WO2021107692A1 - 시신경 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

시신경 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물 Download PDF

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WO2021107692A1
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optic nerve
treating
nerve disease
preventing
pharmaceutical composition
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유혜린
박미라
이후근
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의료법인 성광의료재단
가천대학교 산학협력단
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    • C12N2500/02—Atmosphere, e.g. low oxygen conditions

Definitions

  • It relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating optic nerve disease.
  • Exosomes play an important role in processes such as intercellular signal transduction and waste management. Exosomes have the potential to be used as prognosis, treatment, and biomarkers for health and disease, and interest in clinical applications is increasing recently.
  • the human optic nerve consists of about 1 million optic nerve fibers, and when 30% of the optic nerve fibers are impaired, abnormalities can be detected in the static visual field, and in 50% of the disturbances, the effect on the visual field is expressed for the first time in the dynamic field of view it is supposed to be
  • the most notable clinical symptoms for optic nerve disease are loss of vision and reduced visual field, and the treatment for them is general nursing method, introduction of low-frequency or direct current, injection of fat-soluble vitamins B1, B12, ATP, etc. into the maxillary artery, and surgery. limited to therapy.
  • One aspect is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating an optic nerve disease comprising a mesenchymal stem cell-derived exosome.
  • Another aspect comprises the steps of hypoxic culture of the mesenchymal stem cells for 10 to 60 minutes in a hypoxic state with an oxygen concentration of 1 to 5% and a carbon dioxide concentration of 3 to 10%;
  • Another aspect provides a method for preventing or treating an optic nerve disease, comprising administering the composition to a subject.
  • Another aspect provides a use for preventing or treating an optic nerve disease of a composition comprising a mesenchymal stem cell-derived exosome.
  • compositions comprising a mesenchymal stem cell-derived exosome for use in preventing or treating an optic nerve disease.
  • it provides a pharmaceutical composition for preventing or treating an optic nerve disease comprising a mesenchymal stem cell-derived exosome.
  • prevention refers to any action that inhibits or delays the onset of a disease by administration of the composition.
  • treatment refers to, to a subject suffering from or at risk of developing a disease, ameliorating the condition (eg, one or more symptoms) of the subject, delaying the progression of the disease, delaying the onset of symptoms, or treating the symptoms of the disease. means any form of treatment that provides an effect, including blunting and the like. Accordingly, the terms “treatment” and “prevention” are not intended to mean cure or complete elimination of symptoms.
  • the “individual” refers to a living organism that has or can develop an optic nerve disease. As an example, it may be a higher vertebrate including optic nerve tissue, and as another example, it may be a mammal, and another For example, it may be a primate, and as another example, it may be a rat, a mouse, a livestock, etc. including humans.
  • stem cell is a cell having the ability to differentiate into various cells through a suitable environment and stimulus, and has the ability to self-proliferate, adult stem cells, pluripotent stem cells, induced pluripotent stem cells Or it may be an embryonic stem cell.
  • the stem cells may be derived from placenta, umbilical cord blood, adipose tissue, muscle, cornea, pulp or bone marrow.
  • mesenchymal stem cell maintains self-renewal and stemness maintenance and differentiates into various mesenchymal cells or ectoderm cells such as neurons. It may refer to pluripotent stem cells having the ability, and may include mesenchymal stem cells of mammals, for example, animals including humans.
  • the mesenchymal stem cells are umbilical cord-derived, umbilical cord blood-derived, bone marrow-derived, It may be placental-derived or adipose-derived mesenchymal stem cells.Isolation of mesenchymal stem cells can be carried out by methods obvious to those skilled in the art, for example, with Pittenger et al. (Science 284: 143, 1997). van et al. (J. Clin. Invest., 58: 699, 1976), etc.
  • the mesenchymal stem cells secrete activin A or an active fragment thereof, or induce secretion thereof. It could have been entirely rigged.
  • exosome refers to a small vesicle having a membrane structure in which a multivesicular body, which is a vesicle during maturation of an endosome, fuses with a cell membrane and is discharged.
  • the discharged exosomes contain various proteins, nucleic acids, lipids, etc., and can fuse with other cells to deliver the contents.
  • the diameter of the exosome is about 30 nm to about 500 nm, about 30 nm to about 400 nm, about 30 nm to about 300 nm, about 30 nm to about 200 nm, about 50 nm to about 200 nm, about 50 nm to about 180 nm, about 75 nm to about 180 nm, or about 50 nm to about 150 nm.
  • the exosomes originate from the plasma membrane or multivesicular bodies (MVBs) and may be released or secreted out of the cell.
  • optical nerve disease or “optic nerve disorder” may refer to a disease, disorder or disorder in which the optic nerve is damaged or the pathway leading to the brain is damaged, leading to loss of vision.
  • optic nerve junction an internal structure in the brain
  • optic nerve fibers cross in different directions, and because of this anatomical arrangement, damage along the optic nerve pathway can cause certain patterns of loss of vision.
  • the stem cells provide a pharmaceutical composition for preventing or treating optic nerve disease that is derived from placenta, umbilical cord blood, adipose tissue, muscle, cornea, pulp or bone marrow.
  • placenta is made for the fetus during pregnancy and is in the form of a disk with a weight of 500 g, diameter of 15-20 cm, and thickness of about 2-3 cm.
  • One side of the placenta is in contact with the mother and the other side is in contact with the fetus, and the space between the placenta contains the mother's blood to supply nutrients to the fetus.
  • the placenta is composed of three layers: the amniotic membrane, the chorion, and the decidua.
  • the amniotic membrane is a thin, transparent membrane that surrounds the fetus and contains amniotic fluid, and the fetal stem cells are present in the amniotic membrane.
  • the decidua is a membrane formed by the transformation of the epithelial cells of the uterus for the implantation of a fertilized egg into the uterus.
  • the amount of stem cells contained in the placenta is very abundant, proliferates well and can differentiate into other cells.
  • the chorion is the membrane between the amniotic membrane and the decidua that surrounds the fetus or amniotic fluid, and it develops in a fertilized egg and constitutes a part of the egg membrane.
  • Placental stem cells are those derived from the fetus or mother (that is, they may have the genotype of either the fetus or the mother).
  • the placental stem cell population or the placental stem cell-containing cell population may include only fetal-derived or maternally-derived placental and maternal stem cells, and may include a mixed fetal and maternal stem cell population.
  • the placenta stem cells and the cell group containing the placental stem cells can be identified and selected according to the morphological markers and culture characteristics described below.
  • placenta-derived mesenchymal stem cells refers to cells that are not derived from the inner cell mass of the blastocyst.
