WO2021086136A1 - 세포 분주 및 배양용 디스크, 실시간 모니터링 시스템 및 세포 분주 및 배양 방법 - Google Patents

세포 분주 및 배양용 디스크, 실시간 모니터링 시스템 및 세포 분주 및 배양 방법 Download PDF

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    • C12M41/48—Automatic or computerized control

Definitions

  • the present disclosure relates to a disk for dispensing and culturing cells, a real-time monitoring system, and a method for distributing and culturing cells using the same.
  • CHO Choinese hamster ovary cells are genetically engineered to overexpress and secrete a specific protein. After that, cells with the best secretion of the target protein and good growth are selected, introduced into the bioreactor, and the protein is collected by repeating the replication process numerous times.
  • the gene When genetically engineered to overexpress the target protein, the gene is generally introduced into cells through a transfection process in tens of thousands of cells or more. However, since the degree to which genes are introduced and expressed varies greatly for each cell, selecting the best-growing cells that produce the best protein at the level of a single cell is the most important part of protein restriction.
  • One aspect of the embodiment is that at least thousands of single cells can be dispensed at the same time, and each isolated single cell is placed in a culture space, and then cultured, and a cell dispensing and culture disk that can be monitored in real time through imaging. I want to provide.
  • Another aspect of the embodiment is to provide a real-time monitoring system capable of performing cell dispensing and culturing while performing real-time monitoring by mounting a cell dispensing and culturing disk, and a cell dispensing and culturing method using the same.
  • a disk for dispensing and culturing cells is a disk having an inlet and an outlet, the cell distribution region including a cell supply region connected to the inlet, a cell transfer channel extending in a radial direction of the disk, and the cells It includes a cell capture portion having a capture groove close to the end of the transfer channel, and a cell culture portion having a space connected to the capture groove.
  • the space of the cell culture unit may be located in different layers separated from the cell transfer channel.
  • It may further include a cell recovery region in communication with the cell distribution region and connected to the outlet.
  • the height of the cell distribution region may be lower than the height of the cell supply region.
  • the cell transfer channel may be narrower in width toward the outer side in the radial direction of the disk.
  • the capture groove may be formed to be concave in a direction toward the center of the disk.
  • the trapping groove may have a radius of curvature corresponding to the radius of a single cell.
  • the cell culture unit may be connected to a cell discharge unit opened to the outside of the disk.
  • a disk for dispensing and culturing cells is a disk having an inlet and an outlet connected to an inner space on a surface, a cell supply area located in the inner space and connected to the injection port, and the cell supply area in the inner space And a cell distribution region including a plurality of cell transfer channels each extending in a radial direction of the disk, a cell capture portion having a capture groove close to an end of the cell transfer channel, and a culture space connected to the capture groove. It may include a cell culture unit, and a cell recovery region connected to the outlet and communicated with the cell transfer channel.
  • the injection port and the discharge port may be spaced apart from each other in a radial direction of the disk, the injection port may be closer to a center of the disk, and the discharge port may be closer to an edge of the disk.
  • the cell supply region may include a diffusion portion connected to the injection port, and a transition portion extending from the diffusion portion and having a portion lower than the height measured in the disk thickness direction of the diffusion portion and connected to the cell transfer channel. .
  • the cell distribution region may include a plurality of partitions extending in a radial direction of the disk, and the partition may form a boundary between the cell transfer channel.
  • Each of the cell transfer channels may be narrower in width toward the outer side in the radial direction of the disk.
  • the capture groove may be formed to be concave in a direction toward the center of the disk.
  • the trapping groove may have a radius of curvature corresponding to the radius of a single cell.
  • the cell trapping portion has a pointed attachment in a direction toward the center of the disk, and the trapping grooves may be located at one end of the attachment.
  • each of the partitions has an attachment at a distal end facing outward in the radial direction of the disk, and the attachment of the cell trapping portion and the attachment of the partition portion are alternately arranged. I can.
  • the cell trapping unit is located downstream of the cell transfer channel and may be provided as many as a number corresponding to each of the plurality of cell transfer channels.
  • the culture space of the cell culture unit may be located in a second layer separated from the first layer in which the cell transfer channel is located.
  • the cell culture unit may further include a cell collecting unit in communication with the capturing groove, and the cell collecting unit may be disposed to overlap the capturing groove when viewed from a plane perpendicular to the rotational axis of the disk.
  • the cell culture part may be connected to a cell discharge part opened to the outside of the disk, and the cell discharge part may be connected to a part spaced apart from the cell collection part.
  • the cell discharge part may include a first discharge pipe communicating with the culture space of the cell culture part, and a second discharge pipe having a larger diameter than the first discharge pipe and opening to the outside of the disk.
  • the cell recovery region may further include a re-diffusion unit positioned between the cell distribution region and the outlet.
  • a real-time monitoring system for cell dispensing and cultivation is a monitoring system for distributing and culturing cells by carrying in a disk for cell dispensing and culturing, and rotating by mounting the disc for dispensing and culturing cells. And a fluorescent image pickup unit positioned at a lower portion of the cell dispensing and culturing disk to correspond to the cell culture unit to irradiate light and measure reflected fluorescence.
  • the real-time monitoring system for cell dispensing and culturing may further include an incubating chamber provided to surround the cell dispensing and culturing disk separated from the fluorescence image pickup unit and outside air.
  • a cell dispensing and culturing method includes preparing a cell dispensing and culturing disk having an inlet and an outlet connected to the inner space on the surface, injecting cells into the inlet, and for distributing and culturing the cells. Rotating a disk and distributing and transferring the injected cells for each of a plurality of cell transfer channels, rotating the cell dispensing and culturing disk, and from the transferred cells to a capture groove of a cell trap located downstream of the cell transfer channel It may include capturing a single cell, and moving the captured single cell to a cell culture unit.
  • the step of moving the captured single cells to the cell culture unit includes the process of inverting the cell dispensing and culturing disk to move the captured single cells to the cell collection unit by gravity, and rotating the cell dispensing and culturing disk. It may further include a process of moving a single cell of the cell collection unit to the cell culture unit.
  • the method of distributing and culturing cells may further include culturing the single cells in the cell culture unit, and extracting the cultured cells from the cell culture unit.
  • a cell dispensing and culturing method includes measuring the growth of cells cultured in the cell culture unit through real-time imaging, and measuring the amount of protein produced in the cell culture unit using a fluorescent reagent. It may further include.
  • the cell dispensing and culturing method may further include the step of recovering the transferred cells excluding the captured single cells from the outlet of the cell dispensing and culturing disk.
  • the real-time monitoring system, and the cell dispensing and culturing method at least thousands of single cells can be dispensed at the same time, and the isolated single cells are placed into the culture space, respectively, It can be cultured and monitored in real time through imaging.
  • FIG. 1 is a perspective view showing a disk for dispensing and culturing cells according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 2 is a plan view and an enlarged plan view showing a disk for dispensing and culturing cells according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 3 is a partially cut-away perspective view showing a part of a disk for dispensing and culturing cells according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 4 is a perspective view showing an enlarged part of a disk for cell dispensing and culturing according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 5 is a perspective view showing a real-time monitoring system for dispensing and culturing cells according to another embodiment of the present invention.
  • FIG. 6 is an enlarged perspective view of a disk driving unit of the monitoring system shown in FIG. 5.
  • FIG. 7 is a flow chart showing a cell dispensing and culturing method according to another embodiment of the present invention.
  • FIGS. 8 to 12 are views for explaining a cell dispensing and culturing method according to another embodiment of the present invention.
  • FIG. 1 is a perspective view showing a disk for dispensing and culturing cells according to an embodiment of the present invention.
  • the disk 100 for dispensing and culturing cells according to the present embodiment (hereinafter, also referred to as “disc”) has a disk-shaped appearance and has an approximately central region 110 along a radial direction from the center to the edge. ), a dummy area 115, a cell supply area 120, a cell distribution area 130, and a cell recovery area 160.
  • the central region 110 includes the center of the disk 100 and may be formed as a circular region having a predetermined radius.
  • the disk 100 may be fixed and used in a device that provides a rotational driving force, and for this purpose, a groove or a protrusion may be provided in the central region 110 so as to be fixed to the device.
  • the dummy area 115 may be formed of an annular area extending radially outward from the boundary of the center area 110 by a predetermined distance.
  • the cell supply region 120, the cell distribution region 130, and the cell recovery region 160 may extend from the boundary of the dummy region 115 to the outer edge in the radial direction. In these areas, a process of supplying and distributing cells to the inner space of the disk 100 from the outside, capturing each single cell, and recovering the remaining cells may be performed.
  • the disk 100 may be entirely made of a transparent plastic material, and for example, may be made of transparent polypropylene (PP) or polystyrene (PS).
