WO2021101145A1 - 소광자 및 이의 용도 - Google Patents

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WO2021101145A1
WO2021101145A1 PCT/KR2020/015592 KR2020015592W WO2021101145A1 WO 2021101145 A1 WO2021101145 A1 WO 2021101145A1 KR 2020015592 W KR2020015592 W KR 2020015592W WO 2021101145 A1 WO2021101145 A1 WO 2021101145A1
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substituted
unsubstituted
quencher
nucleic acid
formula
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PCT/KR2020/015592
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Inventor
김태영
마산타고우탐
이도민
송주만
제종태
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에스에프씨 주식회사
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D403/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00
    • C07D403/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00 containing two hetero rings
    • C07D403/06—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00 containing two hetero rings linked by a carbon chain containing only aliphatic carbon atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09B—ORGANIC DYES OR CLOSELY-RELATED COMPOUNDS FOR PRODUCING DYES, e.g. PIGMENTS; MORDANTS; LAKES
    • C09B23/00—Methine or polymethine dyes, e.g. cyanine dyes
    • C09B23/02—Methine or polymethine dyes, e.g. cyanine dyes the polymethine chain containing an odd number of >CH- or >C[alkyl]- groups
    • C09B23/08—Methine or polymethine dyes, e.g. cyanine dyes the polymethine chain containing an odd number of >CH- or >C[alkyl]- groups more than three >CH- groups, e.g. polycarbocyanines
    • C09B23/083—Methine or polymethine dyes, e.g. cyanine dyes the polymethine chain containing an odd number of >CH- or >C[alkyl]- groups more than three >CH- groups, e.g. polycarbocyanines five >CH- groups
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D403/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00
    • C07D403/14—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00 containing three or more hetero rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C07H21/04—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with deoxyribosyl as saccharide radical
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C09B23/00—Methine or polymethine dyes, e.g. cyanine dyes
    • C09B23/02—Methine or polymethine dyes, e.g. cyanine dyes the polymethine chain containing an odd number of >CH- or >C[alkyl]- groups
    • C09B23/06—Methine or polymethine dyes, e.g. cyanine dyes the polymethine chain containing an odd number of >CH- or >C[alkyl]- groups three >CH- groups, e.g. carbocyanines

Definitions

  • the present invention relates to a quencher exhibiting a quenching effect for a fluorescent substance exhibiting luminescence properties at an excited energy level and various uses thereof.
  • a quencher refers to a molecule capable of quenching the fluorescence of a fluorescent molecule, and generally, a dye having a characteristic capable of absorbing light is used.
  • the mechanism of quenching is known to occur through aggregation of dyes such as fluorescence resonance energy transfer (FRET), photo-induced electron transfer, and H-dimer formation.
  • FRET fluorescence resonance energy transfer
  • the range of the absorption wavelength of the quenching dye encompasses (overlaps) a significant part or the entire region of the wavelength region of the fluorescence represented by the fluorescent dye.
  • the length between the fluorescent dye and the quencher is also important in obtaining the quenching effect.
  • the number of bases in the case of DNA and the number of amino acids in the case of peptides/proteins are considered. And it also controls the length of the linker to which the quencher is labeled.
  • a dye structure that does not emit light and can only absorb is generally selected, but a combination of fluorescent-fluorescent dyes using the FRET phenomenon is also widely used.
  • the fluorescence-quenching and fluorescence-fluorescent dyes combined in this way restore or increase their original fluorescence when the distance between them increases or when they are separated from within the biomolecule, so that they can give a kind of on/off function of fluorescence.
  • biosensors or activation probes that can respond to biomarkers such as specific proteins/enzymes.
  • Fluorescent or quenching dyes used in the bio field are limited to FDA-approved dyes such as indocyanine green or methylene blue when used alone, and a reactive group capable of binding to a substituent of a biomolecule is generally introduced. . Although various types of reactive groups are known, substituent selectivity, reaction rate, yield, reproducibility, stability, etc. have been verified for a long time by many researchers, and recently, the reactive groups introduced into dyes for actual research or commercial purposes are limited to a few. Has been.
  • succinimidyl ester and isothiocyanate are the most commonly used reactive groups for the purpose of bonding with amine groups of protein molecules, and the most common reactive groups for bonding with thiol groups of protein molecules.
  • Maleimide is used, and dichlorotriazine is mainly selected as a reactive group for the purpose of binding to a hydroxy group of a protein molecule.
  • the reactive groups are bonded through a substitution reaction or it is difficult to maintain long-term reaction and storage stability in aqueous conditions.
  • An object of the present invention is to provide a novel quencher as a compound that can be widely used for observing the identification of biomolecules in the field of optical imaging.
  • an object of the present invention is to provide a nucleic acid detection oligonucleotide comprising the novel quencher, a composition, a support, and a nucleic acid detection method.
  • a quencher represented by Formula 1 below is provided.
  • R 1 and R 2 are each conjugated with a and b, b and c or c and d of the following formula (2),
  • Ar 1 is selected from substituted or unsubstituted aryl, substituted or unsubstituted heteroaryl and Formula 2,
  • n is an integer of 1 to 3
  • R 3 to R 19 are each independently hydrogen, deuterium, substituted or unsubstituted C1-C10 alkyl, substituted or unsubstituted C1-C10 heteroalkyl containing at least one hetero atom, or substituted or unsubstituted C2-C10 Alkenyl, substituted or unsubstituted C2-C10 alkynyl, substituted or unsubstituted C 3 -C 20 cycloalkyl, substituted or unsubstituted C1-C10 alkoxy, substituted or unsubstituted aryloxy, substituted or unsubstituted C1-C10 haloalkyl, halogen, cyano, hydroxy, substituted or unsubstituted amino, substituted or unsubstituted amide, carbamate, sulfhydryl, nitro, carboxyl, carboxylate, substituted or unsubstituted Aryl, substituted or unsubstituted heteroaryl,
  • R 5 and R 6 are each independently present or linked to each other to form a ring
  • R 7 and R 8 are each independently present or linked to each other to form a ring
  • R 18 and R 19 are each independently present or linked to each other to form a ring
  • L 1 and L 3 are a single bond or a linker containing 1 to 40 non-hydrogen atoms
  • L 2 and L 4 are a linker containing 1 to 40 non-hydrogen atoms.
  • an oligonucleotide comprising the quencher, a minor groove binder (MGB), and a fluorophore.
  • composition for detecting a nucleic acid comprising the oligonucleotide is provided.
  • a support for detecting a nucleic acid comprising the quencher, a support, and a linker connecting the quencher and the support.
  • a target nucleic acid a reagent necessary for amplifying the target nucleic acid, and an oligonucleotide comprising the quencher, a minor groove binder (MGB), and a fluorophore
  • a reaction mixture comprising,
  • a target nucleic acid a reagent necessary for amplifying the target nucleic acid, and an oligonucleotide comprising the quencher, a minor groove binder (MGB), and a fluorophore
  • MGB minor groove binder
  • the present invention relates to a quencher exhibiting a quenching effect for a fluorescent material exhibiting luminescence properties at an excited energy level, and various uses thereof.
  • the quencher according to the present invention exhibits excellent quenching characteristics due to high quenching efficiency compared to the existing quencher. I can.
  • a quencher represented by Formula 1 below is provided.
  • R 1 and R 2 are each conjugated with a and b, b and c or c and d of the following formula (2),
  • Ar 1 is selected from substituted or unsubstituted aryl, substituted or unsubstituted heteroaryl and Formula 2,
  • n is an integer of 1 to 3
  • R 3 to R 19 are each independently hydrogen, deuterium, substituted or unsubstituted C1-C10 alkyl, substituted or unsubstituted C1-C10 heteroalkyl containing at least one hetero atom, or substituted or unsubstituted C2-C10 Alkenyl, substituted or unsubstituted C2-C10 alkynyl, substituted or unsubstituted C 3 -C 20 cycloalkyl, substituted or unsubstituted C1-C10 alkoxy, substituted or unsubstituted aryloxy, substituted or unsubstituted C1-C10 haloalkyl, halogen, cyano, hydroxy, substituted or unsubstituted amino, substituted or unsubstituted amide, carbamate, sulfhydryl, nitro, carboxyl, carboxylate, substituted or unsubstituted Aryl, substituted or unsubstituted heteroaryl,
  • At least one of the substituents of R 3 to R 19 and Ar 1 in the quencher represented by Formula 1 may be a substituted or unsubstituted amino group.
  • at least one of the substituents of Ar 1 may be a substituted or unsubstituted amino group.
  • the amino group may be a mono- or di-substituted amino group.
  • the substituent included in the mono- or di-substituted amino group is bonded to the nitrogen of the amino group, and the substituent may be a functional group and/or a reactive group identical to the definition of R 3 to R 19 described above.
  • the substituent bonded to the nitrogen of the amino group is hydrogen, deuterium, substituted or unsubstituted C1-C10 alkyl, substituted or unsubstituted C2-C10 alkenyl, substituted or unsubstituted C 3 -C 20 cycloalkyl , Substituted or unsubstituted aryl, substituted or unsubstituted heteroaryl, or substituted or unsubstituted aralkyl.
  • the substituent bonded to the nitrogen of the amino group may be linked to another substituent bonded to the nitrogen to form a ring, or may be linked to a substituent other than the amino group to form a ring.
  • R 5 and R 6 may each independently exist as the above-described functional groups, but in some embodiments, they are linked to each other to form a ring (e.g., a four-membered ring, a five-membered ring).
  • a ring, a 6-membered ring or a ring consisting of more than one atom, a fused ring in which a plurality of rings are fused, etc. can be formed.
  • R 7 and R 8 may each independently exist as the above-described functional groups, but in some embodiments, they are linked to each other to form a ring (e.g., a four-membered ring, a five-membered ring).
  • a ring, a 6-membered ring or a ring consisting of more than one atom, a fused ring in which a plurality of rings are fused, etc. can be formed.
  • R 18 and R 19 may each independently exist as the above-described functional groups, but in some embodiments, they are linked to each other to form a ring (e.g., a four-membered ring, a five-membered ring).
  • a ring e.g., a four-membered ring, a five-membered ring.
  • R 3 to R 19 of R 5 and R 6 , R 7 and R 8, and R 18 and R 19 are all linked to each other to form a ring (e.g., a four-membered ring, a five-membered ring, a six-membered ring Or a ring consisting of more atoms, a fused ring in which a plurality of rings are fused, etc.) can be formed.
  • a ring e.g., a four-membered ring, a five-membered ring, a six-membered ring Or a ring consisting of more atoms, a fused ring in which a plurality of rings are fused, etc.
  • any carbon in the ring is deuterium, substituted or unsubstituted C 1 -C 40 alkyl, substituted or unsubstituted C 1 -C 40 heteroalkyl containing at least one hetero atom, Substituted or unsubstituted C 2 -C 40 alkenyl, substituted or unsubstituted C 2 -C 40 alkynyl, substituted or unsubstituted C 1 -C 40 alkoxy, substituted or unsubstituted aryloxy, substituted or unsubstituted C 1 -C 40 haloalkyl, halogen, cyano, hydroxy, substituted or unsubstituted amino, substituted or unsubstituted amide, carbamate, sulfhydryl, nitro, carboxyl, carboxylate, substitute
  • R 14 to R 17 may each independently exist as the above-described functional groups, but in some embodiments, they are connected to each other.
  • Adjacent substituents among R 14 to R 17 may be linked to each other to form a ring (e.g., a four-membered ring, a five-membered ring, a six-membered ring or a ring consisting of more than one atom, a fused ring in which a plurality of rings are conjugated) have.
  • a ring e.g., a four-membered ring, a five-membered ring, a six-membered ring or a ring consisting of more than one atom, a fused ring in which a plurality of rings are conjugated
  • any carbon in the ring may be substituted with the same functional group and/or reactive group as defined for R 3 to R 19 described above.
  • L 1 and L 3 are a single bond or a linker containing 1 to 40 non-hydrogen atoms
  • L 2 and L 4 are a linker containing 1 to 40 non-hydrogen atoms.
  • the linker including a non-hydrogen atom refers to a group consisting of a bond of atoms such as carbon, nitrogen, and oxygen, not hydrogen.
  • the linker may include a chain and/or a ring (eg, an aromatic ring and/or an aliphatic ring) consisting of a bond of non-hydrogen atoms such as carbon, nitrogen, oxygen, and the like.
  • the linker may be a substituted or unsubstituted C 1 -C 50 alkyl or a substituted or unsubstituted C 2 -C 50 heteroalkyl including at least one hetero atom, but is not limited thereto.
  • linker containing the non-hydrogen atom may include modifications that can be identified from [Compound 1] to [Compound 22] showing specific examples of quenchers represented by Formula 1, even if not explicitly mentioned above. will be.
  • At least one of R 3 to R 19 is carboxyl, carboxyl derivative, hydroxyl, haloalkyl, diene body, aldehyde, ketone, sulfonyl halide, thiol, amine, sulfhydryl, alkene, It may be a functional group selected from epoxide and phosphoramidite, or a reactive group capable of covalently bonding to the functional group.
  • R 3 and R 4 is carboxyl, carboxyl derivative, hydroxyl, haloalkyl, diene body, aldehyde, ketone, sulfonyl halide, thiol, amine, sulfhydryl, alkene, epoxide and phosphide. It may be a functional group selected from poamidite or a reactive group capable of covalently bonding to the functional group.
  • At least one of the substituents of R 3 to R 19 and Ar 1 is carboxyl, carboxyl derivative, hydroxyl, haloalkyl, diene, aldehyde, ketone, sulfonyl halide, thiol, amine, sulf It is a functional group selected from hydryl, alkene, epoxide, and phosphoramidite, or a reactive group capable of covalently bonding to the functional group.
  • the reactive group (a) carboxyl group and derivatives thereof: N-hydroxysuccinimide ester, N-hydroxybenztriazole ester, acyl halide, acyl imidazole, thioester, p-nitrophenyl ester, Alkyl esters, alkenyl esters, alkynyl esters and aromatic esters; (b) esters, ethers, hydroxyls that can be converted to aldehydes; (c) haloalkyl which may be covalently attached to other functional groups by substitution of a halogen with a nucleophilic functional group such as, for example, an amine, carboxylate anion, thiol anion, carboanion or alkoxide ion; (d), for example, a maleimido group and a dienophile capable of a Dieels-Elder reaction; (e) aldehydes or ketones capable of forming carbonyl derivatives such as imine, hydrazone,
  • such reactive groups may be protected with a protecting group such that the reactive group does not participate in any reaction in the presence of the protecting group.
  • a protecting group such that the reactive group does not participate in any reaction in the presence of the protecting group.
  • the reactive group is hydroxyl, trialkylsilyl, 4,4-dimethoxytrityl or an analog thereof may be used as the protecting group.