  • Stem cells obtainable from the placenta include placental stem cells, pluripotent cells, pluripotent cells and committed progenitor cells.
  • the placenta-derived mesoderm stem cells of the present invention are derived from the chorionic valve of the placenta, and are valuable as a raw material for cell therapy using stem cells because they are derived from a single extra-embryonic mesoderm.
  • the stem cells may be cultured in a hypoxic state.
  • hypoxia may refer to a state of low oxygen partial pressure compared to the normal oxygen partial pressure of 21%.
  • the hypoxic state has an oxygen concentration of 1 to 5%.
  • the carbon dioxide concentration may be 3 to 10%.
  • the oxygen concentration may be 1-4%, 1-3%, 2-3%, and the carbon dioxide concentration may be 3-10%, 3-8%, 3-7%, 4-6% .
  • the stem cells may be exposed in a hypoxic environment for about 10 minutes to 1 hour, and cultured for a total of 24 hours to 72 hours. For example, it may be exposed for 10 minutes to 50 minutes, 20 minutes to 40 minutes, 25 minutes to 35 minutes in a hypoxic environment, and the total incubation time may be 30 to 60, 35 to 55, 40 to 55 hours.
  • the composition may increase the expression of the optic nerve regeneration protein in R28 cells.
  • the optic nerve disease may be caused by hypoxia.
  • the optic nerve disease may be caused by trauma, surgery, ischemia, hypoxia, metabolism, infection, drug addiction, immunity, inflammatory, genetic factors, tumors or brain lesions, and the like.
  • the optic nerve disease is traumatic optic neuropathy, ischemic optic neuropathy, compressive optic neuropathy, toxic optic neuropathy, Leber's hereditary optic neuropathy, optic nerve cut, optic neuritis, optic neuromyelitis or amblyopia.
  • the pharmaceutical composition may include a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the carrier is used in the sense of including excipients, diluents or adjuvants.
  • the carrier may be, for example, lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, gum acacia, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, polyvinyl pi It may be selected from the group consisting of rolidone, water, physiological saline, buffers such as PBS, methylhydroxy benzoate, propylhydroxy benzoate, talc, magnesium stearate, and mineral oil.
  • the composition may include a filler, an anti-agglomeration agent, a lubricant, a wetting agent, a flavoring agent, an emulsifying agent, a preservative, or a combination thereof.
  • the pharmaceutical composition may be prepared in any formulation according to a conventional method.
  • the composition may be formulated, for example, in an oral dosage form (eg, a powder, tablet, capsule, syrup, pill, or granule), or a parenteral dosage form (eg, an injection).
  • an oral dosage form eg, a powder, tablet, capsule, syrup, pill, or granule
  • a parenteral dosage form eg, an injection.
  • composition may be prepared as a systemic formulation or a topical formulation.
  • the pharmaceutical composition may be administered orally, intravenously, intratumorally, intramuscularly, orally, transdermally, mucosally, nasally, intratracheally, subcutaneously, or a combination thereof.
  • the pharmaceutical composition may include the stem cell-derived exosome according to an aspect in an effective amount.
  • effective amount refers to an amount sufficient to exhibit the effect of prophylaxis or treatment when administered to a subject in need thereof.
  • the effective amount can be appropriately selected by those skilled in the art depending on the cell or individual to be selected.
  • the effective amount may be from about 0.1 ⁇ g to about 2 g, from about 0.5 ⁇ g to about 1 g, from about 1 ⁇ g to about 500 mg, from about 10 ⁇ g to about 100 mg, or from about 100 ⁇ g to about 50 mg per the pharmaceutical composition. .
  • the dosage of the pharmaceutical composition may be, for example, from about 0.001 mg/kg to about 100 mg/kg, from about 0.01 mg/kg to about 10 mg/kg, or from about 0.1 mg/kg to about 1 mg/kg, based on an adult. may be in the range of kg.
  • the administration may be administered once a day, multiple times a day, or once a week, once every two weeks, once every three weeks, or once every four weeks to once a year.
  • the mesenchymal stem cells oxygen concentration of 1 to 5%, carbon dioxide concentration of 3 to 10% hypoxic culturing for 10 minutes to 60 minutes in a hypoxic state;
  • It provides a method for preparing a pharmaceutical composition for preventing or treating optic nerve disease, comprising the step of collecting the exosomes from the hypoxic cultured mesenchymal stem cells.
  • the method for preventing or treating an optic nerve disease may include administering the pharmaceutical composition for preventing or treating an optic nerve disease to a subject that is likely to develop an optic nerve disease or an optic nerve disease has already been invented.
  • a use for preventing or treating an optic nerve disease of a composition comprising a mesenchymal stem cell-derived exosome.
  • composition comprising a mesenchymal stem cell-derived exosome for use in preventing or treating optic nerve disease.
  • the pharmaceutical composition comprising the stem cell-derived exosome exhibits an excellent effect in the treatment and prevention of optic nerve disease.
  • a pharmaceutical composition for preventing or treating optic nerve disease including mesenchymal stem cell-derived exosomes, by using exosomes derived from stem cells cultured in a hypoxic environment, exhibits excellent optic nerve disease prevention or treatment, and optic nerve regeneration effect.
  • 1 is a result showing the viability of cells for 24 hours after treatment with exosomes.
  • Figure 2 is a Western blot result of intracellular optic nerve regeneration-related protein for 24 hours after treatment with exosomes.
  • 3 is a result showing the expression level of intracellular optic nerve regeneration-related protein for 24 hours after treatment with exosomes.
  • Figure 4 is a result of proteomics analysis for the change in the protein in R28 cells after treatment with the exosomes.
  • 5 is a result of comparing the protein expression level of the optic nerve regeneration-related factors in the control group and the group treated with NE or HPE.
  • Placental mesenchymal stem cells are cultured in a culture medium (MEM-alpha glutamax + 10 % FBS + 1% Penicilin Streptomycin + 25 ng hFGF4 + 1 ug Heparin) until about 80% of colonies are formed in a culture dish.
  • a culture medium MEM-alpha glutamax + 10 % FBS + 1% Penicilin Streptomycin + 25 ng hFGF4 + 1 ug Heparin
  • To isolate HPE cells in culture are exposed to O 2 (2.2%) and CO 2 (5.5%) environments for 30 minutes using a hypoxic chamber. After that, it is cultured in a culture medium containing exosome-free FBS for 48 hours. After collecting the culture medium, centrifuge at 4 °C at a speed of 2000 g for 10 minutes.