  • PP transparent polypropylene
  • PS polystyrene
  • FIG. 2 is a plan view and an enlarged plan view showing a disk for cell dispensing and culturing according to an embodiment of the present invention, in which the cell supply area 120, the cell distribution area 130, and the cell recovery area 160 are enlarged. Shown.
  • the disk 100 for dispensing and culturing cells may include an inlet 121 and an outlet 161 connected to an inner space.
  • the injection port 121 and the discharge port 161 may be opened from the inner space to the outside, and are spaced apart from each other in the radial direction of the disk 100.
  • the injection hole 121 may be located closer to the center of the disk 100 and the discharge hole 161 may be located closer to the edge of the disk 100.
  • the cell supply area 120 is an area connected to the injection port 121 in the inner space of the disk 100
  • the cell recovery area 160 is an area connected to the discharge port 161 in the inner space of the disk 100. .
  • the cell distribution region 130 may distribute and capture the supplied cells by providing a plurality of cell transfer channels 132 between the cell supply region 120 and the cell recovery region 160. That is, a plurality of partitions 134 extending in the radial direction of the disk 100 may be positioned in the inner space of the disk 100 to form a plurality of cell transfer channels 132.
  • a cell capture unit 141 may be positioned at a boundary between the cell distribution region 130 and the cell recovery region 160.
  • the cell capture portions 141 may be provided as many as the number corresponding to each of the plurality of cell transfer channels 132, and may be disposed close to the distal end of the cell transfer channel 132.
  • Each cell capture part 141 has one capture groove 143, and the capture groove 143 is located downstream of the cell transfer channel 132 and may be formed concave in a direction toward the center of the disk 100. have.
  • the trapping groove 143 may have a radius of curvature corresponding to the radius of a single cell, thereby enabling a single cell to be captured.
  • the cell capture part 141 may be formed of a block having a pointed attachment in a direction toward the center of the disk 100, and a capture groove 143 may be formed at the end of the attachment.
  • the partition portion 134 may have an attachment at a distal end facing radially outward of the disk 100, and attachment of the cell trapping portion 141 and the attachment of the partition portion 134 may be alternately disposed. Accordingly, the cell solution flowing through the cell transfer channel 132 defined by the partition portion 134 may be branched into two branches while meeting the cell trapping portion 141 and transferred to the cell recovery region 160.
  • the cell recovery area 160 communicates with the plurality of cell transfer channels 132 in the inner space of the disk 100 and may be connected to the discharge port 161.
  • FIG. 3 is a partially cut-away perspective view showing a partial cut-away view of a cell dispensing and culturing disk according to an embodiment of the present invention, showing a cell supply area 120, a cell distribution area 130, and a cell recovery area 160 A three-dimensional perspective view is shown.
  • the cell supply region 120 may include a diffusion part 123 and a transient part 125.
  • the diffusion part 123 is connected to the injection hole 121 and may have a wide integrated annular area.
  • the transition part 125 may extend from the diffusion part 123 and be fluidly connected to the cell transfer channel 132 of the cell distribution region 130.
  • the height of the cell transfer channel 132 measured in the thickness direction of the disk may be formed to be lower than the height of the diffusion part 123, and the transient part 125 starts from the height of the diffusion part 123 and the cell transfer channel 132 It can be gradually lowered to the height of.
  • the cell transfer channel 132 of the cell distribution region 130 may be formed by positioning a plurality of partitions 134 in the inner space of the disk 100. That is, the partition portion 134 is provided as a partition block formed to contact the upper surface and the bottom surface of the inner space of the disk 100 to form a boundary between the cell transfer channel 132 and separate neighboring ones from each other.
  • the partition portion 134 extends long in the radial direction of the disk 100, and the width in the circumferential direction of the disk 100 may gradually expand as it goes outward in the radial direction. Accordingly, the width of the cell transfer channel 132 in the circumferential direction may gradually decrease as it goes outward in the radial direction.
  • the cell recovery region 160 may include a re-diffusion unit 163, and the re-diffusion unit 163 may be connected to an outlet 161 adjacent to an edge of the disk 100.
  • the re-diffusion unit 163 is fluidly connected to the cell transfer channel 132 and may provide a space in which the remaining cells other than the cells captured by the cell capture unit 141 gather again.
  • FIG. 4 is an enlarged perspective view of a part of a cell dispensing and culturing disk according to an embodiment of the present invention, showing an enlarged view of the cell capture unit 141 and the cell culture unit 152.
  • the capture groove 143 of the cell capture part 141 may be fluidly connected to the cell culture part 152, and the cell culture part 152 is formed of a cell transfer channel 132.
  • a culture space 154 may be provided on a second layer separated from the first floor.
  • the cell culture unit 152 may include a cell collection unit 156 communicating with the capture groove 143, and the cell collection unit 156 is connected to the culture space 154 of the cell culture unit 152.
  • the cell culture unit 152 provides a culture space 154 adjacent to the capture block of the cell capture unit 141, and this culture space 154 is the capture groove 143 through the cell collection unit 156. Can be connected to.
  • the cell collection unit 156 is disposed to overlap the capture groove 143, whereby the first layer and the cell culture unit ( It may serve as a passage connecting the second floor where 152 is located.
  • the cell culture unit 152 may be connected to the cell discharge unit 171 opened to the outside of the disk 100.
  • the cell discharge unit 171 may be connected to a portion spaced apart from the cell collection unit 156 in the cell culture unit 152, and the opening of the cell collection unit 156 from the culture space 154 of the cell culture unit 152 It can extend in a direction opposite to the direction.
  • the cell discharge part 171 may include a first discharge pipe 172 communicating with the culture space 154 of the cell culture part 152 and a second discharge pipe 174 opened to the outside of the disk 100 therefrom.
  • the second discharge pipe 174 may have a funnel shape whose diameter increases toward the surface of the disk 100.
  • the second discharge tube 174 may be closed by attaching an adhesive film to the surface of the disk 100 during the process of dispensing and culturing cells.
  • FIG. 5 is a perspective view showing a real-time monitoring system for cell dispensing and culturing according to another embodiment of the present invention
  • FIG. 6 is a perspective view showing an enlarged disk drive unit of the monitoring system shown in FIG. 5.
  • the monitoring system 300 may include a disk driving unit 320, a fluorescence image capturing unit 340, and a control unit 360 in a housing 310.
  • the housing 310 is made of a container having a substantially rectangular parallelepiped shape, and its upper surface may be opened to allow the carrying of the disk 100 in and out.
  • the disk driving unit 320 is a part that rotates by fixing the disk 100 for cell dispensing and cultivation, and referring to FIG. 6, a motor that generates a rotational force and a central region of the disk 100 are connected to a rotation shaft of the motor. It may include a fixing member 321 fitted to (110).
  • the motor may include a step motor or a servo motor, and the fixing member 321 may be formed of a convex portion that can be fitted according to the shape of the central region 110 of the disk 100.
  • the fluorescence image capture unit 340 is a portion for capturing an image while observing fluorescence emitted by cells cultured and processed in the cell culture unit 152 of the disk 100 and may include a light source and a fluorescence microscope.
  • the light source may include an LED light source
  • the fluorescence microscope may be provided with an inverted microscope in which the objective lens is positioned below the sample. That is, the fluorescence image pickup unit 340 may observe cells in the cell culture unit 152 with a fluorescence microscope located under the disk 100. That is, the growth of cells can be measured through real-time imaging, and the amount of protein produced in each culture section can be measured using a fluorescent reagent.
  • an incubating chamber 350 surrounding and protecting the disk 100 may be provided in a region in which the disk 100 is fixed and rotated.
  • the incubating chamber 350 is made of a container having an outer shape of a substantially rectangular parallelepiped and may be mounted on the stage 315 located at the inner upper end of the housing 310.
  • the fixing member 321 of the disk driving unit 320 may penetrate and protrude, and the disk 100 may be seated thereon.
  • the stage 315 may be in contact with the objective lens of the fluorescence microscope, through which the observation window 352 made of transparent glass at a portion corresponding to the objective lens so that the cell culture portion 152 of the disk 100 can be observed. It may include. That is, the incubating chamber 350 may be separated from the fluorescence image pickup unit 340 and outside air to protect the disk 100 and maintain an environment suitable for cell culture.
  • a sample introduction door 354 through which the disk 100 can be carried in and out may be installed on the upper surface of the incubating chamber 350.
  • the sample introduction door 354 may be slidably opened and closed, and may be formed at least a size sufficient to carry in/out the disk 100.
  • the control unit 360 is a part for controlling the operation of components included in the housing 310 of the monitoring system 300, and may include a temperature controller, a gas controller, an optical controller, and a disk drive controller.
  • the temperature controller and the gas controller may be controlled to maintain a constant temperature and humidity inside the incubating chamber 350.
