ES2926555A2 - Composiciones biopesticidas que comprenden extractos vegetales y su uso fitosanitario - Google Patents

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Abstract

Composiciones biopesticidas que comprenden extractos vegetales y su uso fitosanitario. Una composición biopesticida que comprende un núcleo bioactivo sinérgico, formado por: aceite esencial, oleorresina, extracto acuoso, alcohólico o hidroalcohólico de raíz o rizomas de Zingiber officinale Roscoe y cinamaldehído o fuente de cinamaldehído. Dicha composición puede llevar al menos un componente secundario y/o sustancias inertes. La presente memoria también se refiere al procedimiento para la obtención de la misma, así como su uso en agricultura, parques e instalaciones deportivas contra plagas pertenecientes al grupo de la mosca blanca.

Description

DESCRIPCIÓN
Composiciones biopesticidas que comprenden extractos vegetales y su uso fitosanitario Campo de la invención
La invención se engloba dentro del campo de la Agricultura y la Biotecnología Vegetal; y más concretamente en el sector de los biopesticidas derivados de materiales vegetales y particularmente dentro del campo de los biopesticidas bioquímicos que comprenden sustancias naturales como extractos y ácidos grasos que controlan plagas y enfermedades.
Antecedentes de la invención
El empleo masivo de fitosanitarios químicos en el sector agrícola, fundamentalmente para la protección pre y post-cosecha, constituye una de las principales fuentes de residuos tóxicos en la cadena alimentaria. El aumento de la población mundial está directamente relacionado con un incremento de la producción agrícola para satisfacer la demanda de alimentos.
En la actualidad, el uso de fitosanitarios y fertilizantes sintéticos constituyen las principales herramientas disponibles para la protección de los cultivos y su correcta nutrición y desarrollo. Sin embargo, el uso excesivo de estos productos químicos ha llevado al desarrollo de resistencias en las plagas, a la contaminación del medio ambiente, toxicidad en otros organismos y riesgos para la salud humana.
Las multinacionales químicas (agricultura convencional) hacen frente a una plaga, enfermedad o problema nutricional mediante la aplicación de productos basados en la síntesis química de moléculas individuales de alta persistencia y con un único mecanismo de acción específico. Esto provoca la rápida aparición de resistencias cruzadas (plagas y enfermedades) o pérdidas de eficacia (fertilizantes) del producto, además del impacto negativo sobre el medio ambiente y la salud humana.
Los graves problemas derivados del uso intensivo de pesticidas químicos han producido un endurecimiento de la legislación sobre el uso de este tipo de compuestos (ej. Directiva 2009/128/EC). Es por ello que, ante los requerimientos de seguridad alimentaria cada vez más restrictivos impuestos por las legislaciones vigentes unido a las propias exigencias del mercado y los consumidores, se ha desarrollado una necesidad creciente en desarrollar nuevos bioproductos destinados a la protección de cultivos.
En este sentido, el desarrollo de productos de protección vegetal de origen natural (bioplaguicidas) ofrece una alternativa real con alta multifuncionalidad asociada a una composición química variada y compleja, retardando o impidiendo la aparición de resistencias cruzadas en las plagas y enfermedades, principal problema, técnicamente demostrado, asociado al uso continuado de productos de síntesis.
La gran mayoría de los bioplaguicidas desarrollados y comercializados hasta el momento todavía tienen limitaciones importantes relacionadas con la falta de disponibilidad de una materia prima procedente de fuentes renovables y que a vez sea abundante, barata, homogénea, trazable y rica en principios activos sanos y efectivos.
Los metabolitos secundarios de microorganismos (hongos, bacterias, levaduras), extractos de origen vegetal (plantas, algas, subproductos agroindustriales) y compuestos químicos derivados de las mismas son, sin duda, las fuentes más estudiadas y abundantes de materias primas para el desarrollo de biopesticidas.
Las plantas constituyen una fábrica natural de sustancias químicas con actividad bioplaguicida, derivadas fundamentalmente del metabolismo secundario y como consecuencia de millones de años de coevolución entre las plantas y las plagas. Estas sustancias se caracterizan por pertenecer a diversas clases químicas lo que deriva en una gran multifuncionalidad. Entre ellas se encuentran: terpenos, esteroles, alcaloides, polifenoles (flavonas, isoflavonas, cumarinas, lignanos, iridoides, fenilpropanoides), glucosinolatos, isotiocianatos, ácidos grasos, ésteres y aceites esenciales.
Una especial mención merecen los aceites esenciales (AEs) obtenidos mayoritariamente a partir de plantas aromáticas, medicinales y/o condimentarias mediante diferentes procesos de destilación y/o extracción con solventes de baja polaridad incluido el CO2 (extracción supercrítica). Los AEs constituyen la parte más volátil de numerosas especies vegetales fundamentalmente pertenecientes a la familia Lamiaceae y comprenden mezclas complejas de monoterpenos, sesquiterpenos y compuestos aromáticos. Estos compuestos, sin duda, son los componentes naturales más empleados en el desarrollo de bioplaguicidas. Los trabajos que refieren la aplicación de los AEs como “potenciales” biopesticidas para el control de plagas y enfermedades ocupan más del 70% del total de las publicaciones científicas sobre compuestos de protección vegetal derivados de plantas. Sin embargo, el 95% de estas publicaciones sólo versan sobre estudios a nivel de laboratorio y muy pocos se refieren a posibilidades reales de escalado. (Green Pesticides Handbook. Essential Oils for Pest Control. ISBN: 13: 978-1-4987­ 5938-0, 2017).
La presente invención supera las limitaciones existentes en el estado de la técnica. Consiste en el desarrollo de nuevas composiciones biopesticidas que puedan ser utilizadas en el tratamiento fitosanitario de plagas de moscas, principalmente del complejo de las moscas blancas (Hemiptera: Aleyrodidae). Las composiciones biopesticidas de la invención son al mismo tiempo fácilmente obtenibles, escalables y eficaces; igualando y/o superando la eficacia de los productos de síntesis química y/o productos de origen natural empleados actualmente en sistemas agrícolas convencionales y orgánicos. Además, presentan la ventaja de atenuar el desarrollo de las resistencias cruzadas, no presentar fitotoxicidad y ser respetuosos con el medio ambiente.
Los insecticidas convencionales contienen una o dos moléculas activas obtenidas por síntesis química y generalmente pertenecientes al mismo grupo químico o grupos muy relacionados. Dichas moléculas afectan de forma muy específica un único punto de acción (target site) de la diana. Esta especificidad de acción sobre un receptor común es la principal causa de la aparición de resistencias cruzadas con la consiguiente pérdida de eficacia (IRAC, 2019; https://bit.ly/33t9FF8). De igual forma, la mayoría de las soluciones naturales presentes en el mercado provienen de extractos vegetales donde predominan mayoritariamente las que contienen entre 3-5 moléculas activas, con el consiguiente riesgo de desarrollo de resistencias.
En el caso de los biopesticidas, la complejidad de su composición química (varias moléculas pertenecientes a diferentes grupos químicos) permite que ejerzan su acción a través de diferentes mecanismos de acción y por consiguiente minimicen la aparición de resistencias e incrementen su eficacia a largo plazo.
Las composiciones que se reivindican en esta invención presentan una composición química compleja. Tienen en común un núcleo sinérgico bioactivo constituido por moléculas activas pertenecientes a clases químicas muy divergentes. Dicha complejidad está directamente asociada a la multifuncionalidad del formulado en cuanto a modos de acción y eficacia global. Moléculas químicamente diferentes pueden incidir sobre el mismo modo de acción (por ejemplo, repelencia) actuando sobre receptores (sitios de acción) diferentes. En estos casos, el riesgo de desarrollo de resistencias cruzadas es casi nulo.
El Comité de Acción para la Resistencia a los Insecticidas (IRAC, 2019; https://bit.ly/33t9FF8) recomienda "las alternancias, secuencias o rotaciones de compuestos con diferentes mecanismos de acción (MdA) para el manejo sostenible y eficaz de la aparición de resistencias cruzadas”. En el caso de los insecticidas químicos y aquellos biopesticidas de composición química muy simple (con predominio de una determinada molécula); implicaría alternar diferentes productos (diferentes químicos de síntesis y/o productos de síntesis con biopesticidas) con mecanismos de acción diferentes. En el caso de las composiciones de la presente invención, esto no sería necesario ya que la alternancia de mecanismos de acción estaría garantizada por la gran variedad de moléculas diferentes que componen la fórmula. No existe en el arte previo ni en el mercado de los biopesticidas una composición como la que se divulga en la presente invención, en la que la formulación final a escala comercial exhiba un efecto sinérgico, cooperativo y/o potenciador que permita:
- Reducir las dosis de los principios activos y por consiguiente la carga de formulado a utilizar.
- Actuar mediante más de un mecanismo de acción que combine efectos físicos (mortalidad por contacto y efecto volteo) y efectos sobre los quimiorreceptores que controlan la conducta alimentaria y fisiológica de la mosca blanca (antialimentarios, repelentes e inhibidores de la oviposición).
- La liberación controlada de los principios activos.
- Eliminar o minimizar la aparición de resistencias cruzadas frente a plagas del grupo de las moscas blancas debido a su naturaleza y multifuncionalidad.
- Etiquetar el producto como "residuo cero”, según legislación vigente. Las formulaciones contienen metabolitos secundarios de plantas que normalmente existen en la naturaleza y presentan una tasa de degradación rápida.
- Eliminar los plazos de seguridad.
- Etiquetar el producto como “safe”. Los seres humanos y organismos beneficiosos ("nontarget’) han estado expuestos de forma natural a los metabolitos secundarios que componen las formulaciones divulgadas.
Ejemplos relevantes de formulaciones comerciales que entran en la clasificación de insecticidas de origen natural son:
• Requiem® (Bayer): Contiene aproximadamente un 25% de componentes del extracto de Chenopodium ambrosioides, especificamente una mezcla de a-terpineno, p-cimeno y limoneno.
• Pre-VAM® (Oro Agri SA. Ltd.): Contiene entre un 6-10% de aceite de naranja (Orange oil) con un contenido de limoneno mayor del 90%.
• Pirecris® (SEIPASA): Contiene un 2% de piretrinas naturales.
• Agroneem™ (Ajay Bio Tech India Limited Body Incorporate). Contiene azadiractina, componente principal del aceite de Neem (Azadirachta indica).
Estas formulaciones han demostrado su efectividad para el control de diferentes plagas de mosca blanca. Sin embargo, las composiciones divulgadas en la presente invención presentan ventajas claras con respecto a dichas formulaciones en lo relativo a:
• Identidad química.
• Tipo y alternancia de mecanismos de acción (MdAs).
• Manejo de resistencias cruzadas (MR).
• Eficacia.
En la Tabla 1 (elaboración propia) se muestra una comparativa de las ventajas de composiciones divulgadas frente a formulaciones de naturaleza similar.
Tabla 1. Ventajas comparativas de las composiciones de la presente invención
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Referencias:
1 US2013/0331462 A1
2 Green Pesticides Handbook. Essential oil for pest control. Chapter 2. Commercialization of insecticides based on essential oil. Nollet & Singh, Eds. CRC Press, ISBN: 13: 978-1-4987­ 5938-0.
3 Green Pesticides Handbook. Essential oil for pest control. Chapter 15. Orange oil. Nollet & Singh, Eds. CRC Press, ISBN: 13: 978-1-4987-5938-0.
4 ES2444991 A1.
5 Journal of Agricultural Science and Technology A 6 (2016) 77-91.
Sin embargo, existen diferencias y distinciones entre los biopesticidas que determinan su éxito frente a los productos de síntesis y su prevalencia en el mercado. Pre-VAM® (Oro Agri SA. Ltd.) es una formulación natural compuesta por aceite de naranja y aprobada para uso como fitosanitario en USA, Canadá, Europa y otros países. Á pesar de su eficacia, presenta varias desventajas comparado con las composiciones que se reivindican en esta invención. La presencia mayoritaria en su composición de un solo ingrediente (más del 95% de d-limoneno) con un mecanismo de acción propuesto, aumenta el riesgo de la aparición de resistencias. Además, la alta volatilidad e inestabilidad del aceite de naranja hacen dificil su aplicación en condiciones de campo abierto (Green Pesticides Handbook. Essential oil for pest control. Chapter 15. Orange oil. Nollet & Singh, Eds. CRC Press, ISBN: 13: 978-1-4987-5938-0). Por otro lado, formulados como Pirecris® y AgroneemTM, además de una composición química simple, actúan mediante mecanismos de acción tóxicos a nivel del sistema nervioso (Pirecris®) o enzimas digestivas (Agroneem™. Esto aumenta la probabilidad de efectos sobre organismos beneficiosos (“non-target’) a la vez que el riesgo de aparición de resistencias es mayor.
Descripción de la invención
Los siguientes términos de la invención se definen a continuación de forma detallada.
“Composiciones bioplaguicidas o composiciones biopesticidas o composiciones fitosanitarias” son términos que se usan indistintamente en la presente memoria. Pueden definirse como toda entidad biológica, viva o de origen natural incluyendo los subproductos y/o sustancias químicas que de ellos se deriven; que controle/regule todo aquello que denominamos plaga y/o enfermedad de las plantas.
“Extracto crudo, extracto vegetal o extracto botánico” son términos que se usan indistintamente en la presente memoria.
Cualquiera de las alternativas mencionadas en la reivindicación 1: “aceites esenciales, oleorresinas, extractos acuosos, alcohólicos o hidroalcohólicos” son productos obtenidos de la raíz o rizomas de Zingiber officinale Roscoe. Estos productos pueden ser productos crudos tal como se obtienen de su proceso de extracción o pueden ser fracciones de de los mismos que se pueden obtener mediante un fraccionamiento dirigido por métodos cromatográficos, separación líquido-líquido, evaporación, cristalización o destilación. Además, estos productos pueden ser sustancias puras o mezclas de sustancias.
"Fuente de cinamaldehído” en la presente memoria incluye cualquier mezcla de compuestos entre los que se encuentra cinamaldehído o de la cual se pueda obtener cinamaldehído.
En la presente memoria "núcleo bioactivo” equivale a "primer componente”.
En la presente memoria "elementos activos” equivale a "ingredientes activos”.
En la presente memoria "agente encapsulante” equivale a "matriz encapsulante”.
"Caldo o solución de aplicación final” se refiere a la composición biopesticida diluida lista para su aplicación.
"Sustancias adicionales y coformulantes” son términos que se usan indistintamente en la presente memoria. Se refieren a sustancias inertes que pueden formar parte de la composición pesticida y cuyo objetivo es incrementar su eficacia. Ejemplos de estas sustancias son adyuvantes, agentes dispersantes, agentes penetrantes, emulsionantes, estabilizantes, aromatizantes, antiespumantes y/o conservantes.
"Compuestos puros” se refiere a cualquier compuesto natural que actúe como segundo componente activo en la composición bioplaguicida y que puede ser obtenido por un proceso de síntesis, como parte de una fracción semipurificada o aislado en estado puro de las fuentes naturales que lo contengan.