  • NE naive exosomes derived from cultured placental mesenchymal stem cells
  • HPE hypoxic environment
  • R28 cells which are optic nerve progenitor cells, are seeded in a 6-well plate with a cell number of 2 ⁇ 10 5 . After 24 hours, after treatment with CoCl 2 (200 ⁇ M) for 9 hours, NE and HPE were put into CoCl 2 damaged R28 cells and incubated together. After culturing for 24 hours, cells were collected and analyzed.
  • Example 1 Example 2
  • Example 3 Example 4
  • Example 5 Example 6 R28 cells normal cells damaged cells normal cells normal cells damaged cells damaged cells Added exosomes - - NE HPE NE HPE
  • the cell viability analysis (CELL VIABILLITY ASSAY) process is as follows.
  • R28 cells are seeded in a 96-well plate with a cell number of 1.5 ⁇ 10 4 . After 24 hours, after exposure to CoCl 2 (200 ⁇ M) for 9 hours, NE and HPE are put into the cells treated with CoCl 2 and incubated. After 24 hours, using a cell counting kit (Cell Counting Kit-8, CCK-8), the cell viability was measured by the experimental method described in the kit.
  • Cell Counting Kit-8, CCK-8 Cell Counting Kit-8, CCK-8
  • Example 6 containing exosomes derived from placental mesenchymal stem cells cultured in hypoxia was higher than that of Example 5 containing exosomes derived from placental mesenchymal stem cells cultured in general. was high.
  • the process for performing proteomics is as follows. R28 cells are seeded in a 6-well plate with a cell number of 2 ⁇ 10 5 . After 24 hours, after treatment with CoCl 2 (200 ⁇ M) for 9 hours, NE and HPE are put into CoCl 2 damaged R28 cells and incubated together. After culturing for 24 hours, cells are harvested and analyzed. The cell lysate prepared in PBS buffer is subjected to protein extraction in a Covaris S2 Focused-Ultrasonicator (Covaris, Woburn, MA, USA). Put the protease inhibitor at 25X, extract the protein at 20 °C for 12 to 15 minutes, and measure the concentration of the solution using the BCA assay.
  • 0.1% formic acid 0.1% formic acid containing 80% ACN, and 0.1% formic acid are added 100 ⁇ each, and centrifuged at 3,400 x g, 4 ° C for 2 minutes for each solution to equilibrate the column. Transfer the sample solution to the column and load by centrifugation at 3,400 x g, 4 °C for 2 min. Add 50 ⁇ L of 0.1% formic acid, and centrifuge at 3,400 x g, 4 °C for 2 minutes. Transfer the column to a new 1.5 mL microtube, add 100 ⁇ L of 0.1% formic acid containing 80% ACN, and centrifuge at 3,400 x g, 4 °C for 2 min.
  • the degree of darkening of the Western blot band of the regeneration-related protein of Example 6 including exosomes derived from placental mesenchymal stem cells in hypoxia cultured cultured placental mesenchymal stem cells was derived from normal cultured placental mesenchymal stem cells. It was darker than Example 5 containing exosomes.
  • exosomes derived from placental mesenchymal stem cells cultured in a hypoxic environment had a superior optic nerve regeneration effect than exosomes derived from general placental mesenchymal stem cells. .
  • the optic nerve damaged animal model was prepared by the following procedure. Using a 6-week-old SD rat, the optic nerve behind the eye was dissected via the conjunctiva, pressed for about 3 seconds with the armless forceps, and then intra-orbital NE and HPE 300 ug were locally injected. After 4 weeks, the eyes of two rats in each treatment group were removed and the optic nerves were isolated.
  • the collected optic nerve is dissolved in Pro-Prep buffer. After measuring the protein concentration using bicinchoninic acid assay (BCA), SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) is performed with the same amount of protein. Put the membrane that has undergone the blocking process in TBST, attach the primary antibody at a ratio of 1:1000, and incubate it overnight at 4°C. The membrane washed 3 times for 10 minutes is reacted with the secondary antibody at a ratio of 1:5000, and then the washing process is performed again. After the membrane was reacted with an enhanced chemiluminescence solution (ECL solution), the expression of the target protein was measured using ImageQuant LAS 4000 (GE Healthcare Life Sciences, Little Chalfont, UK).
  • ECL solution enhanced chemiluminescence solution
  • the protein expression of optic nerve regeneration-related factors significantly increased in the experimental group injected with the exosomes compared to the disease model group (sham) that did not inject the exosomes. Confirmed. In addition, it was confirmed that the expression of optic nerve regeneration-related protein in the experimental group injected with HPE was higher than that of the NE in the experimental group injected with the exosomes.
  • the optic nerve injury animal model was produced in the same manner as in Experimental Example 5. After local injection of 300 ug of NE and HPE, 4 weeks later, the eyes of 2 rats in each treatment group were enucleated, and the cornea and lens were removed by cutting in a circular path along the Ora serrata of the retina. Retinal detachment from the ocular hemisphere was performed by positioning, and the entire retina was taken between the retina and the eye cup. The detached retina for staining is fixed in 4% paraformaldehyde. The fixed retinas are washed with PBS and then incubated with 1% Triton X-100 in PBS for 30 min at room temperature.

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Abstract

중간엽 줄기세포 유래 엑소좀을 포함하는 시신경 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 발명으로써, 더 뛰어난 시신경 재생 효과를 갖는 저산소 환경에서 배양된 태반중간엽 줄기세포로부터 유래된 엑소좀을 제공한다.

Description

시신경 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물
본 출원은 2019년 11월 28일 출원된 대한민국 특허출원 제10-2019-0156127호를 우선권으로 주장하고, 상기 명세서 전체는 본 출원의 참고문헌이다.
시신경 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
최근 연구 보고에 따르면 엑소좀은 세포 간 신호 전달 및 폐기 관리와 같은 과정에서 중요한 역할을 한다고 보고되고 있다. 엑소좀은 질병에 대한 예후, 치료 및 건강과 질병을 위한 바이오마커로 사용될 수 있는 잠재력을 갖고 있으며, 최근 임상 적용에 대한 관심이 증가하고 있다.
한편, 인간의 시신경은 약 100만개의 시신경섬유로 이루어지고, 그 30%가 장해되면 정적 시야계에서 이상을 검출할 수 있고, 50%의 장해에서는 동적 시야계에서 처음으로 시야에 영향이 발현하는 것으로 되어 있다. 시신경 질환에 대한 가장 주목할만한 임상적 증상은 시력의 상실 및 시야의 축소이며, 그에 대한 치료법은 일반 적인 간호법, 저주파 또는 직류전류의 도입, 지용성 비타민 B1, B12, ATP 제제 등의 상악골 동맥주입 등과 수술요법에 한정된다.