  • Examples of preferred protecting groups can be found in the following references (Greene et al., PROTECTIVE GROUPS IN ORGANIC SYNTHESIS, John Wiley & Sons, New York, 1991).
  • the quencher according to various embodiments of the present invention may be labeled by binding to a target biomolecule (eg, nucleic acid) through the above-described reactive group.
  • a target biomolecule eg, nucleic acid
  • the above-described reactive groups are functional groups capable of reacting with functional groups such as amino groups, imino groups, thiol groups, or hydroxyl groups of the target biomolecule, and are amide bonds, imide bonds, urethane bonds, esters between quenchers and target biomolecules. Covalent bonds such as bonds, phosphite bonds, phosphate bonds or guanidine bonds can be formed.
  • R 1 and R 2 of Formula 1 may be conjugated to a and b, b and c or c and d of Formula 2, respectively.
  • R 1 may be conjugated with a in Formula 2
  • R 2 may be conjugated with b in Formula 2, or vice versa.
  • any carbon in the functional group is deuterium, substituted or unsubstituted C 1 -C 40 alkyl, substituted or including at least one hetero atom Unsubstituted C 1 -C 40 heteroalkyl, substituted or unsubstituted C 2 -C 40 alkenyl, substituted or unsubstituted C 2 -C 40 alkynyl, substituted or unsubstituted C 1 -C 40 alkoxy, substituted Or unsubstituted aryloxy, substituted or unsubstituted C 1 -C 40 haloalkyl, halogen, cyano, hydroxy, substituted or unsubstituted amino, substituted or unsubstituted amide, carbamate, sulfhydryl, nitrate Rho, carboxyl, carboxylate, substituted or unsubstituted aryl, substituted or unsubstituted
  • R a is alkenyl or alkynyl imidazol time, alkenyl of sp 2 - sp- mixed carbon of the hybrid carbon or alkynyl-mixed carbon or alkynyl of sp- hybrid carbon sp 2 bond of the alkenyl directly or Al It may be an indirectly bonded form by an sp 3 -hybrid carbon of an alkyl bonded to.
  • C a -C b functional group means a functional group having a to b carbon atoms.
  • C a -C b alkyl means a saturated aliphatic group including straight chain alkyl and branched alkyl and the like having a to b carbon atoms.
  • Straight chain or branched alkyl may be up to 40 in its main chain (eg, C 1 -C 10 straight chain, C 3 -C 10 branched).
  • alkyl is methyl, ethyl, n-propyl, i-propyl, n-butyl, s-butyl, i-butyl, t-butyl, pent-1-yl, pent-2-yl, pent-3-yl , 3-methylbut-1-yl, 3-methylbut-2-yl, 2-methylbut-2-yl, 2,2,2-trimethyleth-1-yl, n-hexyl, n-heptyl and n - May be octyl.
  • alkoxy herein refers to both an -O-(alkyl) group and an -O-(unsubstituted cycloalkyl) group, and is a straight-chain or branched hydrocarbon having at least one ether group and 1 to 10 carbon atoms.
  • halogen means fluoro (-F), chloro (-Cl), bromo (-Br) or iodo (-I), and haloalkyl means alkyl substituted with the above-described halogen.
  • halomethyl refers to methyl (-CH 2 X, -CHX 2 or -CX 3 ) in which at least one of the hydrogens of methyl is replaced by halogen.
  • Aralkyl herein is a functional group in which aryl is substituted with carbon of alkyl, and is a generic term for -(CH 2 ) n Ar.
  • aralkyl include benzyl (-CH 2 C 6 H 5 ) or phenethyl (-CH 2 CH 2 C 6 H 5 ).
  • aryl refers to an unsaturated aromatic ring comprising a single ring or multiple rings (preferably 1 to 4 rings) linked by conjugation or covalent bonds to each other, unless otherwise defined.
  • Non-limiting examples of aryl include phenyl, biphenyl, o-terphenyl, m-terphenyl, p-terphenyl, 1-naphthyl, 2-naphthyl, 1-anthryl, 2- Anthryl, 9-anthryl, 1-phenanthrenyl, 2-phenanthrenyl, 3--phenanthrenyl, 4--phenanthrenyl, 9-phenanthrenyl, 1-pyrenyl, 2- Pyrenyl and 4-pyrenyl.
  • Heteroaryl herein refers to a functional group in which at least one carbon atom in the aryl as defined above is substituted with a non-carbon atom such as nitrogen, oxygen or sulfur.
  • Non-limiting examples of heteroaryl include furyl, tetrahydrofuryl, phrrolyl, pyrrolidinyl, thienyl, tetrahydrothienyl, oxazolyl, isoxolyl Isoxazolyl, triazolyl, thiazolyl, isothiazolyl, pyrazolyl, pyrazolidinyl, oxadiazolyl, thiadiazolyl , Imidazolyl, imidazolinyl, pyridyl, pyridaziyl, triazinyl, piperidinyl, morpholinyl, thio Thiomorpholinyl, pyrazinyl, piperainyl, pyrimidinyl, naphth
  • Hydrocarbon ring herein or a hydrocarbon ring containing a hetero atom (heterocycloalkyl) will be understood as a cyclic structure of alkyl or heteroalkyl, respectively, unless otherwise defined.
  • Non-limiting examples of hydrocarbon rings include cyclopentyl, cyclohexyl, 1-cyclohexenyl, 3-cyclohexenyl, and cycloheptyl.
  • Non-limiting examples of hydrocarbon rings containing hetero atoms include 1-(1,2,5,6-tetrahydropyridyl), 1-piperidinyl, 2-piperidinyl, 3-piperidinyl, 4- Morpholinyl, 3-morpholinyl, tetrahydrofuran-2-yl, tetrahydrofuran-3-yl, tetrahydrothien-2-yl, tetrahydrothien-3-yl, 1-piperazinyl, 2 -Piperazinyl, etc.
  • a hydrocarbon ring or a hydrocarbon ring including a hetero atom may have a form in which a hydrocarbon ring, a hydrocarbon ring including a hetero atom, an aryl or hetero aryl is fused or covalently linked thereto.
  • the polyalkylene oxide is a water-soluble polymer functional group, polyethylene glycol (PEG), polypropylene glycol (PPG), polyethylene glycol-polypropylene glycol (PEG-PPG) copolymer and N-substituted Methacrylamide-containing polymers and copolymers.
  • Polyalkylene oxide may be additionally substituted as needed within the limit of maintaining the properties of the polymer.
  • the substitution may be a chemical bond to increase or decrease the chemical or biological stability of the polymer.
  • any carbon or terminal carbon in the polyalkylene oxide is hydroxy, alkyl ether (methyl ether, ethyl ether, propyl ether, etc.), carboxylmethyl ether, carboxyethyl ether, benzyl ether, dibenzyl methylene ether, or It may be substituted with dimethylamine.
  • the polyalkylene oxide may be polyethylene oxide (mPEG) terminated with methyl ether, where mPEG is represented by the formula of -(CH 2 CH 2 O) n CH 3, and repeating ethylene glycol
  • mPEG polyethylene oxide
  • the size of mPEG may vary depending on the size of n corresponding to the number of units.
  • the quencher represented by Formula 1 may have a structure further including a counter ion.
  • the counter ion may be appropriately selected as an organic or inorganic anion in consideration of the solubility and stability of the quencher.
  • Examples of counter ions of quenchers include phosphoric acid hexafluoride ions, halogen ions, phosphoric acid ions, perchlorate ions, periodic acid ions, antimony hexafluoride ions, hexafluoride tartaric acid
  • Inorganic acid anions such as ions, fluoroboric acid ions, and tetrafluoride ions, thiocyanate ions, benzene sulfonic acid ions, naphthalene sulfonic acid ions, p-toluene sulfonic acid ions, alkyl sulfonic acid ions, benzene carboxylic acid ions, alkylcar
  • organic acid ions such as acid ions, trihaloalkylcarboxylic acid ions, alkyl sulfonic acid ions, trihaloalkyl sulfonic acid ions, and nicotinic acid ions.
  • metal compound ions such as bisphenylditol, thiobisphenol chelate and bisdiol- ⁇ -dicentone, metal ions such as sodium and potassium, and quaternary ammonium salts may also be selected as counter ions.
  • the quencher according to an embodiment of the present invention may be represented by Formula 3 below.
  • R 21 to R 23 is the same as the definition of R 3 to R 19,
  • At least one of R 3 to R 23 is carboxyl, carboxyl derivative, hydroxyl, haloalkyl, diene body, aldehyde, ketone, sulfonyl halide, thiol, amine, sulfhydryl, alkene, epoxide and phosphorami It is a functional group selected from diet or a reactive group covalently bondable to the functional group,
  • At least one of R 3 to R 23 may be a substituted or unsubstituted amino group.
  • at least one of R 3 to R 23 may be a substituted amino group.
  • at least R 21 may be a substituted amino group.
  • the amino group may be a mono- or di-substituted amino group.
  • the substituent included in the mono- or di-substituted amino group is bonded to the nitrogen of the amino group, and as the substituent, the same functional group and/or reactive group as defined for R 3 to R 19 may be used.
  • the nitrogen group-bonded substituent of the amino group is hydrogen, deuterium, substituted or unsubstituted C1-C10 alkyl, substituted or unsubstituted C2-C10 alkenyl, substituted or unsubstituted C 3 -C 20 cycloalkyl , Substituted or unsubstituted aryl, substituted or unsubstituted heteroaryl, or substituted or unsubstituted aralkyl.
  • the substituent bonded to the nitrogen of the amino group may be linked to another substituent bonded to the nitrogen to form a ring, or may be linked to a substituent other than the amino group to form a ring.
  • the amino group in which the two substituents are linked to each other to form a ring may be defined as a heterocycloalkyl group.
  • a specific example of the quencher represented by Formula 1 is as follows.
  • the quenchers exemplified below are some examples of quenchers represented by Chemical Formula 1, and the quenchers according to the present disclosure target a quencher having a basic skeleton represented by Chemical Formula 1. That is, it should be understood that not only the quenchers exemplified below, but also the compound having a basic skeleton represented by Formula 1 exhibits an equivalent or similar level of quenching effect with respect to a fluorescent material exhibiting luminescence properties at an excited energy level.
  • the biomolecule that is the target of the quencher represented by Formula 1 disclosed herein may be at least one selected from antibodies, lipids, proteins, peptides, carbohydrates, and nucleic acids (including nucleotides).
  • lipids include fatty acids, phospholipids, and lipopolysaccharides
  • carbohydrates include monosaccharides, disaccharides, and polysaccharides (eg, dextran).
  • the biomolecule is a functional group for reacting with an arbitrary functional group of the quencher represented by Formula 1 or a reactive group bonded to the quencher represented by Formula 1, and includes amino, sulfhydryl, carbonyl, hydroxyl, It may contain at least one selected from carboxyl, phosphate and thiophosphate, or may have a derivative form thereof.
  • the biomolecule may be an oxy or deoxy polynucleic acid containing at least one selected from amino, sulfhydryl, carbonyl, hydroxyl, carboxyl, phosphate and thiophosphate, or having a derivative form thereof.
  • the quencher represented by Formula 1 is a drug, hormone (including receptor ligand) containing at least one selected from amino, sulfhydryl, carbonyl, hydroxyl, carboxyl, phosphate and thiophosphate.
  • Receptors, enzymes or enzyme substrates, cells, cell membranes, toxins, microorganisms or nano-biomaterials (polystyrene microspheres, etc.) can be used to label.
  • an oligonucleotide comprising at least one selected from quenchers represented by Chemical Formula 1.
  • Oligonucleotide refers to a polymer of one to hundreds of nucleotides, and includes all of DNA, RNA, or PNA.
  • analogs thereof for example, those in which chemical modifications have been applied to the nucleotide, or those in which sugars are attached, etc., are all included that can be easily modified by a person skilled in the art, and all single-stranded or double-stranded ones Means to include.
  • the oligonucleotide includes a probe.
  • a probe is more preferably a probe capable of complementarily binding to a target nucleic acid, but is not limited thereto.
  • the probe may be selected from nucleic acids, peptides, saccharides, oligonucleotides, proteins, antibodies, or combinations thereof, but is not limited thereto.
  • the oligonucleotide may include a fluorophore.
  • a fluorophore may be labeled at the 5'end of the oligonucleotide, and at least one selected from quenchers represented by Formula 1 may be labeled at the 3'end.
  • a probe capable of complementary binding to a target nucleic acid may be positioned between the 5'end and the 3'end.
  • fluorophore usable herein include 4-acetamido-4'-isothiocyanatostilbene-2,2'disulfonic acid, acridine and derivatives thereof, 5-(2'-aminoethyl)aminonaphthalene-1-sulfonic acid (EDANS), 4-amino-N-[3-vinylsulfonyl)phenyl]naphthalimide-3,5 disulfonate, N-(4-anilino-1-naphthyl)maleimide, anthranilamide, BODIPY, Brilliant Yellow, coumarin (7-amino -4-methylcoumarin (AMC, Coumarin 120), 7-amino-4-trifluoromethylcouluarin (Coumaran 151)) and derivatives thereof, cyano dye, cyanosine, 4',6-diaminidino-2-phenylindole (DAPI), 5', 5"-
  • DAPI diamini
  • the oligonucleotide according to the present invention may further include a minor groove binder (MGB) to improve binding power with nucleic acids.
  • MGB minor groove binder
  • oligonucleotides can be used in a variety of chemical and biological fields. In particular, it may be usefully used for real-time polymerase chain reaction or microassay, but is not limited thereto.
  • composition for detecting a nucleic acid comprising the oligonucleotide is provided.
  • composition for detecting a nucleic acid includes an enzyme and a solvent (buffer, etc.) for reaction with a target biomolecule together with an oligonucleotide including a quencher represented by Formula 1, a minor groove binder, and a fluorophore at the same time. And other reagents.
  • an organic solvent or water selected from the group consisting of phosphate buffer, carbonate buffer, and tris buffer, dimethyl sulfoxide, dimethylformamide, dichloromethane, methanol, ethanol, and acetonitrile. It can be used, and it is possible to adjust the solubility by introducing various functional groups to the quencher according to the type of solvent.
  • a support for detecting a nucleic acid comprising a quencher represented by Formula 1, a support, and a linker connecting the quencher and the support.
  • the biomolecules in the sample can be fixed on the support matrix through interaction with the quencher fixed on the support.
  • the supporting matrix is glass, cellulose, nylon, acrylamide gel, dextran, polystyrene, alginate, collagen, peptide, fibrin, hyaluronic acid, agarose, polyhydroxyethyl methacrylate, polyvinyl alcohol, polyethylene glycol, Polyethylene oxide, polyethylene glycol diacrylate, gelatin, matrigel (matrigel), polylactic acid, carboxymethyl cellulose, dextran, chitosan, latex, and may be made of at least one selected from Sepharose, in the form of beads or membranes I can.