  • a heater may be installed around the incubating chamber 350 and a gas injection pipe may be installed to be connected to the connector 362.
  • a sensor capable of detecting the temperature and humidity in the incubating chamber 350 may be installed to provide the sensed temperature and humidity information to the temperature controller and the gas controller.
  • the optical controller controls the operation of the light source and the glare microscope, and the disk drive controller may control the rotation of the motor driving the disk 100. That is, the disk drive controller can rotate the disk 100 at a predetermined speed for separation of cells, or stop the disk 100 for observing the cells inside the disk 100 and capturing images, and such disk drive control Synchronized with, the optical controller can open and close the light source and control the imaging of the glare microscope.
  • the monitoring system 300 may include a GPU (Graphic Processing Unit) computer inside the housing 310, and may store and analyze an image captured by a fluorescence microscope using this.
  • a display is attached to the front of the monitoring system 300 to display the stored and analyzed images, and a shelf is provided on the lower front of the housing 310 to accommodate input means such as a keyboard and a mouse. have.
  • FIGS. 8 to 12 are views for explaining a method of distributing and culturing cells according to another embodiment of the present invention.
  • a disk 100 for dispensing and culturing cells is prepared (S110).
  • the disk 100 for dispensing and culturing cells may be prepared as a disk 100 as described with reference to FIGS. 1 to 4.
  • cells are injected into the injection port 121 of the disk 100 (S120).
  • a cell solution containing cells to be dispensed may be injected in an appropriate amount into each injection port 121 of the disk 100 using a pipette 20.
  • the disk 100 is rotated while the disk 100 is fixed to the monitoring system 300 described with reference to FIGS. 5 and 6, and a cell solution can be injected into each injection port 121.
  • the cell solution may be injected into the disk 100 through the injection port 121 and then fixed to the monitoring system 300.
  • the cells injected by rotating the disk 100 may be distributed and transferred for each cell transfer channel 132 (S130).
  • the disk 100 may be mounted on the fixing member 321 of the monitoring system 300 and rotated. As shown in FIG. 9, as the disk 100 rotates, a centrifugal force acts on the injected cell solution to move the cells CL outward in the radial direction of the disk 100. That is, the injected cell solution diffuses from the cell supply region 120 and moves the cells to the cell distribution region 130, and in the cell distribution region 130, the cells may be dispersed and moved for each cell transfer channel 132.
  • the cell transfer channel 132 has a height and width in micrometers, and when a cell solution moves through it, a capillary force acts to promote the movement of cells.
  • the transferred cells are captured in the capture groove 143 (S140). Since the capturing groove 143 formed in the cell capturing portion 141 of the disk 100 has a radius of curvature of approximately a size corresponding to the radius of a single cell, as shown in FIG. 10, the cell transfer channel 132 is formed. Cells (CL) moving along may be captured one by one in the capture groove (143). At this time, cells that are not captured in the capture groove 143 may flow together as the cell solution flows out to the cell recovery region 160, and the flowed out cells may be recovered through the outlet 161.
  • the captured cells are moved to the cell collection unit 156 (S150).
  • the cells captured in the capture groove 143 may be moved to the cell collection unit 156 by turning the disk 100 over and leaving it for a predetermined time.
  • the cells captured by gravity may be moved to the cell collection unit 156 in the process of moving downward without providing a separate driving force.
  • the disk 100 is rotated to move the cells of the cell collection unit 156 to the cell culture unit 152 (S160). Since the cell collection unit 156 is located at the beginning of the cell culture unit 152, the disk 100 may be rotated so that the cells CL located therein enter the inside of the cell culture unit 152. That is, the plurality of capture grooves 143 each capture a single cell, and the cell collection units 156 connected to each capture groove 143 move the single cells CL to each cell culture unit. Can be stored in 152. Then, the cell separation can be completed by turning the disk 100 over again. Therefore, in a state in which cell separation is completed, one cell may be separated and stored in each cell culture unit 152.
  • the separated cells are cultured in the cell culture unit 152 (S170). While maintaining the cell culture conditions in the incubating chamber 350 of the monitoring system 300 of the disk 100, as shown in FIG. 12, cells (CL) stored in the culture space 154 of the cell culture unit 152 ) Can be cultivated.
  • cell growth is measured through real-time imaging (S180).
  • cell growth may be measured through real-time imaging using the monitoring system 300 shown in FIG. 5.
  • the cell culture unit 152 of the disk 100 may be monitored through the fluorescence image pickup unit 340 while slowly rotating the disk 100.
  • the amount of protein produced in each culture section is measured using a fluorescent reagent (S190).
  • a fluorescent reagent When a fluorescent reagent is introduced into the cell culture unit 152, it reacts with proteins generated by the cultured cells to emit fluorescence. The emitted fluorescence image may be observed by the fluorescence image capture unit 340 to measure the amount of generated protein.
  • the cultured cells are extracted from the cell culture unit 152 (S200).
  • Cells cultured in the cell culture unit 152 may be selected, and the selected cells may be extracted through the cell discharge unit 171 using a pipette.
  • the cell discharge part 171 of the disk 100 may be closed by attaching a film to the surface of the disk 100 during the cell separation and culture process, and the cell discharge part 171 is removed after the cell separation and culture are completed. By removing the blocking film, you can open it and extract the cells.
  • the real-time monitoring system, and the cell dispensing and culturing method at least thousands of single cells can be simultaneously dispensed, and each of the separated single cells is transferred to the culture space. After positioning, it can be incubated and monitored in real time through imaging.
  • a cell line (adherent cell) having a target reactant is introduced into a space outside the culture chamber and cultured. It can be induced to bind to the cell line.
  • a fluorescent antibody that reacts with a specific protein is introduced to react with a specific protein, and then confirmed through real-time fluorescence imaging, the cells in which the specific protein and the target reactant have reacted can be identified. It can be seen that it is a target new drug protein.
  • disk for dispensing cells disk 110: central area
  • injection port 123 diffusion
  • transient 130 cell distribution region
  • outlet 163 re-diffusion unit
  • monitoring system 310 housing
  • stage 320 disk drive
  • fixing member 340 fluorescence imaging imaging unit

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Abstract

본 개시의 세포 분주 및 배양용 디스크는, 주입구와 배출구를 갖는 디스크로서, 상기 주입구에 연결되는 세포 공급 영역, 상기 디스크의 반경 방향으로 연장되는 세포 이송 채널을 포함하는 세포 분배 영역, 상기 세포 이송 채널의 단부에 근접하여 포획 홈을 갖는 세포 포획부, 및 상기 포획 홈에 연결된 공간을 갖는 세포 배양부를 포함한다.

Description

세포 분주 및 배양용 디스크, 실시간 모니터링 시스템 및 세포 분주 및 배양 방법
본 개시는 세포 분주 및 배양용 디스크, 실시간 모니터링 시스템 및 이를 사용한 세포 분주 및 배양 방법에 관한 것이다.
세포를 이용한 단백질 생산은 제약산업에서 가장 중요한 부분이다. 세포를 이용해 특정한 단백질 약품을 생산하기 위해서는, CHO (Chinese hamster ovary) 세포 등을 유전자 조작하여 특정 단백질이 과발현 및 분비되도록 만든다. 이후 목적 단백질을 가장 잘 분비하고 생장이 좋은 세포를 선별해 바이오 리액터에 도입하고 복제과정을 수없이 반복하여 단백질을 채취한다.
목적 단백질을 과발현 되도록 유전자 조작을 할 때 일반적으로 수 만개 이상의 세포에서 트랜스펙션(transfection) 과정을 통해 유전자를 세포로 도입한다. 하지만 유전자가 도입되고 발현되는 정도는 각 세포마다 크게 차이가 나기 때문에 단일 세포 수준에서 가장 단백질을 잘 만들어 내는 생육이 좋은 세포를 선별하는 것이 단백질 제약에서 가장 중요한 부분이다.
현재는 수십 개의 웰을 가지는 플레이트에 각 웰당 최소 수백 개의 세포를 분배하고 각 웰에서 생산된 목적 단백질의 양을 측정하여 가장 적합한 웰의 세포들을 바이오 리액터에 도입한다. 이러한 방법에 따르면 가장 단백질을 잘 만드는 단일 세포를 배양한 것에 비해 수십에서 수백 배 수율이 낮아 생산성이 떨어지고 시간이 오래 걸리며 큰 비용을 지출해야 하는 등의 많은 문제를 안고 있다.
