KR20220143042A - 식물 추출물을 포함하는 생물농약 조성물 및 이의 식물위생 용도 - Google Patents

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에프렌 레메살 곤잘레스
루이스 페르난도 줄리오 토레스
오마르 산타나 메리다스
마리아 마틴 베제라노
살바도르 기메네즈 가르시아
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Abstract

생물농약 조성물은 징지베르 오피시날레 로스코의 뿌리 또는 근경의 에센셜 오일, 올레오레진, 수성, 알코올성 또는 하이드로알코올성 추출물 및 신남알데하이드 또는 신남알데하이드의 원천으로 이루어진 상승작용적 생물활성 코어를 포함한다. 상기 조성물은 적어도 하나의 제2 구성성분 및/또는 불활성 물질을 함유할 수 있다. 본 발명은 또한 이를 수득하기 위한 방법뿐만 아니라 가루이 군에 속하는 해충에 대한 농업, 공원 및 스포츠 시설에서 이의 용도에 관한 것이다.

Description

식물 추출물을 포함하는 생물농약 조성물 및 이의 식물위생 용도
본 발명은 농업 및 식물 생명공학 분야, 보다 구체적으로 식물 소재로부터 유래된 생물농약 분야, 특히 해충 및 질병을 방제하는 추출물 및 지방산과 같은 천연 물질을 포함하는 생화학적 생물농약 분야에 속한다.
주로 수확 전후 보호를 위해, 농업 부문에서 화학 식물 보호제의 대량 사용은 먹이 사슬에서 독성 잔류물의 주요 원천 중 하나를 구성한다. 세계 인구의 증가는 식량에 대한 수요에 관하여 농업 생산의 증가와 직접적으로 연결되어 있다. 현재, 식물위생 제품과 합성 비료의 사용은 작물의 보호와 이의 올바른 영양 및 발달 과정에 이용할 수 있는 주요 도구를 구성한다. 그러나, 이러한 화학 제품의 과도한 사용은 해충의 내성 발달, 환경 오염, 다른 유기체에서의 독성 및 인간 건강에 대한 위험으로 이어졌다. 화학 다국적 기업(재래식 농업)은 개별 분자의 화학적 합성을 기반으로 하고 작용의 단일 특정 메커니즘을 가지며 지속성이 높은 제품을 살포함으로써 해충, 질병 또는 영양 문제에 대처한다. 이는 교차 내성(해충 및 질병)의 빠른 발생 또는 제품의 효능(비료) 상실뿐만 아니라 환경 및 인간 건강에 대한 부정적인 영향을 야기한다.
화학 살충제의 집중적인 사용으로부터 발생하는 심각한 문제는 이러한 종류의 화합물 사용에 대한 더 엄격한 법률로 이어졌다(예를 들어, 2009/128/EC 지침). 따라서, 시장 및 소비자 요구와 관련된 현행법에 의해 점점 더 제한적으로 시행되는 식품 안전성의 법적 요건으로 인해, 작물 보호를 다루는 새로운 바이오 제품을 개발해야 할 필요성이 증가하고 있다.
이와 관련하여, 천연 작물 보호 제품(생물농약)의 개발은 광범위하고 복잡한 화학 조성과 관련된 높은 다기능성을 갖는 실제 대안을 제공하여, 해충 및 질병의 교차 내성의 발생; 합성 제품의 계속되는 사용과 관련이 있는, 기술적으로 입증된 주요 문제를 지연시키거나 방지한다.
지금까지 개발되고 상업화된 대다수의 생물농약은 재생가능한 원천 유래의 원료의 이용가능성의 부족과 관련된 상당한 한계를 가지며, 동시에 이는 건강하고 유효한 활성 성분이 풍부하고, 저렴하고, 균질하고, 추적가능하고, 충만해야 한다.
미생물(진균, 박테리아, 효모)의 2차 대사생성물, 식물 기원의 추출물(식물, 조류, 농산업 부생성물) 및 이들로부터 유도된 화합물은 확실히 가장 많이 연구되고 생물농약 개발을 위한 원료의 풍부한 원천이다.
식물은 식물과 해충 사이의 수백만 년의 공동-진화의 결과로서 그리고 2차 대사로부터 주로 유도된 생물농약 활성을 갖는 화학 물질의 천연 공장이다. 이러한 물질은 큰 다기능성을 초래하는 다양한 화학적 부류에 속하는 것을 특징으로 한다. 이들은 테르펜, 스테롤, 알칼로이드, 폴리페놀(플라본, 이소플라본, 쿠마린, 리그난, 이리도이드, 페닐프로파노이드), 글루코시놀레이트, 이소티오시아네이트, 지방산, 에스테르 및 에센셜 오일을 포함한다.
CO2(초임계 추출)를 포함하는 낮은 극성을 이용한 상이한 증류 및/또는 용매 추출 공정을 통해 주로 방향족, 약용 및/또는 조미료 식물로부터 수득되는 에센셜 오일(AE)은 특별히 언급할 만하다. AE는 주로 꿀풀과(Lamiaceae) 계통에 속하는 수많은 식물종 중 가장 휘발성인 일부를 대표하며, 모노테르펜, 세스퀴테르펜 및 방향족의 복잡한 혼합물을 포함한다. 의심할 여지 없이, 이러한 화합물은 생물농약의 개발에 가장 널리 사용되는 천연 구성성분이다. 해충 및 질병 방제를 위한 생물농약 "잠재력"으로서 AE의 살포에 관한 논문은 식물-유래 식물 보호 화합물에 대한 전체 과학 간행물 중 70%를 넘게 점유한다. 그러나, 이러한 간행물 중 95%는 실험실의 검정일 뿐이며, 규모가 확대된 실제 공정에 관한 것은 매우 소수이다(Green Pesticides Handbook. Essential Oils for Pest Control. ISBN: 13-978-1-4987-5938-0,2017).
본 발명은 최신 기술에 존재하는 한계를 극복한다. 이는, 주로 가루이(노린재류: 가루이과(Aleyrodidae))의 집합체(complex)로서 파리 해충의 식물 처리에 사용될 수 있는 새로운 생물농약 조성물의 개발로 구성된다. 동시에, 본 발명의 생물농약 조성물은 통상적인 농업 및 유기 시스템에서 현재 사용되는 화학적 합성 제품 및/또는 천연 제품의 효능과 관련하여, 쉽게 얻을 수 있고, 확장 가능하며, 효과적이다. 이들은 또한, 교차 내성의 발달을 약화시키고, 식물약해(phytotoxicity)를 나타내지 않으며, 환경 친화적이라는 이점을 제공한다.
통상적인 살충제는 화학적 합성에 의해 수득된 1개 또는 2개의 활성 분자를 함유하고, 일반적으로 동일하거나 밀접하게 관련된 화학 군에 속한다. 이러한 분자는 공통 수용체 상의 표적 부위에 매우 구체적으로 영향을 미치며, 교차 내성 발생과 그 결과인 효능 상실의 주요 원인이다(IRAC, 2019; https://bit.ly/33t9FF8). 마찬가지로, 시장의 대부분의 천연 용액은 주로 활성 분자를 3-5개 사이로 함유하는 것들이 지배적인 식물 추출물로부터 유래되었고, 그 결과 내성 발달의 위험이 있다.
생물농약의 경우, 화학적 조성의 복잡성(상이한 화학 군에 속하는 여러 분자)은 상이한 작용 메커니즘을 통해 이들의 작용을 발현시켜, 내성의 발생을 최소화하고 장기간 효과를 증가시킬 수 있다.
본 발명에 청구된 조성물은 복잡한 화학적 조성을 나타낸다. 이들은 공통적으로 매우 다양한 화학 부류에 속하는 활성 분자로 구성된 상승작용적 생물활성 코어(bioactive core)를 갖는다. 이러한 복잡성은 전반적인 작용 방식 및 효능 측면에서 공식화된 다기능성과 직접적으로 관련된다. 화학적으로 상이한 분자는 상이한 작용 부위에서 작용하는 동일한 작용 방식(예를 들어, 방충성(repellency))에 영향을 미칠 수 있다. 이러한 경우, 교차 내성이 발생할 위험은 극도로 낮다.
살충제 저항 행동 위원회(Insecticide Resistance Action Committee, IRAC, https://bit.Iy/33t9 FF8)는 "교차 내성 발생의 효과적이면서 지속가능한 관리를 위해 작용 메커니즘(MoA)이 상이한 화합물의 대체, 순서 또는 로테이션"을 권장한다. 화학 살충제 및 매우 단순한 화학 조성의 이의 생물농약(주로 특정 분자)의 경우, 상이한 작용 메커니즘을 갖는 상이한 제품들(상이한 합성 화학물질 및/또는 합성 제품과 생물농약)을 대체하는 것을 수반할 것이다. 본 발명의 조성물의 경우, 작용 메커니즘의 대체가 화학식을 구성하는 매우 다양한 상이한 분자에 의해 보장될 것이기 때문에 이는 필요하지 않을 것이다. 선행 기술과 생물농약 시장에는 본원에 개시된 바와 같은 생물농약 조성물이 없으며, 여기서 상업적 규모의 최종 제형은 다음을 가능하게 하는 상승작용적, 협력적 및/또는 효력증가적 효과를 나타낸다:
- 활성 성분의 약량을 감소시켜, 사용될 제형의 로딩을 감소시키는 것.
- 물리적 효과(접촉 및 플립핑(flipping)으로 인한 사충률) 및 가루이의 섭식 및 생리적 행동을 통제하는 화학수용체에 대한 효과(항섭식, 방충제 및 산란 억제제)를 조합하는 하나 초과의 작용 메커니즘에 의해 작용하는 것.
- 활성 성분의 통제 방출(Controlled release).
- 가루이 군 해충의 본질 및 다기능성으로 인해 이들에 대한 교차 내성의 출현을 제거하거나 최소화하는 것.
- 현행법에 따라 제품을 "제로 잔류물"로 표지하는 것으로. 제형은 보통 자연에 존재하고, 빠른 분해 속도를 나타내는 식물의 2차 대사생성물을 함유한다.
- 보장 기간 삭제.
- 무해한 제품임을 표지하는 것. 사람과 유익한 유기체("비-표적")는 공개된 제형을 구성하는 2차 대사생성물에 자연적으로 노출된 적이 있다.
천연 살충제의 유형에 속하는 상업 제형의 관련 예는 다음과 같다:
ㆍ 레퀴엠(requiem)®(바이엘(Bayer)): 대략 25%의 체노포디움 엄브로시오이데스(Chenopodium ambrosioides) 추출물 구성성분, 구체적으로 α-터피넨, p-시멘 및 리모넨의 블렌드를 함유한다.
ㆍ 프리-VAM®(골드 아그리 에스에이 리미티드(Gold Agri SA. Ltd.)): 6-10%사이의 오렌지 오일과 90% 이상의 리모넨을 함유한다.
ㆍ 파이레크리스(Pyrecris)®(세이파사(SEIPASA)): 2%의 천연 피레트린을 함유한다.
ㆍ 아그로님(Agroneem)TM(아제이 바이오 테크 인디아 리미티드 바디 인코포레이트(Ajay Bio Tech India Limited Body Incorporate)): 님 오일(neem oil)(아자디라크틴 인디카(Azadirachta indica))의 주요 구성성분인 아자디라크틴을 함유한다.
이러한 제형들은 상이한 가루이 해충을 방제함에 있어서 효과적인 것으로 밝혀졌다. 그러나, 본원에 개시된 조성물은 상기 제형들에 비해 하기에 대해서는 명확한 이점을 나타낸다:
ㆍ 화학적 정체성(Chemical Identity).
ㆍ 작용 메커니즘(MOA)의 종류 및 대체.
ㆍ 교차 내성 관리(CRM).
ㆍ 효능.
개시된 조성물 대 유사한 성질의 제형의 장점의 비교가 표 1에 나타나 있다.
Figure pct00001
참조문헌:
1 US 2013/0331462 A1
2 Green Pesticides Handbook. Essential oil for pest control. Chapter 2. Commercialization of insects based on essential oil. Nollet & Singh, Eds. CRC Press, ISBN 978-1-4987-5938-0.
3 Green Pesticides Handbook Essential oil for pest control. Chapter 15. Orange oil. Nollet & Singh, Eds. CRC Press, ISBN: 13-978-1-4987-5938-0.
4 ES2444991 A1.
5 Journal of Agricultural Science and Technology A 6(2016) 77-91.
그러나, 합성 제품에 대한 성공과 시장에서의 유행을 결정하는 생물농약들 사이에는 차이점과 차별점이 있다. 프리-VAM®(골드 아그리 에스에이 리미티드)은 오렌지 오일로 구성된 천연 제형으로 미국, 캐나다, 유럽 및 다른 국가에서 식물 보호 용도로 승인되었다. 이의 효능에도 불구하고, 본 발명에 청구된 조성물에 비해 몇 가지 단점이 있다. 제안된 작용 메커니즘을 갖는 단일 성분 조성물(95% 초과의 d-리모넨)에서 대부분의 존재는 내성이 발생할 위험을 증가시킨다. 또한, 오렌지 오일의 높은 휘발성 및 불안정성은 노지 조건에서 이를 살포하기 어렵게 한다(Green Pesticides Handbook. Essential oil for pest control. Chapter 15. Orange oil. Nollet & Singh, Eds. CRC Press, ISBN 978-1-4987-5938-0). 반면에, 제형화된 피레크리스(Pirecris)® 및 아그로님TM뿐만 아니라 단순한 화학 조성물은 신경계(피레크리스®) 또는 소화 효소(아그로님TM)에서 독성 작용 메커니즘에 의해 작용한다. 이는 유익한('비-표적') 유기체에 영향을 미칠 가능성을 증가시키는 한편 내성 발생의 위험은 더 높다.
본 발명의 하기 용어는 이하에서 보다 충분히 정의된다.
"생물농약 조성물 또는 식물 보호 조성물"은 본원에서 상호교환적으로 사용되는 용어이다. 이들은 이들로부터 유래되는 부생성물 및/또는 화학 물질을 포함하여, 살아 있거나 자연적으로 발생하는 임의의 생물학적인 독립체로 정의될 수 있으며; 이는 식물 해충 및/또는 질병이라고 부르는 모든 것을 방제/조절한다.
"조 추출물, 식물 추출물 또는 식물학적 추출물"은 본원에서 상호교환적으로 사용되는 용어이다.
제1항에 언급된 임의의 대안적 사항: "에센셜 오일, 올레오레진, 수성, 알코올성 또는 하이드로알코올성 추출물"은 징지베르 오피시날레 로스코의 뿌리 또는 근경으로부터 수득되는 생성물이다. 이러한 생성물은 추출 공정으로부터 수득되는 바와 같은 조 생성물일 수 있거나, 크로마토그래피 방법, 액체-액체 분리, 증발, 결정화 또는 증류에 의한 유도 분획에 의해 수득될 수 있는 이의 분획물일 수 있다. 더욱이, 이러한 생성물은 순수한 물질 또는 물질의 혼합물일 수 있다.
본원에서 "신남알데하이드의 원천"은 신남알데하이드를 포함하거나 이로부터 신남알데하이드가 수득될 수 있는 화합물의 임의의 혼합물을 포함한다. 본원에서 "생물활성 코어"는 "제1 구성성분"과 동일하다.
본원에서, "활성 요소"는 "활성 성분"과 동일하다.
본원에서, "캡슐화제"는 "캡슐화 매트릭스"와 동일하다.
"최종-살포-용액"은 살포할 준비가 된 희석된 생물농약 조성물을 지칭한다.
"추가 물질 및 공동-제형"은 본원에서 상호교환적으로 사용되는 용어이다. 이들은 살충 조성물의 일부를 형성할 수 있고, 그 목적이 이의 효과를 증가시키기 위한 불활성 물질을 지칭한다. 이러한 물질의 예는 보조제, 분산제, 침투제, 유화제, 안정화제, 향미제, 소포제 및/또는 방부제이다.
"순수 화합물"은 생물농약 조성물에서 제2 활성 구성성분으로 작용하고 합성 공정에 의해 반-정제된 분획물의 일부로서 수득되거나 이를 함유하는 천연 원천으로부터 순수한 상태로 단리될 수 있는 임의의 천연 화합물을 지칭한다.
본원에 사용된 임의의 다른 용어는 본 발명과 관련된 최신 기술의 통상적인 의미를 가질 것이다.