  • the linker is a part that connects the quencher and the support, and any material capable of connecting the quencher and the support may be used as a linker intended herein.
  • the linker is a substituted or unsubstituted C 1 -C 30 alkyl, a substituted or unsubstituted C 2 -C 30 heteroalkyl containing at least one hetero atom, a substituted or unsubstituted C 6 -C 30 aryl And a substituted or unsubstituted C 3 -C 30 heteroaryl, and more specifically, it may be a chain to which 1 to 6 ethylene glycols are connected.
  • This linker connects the quencher and the support, but does not affect other reactions of the quencher or fluorophore, or the fluorescence and quenching action.
  • a method of labeling a target nucleic acid by reacting a probe labeled with a quencher may be implemented.
  • a method of labeling a biomolecule using a target-specific interaction may be implemented by introducing an appropriate reactive group to the quencher according to the type of the target biomolecule.
  • a method of identifying biomolecules labeled with quenchers through electrophoresis may be implemented.
  • a target nucleic acid to be labeled is reacted with a dye to label, while a single-chain probe nucleic acid having a base sequence complementary to the target nucleic acid is prepared, and the target nucleic acid and the probe nucleic acid denatured into the single chain are substrates.
  • the fluorescence of the target nucleic acid is measured.
  • the probe nucleic acid immobilized on the substrate in this labeling method is a cDNA library such as cDNA, a genome library, or amplified by PCR using all genomes as a template when gene expression is investigated. Can be used.
  • a suitable method can be selected according to the type of nucleic acid or the type of substrate. For example, it is also possible to use a method of electrostatically bonding to a substrate surface-treated with a cation such as polylysine using the electric charge of DNA.
  • a target nucleic acid denatured with a single chain is immobilized on a substrate and hybridized with an oligonucleotide.
  • a fluorophore is labeled at the 5'end of the oligonucleotide, and at least one selected from quenchers represented by Formula 1 is labeled at the 3'end.
  • a probe capable of complementary binding to a target nucleic acid may be positioned between the 5'end and the 3'end.
  • Hybridization is preferably performed in the range of room temperature to 70° C. and 2 to 48 hours.
  • a target nucleic acid having a base sequence complementary to the probe nucleic acid is selectively bound to the probe nucleic acid. After that, the substrate is cleaned and dried at room temperature.
  • the oligonucleotide hybridizes to the target nucleic acid by the probe, but the fluorophore at the 5'end remains quenched by the quencher at the 3'end.
  • the oligonucleotide hybridized to the target nucleic acid is extended by a polymerase, the oligonucleotide is separated and decomposed from the target nucleic acid by the exonuclease activity of the polymerase, and the fluorophore and the 3'end of the 5'end of the oligonucleotide
  • the quenchers of are separated from each other, and thus the fluorophore can emit fluorescence.
  • 2,3,3-trimethylindolenine (30 g, 0.188 mol) and 120 ml of sulfuric acid were added to a 500 mL one-neck reactor and stirred at 0°C.
  • intermediate 2 (36.3g, 0.178mol) and 950ml of 6M HCl were added and stirred.
  • Tin(II) chloride dehydrate (240.6g, 1.066mol) was added and stirred at 100°C for 2 hours.
  • the reaction was completed, it was cooled to room temperature and neutralized with NaOH. Subsequently, after extraction with MC and water, it was concentrated and dried.
  • intermediate 9 100g, 0.366mol
  • intermediate 10 86.2g, 0.439mol
  • Pd(OAc) 2 8.2g, 0.037mol
  • BINAP 22.8g, 0.037mol
  • STB 49.3g, 0.513mol
  • toluene was added and stirred under reflux. After checking TLC, it was cooled to room temperature. Subsequently, after concentration , extraction was performed with MC/H 2 O, followed by column purification.
  • N,N-diethyl-1,4-phenylenediamine 25 g, 0.152 mol
  • 3-bromo-3-methyl-2-butanone 30.1 g, 0.183 mol
  • potassium carbonate 25.2 g, 0.183 mol
  • dimethylformamide 250 mL
  • Water 100 mL was added to the reactor, stirred strongly, and extracted with ethyl acetate (100 mL x 2).
  • Anhydrous magnesium sulfate was added to the organic layer, stirred for 5 minutes, and the solid was filtered.
  • Bromo-9,9-dimethylfluorene (25g, 0.0915mol), benzophenolhydrazine (21.55g, 0.109mol), Pd 2 (dba) 3 (3.35g, 3.660mmol), BINAP ( 2.28g, 3.66 mmol), sodium-tert-butoxide (12.31g, 0.128mol), and toluene (250mL) were added and stirred at 100°C for 12 hours. The solid was filtered in a hot state over Celite. Then, the column was purified after concentration.
  • intermediate 42 (700mg, 0.89mmol), N,N'-dicyclohexylcarboimide (220mg, 1.068mmol), N-hydroxysuccinimide (123mg, 1.068mmol), dichloromethane (20mL) ) And stirred at room temperature for 1 hour. The resulting solid was filtered and purified by column.
  • FIG. 1 shows the real time PCR results of a double-labeled probe consisting of CalfluorRed ® 610 and Compound 2 in which the fluorophore and quencher, respectively .
  • Compound 2 effectively quenches the fluorescence of CalfluorRed ® 610, and PCR amplification also proceeds in an ideal pattern. Can be confirmed.

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Abstract

본 발명은 들뜬 에너지 준위에서 발광 특성을 나타내는 형광 물질에 대한 소광 효과를 나타내는 소광자와 이의 다양한 용도에 관한 것이다.

Description

소광자 및 이의 용도
본 발명은 들뜬 에너지 준위에서 발광 특성을 나타내는 형광 물질에 대한 소광 효과를 나타내는 소광자와 이의 다양한 용도에 관한 것이다.
소광자(quencher)란 형광 분자의 형광을 소광(quenching)시킬 수 있는 분자를 의미하며, 일반적으로 광을 흡수할 수 있는 특성을 갖는 염료가 사용된다.
소광 현상의 메커니즘으로는 형광 공명 에너지 전이(fluorescence resonance energy transfer, FRET), 광-유도 전자 전달(photo-induced electron transfer) 및 H-이량체 형성과 같은 염료의 응집을 통해 일어나는 것으로 알려져 있다.
형광 염료의 형광을 제어 또는 소멸시키기 위해서 소광자를 사용할 경우, 소광 염료의 흡수 파장의 범위가 형광 염료가 나타내는 형광의 파장 영역의 상당 부분 또는 전체 영역을 포괄(중첩)하는지가 가장 중요하다.
또한, 소광 효과를 얻는데 있어 형광 염료와 소광자 사이의 길이도 중요한데, 예를 들어 DNA의 경우는 염기의 개수, 펩타이드/단백질의 경우 아미노산의 개수 등이 고려되며 보다 높은 소광 효과를 얻기 위해 형광 염료 및 소광자가 표지되는 링커의 길이를 조절하기도 한다.
바이오 분야에서 상업적으로 주로 사용되는 소광자의 경우 일반적으로 빛을 내지 못하고 흡수만 가능한 염료 구조가 선택되지만, FRET 현상을 이용한 형광-형광 염료 조합도 많이 활용되고 있다. 이렇게 조합된 형광-소광, 형광-형광 염료들은 서로 간의 거리가 멀어지거나 생체분자 내에서 이탈될 경우 원래의 형광이 복원되거나 강해지게 되므로 일종의 형광의 on/off 기능을 부여할 수 있게 되며, 이러한 특성을 고려하여 특정 단백질/효소 등의 바이오 마커에 감응할 수 있는 바이오센서나 활성화 프로브 등을 설계할 때 많이 사용되고 있다.
바이오 분야에서 사용되는 형광 또는 소광 염료들의 경우 단독으로 사용되는 경우는 Indocyanine green이나 Methylene blue와 같이 FDA 승인을 받은 한정된 염료에 한하며, 일반적으로는 생체분자가 갖는 치환기에 결합할 수 있는 반응성기가 도입된다. 상기 반응성기들로는 여러 가지가 알려져 있지만, 치환기 선택성, 반응 속도, 수율, 재현성, 안정성 등이 많은 연구자들로부터 장시간 검증되어 왔으며, 최근에는 실제 연구나 상업적인 목적으로 염료에 도입되는 반응성기는 몇 가지로 한정되어 있다.
예를 들면, 단백질 분자의 아민기와 결합을 목적으로 하는 반응성기로 가장 많이 이용되는 것은 숙신이미딜 에스터와 이소티오시아네이트(isothiocyanate)이고, 단백질 분자의 티올기와 결합을 목적으로 하는 반응성기로서 가장 많이 이용되는 것은 말레이미드이며, 단백질 분자의 히드록시기와 결합을 목적으로 하는 반응성기로는 디클로로트리아진(dichlorotriazine)이 주로 선택된다.
다만, 상기 반응성기들은 치환반응으로 결합이 되거나 수용성 조건에서 장시간 반응 및 보관 안정성을 유지하기 어려운 경우가 대부분이다.
본 발명은 광학 영상 분야에서 생체분자의 동정을 관찰하기 위하여 광범위하게 사용될 수 있는 화합물로서 신규한 소광자를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 신규한 소광자를 포함하는 핵산 검출용 올리고뉴클레오타이드, 조성물, 지지체 및 핵산 검출 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상술한 기술적 과제를 해결하기 위한 본 발명의 일 측면에 따르면, 하기의 화학식 1로 표시되는 소광자가 제공된다.
[화학식 1]
Figure PCTKR2020015592-appb-img-000001
여기서,
R 1 및 R 2는 각각 하기 화학식 2의 a 및 b, b 및 c 또는 c 및 d와 접합되며,
[화학식 2]
Figure PCTKR2020015592-appb-img-000002
Ar 1은 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴 및 화학식 2로부터 선택되며,
n은 1 내지 3의 정수이며,
R 3 내지 R 19는 각각 독립적으로 수소, 중수소, 치환 또는 비치환된 C1-C10 알킬, 적어도 하나의 헤테로 원자를 포함하는 치환 또는 비치환된 C1-C10 헤테로알킬, 치환 또는 비치환된 C2-C10 알케닐, 치환 또는 비치환된 C2-C10 알키닐, 치환 또는 비치환된 C 3-C 20 사이클로알킬, 치환 또는 비치환된 C1-C10 알콕시, 치환 또는 비치환된 아릴옥시, 치환 또는 비치환된 C1-C10 할로알킬, 할로겐, 사이아노, 하이드록시, 치환 또는 비치환된 아미노, 치환 또는 비치환된 아마이드, 카바메이트, 설프하이드릴, 나이트로, 카르복실, 카르복실산염, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환 또는 비치환된 아르알킬, 4차 암모늄, 인산, 인산염, 치환된 케톤, 알데하이드, 치환된 에스터, 치환된 설포닐, 치환 또는 비치환된 설폰아마이드, 아실클로라이드, 설폰산, 설폰산염, 히드라진, 티올, 아세탈, 케탈, 포스포네이트(아인산염), 하이포아인산염, 술포히드록시, 설페이트, 아지도, 구아니디움, 케텐, 티오카르보닐, 아미노티오카르보닐, 폴리알킬렌옥사이드, 카르복실 유도체, 친다이엔체, 설포닐 할라이드, 에폭사이드 및 포스포아미디트로부터 선택되는 작용기이거나, 카르복실, 카르복실 유도체, 하이드록실, 할로알킬, 친다이엔체, 알데하이드, 케톤, 설포닐 할라이드, 티올, 아민, 설프하이드릴, 알켄, 에폭사이드 및 포스포아미디트로부터 선택되는 작용기와 공유 결합 가능한 반응성기로부터 선택되며,
R 5 와 R 6는 각각 독립적으로 존재하거나 서로 연결되어 고리를 형성하며,
R 7 와 R 8은 각각 독립적으로 존재하거나 서로 연결되어 고리를 형성하며,
R 18 와 R 19은 각각 독립적으로 존재하거나 서로 연결되어 고리를 형성하며,
L 1 및 L 3은 단결합 또는 1 내지 40개의 비수소 원자를 포함하는 링커이며, L 2 및 L 4는 1 내지 40개의 비수소 원자를 포함하는 링커이다.
또한, 본 발명의 다른 측면에 따르면, 상기의 소광자와 마이너 그루브 바인더(MGB; minor groove binder) 및 형광단을 포함하는 올리고뉴클레오타이드가 제공된다.
또한, 본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 상기의 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 핵산 검출용 조성물이 제공된다.
또한, 본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 상기의 소광자, 지지체 및 상기 소광자와 상기 지지체를 연결하는 링커를 포함하는 핵산 검출용 지지체가 제공된다.
또한, 본 발명의 또 다른 측면에 따르면, (a) 표적 핵산, 상기 표적 핵산을 증폭시키기 위해 필요한 시약 및 상기의 소광자와 마이너 그루브 바인더(MGB; minor groove binder) 및 형광단을 포함하는 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 반응 혼합물을 준비하는 단계, (b) 상기 반응 혼합물 중 표적 핵산을 중합효소 연쇄 반응에 의해 증폭하는 단계 및 (c) 상기 반응 혼합물의 형광 강도를 측정하는 단계를 포함하는 핵산 검출 방법이 제공된다.
본 발명은 들뜬 에너지 준위에서 발광 특성을 나타내는 형광 물질에 대한 소광 효과를 나타내는 소광자와 이의 다양한 용도에 관한 것으로서, 본 발명에 따른 소광자는 기존 소광자 대비 소광 효율이 높음에 따라 우수한 소광 특성을 나타낼 수 있다.
도 1은 형광단과 소광자가 각각 CalfluorRed ® 610과 화합물 2로 구성된 이중 표지 프로브의 real time PCR 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 형광단과 소광자가 각각 CalfluorRed ® 610과 화합물 6으로 구성된 이중 표지 프로브의 real time PCR 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 형광단과 소광자가 각각 CalfluorRed ® 610과 화합물 7로 구성된 이중 표지 프로브의 real time PCR 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 형광단과 소광자가 각각 CalfluorRed ® 610과 화합물 9로 구성된 이중 표지 프로브의 real time PCR 결과를 나타낸 것이다.
본 발명을 더 쉽게 이해하기 위해 편의상 특정 용어를 본원에 정의한다. 본원에서 달리 정의하지 않는 한, 본 발명에 사용된 과학 용어 및 기술 용어들은 해당 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 가질 수 있다.
또한, 문맥상 특별히 지정하지 않는 한, 단수 형태의 용어는 그것의 복수 형태도 포함하는 것이며, 복수 형태의 용어는 그것의 단수 형태도 포함할 수 있다.
본 연구는 대한민국 산업통장자원부에 의한 「우수기술연구센터(ATC) 사업(과제번호 10076988, 분자 진단을 위한 형광체와 그 응용 기술의 개발)」로부터의 조성금의 지원을 받은 것이다.