Cualquier otro término empleado en la presente memoria tendrá el significado habitual del sector de la técnica al que se refiere la presente invención.
El problema técnico que resuelve la presente invención es el desarrollo de composiciones biopesticidas utilizadas en el tratamiento fitosanitario de plagas incluidas en el grupo de las moscas blancas. Las composiciones comprenden un núcleo bioactivo (formado por un aceite esencial, oleorresina, extracto acuoso, alcohólico o hidroalcohólico de raíz o rizomas de Zingiber officinale y cinamaldehido o una fuente de cinamaldehido). Además, se ha encontrado que los componentes del núcleo bioactivo sorprendentemente presentan un efecto potenciador y/o cooperativo en la actividad anti moscas frente al complejo de las moscas blancas.
De esta forma, la presente invención divulga una composición biopesticida que comprende un núcleo bioactivo sinérgico formado por:
- aceite esencial, oleorresina, extracto acuoso, alcohólico o hidroalcohólico de raíz o rizomas de Zingiber officinale Roscoe y
- cinamaldehído o una fuente de cinamaldehído.
La concentración, % peso/peso (% p/p) de cada componente en el núcleo bioactivo, se encuentra en los siguientes intervalos:
- aceite esencial, oleorresina, extracto acuoso, alcohólico o hidroalcohólico de raíz o rizomas de Zingiber officinale Roscoe: 0,1-99,9% (p/p), preferentemente 10-90% (p/p), más preferentemente 20-80% (p/p), aún más preferentemente 30-70% (p/p) y más preferentemente 40-60% (p/p) y
- cinamaldehído o una fuente de cinamaldehído: 0,1-99,9% (p/p), preferentemente 10-90% (p/p), más preferentemente 20-80% (p/p), aún más preferentemente 30-70% (p/p) y más preferentemente 40-60% (p/p).
El cinamaldehíido puede ser el isómero trans, cis o la mezcla de los isómeros.
El cinamaldehído como componente del núcleo bioactivo se obtiene como:
- compuesto con alto grado de pureza (295%) aislado/purificado a partir de especies del género Cinnamomun sp. que lo contengan,
- compuesto con alto grado de pureza (> 95%) obtenido por síntesis total, semisintesis o síntesis biomimética y
- compuesto producido por cualquier organismo (ej. hongos filamentosos como Aspergillus sp., bacterias e insectos) en procesos de biotransformación y/o bioconversión.
La fuente de cinamaldehido como componente del núcleo bioactivo puede ser extractos/aceites esenciales de especies vegetales que lo contengan, preferentemente del género Cinnamomum sp. Ejemplos significativos de especies de este género que contienen cinamaldehído son: C. verum. (sinonimia Cinnamomum zeylanicum), C. cassia, C. loureirii, C. burmannií, C. tamala, C. osmophloeum, C. bejolghota, C. dubium, C. rivulorum, C. citriodorum y C. camphora.
El cinamaldehido y/o la fuente de cinamaldehído se puede emplear de forma libre y/o encapsulada en un agente encapsulante.
El agente encapsulante se puede seleccionar entre: maltodextrinas, ciclodextrinas, lecitinas, aceites vegetales y/o excipientes de sílice, estos últimos comprenden gel de sílice (silica gel), sílice coloidal y dióxidos de silicio, preferentemente se emplean ciclodextrinas.
La forma encapsulada de la fuente de cinamaldehído, incrementa su actividad biológica y favorece la liberación controlada del ingrediente o elemento activo.
En una realización adicional de la invención las composiciones biopesticidas comprenden además un segundo componente. Este segundo componente puede ser uno o más elementos o ingredientes activos.
El ingrediente activo como segundo componente se puede seleccionar entre uno o más de:
- extractos botánicos o fracciones de los extractos,
- extracto obtenido partir de fermentados de microorganismos o fracciones de dichos extractos,
- compuestos puros seleccionados entre geranial (citral A), neral (citral B), saponinas, alcohol bencílico, benzoato de bencilo, acetato de bencilo, eugenol, 1,8-cineol, timol, geraniol, acetato de geranilo y ácidos grasos, seleccionados entre: saturados de cadena corta y larga preferentemente los de cadena larga e insaturados y derivados de ácidos grasos (por ejemplo, metilados, ésteres metílicos de ácidos grasos, FAME, “fatty acid methyl es te " más preferentemente ácidos grasos saturados de cadena larga y/o ácidos grasos insaturados y
- lecitina, preferentemente de huevo, girasol, colza, maíz, algodón, cacahuete o soja. El extracto botánico se puede seleccionar entre:
- extractos acuosos, alcohólicos e hidroalcohólicos y/o
- aceites esenciales.
El origen del extracto botánico se puede seleccionar entre residuos agroindustriales, bulbos, semillas, hojas, folículos, flores y/o parte aérea completa a partir de plantas pertenecientes a los siguientes géneros: Allium sp., Angélica sp., Annona sp., Artemisia sp., Carum sp., Cassia sp., Chenopodium sp., Citrus sp., Coffea sp., Crocus sp., Curcuma sp., Cyamopsis sp., Cymbopogon sp., Cytisus sp., Eucalyptus sp., Eurycoma sp., Ficus sp., Foeniculum sp., Fumaria sp., Geranium sp., Ginkgo sp., Helianthus sp., Hyssopus sp., Jatropha sp., Lavandula sp., Mentha sp., Moringa sp., Nigella sp., Ocimum sp., Olea sp., Papaver sp., Pelargononium sp., Persea sp., Petroselinum sp., Pimpinella sp., Prunus sp., Quassia sp., Retama sp., Rheum sp., Rosmarinus sp., Salvia sp., Satfureja sp., Schoenocaulon sp., Syzygium sp., Trigonella sp., Thymus sp. y Vitis sp., preferentemente las especies: Allium sativum, Angelica archangelica, Annona cherimola, Artemisia absinthium, Carum carvi, Cassia angustifolia, Cassia senna, Chenopodium ambrosioides, Citrus aurantium, Citrus limon, Citrus sinensis, Coffea arabica, Crocus corsicus, Crocus sativus, Crocus speciosus, Crocus vemus, Curcuma aromatica, Curcuma longa, Cymbopogon citratus, Cyamopsis tetragonoloba, Cymbopogon flexuosus, Cymbopogon martinii Cymbopogon nardus, Cytisus scoparius, Eucalyptus camaldulensis, Eucalyptus globulus, Eurycoma longifolia, Ficus carica, Fumaria officinalis, Foeniculum vulgare, Geranium macrorrhizum, Ginkgo biloba, Helianthus annuus, Helianthus tuberosum, Hyssopus officinalis, Jatropha curcas, Lavandula angustifolia, Lavanda x intermedia, Lavandula luisieri, Mentha piperita, Mentha spicata, Moringa oleifera, Nigella sativa, Ocimum basilicum, Olea europaea, Papaver rhoeas, Papaver somniferum, Pelargonium citriodorum, Pelargonium graveolens, Persea americana, Persea indica, Petroselinum sativum (sin. P. crispum), Pinpinella anisum, Prunus persica, Quassia amara, Retama monosperma, Retama sphaerocarpa, Rheum rhabarbarum, Rheum officinale, Rosmarinus officinalis, Salvia lavandulifolia, Salvia officinalis, Satureja montana, Schoenocaulon officinale, Syzygium aromaticum, Trigonella foenum-graecum, Thymus vulgaris, Thymus zygís y Vitis vinifera.
Los fermentos de microorganismos se refieren al extracto o líquido de fermentación (puro o previamente extraído con un disolvente orgánico) resultante del proceso de fermentación de un microorganismo (hongo o bacteria) en presencia de un sustrato vegetal y una vez eliminado el microrganismo vivo mediante un proceso de pasteurización.
El extracto obtenido a partir del fermento de microorganismos se puede seleccionar entre extractos obtenidos a partir de la fermentación de un sustrato con Bacillus sp., Pseudomonas sp., Trichoderma sp., Corynebacterium sp. y Aspergillus sp, preferentemente: Aspergillus niger, Trichoderma harzianum, Bacillus thuringiensis, Pseudomonas fluorescens, Bacillus amyloliquefaciens, Corynebacterium efficiens y Bacillus subtilis.
El sustrato de fermentación se puede escoger entre residuos agroindustriales, bulbos, semillas, hojas, folículos, flores y/o parte aérea completa a partir de plantas pertenecientes a los siguientes géneros: Zingiber sp., Citrus sp., Cyamopsis sp., Crocus sp., Helianthus sp., Petroselinum sp., Papaver sp., Rheum sp., Salvia sp., Retama sp., Lavandula sp., Prunus sp., Persea sp., Curcuma sp. y Thymus sp, preferentemente: Agaricus bisporus, Cyamopsis tetragonoloba, Helianthus annus, Citrus x sinensis y Glycine max.
Los compuestos puros se pueden obtener de alguna(s) de las siguientes fuentes:
- para los isómeros del citral, geranial y neral, las especies incluidas en los géneros Cymbopogon sp. [ej. C. cifratus, C. martinii, C. flexuosus, C. winterianus, C. nardus), entre otras], Líftsea sp. (ej. L. cubeba, L. citrate., entre otras), Aloysía sp. (ej. A. citrodora, entre otras), Ocimun sp. (ej. O. gratissimum, entre otras), Melissa sp. (ej. M. officinalis, entre otras) y Citrus sp. para eugenol las incluidas en el género Cinnamomum sp. [ej. C. verum (sin., Cinnamomum zeylanicum), C. cassia, C. citriodorum, C.
camphora, entre otras], Syzygium sp. (ej. S. aromaticum, entre otras), Curcuma sp. (ej. C. longa, entre otras), Zingiber sp. (ej. Z. officinale, entre otras) y Ocimum sp. (ej. O. tenuiflorum, entre otras),
- para saponinas las especies incluidas en los géneros Cyamopsis sp. (ej. C.
tetragonoloba, entre otras), Quillaja sp. (ej. Q. saponaria, entre otras), Trigonella sp. (ej.
7. fosenum-graceum, entre otras), Saponaria sp. (S. officinalis, entre otras), Crocus sp. (ej. C. sativus, entre otras), Yucca sp. (ej. Y. schidigera, entre otras), Beta sp. (ej. B. vulgaris, entre otras), Hedera sp. (ej. H. hélix, entre otras), Polygala sp. y Primula sp. Para alcohol bencílico las incluidas en los géneros Cinnamomum sp. (ej. C. cassía) y Jasminum sp. (ej. J. grandiflorum, entre otras),
- para 1,8 cineol (Eucaliptol) las especies incluidas en los géneros Eucalyptus sp. (ej. E.
globulus, E. camaldulensís, entre otras), Salvia sp. (ej. S. officinalis, S. fructicosa, entre otras), Thymus sp. (ej. T. vulgaris, T. zigys, T. capitatus, entre otras), Curcuma sp. (ej. C. longa, entre otras), Rosmarinus sp. (ej. R. officinalis, entre otras), Artemisia sp. (ej. A. vulgaris, entre otras), para geraniol las incluidas en los géneros Rosa sp. (ej. R. damascena, R. alba, R. gallica, entre otras), Cymbopogon sp. (ej. C. citratus, C. martini, C. flexuosus, C. winterianus, C. nardus, entre otras), Geranium sp. (G. pretense, G. macrorrhizum, entre otras), Pelargonium sp. (ej. P. hirsutum, entre otras),
- para ácidos grasos son las especies incluidas en los géneros Persea sp. (ej. P.
americana, entre otras), Glycine sp. (ej. G. max, entre otras), Helianthus sp. (ej. H. annuus, entre otras), Olea sp. (ej. Olea europaea) y otras oleaginosas,
- síntesis total, semisintesis o sintesis biomimética del compuesto puro y/o análogos mediante estudios de relación estructura actividad (SAR) y
- producido por cualquier organismo seleccionado entre hongos filamentosos como Aspergillus sp., bacterias e insectos en procesos de biotransformación y/o bioconversión.
La lecitina se selecciona entre:
- Lecitina sólida,
- Lecitina líquida o fluida y
- Lecitina hidrolizada o parcialmente hidrolizada.
El segundo componente se puede emplear de forma libre o encapsulada. La concentración del segundo componente en la composición biopesticida se combina con el núcleo bioactivo, en el siguiente intervalo de concentraciones peso / volumen total de la composición: 1-30% (p/v), preferentemente 5-25% (p/v) y aún más preferentemente 10-20% (p/v).
Las composiciones biopesticidas pueden comprender además al menos una sustancia inerte que puede ser seleccionada entre: adyuvantes, emulsionantes, dispersantes, aromatizantes, conservantes, antiespumantes, agentes tixotrópicos, matrices de encapsulación, ácidos grasos, fosfolípidos y mezclas de ellos.
Los adyuvantes pueden ser organosiliconados del grupo de los organosiloxanos.
Los agentes tixotrópicos pueden ser carboximetilcelulosa, carboximetilcelulosa sódica, celulosa microcristalina y otros derivados de la celulosa preferentemente goma y gel.
Las matrices de encapsulación se pueden seleccionar entre: maltodextrinas, ciclodextrinas, lecitinas, aceites vegetales y/o excipientes de sílice, estos últimos comprenden gel de sílice (silica gel), sílice coloidal y dióxidos de silicio, preferentemente se emplean ciclodextrinas.
En una realización particular de la invención la composición biopesticida comprende el núcleo bioactivo, lecitina y opcionalmente otras sustancias mencionadas como segundos componentes y/o sustancias inertes.
En una realización particular de la invención la composición biopesticida se selecciona entre las composiciones biopesticidas que comprenden:
- Zingiber officinale y Cinnamomum verum,
- Zingiber officinale, Cinnamomum verum y lecitina de soja,
- Zingiber officinale, E-cinamaldehido y Persea americana,
- Zingiber officinale, Cinnamomum verum y derivado siliconado tipo organosiloxano, - Zingiber officinale, Cinnamomum verum, extracto hidroalcohólico de Satureja montana y lecitina de soja,
- Zingiber officinale, Cinnamomum verum, lecitina de soja, derivado siliconado tipo organosiloxano, p-ciclodextrina y adyuvante polimérico,
- Zingiber officinale, Cinnamomum cassia, Persea americana, Cymbopogon citratus, lecitina de soja, Tween-80, derivado siliconado tipo organosiloxano, carboximentilcelulosa, p-ciclodextrina y adyuvante polimérico,
- Zingiber officinale, Cinnamomum verum, Persea americana, Aspergillus sp, lecitina de soja, derivado siliconado tipo organosiloxano y adyuvante polimérico,
- Zingiber officinale, Cinnamomum cassia, Mentha piperita, lecitina de soja, derivado siliconado tipo organosiloxano y adyuvante polimérico,
- Zingiberofficinale, Cinnamomum cassia, Cassia angustifolia, lecitina de soja, derivado siliconado tipo organosiloxano y adyuvante polimérico,
- Zingiber officinale, Cinnamomum cassía, Trigonella foenum-graecum, acetato de bencilo, lecitina de soja, derivado siliconado tipo organosiloxano y adyuvante polimérico, - Zingiber officinale, Cinnamomum verum, citral, benzoato de bencilo, lecitina de soja, - derivado siliconado tipo organosiloxano y adyuvante polimérico,
- Zingiber officinale, Cinnamomum verum, acetato de bencilo, geraniol, lecitina de soja, - derivado siliconado tipo organosiloxano y adyuvante polimérico,
- Zingiber officinale, Cinnamomum verum, Papaver somniferum, lecitina de soja, derivado siliconado tipo organosiloxano y adyuvante polimérico,
- Zingiber officinale, Cinnamomum verum, aceite esencial de Satureja montana, extracto de Satfureja montana, lecitina de soja, derivado siliconado tipo organosiloxano y adyuvante polimérico, y
- Zingiber officinale, E-cinamaldehído, acetato de geranilo, lecitina de soja, derivado siliconado tipo organosiloxano y adyuvante polimérico.