본 발명이 해소하는 기술적 문제는 가루이 군에 포함된 해충의 식물 보호 처리에 사용되는 생물농약 조성물의 개발이다. 조성물은 생물활성 코어(징지베르 오피시날레의 에센셜 오일, 올레오레진, 수성, 알코올성 또는 하이드로알코올성 뿌리 또는 근경의 추출물 및 신남알데하이드, 신남알데하이드 원천)를 포함한다. 또한, 생물활성 코어의 구성성분은 놀랍게도 가루이 집합체에 대한 항-파리 활성에 대한 강화 및/또는 협력 효과를 나타내는 것으로 밝혀졌다.
따라서, 본 발명은 다음을 포함하는 상승작용적 생물활성 코어를 포함하는 생물농약 조성물을 개시한다:
ㆍ 징지베르 오피시날레 로스코의 에센셜 오일, 올레오레진, 수성, 알코올성 또는 하이드로알코올성 뿌리 또는 근경 추출물 및
ㆍ 신남알데하이드 또는 신남알데하이드 원천.
생물활성 코어 중 각각의 구성성분의% w/w 농도는 하기 범위 내에 있다:
ㆍ 징지베르 오피시날레 로스코의 에센셜 오일, 올레오레진, 수성, 알코올성 또는 하이드로알코올성 뿌리 또는 근경 추출물: 0.1-99.9%(w/w), 바람직하게는 10-90%(w/w), 보다 바람직하게는 20-80%(w/w), 보다 더 바람직하게는 30-70%(w/w) 및 가장 바람직하게는 40-60%(w/w) 및
ㆍ 신남알데하이드 또는 신남알데하이드의 원천: 0.1-99.9%(w/w), 바람직하게는 10-90%(w/w), 보다 바람직하게는 20-80%(w/w), 보다 더 바람직하게는 30-70%(w/w) 및 가장 바람직하게는 40-60%(w/w).
신남알데하이드는 트랜스, 시스 또는 이성질체의 혼합물일 수 있다.
생물활성 코어의 구성성분으로서 신남알데하이드는 다음으로 수득된다:
- 이를 함유하는 속 신남모문 종의 종으로부터 단리/정제된 고순도(≥95%)의 화합물,
- 전합성, 반합성 또는 생체모방 합성에 의해 수득된 고순도(≥95%)의 화합물 및
- 생물변형 및/또는 생물전환 과정 중 임의의 유기체(예를 들어, 곰팡이 유사 아스페르길루스 종., 박테리아 및 곤충)에 의해 생성된 화합물.
생물활성 코어의 구성성분으로서 신남알데하이드 원천은 바람직하게는 속 신나모뭄 종 유래의 코어를 함유하는 식물종으로부터의 에센셜 추출물/오일일 수 있다. 이러한 속의 종을 포함하는 신남알데하이드의 유의미한 예는 C. 베룸.(동의어 신나모뭄 제일라니쿰), C. 카시아, C. 로우레이, C. 버마니, C. 타말라, C. 오스모플로윰, C. 베졸고타, C. 두비움, C. 리불로움, C. 시트리오도룸 및 C. 캄포라이다.
신남알데하이드 및/또는 신남알데하이드 원천은 자유형으로 사용되고/되거나 캡슐화제에 캡슐화될 수 있다.
캡슐화제는 말토덱스트린, 사이클로덱스트린, 레시틴, 식물성 오일 및/또는 실리카겔(실리카겔), 콜로이드 실리카 및 실리콘 디옥사이드를 포함하는 실리카 부형제로부터 선택될 수 있고, 바람직하게는 사이클로덱스트린이 사용된다.
신남알데하이드 원천의 캡슐화된 형태는 생물학적 활성을 증가시키고, 활성 성분 또는 요소의 통제 방출을 촉진한다.
본 발명의 특정 실시양태에서, 생물농약 조성물은 제2 구성성분을 추가로 포함한다. 이러한 제2 구성성분은 하나 이상 활성 요소 또는 성분일 수 있다. 제2 구성성분으로서 활성 성분은 다음 중 하나 이상으로부터 선택될 수 있다:
ㆍ 식물학적 추출물 또는 추출물의 분획물,
ㆍ 미생물의 발효로부터 수득되는 추출물 또는 상기 추출물의 분획물,
ㆍ 제라니알(시트랄 A), 네랄(시트랄 B), 사포닌, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 벤질 아세테이트, 유제놀, 1,8-시네올, 티몰, 제라니올, 제라닐 아세테이트, 및 단쇄 및 장쇄 포화, 바람직하게는 장쇄 및 불포화, 및 지방산의 유도체(예를 들어, 메틸화, 지방산의 메틸 에스테르, FAME, "지방산 메틸 에스테르") 보다 바람직하게는 장쇄 포화 지방산 및/또는 불포화 지방산으로부터 선택되는 지방산으로부터 선택되는 순수 화합물, 및
ㆍ 알, 해바라기, 유채 씨, 옥수수, 목화, 땅콩 또는 대두 유래의 레시틴.
식물학적 추출물은 다음으로부터 선택될 수 있다:
ㆍ 수성, 알코올성 및 하이드로알코올성 추출물 및/또는
ㆍ 에센셜 오일.
식물학적 추출물의 기원은 하기 속에 속하는 식물로부터의 농산업 폐기물, 비늘줄기, 씨앗, 잎, 골돌, 꽃 및/또는 완전 지상부로부터 선택될 수 있다: 알리움 종, 안젤리카 종. 안노나 종., 아르테미시아 종, 카룸종, 카시아 종, 체노포디움 종, 시트러스 종, 코피아 종, 크로커스 종, 쿠르쿠마 종, 시아몹시스 종, 킴보포곤 종, 시티서스 종, 유칼립투스 종, 유리코마 종, 피커스 종, 포에니쿨룸 종, 퓨마리아 종 제라늄 종, 긴크고 종, 헬리안투스 종, 히소푸스 종, 자트로파 종, 라반둘라 종, 멘타 종, 모린가 종, 니겔라 종, 오시뭄 종, 올레아 종, 파파버 종, 펠라르고노늄 종, 페르세아 종, 페트로셀리눔 종, 핌피넬라 종, 프루너스 종 콰시아 종, 리타마 종, 리움 종, 로스마리너스 종, 살비아 종, 사투레자 종, 스초에노카울론 종, 시지기움 종, 트리고넬라 종, 티무스 종 및 비티스 종, 바람직하게는 하기 종: 알리움 사티붐, 안젤리카 아치안젤리카, 안노나 체리몰라, 아르테미시아 앱신티움, 카룸 카비, 카시아 안구스티폴리아, 카시아 센나, 체노포디움 엄브로시오이데스, 시트러스 아우란티움, 시트러스 레몬, 시트러스 시넨시스, 코피아 아라비카, 크로커스 코르시커스, 코르커스 사티버스, 크로커스 스페시오서스, 코로커스 베무스, 쿠르쿠마 아로마티카, 쿠르쿠마 론가, 킴보포곤 시트라투스, 시아몹시스 테트라고놀로바, 킴보포곤 플렉숴수스, 킴보포곤 마르티니, 킴보포곤 나르더스, 시티서스 스코파리우스, 유칼립투스 카말둘렌시스, 유칼립투스 글로불러스, 유리코마 론기폴리아, 피커스 카리카, 퓨마리아 오피시날리스, 포에니쿨룸 불가레, 제라늄 마크로르리줌, 긴크고 빌로바, 헬리안투스 안누우스, 헬리안투스 투베로섬, 히소푸스 오피시날리스, 자트로파 쿠르카스, 라반둘라 안구스티폴리아, 라반다 x 인터메디에이트, 라반둘라 루이시에리, 멘타 피페리타, 멘타 스피카타, 모린가 올레이페라, 니겔라 사티바, 오시뭄 바실리쿰, 올레아 유로파에아, 파파버 로에아스, 파파버 솜니페룸, 펠라르고늄 시트리오도룸, 펠라르고늄 그라베올렌스, 페르세아 아메리카나, 페르세아 인디카, 페트로셀리눔 사티붐(동의어 P. 크리스펌), 핀피넬라 아니섬, 프루너스 페르시카, 콰시아 아마라, 레타마 모노스페르마, 레타마 스파에로카르파, 리움 라바르바룸, 리움 오피시날레, 로스마리너스 오피시날리스, 살비아 라반둘리폴리아, 살비아 오피시날리스, 사투레자 몬타나, 스초에노카울론 오피시날레, 시지기움 아로마티쿰, 트리고넬라 포에눔-그라에쿰, 티무스 불가리스, 티무스 지기스 및 비티스 비니페라.
발효 생성물은 식물 기질 존재 하의 미생물(균류 또는 박테리아) 발효 과정 및 저온 살균 공정에 의한 살아있는 미생물의 제거로부터 생성되는 추출물 또는 발효액(순수 또는 유기 용매로 사전 추출된 것)을 지칭한다.
미생물 발효로부터 수득되는 추출물은 기질과 바실러스 종, 슈드모나스 종, 트리코데르마 종 코리네박테리움 종 및 아스페르길루스 종, 바람직하게는, 아스페르길루스 니게르, 트리코데르마 하르지아눔, 바실러스 튜링겐시스, 슈도모나스 플루오레스센스, 바실러스 아미롤리퀘펙시언스, 코리네박테리움 에피시언스 및 바실러스 서브틸리스의 발효로부터 수득되는 추출물로부터 선택될 수 있다.
발효 기질은 하기 속에 속하는 식물로부터의 농산업 잔류물, 비늘줄기, 씨앗, 잎, 골돌, 꽃 및/또는 완전 지상부 중에서 선택될 수 있다: 징지베르 종, 시트러스 종, 시아몹시스 종, 크로커스 종, 헬리안투스 종, 페트로셀리눔 종, 파파버 종, 리움 종, 살비아 종, 리타마 종, 라반둘라 종, 프루너스 종, 페르세아 종, 터메릭 종(Turmeric sp.), 및 티무스 종, 바람직하게는, 아가리쿠스 비스포루스, 시아몹시스 테트라고놀로바, 헬리안투스 안누스, 시트러스 x 시넨시스 및 글리신 맥스.
순수 화합물은 하기 원천 중 일부로부터 수득될 수 있다:
ㆍ 시트랄, 제라니알 및 네랄 이성질체의 경우, 속 킴보포곤 종[예를 들어: 특히 C. 시트라투스, C. 마르티니, C. 플렉숴수스, C. 윈테리아누스, C. 나르더스]], 리테세아 종(예를 들어: 특히, L 쿠베바, L 시트레이트), 알로이시아 종(예를 들어: 특히 A. 시트로도라), 오시문 종(예를 들어: 특히, O. 그라티시뭄), 멜리사 종(예를 들어: 특히, M. 오피시날리스) 및 시트러스 종에 포함된 종, 유제놀의 경우, 속 신나모뭄 종[예를 들어: 특히, C. 베룸(동의어, 신나모뭄 제일라니쿰), C. 카시아, C. 시트리오도룸, C. 캄포라], 시지기움 종(예를 들어: 특히, S. 아로마티쿰), 쿠르쿠마 종(예를 들어: 특히, C. 론가), 징지베르 종(예를 들어: 특히, Z. 오피시날레) 및 오시뭄 종(예를 들어, 특히, O. 테누이피오룸(tenuifiorum))에 포함된 것,
ㆍ 사포닌의 경우, 속 시아몹시스 종(예를 들어: 특히, C. 테트라고놀로바), 쿠일라자 종(예를 들어: 특히, Q. 사포나리아), 트리고넬라 종(예를 들어: 특히, T. 포에눔-그라세움), 사포나리아 종(특히, S. 오피시날리스), 크로커스 종(예를 들어: 특히, C. 사티버스), 유카 종(예를 들어: 특히, Y. 스키디게라), 베타 종(예를 들어: 특히, B. 불가리스), 헤데라 종(예를 들어: 특히, H. 헬릭스), 폴리갈라 종 및 프리뮬러 종에 포함된 종, 벤질 알코올의 경우, 속 신나모뭄 종(예를 들어: 특히, C. 카시아) 및 재스미눔 종(예를 들어: 특히, J. 그란디플로룸)에 포함되는 것,
ㆍ 1,8 시네올(유칼립톨)의 경우, 속 유칼립투스 종(예를 들어: 특히, E. 글로불러스, E. 카말둘렌시스), 살비아 종(예를 들어, 특히, S. 오피시날리스, S. 프럭티코사), 티무스 종(예를 들어: 특히, T. 불가리스, T. 지기스, T. 카피타투스), 쿠르쿠마 종(예를 들어: 특히, C. 로리가), 로스마리너스 종(예를 들어: 특히, R. 오피시날리스), 아르테미시아 종(예를 들어: 특히, A. 불가리스)에 포함되는 종, 제라니올의 경우, 속 로사 종(예를 들어: 특히, R. 다마스세나, R. 알바, R. 갈리카), 킴보포곤 종(예를 들어: 특히, C. 시트라투스, C. 마티니, C. 플렉숴수스, C. 윈테리아누스, C. 나르더스), 제라늄 종(특히, G. 프레텐세, G. 마크로르리줌), 펠라르고늄 종(예를 들어, 특히, P. 히르수툼)에 포함되는 것,
ㆍ 지방산의 경우, 속 페르세아 종(예를 들어: 특히, P. 아메리카나), 글리시네 종(예를 들어: 특히, G. 맥스), 헬리안투스 종(예를 들어: 특히, H. 안누우스), 올레아 종(예를 들어: 특히, 올레아 유로파에아) 및 다른 오일시드에 포함되는 종,
ㆍ 구조 활성 상관관계(SAR)를 통한 순수 화합물 및/또는 유사체의 전합성, 반합성 또는 생체모방 합성 및
ㆍ 생물변형 및/또는 생물전환 과정에서 곰팡이, 예컨대 아스페르길루스 종, 박테리아 및 곤충로부터 선택되는 임의의 유기체에 의해 생성되는 것.
레시틴은 다음으로부터 선택된다:
ㆍ고체 레시틴,
ㆍ 액체 또는 유체 레시틴 및
ㆍ 가수분해 또는 부분적으로 가수분해된 레시틴.
제2 구성성분은 자유형 또는 캡슐형으로 사용될 수 있다.
생물농약 조성물 중 제2 구성성분의 농도는 하기 총 중량/부피 조성물 농도 범위로 생물활성 코어와 조합된다: 1-30%(w/v), 바람직하게는 5-25%(w/v), 보다 더 바람직하게는 10-20%(w/v).
생물농약 조성물은 보조제, 유화제, 분산제, 향미제, 방부제, 소포제, 요변제, 캡슐화 매트릭스, 지방산, 인지질 및 이들의 혼합물로부터 선택될 수 있는 적어도 하나의 불활성 물질을 추가로 포함할 수 있다.
보조제는 유기실록산의 군으로부터의 오가노실리콘일 수 있다.
요변제는 카복시메틸셀룰로오스, 나트륨 카복시메틸셀룰로오스, 미세결정질 셀룰로오스 및 다른 셀룰로오스 유도체, 바람직하게는 검 및 겔일 수 있다.
캡슐화 매트릭스는 말토덱스트린, 사이클로덱스트린, 레시틴, 식물성 오일 및/또는 실리카겔, 콜로이드 실리카 및 실리콘 디옥사이드를 포함하는 실리카 부형제 중에서 선택될 수 있고, 바람직하게는 사이클로덱스트린일 수 있다.
본 발명의 특정 실시양태에서, 생물농약 조성물은 생물활성 코어, 레시틴 및 선택적으로 제2 구성성분 및/또는 불활성 물질로 지칭되는 다른 물질을 포함한다.