신규 소광자
본 발명의 일 측면에 따르면, 하기의 화학식 1로 표시되는 소광자가 제공된다.
[화학식 1]
Figure PCTKR2020015592-appb-img-000003
여기서,
R 1 및 R 2는 각각 하기 화학식 2의 a 및 b, b 및 c 또는 c 및 d와 접합되며,
[화학식 2]
Figure PCTKR2020015592-appb-img-000004
Ar 1은 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴 및 화학식 2로부터 선택되며,
n은 1 내지 3의 정수이며,
R 3 내지 R 19는 각각 독립적으로 수소, 중수소, 치환 또는 비치환된 C1-C10 알킬, 적어도 하나의 헤테로 원자를 포함하는 치환 또는 비치환된 C1-C10 헤테로알킬, 치환 또는 비치환된 C2-C10 알케닐, 치환 또는 비치환된 C2-C10 알키닐, 치환 또는 비치환된 C 3-C 20 사이클로알킬, 치환 또는 비치환된 C1-C10 알콕시, 치환 또는 비치환된 아릴옥시, 치환 또는 비치환된 C1-C10 할로알킬, 할로겐, 사이아노, 하이드록시, 치환 또는 비치환된 아미노, 치환 또는 비치환된 아마이드, 카바메이트, 설프하이드릴, 나이트로, 카르복실, 카르복실산염, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환 또는 비치환된 아르알킬, 4차 암모늄, 인산, 인산염, 치환된 케톤, 알데하이드, 치환된 에스터, 치환된 설포닐, 치환 또는 비치환된 설폰아마이드, 아실클로라이드, 설폰산, 설폰산염, 히드라진, 티올, 아세탈, 케탈, 포스포네이트(아인산염), 하이포아인산염, 술포히드록시, 설페이트, 아지도, 구아니디움, 케텐, 티오카르보닐, 아미노티오카르보닐, 폴리알킬렌옥사이드, 카르복실 유도체, 친다이엔체, 설포닐 할라이드, 에폭사이드 및 포스포아미디트로부터 선택되는 작용기이거나, 카르복실, 카르복실 유도체, 하이드록실, 할로알킬, 친다이엔체, 알데하이드, 케톤, 설포닐 할라이드, 티올, 아민, 설프하이드릴, 알켄, 에폭사이드 및 포스포아미디트로부터 선택되는 작용기와 공유 결합 가능한 반응성기로부터 선택될 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 화학식 1로 표시되는 소광자는 R 3 내지 R 19 및 Ar 1의 치환기 중 적어도 하나는 치환 또는 비치환된 아미노기일 수 있다. 또한, 다른 실시예에 있어서, Ar 1의 치환기 중 적어도 하나는 치환 또는 비치환된 아미노기일 수 있다.
R 3 내지 R 19 및 Ar 1의 치환기 중 적어도 하나가 치환된 아미노기인 경우, 상기 아미노기는 모노- 또는 디-치환된 아미노기일 수 있다.
상기 상기 모노- 또는 디-치환된 아미노기에 포함된 치환기는 상기 아미노기의 질소에 결합되며, 상기 치환기로는 상술한 R 3 내지 R 19의 정의와 동일한 작용기 및/또는 반응성기가 사용될 수 있다. 바람직하게는, 상기 아미노기의 질소에 결합된 치환기는 수소, 중수소, 치환 또는 비치환된 C1-C10 알킬, 치환 또는 비치환된 C2-C10 알케닐, 치환 또는 비치환된 C 3-C 20 사이클로알킬, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴 또는 치환 또는 비치환된 아르알킬일 수 있다.
또한, 상기 아미노기의 질소에 결합된 치환기는 상기 질소에 결합된 다른 치환기와 서로 연결되어 고리를 형성하거나, 상기 아미노기 외 다른 치환기와 서로 연결되어 고리를 형성할 수 있다.
상기 화학식 1로 표시되는 소광자의 구체적인 예 중 하나인 [화합물 14]를 참조하면, 만약 상기 아미노기의 질소에 결합된 치환기가 상기 질소에 결합된 다른 치환기와 서로 연결되어 고리를 형성할 경우, 두 치환기가 서로 연결되어 고리를 형성한 상기 아미노기는 헤테로사이클로알킬기로서 정의될 수도 있다.
일 실시예에 있어서, R 3 내지 R 19 중 R 5와 R 6은 상술한 작용기들로 각각 독립적으로 존재할 수 있으나, 몇몇 실시예에 있어서 서로 연결되어 고리(예를 들어, 4원자 고리, 5원자 고리, 6원자 고리 또는 그 이상의 원자로 이루어진 고리, 복수의 고리가 접합된 융합 고리 등)를 형성할 수 있다.
일 실시예에 있어서, R 3 내지 R 19 중 R 7과 R 8은 상술한 작용기들로 각각 독립적으로 존재할 수 있으나, 몇몇 실시예에 있어서 서로 연결되어 고리(예를 들어, 4원자 고리, 5원자 고리, 6원자 고리 또는 그 이상의 원자로 이루어진 고리, 복수의 고리가 접합된 융합 고리 등)를 형성할 수 있다.
일 실시예에 있어서, R 3 내지 R 19 중 R 18과 R 19는 상술한 작용기들로 각각 독립적으로 존재할 수 있으나, 몇몇 실시예에 있어서 서로 연결되어 고리(예를 들어, 4원자 고리, 5원자 고리, 6원자 고리 또는 그 이상의 원자로 이루어진 고리, 복수의 고리가 접합된 융합 고리 등)를 형성할 수 있다.
다른 실시예에 있어서, R 3 내지 R 19 중 R 5와 R 6, R 7과 R 8 및 R 18과 R 19 모두 서로 연결되어 고리(예를 들어, 4원자 고리, 5원자 고리, 6원자 고리 또는 그 이상의 원자로 이루어진 고리, 복수의 고리가 접합된 융합 고리 등)를 형성할 수 있다.
이 때, R 5와 R 6, R 7과 R 8 및 R 18과 R 19로부터 선택되는 적어도 하나의 조합이 서로 연결되어 고리를 형성할 경우, 고리 내 임의의 탄소는 중수소, 치환 또는 비치환된 C 1-C 40 알킬, 적어도 하나의 헤테로 원자를 포함하는 치환 또는 비치환된 C 1-C 40 헤테로알킬, 치환 또는 비치환된 C 2-C 40 알케닐, 치환 또는 비치환된 C 2-C 40 알키닐, 치환 또는 비치환된 C 1-C 40 알콕시, 치환 또는 비치환된 아릴옥시, 치환 또는 비치환된 C 1-C 40 할로알킬, 할로겐, 사이아노, 하이드록시, 치환 또는 비치환된 아미노, 치환 또는 비치환된 아마이드, 카바메이트, 설프하이드릴, 나이트로, 카르복실, 카르복실산염, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환 또는 비치환된 아르알킬, 4차 암모늄, 인산, 인산염, 케톤, 알데하이드, 에스터, 아실클로라이드, 설폰산 및 설폰산염, 치환 또는 비치환된 C 1-C 40 알킬티오, 치환 또는 비치환된 아릴티오, 치환 또는 비치환된 C 3-C 20 사이클로알킬, 적어도 하나의 헤테로 원자를 포함하는 치환 또는 비치환된 C 1-C 20 헤테로사이클로알킬, 치환 또는 비치환된 C 3-C 20 사이클로알케닐, 적어도 하나의 헤테로 원자를 포함하는 치환 또는 비치환된 C 2-C 20 헤테로사이클로알케닐, 치환 또는 비치환된 실릴, 치환 또는 비치환된 게르마늄, 에테르, 나이트릴, 폴리알킬렌옥사이드, 카르복실, 카르복실 유도체, 하이드록실, 할로알킬, 친다이엔체, 설포닐 할라이드, 에폭사이드 및 포스포아미디트로부터 선택되는 작용기이거나 상기 작용기와 공유 결합 가능한 반응성기으로부터 선택되는 적어도 하나로 치환될 수 있다.
또한, 상기 화학식 1의 R 1 및 R 2에 연결되는 상기 화학식 2에 있어서, R 14 내지 R 17는 상술한 작용기들로 각각 독립적으로 존재할 수 있으나, 몇몇 실시예에 있어서, 서로 연결되어
R 14 내지 R 17 중 인접한 치환기는 서로 연결되어 고리(예를 들어, 4원자 고리, 5원자 고리, 6원자 고리 또는 그 이상의 원자로 이루어진 고리, 복수의 고리가 접합된 융합 고리 등)를 형성할 수 있다.
이 때, R 14 내지 R 17 중 인접한 치환기는 서로 연결되어 고리를 형성할 경우, 고리 내 임의의 탄소는 상술한 R 3 내지 R 19의 정의와 동일한 작용기 및/또는 반응성기로 치환될 수 있다.
L 1 및 L 3은 단결합 또는 1 내지 40개의 비수소 원자를 포함하는 링커이며, L 2 및 L 4는 1 내지 40개의 비수소 원자를 포함하는 링커이다. 여기서, 비수소 원자를 포함하는 링커란 수소가 아닌, 탄소, 질소, 산소 등과 같은 원자의 결합으로 이루어진 그룹을 의미한다. 이에 따라, 링커는 탄소, 질소, 산소 등과 같은 비수소 원자의 결합으로 이루어진 사슬 및/또는 고리(예를 들어, 방향족성 고리 및/또는 지방족성 고리)를 포함할 수 있다.
보다 구체적으로, 상기 링커는 치환 또는 비치환된 C 1-C 50 알킬 또는 적어도 하나의 헤테로 원자를 포함하는 치환 또는 비치환된 C 2-C 50 헤테로알킬일 수 있으나 반드시 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 비수소 원자를 포함하는 링커는 상기에 명시적으로 언급되지 않다 하더라도, 상기 화학식 1로 표시되는 소광자의 구체적인 예를 나타낸 [화합물 1] 내지 [화합물 22]로부터 확인 가능한 변형예를 포함할 것이다.
일 실시예에 있어서, R 3 내지 R 19 중 적어도 하나는 카르복실, 카르복실 유도체, 하이드록실, 할로알킬, 친다이엔체, 알데하이드, 케톤, 설포닐 할라이드, 티올, 아민, 설프하이드릴, 알켄, 에폭사이드 및 포스포아미디트로부터 선택되는 작용기이거나 상기 작용기와 공유 결합 가능한 반응성기일 수 있다.
특히, R 3 및 R 4 중 적어도 하나는 카르복실, 카르복실 유도체, 하이드록실, 할로알킬, 친다이엔체, 알데하이드, 케톤, 설포닐 할라이드, 티올, 아민, 설프하이드릴, 알켄, 에폭사이드 및 포스포아미디트로부터 선택되는 작용기이거나 상기 작용기와 공유 결합 가능한 반응성기일 수 있다.
다른 실시예에 있어서, R 3 내지 R 19 및 Ar 1의 치환기 중 적어도 하나는 카르복실, 카르복실 유도체, 하이드록실, 할로알킬, 친다이엔체, 알데하이드, 케톤, 설포닐 할라이드, 티올, 아민, 설프하이드릴, 알켄, 에폭사이드 및 포스포아미디트로부터 선택되는 작용기이거나 상기 작용기와 공유 결합 가능한 반응성기이다.
여기서, 반응성기로는 (a) 카르복실 그룹과 이의 유도체 : N-하이드록시숙신이미드 에스터, N-하이드록시벤즈트리아졸 에스터, 아실 할라이드, 아실 이미다졸, 티오에스터, p-나이트로페닐 에스터, 알킬 에스터, 알케닐 에스터, 알키닐 에스터 및 방향족성 에스터; (b) 에스터, 에테르, 알데하이드로 전환될 수 있는 하이드록실; (c) 할로겐이 예를 들어, 아민, 카르복실레이트 음이온, 티올 음이온, 카보음이온 또는 알콕사이드 이온과 같은 친핵성 작용기로 치환됨으로써 다른 작용기에 공유적으로 부착될 수 있는 할로알킬; (d) 예를 들어, 말레이미도기와 다이엘스-엘더 반응을 할 수 있는 친다이엔체; (e) 이민, 하이드라존, 세미카바존 또는 옥심과 같은 카보닐 유도체를 형성하는 것이 가능한 알데하이드 또는 케톤; (f) 아민과 반응하여 설포아마이드를 형성하는 설포닐 할라이드; (g) 다이설파이드로 전환되거나 아실 할라이드와 반응할 수 있는 티올; (h) 아실화, 알킬화 또는 산화될 수 있는 아민 또는 설프하이드릴; (i) 고리화첨가, 아실화, 마이클 반응 등과 같은 반응을 수행할 수 있는 알켄; (j) 아민 또는 하이드록실 화합물과 반응할 수 있는 에폭사이드; (k) 포스포아미디트 및 핵산 반응에 유용한 다른 표준 작용기 등이 사용될 수 있다. 이러한 반응성기는 반응성 소광자를 합성하는데 필요한 반응에 참여하거나 간섭하지 않도록 적절히 선택될 수 있다.
다른 실시예에 있어서, 이러한 반응성기는 보호기로 보호됨으로써 반응성기가 보호기의 존재 하에 임의의 반응에 참여하지 않도록 할 수 있다. 예를 들어, 반응성기가 하이드록실인 경우, 보호기로는 트라이알킬실릴, 4,4-다이메톡시트리틸 또는 그의 유사체가 사용될 수 있다. 바람직한 보호기의 예로는 다음 참조 문헌에 기재된 내용을 참고할 수 있다(Greene et al., PROTECTIVE GROUPS IN ORGANIC SYNTHESIS, John Wiley & Sons, New York, 1991).
본 발명의 다양한 실시예에 따른 소광자는 상술한 반응성기를 통해 표적 생체분자(예를 들어, 핵산)와 결합하여 표지하는 것이 가능하다.
상술한 반응성기들은 표적 생체분자의 아미노기, 이미노기, 티올기 또는 하이드록실기 등과 같은 작용기와 반응할 수 있는 관능기로서, 소광자와 표적 생체분자 사이에 아미드 결합, 이미드 결합, 우레탄 결합, 에스터 결합, 포스파이트 결합, 포스페이트 결합 또는 구아니딘 결합과 같은 공유결합을 형성할 수 있다.
또한, 상기 화학식 1의 R 1 및 R 2는 각각 상기 화학식 2의 a 및 b, b 및 c 또는 c 및 d와 접합될 수 있다. 예를 들어, R 1이 상기 화학식 2의 a와 접합되고, R 2가 상기 화학식 2의 b와 접합될 수 있으며, 이의 역으로 접합될 수도 있다.