La presente invención se refiere también a un caldo o solución final de aplicación que comprende la composición biopesticida definida anteriormente diluida con un disolvente, preferentemente acuoso y más preferentemente agua.
La concentración de cada componente del núcleo bioactivo en el caldo de aplicación final se encuentra en el intervalo:
- aceite esencial, oleorresina, extracto acuoso, alcohólico o hidroalcohólico de raíz o rizomas de Zingiber officinale Roscoe: 0,01-0,99% (p/v), preferentemente 0,05-0,95% (p/m), preferentemente 0,1-0,9% (p/v), más preferentemente 0,2-0,8% (p/v), aún más preferentemente 0,3-0,7% (p/v) y más preferentemente 0,4-0,6% (p/v) y
- cinamaldehído o una fuente de cinamaldehido: 0,01-0,99% (p/v), preferentemente 0,05-0,95% (p/v), preferentemente 0,1-0,9% (p/v), más preferentemente 0,2-0,8% (p/v), aún más preferentemente 0,3-0,7% (p/v) y más preferentemente 0,4-0,6% (p/v).
Las principales ventajas técnicas de las composiciones biopesticidas divulgadas son:
- Presentan una alta eficacia y especificidad en el control de moscas y a dosis más bajas comparadas con:
- Los elementos activos (extractos, aceites, moléculas) individuales teniendo en cuenta tanto los valores obtenidos dentro de esta invención como los reportados en el estado de la técnica.
- Otros compuestos y/o formulaciones naturales y sintéticas de reconocida actividad. - Presentan modos de acción múltiples y no tóxicos frente a moscas (contactoantialimentario-repelencia-oviposición).
- Eliminan y/o retardan la aparición de resistencias cruzadas.
- Las especies seleccionadas de plantas presentan gran biodiversidad y sostenibilidad en el cultivo, garantizando la disponibilidad del material de partida.
- En el caso de los activos, no se espera que sean tóxicos para humanos y animales ni para plantas, teniendo en cuenta:
- Su ocurrencia en la naturaleza.
- Sus usos alimentarios y farmacológicos.
- Historial de exposición natural a los seres humanos y medio ambiente.
- En algunos casos, la obtención del extracto, como componente de algunas composiciones biopesticidas constituye una alternativa a la valorización de un material vegetal con muy escaso o nulo valor comercial y que se gestiona como residuo en el procesado de la industria agroalimentaria.
- El proceso de extracción y formulación optimizado que se divulga es limpio, rápido, eficiente y fácilmente escalable lo que redunda en una reducción del coste final del producto en el mercado.
Un objeto adicional de la invención constituye el procedimiento de obtención de la composición biopesticida de la invención que comprende la mezcla en medio acuoso de los componentes del núcleo bioactivo:
- aceite esencial, oleorresina, extracto acuoso alcohólico o hidroalcohólico de raíz o rizomas de Zingiber officinale Roscoe y
- cinamaldehíido o fuente de cinamaldehído.
En una etapa previa al procedimiento de obtención del núcleo bioactivo, el aceite esencial, oleorresina, extracto acuoso, alcohólico o hidroalcohólico de Zingiber officinale Roscoe se puede obtener mediante maceración, percolación, decocción, infusión, hidrodestilación Clevenger; extracción asistida por ultrasonidos, por microondas, por fluidos supercríticos; extracción tipo Soxhlet, extrusión, destilación por arrastre de vapor (directa, indirecta, a presión y/o a vacio) o extracción con disolventes (en caliente o frio) y preferentemente en un sistema de dispersión multifuncional con molino coloidal.
Por otro lado, la fuente de cinamaldehído se puede obtener mediante la destilación de una especie de las indicadas anteriormente que lo contenga. El cinamaldehído puede ser encapsulado previamente a la formación del núcleo bioactivo.
Es necesario seguir un orden determinado de adición de los componentes, al agua primero se añade el aceite esencial, oleorresina, extracto acuoso alcohólico o hidroalcohólico de raíz o rizomas de Zingiber officinale Roscoe y después el cinamaldehído o fuente de cinamaldehído (Ejemplo 1).
Opcionalmente, las composiciones biopesticidas se obtienen de la mezcla ordenada y en proporciones específicas, del núcleo bioactivo sinérgico, al menos un componente secundario y/o al menos una sustancia inerte. Se añaden posteriormente a la mezcla, de forma ordenada, y con un periodo de agitación tras la adición de cada componente.
La mezcla de los componentes del núcleo bioactivo se realiza a una velocidad comprendida en el intervalo entre 500 y 4000 rpm, preferentemente entre 1500 y 3000 rpm. La mezcla se realiza en medio acuoso.
La temperatura de la mezcla se encuentra entre los 20 y 40°C, preferentemente entre 24 y 35°C y durante un periodo comprendido entre 30 y 120 minutos, preferentemente 40 y 100 minutos.
El procedimiento de preparación de las composiciones biopesticidas se puede realizar en los aparatos o reactores habitualmente empleados para la realización de estas tareas en el campo de la técnica.
Un objeto adicional de la invención constituye el uso de composiciones biopesticidas para el control de plagas de moscas.
Particularmente el grupo de la mosca blanca, preferentemente las pertenecientes a los géneros Bemisia sp. "complex” (biotipos), Dialeurodes sp., Trialeurodes sp. Encarsia sp., Aleurolobus sp., Aleurothrixus sp., Aleurodicus sp., Aleyrodes sp., Parabemisia Sp., Paraleyrodes sp., Orchamoplatus sp., Siphoninus sp. y Tetraleurodes sp.
Los elementos de las composiciones biopesticidas actúan de forma sinérgica, aditiva, polivalente y/o potenciadora.
Los biopesticidas tienen un efecto prolongado mediante un mecanismo de liberación controlada.
La composición biopesticida se puede usar:
- de manera preventiva y/o
- curativa,
hasta condiciones de alta infestación con peligro de pérdida del cultivo.
Adicionalmente, los biopesticidas se pueden aplicar individualmente o en combinación con otros productos fitosanitarios o sistemas de control de plagas y enfermedades.
Por otros productos fitosanitarios o sistemas de control de plagas se entiende cualquier tipo de insecticidas, nematicidas, acaricidas, fungicidas, bactericidas, herbicidas, reguladores del crecimiento de la planta, elicitores, fertilizantes, acondicionadores del suelo, y cebos entre otros.
La aplicación de la composición biopesticida puede ser mediante aspersión foliar.
En otra realización particular las aplicaciones de las composiciones biopesticidas se realizan en cultivos agrícolas de uso alimentario y no alimentario, ya sea agricultura convencional, orgánica o ecológica, preferentemente en cultivos hortícolas, extensivos y ornamentales y jardinería, así como parques e instalaciones deportivas.
En otra realización particular las aplicaciones se realizan en invernadero y en campo abierto, así como jardines y áreas verdes de instalaciones deportivas y recreativas.
La dosis de la composición biopesticida, puede aumentar o disminuir según el tipo de formulación, tipo e intensidad de ataque de la plaga a controlar, cultivo y país de uso.
Mecanismos y definición de los modos de acción
El modo de acción se refiere a la interacción física y/o bioquímica específica a través de la cual un biopesticida produce su efecto.
Para determinar los modos y mecanismos de acción se emplearon un conjunto de microensayos (in vitro e in vivo) desarrollados y/o adaptados de la literatura científica (por ejemplo, ensayos de elección vs. no elección, pulverización directa, toxicidad por ingestión, bivensayo con olfatómetro de tubo en Y, bioensayos de priming, microscopía, etc.).
Preferentemente se realizan los siguientes bioensayos:
• Ensayos de mortalidad por contacto: El objetivo es evaluar el efecto de diferentes dosis de la sustancia sobre la mortalidad de adultos y estados inmaduros de la mosca blanca mediante aplicación tópica.
• Ensayos de inhibición del asentamiento: El objetivo es evaluar el efecto de diferentes dosis de la sustancia sobre el comportamiento (asentamiento) de adultos de mosca blanca. Se basa en la preferencia de las moscas por plantas tratadas y no tratadas localizadas en la misma caja entomológica (ensayos de elección) o en diferentes (no elección).
• Ensayos de inhibición de la oviposición: El objetivo es evaluar el efecto de diferentes dosis de la sustancia sobre la puesta de huevos de adultos de mosca blanca. Se basa en la preferencia para ovipositar de las moscas en superficies de plantas tratadas y no tratadas localizadas en la misma caja entomológica (ensayos de elección) o en diferentes (no elección).
• Ensayos de repelencia espacial: El objetivo es medir la capacidad de la sustancia para inhibir la preferencia de adultos de mosca blanca por su planta huésped (ensayos en olfatómetros).
En los protocolos de ensayo se tuvo en cuenta lo siguiente:
• Se ensayan cada uno de los elementos activos de las composiciones biopesticidas por separado y combinaciones entre ellos.
• Se ensayan cada una de las composiciones biopesticidas.
• Para cada uno de los elementos que componen las composiciones divulgadas, y para cada una de las composiciones biopesticidas se realizaron ensayos de dosis respuesta y se calculó la EC/LC 50 (dosis a la que se produce el 50% del efecto estudiado).
Teniendo en cuenta los resultados obtenidos se concluye que los elementos activos y/o composiciones biopesticidas evaluadas actúan mediante dos modos de acción principales: Modo de acción 1: Contacto directo (efecto “knock down”). Los mecanismos de acción involucrados en este modo de acción son:
- Bloqueo de las vías respiratorias de las moscas (muerte por asfixia).
- Destrucción de la capa de cera del exoesqueleto (muerte por deshidratación).
- Desestructuración de la membrana celular (shock osmótico).
Modo de acción 2: Acción sobre los receptores olfatorios y del gusto de la mosca. Los mecanismos de acción involucrados en este modo de acción son:
- Efecto antialimentario: Inhibición de la alimentación mediante la interacción de los componentes del formulado con los receptores del gusto.
- Efecto repelente: Fuerte efecto repelente mediante la liberación controlada de los componentes volátiles encapsulados y su interacción con los receptores olfativos.
- Inhibición de la oviposición: Reduce considerablemente la puesta de huevos mediante la interacción de los componentes del formulado con los quimiorreceptores del adulto. Los mecanismos y modos de acción de cada uno de los elementos del núcleo bivactivo se resumen en la Tabla 2.
Tabla 2. Modos y mecanismos de acción de los elementos del núcleo bioactivo
Figure imgf000016_0001
Los ingredientes del núcleo bioactivo presentan una composición química compleja asociada a una gran multifuncionalidad en cuanto a mecanismos de acción. La combinación de los mecanismos de acción propuestos (físicos y conductuales) determinan la eficacia del núcleo bioactivo y minimizan el riesgo de aparición de resistencias cruzadas. Esta eficacia se ve potenciada con la adición de, al menos, un segundo componente activo, así como coformulantes (sustancias) inertes que contribuyen al aumento de la estabilidad del formulado y favorecen la liberación controlada de los ingredientes activos.
Breve descripción del contenido de las figuras
Figura 1: Reactor de formulación.
Figura 2: Diagrama del proceso de destilación por arrastre de vapor.
Figura 3: Diagrama de flujo del proceso de fermentación.
Figura 4: Esquema de un fraccionamiento químico biodirigido.
Figura 5: Diseño de un ensayo in vitro de mortalidad por contacto.
Figura 6: Observación al microscopio de adultos de mosca blanca en ensayos de mortalidad por contacto. A: Desestabilización de membranas celulares, B: Bloqueo de los espiráculos traqueales (asfixia).
Figura 7: Olfatómetro en "Y” diseñado para los ensayos de repelencia espacial.
Figura 8: Diseño experimental de los ensayos de inhibición de la alimentación in planta.
Figura 9: Análisis isobolográfico de la interacción entre los componentes de núcleo bioactivo.
Figura 10: Cromatograma (GC-MS-MS) del aceite esencial de Cinnamomum zeylanicum puro (A) y encapsulado (B).
Figura 11: Curva de dosis-respuesta de los elementos del núcleo bioactivo para la mortalidad por contacto (%M).
Figura 12: Curva de dosis-respuesta de los elementos del núcleo bioactivo para la inhibición del asentamiento (%SI).
Figura 13: Curva de dosis-respuesta de los elementos del núcleo bioactivo para la inhibición de la puesta de huevos (%lO).
Figura 14: Metodología del Triángulo de Gibbs para el estudio de mezclas sinérgicas, potenciadoras y/o cooperativas. El triángulo superior muestra el número de combinaciones sinérgicas generadas entre los componentes A, B y C. El triángulo inferior representa la proporción de cada uno de los ingredientes A, B y C en la combinación.
Figura 15: Diseño experimental y distribución de parcelas experimentales y de muestro en el ensayo de la composición WF_F4 frente a mosca blanca en berenjena.
Ejemplos
Las siguientes figuras, diagramas, tablas y ejemplos se muestran a título ilustrativo y no limitativos de la presente invención.
Ejemplo 1. Obtención del núcleo bioactivo
En la Tabla 3 se incluyen varios ejemplos de composiciones biopesticidas divulgadas en el marco de esta patente.
En un ejemplo específico el núcleo bioactivo (ver composición MO, Tabla 3) comprende un 10,5% de extracto hidroalcohólico de raíces/rizomas de Zingiber officinale y un 15% de aceite esencial de Cinnamomum verum J. Presi. (sin., C. zeylanicum Blume), como fuente de cinamaldehído (CAS 8015-91-68) en agua. El aceite esencial puede ir incorporado de forma libre (como 100% aceite esencial) y/o parcial o totalmente encapsulado con un agente encapsulante. En un ejemplo específico el agente encapsulante es p-ciclodextrina. El proceso de obtención, siguiendo las etapas generales descritas anteriormente, se detalla a continuación:
La mezcla de los elementos del núcleo bioactivo se lleva a cabo en un reactor de acero inoxidable (Figura 1) con una capacidad total de 650 litros y una capacidad útil de 560 litros. Está dotado de una doble camisa por la que circula un fluido intercambiador de calor para el control de la temperatura dentro del tanque a través de un sensor PT100. El reactor está equipado con dos agitadores: un agitador central de disco tipo cowles (velocidad máxima de 1500 rpm) y un emulsionador de alta velocidad (3000 rpm, tipo ultra-turrax) ubicado en el fondo del reactor. Ambos agitadores se controlan de forma independiente para lograr una velocidad y control de la rotación específica para cada ingrediente y momento durante el proceso de mezclado. Además, el reactor está conectado a una bomba de vacío que se emplea para eliminar las burbujas de aire que se forman en el producto y prevenir la formación de interfaces gas-líquido. También presenta un sistema de inyección de gas inerte para evitar el trabajo en presencia de oxígeno y así evitar procesos oxidativos. Por último, el reactor cuenta con un sistema de limpieza tipo CIP (“cleaning in place") para la limpieza automática.