본 발명의 특정 실시양태에서, 생물농약 조성물은 다음을 포함하는 생물농약 조성물로부터 선택된다:
- 징지베르 오피시날레 및 신나모뭄 베룸,
- 징지베르 오피시날레, 신나모뭄 베룸 및 콩 레시틴,
- 징지베르 오피시날레, E-신남알데하이드 및 페르세아 아메리카나,
- 징지베르 오피시날레, 신나모뭄 베룸 및 실리콘 유도체 오가노실록산 종류,
- 징지베르 오피시날레, 신나모뭄 베룸, 사투레자 몬타나 하이드로알코올성 추출물 및 콩 레시틴,
- 징지베르 오피시날레, 신나모뭄 베룸, 콩 레시틴, 실리콘 유도체 오가노실록산 종류, β-사이클로덱스트린 및 중합성 보조제,
- 징지베르 오피시날레, 신나모뭄 카시아, 페르세아 아메리카나, 킴보포곤 시트라투스, 콩 레시틴, 트윈-80, 실리콘 유도체 오가노실록산 종류, 카복시메틸셀룰로오스, β-사이클로덱스트린 및 중합성 보조제,
- 징지베르 오피시날레, 신나모뭄 베룸, 페르세아 아메리카나, 아스페르길루스 종, 콩 레시틴, 실리콘 유도체 오가노실록산 종류 및 중합성 보조제,
- 징지베르 오피시날레, 신나모뭄 카시아, 멘타 피페리타, 콩 레시틴, 실리콘 유도체 오가노실록산 종류 및 중합성 보조제,
- 징지베르 오피시날레, 신나모뭄 카시아, 카시아 안구스티폴리아, 콩 레시틴, 실리콘 유도체 오가노실록산 종류 및 중합성 보조제,
- 징지베르 오피시날레, 신나모뭄 카시아, 트리고넬라 포에눔-포테쿰, 벤질 아세테이트, 콩 레시틴, 실리콘 유도체 오가노실록산 종류 및 중합성 보조제,
- 징지베르 오피시날레, 신나모뭄 베룸, 시트랄, 벤질 벤조에이트, 콩 레시틴, 실리콘 유도체 오가노실록산 종류 및 중합성 보조제,
- 징지베르 오피시날레, 신나모뭄 베룸, 벤질 아세테이트, 제라니올, 콩 레시틴, 실리콘 유도체 오가노실록산 종류 및 중합성 보조제,
- 징지베르 오피시날레, 신나모뭄 베룸, 파파버 솜니페룸, 콩 레시틴, 실리콘 유도체 오가노실록산 종류 및 중합성 보조제,
- 징지베르 오피시날레, 신나모뭄 베룸, 사투레자 몬타나 에센셜 오일, 사투레자 몬타나 추출물, 콩 레시틴, 실리콘 유도체 오가노실록산 종류 및 중합성 보조제, 및
- 징지베르 오피시날레, E-신남알데하이드, 제라닐 아세테이트, 콩 레시틴, 실리콘 유도체 오가노실록산 종류 및 중합성 보조제.
본 발명은 또한, 용매, 바람직하게는 수용액, 보다 바람직하게는 물로 희석된 상기 정의된 생물농약 조성물을 포함하는 최종-살포-용액에 관한 것이다.
최종-살포-용액 중 생물활성 코어의 각각의 구성성분의 농도는 하기 범위를 이룬다:
- 징지베르 오피시날레 로스코의 에센셜 오일, 올레오레진, 수성, 알코올성 또는 하이드로알코올성 뿌리 또는 근경 추출물: 0.01-0.99%(w/v), 바람직하게는 0.05-0.95%(w/v), 바람직하게는 0.1-0.9%(w/v), 보다 바람직하게는 0.2-0.8%(w/v), 가장 바람직하게는 0.3-0.7%(w/v), 가장 바람직하게는 0.4-0.6%(w/v), 및
- 신남알데하이드 또는 신남알데하이드의 원천: 0.01-0.99%(w/v), 바람직하게는 0.05-0.95%(w/v), 바람직하게는 0.1-0.9%(w/v), 가장 바람직하게는 0.2-0.8%(w/v), 가장 바람직하게는 0.3-0.7%(w/v), 가장 바람직하게는 0.4-0.6%(w/v).
개시된 생물농약 조성물의 주요 기술적 이점은 다음과 같다:
- 이들은 다음과 비교하여 파리 방제에서 더 낮은 약량으로 높은 효능과 특이성을 나타낸다:
o 본 발명 내에서 구한 값과 최신 기술에서 보고된 값을 모두 고려하는 개별 활성 요소(추출물, 오일, 분자).
o 알려진 활성의 다른 천연 및 합성 화합물 및/또는 제형.
이들은 파리에 대항하여 복합적인, 무독성 작용 방식을 갖는다(접촉-항섭식-방충성 산란(contact-antifood-repellence oviposition)).
교차 내성의 시작을 제거 및/또는 지연시킨다.
선택된 식물종은 작물에서 큰 생물다양성과 지속가능성을 나타내어, 공정의 첫 번째 단계에서 재료의 가용성을 보장한다.
활성 성분의 경우, 다음을 고려하면 이들은 인간과 동물 또는 식물에 대해 유독성일 것으로 예상되지 않는다:
- 이들의 자연 발생.
- 이들의 식품 및 약리학적 용도.
- 자연적인 인간 노출 이력 및 환경.
일부 경우에서, 일부 생물농약 조성물의 구성성분으로서 추출물을 수득하는 것은 상업적 가치가 거의 또는 전혀 없는 식물 재료의 평가에 대한 대안을 구성하고 농식품 산업의 공정에서 잔류물로서 관리된다.
개시된 최적화된 추출 및 제형화 공정은 깨끗하고, 빠르고, 효율적이며 쉽게 확장가능(scalable)하여 시장에서 제품의 최종 가격을 감소시킨다.
본 발명의 추가 목적은 수성 매질에서 하기 생물활성 코어 구성성분을 혼합하는 것을 포함하는, 본 발명의 생물농약 조성물을 수득하는 공정을 구성한다:
- 징지베르 오피시날레 로스코 의 에센셜 오일, 올레오레진, 수성, 알코올성 또는 하이드로알코올성 뿌리 또는 근경 추출물 및
- 신남알데하이드 또는 신남알데하이드 원천.
생물활성 코어를 수득하기 위한 공정의 이전 단계에서, 징지베르 오피시날레 로스코의 에센셜 오일, 올레오레진, 수성, 알코올성 또는 하이드로알코올성 추출물은, 온침(maceration), 퍼컬레이션(percolation), 달임(decoction), 주입, 수증류-클레벤저(hydrodistillation-Clevenger); 초음파, 마이크로파, 초임계 유체에 의해 조력을 받는 추출; 속슬렛(Soxhlet) 추출, 압출, 엔트레인먼트(entrainment)(직접, 간접, 가압 및/또는 진공) 또는 용매 추출(고온 또는 저온)에 의해, 바람직하게는 콜로이드 밀(colloid mill) 다기능 분산 시스템에서 수득될 수 있다.
대안적으로, 신남알데하이드 원천은 상기 나타낸 바와 같은 종의 증류에 의해 수득될 수 있다. 신남알데하이드는 생물활성 코어를 제형화하기 위해 사전 캡슐화될 수 있다.
구성성분의 주어진 첨가 순서는 징지베르 오피시날레 로스코의 에센셜 오일, 올레오레진, 수성, 알코올성 또는 하이드로알코올성 뿌리 또는 근경 추출물을 물에 먼저 첨가한 후, 신남알데하이드 또는 신남알데하이드 원천을 첨가하는 것을 필요로 한다(실시예 1).
선택적으로, 생물농약 조성물은 상승작용적 생물활성 코어, 적어도 하나의 제2 구성성분 및/또는 적어도 하나의 불활성 물질의 정렬된 혼합물로부터 특정 비율로 수득된다. 그 후, 이들은 각각의 구성성분의 첨가 후 교반 기간을 가지면서 혼합물에 순차적인 방식으로 첨가된다.
생물활성 코어의 구성성분의 혼합은 500 내지 4000 rpm, 바람직하게는 1500 내지 3000 rpm 범위의 속도로 수행된다. 혼합은 수성 매질에서 일어난다.
혼합의 온도는 30 내지 120분, 바람직하게는 40 내지 100분으로 구성된 기간 동안 20 내지 40℃, 바람직하게는 24 내지 35℃이다.
생물농약 조성물을 제조하는 공정은 당해 분야에서 이러한 작업을 수행하기 위해 통상적으로 사용되는 장치 또는 반응기에서 수행될 수 있다.
본 발명의 추가 목적은 파리 해충의 방제를 위한 생물농약 조성물의 용도를 구성한다.
특히, 가루이 군은, 바람직하게는 속 베미시아 종 "복합체"(생물형) 디알레우로데스 종, 트리알레우로데스 종 엔카르시아 종, 알레우롤로버스 종, 알레우로스릭서스 종, 알레우로디커스 종, 알레이로데스 종, 파라베미시아 종, 파랄레이로데스 종, 오차모플라투스 종, 시포니누스 종 및 테트랄레우로데스 종에 속하는 것이다.
생물농약 조성물의 요소는, 상승작용적으로, 부가적으로, 다기능적으로 및/또는 강력하게 작용한다.
생물농약은 통제 방출 메커니즘에 의해 장기간 효과를 갖는다. 생물농약 조성물은 작물 손실의 위험이 있는 높은 기생충 감염(infestation) 조건에 대해 예방적으로 및/또는 치유적으로 사용될 수 있다.
또한, 생물농약은 개별적으로 또는 다른 식물 보호 제품 또는 해충 및 질병 방제 시스템과 조합하여 살포될 수 있다.
다른 식물 보호 제품 또는 해충 방제 시스템이란 임의 종류의 살충제, 살선충제, 살비제, 살진균제, 살균제, 제초제, 식물 성장 조절제, 엘리시터, 비료, 토양 개량제, 및 먹이 유인제를 특히 의미한다.
생물농약 조성물의 살포는 잎 분무기에 의한 것일 수 있다.
또 다른 특정 실시양태에서, 생물농약 조성물의 살포는 식품 및 비-식품 농작물, 통상적인, 유기 또는 생태학적 농업, 바람직하게는 원예, 노지 및 관상용 작물 및 정원용 뿐만 아니라 공원 및 스포츠 시설에 수행된다.
또 다른 특정 실시예에서, 살포는 온실 및 노지뿐만 아니라 정원 및 스포츠와 레크리에이션 시설의 녹지에서 이루어진다.
생물농약 조성물의 약량은 제형의 종류, 방제될 해충의 공격 종류와 강도, 작물 및 사용 국가에 따라 증가하거나 감소할 수 있다.
작용 방식의 메커니즘 및 정의
작용 방식(MoA)은 생물농약이 이의 효과를 생성하는 특정한 물리적 및/또는 생화학적 상호작용을 지칭한다.
작용 방식 및 메커니즘을 결정하기 위해, 과학 문헌(예를 들어, 선택 대 비-선택 검정, 직접 분무, 섭취 독성, Y-관 후각계(olfactometer) 생물검정, 프라이밍 생물검정, 현미경 등)으로부터 개발되고/되거나 조정된 미세검정의 세트(시험관내 및 생체내)가 사용되었다. 바람직하게는, 하기 생체검정이 수행된다:
ㆍ 접촉 검정의 사충률: 목적은 국소 살포에 의해 성충 사충률 및 가루이 미성숙 상태에 대한 상이한 물질 약량의 효과를 평가하는 것이다.
ㆍ 정착(settling) 억제 검정: 표적은 가루이 성충의 행동(정착)에 대한 상이한 물질 약량의 효과를 평가하는 것이다. 동일한 곤충학 상자(선택 시험) 또는 상이한 상자(비-선택)에 위치된 처리 및 미처리 식물에 대한 파리의 선호도에 기반한다.
ㆍ 산란 억제 검정: 표적은 가루이 성충의 알 산란에 대한 물질의 상이한 약량의 효과를 평가하는 것이다. 동일한 곤충학 상자(선택 시험) 또는 상이한 상자(비-선택)에 위치된 처리 및 미처리 식물 표면에 산란하는 파리의 선호도에 기반한다.
ㆍ 공간 방충성 검정: 목적은 숙주 식물에 대한 가루이 성충 선호도를 억제하는 물질의 능력을 측정하는 것이다(후각계 검정).
다음이 검정 프로토콜에서 고려되었다:
ㆍ 생물농약 조성물의 활성 요소 각각은 개별적으로 그리고 이들 간의 조합으로 테스트된다.
ㆍ 생물농약 조성물이 각각 검정된다.
ㆍ 공개된 조성물을 구성하는 각각 요소에 대해, 그리고 각각의 생물농약 조성물에 대해 약량-반응 검정이 수행되었고, CE/LC50(연구된 효과의 50%가 발생하는 약량)이 계산되었다.
얻어진 결과를 고려할 때, 평가된 활성 요소 및/또는 생물농약 조성물은 2가지 주요 작용 방식에 의해 작용하는 것으로 귀결된다:
작용 방식 1: 녹 다운(Knock down) 효과. 이러한 작용 방식에 관련된 작용 메커니즘은 다음과 같다:
ㆍ 파리 기도가 차단됨(기도 폐쇄 사망).
ㆍ 외골격 왁스층의 파괴(탈수 사망).
ㆍ 세포막의 파괴(삼투압 쇼크).
작용 방식 2: 파리 후각 수용체 및 미각에 작용. 이러한 작용 방식과 관련된 작용 메커니즘은 다음과 같다:
ㆍ 항섭식 효과: 미각 수용체와 조성물의 구성성분의 상호작용에 의한 섭식 억제.
ㆍ 방충 효과: 캡슐화된 휘발성 구성성분의 통제 방출 및 후각 수용체와의 상호작용에 의한 강력한 방충 효과.
ㆍ 산란 억제: 성충 화학수용체와 조성물의 구성성분의 상호작용에 의해 유의미하게 감소한 알 산란.
생물활성 코어의 각각의 요소에 대한 작용 방식 및 메커니즘이 표 2에 요약된다.
Figure pct00002
생물활성 코어의 성분은 작용 메커니즘 측면에서 큰 다기능성과 관련된 복잡한 화학 조성을 나타낸다. 제안된 작용 메커니즘(물리적 및 행동적)의 조합은 생물활성 코어의 효과를 결정하고, 교차 내성의 발생 위험을 최소화한다. 이러한 효능은 조성물의 안정성 증가에 기여하고 활성 성분의 통제 방출을 촉진하는 불활성 부성분(co-formulant)(물질)뿐만 아니라 적어도 하나의 제2 활성 구성성분의 첨가에 의해 향상된다.
도 1: 제형 반응기.
도 2: 엔트레인먼트 공정 흐름도.
도 3: 발효 공정 흐름도.
도 4: 생물-지향적 화학 분류 도식.
도 5: 접촉 검정에서 시험관 내 사충률의 디자인.
도 6: 접촉 검정의 사충 시 가루이 성충의 현미경 관찰. A: 막의 파괴, B: 차단된 기관 숨문(질식).
도 7: 공간 방충 검정을 위해 디자인된 Y-후각계.
도 8: 식물 섭식 억제 검정의 실험 디자인.
도 9: 생물활성 코어 구성성분 간의 상호작용의 이소볼로그래프 분석(Isobolographic analysis).
도 10: 순수(A) 및 캡슐화(B) 신나모뭄 제일라니쿰 에센셜 오일의 크로마토그램(GC-MS-MS).
도 11: 접촉으로 인한 사충률(% M)에 대한 생물활성 코어 요소의 약량 반응 곡선.
도 12: 정착 억제(% SI)에 대한 생물활성 코어 요소의 약량 반응 곡선.
도 13: 알 산란 억제(% IO)에 대한 생물활성 코어 요소의 약량 반응 곡선.
도 14: 상승작용적, 부양적(boosting) 및 협력적 혼합물의 연구를 위한 기브스 삼각형(Gibbs Triangle) 방법론. 상단 삼각형은 구성성분 A, B 및 C 사이에 생성된 상승작용적 조합의 수를 도시한다. 하단 삼각형은 조합에서 각각의 성분 A, B 및 C의 비율을 나타낸다.
도 15: 가지(eggplant)에서의 WF_ F4 조성물 대 가루이의 노지 시험 시, 실험 및 샘플링 토지(plot)의 실험 디자인과 분포.
출원 실시예
하기 도면, 도표, 표 및 실시예는 예시로서 도시되고 본 발명을 한정하지 않는다.