또한, R 3 내지 R 19 및 Ar 1 중 임의의 작용기가 치환된 경우, 상기 작용기 내 임의의 탄소는 중수소, 치환 또는 비치환된 C 1-C 40 알킬, 적어도 하나의 헤테로 원자를 포함하는 치환 또는 비치환된 C 1-C 40 헤테로알킬, 치환 또는 비치환된 C 2-C 40 알케닐, 치환 또는 비치환된 C 2-C 40 알키닐, 치환 또는 비치환된 C 1-C 40 알콕시, 치환 또는 비치환된 아릴옥시, 치환 또는 비치환된 C 1-C 40 할로알킬, 할로겐, 사이아노, 하이드록시, 치환 또는 비치환된 아미노, 치환 또는 비치환된 아마이드, 카바메이트, 설프하이드릴, 나이트로, 카르복실, 카르복실산염, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환 또는 비치환된 아르알킬, 4차 암모늄, 인산, 인산염, 케톤, 알데하이드, 에스터, 아실클로라이드, 설폰산 및 설폰산염, 치환 또는 비치환된 C 1-C 40 알킬티오, 치환 또는 비치환된 아릴티오, 치환 또는 비치환된 C 3-C 20 사이클로알킬, 적어도 하나의 헤테로 원자를 포함하는 치환 또는 비치환된 C 1-C 20 헤테로사이클로알킬, 치환 또는 비치환된 C 3-C 20 사이클로알케닐, 적어도 하나의 헤테로 원자를 포함하는 치환 또는 비치환된 C 2-C 20 헤테로사이클로알케닐, 치환 또는 비치환된 실릴, 치환 또는 비치환된 게르마늄, 에테르, 나이트릴, 폴리알킬렌옥사이드, 카르복실, 카르복실 유도체, 하이드록실, 할로알킬, 친다이엔체, 알데하이드, 케톤, 설포닐 할라이드, 티올, 아민, 설프하이드릴, 알켄, 에폭사이드 및 포스포아미디트로부터 선택되는 작용기이거나 상기 작용기와 공유 결합 가능한 반응성기로부터 선택되는 적어도 하나로 치환될 수 있다.
본원에서, R a가 알케닐 또는 알키닐일 때, 알케닐의 sp 2-혼성 탄소 또는 알키닐의 sp-혼성 탄소가 직접적으로 결합되거나 알케닐의 sp 2-혼성 탄소 또는 알키닐의 sp-혼성 탄소에 결합된 알킬의 sp 3-혼성 탄소에 의해 간접적으로 결합된 형태일 수 있다.
본원에서 C a-C b 작용기는 a 내지 b 개의 탄소 원자를 갖는 작용기를 의미한다. 예를 들어, C a-C b 알킬은 a 내지 b 개의 탄소 원자를 갖는, 직쇄 알킬 및 분쇄 알킬 등을 포함하는 포화 지방족기를 의미한다. 직쇄 또는 분쇄 알킬은 이의 주쇄에 40개 이하(예를 들어, C 1-C 10의 직쇄, C 3-C 10의 분쇄)일 수 있다.
구체적으로, 알킬은 메틸, 에틸, n-프로필, i-프로필, n-부틸, s-부틸, i-부틸, t-부틸, 펜트-1-일, 펜트-2-일, 펜트-3-일, 3-메틸부트-1-일, 3-메틸부트-2-일, 2-메틸부트-2-일, 2,2,2-트리메틸에트-1-일, n-헥실, n-헵틸 및 n-옥틸일 수 있다.
또한, 본원에서 알콕시는 -O-(알킬)기와 -O-(비치환된 사이클로알킬)기 둘 다를 의미하는 것으로, 하나 이상의 에터기 및 1 내지 10 개의 탄소 원자를 갖는 직쇄 또는 분쇄 탄화 수소이다.
구체적으로, 메톡시, 에톡시, 프로폭시, 이소프로폭시, n-부톡시, tert-부톡시, sec-부톡시, n-펜톡시, n-헥속시, 1,2-다이메틸부톡시, 사이클로프로필옥시, 사이클로부틸옥시, 사이클로펜틸옥시, 사이클로헥실옥시 등을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.　
또한, 본원에서 할로겐은 플루오로(-F), 클로로(-Cl), 브로모(-Br) 또는 요오도(-I)을 의미하며, 할로알킬은 상술한 할로겐으로 치환된 알킬을 의미한다. 예를 들어, 할로메틸은 메틸의 수소 중 적어도 하나가 할로겐으로 대체된 메틸(-CH 2X, -CHX 2 또는 -CX 3)을 의미한다.
본원에서 아르알킬은 아릴이 알킬의 탄소에 치환된 형태의 작용기로서, -(CH 2) nAr의 총칭이다. 아르알킬의 예로서, 벤질(-CH 2C 6H 5) 또는 페네틸(-CH 2CH 2C 6H 5) 등이 있다.
본원에서 아릴은 달리 정의되지 않는 한, 단일 고리 또는 서로 접합 또는 공유결합으로 연결된 다중 고리(바람직하게는 1 내지 4개의 고리)를 포함하는 불포화 방향족성 고리를 의미한다. 아릴의 비제한적인 예로는 페닐, 바이페닐, o-터페닐(terphenyl), m-터페닐, p-터페닐, 1-나프틸, 2-나프틸, 1-안트릴(anthryl), 2-안트릴, 9-안트릴, 1-페난트레닐(phenanthrenyl), 2-페난트레닐, 3--페난트레닐, 4--페난트레닐, 9-페난트레닐, 1-피레닐, 2-피레닐 및 4-피레닐 등이 있다.
본원에서 헤테로아릴은 상기에서 정의된 아릴 내 하나 이상의 탄소 원자가 질소, 산소 또는 황과 같은 비-탄소 원자로 치환된 작용기를 의미한다. 헤테로 아릴의 비제한적인 예로는, 퓨릴(furyl), 테트라하이드로퓨릴, 피로릴(phrrolyl), 피롤리디닐(pyrrolidinyl), 티에닐(thienyl), 테트라하이드로티에닐, 옥사졸릴(oxazolyl), 아이소옥사졸릴(isoxazolyl), 트리아졸릴(triazolyl), 티아졸릴(thiazolyl), 아이소티아졸릴(isothiazolyl), 피라졸릴(pyrazolyl), 피라졸리디닐(pyrazolidinyl), 옥사디아졸릴(oxadiazolyl), 티아디아졸릴(thiadiazolyl), 이미다졸릴(imidazolyl), 이미다졸리닐(imidazolinyl), 피리딜(pyridyl), 피리다지일(pyridaziyl), 트리아지닐(triazinyl), 피페리디닐(piperidinyl), 모르포리닐(morpholinyl), 티오모르포리닐(thiomorpholinyl), 피라지닐(pyrazinyl), 피페라이닐(piperainyl), 피리미디닐(pyrimidinyl), 나프티리디닐(naphthyridinyl), 벤조퓨라닐, 벤조티에닐, 인돌릴(indolyl), 인도리닐, 인돌리지닐, 인다졸릴(indazolyl), 퀴놀리지닐, 퀴놀리닐, 아이소퀴놀리닐, 시놀리닐(cinnolinyl), 프탈라지닐(phthalazinyl), 퀴나졸리닐, 퀴녹사리닐, 프테리디닐(pteridinyl), 퀴누클리디닐(quinuclidinyl), 카바조일, 아크리디닐, 페나지닐, 페노티지닐(phenothizinyl), 페녹사지닐, 퓨리닐, 벤즈이미다졸릴(benzimidazolyl) 및 벤조티아졸릴 등과 이들이 접합된 유사체들이 있다.
본원에서 탄화수소 고리(cycloalkyl) 또는 헤테로 원자를 포함하는 탄화수소 고리(heterocycloalkyl)은 달리 정의되지 않는 한 각각 알킬 또는 헤테로알킬의 고리형 구조로 이해될 수 있을 것이다.
탄화수소 고리의 비제한적인 예로는 사이클로펜틸, 사이클로헥실, 1-사이클로헥세닐, 3-사이클로헥세닐 및 사이클로헵틸 등이 있다. 헤테로 원자를 포함하는 탄화수소 고리의 비제한적인 예로는 1-(1,2,5,6-테트라하이드로피리딜), 1-피페리디닐, 2-피페리디닐, 3-피페리디닐, 4-모르포리닐, 3-모르포리닐, 테트라하이드로퓨란-2-일, 테트라하드로퓨란-3-일, 테트라하이드로티엔-2-일, 테트라하이드로티엔-3-일, 1-피페라지닐, 2-피페라지닐 등이 있다.
또한, 탄화수소 고리 또는 헤테로 원자를 포함하는 탄화수소 고리는 여기에 탄화수소 고리, 헤테로 원자를 포함하는 탄화수소 고리, 아릴 또는 헤테로 아릴이 접합되거나 공유결합으로 연결된 형태를 가질 수 있다.
여기서, 폴리알킬렌옥사이드는 수용성 폴리머 작용기로서 폴리에틸렌 글라이콜(PEG), 폴리프로필렌 글라이콜(PPG), 폴리에틸렌 글라이콜-폴리프로필렌 글라이콜(PEG-PPG) 코폴리머 및 N-치환된 메타크릴아마이드-함유 폴리머 및 코폴리머를 포함한다.
폴리알킬렌옥사이드는 폴리머의 특성이 유지되는 한도 내에서 필요에 따라 추가적으로 치환될 수 있다. 예를 들어, 상기 치환은 폴리머의 화학적 또는 생물학적 안정성을 증가 또는 감소시키기 위한 화학적 결합일 수 있다. 구체적인 예로서, 폴리알킬렌옥사이드 내 임의의 탄소 또는 말단 탄소는 하이드록시, 알킬 에터(메틸 에터, 에틸 에터, 프로필 에터 등), 카르복실메틸 에터, 카복시에틸 에터, 벤질 에터, 다이벤질메틸렌 에터 또는 다이메틸아민으로 치환될 수 있다. 일 실시예에 있어서, 폴리알킬렌옥사이드는 메틸 에터로 종결되는 폴리에틸렌옥사이드(mPEG)일 수 있으며, 여기서 mPEG는 -(CH 2CH 2O) nCH 3의 화학식으로 표현되며, 에틸렌 글라이콜 반복 단위의 수에 해당하는 n의 크기에 따라 mPEG의 크기가 달라질 수 있다.
또한, 화학식 1로 표시되는 소광자는 카운터 이온을 더 포함하는 구조를 가질 수 있다. 카운터 이온은 유기 또는 무기 음이온으로서 소광자의 용해도 및 안정성 등을 고려하여 적절히 선택될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 소광자의 카운터 이온의 예로서, 포스포릭산 육플루오라이드 이온, 할로겐 이온, 포스포릭산 이온, 과염소산 이온, 과요오드산 이온, 안티몬 육플루오라이드 이온, 주석산 육플루오라이드 이온, 플루오로보릭산 이온 및 사플루오르 이온 등과 같은 무기산 음이온과 티오시안산 이온, 벤젠설폰산 이온, 나프탈렌설폰산 이온, p-톨루엔설폰산 이온, 알킬설폰산 이온, 벤젠카르복실산 이온, 알킬카르복실산 이온, 삼할로알킬카르복실산 이온, 알킬설폰산 이온, 트라이할로알킬설폰산 이온, 및 니코틴산 이온 등과 같은 유기산 이온이 있다. 또한, 비스페닐디톨, 티오비스페놀 킬레이트 및 비스디올-α-디켄톤 등과 같은 금속 화합물 이온, 소듐 및 포타슘 등과 같은 금속 이온과 4차 암모늄 염도 카운터 이온으로서 선택될 수 있다.
보다 구체적으로, 본 발명의 일 실시예에 따른 소광자는 하기의 화학식 3으로 표시될 수 있다.
[화학식 3]
Figure PCTKR2020015592-appb-img-000005
R 21 내지 R 23의 정의는 R 3 내지 R 19의 정의와 동일하며,
R 3 내지 R 23 중 적어도 하나는 카르복실, 카르복실 유도체, 하이드록실, 할로알킬, 친다이엔체, 알데하이드, 케톤, 설포닐 할라이드, 티올, 아민, 설프하이드릴, 알켄, 에폭사이드 및 포스포아미디트로부터 선택되는 작용기이거나 상기 작용기와 공유 결합 가능한 반응성기이며,
R 3 내지 R 23 중 적어도 하나는 치환 또는 비치환된 아미노기일 수 있다. 또한, 다른 실시예에 있어서, R 3 내지 R 23 중 적어도 하나는 치환된 아미노기일 수 있다. 바람직하게는, 적어도 R 21은 치환된 아미노기일 수 있다.
R 3 내지 R 23 중 적어도 하나가 치환된 아미노기인 경우, 상기 아미노기는 모노- 또는 디-치환된 아미노기일 수 있다.
상기 모노- 또는 디-치환된 아미노기에 포함된 치환기는 상기 아미노기의 질소에 결합되며, 상기 치환기로는 상술한 R 3 내지 R 19의 정의와 동일한 작용기 및/또는 반응성기가 사용될 수 있다. 바람직하게는, 상기 아미노기의 질소게 결합된 치환기는 수소, 중수소, 치환 또는 비치환된 C1-C10 알킬, 치환 또는 비치환된 C2-C10 알케닐, 치환 또는 비치환된 C 3-C 20 사이클로알킬, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴 또는 치환 또는 비치환된 아르알킬일 수 있다.
또한, 상기 아미노기의 질소에 결합된 치환기는 상기 질소에 결합된 다른 치환기와 서로 연결되어 고리를 형성하거나, 상기 아미노기 외 다른 치환기와 서로 연결되어 고리를 형성할 수 있다.
만약 상기 아미노기의 질소에 결합된 치환기가 상기 질소에 결합된 다른 치환기와 서로 연결되어 고리를 형성할 경우, 두 치환기가 서로 연결되어 고리를 형성한 상기 아미노기는 헤테로사이클로알킬기로서 정의될 수도 있다.
상기 화학식 1로 표시되는 소광자의 구체적인 예는 다음과 같다. 하기에 예시로 든 소광자는 화학식 1로 표시되는 소광자의 몇몇 예시로서, 본원에 따른 소광자는 화학식 1로 표시되는 기본 골격을 가지는 소광자를 그 대상으로 한다. 즉, 하기에 예시로 든 소광자 뿐만 아니라, 화학식 1로 표시되는 기본 골격을 가지는 화합물은 들뜬 에너지 준위에서 발광 특성을 나타내는 형광 물질에 대하여 동등 또는 유사한 수준의 소광 효과를 나타내는 것으로 이해되어야 할 것이다.