이러한 문제를 해결하기 위하여 단일세포로 분리하여 분주 후 실험할 수 있으나, 현재의 기술로는 분리과정에 많은 시간, 노력 및 비용이 소요된다. 또한 분리된 단일세포를 미세한 공간에 넣을 기술이 없어 기존의 수십 개의 웰을 가지는 웰 플레이트 등에 넣어 실험해야 하는데, 웰 플레이트의 각 웰은 단일세포에 비해 최소 수천 배 큰 공간으로, 이들을 현미경을 통한 이미징으로 세포 생장을 실시간 모니터링이 하는 것은 불가능한 실정이다.
또한, 단백질 신약개발을 위해서는 단일세포가 분비하는 단백질과 목적 반응물질(항원) 간의 결합을 확인하는 것이 신약개발의 핵심부분이다. 하지만 같은 유전자 조작을 한 세포들 조차 분비하는 단백질의 종류가 다르고, 비슷한 아형이 많아 이들 중 목적 반응물질과 반응하는 단백질을 생산하는 단일세포를 찾아내는 것은 매우 어려운 일이다. 현재는 웰 플레이트 등에 유전자 조작된 세포주와 목적 반응물질을 가지는 세포주를 섞어 배양하고 이들을 이미징 혹은 분자생물학적 분석을 통해 유력 세포군을 찾아낸다. 이러한 방식은 많은 비용과 노력이 소모됨에도 불구하고, 수천 개의 웰에서 실험이 불가능하며, 실험 후에도 단일 세포를 특정할 수 없어 정확한 신약 단백질을 찾아내기 어렵다.
실시예의 일측면은 최소 수천 개의 단일 세포를 동시에 분주할 수 있고, 또한 분리된 단일 세포를 각각 한 개씩 배양 공간으로 위치시킨 후 이를 배양하고, 이미징을 통해 실시간 모니터링 할 수 있는 세포 분주 및 배양용 디스크를 제공하고자 한다.
실시예의 다른 일측면은 세포 분주 및 배양용 디스크를 장착하여 실시간 모니터링 하면서 세포 분주와 배양을 수행할 수 있는 실시간 모니터링 시스템과 이를 이용한 세포 분주 및 배양 방법을 제공하고자 한다.
그러나, 본 발명의 실시예들이 해결하고자 하는 과제는 상술한 과제에 한정되지 않고 본 발명에 포함된 기술적 사상의 범위에서 다양하게 확장될 수 있다.
한 실시예에 따른 세포 분주 및 배양용 디스크는, 주입구와 배출구를 갖는 디스크로서, 상기 주입구에 연결되는 세포 공급 영역, 상기 디스크의 반경 방향으로 연장되는 세포 이송 채널을 포함하는 세포 분배 영역, 상기 세포 이송 채널의 단부에 근접하여 포획 홈을 갖는 세포 포획부, 및 상기 포획 홈에 연결된 공간을 갖는 세포 배양부를 포함한다.
상기 세포 배양부의 공간은 상기 세포 이송 채널과 구분되는 서로 다른 층에 위치할 수 있다.
상기 세포 분배 영역과 연통되며 상기 배출구에 연결되는 세포 회수 영역을 더 포함할 수 있다.
상기 디스크 두께 방향으로 측정한 높이에서, 상기 세포 분배 영역의 높이는 상기 세포 공급 영역의 높이보다 더 낮을 수 있다.
상기 세포 이송 채널은 상기 디스크의 반경 방향 외측으로 갈수록 폭이 더 좁아질 수 있다.
상기 포획 홈은 상기 디스크의 중심을 향하는 방향으로 오목하게 형성될 수 있다.
상기 포획 홈은 단일 세포의 반경에 대응하는 곡률 반경을 가질 수 있다.
상기 세포 배양부는 상기 디스크의 외부로 개구되는 세포 토출부에 연결될 수 있다.
다른 실시예에 따른 세포 분주 및 배양용 디스크는, 내부 공간으로 연결된 주입구와 배출구를 표면에 갖는 디스크로서, 상기 내부 공간에 위치하며 상기 주입구에 연결되는 세포 공급 영역, 상기 내부 공간에서 상기 세포 공급 영역과 이어지며, 상기 디스크의 반경 방향으로 각각 연장되는 복수의 세포 이송 채널을 포함하는 세포 분배 영역, 상기 세포 이송 채널의 단부에 근접하여 포획 홈을 갖는 세포 포획부, 상기 포획 홈에 연결된 배양 공간을 갖는 세포 배양부, 및 상기 세포 이송 채널과 연통되며 상기 배출구에 연결되는 세포 회수 영역을 포함할 수 있다.
상기 주입구와 배출구는 상기 디스크의 반경 방향으로 서로 이격되어 있고, 상기 주입구는 상기 디스크의 중심에 더 가깝고, 상기 배출구는 상기 디스크의 가장자리에 더 가까울 수 있다.
상기 세포 공급 영역은, 상기 주입구와 연결되는 확산부, 및 상기 확산부로부터 연장되어 상기 확산부의 상기 디스크 두께 방향으로 측정한 높이보다 낮은 부분을 가지며 상기 세포 이송 채널로 연결되는 과도부를 포함할 수 있다.
상기 세포 분배 영역은 상기 디스크의 반경 방향으로 연장되는 복수의 칸막이부를 포함하고, 상기 칸막이부는 상기 세포 이송 채널의 경계를 이룰 수 있다.
상기 세포 이송 채널 각각은 상기 디스크의 반경 방향 외측으로 갈수록 폭이 더 좁아질 수 있다.
상기 포획 홈은 상기 디스크의 중심을 향하는 방향으로 오목하게 형성될 수 있다.
상기 포획 홈은 단일 세포의 반경에 대응하는 곡률 반경을 가질 수 있다.
상기 세포 포획부는 상기 디스크의 중심을 향하는 방향으로 뾰족한 첨부를 가지며, 상기 포획 홈은 상기 첨부의 끝에 하나씩 위치할 수 있다.
상기 세포 이송 채널의 경계를 이루는 복수의 칸막이부를 포함하고, 상기 칸막이부 각각은 상기 디스크의 반경 방향 외측을 향하는 말단부에 첨부를 가지며, 상기 세포 포획부의 첨부와 상기 칸막이부의 첨부는 서로 교번하여 배치될 수 있다.
상기 세포 포획부는 상기 세포 이송 채널의 하류에 위치하며 복수의 상기 세포 이송 채널 각각에 대응하는 개수만큼 제공될 수 있다.
상기 세포 배양부의 배양 공간은 상기 세포 이송 채널이 위치하는 제1 층과 구분되는 제2 층에 위치할 수 있다.
상기 세포 배양부는 상기 포획 홈과 연통되는 세포 포집부를 더 포함하고, 상기 세포 포집부는 상기 디스크의 회전 축에 수직한 평면상에서 볼 때 상기 포획 홈과 중첩하도록 배치될 수 있다.
상기 세포 배양부는 상기 디스크의 외부로 개구되는 세포 토출부에 연결되고, 상기 세포 토출부는 상기 세포 포집부와 이격된 부분에 연결될 수 있다.
상기 세포 토출부는 상기 세포 배양부의 배양 공간과 연통되는 제1 토출관과, 상기 제1 토출관보다 더 큰 직경을 가지며 상기 디스크 외측으로 개구되는 제2 토출관을 포함할 수 있다.
상기 세포 회수 영역은 상기 세포 분배 영역과 상기 배출구 사이에 위치하는 재확산부를 더 포함할 수 있다.
또 다른 실시예에 따른 세포 분주 및 배양을 위한 실시간 모니터링 시스템은, 세포 분주 및 배양용 디스크를 반입하여 회전 구동 시키며 세포를 분주 및 배양하는 모니터링 시스템으로서, 상기 세포 분주 및 배양용 디스크를 장착하여 회전시킬 수 있는 디스크 구동부, 및 상기 세포 분주 및 배양용 디스크의 하부에서 세포 배양부에 대응하도록 위치하여 광을 조사하고 반사된 형광을 측정할 수 있는 형광 이미지 촬상부를 포함한다.
또 다른 실시예에 따른 세포 분주 및 배양을 위한 실시간 모니터링 시스템은, 상기 형광 이미지 촬상부 및 외기로부터 분리되어 상기 세포 분주 및 배양용 디스크를 둘러싸도록 제공되는 인큐베이팅 챔버를 더 포함할 수 있다.
또 다른 실시예에 따른 세포 분주 및 배양 방법은, 내부 공간으로 연결된 주입구와 배출구를 표면에 갖는 세포 분주 및 배양용 디스크를 준비하는 단계, 상기 주입구에 세포를 주입하는 단계, 상기 세포 분주 및 배양용 디스크를 회전시키며 상기 주입된 세포를 복수의 세포 이송 채널별로 분산하여 이송하는 단계, 상기 세포 분주 및 배양용 디스크를 회전시키며 상기 세포 이송 채널의 하류에 위치한 세포 포획부의 포획 홈으로 상기 이송된 세포로부터 단일 세포를 포획하는 단계, 및 상기 포획된 단일 세포를 세포 배양부로 이동시키는 단계를 포함할 수 있다.