실시예 1. 생물활성 코어 수득
본 특허의 틀 내에서 개시된 생물농약 조성물의 여러 실시예가 표 3에 포함된다. 하나의 특정 예로서 생물활성 코어(조성물 M0, 표 3)는 징지베르 오피시날레 뿌리/근경의 하이드로알코올성 추출물 10.5% 및 물 중 신남알데하이드 원천(CAS 8015-91-6)으로서 신나모뭄 베룸 J. Presl.(동의어, C. 제일라니쿰 블룸)의 에센셜 오일 15%를 포함한다. 에센셜 오일은 자유형(100% 에센셜 오일)으로 혼입될 수 있고/있거나 캡슐화제로 부분적으로 또는 완전히 캡슐화될 수 있다. 하나의 특정 예에서, 캡슐화제는 β-사이클로덱스트린이다. 상기 일반적인 단계에 따라 수득하는 과정이 이하에 상세히 설명된다:
650리터의 총 용량 및 560리터의 유용한 용량을 갖는 스테인리스 스틸 반응기(도 1)에서 생물활성 코어 요소의 혼합을 수행한다. 이는 PT100 센서를 통해 탱크 내부의 온도를 제어하도록 열교환기 유체가 순환하는 이중 자켓을 갖는다. 반응기에는 2개의 교반기가 장착된다: 중앙 디스크형 콜스 교반기(cowles stirrer)(1500 rpm의 최대 속도) 및 반응기 바닥에 위치한 고속 유화기(3000 rpm, 울트라-투락스(turrax) 형). 두 교반기를 독립적으로 제어하여, 혼합 과정 중 성분 각각과 시간에 대한 특정 속도 및 회전 제어를 달성한다. 또한, 반응기는 생성물에 형성되는 기포를 제거하고 기체-액체 계면의 형성을 방지하는 데 사용되는 진공 펌프에 연결된다. 이는 또한, 산소의 존재 하에 작동을 방지하여 산화 과정을 방지하기 위한 불활성 가스 주입 시스템을 특징으로 한다. 마지막으로 반응기는 자동 세정을 위한 제자리 세정 시스템을 특징으로 한다.
반응기(도 1)의 특징을 고려하여, 표 4에 상세히 설명된 바와 같이 각각의 교반기의 온도 및 회전 변수를 조정하면서, 생물활성 코어의 요소들을 특정 순서로 신중히 첨가한다.
Figure pct00003
Figure pct00004
*16%의 에센셜 오일 C. 베룸은 10%의 β-사이클로덱스트린에 의해 캡슐화된 3%의 에센셜 오일 및 13% 순수 에센셜 오일로 구성된다.
** 2.5%의 에센셜 오일 C. 카시아는 6,5%의 β-사이클로덱스트린에 의해 캡슐화된다.
Figure pct00005
실시예 2. 생물농약 조성물의 수득
생물농약 조성물을 구성하는 부성분 및 활성 요소의 성질에 기초한 특정 혼합 순서에 따라 각각의 생물농약 조성물을 제형화한다. 두 가지 방식으로 생물활성 코어의 요소를 최종 조성물에 사용한다:
(1) 생물농약 조성물을 제형화하는 과정 동안에 이들을 개별적으로 그리고 해당하는 순서로 포함시킨다.
(2) 이를 사전 혼합한 후 생물농약 조성물에 따라 해당하는 비율과 순서로 최종 제형에 첨가한다.
방법은 다음의 일반적인 단계로 구성된다:
a. 원료 선택
■ 활성 요소
- 생물활성 코어(제1 구성성분)
- 제2 구성성분(들)
■ 불활성 물질
- 유화제
- 보조제
- 안정화제
- 방부제
- 캡슐화제
- 향미제
- 소포제
b. 활성 성분(들)의 캡슐화(해당되는 경우)
c. 제형화(성분의 혼합)
본 특허의 틀 내에서 개시된 생물농약 조성물의 여러 예가 표 3에 나열된다. 각각의 변이형(조성물 M1, M2, M3, M4, WF_f4, ADI-23, PW-1.5 및 MxM5)을 수득하기 위한 방법의 예는 이하에 상세히 설명된다. 본 과정은 표 3에 나열된 나머지 조성물(MxM14, MxM15, MxM22, MxM19, MxM12, MxM16 및 MxM25)의 경우 광범위하다.
2.1 제2 구성성분으로서 레시틴 + 생물활성 코어에 의해 형성된 생물농약 조성물
생물농약 조성물의 하나의 예(조성물 M1, 표 3)로서, 생물활성 코어(Z. 오피시날레의 하이드로알코올성 추출물 7.5% 및 신남알데하이드 원천으로서 C. 베룸의 에센셜 오일 10%)를 활성 증강제 및 유화제로서 17.5%의 콩 레시틴(CAS: 8002-43-5)과 블렌딩하여, 조성물 M1(표 3)을 제조한다.
실시예 1에 기재된 반응기 특성을 고려하여, 표 5에 상세히 설명된 바와 같이 각각의 교반기의 온도 및 회전 변수를 조정하면서, 콩 레시틴 및 생물활성 코어의 요소를 특정 순서로 신중히 첨가한다.
Figure pct00006
2.2 제2 구성성분으로서 페르세아 아메리카나 추출물 및 생물활성 코어에 의해 형성된 생물농약 조성물
생물농약 조성물(조성물 M2, 표 3)의 예로서, 생물활성 코어(7.5%의 Z 오피시날레 하이드로알코올성 추출물 및 신남알데하이드 원천으로서, 5%의 신남알데하이드(CAS 104-55-2))를 20%의 페르세아 아메리카나 하이드로알코올성 추출물(제2 구성성분)과 혼합하여, 조성물 M2(표 3)를 제조한다.
실시예 1에 기재된 반응기 특징을 고려하여, 표 6에 상세히 설명된 바와 같이 각각의 교반기의 온도 및 회전 변수를 조정하면서, 제2 구성성분(P. 아메리카나 하이드로알코올성 추출물) 및 생물활성 코어의 요소들을 특정 순서로 신중히 첨가한다.
Figure pct00007
2.3 생물활성 코어+ 불활성 물질에 의해 형성된 생물농약 조성물
생물농약 조성물(조성물 M3, 표 3)의 예로서, 생물활성 코어(12.5%의 Z. 오피시날레 하이드로알코올성 추출물 및 신남알데하이드 원천으로서, 12.5%의 C. 베룸 에센셜 오일)를 10%의 오가노실록산 종류의 실리콘 유도체(보조제)와 혼합하여 조성물 M3(표 3)을 제조한다.
실시예 1에 기재된 반응기 특징을 고려하여, 표 7에 상세히 설명된 바와 같이 각각의 교반기의 온도 및 회전 변수를 조정하면서, 보조제(오가노실리콘 유도체) 및 생물활성 코어의 요소들을 특정 순서로 신중히 첨가한다.
Figure pct00008
2.4 생물활성 코어 및 2개의 제2 구성성분에 의해 형성된 생물농약 조성물
생물농약 조성물(조성물 M4, 표 3)의 예로서 생물활성 코어(1%의 Z. 오피시날레 하이드로알코올성 추출물 및 신남알데하이드 원천으로서, 12.5%의 C. 베룸 에센셜 오일)를 20%의 사투레자 몬타나 하이드로알코올성 추출물 및 17.5%의 콩 레시틴(제2 구성성분)과 블렌딩하여, 조성물 M4(표 3)를 제조한다.
실시예 1에 기재된 반응기 특징을 고려하여, 표 8에 상세히 설명된 바와 같이 각각의 교반기의 온도 및 회전 변수를 조정하면서, 보조제(오가노실리콘 유도체) 및 생물활성 코어의 요소들을 특정 순서로 신중히 첨가한다.
Figure pct00009
2.5 생물활성 코어, 콩 레시틴, 불활성 물질 및/또는 제2 활성 구성성분에 의해 형성된 생물농약 조성물
2.5.1. 조성물 WF F4
생물농약 조성물의 하나의 예로서, 생물활성 코어(7.5%의 Z. 오피시날레 하이드로알코올성 추출물 및 신남알데하이드 원천으로서, 16.0%의 C. 베룸 에센셜 오일)을 17.5%의 콩 레시틴(유화제 및 증강제 기능을 갖는 제2 구성성분), 13%의 오가노실리콘 보조제 및 분산제로서 작용하는 10%의 중합성 보조제와 블렌딩한다. 이러한 특정한 경우에는, 13%의 C. 베룸 에센셜 오일을 자유형으로 첨가하고, 3%의 C. 베룸 에센셜 오일을 10%의 β-사이클로덱스트린에 캡슐화 형태로 첨가하여, 조성물 WF_F4(표 3)를 제조한다.
실시예 1에 기재된 반응기 특징을 고려하여, 표 9에 상세히 설명된 바와 같이 각각의 교반기의 온도 및 회전 변수를 조정하면서, 생물활성 코어의 요소들, 콩 레시틴 및 나머지 불활성 물질을 특정 순서로 신중히 첨가한다.
Figure pct00010
*13%의 캡슐화된 성분은 3%의 C.베룸 에센셜 오일 및 10%의 캡슐화제 β-사이클로덱스트린으로 구성된다.
2.5.2. ADI-23 조성물
생물농약 조성물의 하나의 예로서, 생물활성 코어(7%의 Z. 오피시날레 하이드로알코올성 추출물 및 신남알데하이드 원천으로서, 2.5%의 C. 카시아 에센셜 오일)를 페르세아 아메리카나 유래의 13.5%의 하이드로알코올성 추출물, 킴보포곤 시트라투스 유래의 10%의 에센셜 오일, 17.5%의 콩 레시틴(유화제 및 증강제 기능을 갖는 제2 구성성분) 및 불활성 물질과 블렌딩한다. 이러한 특정한 경우에는, P. 아메리카나 추출물 및 C. 시트라투스 에센셜 오일 또한 제2 구성성분으로 간주된다.
실시예 1에 기재된 반응기 특징을 고려하여, 표 10에 상세히 설명된 바와 같이 각각의 교반기의 온도 및 회전 변수를 조정하면서, 생물활성 코어의 요소들, 제2 구성성분 및 나머지 불활성 물질을 특정 순서로 신중히 첨가한다.
Figure pct00011
*10%의 캡슐화된 성분은 2.5%의 C. 카시아 에센셜 오일 및 7.5% 캡슐화제 β-사이클로덱스트린으로 구성된다.
2.5.3. 조성물 PW-1.5
생물농약 조성물의 하나의 예로서, 생물활성 코어(3%의 Z. 오피시날레 하이드로알코올성 추출물 및 신남알데하이드 원천으로서, 2.5%의 C. 베룸 에센셜 오일)를 7%의 페르세아 아메리카나 하이드로알코올성 추출물, 아스페르길루스 니게르 발효로부터 수득된 47.7%의 생성물, 17.5%의 콩 레시틴 및 불활성 물질과 혼합한다. 이러한 특정한 경우에는, P. 아메리카나 추출물 및 아스페르길루스 발효 생성물 및 레시틴은 제2 구성성분으로 간주된다. 실시예 1에 기재된 반응기 특징을 고려하여, 표 11에 상세히 설명된 바와 같이 각각의 교반기의 온도 및 회전 변수를 조정하면서, 생물활성 코어의 요소들, 제2 구성성분 및 나머지 불활성 물질을 특정 순서로 신중히 첨가한다.
Figure pct00012
2.5.4. 조성물 MxM5
생물농약 조성물의 하나의 예로서, 생물활성 코어(1%의 Z. 오피시날레 하이드로알코올성 추출물 및 신남알데하이드 원천으로서, 0.5%의 C. 베룸 에센셜 오일)를 12.5%의 시트랄, 20%의 벤질 벤조에이트, 17.5%의 콩 레시틴(부양 유화제) 및 불활성 물질과 블렌딩한다. 이러한 특정한 경우에는, 순수 화합물 시트랄 및 벤질 벤조에이트가 제2 구성성분으로 간주된다. 실시예 1에 기재된 반응기 특징을 고려하여, 표 12에 상세히 설명된 바와 같이 각각의 교반기의 온도 및 회전 변수를 조정하면서 생물활성 코어의 요소들, 제2 구성성분 및 불활성 물질을 특정 순서로 신중히 첨가한다.
Figure pct00013
실시예 3. 제2 구성성분을 수득하는 방법론
실시예 2에 기재된 식물 재료를 상이한 추출 공정으로 처리하여, 생물활성 코어를 구성하는 성분과 제2 구성성분으로 사용되는 성분 둘 모두로서, 제2 구성성분을 수득한다.
A) 수성, 알코올성 v/o 하이드로알코올성 추출물
수성 추출을 위해 물을 사용한다. 알코올 추출의 경우, 용매 추출, 바람직하게는 에탄올, 이소프로판올 또는 벤질 알코올을 사용한다. 추출 방법은 온침(저온 또는 고온, 휴지(resting) 또는 진탕), 주입, 퍼컬레이션, 달임, 환류, 초음파, 마이크로파, 속슬렛 및 바람직하게는 작동 원리가 회전자/고정자 시스템인 콜로이드 밀을 이용한 첨단 다기능 분산 기술에 의한 추출 중에서 선택된다. 추출물의 화학적 프로파일을 기체 크로마토그래피가 결부된 질량 분석(GC-MS) 및 액체 크로마토그래피가 결부된 질량 분석(LC-MS)에 의해 결정한다.
B) 에센셜 오일
수증류, 비극성 용매(예를 들어, 아세톤, 헥산, 디클로로메탄, 석유 에테르)에서의 온침, 초임계 유체에 의한 추출 및 바람직하게는 인증 UNE EN ISO 9001: 215 하의 유럽 약전(Ph. Eur. 8.0. 2013, ISBN: 978-92-871-7525-0, 3513 pp.)에 기재된 방법론에 따른 증기 스트리핑 증류(steam stripping distillation)에 의해 오일을 수득한다. 에센셜 오일의 화학적 프로파일을 질량 분석에 결부된 가스 크로마토그래피(GC-MS)에 의해 결정한다. 스팀 스트리핑 공정의 전형적인 흐름도가 도 2에 도시된다.
C. 발효
시트러스 건조 고체 부스러기(나무껍질, 깍지, 펄프), 실시예 1-2에서 인용된 것으로부터 선택된 원래의 식물 재료 및/또는 추출 공정 유래의 부스러기를 발효 공정 및 후속 추출에서 처리한다. 이를 위해, 10-15%의 백분율로 원재료를, 물에서, 상이한 선택된 미생물(바실러스 종, 슈드모나스 종, 트리코데르마 종 및 아스페르길루스 종) 중 하나와 함께, F3-100 발효조(스페인 무르시아 소재의 바이오넷(Bionet))에서 120시간 동안 28℃-30℃로 항온처리한다. 항온처리 후, 발효물을 5000 rpm에서 5분 동안 원심분리하고(히타치 히맥(Hitachi Himac) CR22N), 메쉬 또는 섬유 필터를 통해 여과한다. 생성 액체를 제형에 사용하기 위해 준비한다. 일반적인 공정은 도 3의 순서도에 상세히 설명된다.
D. 생체-표적 화학적 분류
본 발명의 틀 내에서, 생체검정-유도 화학적 분류를 필요로 하는 수성, 알코올성 및/또는 하이드로알코올성 추출물의 생체검정-유도 화학적 분류를 수행한다. 전문화된 문헌에 잘 알려진 전통적이며 진보된 추출/분리 기술을 사용함으로써 이를 수행한다. 이는 액체-액체 추출, 진공 액체 크로마토그래피(VLC), 컬럼 크로마토그래피(CC), 고체상 크로마토그래피(예를 들어, 실리카, 세파덱스(Sephadex)), 분취용 고성능 액체 크로마토그래피(pHPLC) 및 초임계 유체를 포함한다. 페르세아 아메리카나 추출물로부터 생물활성 분획물을 수득하는 구체적인 예는 도 4에서 설명된다.
실시예 4. 신남알데하이드 캡슐화 공정
본 공정은 생물활성 코어의 캡슐화된 신남알데하이드 원천 및 생물농약 조성물의 제2 구성성분의 임의의 캡슐화된 형태에 유효하다.
실시예 1(도 1)에 기재된 것과 동일한 반응기에서 캡슐화 공정을 수행한다.