이러한 기술적 배경 하에서 엑소좀을 활용하여 시신경 질환을 치료 및 예방하는 연구가 활발히 진행되고 있으나(KR 공개특허 10-2019-0115725), 아직은 미비한 실정이다.
일 양상은 중간엽 줄기세포 유래 엑소좀을 포함하는 시신경 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
다른 양상은 중간엽 줄기세포를 산소농도가 1 내지 5%, 이산화탄소 농도가 3 내지 10%인 저산소 상태에서 10분 내지 60분 동안 저산소 배양하는 단계; 및
저산소 배양된 중간엽 줄기세포에서 엑소좀을 수거하는 단계를 포함하는 시신경 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물의 제조 방법을 제공하는 것이다.
다른 양상은 상기조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 시신경 질환 예방 또는 치료방법을 제공한다.
다른 양상은 중간엽 줄기세포 유래 엑소좀을 포함하는 조성물의 시신경 질환 예방 또는 치료에 사용하기 위한 용도를 제공한다.
다른 양상은 시신경 질환 예방 또는 치료에 사용하기 위한 중간엽 줄기세포 유래 엑소좀을 포함하는 조성물을 제공한다.
본 출원의 다른 목적 및 이점은 첨부한 청구범위 및 도면과 함께 하기의 상세한 설명에 의해 보다 명확해질 것이다. 본 명세서에 기재되지 않은 내용은 본 출원의 기술 분야 또는 유사한 기술 분야 내 숙련된 자이면 충분히 인식하고 유추할 수 있는 것이므로 그 설명을 생략한다.
본 출원에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
일 양상에 있어서, 중간엽 줄기세포 유래 엑소좀을 포함하는 시신경 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
용어, “예방”은 상기 조성물의 투여로 질병의 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
용어, “치료”는 질병을 앓거나 또는 질병이 발병할 위험이 있는 개체에게, 상기 개체의 상태(예를 들면, 하나 이상의 증상)의 개선, 질병 진행의 지연, 증상 발생의 지연 또는 증상 진행의 둔화 등을 포함한 효과를 제공하는 임의의 형태의 치료를 의미한다. 따라서, 상기 “치료” 및 “예방”은 증상의 치유 또는 완전한 제거를 의미하도록 의도되지 않는다.
상기 “개체”는 시신경 질환이 발병하였거나 발병할 수 있는 살아있는 유기체를 의미하는데, 일 예로서, 시신경 조직을 포함하는 고등 척추동물이 될 수 있고, 다른 예로서, 포유동물이 될 수 있으며, 또 다른 예로서, 영장류가 될 수 있고, 또 다른 예로서, 인간을 포함한 쥐, 생쥐, 가축 등이 될 수 있다.
용어, "줄기세포(stem cell)"는 적합한 환경 및 자극을 통해 각종 세포로 분화할 수 있는 능력을 갖추고 있으며, 자가 증식 능력을 갖추고 있는 세포로서, 성체줄기세포, 만능줄기세포, 유도만능줄기세포　또는 배아줄기세포일 수 있다. 상기 줄기세포는 태반, 제대혈, 지방조직, 근육, 각막, 치수 또는 골수에서 유래한 것일 수 있다.
　용어 "중간엽　줄기세포(Mesenchymal Stem Cell: MSC)는 자기재생능력(self-renewal)과　줄기세포능(stemness maintenance)을 유지하고 여러 가지 중배엽성 세포 또는 신경세포와 같은 외배엽성 세포로도 분화하는 능력을 가진 다분화능　줄기세포를 의미할 수 있고, 포유류, 예를 들면 인간을 포함한 동물의　중간엽　줄기세포를 포함할 수 있다. 또한, 상기　중간엽　줄기세포는 탯줄 유래, 제대혈 유래, 골수 유래, 태반 유래, 또는 지방 유래　중간엽　줄기세포인 것일 수 있다. 중간엽　줄기세포의 분리는 통상의 당업자에게 자명한 방법으로 수행될 수 있으며, 예를 들면, Pittenger 등(Science 284: 143, 1997)와 van 등(J. Clin. Invest., 58: 699, 1976)의 문헌들에 개시되어 있다. 상기　중간엽　줄기세포는 액티빈 A(activin A) 또는 그의 활성 단편을 분비하거나, 또는 이를 분비하도록 유전적으로 조작된 것일 수 있다.
용어 “엑소좀” 또는 “엑소솜”(exosome)이란 엔도솜(endosome)의 성숙과정 중의 소포인 다중 소포체(multivesicular　body)가 세포막과 융합하여 배출되는 막 구조의 작은 소낭을 의미할 수 있다.　배출된 엑소좀은 다양한 단백질,　핵산, 지질 등이 포함되어 있으며, 다른 세포와 융합하여 내용물을 전달할 수 있다. 상기 엑소좀의 직경은 약 30 nm 내지 약 500 nm, 약 30 nm 내지 약 400 nm, 약 30 nm 내지 약 300 nm, 약 30 nm 내지 약 200 nm, 약 50 nm 내지 약 200 nm, 약 50 nm 내지 약 180 nm, 약 75 nm 내지 약 180 nm, 또는 약 50 nm 내지 약 150 nm일 수 있다. 상기 엑소좀은 원형질막(plasma membrane) 또는 다낭체(multivesicular bodies: MVBs)으로부터 기원하여 세포 밖으로 방출 또는 분비될 수 있다.
용어 “시신경 질환” 또는 “시신경 장애”는 시신경이 손상되거나 뇌로 연결되는 경로가 손상되어 시력 상실로 이어지는 질병, 질환 또는 장애를 의미할 수 있다. 각각의 시신경은 시신경 교차라 부르는 뇌 내부 구조에서 분리되며, 시신경 섬유 중 절반은 서로 다른 쪽으로 교차하며 이러한 해부학적 배열로 인해 시신경 경로를 따라 발생하는 손상이 특정 패턴의 시력 상실을 유발할 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 줄기세포는 태반, 제대혈, 지방조직, 근육, 각막, 치수 또는 골수에서 유래한 것인 시신경 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
용어, "태반(placenta)"은 임신 중에 태아를 위해 만들어지는 것으로 무게 500 g, 지름 15~20 cm, 두께 2~3 cm 정도의 원반형태로 되어있다.　태반의 한쪽은 모체와 닿아 있고 다른 한쪽은 태아와 맞닿아 있으며 그 사이 공간에 모체의 혈액이 담겨 있어 태아에게 영양분을 공급하게 된다.　태반은 양막, 융모막, 탈락막의 3층으로 구성되어 있다. 양막은 태아를 둘러싸고 있는 얇고 투명한 막으로, 양수가 들어 있으며, 양막에는 태아의　줄기세포가 존재한다. 탈락막은 수정란이 자궁에 착상되기 위해 자궁의 상피세포가 변형되어 형성된 막으로써 모체의　줄기세포가 존재한다.　태반에 들어있는　줄기세포의 양은 아주 풍부하며 증식이 잘되고 다른세포로 분화도 가능하다. 융모막은 태아나 양수를 둘러싸고 있는 양막과 탈락막 사이에 있는 막으로, 수정란에서 발생하여 난막의 일부를 구성한다.　태반　줄기세포는 태아 또는 모체에서 유래한 것(즉 태아 아니면 모체의 유전형을 띨 수 있음)이다.　태반　줄기 세포군 또는　태반　줄기세포를 함유하는 세포군은 오로지 태아 유래 또는 오로지 모체 유래인　태반　줄기세포를 포함할 수 있고, 또 태아와 모체 유래가 섞인 혼합　태반　줄기세포군을 포함할 수도 있다. 상기　태반　줄기세포와 상기　태반　줄기세포를 함유하는 세포군은 아래에 기술하는 형태학적 표지와 배양 특성에 따라 동정되고 선택될 수 있다.