상기 포획된 단일 세포를 세포 배양부로 이동시키는 단계는, 상기 세포 분주 및 배양용 디스크를 뒤집어 상기 포획된 단일 세포를 중력으로 세포 포집부로 이동시키는 과정, 및 상기 세포 분주 및 배양용 디스크를 회전시켜 상기 세포 포집부의 단일 세포를 상기 세포 배양부로 이동시키는 과정을 더 포함할 수 있다.
또 다른 실시예에 따른 세포 분주 및 배양 방법은, 상기 세포 배양부에서 상기 단일 세포를 배양하는 단계, 및 상기 배양된 세포를 상기 세포 배양부에서 추출하는 단계를 더 포함할 수 있다.
또 다른 실시예에 따른 세포 분주 및 배양 방법은 실시간 이미징을 통해 상기 세포 배양부에서 배양된 세포의 생장을 측정하는 단계, 및 형광 시약을 이용해 상기 세포 배양부에 생성된 단백질의 양을 측정하는 단계를 더 포함할 수 있다.
또 다른 실시예에 따른 세포 분주 및 배양 방법은, 상기 포획된 단일 세포를 제외한 나머지 상기 이송된 세포를 상기 세포 분주 및 배양용 디스크의 배출구로부터 회수하는 단계를 더 포함할 수 있다.
실시예에 따른 세포 분주 및 배양용 디스크, 실시간 모니터링 시스템 및 세포 분주 및 배양 방법에 의하면, 최소 수천 개의 단일 세포를 동시에 분주할 수 있고, 또한 분리된 단일 세포를 각각 한 개씩 배양 공간으로 위치시킨 후 이를 배양하고, 이미징을 통해 실시간 모니터링 할 수 있다.
또한, 실시예에 따른 디스크의 설계를 통해, 단일 세포로 분리된 수천 개의 세포를 각 배양실에서 배양하고 실시간 모니터링 함으로써, 가장 생육이 좋은 단일 세포 및 목적 단백질을 가장 많이 생산하는 단일 세포를 획득할 수 있다.
도 1은 본 발명의 한 실시예에 따른 세포 분주 및 배양용 디스크를 도시한 사시도이다.
도 2는 본 발명의 한 실시예에 따른 세포 분주 및 배양용 디스크를 도시한 평면도 및 확대 평면도이다.
도 3은 본 발명의 한 실시예에 따른 세포 분주 및 배양용 디스크의 일부를 절단하여 도시한 부분 절단 사시도이다.
도 4는 본 발명의 한 실시예에 따른 세포 분주 및 배양용 디스크의 일부를 확대하여 도시한 사시도이다.
도 5는 본 발명의 다른 실시예에 따른 세포 분주 및 배양을 위한 실시간 모니터링 시스템을 도시한 사시도이다.
도 6은 도 5에 도시된 모니터링 시스템의 디스크 구동부를 확대하여 도시한 사시도이다.
도 7은 본 발명의 또 다른 실시예에 따른 세포 분주 및 배양 방법을 도시한 순서도이다.
도 8 내지 도 12는 본 발명의 또 다른 실시예에 따른 세포 분주 및 배양 방법을 설명하기 위한 도면이다.
이하, 첨부한 도면을 참조하여 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 상세히 설명한다. 도면에서 본 발명을 명확하게 설명하기 위해서 설명과 관계없는 부분은 생략하였으며, 명세서 전체를 통하여 동일 또는 유사한 구성요소에 대해서는 동일한 참조부호를 붙였다. 또한, 첨부된 도면은 본 명세서에 개시된 실시예를 쉽게 이해할 수 있도록 하기 위한 것일 뿐, 첨부된 도면에 의해 본 명세서에 개시된 기술적 사상이 제한되지 않으며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
또한, 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함" 한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
도 1은 본 발명의 한 실시예에 따른 세포 분주 및 배양용 디스크를 도시한 사시도이다.
도 1을 참조하면, 본 실시예에 따른 세포 분주 및 배양용 디스크(100)(이하에서 간략히 '디스크'로도 표기함)는 원반형의 외관을 가지며 중심에서부터 가장자리까지 반경 방향을 따라 대략 중심 영역(110), 더미 영역(115), 세포 공급 영역(120), 세포 분배 영역(130), 및 세포 회수 영역(160)으로 구분될 수 있다.
중심 영역(110)은 디스크(100)의 중심을 포함하며 소정의 반경을 갖는 원형의 영역으로 이루어질 수 있다. 디스크(100)는 회전 구동력을 제공하는 장치에 고정되어 사용될 수 있는데, 이를 위해 중심 영역(110)에는 상기 장치에 고정될 수 있도록 홈이나 돌기가 구비될 수 있다. 더미 영역(115)은 중심 영역(110) 경계로부터 반경 방향 외측으로 소정의 거리만큼 확장되는 환형 영역으로 이루어질 수 있다.
세포 공급 영역(120), 세포 분배 영역(130), 및 세포 회수 영역(160)은 더미 영역(115) 경계로부터 반경 방향 외측으로 가장자리까지 확장될 수 있다. 이들 영역에서는 외부로부터 디스크(100) 내부 공간으로 세포를 공급하고 분배하여 단일 세포별로 포획하고 나머지 세포를 회수하는 공정이 수행될 수 있다.
디스크(100)는 전체가 투명한 플라스틱 재질로 이루어질 수 있으며, 일례로 투명한 폴리프로필렌(polyprophylene, PP) 또는 폴리스티렌(polystyrene, PS)으로 제작될 수 있다.
도 2는 본 발명의 한 실시예에 따른 세포 분주 및 배양용 디스크를 도시한 평면도 및 확대 평면도로서, 세포 공급 영역(120), 세포 분배 영역(130), 및 세포 회수 영역(160)을 확대하여 도시하였다.
도 2를 참조하면, 본 실시예에 따른 세포 분주 및 배양용 디스크(100)는 내부 공간으로 연결된 주입구(121)와 배출구(161)를 구비할 수 있다. 주입구(121)와 배출구(161)는 내부 공간으로부터 외부로 개구될 수 있으며, 디스크(100)의 반경 방향으로 서로 이격되어 있다. 이 때 주입구(121)는 디스크(100)의 중심에 더 가깝고 배출구(161)는 디스크(100)의 가장자리에 더 가깝게 위치할 수 있다. 또한 세포 공급 영역(120)은 디스크(100)의 내부 공간에서 주입구(121)와 연결되는 영역이고, 세포 회수 영역(160)은 디스크(100)의 내부 공간에서 배출구(161)와 연결되는 영역이다.
세포 분배 영역(130)은 세포 공급 영역(120)과 세포 회수 영역(160) 사이에서 복수의 세포 이송 채널(132)을 제공하여 공급된 세포를 분배하고 포획할 수 있다. 즉, 디스크(100)의 내부 공간에 디스크(100)의 반경 방향으로 연장되는 복수의 칸막이부(134)가 위치하여 복수의 세포 이송 채널(132)이 형성될 수 있다.
세포 분배 영역(130)과 세포 회수 영역(160)의 경계에는 세포 포획부(141)가 위치할 수 있다. 세포 포획부(141)는 복수의 세포 이송 채널(132) 각각에 대응하는 개수만큼 제공될 수 있으며, 세포 이송 채널(132)의 말단부에 근접하여 배치될 수 있다. 각각의 세포 포획부(141)는 포획 홈(143)을 하나씩 가지며, 포획 홈(143)은 세포 이송 채널(132)의 하류에 위치하여 디스크(100)의 중심을 향하는 방향으로 오목하게 형성될 수 있다. 또한 포획 홈(143)은 단일 세포의 반경에 대응하는 곡률 반경을 가질 수 있으며, 이로써 하나의 단일 세포 포획이 가능하다.
한편, 세포 포획부(141)는 디스크(100)의 중심을 향하는 방향으로 뾰족한 첨부를 갖는 블록으로 이루어질 수 있으며, 첨부의 끝에 포획 홈(143)이 형성될 수 있다. 칸막이부(134)는 디스크(100)의 반경 방향 외측을 향하는 말단부에 첨부를 가질 수 있으며, 세포 포획부(141)의 첨부와 칸막이부(134)의 첨부는 서로 교번하여 배치될 수 있다. 따라서 칸막이부(134)에 의해 경계가 형성되는 세포 이송 채널(132)을 통해서 흐르던 세포 용액은 세포 포획부(141)를 만나면서 두 갈래로 분기되어 세포 회수 영역(160)으로 전달될 수 있다.