이어서, 신남알데하이드 원천으로서 C. 베룸의 캡슐화 공정이 이하에 기재된다. 450리터의 물을 25℃의 반응기에 첨가하여 이를 수행한다. 후속하여, 45 Kg의 β-사이클로덱스트린(캡슐화제)을 천천히 혼입하고, 격렬한 교반(3000 rpm으로 투락스 진탕기 및 1000 rpm으로 콜스 진탕기) 하에 30분 동안 유지한다. 그 후, 투락스 교반기를 멈추고, 콜스 교반기를 500 rpm으로 설정하여, 20 Kg의 C. 베룸 에센셜 오일을 천천히 첨가한다. 2시간 동안 교반 조건 하에 혼합을 유지한다. 이 시간 이후에, 혼합물을 반응기로부터 제거하고, 본 목적을 위해 컨디셔닝된 스테인리스 스틸 탱크에서 10℃로 24시간 동안 방치되게 한다. 그 후, 혼합물을 액체로부터 고체 입자를 분리하는 체(42 마이크론)로 펌핑(진공)시킨다. 액체 부분을 저장하고, 새로운 캡슐화 공정에 사용하고/하거나 제형화 공정에서 물로서 사용한다. 고체를 1 cm 두께의 스테인리스 스틸 트레이 위로 펼치고, 35℃의 제어된 온도에서 12% 습도까지, 24시간 더 건조시켜 생물농약 조성물의 제형화 공정에 사용하기 위해 준비한다.
실시예 5. 생물농약 조성의 희석
혼합물로 구성될 생성물의 수에 따라, 특정 혼합 순서를 수행하여 비호환성을 회피한다.
청구된 생물농약 조성물을 적어도 하나의 용매, 바람직하게는 물에 희석함으로써 최종-살포-용액의 제조를 수행한다. 희석제의 양과 희석 규모는 배양 종류, 필요한 최종-살포-용액의 부피, 파리 종 및 살포 시점의 감염/피해 수준에 따라 다르다. 대체로, 최종-살포-용액은 하기 단계에 따라 수행될 것이다:
ㆍ pH(5-7) 및 물 경도(소프트) 조건형성.
ㆍ 제형을 포함하는 생성물(들)의 주어진 부피의 용매(예를 들어, 탱크의 1/3)에서 사전 혼합을 수행한다. 하나 초과의 생성물을 첨가하는 경우, 먼저 고체 화합물을 첨가한 후, 액체 화합물을 첨가한다. 각각의 탱크의 사양과 특성에 따라, 최종 사용자에 의해 예비 혼합물을 교반하고 유지한다. 사전 혼합의 지속시간은 사용자 각각의 조건과 최종-살포-용액을 구성하는 요소의 수에 따라 다를 것이다.
ㆍ 선택한 부가물(adjunct)을 첨가한다(해당되는 경우).
ㆍ 약량에 따라 적절한 양의 용매로 탱크를 채우고 계속 교반한다.
개시된 생물농약 조성물을 50배 내지 10000배 범위로 희석한다. 실시예 1 및 2에 나타낸 제제 희석의 예를 이하에 나타낸다.
5.1. 실시예 1에 나타낸 조성물의 희석
생물활성 코어만을 함유하는 생물농약 조성물(조성물 M0, 표 3)의 예는 실시예 1에 나타나 있다. 상이한 희석 인자 적용에 의한 최종-살포-용액 중 요소들의 최종 농도의 일부 예가 표 13에 나타나 있다.
Figure pct00014
5.2. 실시예 2에 나타낸 조성물의 희석
실시예 2는 생물활성 코어를 포함하는 생물농약 조성물의 다른 예를 나타낸다.
하나의 예는 생물활성 코어 및 레시틴을 함유하는 생물농약 조성물M1(표 3, 실시예 2.1)이다. 상이한 희석 인자 적용에 의한 최종-살포-용액 중 요소들의 최종 농도의 일부 예가 표 14에 나타나 있다.
Figure pct00015
또 다른 예는 생물활성 코어 및 제2 구성성분를 함유하는 생물농약 조성물 M2(표 3, 실시예 2.2)이다. 상이한 희석 인자 적용에 의한 최종-살포-용액 중 요소들의 최종 농도의 일부 예가 표 15에 나타나 있다.
Figure pct00016
또 다른 예는 생물활성 코어 및 불활성 물질을 함유하는 생물농약 조성물 M3(표 3, 실시예 2.3)이다. 상이한 희석 인자 적용에 의한 최종-살포-용액 중 요소들의 최종 농도의 일부 예가 표 16에 나타나 있다.
Figure pct00017
또 다른 예는 생물활성 코어 및 2개의 제2 구성성분을 함유하는 생물농약 조성물 M4(표 3, 실시예 2.4)이다. 상이한 희석 인자 적용에 의한 최종-살포-용액 중 요소들의 최종 농도의 일부 예가 표 17에 나타나 있다.
Figure pct00018
또 다른 예는 생물활성 코어, 콩 레시틴 및 불활성 물질을 함유하는 생물농약 조성물 WF_F4(표 3, 실시예 2.5.1)이다. 상이한 희석 인자 적용에 의한 최종-살포-용액 중 요소들의 최종 농도의 일부 예가 표 18에 나타나 있다.
Figure pct00019
* 캡슐화제(β-사이클로덱스트린) 및 C. 베룸 에센셜 오일의 혼합물
또 다른 예는 생물활성 코어, 3개의 다른 제2 구성성분 및 불활성 물질을 함유하는 생물농약 조성물 ADI-23(표 3, 실시예 2.5.2)이다. 상이한 희석 인자 적용에 의한 최종-살포-용액 중 요소들의 최종 농도의 일부 예가 표 19에 나타나 있다.
또 다른 예는 생물활성 코어, 3개의 다른 제2 구성성분(발효 공정으로부터 유도된 것들 중 하나) 및 불활성 물질을 함유하는 생물농약 조성물 PW-1.5(표 3, 실시예 2.5.3)이다. 상이한 희석 인자 적용에 의한 최종-살포-용액 중 요소들의 최종 농도의 일부 예가 표 20에 나타나 있다.
Figure pct00020
* 캡슐화제(β-사이클로덱스트린) 및 C. 카시아 에센셜 오일의 혼합물
Figure pct00021
* 실시예 3과 관련하여 수득된 생성물
또 다른 예는 생물활성 코어, 2개의 제2 구성성분(순수 화합물 및 콩 레시틴) 및 불활성 물질을 함유하는 생물농약 조성물 MxM5(표 3, 실시예 2.5.4)이다. 상이한 희석 인자 적용에 의한 최종-살포-용액 중 요소들의 최종 농도의 일부 예가 표 21에 나타나 있다.
Figure pct00022
실시예 6. 일반 실험실 검정 프로토콜
6.1. 표적 파리 종
대부분의 효능 및 작용 메커니즘 검정을 위한 생물학적 표적으로서 활용된 해충 종은 표 22에 상세히 설명된다.
Figure pct00023
원예 작물에 대한 이들의 발병률의 경제적 중요성, 합성 살충제에 대한 내성 발달, 바이러스를 전파하는 이들의 능력뿐만 아니라 가루이 군에 속하는 관련 해충 관리를 위한 연구 모델로서의 이들의 광범위한 사용을 고려하여 표적을 선택하였다.
6.2. 생물학적 표적의 사육 및 유지
개체군을 확립하기 위해, 각 종의 상이한 성충 개체를 샘플링하였다(표 22). 개체는 플라스틱에서 작물 집단이 가장 높은 곳 중 하나인 알메리아(Almeria) 지방의 상이한 온실을 대표한다. 각각의 표적의 대표적인 풀(pool)을 이들의 숙주 식물(파세올루스 불가리스 L) 중 하나에서 확립하였다. 확립된 개체를 22℃ ± 1℃, 60-70% 상대 습도 및 16:8시간 광주기(밝음:어두움)의 환경 조건 하에 워크-인 기후 챔버(walk-in climate chamber)에서 유지하였다.
6.3. 참조 제품
이하에 기재된 상이한 생체검정은 현재 시장에 상용화되어 있고 가루이 방제를 위한 상이한 권장 제품을 포함하였다(표 23). 이들은 본 발명에 청구된 생물농약 조성물에 대한 양성 효능 대조군으로서 사용되도록 의도된다.
Figure pct00024
6.4. 가루이의 방제를 위한 미세검정(시험관내 및 생체내)
테스트된 물질의 상이한 작용 방식과 메커니즘을 식별하기 위해 테스트 프로토콜을 개발하였다. 생물활성 코어(징지베르 오피시날레 + 신남알데하이드 원천)뿐만 아니라 본 발명의 상이한 생물농약 조성물을 선택된 해충에 대한 효능 시험에서 테스트하였다. 이들의 경우, 페트리 접시(petri dish)의 시험관내 검정과 생체내 검정을 재현가능한 식물내 모델을 이용하여 수행하였다.
본 발명의 틀 내에서 사용된 조성물 사용의 검정 종류에 대한 일반적인 설명.
검정은 세 개의 큰 그룹으로 나뉜다:
ㆍ 접촉으로 인한 사충률: 국소 살포에 의한 단기 및 중기(0-24시간) 내에 가루이에 대한 제품의 살충 능력. 여기서 본 출원은 두 가지 작용 메커니즘을 식별한다:
ㆍ 파리 큐티클 및 막에 대한 효과(삼투압 쇼크).
ㆍ 파리 호흡 기관에 대한 효과(기도 폐쇄).
ㆍ 파리 행동에 대한 효과: 미각 및 후각 수용체와 상호작용함으로써 중장기(24시간-7일) 내에 가루이 방제에 대한 효과.
ㆍ 실제 방충제: 파리는 물질과 직접 접촉하게 되지 않고 처리 영역으로부터 물러난다(후각 수용체).
ㆍ 착지 억제제: 파리는 물질과 직접 접촉하게 된 후 처리 영역으로부터 물러난다(미각 및 후각 수용체).
ㆍ 항섭식 또는 억지제:
ㆍ 섭식 억제: 파리는 제품과 접촉하지만 섭식을 하지 않고, 결국 처리 영역으로부터 물러난다(미각 수용체).
ㆍ 산란 억제: 파리는 처리 영역에 접촉하지만, 산란된 알은 억제된다(후각 및 미각 수용체).
제안된 각각의 시험에 사용된 방법론은 이하에 기재된다.
ㆍ 접촉으로 인한 사충률
테스트 목적은 국소 살포에 의한 가루이 성충 사충에 대해 테스트될 물질의 상이한 약량의 효과를 평가하는 것이다.
높이 10 cm 및 직경 5 cm의 플라스틱 스크류-캡 캐니스터에서 테스트를 수행한다. 뚜껑의 중앙에서, 2 cm2의 오리피스를 천공하고, 구멍 길이가 0.77 x 0.27 mm(세로:가로)인 파인 패브릭(fine fabric)으로 덮는다. 숙주 식물(파세올루스 불가리스)로부터 잎 디스크(5.7 cm2)를 잘라내고, 지지하는 것 외에도 시험 시간(24시간) 동안 디스크에 필요한 수분을 제공하는 1 cm 두께 층의 한천(12% w/v)으로 사전 코팅된 병 바닥에 놓는다(빔(beam) 측이 아래로 향함). 푸터(pooter)로 사전 포획된 15마리의 성충 개체를 각각의 병에 넣었다(도 5). 파리가 있는 병을 해충의 이동성을 일시적으로 감소시키고 병 기저의 디스크에 이의 정착을 용이하게 하기 위하여 4℃에서 1분 동안 항온처리한다. 그 후, 휴대용 디퓨저를 이용하여 병 바닥에 정착한 파리 위로 처리될 물질(생물활성 코어, 생물농약 조성물, 참조 제품)을 균일하게 분무한다. 제품이 살포되면, 파리 사육에 대해 기재된 바와 동일한 조건 하에 기후 챔버에서 병을 유지한다. 성충 사충 시험 각각은 처리군 각각에 대해 20개의 병(반복 실험(replicate)) 및 대조군(물)에 대해 20개의 병(반복 실험)으로 구성된다. 동시에, 검정의 경우, 각각의 검정을 3회 반복한다.
생물활성 코어의 상이한 조합(표 3)을 최종-살포-용액의 0.01-0.5% 사이의 초기 농도로 검정한다. 생물농약 조성물(표 3) 및 참조 제품을 권장 약량 범위(1-5 mL의 제형화/물 1리터)로 살포한다. 시험 종료 시(24시간), 입체 확대경을 사용하여 죽은 파리와 살아있는 파리의 수를 계수한다. 넉 다운 효과를 결정하는 경우에는, 살포 처리 2, 4, 6, 8, 16, 24시간 후, 순차적으로 계수를 수행한다. 파리는 곤충학적 브러시(entomological brush)에 의해 건드렸을 때 움직임의 징후를 보이지 않는 경우 죽은 것으로 간주한다. 사충률은 대조군에 대한 %로 표현하며, 데이터는 하기 애보트 식(Abbott's formula)을 이용하여 보정한다:
Figure pct00025
상기 식에서,
X = 처리군에 대한 퍼센트(%) 사충률이고,
Y = 대조군에 대한 퍼센트(%) 사충률이다.
분산 분석(ANOVA, p<0.05) 및 LSD 사후 테스트를 이용해 데이터를 비교하여 평균 간의 차이를 확인하였다. 이러한 목적을 위해, 통계 패키지 IBM® SPSS 스태티스틱스(Statistics)®를 사용하였다. 데이터의 비-정규성의 경우, 윌콕슨(Wilconxon) 다중-순위 비모수 테스트를 적용할 것이다(p<0.05). 상당한 퍼센트 사충률(> 70%)을 갖는 처리군을 약량-반응 연구를 위해 선택한다. 원하는 효과의 50%가 발생하는 약량(EC50)을 로그-약량을 기반으로 하는 프로빗(probit) 회귀 분석에 의해 계산한다.
사충이 발생하는 메커니즘을 구별하기 위해 죽은 파리를 현미경으로 면밀히 관찰한다(도 6). 본 발명의 틀 내에서 메커니즘은 다음과 같이 상이하다:
ㆍ 약간 노르스름(yellowish)한 색을 가진 온전한 형태와 구조를 유지하는 죽은 파리: 질식이 주요 작용 메커니즘으로 제안된다.
ㆍ 갈색을 가진 형태와 구조를 상실(해체 및/또는 으스러짐)한 죽은 파리: 막/큐티클 부패로 인한 삼투압 쇼크가 주요 작용 메커니즘으로 제안된다.
후속하는 실시예는 각각의 특정 실험에 사용된 생물농약 조성물, 농도, 유기체 및 보다 구체적인 세부사항을 설명한다.
파리 행동에 대한 효과: 직접적인 방충성
직접적인 방충성 연구를 위해 후각계 방법론을 사용하였다.
본원에 참조된 연구는 도 7에 도시된 바와 같은 Y-관 후각계를 사용한다. 높이 10 cm 및 직경 5 cm의 플라스틱 스크류 캡 병 2개를 준비하였다. 뚜껑의 중앙에서, 2 cm2의 오리피스를 천공하고, 구멍 길이가 0.77 x 0.27 mm(세로:가로)인 파인 패브릭으로 덮는다. 숙주 식물(파세올루스 불가리스)로부터 잎 디스크(5.7 cm2)를 잘라내고, 지지하는 것 외에도 시험의 지속 기간(24시간) 동안 디스크에 필요한 수분을 제공하는 1 cm 두께 층의 한천(물 중 12% w/v)으로 사전 코팅된 병 바닥에 놓는다(빔 측이 아래로 향함).
테스트될 물질(생물농약 조성물)로 처리된 병 중 하나를 상부 암(arm) 중 하나에 배치하고, 다른 하나에는 물 처리된 디스크(대조군)가 있는 동일한 병을 배치하였다. 하부 암에 의해 파리를 방출한다. 실험을 22℃ ± 1℃, 60-70% 상대 습도 및 16:8시간 광주기(밝음:어두움)의 환경 조건에서 워크인 기후 챔버에서 항온처리한다. 각각의 시험에서, 3개의 후각계를 사용하였고, 반복 실험으로 간주하였다. 24시간 후, 파리가 처리군 및 대조군에 대해 정착하고, 방충성 지수(% RI)를 다음 식을 이용하여 테스트된 각각의 물질에 대해 계산한다:
Figure pct00026
상기 식에서,
T: 처리된 챔버 내에 살아있는 파리의 수(처리된 디스크에 정착 및/또는 병 벽에 정착)
C: 대조군 챔버 내에 살아있는 파리의 수(대조군 디스크에 정착 및/또는 병 벽에 정착)
% RI의 평균을 IBM® SPSS 스태티스틱스® 통계 패키지를 이용하여, 윌콕슨 부호-순위-테스트 다중-순위 비모수 테스트(p<0.05)에 의해 분석하였다.