용어, "태반유래　중간엽　줄기세포"는 포배낭의 내부 세포 덩어리로부터 유도되지 않은 세포를 지칭한다.　태반으로부터 수득될 수 있는　줄기세포는　태반　줄기세포, 만능성 세포, 다능성 세포 및 수임 전구(progenitor) 세포를 포함한다. 본 발명의　태반유래　중간엽　줄기세포는　태반의 융모판막으로부터 유래한 것으로, 단일한 배아밖중배엽(extra-embryonic mesoderm)으로부터 유래되었기 때문에　줄기세포를 이용한 세포치료의 원료로써 그 가치가 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 줄기세포는 저산소 상태에서 배양된 것일 수 있다.
용어 "저산소(hypoxia)"는 통상적인 정상산소 조건인 산소 분압 21%에 비해 낮은 산소 분압 상태를 의미할 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 저산소 상태는 산소 농도가 1 내지 5%. 이산화탄소 농도가 3 내지 10%일 수 있다. 예를 들어, 산소 농도는 1 내지 4%, 1 내지 3%, 2 내지 3%일 수 있으며, 이산화탄소 농도는 3 내지 10%, 3 내지 8%, 3 내지 7%, 4 내지 6%일 수 있다.
상기 산소농도보다 낮을 시엔 줄기세포의 배양 자체가 불가능하며, 상기 산소농도보다 높을 시엔 엑소좀의 효과가 증가하는 정도가 감소한다.
일 구체예에 있어서, 상기 줄기세포는 저산소 환경에서 10분 내지 1시간 가량 노출되고, 총 24시간 내지 72시간 동안 배양된 것일 수 있다. 예를 들어, 저산소 환경에서 10분 내지 50분, 20분 내지 40분, 25분 내지 35분 노출될 수 있으며, 총 배양 시간은 30 내지 60, 35 내지 55, 40 내지 55시간일 수 있다.
상기 배양시간보다 짧을 시엔 엑소좀의 효과가 증가하는 정도가 감소하며, 상기 배양시간보다 길 시엔 줄기세포의 배양이 어려워진다.
일 구체예에 있어서, 상기 조성물은 R28 세포 내의 시신경 재생 단백질의 발현을 증가시키는 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 시신경 질환은 저산소증에 의해 유래된 것일 수 있다.
상기 시신경 질환은 외상, 수술 후, 허혈, 저산소증, 대사, 감염, 약물 중독, 면역성, 염증성, 유전적 요인, 종양 또는 뇌병변 등에 의하여 유발된 것 일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 시신경 질환은 외상성 시신경병증, 허헐성 시신경병증, 압박성 시신경병증, 독성 시신경병증, 레버씨유전성 시신경병증, 시신경 절단, 시신경염, 시신경척수염 또는 약시인 것인 것일 수 있다.
상기 약학적 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있다. 상기 담체는 부형제, 희석제 또는 보조제를 포함하는 의미로 사용된다. 상기 담체는 예를 들면, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리트리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알기네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로스, 메틸 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 생리식염수, PBS와 같은 완충액, 메틸히드록시 벤조에이트, 프로필히드록시 벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 및 미네랄 오일로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다. 상기 조성물은 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 풍미제, 유화제, 보존제, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.
상기 약학적 조성물은 통상의 방법에 따라 임의의 제형으로 준비될 수 있다. 상기 조성물은 예를 들면, 경구 투여 제형(예, 분말, 정제, 캡슐, 시럽, 알약, 또는 과립), 또는 비경구 제형(예, 주사제)으로 제형화될 수 있다.
또한, 상기 조성물은 전신 제형 또는 국부 제형으로 제조될 수 있다. 상기 약학적 조성물은 경구, 정맥내, 종양내, 근육내, 경구, 경피, 점막, 코안, 기관내, 피하, 또는 이들의 조합으로 투여될 수 있다.
상기 약학적 조성물은 일 양상에 따른 줄기세포 유래 엑소좀을 유효한 양으로 포함할 수 있다. 용어 "유효한 양"은 예방 또는 치료를 필요로 하는 개체에게 투여되는 경우 예방 또는 치료의 효과를 나타내기에 충분한 양을 말한다. 상기 유효한 양은 당업자가 선택되는 세포 또는 개체에 따라 적절하게 선택할 수 있다. 질환의 중증도, 환자의 연령, 체중, 건강, 성별, 환자의 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 사용된 조성물과 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 상기 유효한 양은 상기 약학적 조성물 당 약 0.1 ㎍ 내지 약 2 g, 약 0.5 ㎍ 내지 약 1 g, 약 1 ㎍ 내지 약 500 mg, 약 10 ㎍ 내지 약 100 mg, 또는 약 100 ㎍ 내지 약 50mg일 수 있다.
상기 약학적 조성물의 투여량은 예를 들어, 성인 기준으로 약 0.001 ㎎/kg 내지 약 100 ㎎/kg, 약 0.01 ㎎/kg내지 약 10 ㎎/kg, 또는 약 0.1 ㎎/kg 내지 약 1 ㎎/kg의 범위 내 일 수 있다. 상기 투여는 1일 1회, 1일 다회 또는 1주일에 1회, 2주일에 1회, 3주일에 1회, 또는 4주일에 1회 내지 1년에 1회 투여될 수 있다.
다른 양상에 있어서, 중간엽 줄기세포를 산소농도가 1 내지 5%, 이산화탄소 농도가 3 내지 10%인 저산소 상태에서 10분 내지 60분 동안 저산소 배양하는 단계; 및
저산소 배양된 중간엽 줄기세포에서 엑소좀을 수거하는 단계를 포함하는 시신경 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물의 제조 방법을 제공한다.