세포 회수 영역(160)은 디스크(100)의 내부 공간에서 복수의 세포 이송 채널(132)과 연통되며 배출구(161)에 연결될 수 있다.
도 3은 본 발명의 한 실시예에 따른 세포 분주 및 배양용 디스크의 일부를 절단하여 도시한 부분 절단 사시도로서, 세포 공급 영역(120)과 세포 분배 영역(130) 및 세포 회수 영역(160)의 입체 사시도를 도시하였다.
도 3을 참조하면, 세포 공급 영역(120)은 확산부(123)와 과도부(125)를 포함할 수 있다. 확산부(123)는 주입구(121)와 연결되며 넓게 통합된 환형의 영역을 가질 수 있다. 과도부(125)는 확산부(123)로부터 연장되어 세포 분배 영역(130)의 세포 이송 채널(132)로 유체적으로 연결될 수 있다. 디스크 두께 방향으로 측정한 세포 이송 채널(132)의 높이는 확산부(123)의 높이보다 낮게 형성될 수 있으며, 과도부(125)는 확산부(123)의 높이로부터 시작하여 세포 이송 채널(132)의 높이까지 점진적으로 낮아질 수 있다.
세포 분배 영역(130)의 세포 이송 채널(132)은 디스크(100)의 내부 공간에 복수의 칸막이부(134)가 위치함으로써 형성될 수 있다. 즉, 칸막이부(134)는 디스크(100)의 내부 공간의 상면과 바닥면에 접촉하도록 형성되는 칸막이 블록으로 제공되어 세포 이송 채널(132)의 경계를 이루며 이웃한 것끼리 서로 분리할 수 있다. 이러한 칸막이부(134)는 디스크(100)의 반경 방향으로 길게 연장되며, 반경 방향 외측으로 갈수록 디스크(100)의 원주 방향 폭이 점진적으로 확장될 수 있다. 이에 따라 세포 이송 채널(132)은 반경 방향 외측으로 갈수록 원주 방향 폭이 점진적으로 좁아질 수 있다.
세포 회수 영역(160)은 재확산부(163)를 포함하고, 재확산부(163)는 디스크(100)의 가장자리에 인접한 배출구(161)에 연결될 수 있다. 재확산부(163)는 세포 이송 채널(132)에 유체적으로 연결되며 세포 포획부(141)에서 포획된 세포를 제외한 나머지 세포들이 다시 모이는 공간을 제공할 수 있다.
도 4는 본 발명의 한 실시예에 따른 세포 분주 및 배양용 디스크의 일부를 확대하여 도시한 사시도로서, 세포 포획부(141)와 세포 배양부(152)를 확대하여 도시하였다.
도 4를 참조하면, 세포 포획부(141)의 포획 홈(143)은 세포 배양부(152)와 유체적으로 연결될 수 있으며, 세포 배양부(152)는 세포 이송 채널(132)이 형성되는 제1 층과 구분되는 제2 층에 배양 공간(154)을 가질 수 있다.
이 때 세포 배양부(152)는 포획 홈(143)과 연통되는 세포 포집부(156)를 구비할 수 있으며, 세포 포집부(156)는 세포 배양부(152)의 배양 공간(154)과 연결될 수 있다. 즉, 세포 배양부(152)는 세포 포획부(141)의 포획 블록에 인접하여 배양 공간(154)을 마련하고, 이러한 배양 공간(154)은 세포 포집부(156)를 통하여 포획 홈(143)으로 연결될 수 있다. 디스크(100)의 회전 축에 수직한 평면상에서 보았을 때 세포 포집부(156)는 포획 홈(143)과 중첩하도록 배치되며, 이로써 세포 이송 채널(132)이 위치하는 제1 층과 세포 배양부(152)가 위치하는 제2 층을 연결하는 통로 역할을 할 수 있다.
한편, 세포 배양부(152)는 디스크(100)의 외부로 개구되는 세포 토출부(171)에 연결될 수 있다. 세포 토출부(171)는 세포 배양부(152)에서 세포 포집부(156)와 이격된 부분에 연결될 수 있으며, 세포 배양부(152)의 배양 공간(154)으로부터 세포 포집부(156)의 개구 방향과 반대 방향을 향해 연장될 수 있다.
세포 토출부(171)는 세포 배양부(152)의 배양 공간(154)과 연통되는 제1 토출관(172)과 이로부터 디스크(100) 외측으로 개구되는 제2 토출관(174)을 포함할 수 있다. 이 때, 제2 토출관(174)은 디스크(100) 표면으로 갈수록 직경이 확장되는 깔때기 형상으로 이루어질 수 있다. 제2 토출관(174)은 세포의 분주 및 배양 과정 동안 디스크(100) 표면에 접착성 필름을 부착하여 폐쇄될 수 있다.
도 5는 본 발명의 다른 실시예에 따른 세포 분주 및 배양을 위한 실시간 모니터링 시스템을 도시한 사시도이고, 도 6은 도 5에 도시된 모니터링 시스템의 디스크 구동부를 확대하여 도시한 사시도이다.
도 5를 참조하면, 본 실시예에 따른 모니터링 시스템(300)은 하우징(310) 내에 디스크 구동부(320), 형광 이미지 촬상부(340) 및 제어부(360)를 포함할 수 있다. 하우징(310)은 대략 직육면체 외형을 갖는 용기로 이루어지며, 그 상면은 디스크(100)의 반출입이 가능하도록 개구되어 있을 수 있다.
디스크 구동부(320)는 세포 분주 및 배양용 디스크(100)를 고정시켜 회전 구동하는 부분으로서, 도 6을 참조하면, 회전력을 발생시키는 모터와, 모터의 회전축에 연결되고 디스크(100)의 중심 영역(110)에 끼워지는 고정부재(321)를 포함할 수 있다. 모터는 스텝 모터 또는 서보 모터를 포함할 수 있으며, 고정부재(321)는 디스크(100)의 중심 영역(110) 형상에 따라 끼워 맞춤 될 수 있는 볼록부로 이루어질 수 있다.
형광 이미지 촬상부(340)는 디스크(100)의 세포 배양부(152)에서 배양되고 처리된 세포들이 내보이는 형광을 관찰하며 이미지 캡쳐하는 부분으로서, 광원과 형광 현미경을 포함할 수 있다. 광원은 LED 광원을 포함할 수 있으며, 형광 현미경은 대물렌즈의 위치가 시료보다 아래에 위치한 도립 현미경(Inverted Microscope)으로 구비될 수 있다. 즉, 형광 이미지 촬상부(340)에서는 디스크(100)의 아래에 위치한 형광 현미경으로 세포 배양부(152) 내의 세포를 관찰할 수 있다. 즉, 실시간 이미징을 통해 세포의 생장을 측정할 수 있고, 형광 시약을 이용해 각 배양부에 생성된 단백질의 양을 측정할 수도 있다.
이 때 디스크(100)가 고정되어 회전하는 구역에 디스크(100)를 둘러싸 보호하는 인큐베이팅 챔버(350)가 제공될 수 있다. 이러한 인큐베이팅 챔버(350)는 대략 직육면체의 외형을 갖는 용기로 이루어지며 하우징(310)의 내부 상단에 위치한 스테이지(315) 상에 장착될 수 있다. 스테이지(315)에는 디스크 구동부(320)의 고정부재(321)가 관통하여 돌출될 수 있으며,그 위에 디스크(100)가 안착될 수 있다. 또한 스테이지(315)는 형광 현미경의 대물렌즈와 접할 수 있으며, 이를 통하여 디스크(100)의 세포 배양부(152)를 관찰할 수 있도록 대물렌즈에 대응하는 부분에 투명한 유리로 이루어진 관측 창(352)을 포함할 수 있다. 즉, 인큐베이팅 챔버(350)는 형광 이미지 촬상부(340) 및 외기로부터 분리되어 디스크(100)를 보호하고 세포 배양에 적합한 환경을 유지하도록 할 수 있다.
인큐베이팅 챔버(350)의 상면에는 이를 통해 디스크(100)를 반출입할 수 있는 시료 도입문(354)이 설치될 수 있다. 시료 도입문(354)은 슬라이딩 개폐 가능하며 적어도 디스크(100)를 반입/반출할 수 있을 정도의 크기로 이루어질 수 있다.
제어부(360)는 모니터링 시스템(300)의 하우징(310) 내에 구비되는 구성요소들의 작동을 제어하는 부분으로서, 온도 제어기, 가스 제어기, 광학 제어기 및 디스크 구동 제어기를 포함할 수 있다.
온도 제어기와 가스 제어기는 인큐베이팅 챔버(350) 내부의 온도와 습도를 일정하게 유지하도록 제어할 수 있다. 이를 위해 인큐베이팅 챔버(350) 주위에 히터가 설치될 수 있고 가스 주입관이 설치되어 커넥터(362)에 연결될 수 있다. 또한 인큐베이팅 챔버(350) 내의 온도와 습도를 감지할 수 있는 센서가 설치되어 감지된 온도와 습도 정보를 온도 제어기와 가스 제어기로 제공할 수 있다.