후속 실시예는 각각의 특정 실험에 사용된 생물농약 조성물, 농도, 유기체 및 보다 구체적인 세부사항을 설명한다.
파리 행동에 대한 효과: 섭식억제 효과(간접적 방충성)
본 발명의 틀 내에서, 본 출원은 섭식, 정착 및 산란을 억제하는 파리 행동에 대해 작용하는 임의의 항-섭식 물질을 고려하였다. 정착 억제는 간접적인 방충 효과로 간주된다.
플랜타에 대한 정착 억제 생체검정(선택)
이러한 종류의 검정은 숙주 식물(파세올루스 불가리스)에서 가루이 성충의 정착에 대한 테스트된 물질의 효과를 결정한다. 이는 동일한 상자에 배치된 처리 및 대조군 숙주 식물에 대한 성충의 선호도를 기반으로 한다. 상단에 뚜껑을 갖는 직사각형 메타크릴레이트 곤충학 상자 50 x 35 cm(높이 x 폭)를 생체검정 개발을 위해 디자인하였다. 0.77 x 0.27 mm(세로:가로) 기공의 메쉬로 덮인 직경 25 cm의 통풍구를 캡에 만든다. 완전히 발달된 2-지엽기(leaf stage)(측면의 나머지와 속잎이 제거됨)에 있는 숙주 식물을 각각 갖는 2개의 동일한 화분을 준비하였다. 잎의 양면에 제품의 양호한 적용을 보장하는 휴대용 디퓨저를 이용해, 식물 중 하나를 테스트될 용액(생물활성 코어, 생물농약 조성물)으로 처리하고, 다른 하나를 물(대조군)로 처리한다. 두 식물(처리 및 대조군)을 동일한 곤충학 상자에 넣는다. 그 후, 100마리의 성충 가루이 개채가 있는 병을 상자 바닥에서, 두 식물 간 등거리 지점에 위치시킨다. 실험 디자인은 도 8에서 관찰할 수 있다.
그 후, 상자를 뚜껑을 덮어 상기한 바와 동일한 조건 하의 기후 챔버에서 항온처리한다. 각각의 방충성 검정은 각각의 스크리닝 변이형에 대해 5개의 상자(반복 실험)로 구성된다. 시험 종료(24시간)에, 처리 및 대조군 식물에 정착한 살아있는 개체의 수를 계수한다. 또한, 사충률 시험과 동일한 방식으로 양면에서 죽은 개체의 수를 계수한다. 이러한 데이터를 사용하여, 하기 식에 따라 정착 억제율(% SI)을 계산한다:
Figure pct00027
상기 식에서,
T: 처리된 식물에 정착한 파리
C: 대조군 식물에 정착한 파리.
데이터를 통계 패키지 IBM® SPSS 스태티스틱스®를 사용하여 윌콕슨 비모수 다중-순위 테스트(p<0.05)에 의해 분석하였다. % 정착 억제(> 60%)를 갖는 처리군을 약량-반응 연구를 위해 선택하였다. 원하는 효과의 50%가 발생하는 약량(EC50)을 회귀 분석(로그-약량 프로빗(Log-dose probit))에 의해 계산하였다.
후속 실시예는 각각의 특정 실험에 사용된 생물농약 조성물, 농도, 유기체 및 보다 구체적인 세부사항을 설명한다.
산란 억제 생체검정
본 검정은 동일한 상자에 배치된 숙주 식물(파세올루스 불가리스)에서 처리 및 대조군 해충의 성충의 산란된 알에 대한 상이한 물질의 효과를 결정한다(선택 검정).
실험을 메타크릴레이트의 곤충학 상자에서 수행하였고 식물에 대한 정착 억제 생체검정에서와 동일한 방식으로 진행하였다(도 8). 실험의 종료 시, 잎 조각에 정착한 성충을 제거하고 입체 확대경에서 알을 계수한다. 얻은 데이터를 이용하여, 하기 식에 따라 산란 억제 지수(% IO)를 계산한다:
Figure pct00028
상기 식에서,
T = 처리군에 산란된 알의 수
C = 대조군에서 산란된 알의 수
데이터를 IBM® SPSS 스태티스틱스® 통계 패키지를 사용하는 윌콕슨 다중-순위 비모수 테스트(p<0.05)를 이용하여 분석하였다. % 정착 억제(> 60%)를 갖는 처리군을 약량-반응 연구를 위해 선택하였다. 원하는 효과의 50%가 발생하는 약량(EC50)을 로그-약량 프로빗에 기반한 회기 분석에 의해 계산하였다.
후속 실시예는 각각의 특정 실험에 사용된 생물농약 조성물, 농도, 유기체 및 보다 구체적인 세부사항을 설명한다.
실시예 7. 실지 시험에 대한 일반적인 프로토콜
본원에서 생물농약 조성물의 가루이 방제 활성 평가를 위한 실지 시험 프로토콜(노지) 및 반-실지(온실)를 THE EPO/EPPO 지침(i EPP/EPPO Bulletin, 2012, 42(3), 367-381)에 따라 디자인한다. 각각의 시험에서 실험 디자인은 후속 실시예에서 상세히 설명된다.
실시예 8. 생물활성 코어의 생물농약 활성 및 상승작용적 효과
가루이에 대한 청구된 생물활성 코어 및 이의 구성성분의 살충(살충률) 및 항섭식(방충성과 산란 억제) 활성이 표 24에 나타나 있다. 2가지 농도로 코어를 구성하는 개별 요소의 효능 결과가 제시된다:
ㆍ 가장 큰 것은 스크리닝 과정 동안 성분이 테스트되는 가장 높은 약량에 대응한다.
ㆍ 가장 낮은 것은 성분이 최종-살포-용액에서 발견될 수 있는 약량(% w/v) 중 하나에 대응한다.
생물활성 코어의 경우, 요소를 특정 비율[(A)+(B)]로 조합할 때, 코어는 이러한 약량(% w/v)으로 최종-살포-용액에 있을 것이다. 연구된 모든 표적 및 작용 메커니즘의 경우, 본 출원은 생물활성 코어로 달성한 효능이 개별 요소를 살포할 때 얻은 수준을 놀랍게도 초과하였고 예상보다 우수하였음을 관찰하였다.
이는 블렌드에 대한 상승작용적 및/또는 부양 효과의 존재를 확인시켜 준다(실시예 9). 이 효과는 다음과 같이 나타난다:
ㆍ 각각의 개별 작용 메커니즘에 대한 활성의 상당한 증가: 사충률-방충성-산란.
ㆍ 개별 구성성분에 사용된 것과 비교하여, 유효 약량의 혼합물 효능의 상당한 감소.
Figure pct00029
%M: 실시예 6.4에 따라 계산된 사충률의 백분율, %SI: 실시예 6.4에 따라 계산된 공간 방충성의 백분율, %IO: 실시예 6.4에 따라 계산된 산란 억제의 백분율, (A): Z. 오피시날레의 하이드로알코올성 뿌리/근경 추출물, (B): 에센셜 오일 신나모뭄베룸, *ρ<0,01, 윌콕슨 비모수 다중-순위 테스트.
실시예 9: 생물활성 코어의 상승작용적 효과의 입증
본 발명의 주요 이점 중 하나는 생물활성 코어를 구성하는 활성 요소를 조합함으로써 달성되는 가루이 군에 속하는 파리의 방제에 있어서 상승작용적인 효과(사충률, 방충성 및 산란 억제)이다. 엄밀히 말하면, 상승작용은, 다음과 같이, 혼합물 중의 둘 이상의 구성성분 간의 상호작용으로서 수학적으로 정의된다:
ㆍ 개별 구성성분의 효과의 합으로부터 발생하는 것보다 혼합물에서 동일한 약량으로 더 큰 효과가 얻어진다(강화 상승작용).
ㆍ 혼합물에서 확인되는 바와 동일한 비율로 동일한 효과가 얻어지며, 이는 개별 구성성분의 효과의 합산으로부터 초래된다(합산 상승작용).
그러나, 이러한 정의는 다음과 같은 경우에 엄밀한 의미로는 적용하기가 매우 어렵다:
ㆍ 식물 추출물의 혼합물은, 이들의 복잡한 화학 조성으로부터 유래되는 상이한 효과로 인해, 종종 정량화되지 않는다.
ㆍ 상이한 작용 메커니즘을 갖는 조성물. 반응의 선형성을 가정하는 알려진 작용 메커니즘에 대해 상승작용적 효과가 연구되어야 한다.
다만, 상승작용적 조합의 상이한 적용은 식물의학 분야(Phytomedicine, Vol. 8(5), pp. 401-409. 2001) 및 살충 조성물(Neth. J. PlantPath. 70,1964; US005837652A, ES 2.153.503 T3)에 존재한다. 개별 구성성분과 관련하여 혼합물에서 달성된 상승작용적 효과는 하기 두 가지 방식으로 나타난다:
ㆍ 각각의 개별 작용 메커니즘에 대한 활성의 상당한 증가: 사충률-방충성 산란.
ㆍ 개별적으로 사용되는 약량과 비교하여 혼합물에서 유효 약량(EC50)의 요소들 효능의 상당한 감소.
본 특허의 틀 내에서 상승작용적 효과를 입증하기 위해, 본 출원은 하기 두 가지 방법을 사용하였다:
(1) 작용 메커니즘과 무관하기 때문에 가장 널리 사용되는 방법 중 하나인, 이소볼레 방법(isobole method). 방법론은 Phytomedicine, Vol. 8(5), pp. 401-409. 2001에 기재된다.
(2) 하기 식을 사용하여 림펠(Limpel)(Proc. North. Weed Control Conf., v. 16, pp 48-53, 1962)에 의해 제안된 방법론:
Figure pct00030
상기 식에서,
E = 주어진 약량에서 요소 (A)와 (B)의 혼합물의 예상되는 백분율 효능이다.
X = 주어진 약량에서 성분(A)의 백분율 효능.
Y = 주어진 약량에서 성분(B)의 백분율 효능.
가루이에 대한 생물활성 코어의 상승작용적 효과의 입증:
a) 이소볼레 방법
표 25에서, 베미시아 타바시의 사충률에 대한 상이한 생물활성 코어 조합의 효과는 국소 살포를 위한 검정으로 나타낼 수 있다. 약량은 최종-살포-용액 중 성분 농도(%w/v)를 지칭한다. 모든 경우에서, 요소들의 상이한 조합이 개별 요소보다 더 큰 효능을 가졌다. 이러한 결과로부터, 하기 희석을 적용하여 각각의 조합에 대해 EC50을 계산하였다:
ㆍ 약량(A)+ 약량(B): 표 25에 표시된 동일 %M
ㆍ [약량(A)+ 약량(B)]/2
ㆍ [약량(A)+ 약량(B)]/4
ㆍ [약량(A)+ 약량(B)]/8
ㆍ [약량(A)+ 약량(B)]/16
Figure pct00031
(A): Z. 오피시날레의 하이드로알코올성 뿌리/근경 추출물, (B): 신남알데하이드의 원천; %M: 실시예 6.4에 따라 계산된 사충률의 백분율; 약량(%) 최종-살포-용액, *ρ<0,05, 윌콕슨 비모수 다중-순위 테스트.
도 9는 상승작용적 코어를 구성하는 일련의 구성성분 조합에 대한 관찰 값(점선) 및 예상된 합산 값(검은색 실선)으로부터 계산된 EC50 값을 갖는 아웃라이어 플롯을 도시한다(표 25의 값).
개별 구성성분의 EC50을 연결한 직선은 부가 효과를 생성할 이들 사이의 모든 가능한 조합을 포함한다(이소볼레). 점은 각각의 조합의 실험적 EC50을 나타낸다. 오목한 곡선(상승작용적 특징)이 나타나는 상호작용 프로파일(A+B)을 볼 수 있으며, 이는 두 화합물의 (개별 요소의 유효 약량에 비해) 낮은 약량이 높은 사충률로 이어짐을 나타낸다.
(b) 림펠 방법
림펠에 의해 제안된 방법론(Proc. North. Weed Control Salvi, v. 16th, 48-53,1962)은 상기한 식(림펠 방법)을 사용한다. 표 24의 값을 취히면 다음과 같다:
ㆍ X = 35.7%(0.06%에서 성분 A의 %사충률에 해당)
ㆍ Y = 2.3%(0.024%에서 성분 B의 %사충률에 해당)
식에서 다음을 치환하였다:
E(기대값) = 35.7 + 2.2 - (35.7 x 2.2) / 100 = 37.12% 사충률
표 23에 도시된 바와 같이 관찰된 값은 기대값보다 상당히 높은 74.3%의 사충률이며, 이는 상승작용이 존재함을 보여준다.
실시예 10. 신남알데하이드 원천의 통제 방출
많은 경우에서 방충 활성은 파리 화학수용체와 상호작용하는 휘발성 화합물의 존재로 인한 것이다. 이들의 휘발 성질로 인해, 이러한 화합물은 수 시간 후에 상실되는 매우 단기적 효능 갖는다. 또한, 이들의 낮은 수용성과 빛에 의해 산화하는 경향은 이들의 제형화를 복잡하게 만든다. 사이클로덱스트린 복합화(캡슐화)는 이러한 종류의 물질을 보호하고 방출을 제어하기 위해 가장 널리 사용되는 기술 중 하나이다.
본원에 개시된 많은 생물농약 조성물은 활성 성분의 통제 방출을 보장하기 위해 적어도 하나의 캡슐화된 구성성분을 갖는다. 본 발명에서는 캡슐화 효율(> 60%) 및 스케일-업 용이성을 위해 공침법을 사용하여 캡슐화를 수행하였다.
얻어진 결과를 이용하여 바람직하게는 β-시클로덱스트린(W7)을 매트릭스로 선택하였다(표 26). 실시예 4에 상세히 설명된 바와 같은 과정을 수행하였다. 80% 캡슐화를 수득하였다. 화학적 관점으로부터의 캡슐화 효능은 가스 크로마토그래피-질량 분석(GC-MS) 분석으로 이어졌다. 과정의 크로마토그래피 추적(GC-MS)은 도 10에 도시된다. 캡슐화 과정은 추출물과 이의 통제 방출로부터 일부 생물활성 구성성분의 보유를 선호한다.
표 26에서, 가루이(베미시아 타바시)의 행동(방충성 및 산란 억제)에 대한 자유형 및 캡슐화된 C. 베룸 에센셜 오일(신남알데하이드 원천 예로서 취득됨)의 활성이 나타나 있다. 실시예 4에서 제안된 방법론에 따라 β-사이클로덱스트린(W7)을 이용한 캡슐화는 효능 및 통제 방출에서 최상의 결과를 나타내었다.
Figure pct00032
*ρ<0,05, 윌콕슨 비모수 다중-순위 테스트; β-사이클로덱스트린 및 콜로이드 실리카는 캡슐화제이다;(%SI) 및 (%IO)를 실시예 6.4에 제안된 방법론에 따라 계산하였다.
실시예 11. 생물활성 코어에 기인한 작용 메커니즘의 정의
본 실시예의 목적은 가루이 방제에 대한 최종 효과를 달성하기 위해 생물활성 코어의 작용 메커니즘에 대한 요소들의 개별 기여를 입증하는 것이다.
표 27은 상이한 농도의 생물활성 코어(Z. 오피시날레 뿌리/근경의 하이드로알코올성 추출물 및 신남알데하이드 원천으로서 C. 베룸 유래 잎의 에센셜 오일)의 개별 구성성분 및 조성물 MO(표 3의 생물활성 코어에 의해 형성된 생물농약 조성물)의 가루이에 대한 살충 활성을 나타낸다.
Figure pct00033
%M: 실시예 6.4에 따라 계산된 사충률의 백분율; (%SI) 정착 억제는 실시예 6.4에 따라 계산된다; (%IO) 산란 억제는 실시예 6.4에 따라 계산된다; 동일한 컬럼 내에 있는 동일한 문자의 평균은 상당한 차이를 나타낸다(ANOVA, ρ<0,05). EC50; 50%의 효과, 95% 신뢰도를 생성하는 약량(한계 열등 및 한계 우수); *p<0.05, 윌콕슨 쌍체 테스트(Wilcoxon paired test); 표 3에 상세히 설명된 바와 같은 조성물 MO.