용어 “중간엽 줄기세포”, “저산소”, “엑소좀”, “시신경 질환”은 상술한 바와 같다.
다른 양상에 있어서, 상기 시신경 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 이용하여 시신경 질환을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다. 상기 시신경 질환 예방 또는 치료 방법은 상기 시신경 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 시신경 질환이 발병될 가능성이 있거나 또는 시신경 질환이 이미 발명된, 개체에 투여하는 단계를 포함할 수 있다.
다른 양상에 있어서, 중간엽 줄기세포 유래 엑소좀을 포함하는 조성물의 시신경 질환 예방 또는 치료에 사용하기 위한 용도를 제공한다.
다른 양상에 있어서, 시신경 질환 예방 또는 치료에 사용하기 위한 중간엽 줄기세포 유래 엑소좀을 포함하는 조성물을 제공한다.
용어 “중간엽 줄기세포”, “엑소좀”, “시신경 질환”은 상술한 바와 같다.
일 실시예에 이르면, 상기 줄기세포 유래 엑소좀을 포함하는 약학적 조성물은 시신경 질환 치료 및 예방에 있어 뛰어난 효과를 나타낸다.
중간엽 줄기세포 유래 엑소좀을 포함하는 시신경 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 저산소 환경에서 배양된 줄기세포에서 유래된 엑소좀을 사용함으로써, 뛰어난 시신경 질환 예방 또는 치료, 시신경의 재생 효과를 나타낸다.
도 1은 엑소좀을 처리한 후의 24시간 동안 세포의 생존률을 나타낸 결과이다.
도 2는 엑소좀을 처리한 후의 24시간 동안 세포내 시신경 재생 관련 단백질의 웨스턴 블롯 결과이다.
도 3은 엑소좀을 처리한 후의 24시간 동안 세포내 시신경 재생 관련 단백질의 발현량을 나타낸 결과이다.
도 4는 엑소좀을 처리한 후의 R28 세포 내 단백질의 변화에 대한 프로테오믹스 분석 결과이다.
도 5는 대조군과 NE 또는 HPE를 처리한 군의 시신경재생관련 인자의 단백질 발현량을 비교한 결과이다.
도 6은 대조군과 NE 또는 HPE를 처리한 군의 망막에서 시신경 마커 종류를 비교한 결과이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실험예 1. 줄기세포 유래 엑소좀의 제조
줄기세포 유래 엑소좀을 제조하기 위하여 하기와 같은 실험을 실시하였다. 이하 태반중간엽 줄기세포의 각 배양과정 및 엑소좀의 제조과정은 다음과 같다.
태반 중간엽 줄기세포를 배양 접시에 약 80% 정도의 군집이 형성될 때까지 배양액(MEM-alpha glutamax+10 % FBS + 1% Penicilin Streptomycin + 25 ng hFGF4 + 1 ug Heparin)으로 배양한다. HPE을 분리하기 위해서, 배양 중인 세포를 저산소 챔버를 이용하여 O2(2.2%), CO2(5.5%) 환경에 30분 동안 세포를 노출시킨다. 그 후 48시간동안 엑소좀-프리 FBS가 포함된 배양액에 배양한다. 배양액을 수거한 뒤 4°C 에서 2000g 의 속도로 10분간 원심 분리한다. 상층액만 수거하여 0.2 μm 포어 필터로 여과 후 원심분리 전용 튜브에 담는다. 상층액은 4°C, 4000rpm 속도로 45분간 원심 분리한다. 다시 수거한 상층액을 초원심분리기를 이용하여 4°C, 27500rpm 속도로 85분간 원심 분리한다. 원심분리 후 상층액을 제거하고 남아있는 pellet를 PBS(Phosphate-Buffered Saline)로 washing 후 다시 한번 4°C, 27500rpm 속도로 85분간 원심 분리한다. 워싱과정이 끝난 후 모아진 엑소좀을 100 μl PBS에 녹인 후 -80°C에 보관한다.
일반적으로 배양된 태반중간엽 줄기세포로부터 유래한 엑소좀(naive exosome)을 NE, 저산소 환경에서 배양된 태반중간엽 줄기세포로부터 유래한 엑소좀(hypoxia-preconditioned exosome)을 HPE로 명명하였다.
실험예 2. 줄기세포 유래 엑소좀을 처리한 R28 세포의 제조
줄기세포 유래 엑소좀이 시신경 재생에 미치는 효과를 확인하기 위하여 하기와 같은 실험을 실시하였다.
이하 각 R28의 저산소 손상을 입는 과정, 각 엑소좀을 처리하는 방법은 다음과 같다.
시신경 전구 세포인 R28 세포를 2 × 105의 세포수로 6웰 플레이트에 시딩한다. 24시간 뒤 CoCl2 (200 μM)를 9시간동안 처리한 후 NE 및 HPE를 CoCl2를 손상시킨 R28 세포에 넣어 함께 배양한다. 24시간 동안 배양 후 세포를 수거하여 분석을 진행하였다.
상기 저산소 손상을 입지 않은 정상적인 R28을 정상세포(대조군, Control), 저산소 환경으로 손상을 입은 R28을 손상세포(비교군, COCL2)라 명하고 하기 표 1과 같은 실시예를 제조하였다.
실시예1 실시예2 실시예3 실시예4 실시예5 실시예6
R28세포 정상세포 손상세포 정상세포 정상세포 손상세포 손상세포
첨가한 엑소좀 - - NE HPE NE HPE
실험예 3. R28 세포 생존률의 확인 실시예 1 내지 6의 R28 세포의 생존률을 확인하기 위하여 하기와 같은 실험을 실시하였다.
상기 세포 생존률 분석(CELL VIABILLITY ASSAY) 과정은 다음과 같다.
R28 세포를 1.5 × 104의 세포수로 96 웰 플레이트에 시딩한다. 24시간 뒤 CoCl2 (200 μM)를 9시간 동안 노출 시킨 후 NE 및 HPE를 CoCl2를 처리한 세포에 넣어 배양한다. 24시간 뒤 세포 카운팅 키트(Cell Counting Kit-8, CCK-8)을 이용하여 키트에 설명된 실험방법으로 세포의 생존률을 측정하였다.
도 1에 나타난 바와 같이, 저산소 배양된 태반중간엽 줄기세포에서 유래된 엑소좀을 포함하는 실시예 6의 세포 생존률은 일반 배양된 태반중간엽 줄기세포에서 유래된 엑소좀을 포함하는 실시예 5보다 높았다.