광학 제어기는 광원과 현광 현미경의 작동을 제어하며, 디스크 구동 제어기는 디스크(100)를 구동하는 모터의 회전을 제어할 수 있다. 즉, 디스크 구동 제어기는 세포의 분리를 위하여 디스크(100)를 소정의 속도로 회전하거나, 디스크(100) 내부의 세포의 관찰 및 이미지 캡쳐를 위하여 디스크(100)를 멈출 수 있고, 이러한 디스크 구동 제어와 동기화되어 광학 제어기는 광원의 개폐와 현광 현미경의 촬상 제어를 할 수 있다.
모니터링 시스템(300)은 GPU (Graphic Processing Unit) 컴퓨터를 하우징(310) 내부에 포함할 수 있으며, 이를 사용하여 형광 현미경에서 캡쳐한 이미지를 저장하고 분석할 수 있다. 또한 모니터링 시스템(300)의 전면에는 디스플레이가 부착되어 상기 저장되고 분석된 이미지를 표시할 수 있으며, 하우징(310)의 하부 전면으로 쉘프(shelf)가 마련되어 입력수단인 키보드와 마우스 등을 수납할 수 있다.
도 7은 본 발명의 또 다른 실시예에 따른 세포 분주 및 배양 방법을 도시한 순서도이고, 도 8 내지 도 12는 본 발명의 또 다른 실시예에 따른 세포 분주 및 배양 방법을 설명하기 위한 도면이다.
먼저, 세포 분주 및 배양용 디스크(100)를 준비한다(S110). 세포 분주 및 배양용 디스크(100)는 상기 도 1 내지 도 4를 참조하여 설명한 바와 같은 디스크(100)로 준비될 수 있다.
다음으로, 디스크(100)의 주입구(121)에 세포를 주입한다(S120). 도 8에 도시된 바와 같이, 분주하고자 하는 세포를 포함하는 세포 용액을 피펫(20)을 사용하여 디스크(100)의 각 주입구(121)에 적정량으로 주입할 수 있다. 상기 도 5 및 6을 참조하여 설명한 모니터링 시스템(300)에 디스크(100)를 고정한 상태로 이를 회전시키며 각 주입구(121)마다 세포 용액을 주입할 수 있다. 대안적으로 주입구(121)를 통해 디스크(100)에 세포 용액을 주입한 다음 모니터링 시스템(300)에 고정시킬 수도 있다.
다음으로, 디스크(100)를 회전시켜 주입된 세포를 세포 이송 채널(132)별로 분산하여 이송할 수 있다(S130). 디스크(100)를 모니터링 시스템(300)의 고정부재(321)에 장착하여 회전 구동할 수 있다. 도 9에 도시된 바와 같이, 디스크(100)가 회전하면서 주입된 세포 용액에 원심력이 작용하여 세포(CL)들을 디스크(100)의 반경 방향 외측으로 이동시킬 수 있다. 즉, 주입된 세포 용액은 세포 공급 영역(120)에서 확산하면서 세포 분배 영역(130)으로 세포를 이동시키고, 세포 분배 영역(130)에서는 세포들이 세포 이송 채널(132)별로 분산되어 이동할 수 있다. 세포 이송 채널(132)은 마이크로미터 단위의 높이와 폭으로 이루어져 세포 용액이 이를 통해 이동할 때 모세관력(capillary force)이 작용하여 세포들의 이동을 촉진할 수 있다.
다음으로, 이송된 세포를 포획 홈(143)으로 포획한다(S140). 디스크(100)의 세포 포획부(141)에 형성된 포획 홈(143)은 곡률반경이 대략 단일 세포의 반경에 대응하는 크기로 이루어지므로, 도 10에 도시된 바와 같이, 세포 이송 채널(132)을 따라 이동하던 세포(CL)들은 포획 홈(143)에 하나씩 포획될 수 있다. 이 때 포획 홈(143)에 포획되지 않은 세포들은 세포 용액이 세포 회수 영역(160)으로 흘러 나감에 따라 함께 흘러갈 수 있으며, 이렇게 흘러 나간 세포들은 배출구(161)를 통해 다시 회수될 수 있다.
다음으로, 포획된 세포를 세포 포집부(156)로 이동시킨다(S150). 포획 홈(143)에 포획된 세포는 디스크(100)를 뒤집어 소정 시간 방치함으로써 세포 포집부(156)로 이동될 수 있다. 이 때, 도 11에 도시된 바와 같이, 별도의 구동력을 제공하지 않고도 중력에 의해 포획된 세포가 아래로 이동하는 과정에서 세포 포집부(156)로 이동될 수 있다.
다음으로, 디스크(100)를 회전시켜 세포 포집부(156)의 세포를 세포 배양부(152)로 이동시킨다(S160). 세포 포집부(156)는 세포 배양부(152)의 초입에 위치하므로 이에 위치한 세포(CL)들을 세포 배양부(152)의 안쪽으로 들어가도록 디스크(100)를 회전시킬 수 있다. 즉, 복수개로 마련되는 포획 홈(143)은 각각 단일 세포를 포획하게 되고, 각각의 포획 홈(143)과 연결된 세포 포집부(156)는 상기 단일 세포(CL)를 이동시켜 각각의 세포 배양부(152)에 저장할 수 있다. 그리고 나서 디스크(100)를 다시 뒤집음으로써 세포 분리를 완료할 수 있다. 따라서 세포 분리가 완료된 상태에서는 각 세포 배양부(152)에 하나씩의 세포가 분리되어 저장될 수 있다.
다음으로, 세포 배양부(152)에서 상기 분리된 세포를 배양한다(S170). 디스크(100)를 모니터링 시스템(300)의 인큐베이팅 챔버(350) 내에서 세포 배양 조건을 유지하면서, 도 12에 도시된 바와 같이, 세포 배양부(152)의 배양 공간(154)에 저장된 세포(CL)들을 배양할 수 있다.
다음으로, 실시간 이미징을 통해 세포의 생장을 측정한다(S180). 일례로, 도 5에 도시된 모니터링 시스템(300)을 이용한 실시간 이미징을 통해 세포의 생장을 측정할 수 있다. 이 때 디스크(100)를 서서히 회전시키면서 형광 이미지 촬상부(340)를 통하여 디스크(100)의 세포 배양부(152)를 모니터링할 수 있다.
다음으로, 형광 시약을 이용해 각 배양부에 생성된 단백질의 양을 측정한다(S190). 세포 배양부(152) 내로 형광 시약을 도입시키면 배양된 세포들에 의해 생성된 단백질과 반응하여 형광을 발광할 수 있다. 이렇게 발광된 형광 이미지는 형광 이미지 촬상부(340)에서 관측하여 생성된 단백질의 양을 측정할 수 있다.
다음으로, 배양된 세포를 세포 배양부(152)에서 추출한다(S200). 세포 배양부(152)에서 배양된 세포들을 선택하고 피펫을 사용하여 세포 토출부(171)를 통해 선택된 세포들을 추출할 수 있다. 이 때 디스크(100)의 세포 토출부(171)는 세포 분리 및 배양 과정 동안은 디스크(100) 표면에 필름을 부착하여 폐쇄될 수 있으며, 세포 분리 및 배양이 완료된 후 세포 토출부(171)를 막고 있던 필름을 제거함으로써 개방하여 세포들을 추출할 수 있다.
상기에 설명한 실시예에 따른 세포 분주 및 배양용 디스크, 실시간 모니터링 시스템 및 세포 분주 및 배양 방법에 의하면, 최소 수천 개의 단일 세포를 동시에 분주할 수 있고, 또한 분리된 단일 세포를 각각 한 개씩 배양 공간으로 위치시킨 후 이를 배양하고, 이미징을 통해 실시간 모니터링 할 수 있다.
즉, 실시예에 따른 디스크의 설계를 통해, 단일 세포로 분리된 수천 개의 세포를 각 배양실에서 배양하고 실시간 모니터링 함으로써, 가장 생육이 좋은 단일 세포 및 목적 단백질을 가장 많이 생산하는 단일 세포를 획득할 수 있다.
또한 수천 개의 단일 세포를 각 배양실에 도입한 다음, 목적 반응물질을 가지는 세포주(부착세포)를 배양실 밖의 공간에 도입 후 배양하여, 각 단일 세포가 분비하는 특정 단백질이 배양실 밖으로 확산되면서 반응물질을 가지는 세포주와 결합하도록 유도할 수 있다. 이후 특정 단백질과 반응하는 형광 항체를 도입하여 특정 단백질과 반응하게 한 후, 실시간 형광 이미징을 통해 확인하면, 특정 단백질과 목적 반응물질이 반응한 세포를 확인할 수 있고, 이를 통해 특정 배양실 내의 단일 세포가 목적 신약 단백질임을 알 수 있다.