Teniendo en cuenta las características del reactor (Figura 1), los elementos del núcleo biovactivo se añaden cuidosamente en un determinado orden, ajustando la temperatura y variables de rotación de cada agitador según se detalla en la Tabla 4.
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Tabla 4. Orden de mezcla y condiciones generales para la preparación del núcleo bioactivo
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Ejemplo 2. Obtención de composiciones biopesticidas
Cada composición biopesticida se formula de acuerdo con un orden de mezclado específico según la naturaleza de los elementos activos y coformulantes que la componen. Los elementos del núcleo bioactivo se emplean en la composición final de dos formas:
(1) Se incluyen individualmente y en el orden correspondiente durante el proceso de formulación de la composición biopesticida.
(2) Se premezcla y posteriormente se añaden al formulado final en la proporción y orden correspondiente dependiendo de la composición biopesticida.
El procedimiento consta de las siguientes etapas generales:
a) Selección de las materias primas
• Elementos activos
- Núcleo bioactivo (primer componente)
- Segundo (s) componente (s)
• Sustancias inertes
- Emulsionante
- Adyuvante
- Estabilizante
- Conservante
- Encapsulante
- Aromatizante
- Antiespumante
b) Encapsulación (si procede) del (los) ingrediente (s) activo (s)
c) Formulación (mezcla de los ingredientes).
En la Tabla 3 se incluyen varios ejemplos de composiciones biopesticidas divulgadas en el marco de esta patente. A continuación, se detalla un ejemplo del procedimiento de obtención de cada una de las variantes (composiciones M1, M2, M3, M4, WF_F4, ADI-23, PW-1.5 y MxM5). Este proceso es extensivo para el resto de las composiciones que se relacionan en la Tabla 3 (MxM14, MxM15, MxM22, MxM19, MxM12, MxM16 y MxM25).
2.1 Composición biopesticida formada por el núcleo bioactivo lecitina como segundo componente
En un ejemplo de composición biopesticida (ver composición M1, Tabla 3) el núcleo bioactivo (7,5% de extracto hidroalcohólico de Z. officinale y 10% de aceite esencial de C. verum como fuente de cinamaldehído) se mezclan con un 17,5% de lecitina de soja (CAS: 8002-43-5) como agente emulsionante y potenciador de la actividad, para formar la composición M1 (Tabla 3). Teniendo en cuenta las características del reactor descritas en el ejemplo 1, los elementos del núcleo bioactivo y la lecitina de soja se añaden cuidosamente en un determinado orden, ajustando la temperatura y variables de rotación de cada agitador según se detalla en la Tabla 5.
Tabla 5. Orden de mezcla y condiciones generales para la preparación de la composición M1 que comprende el núcleo bioactivo y lecitina de soja
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2.2 Composición biopesticida formada por el núcleo bioactivo y extracto de Persea americana como segundo componente.
En un ejemplo de composición biopesticida (ver composición M2, Tabla 3) el núcleo bioactivo (7,5% de extracto hidroalcohólico de Z. officinale y 5% de Cinamaldehido (CAS 104-55-2), como fuente de cinamaldehído) se mezclan con un 20% de extracto hidroalcohólico de Persea americana (segundo componente), para formar la composición M2 (Tabla 3).
Teniendo en cuenta las características del reactor descritas en el ejemplo 1, los elementos del núcleo bioactivo y el segundo componente (extracto hidroalcohólico de P. americana) se añaden cuidosamente en un determinado orden, ajustando la temperatura y variables de rotación de cada agitador según se detalla en la Tabla 6.
Tabla 6. Orden de mezcla y condiciones generales para la preparación de la composición M2 que comprende el núcleo bioactivo y un segundo componente activo
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2.3 Composición biopesticida formada por el núcleo bioactivo sustancias inertes.
En un ejemplo de composición biopesticida (ver composición M3, Tabla 3) el núcleo bioactivo (12,5% de extracto hidroalcohólico de Z. officinale y 12,5% de aceite esencial de C. verum, como fuente de cinamaldehído) se mezclan con un 10% de un derivado siliconado del tipo organosiloxano (adyuvante), para formar la composición M3 (Tabla 3).
Teniendo en cuenta las características del reactor descritas en el ejemplo 1, los elementos del núcleo bioactivo y el adyuvante (derivado organosiliconado) se añaden cuidosamente en un determinado orden, ajustando la temperatura y variables de rotación de cada agitador según se detalla en la Tabla 7.
Tabla 7. Orden de mezcla y condiciones generales para la preparación de la composición M3 que comprende el núcleo bioactivo y adyuvante
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2.4 Composición biopesticida formada por el núcleo bioactivo y dos segundos componentes. En un ejemplo de composición biopesticida (ver composición M4, Tabla 3) el núcleo bioactivo (1 % de extracto hidroalcohólico de Z. officinale y 12,5% de aceite esencial de C. verum, como fuente de cinamaldehído) se mezclan con un 20% de extracto hidroalcohólico de Satureja montana y un 17,5% de lecitina de soja (segundos componentes) para formar la composición M4 (Tabla 3).
Teniendo en cuenta las características del reactor descritas en el ejemplo 1, los elementos del núcleo bioactivo y el adyuvante (derivado organosiliconado) se añaden cuidosamente en un determinado orden, ajustando la temperatura y variables de rotación de cada agitador según se detalla en la Tabla 8.
Tabla 8. Orden de mezcla y condiciones generales para la preparación de la composición M4 que comprende el núcleo bioactivo, dos segundos componentes
Figure imgf000024_0001
2.5 Composición biopesticida formada por el núcleo bioactivo, lecitina de soja, sustancias inertes y/o un segundo componente activo.
2.5.1. Composición WF F4
En un ejemplo de composición biopesticida, el núcleo bioactivo (7,5% de extracto hidroalcohólico de Z. officinale y 16,0% de aceite esencial de C. verum, como fuente de cinamaldehído) se mezclan con un 17,5% de lecitina de soja (segundo componente con función de emulsionante y potenciador), un 13% de un adyuvante organosiliconado y un 10% de un adyuvante polimérico que actúa como agente dispersante. En este caso particular, un 13% del aceite esencial de C. verum se añade en forma libre un 3% del aceite esencial de C. verum se añade encapsulado en un 10% de p-ciclodextrina para formar la composición WF_F4 y (Tabla 3).
Teniendo en cuenta las características del reactor descritas en el ejemplo 1, los elementos del núcleo bioactivo, la lecitina de soja y el resto de las sustancias inertes se añaden cuidosamente en un determinado orden, ajustando la temperatura y variables de rotación de cada agitador según se detalla en la Tabla 9.
Tabla 9. Orden de mezcla y condiciones generales para la preparación de la composición WF_F4 que comprende el núcleo bioactivo, lecitina de soja y sustancias inertes
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*Nota: El 13% de ingrediente encapsulado está formado por un 3% de aceite esencial de C. verum y un 10% del agente encapsulante p -ciclodextrina.
2.5.2. Composición ADI-23
En un ejemplo de composición biopesticida, el núcleo bioactivo (7% de extracto hidroalcohólico de Z. officinale y 2,5% de aceite esencial de C. cassía, como fuente de cinamaldehído) se mezclan con un 13,5% de extracto hidroalcohólico de Persea americana, un 10% de aceite esencial de Cymbopogon citratus, un 17,5% de lecitina de soja (segundo componente con función de emulsionante y potenciador) y sustancias inertes. En este caso particular, el extracto de P. americana y aceite esencial de C. citratus también se consideran como segundos componentes.
Teniendo en cuenta las características del reactor descritas en el ejemplo 1, los elementos del núcleo bioactivo, los segundos componentes, y el resto de las sustancias inertes se añaden cuidosamente en un determinado orden, ajustando la temperatura y variables de rotación de cada agitador según se detalla en la Tabla 10.
Tabla 10. Orden de mezcla y condiciones generales para la preparación de la composición ADI-23 que comprende el núcleo bioactivo, dos segundos componentes y sustancias inertes
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*Nota: El 10% de ingrediente encapsulado está formado por un 2,5% de aceite esencial de C. cassia y un 7,5% del agente encapsulante p-ciclodextrina.
2.5.3. Composición PW-1.5
En un ejemplo de composición biopesticida, el núcleo bioactivo (3% de extracto hidroalcohólico de Z. officinale y 2,5% de aceite esencial de C. verum, como fuente de cinamaldehído) se mezclan con un 7% de extracto hidroalcohólico de Persea americana, un 47,7% de fermento de Aspergillus niger, un 17,5% de lecitina de soja y sustancias inertes. En este caso particular, el extracto de P. americana y el producto de fermentación de Aspergillus y la lecitina se consideran como segundos componentes.
Teniendo en cuenta las características del reactor descritas en el ejemplo 1, los elementos del núcleo bioactivo, segundos componentes, y el resto de las sustancias inertes se añaden cuidosamente en un determinado orden, ajustando la temperatura y variables de rotación de cada agitador según se detalla en la T abla 11.
Tabla 11. Orden de mezcla y condiciones generales para la preparación de la composición PM-1.5
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2.5.4, Composición MxM5
En un ejemplo de composición biopesticida, el núcleo bioactivo (1% de extracto hidroalcohólico de Z. officinale y 0,5% de aceite esencial de C. verum, como fuente de cinamaldehído) se mezclan con un 12,5% de citral, un 20% de benzoato de bencilo, un 17,5% de lecitina de soja (emulsionante potenciador) y sustancias inertes. En este caso particular, los compuestos puros citral y benzoato de bencilo se consideran segundos componentes.
Teniendo en cuenta las características del reactor descritas en el ejemplo 1, los elementos del núcleo bioactivo, los segundos componentes, y las sustancias inertes se añaden cuidosamente en un determinado orden, ajustando la temperatura y variables de rotación de cada agitador según se detalla en la Tabla 12.
Tabla 12. Orden de mezcla y condiciones generales para la preparación de la composición MxM5
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Ejemplo 3. Metodología de obtención de los segundos componentes
El material vegetal descrito en el Ejemplo 2 se somete a diferentes procesos de extracción para obtener los segundos componentes, tanto los que componen el núcleo bioactivo como los que se emplean como segundo componente.
A) Extractos acuosos, alcohólicos y/o hidroalcohólicos
Para la extracción acuosa se emplea agua. En el caso de la extracción alcohólica se emplea una extracción con disolventes, preferentemente etanol, isopropanol o alcohol bencílico. El método de extracción se elige entre maceración (frío o caliente, en reposo o agitada), infusión, percolación, decocción, reflujo, ultrasonido, microondas, Soxhlet y, preferentemente, una extracción mediante una tecnología avanzada de dispersión multifuncional con molino coloidal, cuyo principio de funcionamiento es un sistema de rotor/estator. Los perfiles químicos de los extractos se determinan mediante Cromatografía de Gases acoplada a Espectrometría de Masas (GC-MS-MS) y Cromatografía Líquida acoplada a Espectrometría de Masas (LC-MS-MS).
B) Aceites esenciales
Los aceites se obtienen mediante hidrodestilación, maceración en disolventes apolares (ej. acetona, hexano, diclorometano, éter de petróleo), extracción mediante fluidos supercríticos y preferentemente mediante destilación por arrastre de vapor según las metodologías descritas en la Farmacopea Europea (Ph. Eur. 8.0, 2013, ISBN: 978-92-871-7525-0, 3513 pp.) bajo la certificación UNE EN ISO 9001: 215. Los perfiles químicos de los aceites esenciales se determinan mediante Cromatografía de Gases acoplada a Espectrometría de Masas (GC-MS). En la Figura 2 se muestra un diagrama típico del proceso de destilación por arrastre de vapor. C) Fermentación
Los residuos sólidos secos de cítricos (cortezas, cáscaras, pulpa), el material vegetal original seleccionado entre los citados en los ejemplos 1-2 y/o residuos del proceso de extracción de estos se someten a un proceso de fermentación y posterior extracción. Para ello, la materia prima, en un porcentaje entre el 10-15%, se incuba en agua con uno de los diferentes microorganismos seleccionados (Bacillus sp., Pseudomonas sp., Trichoderma sp. y Aspergillus sp.) durante 120h a 28°C-30°C en un fermentador F3-100 (Bionet, Murcia, España). Tras la incubación, el fermentado se centrifuga a 5000rpm durante 5 min (Hitachi Himac CR22N) y filtrado a través de un filtro de malla o tela. El líquido resultante queda listo para ser empleado en la formulación. El proceso general se detalla en el diagrama de flujo de la Figura 3.
D) Fraccionamiento químico biodirigido
En el marco de esta invención se realiza un fraccionamiento químico guiado por bioensayos de los extractos acuosos, alcohólicos y/o hidroalcohólicos que lo requieran. Para ello se emplean técnicas de extracción/separación convencionales y avanzadas de amplio conocimiento en la literatura especializada. Entre ellas podemos citar: extracción líquido-líquido, cromatografía líquida de vacio (VLC), cromatografía en columna (CC), cromatografía en fase sólida (ej. Sílice, Sephadex), cromatografía líquida preparativa de alta resolución (pHPLC) y fluidos supercríticos. Un ejemplo concreto de la obtención de una fracción bioactiva a partir del extracto de Persea americana se describe en la Figura 4.
Ejemplo 4. Proceso de encapsulación del Cinamaldehido
Este proceso es válido tanto para la forma encapsulada de la fuente de cinamaldehído en el núcleo bioactivo como para cualquier forma encapsulada del segundo componente de la composición biopesticida.
En proceso de encapsulación se lleva a cabo en un reactor idéntico al descrito en el ejemplo 1 (Figura 1).
