lecitinas, aceites vegetales y/o excipientes de sílice, estos últimos comprenden gel de sílice (sílica gel), sílice coloidal y dióxidos de silicio, preferentemente se emplean ciclodextrinas.
19. Una composición biopesticida según la primera reivindicación, seleccionada entre las composiciones biopesticidas que comprenden:
Zingiber officinale y Cinnamomum verum, Zingiber officinale, Cinnamomum verum y lecitina de soja,
Zingiber officinale, E-dnamaldehído y Persea americana,
Zingiber officinale, Cinnamomum verum y derivado siliconado tipo organosiloxano, Zingiber officinale, Cinnamomum verum, extracto hidroalcohólico de Satureja montana y lecitina de soja,
Zingiber officinale, Cinnamomum verum, lecitina de soja, derivado siliconado tipo organosiloxano, b-ciclodextrina y adyuvante polimérico,
Zingiber officinale, Cinnamomum cassia, Persea americana, Cymbopogon citratus, lecitina de soja, Tween-80, derivado siliconado tipo organosiloxano, carboximentilcelulosa, b-ciclodextrina y adyuvante polimérico,
Zingiber officinale, Cinnamomum verum, Persea americana, Aspergillus sp, lecitina de soja, derivado siliconado tipo organosiloxano y adyuvante polimérico,
Zingiber officinale, Cinnamomum cassia, Mentha piperita, lecitina de soja, derivado siliconado tipo organosiloxano y adyuvante polimérico,
Zingiber officinale, Cinnamomum cassia, Cassia angustifolia, lecitina de soja, derivado siliconado tipo organosiloxano y adyuvante polimérico,
Zingiber officinale, Cinnamomum cassia, Trigonella foenum-graecum, acetato de bencilo, lecitina de soja, derivado siliconado tipo organosiloxano y adyuvante polimérico,
Zingiber officinale, Cinnamomum verum, citral, benzoato de bencilo, lecitina de soja, derivado siliconado tipo organosiloxano y adyuvante polimérico,
Zingiber officinale, Cinnamomum verum, acetato de bencilo, geraniol, lecitina de soja, derivado siliconado tipo organosiloxano y adyuvante polimérico,
Zingiber officinale, Cinnamomum verum, Papaver somniferum, lecitina de soja, derivado siliconado tipo organosiloxano y adyuvante polimérico,
Zingiber officinale, Cinnamomum verum, aceite esencial de Satureja montana, extracto de Satureja montana, lecitina de soja, derivado siliconado tipo organosiloxano y adyuvante polimérico, y
Zingiber officinale, E-cinamaldehído, acetato de geranilo, lecitina de soja, derivado siliconado tipo organosiloxano y adyuvante polimérico.
20. Un caldo de aplicación final que contiene la composición definida en una cualquiera de las reivindicaciones 1-19, en el que la concentración de cada componente del núcleo bioactivo se encuentra en el intervalo de concentraciones peso / volumen: aceite esencial, oleorresina, extracto acuoso, alcohólico o hidroalcohólico de raíz o rizomas de Zingiber officinale Roscoe: 0,01-0,99%, preferentemente 0,05-0,95%, preferentemente 0, 1-0,9%, más preferentemente 0,2-0, 8%, aún más preferentemente 0,3-0, 7% y más preferentemente 0,4-0, 6% y cinamaldehído o una fuente de cinamaldehído: 0,01-0,99%, preferentemente 0,05- 0,95%, preferentemente 0,1 -0,9%, más preferentemente 0,2-0, 8%, aún más preferentemente 0,3-0, 7% y más preferentemente 0,4-0, 6%.
21. Procedimiento para la obtención de la composición biopesticida definido en la reivindicación 1 que comprende la mezcla en medio acuoso de los componentes del núcleo bioactivo:
- aceite esencial, oleorresina, extracto acuoso alcohólico o hidroalcohólico de raíz o rizomas de Zingiber officinale Roscoe y
- cinamaldehído o fuente de cinamaldehído.
22. Procedimiento según la reivindicación anterior, en el que se añade al menos un componente secundario y/o al menos una sustancia inerte.
23. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 21-22, en el que la mezcla de los componentes del núcleo bioactivo se realiza a una velocidad comprendida en el intervalo entre 500 y 4000 rpm, preferentemente entre 1500 y 3000 rpm y en medio acuoso.
24. Procedimiento según la reivindicación anterior, en el que la temperatura de la mezcla se encuentra entre los 20 y 40°C, preferentemente entre 24 y 35°C y durante un periodo comprendido entre 60 y 120 minutos, preferentemente 40 y 100 minutos.
25. Uso de una composición biopesticida definida en una cualquiera de las reivindicaciones 1-20, para el control de plagas de moscas.
26. Uso de una composición biopesticida según la reivindicación anterior para el control de la mosca blanca, preferentemente las pertenecientes a los géneros Bemisia sp. “complex” (biotipos), Dialeurodes sp., Trialeurodes sp. Encarsia sp., Aleurolobus sp., Aleurothríxus sp., Aleurodicus sp., Aleyrodes sp., Parabemisia sp., Paraleyrodes sp., Orchamoplatus sp., Siphoninus sp. y Tetraleurodes sp.
27. Uso de una composición biopesticida según una cualquiera de las reivindicaciones 25-26, en la que la composición biopesticida se usa:
- de manera preventiva y/o
- curativa.
28. Uso de una composición biopesticida según una cualquiera de las reivindicaciones 25-27, en la que la composición biopesticida se aplica individualmente o en combinación con otros productos fitosanitarios o sistemas de control de plagas y enfermedades.
29. Uso de una composición biopesticida según la reivindicación anterior, en la que por otros productos fitosanitarios o sistemas de control de plagas se entiende cualquier tipo de insecticidas, nematicidas, acaricidas, fungicidas, bactericidas, herbicidas, reguladores del crecimiento de la planta, elicitores, fertilizantes, acondicionadores del suelo, y cebos entre otros.
30. Uso de una composición biopesticida según una cualquiera de las reivindicaciones 25-29, en la que la aplicación es mediante aspersión foliar.
31. Uso de una composición biopesticida según una cualquiera de las reivindicaciones 25-30, en la que la aplicación es en cultivos agrícolas de uso alimentario y no alimentario, ya sea agricultura convencional, orgánica o ecológica, preferentemente en cultivos hortícolas, extensivos, ornamentales y jardinería, así como parques e instalaciones deportivas.
PCT/ES2020/070037 2020-01-20 2020-01-20 Composiciones biopesticidas que comprenden extractos vegetales y su uso fitosanitario WO2021148684A1 (es)