실험예 4. R28 세포의 시신경 재생 관련 단백질의 확인
실시예 1 내지 6의 R28 세포의 시신경 재생 관련 단백질의 발현 여부 및 발현량을 알기 위하여 하기와 같은 실험을 실시하였다.
상기 시신경 재생 관련 단백질의 웨스턴블롯 및 프로테오믹스 과정은 다음과 같다.
저산소 손상을 준 R28 세포를 수거하여 radioimmune precipitation (RIPA) 버퍼에 용해한다. Bicinchoninic acid assay(BCA)를 이용하여 단백질 농도를 측정 후 동량의 단백질로 SDS-폴리아크릴아마이드겔 전기영동(sodium dodecyl sulfate polyacrylamidegel electrophoresis, SDS-PAGE)을 진행한다. 블로킹과정을 거친 멤브레인을 TBST에 넣어 1:1000의 비율로 1차 항체를 붙여 4°C 에서 밤새 배양한다. 10분씩 3번 워싱한 멤브레인을 1:5000의 비율로 2차 항체와 반응 후 다시 워싱 과정을 진행한다. 멤브레인을 enhanced chemiluminescence solution(ECL-solution)과 반응시킨 후 ImageQuant LAS 4000 (GE Healthcare Life Sciences, Little Chalfont, UK)을 이용하여 타겟 단백질의 발현을 측정한다.
프로테오믹스(Proteomics)를 진행하기 위한 과정은 다음과 같다. R28 세포를 2 × 105의 세포수로 6 웰 플레이트에 시딩한다. 24시간 뒤 CoCl2 (200 μM)를 9시간동안 처리한 후 NE 및 HPE를 CoCl2를 손상시킨 R28 세포에 넣어 함께 배양한다. 24시간 동안 배양 후 세포를 수거하여 분석을 진행한다. PBS 버퍼에 준비된 세포 용해액은 Covaris S2 Focused-Ultrasonicator(Covaris, Woburn, MA, USA)에서 단백질 추출을 수행한다. 프로테아제 억제제는 25 X로 넣고, 12 ~ 15분 동안 20 ℃에서 단백질을 추출하여 BCA 분석을 이용하여 용액의 농도를 측정한다. 총 단백질 무게가 100 μg이 되도록 준비한 후 샘플 용액의 부피에 맞춰 최종 농도가 5 mM가 되도록 TCEP를 넣고, 37 ℃에서 30 분동안 300 rpm으로 혼합하며 배양한다. 샘플 용액을 YM-30 필터로 옮기고, 14,000 x g, 20 ℃ 에서 15분 동안 원심분리 한 뒤, UA를 200 μL 넣고, 14,000 x g, 20℃ 에서 20분 동안 원심분리하고, 동일 과정을 1회 반복한다. 샘플 용액의 부피에 맞춰 50 mM IAA in 50 mM ABC를 넣고, 25 ℃에서 30분동안 300 rpm으로 혼합하며 빛을 차단하고 배양한다. 14,000 x g, 20 ℃에서 15분 동안 원심분리 한다. UA를 100 μL 넣고, 14,000 x g, 20 ℃ 에서 15분 동안 원심분리 하고, 동일 과정을 2회 반복 진행한다. ABC를 100 μL 넣고, 14,000 x g, 20 ℃ 에서 15분 동안 원심분리 하고, 동일 과정을 2회 반복한다. 효소 대 단백질 비율이 1:50이 되도록 트립신이 포함된 50 mM ABC를 200 μL 넣고, 37 ℃에서 1분 동안 600 rpm으로 혼합하고, 37 ℃에서 18 시간 동안 배양한다. 컬렉션 튜브를 새 것으로 교체 후, 14,000 x g, 20 ℃에서 10분 동안 원심분리 한 뒤, 50 mM ABC를 40 μL 넣고, 14,000 x g, 20 ℃에서 10분 동안 원심분리 하고, 동일 과정을 1회 반복한다(마지막 필터링은 반드시 끝까지 완전하게 수행 되어야함). pH 2-3으로 만들기 위해 100 % 포름산을 15 μL 넣는다. Reverse phase micro C18 spin column에 100 % MeOH를 100 μL 넣고, 3,400 x g, 4 ℃에서 2분 동안 원심분리 하여 컨디셔닝한다. 순서대로 0.1 % 포름산, 80 % ACN을 포함하는 0.1 % 포름산, 그리고 0.1 % 포름산을 100 μ씩 넣고, 3,400 x g, 4 ℃에서 각 용액에 대해 2분 동안 원심분리 하여 컬럼을 평형화시킨다. 컬럼으로 샘플 용액을 옮기고, 3,400 x g, 4 ℃에서 2분 동안 원심분리 하여 로딩한다. 0.1 % 포름산을 50 μL 넣고, 3,400 x g, 4 ℃에서 2분 동안 원심분리 한다. 컬럼을 새 1.5 mL 마이크로 튜브에 옮기고, 80 % ACN을 포함하는 0.1 % 포름산을 100 μL 넣고, 3,400 x g, 4 ℃ 에서 2분 동안 원심 분리한다. 샘플 용액을 Speed-Vac에서 건조 후, -20 ℃에 보관하거나, LC-MS 분석을 진행한다. LC-MS 분석 후, 로우 파일은 MaxQuant를 이용하여 tandem MS sequence database search를 수행한다. 조사된 단백질은 FDR ≤ 1 %로 컷-오프하고, Output quantification data는 Perseus에서 통계적으로 분석되어 fold change는 ≥ 2 로, p-value는 ≤ 5 %로 컷-오프한다. 프로테오믹스의 결과는 도 4에 나타난 바와 같다.
도 2에 나타난 바와 같이, 저산소 배양된 태반중간엽 줄기세포에서 유래된 엑소좀을 포함하는 실시예 6의 재생 관련 단백질의 웨스턴 블롯 띠의 진함의 정도는 일반 배양된 태반중간엽 줄기세포에서 유래된 엑소좀을 포함하는 실시예 5보다 진했다.
도 3에 나타난 바와 같이, 저산소 배양된 태반중간엽 줄기세포에서 유래된 엑소좀을 포함하는 실시예 6의 재생 관련 단백질의 상대적인 발현 정도가 일반 배양된 태반중간엽 줄기세포에서 유래된 엑소좀을 포함하는 실시예 5보다 높았다.
상기 실험예 3 및 4에서 나타난 바와 같이, 저산소 환경에서 배양된 태반중간엽 줄기세포로부터 유래된 엑소좀이 일반적인 태반중간엽 줄기세포로부터 유래된 엑소좀보다 더 뛰어난 시신경 재생 효과를 가지는 것을 확인할 수 있었다.