A continuación, se describe el proceso de encapsulación de C. verum como fuente de cinamaldehído. Para ello, se añaden 450 litros de agua en el reactor a 25°C. Posteriormente se incorpora lentamente 45 Kg de p-ciclodextrina (agente encapsulante) y se mantiene durante 30 minutos en agitación vigorosa (agitador Turrax a 3000 rpm y agitador Cowles a 1000 rpm). A continuación, el agitador Turrax se detiene y el agitador Cowles se ajusta a 500 rpm, añadiéndose lentamente 20 Kg de aceite esencial de C. verum. La mezcla se mantiene en esas condiciones de agitación durante 2 horas. Pasado este tiempo la mezcla se extrae del reactor y se deja reposar a 10°C durante 24 horas en un tanque de acero inoxidable acondicionado para este propósito. Posteriormente la mezcla se bombea (mediante vacío) hasta un tamiz (42 micrones) que separa las partículas sólidas del líquido. La parte liquida se almacena y se emplea para nuevos procesos de encapsulación y/o como agua en los procesos de formulación. Los sólidos se extienden en bandejas de acero inoxidable de 1 cm de grosor y se secan a temperatura controlada de 35°C durante otras 24 horas hasta alcanzar una humedad del 12%, estando listo para utilizar en el proceso de formulación de las composiciones biopesticidas.
Ejemplo 5. Dilución de las composiciones biopesticidas
De acuerdo con el número de productos que vayan a componer la mezcla se realiza una secuencia de mezclado específica para evitar incompatibilidades.
La preparación del caldo o solución de aplicación final se realiza diluyendo la composición biopesticida reivindicada en al menos un disolvente, preferentemente agua. La cantidad de diluyente y magnitud de la dilución depende del tipo de cultivo, volumen de caldo requerido, especie de mosca y el nivel de infestación/daño en el momento de la aplicación. Como regla general el caldo de aplicación se realizará siguiendo los siguientes pasos:
• Acondicionar el pH (5-7) y la dureza del agua (blanda).
• Realizar una premezcla en un volumen determinado de disolvente (ej. 1/3 del depósito) del (los) producto (s) que integre (n) la formulación. En caso de más de un producto se añaden primero las formulaciones sólidas y posteriormente las líquidas. Las premezclas se harán en agitación de acuerdo con las especificaciones y características de cada tanque de preparación del caldo que posea el usuario final. La duración del premezclado dependerá de las condiciones de cada usuario y del número de elementos que componen el caldo final.
• Añadir coadyuvante seleccionado (si procede).
• Completar el depósito con la cantidad de disolvente adecuado según la dosis y mantener la agitación.
Las composiciones biopesticidas divulgadas se diluyen en un rango entre 50 y 10000 veces. Á continuación, se muestran ejemplos de diluciones de las preparaciones mostradas en los ejemplos 1 y 2.
5.1. Diluciones de la composición mostrada en el Ejemplo 1.
En el ejemplo 1 se muestra un ejemplo de composición biopesticida (ver composición M0, Tabla 3) que sólo contiene el núcleo bioactivo. En la Tabla 13 se muestran algunos ejemplos de la concentración final de los elementos en el caldo final al aplicar diferentes factores de dilución.
Tabla 13. Ejemplo de diluciones de la composición que comprende sólo el núcleo bioactivo
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5.2. Diluciones de las composiciones mostradas en el Ejemplo 2.
En el ejemplo 2 se muestran diferentes ejemplos de composiciones biopesticidas que comprenden el núcleo bioactivo.
Un ejemplo es la composición biopesticida M1 (Tabla 3, Ejemplo 2.1) que contiene el núcleo bioactivo y la lecitina. En la Tabla 14 se muestran algunos ejemplos de la concentración final de los elementos en el caldo final al aplicar diferentes factores de dilución.
Tabla 14. Ejemplo de diluciones de la composición M1 (núcleo bioactivo lecitina como segundo componente)
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Otro ejemplo es la composición biopesticida M2 (Tabla 3, Ejemplo 2.2) que contiene el núcleo bioactivo y un segundo componente. En la Tabla 15 se muestran algunos ejemplos de la concentración final de los elementos en el caldo final al aplicar diferentes factores de dilución.
Tabla 15. Ejemplo de diluciones de la composición M2 (núcleo bioactivo extracto de P.
americana como segundo componente)
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Otro ejemplo es la composición biopesticida M3 (Tabla 3, Ejemplo 2.3) que contiene el núcleo bioactivo y sustancias inertes. En la Tabla 16 se muestran algunos ejemplos de la concentración final de los elementos en el caldo final al aplicar diferentes factores de dilución.
Tabla 16. Ejemplo de diluciones de la composición M3 (núcleo bioactivo sustancias inertes)
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Otro ejemplo es la composición biopesticida M4 (Tabla 3, Ejemplo 2.4) que contiene el núcleo bioactivo y dos segundos componentes. En la Tabla 17 se muestran algunos ejemplos de la concentración final de los elementos en el caldo final al aplicar diferentes factores de dilución.
Tabla 17. Ejemplo de diluciones de la composición M4 (núcleo bioactivo 2 segundos componentes)
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Otro ejemplo es la composición biopesticida WF_F4 (Tabla 3, Ejemplo 2.5.1) que contiene el núcleo bioactivo, lecitina de soja y sustancias inertes. En la Tabla 18 se muestran algunos ejemplos de la concentración final de los elementos en el caldo final al aplicar diferentes factores de dilución.
Tabla 18. Ejemplo de diluciones de la composición WF_F4 (núcleo bioactivo lecitina como segundo componente sustancias inertes)
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* Se corresponde a la mezcla del agente encapsulante (P-ciclodextrina) con el aceite esencial de C. verum.
Otro ejemplo es la composición biopesticida ADI-23 (Tabla 3, Ejemplo 2.5.2) que contiene el núcleo bioactivo, otros tres segundos componentes, y sustancias inertes. En la Tabla 19 se muestran algunos ejemplos de la concentración final de los elementos en el caldo final al aplicar diferentes factores de dilución.
Otro ejemplo es la composición biopesticida PW-1.5 (Tabla 3, Ejemplo 2.5.3) que contiene el núcleo bioactivo, otros tres elementos activos (uno de ellos es derivado de un proceso de fermentación), y sustancias inertes. En la Tabla 20 se muestran algunos ejemplos de la concentración final de los elementos en el caldo final al aplicar diferentes factores de dilución.
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Otro ejemplo es la composición biopesticida MxM5 (Tabla 3, Ejemplo 2.5.4) que contiene el núcleo biovactivo, dos segundos componentes (compuestos puros y lecitina de soja) y sustancias inertes. En la Tabla 21 se muestran algunos ejemplos de la concentración final de los elementos en el caldo final al aplicar diferentes factores de dilución.
Tabla 21. Ejemplo de diluciones de la composición MxM5 (núcleo bioactivo 3 segundos componentes sustancias inertes)
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Ejemplo 6. Protocolos generales de ensayos de laboratorio
6.1. Especies de moscas dianas
Las especies de plaga que se utilizaron como dianas biológicas para realizar la mayoría de los ensayos de eficacia y mecanismos de acción se detallan en la Tabla 22.
Tabla 22: Dianas biológicas empleadas en el marco de la invención
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Las dianas se seleccionaron teniendo en cuenta la importancia económica de su incidencia sobre cultivos hortícolas, el desarrollo de resistencia a insecticidas de síntesis, su capacidad de transmisión de virus, así como su empleo generalizado como modelos de estudio para el manejo de plagas relacionadas pertenecientes al grupo de las moscas blancas.
6.2. Cría y mantenimiento de las dianas biológicas
Para establecer las poblaciones se muestrearon diferentes poblaciones de adultos de cada una de las especies (Tabla 2 2 ). Las poblaciones son representativas de diferentes invernaderos de la provincia de Almería dónde existe una de las mayores concentraciones de cultivos bajo plástico. El "pool” representativo de cada una de las dianas se estableció sobre una de sus plantas huésped (Phaseolus vulgaris L.). La población establecida se mantuvo en cámaras dimatizadas tipo “walk-in" en las siguientes condiciones ambientales: 22°C 1°C, 60-70% de humedad relativa y un fotoperiodo de 16:8 horas (luz:oscuridad).
6.3. Productos de referencia
En los diferentes bioensayos que se describen a continuación se incluyeron diferentes productos recomendados para el control de la mosca blanca y que se comercializan actualmente en el mercado (Tabla 23). El objetivo es emplearlos como controles positivos de la eficacia de las composiciones biopesticidas que se reivindican en esta invención.
Tabla 23. Productos comerciales de referencia empleados en los estudios de eficacia
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6.4. Microensayos (in vitro e in vivo) de control de mosca blanca
Los protocolos de ensayo se desarrollaron con la finalidad de discriminar entre los diferentes modos y mecanismos de acción de las sustancias ensayadas. El núcleo bioactivo (Zingiber officinale + fuente de cinamaldehído) así como las diferentes composiciones biopesticidas objeto de esta invención, se evaluaron en ensayos de eficacia frente a las plagas seleccionadas. Para ellos se realizaron ensayos in vitro en placas petri e in vivo empleando modelos reproducibles en planta.
Descripción general de los tipos de ensayos de uso de las composiciones empleados en el marco de esta invención.
Los ensayos se dividen en tres grandes grupos:
- Mortalidad por contacto: Determina la capacidad insecticida frente a mosca blanca de un producto a corto y medio plazo (0-24 h) mediante aplicación tópica. En este caso discriminamos entre dos mecanismos de acción:
• Efecto sobre la cutícula y membranas de la mosca (shock osmótico).
• Efecto sobre los órganos respiratorios de la mosca (asfixia).
- Efecto sobre la conducta de la mosca: Determinan el efecto sobre el control de la mosca blanca de un producto a medio y largo plazo (24h-7días) mediante la interacción con los receptores del gusto y olfato.
• Repelencia espacial (true repellents): La mosca se aleja de la zona tratada sin entrar en contacto directo con la sustancia (receptores olfativos).
• Irritantes (Landing inhibitors): La mosca se aleja de la zona tratada después de entrar en contacto directo con la sustancia (receptores gustativos y olfativos).
- Efectos antialimentarios (antifeedants, deterrents):
• Inhibición de la alimentación: La mosca entra en contacto con el producto, pero no se alimenta y termina alejándose del área tratada (receptores gustativos).
• Inhibición de la oviposición: La mosca entra en contacto con la zona tratada, pero se inhibe la puesta de huevos (receptores olfativos y gustativos).
A continuación, se describen las metodologías empleadas para cada uno de los ensayos propuestos.
Mortalidad por contacto
El objetivo del ensayo es evaluar el efecto de diferentes dosis de la sustancia a ensayar sobre la mortalidad de adultos de mosca blanca, mediante aplicación tópica.
El ensayo se realiza en botes de plástico con tapa de rosca de 10 cm de altura y 5 cm de diámetro. En el centro de la tapa se perfora un orificio de 2 cm2 que se cubre con una fina tela con longitud de poro 0.77 x 0.27 mm (longitudinal:transversal). Se corta un disco de hoja (5,7 cm2) de la planta huésped (Phaseolus vulgaris) y se coloca (con el haz hacia abajo) en el fondo del bote previamente recubierto con una capa de agar de 1 cm de espesor (1 2 % en agua p/v) que además de soporte, brinda la humedad necesaria al disco durante la duración del ensayo (24 horas). En cada bote se introducen 15 individuos adultos previamente capturados con un aspirador entomológico (Figura 5). El bote con las moscas se incuba durante un minuto a 4°C con el objetivo de disminuir momentáneamente la movilidad de la plaga y facilitar su asentamiento sobre el disco en la base del bote. Posteriormente, la sustancia a tratar (núcleo bioactivo, composición biopesticida, productos de referencia) se asperja uniformemente sobre las moscas asentadas en el fondo del bote empleando un difusor portátil. Una vez aplicado el producto los botes se mantienen en una cámara climatizada con las mismas condiciones descritas para la cría de la mosca. Cada ensayo de mortalidad en adultos consta de 20 botes (réplicas) para cada uno de los tratamientos y 20 botes (réplicas) para el control (agua). A su vez, cada uno de los ensayos se replica 3 veces en el tiempo.
Las diferentes combinaciones del núcleo bivactivo (Tabla 3) se ensayan a una concentración inicial entre 0,01-0,5% del caldo de aplicación. Las composiciones biopesticidas (Tabla 3) y productos de referencia, se aplican en el intervalo de dosis recomendadas (entre 1-5 ml de formulado/Litro de agua). Al final del ensayo (24 horas) se procede a contar el número de moscas vivas y muertas con ayuda de una lupa estereoscópica. En el caso de la determinación del efecto “knock-down” o volteo, el conteo se realiza de forma seriada a las 2, 4, 6 ,8 , 16 y 24 horas después de aplicado el tratamiento. La mosca se considera muerta cuando no muestra ningún signo de movilidad al tocarla con un pincel entomológico. La mortalidad se expresa en % con respecto al control y los datos se corrigieron empleando la fórmula de Abbott:
Figure imgf000038_0001
donde,
X= Porcentaje (%) de mortalidad en el tratamiento e
Y= Porcentaje (%) de mortalidad en el control
Los datos se compararon mediante Análisis de Varianza (ANOVA, p<0.05) y la prueba LSD (post hoc test) para verificar las diferencias entre las medias. Para ello, se empleó el paquete estadístico IBMO SPSS Statistics®. En caso de no normalidad de los datos se aplicará la prueba no paramétrica de rangos múltiples de Wilconxon (p<0,05). Los tratamientos con un porcentaje de mortalidad significativo (>70%) se seleccionan para estudios de dosis-respuesta. La dosis a la que se produce el 50% del efecto deseado (EC50) se calcula mediante un análisis de regresión probit basado en el logaritmo de la dosis (Log-dose probif).
Las moscas muertas se observan detenidamente al microscopio con el objetivo de diferenciar el mecanismo por el cual se produce la mortalidad (Figura 6 ). En el marco de esta invención los mecanismos se diferenciaron de la siguiente forma:
- Mosca muerta que conserva su forma y estructura intacta con un leve color amarillento:
Se propone la asfixia como mecanismo de acción primario.
- Mosca muerta que ha perdido su forma y estructura (desintegrado y/o aplastado) con un color marrón: Se propone un shock osmótico por desintegración de la membrang/cutícula como mecanismo de acción primario.
En los ejemplos de realización posteriores se explican las composiciones biopesticidas, concentraciones, organismos y detalles más concretos empleados para cada experimento particular.
Efectos sobre la conducta de la mosca: Repelencia directa
Para los estudios de repelencia directa se empleó la metodología del olfatómetro.
En los estudios referidos en esta memoria se emplea un olfatómetro de tres brazos (“arms”) en Y (Y-tube) tal como se muestra en la Figura 7. Se prepararon dos botes de plástico con tapa de rosca de 10 cm de altura y 5 cm de diámetro. En el centro de la tapa se perfora un orificio de 2 cm2 que se cubre con una fina tela con longitud de poro 0.77 x 0.27 mm (longitudinal:transversal). Se corta un disco de hoja (5,7 cm2) de la planta huésped (Phaseolus vulgaris) y se coloca (con el haz hacia abajo) en el fondo del bote previamente recubierto con una capa de agar de 1 cm de espesor (1 2 % en agua p/v) que además de soporte, brinda la humedad necesaria al disco durante la duración del ensayo (24 horas).