Priority Applications (9)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2022544148A JP7522200B2 (ja) 2020-01-20 2020-01-20 植物抽出物を含む生物農薬組成物およびその植物衛生的使用
BR112022013069A BR112022013069A2 (pt) 2020-01-20 2020-01-20 Composição biopesticida, caldo de aplicação final contendo a mesma, procedimento para obtenção da mesma e uso da mesma
PCT/ES2020/070037 WO2021148684A1 (es) 2020-01-20 2020-01-20 Composiciones biopesticidas que comprenden extractos vegetales y su uso fitosanitario
MX2022008447A MX2022008447A (es) 2020-01-20 2020-01-20 Composiciones biopesticidas que comprenden extractos vegetales y su uso fitosanitario.
KR1020227028849A KR20220143042A (ko) 2020-01-20 2020-01-20 식물 추출물을 포함하는 생물농약 조성물 및 이의 식물위생 용도
AU2020424969A AU2020424969A1 (en) 2020-01-20 2020-01-20 Biopesticide compositions comprising plant extracts and phytosanitary use thereof
ES202290052A ES2926555B2 (es) 2020-01-20 2020-01-20 Composiciones biopesticidas que comprenden extractos vegetales y su uso fitosanitario
US17/864,268 US20220354128A1 (en) 2020-01-20 2022-07-13 Biopesticide compositions comprising plant extracts and phytosanitary use thereof
ZA2022/08521A ZA202208521B (en) 2020-01-20 2022-07-29 Biopesticide compositions comprising plant extracts and phytosanitary use thereof