접촉으로 인한 사충률, 정착 억제 및 산란 억제에 대한 생물활성 코어의 요소들의 약량-반응 곡선은 도 11, 12 및 13에 각각 도시된다. 확인할 수 있는 바와 같이, Z. 오피시날레 유래의 하이드로알코올성 추출물은 접촉 효과로 인한 사충률에 크게 기여하는 반면, C. 베룸(신남알데하이드 원천) 잎 유래의 에센셜 오일은 표 2에 요약된 바와 같이, 항섭식 효과(정착 억제 및 산란 억제)에 보다 많이 기여한다.
실시예 12. 레시틴의 강화 및/또는 협력 효과
본 발명의 틀 내에서, 생물농약 조성물 및 특히 생물활성 코어의 활성 증강제로서의 레시틴의 용도가 개시된다.
생물활성 코어를 구성하는 요소 및 콩 레시틴 사이의 상이한 조합을 디자인하여 강화 및/또는 협력 효과를 연구하였다. 조합의 디자인를 위해 상이한 구성성분의 아-치사(Sub-lethal) 농도를 선택하였다. 도 14에 도시된 바와 같이 기브스 삼각형 방법론(삼각형 스크린 제형화 접근법(Triangle Screen Formulation Approach))을 사용하였다.
본 실시예에서, 구성성분 A(징지베르 오피시날레의 하이드로알코올성 뿌리 추출물), B(C. 베룸 잎 유래의 에센셜 오일) 및 C(콩 레시틴) 사이의 상승작용적 조합을 표 28에 따라 가루이에 대한 접촉 사충률의 아차사 농도로 시작하여 연구한다. 상단 삼각형은 상이한 조합을 나타내고, 하단 삼각형은 각각의 조합의 상이한 비율을 나타낸다.
생물농약 조성물에 사용된 생물활성 코어와 콩 레시틴의 조합 중 하나의 예시적이고 비제한적인 가루이 효능이 표 28에 나타나 있다. 조합 "33"은 300/3의 비율로 조합 A+B+C에 해당하고(기브스 삼각형 참조), 이는 최종-살포-용액 중의 농도: A: 0.02%, B: 0.06%, C: 0.07%에 해당한다.
Figure pct00034
%M: 실시예 6.4에 따라 계산된 사충률의 백분율; (%SI) 정착 억제는 실시예 6.4에 따라 계산되었다; (%IO) 산란 억제는 실시예 6.4에 따라 계산되었다; (A); 징지베르 오피시날레의 하이드로알코올성 뿌리/근경 추출물; (B); C. 베룸 잎 유래의 에센셜 오일; (C) 콩 레시틴; *<0,05, 윌콕슨 비모수 다중-순위 테스트.
실시예 13. 가루이에 대한 생물농약 조성물의 검증
표 29는 비교 목적을 위해 양성 대조군으로 사용된 참조 제품 및 모든 생물농약 조성물(표 3)의 가루이에 대한 활성을 나타낸다. 모든 생물농약 조성물은 가루이를 방제하는 데 높은 효능을 나타내며, 이는 대조군과 비교할 때 통계적으로 상당하다. 조성물은 가루이 방제를 위해 현재 시중에 존재하는 참조 제품(화학 및 천연)과 유사하고/하거나 그보다 더 우수한 효능을 나타낸다.
Figure pct00035
%M: 실시예 6.4에 따라 계산된 사충률의 백분율;(%SI) 정착 억제는 실시예 6.4에 따라 계산되었다; (%IO) 산란 억제는 실시예 6.4에 따라 계산되었다; 동일한 컬럼 내에 있는 동일한 문자의 평균은 상당한 차이를 나타낸다(ANOVA, ρ< 0.05). *p<0.05, 윌콕슨 쌍체 테스트; 표 3에 상세히 설명된 바와 같은 생물농약 조성물.
실시예 14. 가루이에 대한 생물활성 코어의 방충 효과(직접적 방충성)
생물활성 코어(표 3의 조성물 M0)의 직접적인 방충성 효과는 표 30에 나타나 있다. 사용된 방법론은 실시예 6.4에서 상세히 설명된다. 확인할 수 있는 바와 같이, 생물활성 코어는 가루이 성충에 대해 강한 방충 효과를 나타낸다.
Figure pct00036
1자유형 성충 수 = 100; 2정착 파리(대조군 챔버 + 처리된 챔버)의 수가 50 이상인 경우 검정이 유효한 것으로 간주됨. *p<0.05, 윌콕슨 쌍체 테스트. 실시예 6.4에 따라 계산됨.
실시예 15. 온실 검정에서 가루이 개체군 역학에 대한 WF_F4 조성물의 효과
15.1 배경
본 연구를 수행하여 가지(솔라넘 멜론제나(Solanum melongena))에서 가루이에 대한 조성물 WF_F4(7.5%의 Z. 오피시날레 뿌리의 하이드로알코올성 추출물 및 16%의 C. 베룸 잎 유래 에센셜 오일)의 온실 효능을 평가하였다. 성충 수 및 알 수의 감소에 대한 효과를 효능 변수로 이용하였다. 사용된 실험 디자인은 7개의 처리군 및 처리군당 3회 반복 실험을 이용한 무작위 블록이었다.
2019년 동안 로케타스 데 마르(Roquetas de Mar)(스페인 알메리아)에서 시험을 수행하였다. 알메리아는 전 세계적으로 최고의 온실 집단을 가지며 유럽의 주요 원예 공급지 중 하나이다. 가지 작물은 알메리아 내의 온실 지역에서 약 5%를 차지한다. 가루이(베미시아 타바시 및 트리알레우로데스 바포라리오룸)는 이러한 작물을 공격하는 주요 해충으로 여겨진다.
전술한 모든 것에 대해, 테스트를 위해 선택된 지역은 그러한 효능 시험을 수행하기 위한 대표로서 간주된다.
15.2. 목적
ㆍ 가지에서 가루이 성충(B. 타바시)를 감소시키는 WF_F4 조성물의 효능을 평가하는 것.
ㆍ 가지에서 가루이 알(B. 타바시)를 감소시키는 WF_F4 조성물의 효능을 평가하는 것.
ㆍ 화학 및 천연 발생 참조 제품에 대한 조성물 WF_F4의 효능을 비교하는 것.
ㆍ 주요 작물에 대한 WF_F4 조성물의 식물약해 및 익충(비-표적)에 대한 이의 효과를 평가하는 것.
15.3. 참조 제품
가루이 방제에 사용된 3가지 상업적 참조 제품을 양성 대조군으로 사용하였다(표 31). 레퀴엠®은 미국 및 다른 국가에 등록된 천연 제형이다.
Figure pct00037
15.4. 처리
사용된 처리 및 약량이 표 32에서 상세히 설명된다.
Figure pct00038
15.5. 검정 개요
작물
ㆍ 종: 솔라넘 멜론제나(가지)
ㆍ 식물 간 거리(m): 0.75
ㆍ 줄(row) 거리(m): 3
ㆍ 재식 밀도: 10000 식물/ha
ㆍ 관개 시스템: 드롭(Drop)
토지
ㆍ 국가: 스페인
ㆍ 장소: 로케타스 데 마르(알메리아)
ㆍ 우편번호: 04740
ㆍ 좌표(N/W): 36,442272-2,515594
ㆍ 토지 너비(m): 3
ㆍ 토지 길이(m): 4
ㆍ 실험 토지 크기: 12 m2
ㆍ 반복 실험: 3
ㆍ 처리군: 7
ㆍ 토지 수: 21
ㆍ 실지 시험 면적: 300 m2
15.6. 실험 디자인
무작위 블록 실험 디자인을 사용하였다. 실험 토지의 디자인 및 공간 분포의 그래픽 표현은 도 15에 도시된다.
15.7. 살포 개요
표 33은 살포 특성을 상세히 설명한다. 단일 살포가 이루어졌다.
Figure pct00039
15.8 효능 변수 및 데이터 포착
효능 변수 및 샘플링 시간은 표 34에 나타나 있다.
Figure pct00040
데이터 포착 일자는 다음과 같았다:
1. DAA-0: 06/08/19(살포 시간)
2. DAA-1: 07/08/19(살포 1일 후)
3. DAA-3: 09/08/19(살포 3일 후)
4. DAB-6: 12/08/19(살포 6일 후)
각각의 샘플링에서 4개의 식물을 무작위로 선택하고, 각각의 식물로부터 3개의 잎을 샘플링하였다. 성충의 수를 선택된 잎의 양면(빔 및 밑면)에 살아있는 파리를 계수하여 결정하였다. 알의 경우, 샘플링된 각각의 잎으로부터, 2 cm2의 디스크를 채취하여 입체 확대경의 도움으로 알을 계수하였다.
15.9. 성장에 대한 효과
효능 변수 이외에도, 하기 데이터를 취득하였다:
ㆍ 식물약해에 의해 피해를 입은 %면적(있을 경우).
ㆍ 익충(비-표적)에 대한 시각적 효과(내부 진단).
15.10. 데이터 처리 및 통계 분석
데이터(잎당 성충의 수 및 알 수)를 각각의 처리군 및 반복 실험에서 12개의 독립적인 측정의 수단으로 표현하였다. 관찰된 데이터(평균)를 이하에 따른 헨더슨-틸튼(Henderson-Tilton) 식을 이용하여 대조군에 대해 표현하였다:
Figure pct00041
상기 식에서,
Ta = 살포 후 처리군에서 성충/알의 수.
Tb = 살포 전 처리군에서 성충/알의 수.
Ca = 살포 후 대조군에서 성충/알의 수.
Cb = 살포 전 대조군에서 성충/알의 수.
보정된 효능 값을 일원 분산 분석(ANOVA)(p<0.05)을 이용하여 비교하였다. 평균 비교를 위해, 최소 유의차(LSD) 사후 테스트를 사용하였다. IBM® SPSS 스태티스틱스®를 분석에 이용하였다.
15.11. 결과 및 논의
가루이 성체 및 알의 수에 대한 WF_F4 조성물 및 참조 제품의 보정된 효능이 각각 표 35 및 36에 나타나 있다.
Figure pct00042
1데이터는 평균으로 표현되고, 헨더슨-틸튼 식에 의해 보정된다. 동일한 컬럼 내에 있는 동일한 문자의 평균은 상당한 차이를 나타낸다(ANOVA-LSD, ρ<0,05).
Figure pct00043
1데이터는 평균으로 표현되고, 헨더슨-틸튼 식에 의해 보정된다. 동일한 컬럼 내에 있는 동일한 문자의 평균은 상당한 차이를 나타낸다(ANOVA-LSD, ρ<0,05).
얻어진 데이터는 가루이를 방제에 있어서 명확한 제품 효능을 보여준다. 조성물 WF_F4는 살포 후 최대 6일까지 가루이 성충 및 알의 수의 매우 유의미한 수준의 감소를 보여준다. 조성물 WF_F4를 이용해 얻어진 결과는 화학 및 천연 참조 제품 둘 모두의 효능보다 명확하게 더 우수하였다.
테스트된 어떠한 약량에서도 WF_F4 조성물 및 참조 제품으로 처리된 작물에서 식물약해 증상이 검출되지 않았다. 더욱이, 실험 전반에 걸쳐서 야생동물에 대한 유익한 영향은 관찰되지 않았다.

Claims (30)

  1. - 징지베르 오피시날레 로스코(Zingiber officinale Roscoe)의 뿌리 또는 근경의 에센셜 오일, 올레오레진, 수성, 알코올성 또는 하이드로알코올성 추출물,
    - 신남알데하이드 또는 신남알데하이드의 원천, 및
    - 고체, 액체 형태 또는 유체로 존재하거나, 가수분해 또는 부분적으로 가수분해된 콩 레시틴
    에 의해 형성되는, 상승작용적 생물활성 코어를 포함하는 생물농약 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    생물활성 코어에서 각각의 구성성분의 농도가 % 중량/중량으로 하기 범위 내에 있는 생물농약 조성물:
    - 징지베르 오피시날레 로스코 유래의 에센셜 오일, 올레오레진, 수성, 알코올성 또는 하이드로알코올성 뿌리 또는 근경 추출물: 0.1-99.8%, 바람직하게는 5-30%, 보다 바람직하게는 10-25%,
    - 신남알데하이드 또는 신남알데하이드의 원천: 0.1-99.8%, 바람직하게는 10-60%, 보다 바람직하게는 30-50%, 및
    - 고체, 액체 또는 유체로 존재하거나, 가수분해 또는 부분적으로 가수분해된 콩 레시틴: 0.1-99.8%, 바람직하게는 30-80%, 보다 바람직하게는 30-50%.
  3. 제2항에 있어서,
    신남알데하이드의 원천이 이를 함유하는 식물종, 바람직하게는 속 신나모뭄 종(Cinnamomum sp.), 보다 바람직하게는 C. 베룸.- 동의어., 신나모뭄 제일라니쿰(Cinnamomum zeylanicum), C. 카시아(cassia), C. 로우레이리(loureirii), C. 버마니(burmannii), C. 타말라(tamala), C. 오스모플로윰(osmophloeum), C. 베졸고타(bejolghota), C. 두비움(dubium), C. 리불로움(rivulorum), C. 시트리오도룸 및 C. 캄포라(camphora)의 추출물/에센셜 오일인, 생물농약 조성물.
  4. 제3항에 있어서,
    신남알데하이드 및/또는 신남알데하이드 원천이 자유형(free form)인, 생물농약 조성물.
  5. 제3항에 있어서,
    신남알데하이드가 캡슐화제에 의해 캡슐화된 형태로 존재하는, 생물농약 조성물.
  6. 제5항에 있어서,
    캡슐화제가 말토덱스트린, 사이클로덱스트린, 레시틴, 식물성 오일, 및/또는 실리카겔, 콜로이드 실리카 및 실리콘 디옥사이드를 포함하는 실리카 부형제로부터 선택되고, 바람직하게는 사이클로덱스트린인, 생물농약 조성물.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    - 식물학적 추출물 또는 이의 분획물,
    - 발효 미생물로 수득된 추출물 또는 이의 분획물,
    - 제라니알-시트랄 A-, 네랄-시트랄 B-, 사포닌, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 벤질 아세테이트, 유제놀, 1,8-시네올, 티몰, 제라니올, 제라닐 아세테이트로부터 선택되는 순수 화합물, 및
    - 단쇄 및 장쇄 포화, 바람직하게는 장쇄 및 불포화 및 유도된 지방산, 예를 들어, 메틸화, 지방산 메틸 에스테르, FAME, 보다 바람직하게는 장쇄 포화 지방산 및/또는 불포화 지방산으로부터 선택되는 지방산
    으로부터 선택되는 하나 이상의 활성 요소인 제2 구성성분을 포함하는, 생물농약 조성물.