En uno de los brazos superiores se colocó uno de los botes tratado con la sustancia a ensayar (composición biopesticida) a probar y en el otro un bote idéntico con un disco tratado con agua (control). Por el brazo inferior se liberan las moscas. El experimento se incuba en cámaras climatizadas tipo “walk-in" en las siguientes condiciones ambientales: 22°C 1°C, 60-70% de humedad relativa y un fotoperiodo de 16:83 horas (luz:oscuridad). En cada ensayo se emplearon 3 olfatómetros que se consideraron como réplicas. Después de 24h se procede a contar las moscas asentadas en el tratamiento y en el control y se calcula el índice de repelencia (%Rl) para cada sustancia ensayada empleando la siguiente fórmula:
%Rt -[1 - 0]¿F 100
Donde,
T: Número de moscas vivas dentro de la cámara tratada (asentados sobre el disco tratado y/o en las paredes del bote)
C: Número de moscas vivas dentro de la cámara control (asentados sobre el disco control y/o en las paredes del bote)
Las medias de los %Rl se analizaron mediante la prueba no paramétrica de rangos múltiples de Wilconxon (Wilconxon signed-rank-test) (p<0,05), empleando el paquete estadístico IBM® SPSS Statistics®.
En los ejemplos de realización posteriores se explican las composiciones biopesticidas, concentraciones, organismos y detalles más concretos empleados para cada experimento particular.
Efectos sobre la conducta de la mosca: Efectos antialimentarios (Repelencia indirecta)
En el marco de esta invención hemos considerado como antialimentario cualquier sustancia que actúe sobre la conducta de la mosca inhibiendo su alimentación, asentamiento y oviposición. La inhibición del asentamiento se considera como un efecto de repelencia indirecta.
Bioensayos de inhibición del asentamiento in planta (choice).
Este tipo de ensayo determina el efecto de las sustancias ensayadas sobre el asentamiento de adultos de mosca blanca en plantas huésped (Phaseolus vulgans). Se basa en la preferencia de los adultos por plantas huésped tratadas y control colocadas en la misma caja. Para el desarrollo del bivensayo se diseñaron cajas entomológicas de metacrilato rectangulares de 50x35 cm (alto x ancho) con tapa en la parte superior. En la tapa se practica un orificio de ventilación de 25 cm de diámetro cubierto con una malla con longitud de poro 0,77 x 0,27 mm (longitudinal: transversal). Se preparan dos macetas idénticas cada una con planta huésped en estadio de 2 hojas totalmente desarrolladas (el resto de las hojas laterales y apicales se eliminaron). Una de las plantas se trata con la solución a ensayar (núcleo biovactivo, composición biopesticida) y la otra con agua (control), con un difusor portátil; asegurándose una buena cobertura del producto en ambas caras de la hoja. Ambas plantas (tratadas y control) se colocan en la misma caja entomológica. Posteriormente se coloca un bote con 100 individuos adultos de mosca blanca en un punto equidistante entre las dos plantas, en la base de la caja. En la Figura 8 se puede observar el diseño experimental.
Posteriormente, se procede a tapar la caja y se incubaron en una cámara climatizada con las mismas condiciones descritas anteriormente. Cada ensayo de repelencia consta de 5 cajas (réplicas) para cada una de las variantes analizadas. Al final del ensayo (24 horas) se procede a contar el número de individuos vivos asentados en la planta tratada y control. Además, se cuenta el número de individuos muertos en ambas superficies de la misma forma que en los ensayos de mortalidad. Con estos datos se calcula el Índice de inhibición del asentamiento (%SI) según la siguiente fórmula:
Figure imgf000040_0001
donde,
T: Moscas asentadas en las plantas tratadas
C: Moscas asentadas en las plantas control
Los datos se analizaron mediante la prueba no paramétrica de rangos múltiples de Wilconxon (p<0,05), empleando el paquete estadístico IBM® SPSS Statistics®. Los tratamientos con un porcentaje de inhibición del asentamiento (>60%) se seleccionaron para estudios de dosisrespuesta. La dosis a la que se produce el 50% del efecto deseado (EC50) se calculó mediante un análisis de regresión probit basado en el logaritmo de la dosis (Log-dose probif). En los ejemplos de realización posteriores se explican las composiciones biopesticidas, concentraciones, organismos y detalles más concretos empleados para cada experimento particular.
Bioensayos de inhibición de la oviposición
Este ensayo determina el efecto de las diferentes sustancias sobre la puesta de huevos de adultos de la plaga en plantas huésped (Phaseolus vulgaris) tratadas y control colocadas en la misma caja (ensayos de elección).
El experimento se lleva a cabo en cajas entomológicas de metacrilato y se procede de la misma forma que en los bivensayos de inhibición del asentamiento in planta (Figura 8 ). Al finalizar el experimento se retiran los adultos asentados en los foliolos y se cuentan los huevos en una lupa estereoscópica. Con los datos obtenidos se calcula el Índice de Inhibición de la Oviposición (%lO) de acuerdo con la siguiente fórmula:
Figure imgf000040_0002
donde,
T= número de huevos depositados en el tratamiento y
C= número de huevos depositados en el control.
Los datos se analizaron mediante la prueba no paramétrica de rangos múltiples de Wilconxon (p<0,05), empleando el paquete estadístico IBM® SPSS Statistics®. Los tratamientos con un porcentaje de inhibición del asentamiento (>60%) se seleccionaron para estudios de dosisrespuesta. La dosis a la que se produce el 50% del efecto deseado (ECso) se calculó mediante un análisis de regresión probit basado en el logaritmo de la dosis (Log-dose probit). En los ejemplos de realización posteriores se explican las composiciones biopesticidas, concentraciones, organismos y detalles más concretos empleados para cada experimento particular.
Ejemplo 7. Protocolo general de ensayos de campo
Los protocolos de ensayos de campo (campo abierto) y semicampo (invernadero) para la evaluación de la actividad, sobre el control de la mosca blanca, de las composiciones biopesticidas de la presente memoria se diseñan de acuerdo con las directrices de la OEPP/EPPO (OEPP/EPPO Bulletin, 2012, 42 (3), 367-381).
En los ejemplos de realización posteriores se explica detalladamente el diseño experimental en cada uno de los ensayos particulares.
Ejemplo 8. Actividad biopesticida y efectos sinérgicos del núcleo bioactivo
En la Tabla 24 se muestra la actividad insecticida (mortalidad) y antialimentaria (repelencia e inhibición de la oviposición) del núcleo bioactivo reivindicado y sus componentes frente a mosca blanca. Se presentan los resultados de eficacia de los elementos individuales que componen el núcleo a dos concentraciones:
• La mayor corresponde a la dosis máxima a la cual se ensaya el ingrediente durante el proceso de screening.
• La menor corresponde a una de las dosis (% p/v) a las que puede encontrase el ingrediente en el caldo de aplicación final.
En el caso de núcleo bioactivo, cuando se combinan los elementos en determinadas proporciones [(A)+(B)], se presenta la dosis (% p/v) a la que se encuentra el núcleo en el caldo de aplicación final.
En todas las dianas y para todos los mecanismos de acción estudiados, se observó que la eficacia conseguida con el núcleo bioactivo era mayor de lo esperado y superaba, sorprendentemente, los niveles obtenidos cuando se aplicaban los elementos por separado. Esto confirma la existencia de un efecto sinérgico y/o potenciador de la mezcla (Ejemplo 9). Dicho efecto se manifiesta de la siguiente forma:
• Incremento significativo de la actividad para cada uno de los mecanismos de acción individuales: mortalidad-repelencia-oviposición. •
• Disminución significativa de las dosis efectivas de eficacia de la mezcla comparado con las que se utilizan en los componentes individualmente.
Tabla 24. Ejemplo de la actividad frente a mosca blanca del núcleo bioactivo y de los elementos que lo componen por separado
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%M: porcentaje de mortalidad calculado según el ejemplo 6.4, %SI: Porcentaje de repelencia espacial calculado según el ejemplo 6.4, %10: Porcentaje de inhibición de la oviposición calculado según el ejemplo 6.4, (A): Extracto hidroalcohólico de raíces/rizomas de Zingiber officinale, (B) Aceite esencial de Cinnamomum verum., * p<0.01, prueba no paramétrica de signos de Wilcoxon.
Ejemplo 9. Demostración del efecto sinérgico del núcleo bioactivo
Una de las principales ventajas de esta invención es el efecto sinérgico en el control de moscas pertenecientes al grupo de las moscas blancas (mortalidad, repelencia e inhibición de la oviposición) que se logra al combinar los elementos activos que conforman el núcleo bioactivo. En sentido estricto, la sinergia se define desde el punto de vista matemático como la interacción entre dos o más componentes en una mezcla de tal forma que:
- Se obtiene un efecto mayor que el resultante de la suma de los efectos de los componentes individuales a la misma dosis en la que se encuentran en la mezcla (sinergia de potenciación).
- Se obtiene un efecto igual al resultante de la adición de los efectos de los componentes individuales a la misma dosis en la que se encuentran en la mezcla (sinergia de adición).
Sin embargo, esta definición resulta muy difícil de aplicar en su sentido estricto en los siguientes casos:
- Mezcla de extractos de plantas, debido a los diferentes efectos que se derivan de su compleja composición química, muchas veces no cuantificada.
- Composiciones que tengan diferentes mecanismos de acción. Los efectos sinérgicos deben ser estudiados frente a un mecanismo de acción conocido asumiendo linealidad en la respuesta.
Sin embargo, existen diferentes aplicaciones de combinaciones sinérgicas en el campo de la fitomedicina (Phytomedicine, Vol. 3 (5), pp. 401-409. 2001) y en composiciones pesticidas (Neth. J. Plant Path. 70, 1964, USO05837652A, ES 2 153503 T3). El efecto sinérgico que se logra en la mezcla con respecto a los componentes individuales se manifiesta de dos formas: - Incremento significativo de la actividad para cada uno de los mecanismos de acción individuales: mortalidad-repelencia-oviposición.
- Disminución significativa de las dosis efectivas de eficacia (EC60) de los elementos en la mezcla comparado con las dosis en las que se utilizan individualmente.
Para la demostración de los efectos sinérgicos en el marco de esta patente hemos empleado dos métodos:
(1) El método de las isobolas, uno de los más utilizados ya que es independiente del mecanismo de acción. La metodología se describe en (Phytomedicine, Vol. 8(5), pp. 401-409. 2001).
(2) La metodología propuesta por Limpel (Proc. North. Weed Control Conf., v. 16, p.
48-53, 1962) que emplea la siguiente fórmula:
K, — X Y - X . Y
100
donde,
E = Es el porcentaje esperado de eficacia de la mezcla de los elementos (A) y (B) a dosis determinadas.
X= Es el porcentaje de eficacia del ingrediente (A) a una dosis determinada.
Y = Es el porcentaje de eficacia del ingrediente (B) a una dosis determinada.
Demostración del efecto sinérgico del núcleo bioactivo frente a mosca blanca:
a) Método de las isobolas
En la Tabla 25 se puede observar el efecto de diferentes combinaciones del núcleo bioactivo sobre la mortalidad de Bemisia tabaci en ensayos de aplicación tópica. Las dosis se refieren a la concentración del ingrediente (% p/v) en el caldo final de aplicación. En todos los casos, las diferentes combinaciones de los elementos tuvieron una mayor eficacia que los elementos por separado. A partir de estos resultados se calculó la EC50 para cada una de las combinaciones aplicando las siguientes diluciones: •
• Dosis (A) Dosis (B): equivale al %M expresado en la Tabla 25
• [Dosis (A) Dosis (B)] / 2
• [Dosis (A) Dosis (B)] / 4
• [Dosis (A) Dosis (B)] / 8
• [Dosis (A) Dosis (B)] / 16
Tabla 25. Ejemplo, de la mortalidad por contacto de la mosca blanca frente a diferentes combinaciones de elementos que componen el núcleo bioactivo.
Figure imgf000044_0001
(A): Extracto hidroalcohólico de raíces de Z. officinale; (B): Fuente de cinamaldehido; %M: Porcentaje de mortalidad de adultos calculado según ejemplo 6.4; dosis (%) en el caldo final de aplicación; * p<0.05, prueba no paramétrica de intervalos con signos de Wileoxon.
La Figura 9 muestra el gráfico de isobolas con los valores de EC50 calculados a partir de los valores observados (línea de puntos) y los valores aditivos esperados (línea continua negra) para una serie de combinaciones de los componentes que conforman el núcleo sinérgico (ver valores en Tabla 25).
La linea recta que conecta las EC50 de los componentes individuales contiene todas las posibles combinaciones entre ellos que producirían un efecto aditivo (isobola). Los puntos representan las EC50 experimentales de cada una de las combinaciones. Se puede observar el perfil de interacción (A+B) donde aparece una curva cóncava (característico de sinergia), indicando que con dosis bajas de ambos compuestos (con respecto a las dosis efectivas de los elementos por separado) se obtiene una elevada mortalidad.
(b) Método de Limpel
La metodología propuesta por Limpel (Proc. North. Weed Control Conf., v. 16, p. 48-53, 1962) emplea la fórmula descrita anteriormente (método de Limpel). Si tomamos los valores de la Tabla 24: •
• X= 35.7 % (corresponde al porcentaje de mortalidad del Ingrediente A al 0.06%)
• Y= 2.3% (corresponde al porcentaje de mortalidad del Ingrediente B al 0.024%) Sustituimos en la fórmula:
E (valor esperado) = 35.7 2.2 -(35.7 x 2.2) /100 = 37.12 % de mortalidad
El valor observado según se representa en la Tabla 23 es de 74,3% de mortalidad, significativamente superior al valor esperado, denotando la existencia de una sinergia.
Ejemplo 10. Liberación controlada de la fuente de cinamaldehído
En muchos casos la actividad repelente se debe a la presencia de compuestos volátiles que interactúan con los quimiorreceptores de las moscas. Debido a su naturaleza volátil, estos compuestos tienen una eficacia a muy corto plazo que se pierde al cabo de las horas. Además, su baja solubilidad en agua y su tendencia a la oxidación con la luz hacen compleja su formulación. La formación de complejos con ciclodextrinas (encapsulación) es una de las tecnologías más empleadas para la protección y liberación controlada de este tipo de sustancias.
Varias de las composiciones biopesticidas que se divulgan en esta memoria tienen, al menos un componente encapsulado, garantizando la liberación controlada del ingrediente activo. En esta invención la encapsulación se ha llevado a cabo usando el método de coprecipitación por su eficiencia de encapsulación (>60%) y su facilidad de escalado.
Teniendo en cuenta los resultados obtenidos (Tabla 26) se seleccionó preferentemente la pciclodextrina (W7) como matriz. El proceso se realizó como se detalla en el Ejemplo 4. Se obtuvo un porcentaje de encapsulación del 80%. La eficacia de la encapsulación desde el punto de vista químico se siguió mediante análisis de cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas (GC-MS). En la Figura 10 se muestra el seguimiento cromatográfico (GC-MS) del proceso. El proceso de encapsulación favorece la retención de algunos componentes bioactivos del extracto y su liberación controlada.