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/ES2020/070037 WO2021148684A1 (es) 2020-01-20 2020-01-20 Composiciones biopesticidas que comprenden extractos vegetales y su uso fitosanitario

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
US17/864,268 Continuation US20220354128A1 (en) 2020-01-20 2022-07-13 Biopesticide compositions comprising plant extracts and phytosanitary use thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2021148684A1 true WO2021148684A1 (es) 2021-07-29

Family

ID=76991660

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/ES2020/070037 WO2021148684A1 (es) 2020-01-20 2020-01-20 Composiciones biopesticidas que comprenden extractos vegetales y su uso fitosanitario

Country Status (9)

Country Link
US (1) US20220354128A1 (es)
JP (1) JP7522200B2 (es)
KR (1) KR20220143042A (es)
AU (1) AU2020424969A1 (es)
BR (1) BR112022013069A2 (es)
ES (1) ES2926555B2 (es)
MX (1) MX2022008447A (es)
WO (1) WO2021148684A1 (es)
ZA (1) ZA202208521B (es)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023057083A1 (fr) * 2021-10-04 2023-04-13 Xeda International Procede de traitement phytosanitaire au moyen d'aldehyde cinnamique encapsule
WO2023242453A1 (es) * 2022-05-27 2023-12-21 Universidade De Vigo Composición herbicida que comprende biomasa de eucalipto, retama, y mastranzo
CN117778276A (zh) * 2024-02-23 2024-03-29 四川省农业农村厅植物保护站 一种防治生姜土传病害的生防菌剂及制备方法和培育方法
EP4385326A1 (en) * 2022-12-15 2024-06-19 Kimitec Biogorup Biopesticide composition and method for controlling and treating broad spectrum of pests and diseases in plants

Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5837652A (en) 1995-12-20 1998-11-17 Rhone-Poulenc Agriculture Limited Herbicidal compositions
ES2153503T3 (es) 1994-11-18 2001-03-01 Aventis Agriculture Ltd Nuevas composiciones herbicidas sinergicas que comprenden compuestos de 4-benzoilisoxazoles y 2,6-dinitroanilinas.
WO2003033008A1 (en) * 2001-06-18 2003-04-24 Champon Louis S All natural soil treatment & insecticide composition containing plant extract heat components
US8202557B1 (en) * 2008-02-05 2012-06-19 Sundy Aisha Doty Bio-pesticide and methods of making and using the same
US20130331462A1 (en) 2009-06-12 2013-12-12 Bayer Cropscience Lp Methods of inhibiting, preventing, killing and/or repelling insects using simulated blends of chenopodium
ES2444991A1 (es) 2012-08-27 2014-02-27 Seipasa S.A. Un insecticida ecológico, procedimiento de producción del insecticida y utilización del mismo
CN104996500A (zh) * 2015-06-23 2015-10-28 上海交通大学 一种控制植物蚜虫的复方植物杀虫剂及其制备和应用
WO2016170531A1 (en) * 2015-04-20 2016-10-27 Botanocap Ltd. Liquid and solid core microcapsules formed by interpolymeric complexation
CN106472611A (zh) * 2016-10-14 2017-03-08 柳州环山科技有限公司 新型植物源环保生物农药
CN108835137A (zh) * 2018-04-27 2018-11-20 吴道华 一种生物农药