[화합물 1]
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[화합물 2]
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[화합물 3]
Figure PCTKR2020015592-appb-img-000008
[화합물 4]
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[화합물 5]
Figure PCTKR2020015592-appb-img-000010
[화합물 6]
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[화합물 7]
Figure PCTKR2020015592-appb-img-000012
[화합물 8]
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[화합물 9]
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[화합물 10]
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[화합물 11]
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[화합물 12]
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[화합물 13]
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[화합물 14]
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[화합물 15]
Figure PCTKR2020015592-appb-img-000020
[화합물 16]
Figure PCTKR2020015592-appb-img-000021
[화합물 17]
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[화합물 18]
Figure PCTKR2020015592-appb-img-000023
[화합물 19]
Figure PCTKR2020015592-appb-img-000024
[화합물 20]
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[화합물 21]
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[화합물 22]
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본원에서 개시된 화학식 1로 표시되는 소광자의 표적이 되는 생체분자는 항체, 지질, 단백질, 펩타이드, 탄수화물, 핵산(뉴클레오타이드 포함)로부터 선택되는 적어도 하나일 수 있다.
지질의 구체적인 예로는 지방산(fatty acids), 인지질(phospholipids), 리포폴리당류(lipopolysaccharides) 등이 있으며, 탄수화물의 구체적인 예로는 단당류, 이당류, 다당류(예를 들어, 덱스트란)을 포함한다.
이 때, 생체분자는 화학식 1로 표시되는 소광자의 임의의 작용기 또는 화학식 1로 표시되는 소광자에 결합된 반응성기와 반응하기 위한 작용기로서, 아미노, 설프하이드릴(sulphydryl), 카보닐, 하이드록실, 카르복실, 포스페이트 및 티오포스페이트로부터 선택되는 적어도 하나를 포함하거나 이의 유도체 형태를 가질 수 있다.
또한, 생체분자는 아미노, 설프하이드릴(sulphydryl), 카보닐, 하이드록실, 카르복실, 포스페이트 및 티오포스페이트로부터 선택되는 적어도 하나를 포함하거나 이의 유도체 형태를 가지는 옥시 또는 디옥시 폴리핵산일 수 있다.
아울러, 생체분자 이외에 화학식 1로 표시되는 소광자는 아미노, 설프하이드릴(sulphydryl), 카보닐, 하이드록실, 카르복실, 포스페이트 및 티오포스페이트로부터 선택되는 적어도 하나를 포함하는 약물, 호르몬(수용체 리간드 포함), 수용체, 효소 또는 효소 기질, 세포, 세포막, 독소, 미생물 또는 나노 바이오 소재(폴리스타이렌 마이크로스피어 등) 등을 표지하기 위해 사용될 수 있다.
신규 소광자를 포함하는 올리고뉴클레오타이드, 핵산 검출용 조성물, 핵산 검출용 지지체
본 발명의 다른 측면에 따르면, 화학식 1로 표시되는 소광자로부터 선택되는 적어도 하나를 포함하는 올리고뉴클레오타이드가 제공된다.
올리고뉴클레오티드는 하나 내지 수백개의 뉴클레오티드의 폴리머를 의미하는 것으로, DNA, RNA, 또는 PNA를 모두 포함한다. 또한 이들의 유사체들, 예를 들어 상기 뉴클레오티드에 화학적 변경이 가해진 것, 또는 당이 결합된 것들 등 통상의 기술자가 용이하게 변형을 가할 수 있는 것들을 모두 포함하며, 단일 가닥 또는 이중 가닥으로 된 것을 모두 포함하는 것을 의미한다.
올리고뉴클레오티드는 프로브를 포함하는 것이 바람직하다. 이러한 프로브는 표적이 되는 핵산과 상보적으로 결합할 수 있는 프로브인 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 여기서, 프로브는 핵산, 펩타이드, 사카라이드, 올리고뉴클레오티드, 단백질, 항체 또는 이들의 조합에서 선택된 것일 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
일 실시예에 있어서, 올리고뉴클레오타이드는 형광단을 포함할 수 있다. 예를 들어, 올리고뉴클레오타이드의 5' 말단에는 형광단이 표지되고, 3' 말단에는 화학식 1로 표시되는 소광자로부터 선택되는 적어도 하나가 표지될 수 있다. 5' 말단과 3' 말단 사이에는 표적이 되는 핵산과 상보적으로 결합할 수 있는 프로브가 위치할 수 있다.
형광단은 다음 참조 문헌에 공개된 형광단의 종류를 참고할 수 있다(Cardullo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 8790-8794 (1988); Dexter, D. L., J. of Chemical Physics 21: 836-850 (1953); Hochstrasser et al., Biophysical Chemistry 45: 133-141 (1992); Selvin, P., Methods in Enzymology 246: 300-334 (1995); Steinberg, I. Ann. Rev. Biochem., 40: 83-114 (1971); Stryer, L. Ann. Rev. Biochem., 47: 819-846 (1978); Wang et al., Tetrahedron Letters 31: 6493-6496 (1990); Wang et al., Anal. Chem. 67: 1197-1203 (1995)).
또한, 본원에 사용 가능한 형광단의 비제한적인 예로는 4-acetamido-4'-isothiocyanatostilbene-2,2'disulfonic acid, 아크리딘 및 이의 유도체, 5-(2'-aminoethyl)aminonaphthalene-1-sulfonic acid (EDANS), 4-amino-N-[3-vinylsulfonyl)phenyl]naphthalimide-3,5 disulfonate, N-(4-anilino-1-naphthyl)maleimide, anthranilamide, BODIPY, Brilliant Yellow, 쿠마린( 7-amino-4-methylcoumarin (AMC, Coumarin 120), 7-amino-4-trifluoromethylcouluarin (Coumaran 151)) 및 이의 유도체, 시안 염료, 시아노신, 4',6-diaminidino-2-phenylindole (DAPI), 5',5"-dibromopyrogallol-sulfonaphthalein (Bromopyrogallol Red), 7-diethylamino-3-(4'-isothiocyanatophenyl)-4-methylcoumarin, diethylenetriamine pentaacetate, 4,4'-diisothiocyanatodihydro-stilbene-2,2'-disulfonic acid, 4,4'-diisothiocyanatostilbene-2,2'-disulfonic acid, 5-[dimethylamino]naphthalene-1-sulfonyl chloride (DNS, dansylchloride), 4-(4'-dimethylaminophenylazo)benzoic acid (DABCYL), 4-dimethylaminophenylazophenyl-4'-isothiocyanate (DABITC), 에오신 및 이의 유도체(에오신 이소시아네이트), 에리스로신 및 이의 유도체(에리스로신 B, 에리스로신 이소시아네이트), 이티디움, 플로세인 및 이의 유도체(5-카복시플로세인(FAM)), 5-(4,6-dichlorotriazin-2-yl)aminofluorescein (DTAF), 2',7'-dimethoxy-4'5'-dichloro-6-carboxyfluorescein (JOE), QFITC (XRITC), fluorescamine, IR144, IR1446, Malachite Green isothiocyanate, 4-methylumbelliferone, ortho cresolphthalein, nitrotyrosine, pararosaniline, 페놀 레드, B-phycoerythrin, o-프탈다이알데하이드, 피렌 및 이의 유도체(피렌 뷰티레이트, 숙신이미딜 1-피렌 뷰티레이트), 양자점, Reactive Red 4 (Cibacron Brilliant Red 3B-A), 로다민 및 이의 유도체(6-카르복시-X-로다민, 6-카르복시로다민, 로다민 B, 로다민 123, 로다민 X 이소시아네이트, 설포로다민 B, 설포로다민 101, 테트라메딜 로다민, 테트라메틸 로다민 이소시아네이트), 리보플라빈, rosolic acid, 피렌, 카르보피로닌, 옥사진, 잔텐, 티오잔텐 및 terbium chelate derivatives 등이 있다.
또한, 본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드는 핵산과의 결합력을 향상시키기 위해 마이너 그루브 바인더(MGB; minor groove binder)를 더 포함할 수 있다.
이러한 올리고뉴클레오티드는 화학적, 생물학적 영역에서 다양하게 활용할 수 있다. 특히 실시간 중합효소연쇄반응 또는 마이크로어세이(microassay) 등에 유용하게 사용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 다른 측면에 따르면, 상기 올리고뉴클레오티드를 포함하는 핵산 검출용 조성물이 제공된다.
본 발명의 일 실시예에 따른 핵산 검출용 조성물은 화학식 1로 표시되는 소광자와 마이너 그루브 바인더 및 형광단을 동시에 포함하는 올리고뉴클레오타이드와 함께 표적 생체분자와의 반응을 위한 효소, 용매(완충액 등) 및 기타 시약 등을 더 포함할 수 있다.
여기서 용매로는 포스페이트 완충액, 카보네이트 완충액 및 트리스 완충액으로 구성된 군에서 선택되는 완충액, 다이메틸설폭사이드, 다이메틸포름아미드, 다이클로로메탄, 메탄올, 에탄올 및 아세토나이트릴로부터 선택되는 유기 용매 또는 물 등이 사용될 수 있으며, 용매의 종류에 따라 소광자에 다양한 작용기를 도입함으로써 용해도를 조절하는 것이 가능하다.
또한, 본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 화학식 1로 표시되는 소광자, 지지체 및 상기 소광자와 상기 지지체를 연결하는 링커를 포함하는 핵산 검출용 지지체가 제공된다.
이에 따라, 샘플 내 생체분자는 지지체 상에 고착화된 소광자와의 상호작용을 통해 지지 매트릭스 상에 고정될 수 있다.
상기 지지 매트릭스는 유리, 셀룰로오스, 나일론, 아크릴아마이드 젤, 덱스트란, 폴리스티렌, 알지네이트, 콜라겐, 펩타이드, 피브린, 히알루론산, 아가로즈, 폴리하이드록시에틸메타크릴레이트,　폴리바이닐알코올, 폴리에틸렌글라이콜,　폴리에틸렌옥사이드, 폴리에틸렌글라이콜다이아크릴레이트, 젤라틴, 매트리젤(matrigel), 폴리락트산, 카르복시메틸셀룰로오스, 덱스트란, 키토산, 라텍스 및 세파로즈로부터 선택되는 적어도 하나로 제조될 수 있으며, 비드 또는 멤브레인 형태일 수 있다.
여기서, 링커는 소광자와 지지체를 연결하는 부분으로서, 소광자와 지지체를 연결할 수 있는 임의의 물질은 모두 본원에서 의도한 링커로서 사용될 수 있다.
예를 들어, 링커는 치환 또는 비치환된 C 1-C 30 알킬, 적어도 하나의 헤테로 원자를 포함하는 치환 또는 비치환된 C 2-C 30 헤테로알킬, 치환 또는 비치환된 C 6-C 30 아릴 및 치환 또는 비치환된 C 3-C 30 헤테로아릴로부터 선택될 수 있으며, 보다 구체적으로, 1 내지 6개의 에틸렌글리콜이 연결된 사슬일 수 있다.
이러한 링커는 소광자와 지지체를 연결할 뿐 소광자 또는 형광단의 다른 반응 또는 형광 및 소광 작용에 영향을 미치지 않는다.
핵산 검출 방법
본 발명의 일 실시예에 따르면, 표적 핵산에 소광자로 표지된 프로브를 반응시켜 표지하는 방법이 구현될 수 있다. 또한, 표적 생체분자의 종류에 따라 소광자에 적절한 반응성기를 도입함으로써 표적-특이적 상호작용을 이용한 생체분자의 표지 방법이 구현될 수도 있다. 아울러, 소광자로 표지한 생체분자를 전기영동을 통해 동정하는 방법이 구현될 수도 있다.
DNA 마이크로어레이법
DNA 마이크로 어레이법은 표지해야 할 표적 핵산에 염료를 반응시켜 표지하는 한편, 표적 핵산에 대하여 상보적인 염기서열을 가지는 단일사슬의 프로브 핵산을 준비하고, 단일사슬으로 변성시킨 표적 핵산과 프로브 핵산을 기판 위에서 혼성화하여, 표적 핵산의 형광을 측정한다.
본 표지 방법에서 기판에 고정하는 프로브 핵산으로는, 유전자의 발현을 조사하는 경우, cDNA 등의 cDNA의 라이브러리, 게놈의 라이브러리 또는 모든 게놈을 주형(鑄型)으로 하여 PCR법에 의해 증폭하여 조제한 것을 사용할 수 있다.
또한, 유전자의 변이 등을 조사하는 경우, 표준이 되는 이미 알려진 서열을 근거로 하여, 변이 등에 대응하는 여러가지 올리고뉴클레오티드를 합성한 것을 사용할 수 있다.
프로브 핵산을 기판 위에 고정하는 것은, 핵산의 종류나 기판의 종류에 따라 적당한 방법을 선택할 수 있다. 예를 들어, DNA의 전하를 이용하여, 폴리리신 등의 양이온으로 표면처리한 기판에 정전결합시키는 방법을 이용할 수도 있다.
단일사슬로 변성시킨 표적 핵산을 기판 위에 고정하고, 올리고뉴클레오타이드와 혼성화한다. 여기서, 올리고뉴클레오타이드의 5' 말단에는 형광단이 표지되고, 3' 말단에는 화학식 1로 표시되는 소광자로부터 선택되는 적어도 하나가 표지된다. 5' 말단과 3' 말단 사이에는 표적이 되는 핵산과 상보적으로 결합할 수 있는 프로브가 위치할 수 있다.
혼성화는 실온~70℃, 그리고 2~48시간의 범위에서 하는 것이 바람직하다. 혼성화에 의해 프로브 핵산과 상보적인 염기서열을 가지는 표적 핵산이 선택적으로 프로브 핵산과 결합한다. 그 후, 기판을 세정하고 실온에서 건조한다.
이 때, 올리고뉴클레오타이드는 프로브에 의해 표적 핵산에 혼성화되지만 5' 말단의 형광단은 3' 말단의 소광자에 의해 소광된 상태로 존재한다.
이어서, 표적 핵산에 혼성화된 올리고뉴클레오타이드는 중합 효소에 의해 신장되는데, 올리고뉴클레오타이드는 중합 효소의 엑소뉴클레아제 활성에 의해 표적 핵산으로부터 분리 및 분해되며, 올리고뉴클레오타이드의 5' 말단의 형광단과 3' 말단의 소광자는 서로 분리되며, 이에 따라 형광단은 형광을 발할 수 있게 된다.
이 때, 발생하는 형광 강도를 측정하여 표적 핵산의 증폭량을 측정할 수 있게 된다.
이하에서는 본 발명의 구체적인 실시예들을 제시한다. 다만, 하기에 기재된 실시예들은 본 발명을 구체적으로 예시하거나 설명하기 위한 것에 불과하며, 이로서 본 발명이 제한되어서는 아니된다.
제조예 1. 화합물 1의 합성
Figure PCTKR2020015592-appb-img-000028
중간체 2의 합성
500mL 1구 반응기에 2,3,3-트라이메틸인돌레닌(30g, 0.188mol)과 황산 120ml을 넣고 0℃에서 교반하였다. KNO 3 (19.0g, 0.188mmol)과 황산(120mL)을 섞은 용액을 0℃에서 적가하였다. 1시간 후 얼음을 넣고 NaOH(aq) 중화하였다. 이어서, 생성된 고체를 필터 후 건조하였다.