En la Tabla 26, se muestra la actividad del aceite esencial de C. verum libre y encapsulado (tomado como ejemplo de fuente de cinamaldehído) sobre el comportamiento (repelencia e inhibición de la oviposición) de la mosca blanca (Bemisia tabaci). La encapsulación con pciclodextrina (W7) según la metodología propuesta en el Ejemplo 4 presentó los mejores resultados en eficacia y liberación controlada.
Tabla 26. Ejemplo de la actividad repelente del aceite esencial de C. verum (0.04%) encapsulado y sin encapsular
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* p<0.05, prueba no paramétrica de intervalos con signos de Wilcoxon; p-Ciclodextrina y Silice coloidal son agentes encapsulantes; Los índices %Sl y %lO se calcularon según la metodología descrita en el ejemplo 6.4
Ejemplo 11. Definición de los mecanismos de acción atribuidos al núcleo bioactivo El objetivo de este ejemplo es demostrar la contribución individual de los elementos a los mecanismos de acción del núcleo bioactivo para lograr el efecto final sobre el control de la mosca blanca.
En la Tabla 27 se muestra la actividad insecticida frente a mosca blanca de diferentes concentraciones de los componentes individuales del núcleo bioactivo (extracto hidroalcohólico de raíces/rizomas de Z. officinale y aceite esencial de hojas de C. verum como fuente de cinamaldehído) y la composición M0 (composición biopesticida formada por el núcleo bioactivo, Tabla 3).
Tabla 27. Mortalidad por contacto y actividad antialimentaria de los elementos del núcleo bioactivo y la composición biopesticida que comprende el núcleo bioactivo frente a Bemisia tabaco
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%M: Mortalidad por contacto calculada según ejemplo 6.4; %sSI: Inhibición del asentamiento calculada según ejemplo 6.4; %lO: Inhibición de la oviposición calculada según el ejemplo 6.4; Medias con la misma letra dentro de la misma columna indican diferencias significativas (ANOVA, p<0.05); ECso: Dosis a la que se produce el 50% del efecto, 95% confianza (limite inferior, superior); * p < 0.05, Wilcoxon paired test, Composición MO según se detalla en Tabla 3.
En las figuras 11, 12 y 13 se muestran las curvas de dosis-respuesta de los elementos del núcleo bioactivo para la mortalidad por contacto, inhibición del asentamiento e inhibición de la oviposición, respectivamente. Como se puede observar el extracto hidroalcohólico de Z. officinale tiene una contribución muy marcada en el efecto de mortalidad por contacto, mientras que el aceite esencial de hojas de C. verum (fuente de cinamaldehído) contribuye más a los efectos antialimentarios (inhibición del asentamiento e inhibición de la oviposición), tal y como se resume en la Tabla 2.
Ejemplo 12. Efecto potenciador y/o cooperativo de la lecitina
En el marco de esta invención se divulga el uso de la lecitina como potenciador de la actividad de la composición biopesticida y en particular del núcleo bioactivo.
Para el estudio de los efectos potenciadores y/o cooperativos se diseñaron diferentes combinaciones entre los elementos que componen el núcleo bioactivo y la lecitina de soja. Para el diseño de las combinaciones se escogieron concentraciones subletales de los diferentes componentes. Se empleó la metodología del Triángulo de Gibbs (Triangle Screen Formulation Approach) como se muestra en la Figura 14.
En este ejemplo se estudian posibles combinaciones sinérgicas entre los componentes A (Extracto hidroalcohólico de raíces de Zingiber officinale), B (aceite esencial de hojas de C. verum) y C (Lecitina de soja) tomando como punto de partida sus concentraciones subletales de mortalidad por contacto frente a mosca blanca según Tabla 26. El triángulo superior muestra las diferentes combinaciones y el inferior las diferentes proporciones de cada combinación.
En la Tabla 28 se muestra, a título ilustrativo y no limitativo, la eficacia frente a mosca blanca de una de las combinaciones del núcleo bioactivo con la lecitina de soja empleada en las composiciones biopesticidas. La combinación "33” corresponde a la combinación A+B+C en una proporción de 3:3:3 (ver triangulo de Gibbs) que corresponde a las siguientes concentraciones en el caldo de aplicación: A:0.02%, B:0.06%, C: 0.07%.
Tabla 28. Concentraciones subletales y efecto cooperativo del núcleo bioactivo y la lecitina de soja
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%M: porcentaje de mortalidad calculado según ejemplo 6.4; %Sl: Porcentaje de repelencia calculado según ejemplo 6.4; %lO: Porcentaje de inhibición de la oviposición calculado según ejemplo 6.4; (A): Extracto hidroalcohólico de raíces/rizomas de Zingiber officinale; (B) Aceite esencial de hojas de C. verum; (C) Lecitina de soja; * p<0.05, prueba no paramétrica de intervalos con signos de Wileoxon.
Ejemplo 13. Validación de las composiciones biopesticidas frente a mosca blanca
En la Tabla 29 se muestra la actividad frente a mosca blanca de todas las composiciones biopesticidas (Tabla 3) y productos de referencia empleados como controles positivos con fines comparativos. Todas las composiciones biopesticidas presentan una alta eficacia en el control de la mosca blanca, estadísticamente significativa cuando se compara con el control. Las composiciones muestran eficacias similares y/o superiores a los productos de referencia (químicos y naturales) que actualmente existen en el mercado para el control de la mosca blanca.
Tabla 29. Mortalidad por contacto y actividad antialimentaria de las composiciones biopesticidas frente a mosca blanca (Bemisia tabaci)
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%M: Mortalidad por contacto calculada según ejemplo 6.4; %SI: Inhibición del asentamiento calculada según ejemplo 6,4; %lO: Inhibición de la oviposición calculada según el ejemplo 6.4; Medias con la misma letra dentro de la misma columna indican diferencias significativas (ANOVA, p<0.05); * p < 0.05, Wilcoxon paired test, Las composiciones biopesticidas se detallan en la Tabla 3.
Ejemplo 14. Efecto repelente (repelencia directa) del núcleo bioactivo frente a mosca blanca
En la Tabla 30 se muestra el efecto de repelencia directa del núcleo bioactivo (composición MO de la Tabla 3). La metodología empleada se detalla en el ejemplo 6.4. Como se puede observar el núcleo bioactivo muestra un potente efecto repelente frente a adultos de mosca blanca.
Tabla 30. Actividad repelente de la composición MO (núcleo bioactivo, Tabla 3) a 6 cc/litro de agua frente a Bemisia tabací en ensayo de olfatómetro
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1Número de adultos liberados=100; El ensayo se considera válido cuando el número de moscas asentadas (cámara control cámara tratada) supera o iguala los 50; * p < 0.05, Wilcoxon paired test; Calculado según el ejemplo 6.4
Ejemplo 15. Efecto de la composición WF_F4 sobre la dinámica poblacional de mosca blanca en ensayo de invernadero
15.1. Antecedentes
El estudio se llevó a cabo con el objetivo de evaluar la eficacia en invernadero de la composición WF_F4 (7.5% de extracto hidroalcohólico de raíces de Z. officinale y 16% de aceite esencial de hojas de C. verum) frente a mosca blanca en berenjena (Solanum melongena). Como variables de eficacia se emplearon el efecto sobre la reducción del número de adultos y el número de huevos. El diseño experimental empleado fue bloques al azar con 7 tratamientos y 3 réplicas por tratamiento.
El ensayo se llevó a cabo en Roquetas de Mar (Almería, España) durante 2019. Almería tiene la más alta concentración de invernaderos a nivel mundial y es uno de los principales proveedores de hortícolas en Europa. El cultivo de berenjena representa alrededor del 5% del área de invernadero en Almería. Las moscas blancas (Bemicia tabaci y Trialeurodes vaporariorum) se consideran las plagas principales que atacan este cultivo.
Por todo lo antes expuesto, el área seleccionada para el ensayo se considera representativa para llevar a cabo un ensayo de eficacia de este tipo.
15.2. Objetivos
• Evaluar la eficacia de la composición WF_F4 en la reducción de adultos de mosca blanca (B. tabaci) en berenjena.
• Evaluar la eficacia de la composición WF_F4 en la reducción de huevos de mosca blanca (B. tabaci) en berenjena.
• Comparar la eficacia de la composición WF_F4 con productos de referencia químicos y de origen natural.
• e Evaluar la fitotoxicidad de la composición WF_F4 sobre el cultivo principal y su efecto sobre insectos beneficiosos (non-targef).
15.3. Productos de referencia
Como controles positivos se emplearon tres productos comerciales de referencia empleados para el control de la mosca blanca (Tabla 31). Requiem® es una formulación natural registrada en Estados Unidos y otros países.
Tabla 31. Productos de referencia empleados como controles positivos
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15.4. Tratamientos
Los tratamientos y dosis empleados se detallan en la Tabla 32
Tabla 32. Tratamientos y dosis empleados
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15.5. Información general del ensayo
Sobre el cultivo
• Especie: Solanum melongena (Berenjena)
• Distancia entre plantas (m): 0.75
• Distancia entre filas (m): 3
• Densidad de plantación: 10000 plantas/ha
• Sistema de riego: Goteo
Sobre la parcela
• País: España
• Localidad: Roquetas de Mar (Almería)
• Código postal: 04740
• Coordenadas (N/M): 36,442272 / 2,515594
• Ancho de la parcela (m): 3
• Longitud de la parcela (m): 4
• Tamaño de la parcela experimental: 12 m2
• Réplicas: 3
• Tratamientos: 7
• Número de parcelas:
• Área de ensayo: 300
15.6. Diseño experimental
Se empleó un diseño experimental de bloques al azar. En la Figura 15 se muestra una representación gráfica del diseño y la distribución espacial de las parcelas experimentales. 15.7, Esquema de aplicación
En la Tabla 33 se detallan las características de la aplicación. Se realizó una sola aplicación.
Tabla 33. Características del equipo y esquema de aplicación
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15.8. Variables de eficacia y toma de datos
En la Tabla 34 se muestran las variables de eficacia y momentos de muestreo.
Tabla 34. Variables de eficacia y momentos de la toma de datos
Figure imgf000051_0002
Las fechas de toma de dato fueron las siguientes:
1. DAA-O: 06/08/19 (Momento de la aplicación)
2. DAA-1: 07/08/19 (Un día después de la aplicación)
3. DAA-3: 09/08/19 (Tres días después de la aplicación)
4. DAB-6: 12/08/19 (Seis días después de la aplicación)
En cada muestreo se seleccionaron 4 plantas al azar y se muestrearon 3 hojas de cada planta. El número de adultos se determinó contando las moscas vivas sobre ambas superficies (haz y envés) de la hoja seleccionada. En el caso de los huevos, de cada hoja muestreada, se tomaron discos de 2 cm2 y se contaron los huevos con ayuda de una lupa estereoscópica. 15.9. Efectos sobre el cultivo
Además de las variables de eficacia se tomaron los siguientes datos:
• Porcentaje de área dañada por fitotoxicidad (si existe).
• Efecto visual (diagnóstico de oficio) sobre insectos beneficiosos (non-target).
15.10. Procesamiento de los datos y análisis estadístico
Los datos (número de adultos y número de huevos por hoja) se expresaron como medias de 12 mediciones independientes en cada tratamiento y réplica. Los datos observados (medias) se expresaron con respecto al control empleando la fórmula de Henderson-Tilton que se expone a continuación:
Figure imgf000052_0001
donde,
Ta= Número de adultos/huevos en el tratamiento después de la aplicación
Tb= Número de adultos/huevos en el tratamiento antes de la aplicación
Ca= Número de adultos/nuevos en el control después de la aplicación
Cb= Número de adultos/huevos en el control antes de la aplicación.
Los valores corregidos de eficacia se compararon mediante Análisis de Varianza (ANOVA) simple (p<0.05). Para la comparación de medias se empleó la prueba post hoc de las mínimas diferencias significativas (LSD). En el análisis se empleó el paquete estadistico IBM® SPSS Statistics®.
15.11. Resultados y discusión
En las Tablas 35 y 36 se muestra la eficacia corregida de la composición WF_F4 y productos de referencia sobre el número de adultos y huevos de mosca blanca, respectivamente.
Tabla 35. Eficacia de la composición WF_F4 y productos de referencia sobre el número de adultos de mosca blanca
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1Los datos están expresados como medias y corregidos mediante la fórmula de Henderson-Tilton. Medias con letras diferentes dentro de la misma columna denotan diferencias estadísticamente significativas (ANOVA-LSD, p<0.05)
Tabla 36. Eficacia de la composición WF_F4 y productos de referencia sobre el número de huevos de mosca blanca
Figure imgf000053_0002
1Los datos están expresados como medias y corregidos mediante la fórmula de Henderson-Tilton. Medias con letras diferentes dentro de la misma columna denotan diferencias estadísticamente significativas (ANOVA-LSD, p<0.05)
Los datos obtenidos muestran una clara eficacia del producto en el control de la mosca blanca. La composición WF_F4 muestra niveles muy significativos de reducción del número de adultos y huevos de mosca blanca hasta 6 días después de la aplicación. Los resultados obtenidos con la composición WF_F4 fueron claramente superiores a las eficacias de los productos de referencia tanto químicos como naturales.
No se detectaron síntomas de fitotoxicidad sobre el cultivo tratado con la composición WF_F4 ni con los productos de referencia a ninguna de las dosis ensayadas. Además, no se observaron efectos sobre la fauna beneficiosa a lo largo de todo el experimento.

Claims (31)

REIVINDICACIONES
1. Una composición biopesticida que comprende un núcleo bioactivo sinérgico, formado por:
- aceite esencial, oleorresina, extracto acuoso, alcohólico o hidroalcohólico de raíz o rizomas de Zingiber officinale Roscoe y
- cinamaldehído o fuente de cinamaldehido.
2. Una composición biopesticida según la reivindicación anterior, en la que la concentración, % peso/peso, de cada componente en el núcleo bioactivo se encuentra en los siguientes intervalos:
- acelte esencial, oleorresina, extracto acuoso, alcohólico o hidroalcohólico de raíz o rizomas de Zingiber officinale Roscoe: 0,1-99,9%, preferentemente 10-90%, más preferentemente 20-80%, aún más preferentemente 30-70% y más preferentemente 40-60% y
- cinamaldehído o una fuente de cinamaldehído: 0,1-99,9%, preferentemente 10-90%, más preferentemente 20-80%, aún más preferentemente 30-70% y más preferentemente 40-60%.
3. Una composición biopesticida según la reivindicación anterior, en la que la fuente de cinamaldehído son extractos/aceites esenciales de especies vegetales que lo contengan, preferentemente del género Cinnamomum sp. más preferentemente: C. verum. -sinonimia., Cinnamomum zeylanicum-, C. cassia, C. loureirit, C. burmannii, C. tamala, C. osmophloeum, C. bejolghota, C. dubium, C. rivulorum, C. citriodorum y C. camphora.