  8. 제7항에 있어서,
    식물학적 추출물이 하기 속에 속하는 식물로부터의 농산업 잔류물(agroindustrial residue), 비늘줄기(bulb), 씨앗, 잎, 골돌(follicle), 꽃 및/또는 완전 지상부(aerial part)로부터 선택되는, 생물농약 조성물:
    안젤리카 종(Angelica sp), 안노나 종(Annona sp), 아르테미시아 종(Artemisia sp.), 카룸 종(Carum sp.), 체노포디움 종(Chenopodium sp.), 시트러스 종(Citrus sp.), 코피아 종(Coffea sp.), 크로커스 종(Crocus sp.), 시아몹시스 종(Cyamopsis sp.), 킴보포곤 종(Cymbopogon sp.), 시티서스 종(Cytisus sp.), 유리코마 종(Eurycoma sp.), 피커스 종(Ficus sp.), 퓨마리아 종(Fumaria sp.), 제라늄 종(Geranium sp.), 긴크고 종(Ginkgo sp.), 헬리안투스 종(Helianthus sp.), 히소푸스 종(Hyssopus sp.), 자트로파 종(Jatropha sp.), 라반둘라 종(Lavandula sp.), 멘타 종(Mentha sp.), 모린가 종(Moringa sp.), 니겔라 종(Nigella sp.), 오시뭄 종(Ocimum sp.), 올레아 종(Olea sp.), 파파버 종(Papaver sp.), 펠라르고노늄 종(Pelargononium sp.), 페르세아 종(Persea), 페트로셀리눔 종(Petroselinum sp.), 핌피넬라 종(Pimpinella sp.), 프루너스 종(Prunus sp.), 콰시아 종(Quassia sp.), 리타마 종(Retama sp.), 리움 종(Rheum sp.), 로스마리너스 종(Rosmarinus sp.), 살비아 종(Salvia sp.), 사투레자 종(Satureja sp.), 스초에노카울론 종(Schoenocaulon), 트리고넬라 종(Trigonella sp.), 티무스 종(Thymus sp.) 및 비티스 종(Vitis sp.), 바람직하게는 하기 종:
    안젤리카 아치안젤리카(Angelica archangelica), 안노나 체리몰라(Annona cherimola), 아르테미시아 앱신티움(Artemisia absinthium), 카룸 카비(Carum carvi), 카시아 안구스티폴리아(Cassia angustifolia), 카시아 센나(Cassia senna), 체노포디움 엄브로시오이데스(ambrosioides,), 시트러스 아우란티움(aurantium), 시트러스 리몬(Citrus limon), 시트러스 시넨시스(Citrus sinensis), 코피아 아라비카(Coffea arabica), 크로커스 코르시커스(Crocus corsicus), 코르커스 사티버스(Crocus sativus), 크로커스 스페시오서스(Crocus speciosus), 크로커스 베르너스(Crocus vernus), 킴보포곤 시트라투스(Cymbopogon citratus), 시아몹시스 테트라고놀로바(Cyamopsis tetragonoloba), 킴보포곤 플렉숴수스(Cymbopogon flexuosus), 킴보포곤 마르티니(Cymbopogon martinii), 킴보포곤 나르더스(Cymbopogon nardus), 시티서스 스코파리우스(Cytisus scoparius), 유리코마 론기폴리아(Eurycoma longifolia), 피커스 카리카(Ficus carica), 퓨마리아 오피시날리스(Fumaria officinalis), 제라늄 마크로르리줌(Geranium macrorrhizum), 긴크고 빌로바(Ginkgo biloba), 헬리안투스 안누우스(Helianthus annuus), 헬리안투스 투베로섬(Helianthus tuberosum), 히소푸스 오피시날리스(Hyssopus officinalis), 자트로파 쿠르카스(Jatropha curcas), 라반둘라 안구스티폴리아(Lavandula angustifolia), 라반둘라 x 인터메디아(Lavandula x intermedia), 라반둘라 루이시에리(Lavandula luisieri), 모린가 올레이페라(Moringa oleifera), 니겔라 사티바(Nigella sativa), 오시뭄 바실리쿰(Ocimum basilicum), 올레아 유로파에아(Olea europaea), 파파버 로에아스(Papaver rhoeas), 파파버 솜니페룸(Papaver somniferum), 펠라르고늄 시트리오도룸(Pelargonium citriodorum), 펠라르고늄 그라베올렌스(Pelargonium graveolens), 페르세아 아메리카나(Persea americana), 페르세아 인디카(Persea indica), 페트로셀리눔 사티붐(Petroselinum sativum)(동의어, 피. 크리스펌(P. crispum)), 핀피넬라 아니섬(Pinpinella anisum), 프루너스 페르시카(Prunus persica), 콰시아 아마라(Quassia amara), 레타마 모노스페르마(Retama monosperma), 레타마 스파에로카르파(Retama sphaerocarpa), 리움 라바르바룸(Rheum rhabarbarum), 리움 오피시날레(Rheum officinale), 로스마리너스 오피시날리스(Rosmarinus officinalis), 살비아 라반둘리폴리아(Salvia lavandulifolia), 살비아 오피시날리스(Salvia officinalis), 사투레자 몬타나(Satureja montana), 스초에노카울론 오피시날레(Schoenocaulon officinale), 트리고넬라 포에눔-그라에쿰(Trigonella foenum-graecum), 티무스 불가리스(Thymus vulgaris), 티무스 지기스(Thymus zygis) 및 비티스 비니페라(Vitis vin
    Figure pct00044
    fera).
  9. 제7항에 있어서,
    추출물이, 바실러스 종(Bacillus sp.), 슈도모나스 종(Pseudomonas sp.), 트리코데르마 종(Trichoderma sp.) 코리네박테리움 종(Corynebacterium sp.), 아스페르길루스 종(Aspergillus sp.), 바람직하게는 아스페르길루스 니게르(Aspergillus niger), 트리코데르마 하르지아눔(Trichoderma harzianum), 바실러스 튜링겐시스(Bacillus thuringiensis), 슈도모나스 플루오레스센스(Pseudomonas fluorescens), 바실러스 아미롤리퀘펙시언스(Bacillus amyloliquefaciens), 코리네박테리움 에피시언스(Corynebacterium efficiens) 및 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)와 기질의 발효로부터 수득되는 선택 발효물인, 생물농약 조성물.
  10. 제9항에 있어서,
    발효 기질이 하기 속에 속하는 식물 유래의 농산업 잔류물, 비늘줄기, 씨앗, 잎, 골돌, 꽃 및/또는 완전 지상부로부터 선택되는, 생물농약 조성물:
    징지베르 종, 시트러스 종, 시아몹시스 종, 크로커스 종, 헬리안투스 종, 페트로셀리눔 종, 파파버 종, 리움 종, 살비아 종, 리타마 종, 라반둘라 종, 프루너스 종, 페르세아 종, 쿠르쿠마 종 및 티무스 종, 바람직하게는 아가리쿠스 비스포루스, 시아몹시스 테트라고놀로바, 헬리안투스 안누스, 시트러스 x 시넨시스(Citrus x sinensis) 및 글리신 맥스.
  11. 제7항에 있어서,
    순수 화합물이 하기 원천 중 임의의 것으로부터 수득되는, 생물농약 조성물:
    - 시트랄, 제라니알 및 네랄 이성질체의 경우, 속 킴보포곤 종 및 리테세아 종(Litsea sp.), 알로이시아 종(Aloysia sp.), 오시문 종(Ocimun sp.), 멜리사 종(Melissa sp.) 및 시트러스 종에 포함되는 종,
    - 유제놀의 경우, 속 신나모뭄 종, 시지기움 종(Syzygium sp.), 쿠르쿠마 종, 징지베르 종 및 오시뭄 종에 포함되는 종,
    - 사포닌의 경우, 속 시아몹시스 종, 쿠일라자 종(Quillaja sp.), 트리고넬라 종, 사포나리아 종(Saponaria sp.), 크로커스 종, 유카 종(Yucca sp.), 베타 종(Beta sp.), 헤데라 종(Hedera sp.), 폴리갈라 종(Polygala sp.) 및 프리뮬러 종(Primula sp.)에 포함되는 종,
    - 벤질 알코올의 경우, 속 신나모뭄 종 및 재스미눔 종(Jasminum sp.)에 포함되는 것,
    - 1.8 시네올(유칼립톨)의 경우, 속 유칼립투스 종(Eucalyptus sp.), 살비아 종, 티무스 종, 쿠르쿠마 종, 로스마리너스 종, 아르테미시아 종에 포함되는 종,
    - 제라니올의 경우, 속 로사 종(Rosa sp.), 킴보포곤 종, 제라늄 종 및 펠라르고늄 종에 포함되는 것,
    - 지방산의 경우, 속 페르세아 종, 글리시네 종(Glycine sp.), 헬라안투스 종, 올레아 종 및 다른 오일시드에 포함되는 종,
    - 생물변형 및/또는 생물전환 과정에서 곰팡이, 예컨대 아스페르길루스 종, 박테리아 및 곤충로부터 선택되는 임의의 유기체에 의해 생성되고, 구조-활성 상관관계(SAR)를 통한 순수 화합물 및/또는 유사체의 전합성, 반합성 또는 생체모방 합성.
  12. 제7항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    제2 구성성분이 자유형 또는 캡슐형으로 사용되는, 생물농약 조성물.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    생물농약 조성물 중 제2 구성성분이, 1-30%, 바람직하게는 5-25%, 보다 더 바람직하게는 10-20%의 조성물의 중량/총 부피의 농도 범위로, 생물활성 코어와 조합된, 생물농약 조성물.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    보조제, 유제, 분산제, 향미제, 방부제, 소포제, 요변제, 캡슐화 매트릭스, 지방산, 인지질 및 이들의 혼합물로부터 선택되는 하나 이상의 불활성 물질을 포함하는, 생물농약 조성물.
  15. 제14항에 있어서,
    보조제가 오가노실록산들의 군으로부터의 오가노실리콘 화합물인, 생물농약 조성물.
  16. 제14항에 있어서,
    요변제가 카복시메틸셀룰로오스, 나트륨 카복시메틸셀룰로오스, 미세결정질 셀룰로오스 및 다른 셀룰로오스 유도체, 바람직하게는 검 및 겔로부터 선택되는, 생물농약 조성물.
  17. 제14항에 있어서,
    캡슐화 매트릭스가 말토덱스트린, 사이클로덱스트린, 레시틴, 식물성 오일, 및/또는 실리카겔, 콜로이드 실리카 및 실리콘 디옥사이드를 포함하는 실리카 부형제로부터 선택되고, 바람직하게는 사이클로덱스트린인, 생물농약 조성물.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
    - 징지베르 오피시날레, 신나모뭄 베룸 및 콩 레시틴,
    - 징지베르 오피시날레, 신나모뭄 베룸, 사투레자 몬타나의 하이드로알코올성 추출물 및 콩 레시틴,
    - 징지베르 오피시날레, 신나모뭄 베룸, 콩 레시틴, 오가노실록산-종류 실리콘 유도체, β-사이클로덱스트린 및 중합성 보조제,
    - 징지베르 오피시날레, 신나모뭄 카시아, 페르세아 아메리카나, 킴보포곤 시트라투스, 콩 레시틴, 트윈-80, 오가노실록산-종류 실리콘 유도체, 카복시메틸셀룰로오스, β-사이클로덱스트린 및 중합성 보조제,
    - 징지베르 오피시날레, 신나모뭄 베룸, 페르세아 아메리카나, 아스페르길루스 종, 콩 레시틴, 오가노실록산-종류 실리콘 유도체 및 중합성 보조제,
    - 징지베르 오피시날레, 신나모뭄 카시아, 멘타 피페리타, 콩 레시틴, 오가노실록산-종류 실리콘 유도체 및 중합성 보조제,
    - 징지베르 오피시날레, 신나모뭄 카시아, 카시아 안구스티폴리아, 콩 레시틴, 오가노실록산-종류 실리콘 유도체 및 중합성 보조제,
    - 징지베르 오피시날레, 신나모뭄 카시아, 트리고넬라 포에눔-그라에쿰, 벤질 아세테이트, 콩 레시틴, 오가노실록산-종류 실리콘 유도체 및 중합성 보조제,
    - 징지베르 오피시날레, 신나모뭄 베룸, 시트랄, 벤질 벤조에이트, 콩 레시틴, 오가노실록산-종류 실리콘 유도체 및 중합성 보조제,
    - 징지베르 오피시날레, 신나모뭄 베룸, 제라니올, 벤질 아세테이트, 콩 레시틴, 오가노실록산 종류 실리콘 유도체 및 중합성 보조제,
    - 징지베르 오피시날레, 신나모뭄 베룸, 파파버 솜니페룸, 콩 레시틴, 오가노실록산-종류 유도된, 콩 레시틴 및 중합성 보조제,
    - 징지베르 오피시날레, 신나모뭄 베룸, 사투레자 몬타나 에센셜 오일, 사투레자 몬타나 추출물, 콩 레시틴, 오가노실록산-종류 실리콘 유도체 및 중합성 보조제,
    - 징지베르 오피시날레, E-신남알데하이드, 제라닐 아세테이트, 콩 레시틴, 오가노실록산-종류 실리콘 유도체 및 중합성 보조제
    를 포함하는 생물농약 조성물로부터 선택되는, 생물농약 조성물.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 정의된 조성물을 함유하고,
    생물활성 코어의 각각의 구성성분의 농도가 하기 중량/부피 농도 범위 내에 있는, 최종-살포-용액:
    - 징지베르 오피시날레 로스코의 뿌리 또는 근경 유래의 에센셜 오일, 올레오레진, 수성, 알코올성 또는 하이드로알코올성 추출물: 0.01-0.99%, 바람직하게는 0.05-0.95%, 바람직하게는 0.1-0.9%, 보다 바람직하게는 0.2-0.8%, 보다 더 바람직하게는 0.3-0.7%, 보다 바람직하게는 0.4-0.6%,
    - 신남알데하이드 또는 신남알데하이드의 원천: 0.01-0.99%, 바람직하게는 0.05-0.95%, 바람직하게는 0.1-0.9%, 보다 바람직하게는 0.2-0.8%, 보다 더 바람직하게는 0.3-0.7%, 가장 바람직하게는 0.4-0.6%, 및
    - 고체, 액체 또는 유체 형태로 존재하거나, 가수분해 또는 부분적으로 가수분해된 콩 레시틴: 0.01-0.18%, 바람직하게는 0.02-0.16%, 바람직하게는 0.03-0.15%, 보다 바람직하게는 0.04-0.14%, 보다 더 바람직하게는 0.05-0.13%, 가장 바람직하게는 0.007-0.11%.
  20. 수성 매질에, 하기 생물활성 코어의 구성성분을 혼합하는 것을 포함하는, 제1항에 정의된 생물농약 조성물을 수득하기 위한 방법:
    - 징지베르 오피시날레 로스코의 뿌리 또는 근경의 에센셜 오일, 올레오레진, 수성, 알코올성 또는 하이드로알코올성 추출물,
    - 신남알데하이드 또는 신남알데하이드의 원천, 및
    - 고체, 액체 또는 유체 형태로 존재하거나, 가수분해 또는 부분적으로 가수분해된 콩 레시틴.
  21. 제20항에 있어서,
    적어도 하나의 제2 구성성분 및/또는 적어도 하나의 불활성 물질이 첨가되는, 방법.
  22. 제20항 또는 제21항에 있어서,
    생물활성 코어의 구성성분의 혼합이 500 내지 4,000 rpm, 바람직하게는 1,500 내지 3,000 rpm의 범위의 속도로 수성 매질에서 수행되는, 방법.
  23. 제22항에 있어서,
    혼합 온도가 60 내지 120분, 바람직하게는 40 내지 100분 동안 20 내지 40℃, 바람직하게는 24 내지 35℃인, 방법.
  24. 파리 해충의 방제를 위한, 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 정의된 생물농약 조성물의 용도.
  25. 제24항에 있어서,
    바람직하게는, 속 베미시아 종(Bemisia sp.) "콤플렉스"(생물형) 디알레우로데스 종(Dialeurodes sp.), 트리알레우로데스 종(Trialeurodes sp.), 엔카르시아 종(Encarsia sp.), 알레우롤로버스 종(Aleurolobus sp.), 알레우로스릭서스 종(Aleurothrixus sp.), 알레우로디커스 종(Aleurodicus sp.), 알레이로데스 종(Aleyrodes sp.), 파라베미시아 종(Paraleyrodes sp.), 파랄레이로데스 종(Paraleyrodes sp.), 오차모플라투스 종(Orchamoplatus sp.), 시포니누스 종(Siphoninus sp.) 및 테트랄레우로데스 종(Tetraleurodes sp.)에 속하는 가루이(whitefly)의 방제를 위한 생물농약 조성물의 용도.
  26. 제24항 또는 제25항에 있어서,
    생물농약 조성물이 예방 및/또는 치유적으로 사용되는, 생물농약 조성물의 용도.
  27. 제24항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서,
    생물농약 조성물이 개별적으로 살포되거나, 다른 식물위생 제품 또는 해충 및 질병 방제 시스템과 조합하여 살포되는, 생물농약 조성물의 용도.
  28. 제27항에 있어서,
    다른 식물위생 제품 또는 해충 방제 시스템이, 특히, 살충제, 살선충제, 살비제, 살진균제, 살균제, 제초제, 식물 성장 조절제, 엘리시터(elicitor), 비료, 토양 개량제 및 먹이 유인제(bait) 중 임의의 종류를 의미하는, 생물농약 조성물의 용도.
  29. 제24항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서,
    살포가 잎 분무기(foliar spray)에 의한 것인, 생물농약 조성물의 용도.
  30. 제24항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서,
    통상적인 농업이든, 유기 농업이든, 생태학적 농업이든, 식품 및 비-식품 용도를 위한 농작물에 살포되고, 바람직하게는, 원예, 조방(extensive), 관상용 작물 및 정원용 뿐만 아니라 공원 및 스포츠 시설에 살포되는, 생물농약 조성물의 용도.
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