중간체 3의 합성
2L 반응기에 중간체 2 (36.3g, 0.178mol)과 6M HCl 950ml를 넣고 교반하였다. Tin(II) chloride dehydrate (240.6g, 1.066mol)를 넣고 100℃에서 2시간 교반하였다. 반응이 종료되면 실온으로 식힌 후 NaOH로 중화하였다. 이어서, MC와 물로 추출 후 농축하여 건조하였다.
중간체 4의 합성
반응기에 중간체 3 (5.0g, 0.029mol) DIPEA (14.8g, 0.115mol), CH3I (12.2g, 0.086mol)과 아세톤 50.0ml을 넣고 3일간 교반하였다. 이어서, MC와 물로 추출한 후 농축하여 컬럼(HEP:EA=4:1) 정제하였다.
중간체 6의 합성
반응기에 중간체 4 (1.4g, 0.007mol)와 중간체 5 (1.5g, 0.008mol)를 다이옥산(14ml)에 녹여서 14시간 환류 교반하였다. 이어서, 용매를 농축 후 컬럽 정제하였다.
중간체 8의 합성
100 mL 1구 반응기에 중간체 6 (1g, 0.003mol), 말론알데하이드 다이아닐라이드 염산염(0.7g, 0.003mol), 초산(2mL), 무수초산(10mL)를 넣고 100℃에서 1시간 교반하였다. 이어서, 에틸 아세테이트로 고체를 석출시킨 뒤 컬럽 정제하였다(MC:MeOH=50:1).
중간체 11의 합성
반응기에 중간체 9 (100g, 0.366mol)과 중간체 10 (86.2g, 0.439mol), Pd(OAc) 2 (8.2g, 0.037mol), BINAP (22.8g, 0.037mol), STB (49.3g, 0.513mol), 톨루엔 1000ml를 넣고 환류교반하였다. TLC 확인 후 상온으로 냉각하였다. 이어서, 농축 후 MC/H 2O로 추출하여 컬럼 정제하였다.
중간체 13의 합성
반응기에 중간체 11 (100g, 0.257mol)과 중간체 12 (44.3, 0.514mol, Con. HCl 250ml와 에탄올 800ml를 넣고 하루 동안 환류 교반하였다. TLC 확인 후 상온으로 냉각하였다. 이어서, 에틸아세테이트로 고체를 석출하여 필터 후 건조하였다.
중간체 15의 합성
반응기에 중간체 13 (10.0g 0.036mol)과 중간체 14 (8.5g, 0.044mol)과 DCB 20ml를 넣고 하루 동안 환류 교반하였다. 에틸아세테이트를 사용하여 고체 석출 후 필터 하여 건조하였다.
중간체 16의 합성
반응기에 중간체 8 (2.0g, 0.005mol), 중간체 15 (3.3g, 0.005mmol), 무수초산(0.9ml, 9.71mmol), 피리딘(40mL)을 넣고 환류 하에 2시간 교반하였다. 이어서, 농축 후 컬럼정제하였다.
화합물 1 (18)의 합성
반응기에 중간체 16 (500mg, 0.726mmol)과 중간체 17 (110.1mg, 1.089mmol), HATU (331.1mg, 0.871mmol), methylmophorine (220.2mg, 2.177mmol), DMF (10ml)을 넣고 상온에서 교반하였다. 이어서, MC와 물을 사용하여 추출 후 컬럼정제하였다.
제조예 2. 화합물 2의 합성
Figure PCTKR2020015592-appb-img-000029
중간체 20의 합성
반응기에 중간체 6 (10.0g, 0.026mole)과 중간체 19 (5.6g, 0.029mole), 초산(5mL), 무수초산(15mL)를 넣고 100℃에서 1시간 교반하였다. 이어서, 에틸 아세테이트로 고체를 석출시킨 뒤 컬럼 정제하였다(MC:MeOH=50:1).
중간체 21의 합성
반응기에 중간체 8 (2.0g, 0.004mol), 중간체 15 (2.3g, 0.004mmol), 무수초산(0.9ml, 9.71mmol), 피리딘(40mL)을 넣고 환류 하에 2시간 교반하였다. 이어서, 농축 후 컬럼정제하였다.
화합물 2 (22)의 합성
반응기에 중간체 16 (500mg, 0.726mmol)과 중간체 17 (107.9mg, 1.067mmol), HATU (324.5mg, 0.854mmol), methylmophorine (215.8mg, 2.134mmol), DMF (10ml)을 넣고 상온에서 교반하였다. 이어서, MC와 물을 사용하여 추출 후 컬럼정제하였다.
제조예 3. 화합물 6의 합성
Figure PCTKR2020015592-appb-img-000030
중간체 25의 합성
반응기에 중간체 23 (25.0g, 0.152mol), 중간체 24 (30.1g, 0.183 mol), K 2CO 3 (25.2g, 0.183mol), DMF (250ml)를 넣고 50℃에서 하루 동안 교반하였다. TLC 확인 후 EA와 물로 추출하여 농축한 뒤에 톨루엔(250ml)와 TsOH(5.2g, 0.030mol)을 넣고 하루 동안 환류 교반하였다. 이어서, MC와 물로 추출한 후 컬럼 정제하였다.
중간체 26의 합성
반응기에 중간체 25 (10.0g, 0.043mol), 아이오도 프로판올(9.7g, 0.052mol), 1,4-다이옥산(20.0ml)를 넣고 하루 동안 환류 교반하였다. 이어서, TLC 확인 후 컬럼 정제하였다.
중간체 28의 합성
반응기에 중간체 26 (5.0g, 0.012mol), 중간체 27 (2.6g, 0.013mol), Ac 2O (15ml)를 넣고 3시간 동안 환류 교반하였다. 이어서, 상온으로 냉각 후 용매 제거한 뒤 컬럼정제 하였다.
중간체 30의 합성
반응기에 중간체 28 (1.3g, 0.003mol), 피리딘(13ml)를 넣고 상온에서 교반하였다. 중간체 29 (1.0g, 0.003mol)을 MC(13ml)에 첨가한 후 상온에서 하루 동안 교반하였다. 이어서, 용매를 농축한 후 컬럼 정제하였다.
중간체 31의 합성
반응기에 중간체 13 (10.0g, 0.036mol), 아이오도 프로판올(6.8g, 0.036mol), 1,4-다이옥산(50ml)를 넣고 하루 동안 환류 교반하였다. 이어서, 용매를 제거한 후 컬럼 정제하였다.
화합물 6 (32)의 합성
반응기에 중간체 30 (1.1g, 0.001mol), 중간체 31 (0.6g, 0.001mol), KOAc (0.2g, 0.002mol), 에탄올(22ml)를 넣고 하루 동안 환류 교반하였다. 이어서, 상온으로 식힌 후 용매를 농축한 뒤에 컬러 정제하였다.
제조예 4. 화합물 7의 합성
Figure PCTKR2020015592-appb-img-000031
중간체 33의 합성
반응기에 중간체 26 (5.0g, 0.012mol), 중간체 7 (3.7g, 0.014mol), Ac 2O (20ml)를 넣고 3시간 동안 환류 교반하였다. 이어서, 용매를 농축한 후 컬럼 정제하였다.
중간체 34의 합성
반응기에 중간체 33 (2.0g, 0.004mol), 중간체 29 (1.5g, 0.004mol)을 넣고 중간체 30과 같은 방법으로 합성하였다.
화합물 7 (35)의 합성
반응기에 중간체 34 (1.5g, 0.002mol), 중간체 31 (0.8g, 0.002mol), KOAc (0.2g, 0.002mol), 에탄올 (30ml)를 넣고 화합물 2의 합성과 같은 방법으로 합성하였다.
제조예 5. 화합물 9의 합성
Figure PCTKR2020015592-appb-img-000032
중간체 36의 합성
500mL 1구 반응기에 N,N-다이에틸-1,4-페닐렌디아민(25g, 0.152mol), 3-브로모-3-메틸-2-뷰탄온(30.1g, 0.183mol), 포타슘카보네이트(25.2g, 0.183mol), 다이메틸포름아미드(250mL)를 넣고 50℃에서 12시간 교반하였다. 반응기에 물(100mL)을 넣고 강교반한 뒤 에틸아세테이트(100mL x 2)로 추출하였다. 유기층에 무수황산마그네슘을 넣고 5분간 교반한 뒤 고체를 여과하였다. 여액은 농축하고 농축액에 p-톨루엔설포닉산(5.2g, 0.03mol), 톨루엔(250mL)을 넣고 환류하에 12시간 교반하였다. 반응기에 물(100mL)을 넣고 강교반한 뒤 에틸아세테이트(100 mL x 2)로 추출하였다. 유기층에 무수황산마그네슘을 넣고 5분간 교반한 뒤 고체를 여과하였다. 이어서, 여액은 농축 후 컬럼정제 하였다.
중간체 37의 합성
100mL 1구 반응기에 중간체 36 (4.46g, 0.0194mol), 아이오도메탄(4.53g, 0.029mol), 아세토니트릴(45mL)를 넣고 환류하에 12시간 교반하였다. 이어서, 농축 후 컬럼정제하였다.
중간체 38의 합성
100mL 1구 반응기에 중간체 37 (2.73g, 7.066mmol), N,N'-다이페닐포름아미딘(1.53g, 7.774mmol), 무수아세트산(25mL)을 넣고 110℃에서 1시간 교반하였다. 이어서, 농축 후 컬럼정제하였다.
중간체 39의 합성
500mL 3구 반응기에 브로모-9,9-다이메틸플루오렌(25g, 0.0915mol), 벤조페놀히드라진(21.55g, 0.109mol), Pd 2(dba) 3 (3.35g, 3.660mmol), BINAP (2.28g, 3.66 mmol), 소듐-tert-부톡사이드(12.31g, 0.128mol), 톨루엔(250mL)를 넣고 100℃에서 12시간 교반하였다. 셀라이트를 깔고 뜨거운상태로 고체를 여과하였다. 이어서, 농축 후 컬럼정제하였다.
중간체 40의 합성
500mL 1구 반응기에 중간체 39 (32.4g, 0.0834mol), 3-메틸-2-부탄온(22.5g, 0.250mol), 진한 염산(80mL), 에탄올(330mL)을 넣고 환류 하에 12시간 교반하였다. 농축 후 반응기에 물(500mL)를 넣고 에틸아세테이트(500mL x 2)로 추출하였다. 유기층에 무수황산마그네슘을 넣고 5분간 교반한 뒤 고체를 여과하였다. 이어서, 여액은 농축 후 컬럼정제하였다.
중간체 41의 합성
100mL 1구 반응기에 중간체 40 (2g, 7.262mmol), 6-요오드헥사노익산 (2.63g, 10.893mmol), 1,4-디옥산(20mL)를 넣고 환류 하에 12시간 교반하였다. 이어서, 냉각 후 반응기에 에틸아세테이트(100mL)를 넣고 결정화한 뒤 고체를 여과하였다.
중간체 42의 합성
100mL 1구 반응기에 중간체 38 (2.46g, 4.638mmol), 중간체 41 (1.2g, 2.319mmol), 피리딘(25mL)를 넣고 80℃에서 2시간 교반하였다. 이어서, 농축 후 컬럼정제하였다.
화합물 9 (43)의 합성
100mL 1구 반응기에 중간체 42 (700mg, 0.89mmol), N,N'-다이사이클로헥실카보이미드(220mg, 1.068mmol), N-하이드록시석신이미드(123mg, 1.068mmol), 다이클로로메탄(20mL)를 넣고 상온에서 1시간 교반하였다. 생성된 고체를 여과한 뒤 컬럼정제하였다.
1H-NMR (300 MHz, CDCl 3) d 8.37 (t, 1H, J = 13.5 Hz), 7.71 (d, 1H, J = 7.5 Hz), 7.62 (s, 1H), 7.44-7.26 (m, 4H), 7.09-7.06 (m, 3H), 6.68-6.66 (m, 2H), 4.36 (q, 2H, J = 7.2 Hz), 4.20 (t, 2H, J = 7.8 Hz), 3.43 (q, 4H, J = 7.2 Hz), 2.85 (s, 4H), 2.72 (t, 2H, J = 7.2 Hz), 1.96-1.91 (m, 4H), 1.76 (s, 6H), 1.73 (s, 6H), 1.60 (m, 2H), 1.53 (s, 6H), 1.25 (t, 9H, J = 6.3 Hz)
제조예 6. 소광자-CPG의 합성
Figure PCTKR2020015592-appb-img-000033
10mL vial에 화합물 2 (75mg, 0.11mmol), 석신산무수물(9.9mg, 0.099mmol), 4-다이메틸아미노피리딘(12.1mg, 0.099mmol), 다이클로로메탄(5ml)를 넣고 상온에서 1.5시간 롤링하였다. 완전히 농축하고 1-에틸-3-(3-다이메틸아미노프로필)카보디이미드(52.7mg, 0.275mmol), 트라이에틸아민(28μl), 피리딘(5ml), CPG-NH 2 (1g)을 넣고 상온에서 2시간 롤링하였다. powder를 여과하고 아세토니트릴, 메탄올, 다이클로로메탄으로 각각 3회씩 세척하였다. 건조 후 CapA/CapB=1ml/1ml를 넣고 상온에서 2시간 롤링하고 아세토니트릴, 다이클로로메탄으로 각각 3회씩 세척한 후 건조하였다. 또한, 상기와 동일한 방법으로 화합물 6-CPG, 화합물 7-CPG 및 화합물 9-CPG를 합성하였다.
실험예 1. 화합물 2의 소광 특성 측정
이중 표지 올리고뉴클레오타이드의 합성
제조예 6에서 합성한 화합물 2-CPG와 CalfluorRed ® 610을 이용하여 10-Column Polygen DNA Synthesizer으로 이중 표지 올리고뉴클레오타이드를 합성하였다. 합성한 이중 표지 올리고뉴클레오타이드를 일반적인 방법으로 Cleavage 및 Deprotection한 후 RP HPLC로 정제하였다. 이중 표지 합성한 올리고뉴클레오타이드의 서열은 하기의 표 1과 같다.
5' 형광단 프로브 서열 3' 소광자
CalfluorRed ® 610 AGC CTT TCT AAC CGC TGC ACT TAC CCT T 화합물 2
소광 특성 측정
상기 표 1의 이중 표지 프로브의 소광 특성을 확인하기 위해 하기의 표 2에 기재된 조성으로 real time PCR을 수행하였다(Biorad사, CFX-96 사용). Real time PCR 결과는 도 1에 나타내었다. PCR Protocol : 95℃, 3min - [95℃, 10s - 60℃, 30s] x 50cycles
구분 함량(μl)
Master Mix (Biolin Probe Master Mix (2X) 20 μl
Primer 10 pmole each
CalfluorRed ®610-화합물 2 probe 5 pmole
Template Hyman gDNA 1 ng &Target plasmid 100fg
PCR water up to 40 μl
형광단과 소광자가 각각 CalfluorRed ® 610과 화합물 2로 구성된 이중 표지 프로브의 real time PCR 결과를 나타낸 도 1을 참조하면, 화합물 2가 CalfluorRed ® 610의 형광을 효과적으로 소광시키며, PCR 증폭 역시 이상적인 패턴으로 진행되는 것을 확인할 수 있다.