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2002255717A (ja) * 2001-02-23 2002-09-11 Yutaka Pharmacy:Kk 植物病害防除剤および植物病害防除方法
US20060165746A1 (en) * 2005-01-24 2006-07-27 Arie Markus Formulations containing microencapsulated essential oils
JP2007001869A (ja) * 2005-06-21 2007-01-11 Nippon Tekuma:Kk 天然植物素材をもとにしたユーカリオイルの薬効増強処理剤
CN102340990B (zh) * 2009-03-05 2015-03-04 关键基因股份有限公司 基于r-姜黄烯的植物挥发性物质
JP6082514B2 (ja) * 2010-08-24 2017-02-15 住友化学園芸株式会社 農園芸用殺虫組成物

Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2153503T3 (es) 1994-11-18 2001-03-01 Aventis Agriculture Ltd Nuevas composiciones herbicidas sinergicas que comprenden compuestos de 4-benzoilisoxazoles y 2,6-dinitroanilinas.
US5837652A (en) 1995-12-20 1998-11-17 Rhone-Poulenc Agriculture Limited Herbicidal compositions
WO2003033008A1 (en) * 2001-06-18 2003-04-24 Champon Louis S All natural soil treatment & insecticide composition containing plant extract heat components
US8202557B1 (en) * 2008-02-05 2012-06-19 Sundy Aisha Doty Bio-pesticide and methods of making and using the same
US20130331462A1 (en) 2009-06-12 2013-12-12 Bayer Cropscience Lp Methods of inhibiting, preventing, killing and/or repelling insects using simulated blends of chenopodium
ES2444991A1 (es) 2012-08-27 2014-02-27 Seipasa S.A. Un insecticida ecológico, procedimiento de producción del insecticida y utilización del mismo
WO2016170531A1 (en) * 2015-04-20 2016-10-27 Botanocap Ltd. Liquid and solid core microcapsules formed by interpolymeric complexation
CN104996500A (zh) * 2015-06-23 2015-10-28 上海交通大学 一种控制植物蚜虫的复方植物杀虫剂及其制备和应用
CN106472611A (zh) * 2016-10-14 2017-03-08 柳州环山科技有限公司 新型植物源环保生物农药
CN108835137A (zh) * 2018-04-27 2018-11-20 吴道华 一种生物农药

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
I EPP/EPPO BULLETIN, vol. 42, no. 3, 2012, pages 367 - 381
JOURNAL OF AGRICULTURAL SCIENCE AND TECHNOLOGY A, vol. 6, 2016, pages 77 - 91
NETH. J. PLANTPATH., vol. 70, pages 1964
PHYTOMEDICINE, vol. 8, no. 5, 2001, pages 401 - 409

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023057083A1 (fr) * 2021-10-04 2023-04-13 Xeda International Procede de traitement phytosanitaire au moyen d'aldehyde cinnamique encapsule
WO2023242453A1 (es) * 2022-05-27 2023-12-21 Universidade De Vigo Composición herbicida que comprende biomasa de eucalipto, retama, y mastranzo
ES2957062A1 (es) * 2022-05-27 2024-01-10 Univ Vigo Composición herbicida que comprende biomasa de eucalipto, retama y mastranzo
EP4385326A1 (en) * 2022-12-15 2024-06-19 Kimitec Biogorup Biopesticide composition and method for controlling and treating broad spectrum of pests and diseases in plants
EP4385327A1 (en) * 2022-12-15 2024-06-19 Kimitec Group S.L. Biopesticide composition and method for controlling and treating broad spectrum of pests and diseases in plants
WO2024126688A1 (en) * 2022-12-15 2024-06-20 Kimitec Biogroup S.L Biopesticide composition and method for controlling and treating broad spectrum of pests and diseases in plants
WO2024126672A1 (en) * 2022-12-15 2024-06-20 Kimitec Biogroup S.L Biopesticide composition and method for controlling and treating broad spectrum of pests and diseases in plants
CN117778276A (zh) * 2024-02-23 2024-03-29 四川省农业农村厅植物保护站 一种防治生姜土传病害的生防菌剂及制备方法和培育方法
CN117778276B (zh) * 2024-02-23 2024-05-10 四川省农业农村厅植物保护站 一种防治生姜土传病害的生防菌剂及制备方法和培育方法