실험예 5. 시신경손상동물모델에서의 시신경 재생 관련 단백질 발현의 확인
시신경손상동물모델에서의 시신경 재생관련된 단백질의 발현량을 확인하기 위하여 하기와 같은 실험을 실시했다.시신경손상동물모델은 하기와 같은 과정으로 제조되었다. 6주령의 SD rat을 이용하여 결막을 경유하여 접근하여 안구 뒤편 시신경을 박리하여 무구포셉으로 약 3초간 눌러 압박한 뒤 안와내 NE 및 HPE 300 ug을 국소 주사하였다. 4주 뒤 각 치료군에서 2 마리의 쥐의 안구를 적출 한 후 시신경을 분리하였다.
수거한 시신경을 Pro-Prep 버퍼에 용해한다. Bicinchoninic acid assay (BCA)를 이용하여 단백질 농도를 측정 후 동량의 단백질로 SDS-폴리아크릴아마이드겔 전기영동 (sodium dodecyl sulfate polyacrylamidegel electrophoresis, SDS-PAGE)을 진행한다. 블로킹과정을 거친 멤브레인을 TBST에 넣어 1:1000의 비율로 1차 항체를 붙여 4°C 에서 밤새 배양한다. 10분씩 3번 워싱한 멤브레인을 1:5000의 비율로 2차 항체와 반응 후 다시 워싱 과정을 진행한다. 멤브레인을 enhanced chemiluminescence solution(ECL solution)과 반응시킨 후 ImageQuant LAS 4000 (GE Healthcare Life Sciences, Little Chalfont, UK)을 이용하여 타겟 단백질의 발현을 측정한다.
그 결과 도 5에 나타난 바와 같이, 엑소좀을 주사하지 않은 질환모델군(sham)에 비해 엑소좀을 주사한 실험군에서 시신경재생관련 인자(Vegf, Gap43, Neuroflament)들의 단백질 발현이 유의성있게 증가함을 확인하였다. 또한 엑소좀을 주사한 실험군에서 NE보다 HPE를 주사한 실험군의 시신경재생관련 단백질의 발현이 더 증가한 것을 확인할 수 있었다.
이는 곧, HPE를 주사할 경우 시신경 재생관련 단백질 발현량이 증가하여, 시신경 재생을 촉진하는 효과가 발생함을 의미한다.
실험예 6. 시신경손상동물모델에서의 시신경 마커 발현의 확인
시신경동물손상모델의 망막에서의 시신경 마커 발현을 확인하기 위하여 하기와 같은 실험을 실시했다.
시신경손상동물모델은 실험예 5와 동일한 과정으로 제작되었다. NE 및 HPE 300 ug을 국소 주사한 후 4주 뒤 각 치료군에서 2 마리의 쥐의 안구를 적출 한 후 망막의 거상연(Ora serrata)를 따라 원형 경로로 절단하여 각막과 렌즈를 제거한다. 안구 반구에서 망막 분리는 위치를 지정하여 수행되었고, 망막과 안구 반구 (eye cup) 사이에서 망막 전체를 채취 하였다. 염색을 위해 분리한 망막을 4% 파라포름알데히드에 고정시킨다. 고정한 망막을 PBS로 세척 한 다음 PBS에서 1% Triton X-100과 함께 실온에서 30 분 동안 배양한다. 망막을 20% 우 태아 혈청에서 1 시간 동안 차단 한 다음 anti-tuj1 및 anti-Brn-3a 항체를 4° C에서 밤새 1:10으로 희석한다. 망막을 PBS-T로 세척하고 FITC 또는 Alexa Fluor 555 2차 항체를 1 : 200으로 실온에서 2 시간 동안 배양한다. 다시 PBS-T로 다시 세척 후 커버 슬립에 결합시킨다. 공 초점 현미경 (Confocal microscope; LSM 880; Carl Zeiss, Jena, Germany)을 사용하여 이미지는 얻은 후, 전체 망막을 네 부위로 나눈 뒤 각각의 부위에서 단백질의 발현을 정량하여 통계 분석을 진행한다.
그 결과 도 6에 나타난 바와 같이, 정상 망막에 비해 시신경 압박을 받은 대조군(sham)에서 유의성있게 Brn-3a와 Tuj1의 발현이 감소됨을 확인하였다. 엑소좀을 주사한 군의 경우 감소된 Brn-3a와 Tuj1의 발현이 유의미하게 회복됨을 확인하였다. 엑소좀을 주사한 실험군에서 NE보다 HPE를 주사한 실험군의 시신경재생관련 마커의 발현이 더 증가한 것을 확인할 수 있었다.
이는 곧, HPE를 주사할 경우 시신경 재생을 촉진하는 효과가 발생함을 의미한다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims (12)

  1. 중간엽 줄기세포 유래 엑소좀을 포함하는 시신경 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 줄기세포는 태반, 제대혈, 지방조직, 근육, 각막, 치수 또는 골수에서 유래한 것인 시신경 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 줄기세포는 저산소 상태에서 배양된 것인 시신경 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  4. 청구항 3에 있어서, 상기 저산소 상태는 산소농도가 1 내지 5%, 이산화탄소 농도가 3 내지 10%인 것인 시신경 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  5. 청구항 4에 있어서, 상기 줄기세포는 10분 내지 60분 동안 저산소 상태에 노출시킨 것인 시신경 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 조성물은 R28 세포 내의 시신경 재생 단백질의 발현을 증가시키는 것인 시신경 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  7. 청구항 1에 있어서, 상기 시신경 질환은 저산소증에 의해 유래된 것인 시신경 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  8. 청구항 1에 있어서, 상기 시신경 질환은 외상성 시신경병증, 허헐성 시신경병증, 압박성 시신경병증, 독성 시신경병증, 레버씨유전성시신경병증, 시신경 절단, 시신경염, 시신경척수염 또는 약시인 것인, 시신경 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  9. 중간엽 줄기세포를 산소농도가 1 내지 5%, 이산화탄소 농도가 3 내지 10%인 저산소 상태에서 10분 내지 60분 동안 저산소 배양하는 단계; 및
    저산소 배양된 중간엽 줄기세포에서 엑소좀을 수거하는 단계를 포함하는 시신경 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물의 제조 방법.
  10. 청구항 1의 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 시신경 질환 예방 또는 치료방법.
  11. 중간엽 줄기세포 유래 엑소좀을 포함하는 조성물의 시신경 질환 예방 또는 치료에 사용하기 위한 용도.
  12. 시신경 질환 예방 또는 치료에 사용하기 위한 중간엽 줄기세포 유래 엑소좀을 포함하는 조성물.
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