실험예 2. 화합물 6의 소광 특성 측정
이중 표지 올리고뉴클레오타이드의 합성
제조예 6에서 합성한 화합물 6-CPG와 CalfluorRed ® 610을 이용하여 10-Column Polygen DNA Synthesizer으로 이중 표지 올리고뉴클레오타이드를 합성하였다. 합성한 이중 표지 올리고뉴클레오타이드를 일반적인 방법으로 Cleavage 및 Deprotection한 후 RP HPLC로 정제하였다. 이중 표지 합성한 올리고뉴클레오타이드의 서열은 하기의 표 3과 같다.
5' 형광단 프로브 서열 3' 소광자
CalfluorRed ® 610 AGC CTT TCT AAC CGC TGC ACT TAC CCT T 화합물 6
소광 특성 측정
상기 표 3의 이중 표지 프로브의 소광 특성을 확인하기 위해 하기의 표 4에 기재된 조성으로 real time PCR을 수행하였다(Biorad사, CFX-96 사용). Real time PCR 결과는 도 2에 나타내었다. PCR Protocol : 95℃, 3min - [95℃, 10s - 60℃, 30s] x 50cycles
구분 함량(μl)
Master Mix (Biolin Probe Master Mix (2X) 20 μl
Primer 10 pmole each
CalfluorRed ®610-화합물 6 probe 5 pmole
Template Hyman gDNA 1 ng &Target plasmid 100fg
PCR water up to 40 μl
형광단과 소광자가 각각 CalfluorRed ® 610과 화합물 6으로 구성된 이중 표지 프로브의 real time PCR 결과를 나타낸 도 2를 참조하면, 화합물 6이 CalfluorRed ® 610의 형광을 효과적으로 소광시키며, PCR 증폭 역시 이상적인 패턴으로 진행되는 것을 확인할 수 있다.
실험예 3. 화합물 7의 소광 특성 측정
이중 표지 올리고뉴클레오타이드의 합성
제조예 6에서 합성한 화합물 7-CPG와 CalfluorRed ® 610을 이용하여 10-Column Polygen DNA Synthesizer으로 이중 표지 올리고뉴클레오타이드를 합성하였다. 합성한 이중 표지 올리고뉴클레오타이드를 일반적인 방법으로 Cleavage 및 Deprotection한 후 RP HPLC로 정제하였다. 이중 표지 합성한 올리고뉴클레오타이드의 서열은 하기의 표 5와 같다.
5' 형광단 프로브 서열 3' 소광자
CalfluorRed ® 610 AGC CTT TCT AAC CGC TGC ACT TAC CCT T 화합물 7
소광 특성 측정
상기 표 5의 이중 표지 프로브의 소광 특성을 확인하기 위해 하기의 표 6에 기재된 조성으로 real time PCR을 수행하였다(Biorad사, CFX-96 사용). Real time PCR 결과는 도 3에 나타내었다. PCR Protocol : 95℃, 3min - [95℃, 10s - 60℃, 30s] x 50cycles
구분 함량(μl)
Master Mix (Biolin Probe Master Mix (2X) 20 μl
Primer 10 pmole each
CalfluorRed ®610-화합물 7 probe 5 pmole
Template Hyman gDNA 1 ng &Target plasmid 100fg
PCR water up to 40 μl
형광단과 소광자가 각각 CalfluorRed ® 610과 화합물 7로 구성된 이중 표지 프로브의 real time PCR 결과를 나타낸 도 3을 참조하면, 화합물 7이 CalfluorRed ® 610의 형광을 효과적으로 소광시키며, PCR 증폭 역시 이상적인 패턴으로 진행되는 것을 확인할 수 있다.
실험예 4. 화합물 9의 소광 특성 측정
이중 표지 올리고뉴클레오타이드의 합성
제조예 6에서 합성한 화합물 9-CPG와 CalfluorRed ® 610을 이용하여 10-Column Polygen DNA Synthesizer으로 이중 표지 올리고뉴클레오타이드를 합성하였다. 합성한 이중 표지 올리고뉴클레오타이드를 일반적인 방법으로 Cleavage 및 Deprotection한 후 RP HPLC로 정제하였다. 이중 표지 합성한 올리고뉴클레오타이드의 서열은 하기의 표 7과 같다.
5' 형광단 프로브 서열 3' 소광자
CalfluorRed ® 610 AGC CTT TCT AAC CGC TGC ACT TAC CCT T 화합물 9
소광 특성 측정
상기 표 7의 이중 표지 프로브의 소광 특성을 확인하기 위해 하기의 표 8에 기재된 조성으로 real time PCR을 수행하였다(Biorad사, CFX-96 사용). Real time PCR 결과는 도 4에 나타내었다. PCR Protocol : 95℃, 3min - [95℃, 10s - 60℃, 30s] x 50cycles
구분 함량(μl)
Master Mix (Biolin Probe Master Mix (2X) 20 μl
Primer 10 pmole each
CalfluorRed ®610-화합물 9 probe 5 pmole
Template Hyman gDNA 1 ng &Target plasmid 100fg
PCR water up to 40 μl
형광단과 소광자가 각각 CalfluorRed ® 610과 화합물 9로 구성된 이중 표지 프로브의 real time PCR 결과를 나타낸 도 4를 참조하면, 화합물 9가 CalfluorRed ® 610의 형광을 효과적으로 소광시키며, PCR 증폭 역시 이상적인 패턴으로 진행되는 것을 확인할 수 있다.
이상, 본 발명의 일 실시예에 대하여 설명하였으나, 해당 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 특허청구범위에 기재된 본 발명의 사상으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서, 구성 요소의 부가, 변경, 삭제 또는 추가 등에 의해 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있을 것이며, 이 또한 본 발명의 권리범위 내에 포함된다고 할 것이다.

Claims (23)

  1. 하기의 화학식 1 로 표시되는 소광자:
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2020015592-appb-img-000034
    여기서,
    R 1 및 R 2는 각각 하기 화학식 2의 a 및 b, b 및 c 또는 c 및 d와 접합되며,
    [화학식 2]
    Figure PCTKR2020015592-appb-img-000035
    Ar 1은 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴 및 화학식 2로부터 선택되며,
    n은 1 내지 3의 정수이며,
    R 3 내지 R 19는 각각 독립적으로 수소, 중수소, 치환 또는 비치환된 C1-C10 알킬, 적어도 하나의 헤테로 원자를 포함하는 치환 또는 비치환된 C1-C10 헤테로알킬, 치환 또는 비치환된 C2-C10 알케닐, 치환 또는 비치환된 C2-C10 알키닐, 치환 또는 비치환된 C 3-C 20 사이클로알킬, 치환 또는 비치환된 C1-C10 알콕시, 치환 또는 비치환된 아릴옥시, 치환 또는 비치환된 C1-C10 할로알킬, 할로겐, 사이아노, 하이드록시, 치환 또는 비치환된 아미노, 치환 또는 비치환된 아마이드, 카바메이트, 설프하이드릴, 나이트로, 카르복실, 카르복실산염, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환 또는 비치환된 아르알킬, 4차 암모늄, 인산, 인산염, 치환된 케톤, 알데하이드, 치환된 에스터, 치환된 설포닐, 치환 또는 비치환된 설폰아마이드, 아실클로라이드, 설폰산, 설폰산염, 히드라진, 티올, 아세탈, 케탈, 포스포네이트(아인산염), 하이포아인산염, 술포히드록시, 설페이트, 아지도, 구아니디움, 케텐, 티오카르보닐, 아미노티오카르보닐, 폴리알킬렌옥사이드, 카르복실 유도체, 친다이엔체, 설포닐 할라이드, 에폭사이드 및 포스포아미디트로부터 선택되는 작용기이거나, 카르복실, 카르복실 유도체, 하이드록실, 할로알킬, 친다이엔체, 알데하이드, 케톤, 설포닐 할라이드, 티올, 아민, 설프하이드릴, 알켄, 에폭사이드 및 포스포아미디트로부터 선택되는 작용기와 공유 결합 가능한 반응성기로부터 선택되며,
    R 5 와 R 6는 각각 독립적으로 존재하거나 서로 연결되어 고리를 형성하며,
    R 7 와 R 8은 각각 독립적으로 존재하거나 서로 연결되어 고리를 형성하며,
    R 18 와 R 19은 각각 독립적으로 존재하거나 서로 연결되어 고리를 형성하며,
    L 1 및 L 3은 단결합 또는 1 내지 40개의 비수소 원자를 포함하는 링커이며, L 2 및 L 4는 1 내지 40개의 비수소 원자를 포함하는 링커이다.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 화학식 1의 R 1 및 R 2는 상기 화학식 2의 a 및 b와 접합되는,
    소광자.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 화학식 1의 R 1 및 R 2는 상기 화학식 2의 b 및 c와 접합되는,
    소광자.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 화학식 1의 R 1 및 R 2는 상기 화학식 2의 c 및 d와 접합되는,
    소광자.
  5. 제1항에 있어서,
    R 3 내지 R 19 중 적어도 하나는 카르복실, 카르복실 유도체, 하이드록실, 할로알킬, 친다이엔체, 알데하이드, 케톤, 설포닐 할라이드, 티올, 아민, 설프하이드릴, 알켄, 에폭사이드 및 포스포아미디트로부터 선택되는 작용기이거나 상기 작용기와 공유 결합 가능한 반응성기인,
    소광자.
  6. 제1항에 있어서,
    R 3 내지 R 19 및 Ar 1의 치환기 중 적어도 하나는 카르복실, 카르복실 유도체, 하이드록실, 할로알킬, 친다이엔체, 알데하이드, 케톤, 설포닐 할라이드, 티올, 아민, 설프하이드릴, 알켄, 에폭사이드 및 포스포아미디트로부터 선택되는 작용기이거나 상기 작용기와 공유 결합 가능한 반응성기인,
    소광자.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 반응성기는 카르복실, 카르복실 유도체, 하이드록실, 할로알킬, 친다이엔체, 알데하이드, 케톤, 설포닐 할라이드, 티올, 아민, 설프하이드릴, 알켄, 에폭사이드 및 포스포아미디트로부터 선택되며, 상기 반응성기는 보호기로 보호되는,
    소광자.
  8. 제1항에 있어서,
    R 14 내지 R 17 중 인접한 치환기는 서로 연결되어 고리를 형성하는,
    소광자.
  9. 제1항에 있어서,
    Ar 1의 치환기 중 적어도 하나는 치환된 아미노기인,
    소광자.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 아미노기의 질소에 결합된 치환기는 상기 질소에 결합된 다른 치환기와 서로 연결되어 고리를 형성하거나, 상기 아미노기 외 다른 치환기와 서로 연결되어 고리를 형성하는,
    소광자.
  11. 제1항에 있어서,
    하기의 화학식 3으로 표시되는 소광자:
    Figure PCTKR2020015592-appb-img-000036
    R 21 내지 R 23의 정의는 R 3 내지 R 19의 정의와 동일하며,
    R 3 내지 R 23 중 적어도 하나는 카르복실, 카르복실 유도체, 하이드록실, 할로알킬, 친다이엔체, 알데하이드, 케톤, 설포닐 할라이드, 티올, 아민, 설프하이드릴, 알켄, 에폭사이드 및 포스포아미디트로부터 선택되는 작용기이거나 상기 작용기와 공유 결합 가능한 반응성기이며,
    R 3 내지 R 23 중 적어도 하나는 치환 또는 비치환된 아미노기이다.
  12. 제11항에 있어서,
    R 20 내지 R 23 중 적어도 하나는 치환된 아미노기인,
    소광자.
  13. 제11항에 있어서,
    R 21은 치환된 아미노기인,
    소광자.
  14. 제12항 또는 제13항에 있어서,
    상기 아미노기의 질소에 결합된 치환기는 상기 질소에 결합된 다른 치환기와 서로 연결되어 고리를 형성하거나, 상기 아미노기 외 다른 치환기와 서로 연결되어 고리를 형성하는,
    소광자.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 소광자;
    마이너 그루브 바인더(MGB; minor groove binder); 및
    형광단;
    을 포함하는 올리고뉴클레오타이드.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 형광단은 쿠마린, 시아닌, 보디피, 플로세인, 로다민, 피렌, 카르보피로닌, 옥사진, 잔텐, 티오잔텐, 아크리딘 및 또는 이의 유도체로부터 선택되는 적어도 하나인,
    올리고뉴클레오타이드.
  17. 제15항에 따른 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 핵산 검출용 조성물.
  18. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 소광자;
    지지체; 및
    상기 소광자와 상기 지지체를 연결하는 링커;
    를 포함하는,
    핵산 검출용 지지체.
  19. 제18항에 있어서,
    상기 지지체는 유리, 셀룰로오스, 나일론, 아크릴아마이드 젤, 덱스트란, 폴리스티렌 또는 레진인,
    핵산 검출용 지지체.
  20. 제18항에 있어서,
    상기 링커는 치환 또는 비치환된 C 1-C 30 알킬, 적어도 하나의 헤테로 원자를 포함하는 치환 또는 비치환된 C 2-C 30 헤테로알킬, 치환 또는 비치환된 C 6-C 30 아릴 및 치환 또는 비치환된 C 3-C 30 헤테로아릴로부터 선택되는,
    핵산 검출용 지지체.
  21. (a) 표적 핵산, 상기 표적 핵산을 증폭시키기 위해 필요한 시약 및 제15항에 따른 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 반응 혼합물을 준비하는 단계;
    (b) 상기 반응 혼합물 중 표적 핵산을 중합효소 연쇄 반응에 의해 증폭하는 단계; 및
    (c) 상기 반응 혼합물의 형광 강도를 측정하는 단계;
    를 포함하는,
    핵산 검출 방법.
  22. 제21항에 있어서,
    상기 단계 (b)는,
    (b-1) 상기 표적 핵산에 혼성화된 올리고뉴클레오타이드가 중합 효소에 의해 신장되는 단계;
    (b-2) 상기 중합 효소의 엑소뉴클레아제 활성에 의해 상기 표적 핵산으로부터 상기 올리고뉴클레오타이드의 소광자와 형광단이 분리되는 단계; 및
    (b-3) 상기 소광자로부터 떨어진 상기 형광단이 형광을 발하는 단계;
    를 포함하는,
    핵산 검출 방법.
  23. 제21항에 있어서,
    상기 단계 (c)에서 측정된 형광 강도로부터 표적 핵산의 증폭량을 측정하는 단계 (d)를 더 포함하는,
    핵산 검출 방법.
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