Also Published As

Publication number Publication date
BR112022013069A2 (pt) 2022-09-06
JP7522200B2 (ja) 2024-07-24
ES2926555R1 (es) 2023-10-23
ES2926555A2 (es) 2022-10-26
ES2926555A9 (es) 2023-10-10
KR20220143042A (ko) 2022-10-24
ES2926555B2 (es) 2024-05-16
MX2022008447A (es) 2022-08-04
US20220354128A1 (en) 2022-11-10
AU2020424969A1 (en) 2022-08-11
ZA202208521B (en) 2024-01-31
JP2023519648A (ja) 2023-05-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2926555B2 (es) Composiciones biopesticidas que comprenden extractos vegetales y su uso fitosanitario
Shahrajabian et al. Chinese star anise ('Illicium verum') and pyrethrum ('Chrysanthemum cinerariifolium') as natural alternatives for organic farming and health care-a review
Afzal et al. Ethno-botanical studies from Northern Pakistan
Hayatie et al. Aqueous extracts of seed and peel of Carica papaya against Aedes aegypti
US20060194698A1 (en) Use of herbs as a delivery system for bioactive phytochemicals
Narwal et al. Review on chemical constituents and pharmacological action of Ocimum kilimandscharicum
Ghosh Biopesticide & integrated pest management
CN102036564A (zh) 对环境无害的植物保护剂
Mouna et al. Insecticidal effect of two aqueous extracts from the leaves of Salvia officinalis and Eucalyptus camaldulensis against Aphis fabae
Valiño et al. Biomass from allelopathic agroforestry and invasive plant species as soil amendments for weed control—a review
Singh Association of the Aphids (Insecta: Homoptera: Aphididae) with monocots flowering plants in India
Taha et al. The first study for the Acaricidal activity of alcoholic extracts of Adiantum capillus-veneris and Funaria hygrometric against Argas persicus
Ahmed et al. A novel surface sterilization method using Artemisia dracunculus extract for tissue culturing of endangered species Sargassum fusiforme
KR102509566B1 (ko) 식물의 약성과 유황 발효를 통해 얻어지는 미생물 및 이를 이용한 살균·살충·탈취제의 제조방법
KR20130080667A (ko) 후추 속 식물과 라반듈라 속 식물 추출물을 함유하는 살충용 조성물
Durge et al. Vetiveria zizanioides l. Nash-a wonder plant: an industrial perspective
Haryanta et al. Repelence of Bintaro Plant Extract (Cerbera manghas) against pod-sucking insects (Riptortus linearis)(Hemiptera)
Fouad et al. Variation in essential oil composition, antioxidant and mosquito larvicidal activity during three cuts dates of five Mentha species
Anvitha et al. The importance, extraction and usage of some floral wastes
Umbreen et al. Sacred Basil
Di Stefano Toxic, repellent and antifeedant activities of Lavandula angustifolia Miller (Lamiaceae) essential oil against Sitophilus granarius (L.)(Coleoptera, Curculionidae) adults
Mane et al. Evaluation of Antibacterial Activity of Extracted Oil from Blumea lacera and Cyathocline purpurea (Asteraceae)
Nisha Phytochemical and biological investigation of Tridax procumbens leaves
Mpumi Evaluation of selected botanicals as insecticides against cabbage insect pests in Tanzania
Balasankar et al. Journal of medicinal plants studies

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 20914958

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

DPE1 Request for preliminary examination filed after expiration of 19th month from priority date (pct application filed from 20040101)
REG Reference to national code

Ref country code: BR

Ref legal event code: B01A

Ref document number: 112022013069

Country of ref document: BR

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2022544148

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2020424969

Country of ref document: AU

Date of ref document: 20200120

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2020914958

Country of ref document: EP

Effective date: 20220822

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 112022013069

Country of ref document: BR

Kind code of ref document: A2

Effective date: 20220629