4. Una composición biopesticida según la reivindicación anterior, en la que el cinamaldehido y/o la fuente de cinamaldehído está presente en forma libre y/o encapsulada en un agente encapsulante.
5. Una composición biopesticida según la reivindicación anterior, en la que el agente encapsulante se selecciona entre: maltodextrinas, ciclodextrinas, lecitinas, aceites vegetales y/o excipientes de sílice, estos últimos comprenden gel de sílice (silica gel), sílice coloidal y dióxidos de silicio, preferentemente ciclodextrinas.
6. Una composición biopesticida según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la composición biopesticida comprende un segundo componente que es uno o más elementos activos seleccionados entre:
- extractos botánicos o fracciones de los mismos,
- extracto obtenido partir de fermentados de microorganismos o fracciones de los mismos,
- compuestos puros seleccionados entre geranial -citral A-, neral -citral B-, saponinas, alcohol bencílico, benzoato de bencilo, acetato de bencilo, eugenol, 1,8-cineol, timol, geraniol, acetato de geranilo y ácidos grasos, seleccionados entre: saturados de cadena corta y larga, preferentemente los de cadena larga, e insaturados y derivados de ácidos grasos, por ejemplo, metilados, ésteres metílicos de ácidos grasos, FAME, más preferentemente ácidos grasos saturados de cadena larga y/o ácidos grasos insaturados y
- lecitina, preferentemente de huevo, girasol, colza, maíz, algodón, cacahuete o soja.
7. Una composición biopesticida según la reivindicación anterior, en la que el extracto botánico se selecciona entre:
- extractos acuosos, alcohólicos e hidroalcohólicos y/o
- aceites esenciales.
8. Una composición biopesticida según la reivindicación anterior, en la que el extracto botánico se selecciona entre residuos agroindustriales, bulbos, semillas, hojas, folículos, flores y/o parte aérea completa a partir de plantas pertenecientes a los siguientes géneros: Allium sp., Angélica sp., Annona sp., Artemisia sp., Carum sp., Cassía sp., Chenopodium sp., Citrus sp., Coffea sp., Crocus sp., Curcuma sp., Cyamopsis sp., Cymbopogon sp., Cyfisus sp., Eucalyptus sp., Eurycoma sp., Ficus sp., Foeniculum sp., Fumaria sp., Geranium sp., Ginkgo sp., Helianthus sp., Hyssopus sp., Jatropha sp., Lavandula sp., Mentha sp., Moringa Sp., Nigella sp., Ocimum sp., Olea sp., Papaver sp., Pelargononium sp., Persea sp., Petroselinum sp., Pimpinella sp., Prunus sp., Quassía sp., Retama sp., Rheum sp., Rosmarinus sp., Salvia sp., Satureja sp., Schoenocaulon sp., Syzygium sp., Trigonella sp., Thymus sp. y Vitis Sp., preferentemente las especies: Allium sativum, Angelica archangelica, Annona cherimola, Artemisia absinthium, Carum carvií, Cassia angustifolia, Cassia senna, Chenopodium ambrosioides, Citrus aurantium, Citrus limon, Citrus sinensis, Coffea arabica, Crocus corsicus, Crocus sativus, Crocus speciosus, Crocus vernus, Curcuma aromatica, Curcuma longa, Cymbopogon citratus, Cyamopsis tetragonoloba, Cymbopogon flexuosus, Cymbopogon martini, Cymbopogon nardus, Cytisus scoparius, Eucalyptus camaldulensis, Eucalyptus globulus, Eurycoma longifolia, Ficus carica, Fumaria officinalis, Foeniculum vulgare, Geranium macrorrhizum, Ginkgo biloba, Helianthus annuus, Helianthus tuberosum, Hyssopus officinalis, Jatropha curcas, Lavandula angustifolia, Lavanda x intermedia, Lavandula luisieri, Mentha piperita, Mentha spicata, Moringa oleifera, Nigella sativa, Ocimum basilicum, Olea europaea, Papaver rhoeas, Papaver somniferum, Pelargonium citriodorum, Pelargonium graveolens, Persea americana, Persea indica, Petroselinum sativum (sin. P. crispum), Pinpinella anisum, Prunus persica, Quassia amara, Retama monosperma, Retama sphaerocarpa, Rheum rhabarbarum, Rheum officinale, Rosmarinus officinalis, Salvia lavandulifolia, Salvia officinalis, Satureja montana, Schoenocaulon officinale, Syzygium aromaticum, Trigonella foenumgraecum, Thymus vulgaris, Thymus zygis y Vitis vinífera.
9. Una composición biopesticida según la reivindicación 6, en la que los extractos se seleccionan fermentos obtenidos a partir de la fermentación de un sustrato con Bacillus sp., Pseudomonas sp., Trichoderma sp. Corynebacterium sp. y Aspergillus sp, preferentemente: Aspergillus niger, Trichoderma harzianum, Bacillus thuringiensis, Pseudomonas fluorescens, Bacillus amyloliquefaciens, Corynebacterium efficiens y Bacillus subtilis.
10. Una composición biopesticida según la reivindicación anterior, en la que el sustrato de fermentación se selecciona entre residuos agroindustriales, bulbos, semillas, hojas, folículos, flores y/o parte aérea completa a partir de plantas pertenecientes a los siguientes géneros: Zingiber sp., Citrus sp., Cyamopsis sp., Crocus sp., Helianthus sp., Petroselinum sp., Papaver sp., Rheum sp., Salvia sp., Retama sp., Lavandula sp., Prunus sp., Persea sp., Curcuma sp. y Thymus sp, preferentemente: Agaricus bisporus, Cyamopsis tetragonoloba, Helianthus annus, Citrus x sinensis y Glycine max.
11. Una composición biopesticida según la reivindicación 6, en la que los compuestos puros se obtienen a partir de alguna(s) de las siguientes fuentes:
- para los isómeros del citral, geranial y neral, las especies incluidas en los géneros Cymbopogon sp. y Litsea sp., Aloysia sp., Ocimun sp., Melissa sp. y Citrus sp. Para eugenol las especies incluidas en el género Cinnamomum sp., Syzygium sp., Curcuma sp., Zingiber sp. y Ocimum sp.,
- para saponinas las especies incluidas en los géneros Cyamopsis sp., Quillaja sp., Trigonella sp., Saponaria sp., Crocus sp., Yucca sp., Beta sp., Hedera sp., Polygala sp. y Primula sp., para alcohol bencílico las incluidas en los géneros Cinnamomum sp. y Jasminum Sp.,
- para 1,8 cineol (Eucalipto) las especies incluidas en los géneros Eucalyptus sp., Salvia sp., Thymus sp., Curcuma sp., Rosmarinus sp., Artemisia sp., para geraniol las incluidas en los géneros Rosa sp., Cymbopogon sp., Geranium sp., y Pelargonium sp.,
- para ácidos grasos son las especies incluidas en los géneros Persea sp., Glycine Sp., Helianthus sp., Olea sp. y otras oleaginosas,
- síntesis total, semi-síntesis o síntesis biomimética del compuesto puro y/o análogos mediante estudios de relación estructura actividad (SAR) y
- producido por cualquier organismo seleccionado entre hongos filamentosos como Aspergillus sp., bacterias e insectos en procesos de biotransformación y/o bioconversión.
12. Una composición biopesticida según la reivindicación 6, en la que la lecitina se selecciona entre:
- lecitina de soja sólida,
- lecitina de soja líquida o fluida y
- lecitina de soja hidrolizada o parcialmente hidrolizada.
13. Una composición biopesticida según una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 12, en la que el segundo componente se emplea de forma libre o encapsulada.
14. Una composición biopesticida según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el segundo componente en la composición biopesticida se combina con el núcleo bioactivo, en el siguiente intervalo de concentraciones peso/volumen total de la composición: 1-30%, preferentemente 5-25% y aún más preferentemente 10-20%.
15. Una composición biopesticida según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la composición biopesticida comprende al menos una sustancia inerte que se selecciona entre adyuvantes, emulsionantes, dispersantes, aromatizantes, conservantes, antiespumantes, agentes tixotrópicos, matrices de encapsulación, ácidos grasos, fosfolípidos y mezclas de ellos.
16. Una composición biopesticida según la reivindicación anterior, en la que los adyuvantes son compuestos organosiliconados del grupo de los organosiloxanos.
17. Una composición biopesticida según la reivindicación 15, en la que los agentes tixotrópicos se seleccionan entre carboximetilcelulosa, carboximetilcelulosa sódica, celulosa microcristalina y otros derivados de la celulosa preferentemente goma y gel.
18. Una composición biopesticida según la reivindicación 15, en la que las matrices de encapsulación se seleccionan entre maltodextrinas, ciclodextrinas, lecitinas, aceites vegetales y/o excipientes de sílice, estos últimos comprenden gel de sílice (silica gel), sílice coloidal y dióxidos de silicio, preferentemente se emplean ciclodextrinas.
19. Una composición biopesticida según la primera reivindicación, seleccionada entre las composiciones biopesticidas que comprenden:
- Zingiber officinale y Cinnamomum verum,
- Zingiber officinale, Cinnamomum verum y lecitina de soja,
- Zingiber officinale, E-cinamaldehíido y Persea americana,
- Zingiber officinale, Cinnamomum verum y derivado siliconado tipo organosiloxano, - Zingiber officinale, Cinnamomum verum, extracto hidroalcohólico de Satureja montana y lecitina de soja,
- Zingiber officinale, Cinnamomum verum, lecitina de soja, derivado siliconado tipo organosiloxano, f-ciclodextrina y adyuvante polimérico,
- Zingiber officinale, Cinnamomum cassía, Persea americana, Cymbopogon citratus, - lecitina de soja, Tween-80, derivado siliconado tipo organosiloxano,
- carboximentilcelulosa, B-ciclodextrina y adyuvante polimérico,
- Zingiber officinale, Cinnamomum verum, Persea americana, Aspergillus sp, lecitina de soja, derivado siliconado tipo organosiloxano y adyuvante polimérico,
- Zingiber officinale, Cinnamomum cassia, Mentha piperita, lecitina de soja, derivado siliconado tipo organosiloxano y adyuvante polimérico,
- Zingiber officinale, Cinnamomum cassia, Cassia angustifolia, lecitina de soja, derivado siliconado tipo organosiloxano y adyuvante polimérico,
- Zingiber officinale, Cinnamomum cassia, Trigonella foenum-graecum, acetato de bencilo, lecitina de soja, derivado siliconado tipo organosiloxano y adyuvante polimérico, - Zingiber officinale, Cinnamomum verum, citral, benzoato de bencilo, lecitina de soja, - derivado siliconado tipo organosiloxano y adyuvante polimérico,
- Zingiber officinale, Cinnamomum verum, acetato de bencilo, geraniol, lecitina de soja, - derivado siliconado tipo organosiloxano y adyuvante polimérico,
- Zingiber officinale, Cinnamomum verum, Papaver somniferum, lecitina de soja,
- derivado siliconado tipo organosiloxano y adyuvante polimérico,
- Zingiber officinale, Cinnamomum verum, aceite esencial de Satureja montana, extracto de Satureja montana, lecitina de soja, derivado siliconado tipo organosiloxano y adyuvante polimérico, y
- Zingiber officinale, E-cinamaldehído, acetato de geranilo, lecitina de soja, derivado siliconado tipo organosiloxano y adyuvante polimérico.
20. Un caldo de aplicación final que contiene la composición definida en una cualquiera de las reivindicaciones 1-19, en el que la concentración de cada componente del núcleo bioactivo se encuentra en el intervalo de concentraciones peso/volumen:
- aceite esencial, oleorresina, extracto acuoso, alcohólico o hidroalcohólico de raíz o rizomas de Zingiber officinale Roscoe: 0,01-0,99%, preferentemente 0,05-0,95%, preferentemente 0,1-0,9%, más preferentemente 0,2-0,8%, aún más preferentemente 0,3-0,7% y más preferentemente 0,4-0,6% y
- Cinamaldehído o una fuente de cinamaldehído: 0,01-0,99%, preferentemente 0,05-0,25%, preferentemente 0,1-0,9%, más preferentemente 0,2-0,8%, aún más preferentemente 0,3-0,7% y más preferentemente 0,4-0,8%.
21. Procedimiento para la obtención de la composición biopesticida definido en la reivindicación 1 que comprende la mezcla en medio acuoso de los componentes del núcleo bioactivo:
- aceite esencial, oleorresina, extracto acuoso alcohólico o hidroalcohólico de raíz o rizomas de Zingiber officinale Roscoe y
- cinamaldehido o fuente de cinamaldehído.
22. Procedimiento según la reivindicación anterior, en el que se añade al menos un componente secundario y/o al menos una sustancia inerte.
23. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 21-22, en el que la mezcla de los componentes del núcleo bioactivo se realiza a una velocidad comprendida en el intervalo entre 500 y 4000 rpm, preferentemente entre 1500 y 3000 rpm y en medio acuoso.
24. Procedimiento según la reivindicación anterior, en el que la temperatura de la mezcla se encuentra entre los 20 y 40°C, preferentemente entre 24 y 35°C y durante un periodo comprendido entre 60 y 120 minutos, preferentemente 40 y 100 minutos.
25. Uso de una composición biopesticida definida en una cualquiera de las reivindicaciones 1-20, para el control de plagas de moscas.
26. Uso de una composición biopesticida según la reivindicación anterior para el control de la mosca blanca, preferentemente las pertenecientes a los géneros Bemisia sp. "complex” (biotipos), Dialeurodes sp., Trialeurodes sp. Encarsia sp., Aleurolobus sp., Aleurothrixus Sp., Aleurodicus sp., Aleyrodes sp., Parabemisia sp., Paraleyrodes sp., Orchamoplatus sp., Siphoninus sp. y Tetraleurodes sp.
27. Uso de una composición biopesticida según una cualquiera de las reivindicaciones 25-26, en la que la composición biopesticida se usa:
- de manera preventiva y/o
- curativa.
28. Uso de una composición biopesticida según una cualquiera de las reivindicaciones 25-27, en la que la composición biopesticida se aplica individualmente o en combinación con otros productos fitosanitarios o sistemas de control de plagas y enfermedades.
29. Uso de una composición biopesticida según la reivindicación anterior, en la que por otros productos fitosanitarios o sistemas de control de plagas se entiende cualquier tipo de insecticidas, nematicidas, acaricidas, fungicidas, bactericidas, herbicidas, reguladores del crecimiento de la planta, elicitores, fertilizantes, acondicionadores del suelo, y cebos entre otros.
30. Uso de una composición biopesticida según una cualquiera de las reivindicaciones 25-29, en la que la aplicación es mediante aspersión foliar.
31. Uso de una composición biopesticida según una cualquiera de las reivindicaciones 25-30, en la que la aplicación es en cultivos agrícolas de uso alimentario y no alimentario, ya sea agricultura convencional, orgánica o ecológica, preferentemente en cultivos hortícolas, extensivos, ornamentales y jardinería, así como parques e instalaciones deportivas.
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