이상을 통해 본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 설명하였지만, 본 발명은 이에 한정되는 것이 아니고 특허청구범위와 발명의 상세한 설명 및 첨부한 도면의 범위 안에서 여러 가지로 변형하여 실시하는 것이 가능하고 이 또한 본 발명의 범위에 속하는 것은 당연하다.
<부호의 설명>
100: 세포 분주용 디스크, 디스크 110: 중심 영역
115: 더미 영역 120: 세포 공급 영역
121: 주입구 123: 확산부
125: 과도부 130: 세포 분배 영역
132: 세포 이송 채널 134: 칸막이부
141: 세포 포획부 143: 포획 홈
152: 세포 배양부 154: 배양 공간
156: 세포 포집부 160: 세포 회수 영역
161: 배출구 163: 재확산부
171: 세포 토출부
300: 모니터링 시스템 310: 하우징
315: 스테이지 320: 디스크 구동부
321: 고정부재 340: 형광 이미징 촬상부
350: 인규베이팅 챔버 352: 관측 창
354: 시료 도입문 360: 제어부
362: 커넥터

Claims (30)

  1. 주입구와 배출구를 갖는 디스크로서,
    상기 주입구에 연결되는 세포 공급 영역;
    상기 디스크의 반경 방향으로 연장되는 세포 이송 채널을 포함하는 세포 분배 영역;
    상기 세포 이송 채널의 단부에 근접하여 포획 홈을 갖는 세포 포획부; 및
    상기 포획 홈에 연결된 공간을 갖는 세포 배양부
    를 포함하는 세포 분주 및 배양용 디스크.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 세포 배양부의 공간은 상기 세포 이송 채널과 구분되는 서로 다른 층에 위치하는, 세포 분주 및 배양용 디스크.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 세포 분배 영역과 연통되며 상기 배출구에 연결되는 세포 회수 영역을 더 포함하는, 세포 분주 및 배양용 디스크.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 디스크 두께 방향으로 측정한 높이에서, 상기 세포 분배 영역의 높이는 상기 세포 공급 영역의 높이보다 더 낮은, 세포 분주 및 배양용 디스크.
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기 세포 이송 채널은 상기 디스크의 반경 방향 외측으로 갈수록 폭이 더 좁아지는, 세포 분주 및 배양용 디스크.
  6. 제 1 항에 있어서,
    상기 포획 홈은 상기 디스크의 중심을 향하는 방향으로 오목하게 형성되는, 세포 분주 및 배양용 디스크.
  7. 제 1 항에 있어서,
    상기 포획 홈은 단일 세포의 반경에 대응하는 곡률 반경을 갖는, 세포 분주 및 배양용 디스크.
  8. 제 1 항에 있어서,
    상기 세포 배양부는 상기 디스크의 외부로 개구되는 세포 토출부에 연결되는, 세포 분주 및 배양용 디스크.
  9. 내부 공간으로 연결된 주입구와 배출구를 표면에 갖는 디스크로서,
    상기 내부 공간에 위치하며 상기 주입구에 연결되는 세포 공급 영역;
    상기 내부 공간에서 상기 세포 공급 영역과 이어지며, 상기 디스크의 반경 방향으로 각각 연장되는 복수의 세포 이송 채널을 포함하는 세포 분배 영역;
    상기 세포 이송 채널의 단부에 근접하여 포획 홈을 갖는 세포 포획부;
    상기 포획 홈에 연결된 배양 공간을 갖는 세포 배양부; 및
    상기 세포 이송 채널과 연통되며 상기 배출구에 연결되는 세포 회수 영역
    을 포함하는 세포 분주 및 배양용 디스크.
  10. 제 9 항에 있어서,
    상기 주입구와 배출구는 상기 디스크의 반경 방향으로 서로 이격되어 있고,
    상기 주입구는 상기 디스크의 중심에 더 가깝고, 상기 배출구는 상기 디스크의 가장자리에 더 가까운, 세포 분주 및 배양용 디스크.
  11. 제 9 항에 있어서,
    상기 세포 공급 영역은,
    상기 주입구와 연결되는 확산부; 및
    상기 확산부로부터 연장되어 상기 확산부의 상기 디스크 두께 방향으로 측정한 높이보다 낮은 부분을 가지며 상기 세포 이송 채널로 연결되는 과도부
    를 포함하는, 세포 분주 및 배양용 디스크.
  12. 제 9 항에 있어서,
    상기 세포 분배 영역은 상기 디스크의 반경 방향으로 연장되는 복수의 칸막이부를 포함하고, 상기 칸막이부는 상기 세포 이송 채널의 경계를 이루는, 세포 분주 및 배양용 디스크.
  13. 제 9 항에 있어서,
    상기 세포 이송 채널 각각은 상기 디스크의 반경 방향 외측으로 갈수록 폭이 더 좁아지는, 세포 분주 및 배양용 디스크.
  14. 제 9 항에 있어서,
    상기 포획 홈은 상기 디스크의 중심을 향하는 방향으로 오목하게 형성되는, 세포 분주 및 배양용 디스크.
  15. 제 9 항에 있어서,
    상기 포획 홈은 단일 세포의 반경에 대응하는 곡률 반경을 갖는, 세포 분주 및 배양용 디스크.
  16. 제 9 항에 있어서,
    상기 세포 포획부는 상기 디스크의 중심을 향하는 방향으로 뾰족한 첨부를 가지며, 상기 포획 홈은 상기 첨부의 끝에 하나씩 위치하는, 세포 분주 및 배양용 디스크.
  17. 제 16 항에 있어서,
    상기 세포 이송 채널의 경계를 이루는 복수의 칸막이부를 포함하고,
    상기 칸막이부 각각은 상기 디스크의 반경 방향 외측을 향하는 말단부에 첨부를 가지며,
    상기 세포 포획부의 첨부와 상기 칸막이부의 첨부는 서로 교번하여 배치되는, 세포 분주 및 배양용 디스크.
  18. 제 9 항에 있어서,
    상기 세포 포획부는 상기 세포 이송 채널의 하류에 위치하며 복수의 상기 세포 이송 채널 각각에 대응하는 개수만큼 제공되는, 세포 분주 및 배양용 디스크.
  19. 제 9 항에 있어서,
    상기 세포 배양부의 배양 공간은 상기 세포 이송 채널이 위치하는 제1 층과 구분되는 제2 층에 위치하는, 세포 분주 및 배양용 디스크.
  20. 제 9 항에 있어서,
    상기 세포 배양부는 상기 포획 홈과 연통되는 세포 포집부를 더 포함하고, 상기 세포 포집부는 상기 디스크의 회전 축에 수직한 평면상에서 볼 때 상기 포획 홈과 중첩하도록 배치되는, 세포 분주 및 배양용 디스크.
  21. 제 20 항에 있어서,
    상기 세포 배양부는 상기 디스크의 외부로 개구되는 세포 토출부에 연결되고,
    상기 세포 토출부는 상기 세포 포집부와 이격된 부분에 연결되는, 세포 분주 및 배양용 디스크.
  22. 제 21 항에 있어서,
    상기 세포 토출부는 상기 세포 배양부의 배양 공간과 연통되는 제1 토출관과, 상기 제1 토출관보다 더 큰 직경을 가지며 상기 디스크 외측으로 개구되는 제2 토출관을 포함하는, 세포 분주 및 배양용 디스크.
  23. 제 9 항에 있어서,
    상기 세포 회수 영역은 상기 세포 분배 영역과 상기 배출구 사이에 위치하는 재확산부를 더 포함하는, 세포 분주 및 배양용 디스크.
  24. 세포 분주 및 배양용 디스크를 반입하여 회전 구동 시키며 세포를 분주 및 배양하기 위한 실시간 모니터링 시스템에 있어서,
    상기 세포 분주 및 배양용 디스크를 장착하여 회전시킬 수 있는 디스크 구동부; 및
    상기 세포 분주 및 배양용 디스크의 하부에서 세포 배양부에 대응하도록 위치하여 광을 조사하고 반사된 형광을 측정할 수 있는 형광 이미지 촬상부
    를 포함하는 모니터링 시스템.
  25. 제 24 항에 있어서,
    상기 형광 이미지 촬상부 및 외기로부터 분리되어 상기 세포 분주 및 배양용 디스크를 둘러싸도록 제공되는 인큐베이팅 챔버를 더 포함하는 모니터링 시스템.
  26. 내부 공간으로 연결된 주입구와 배출구를 표면에 갖는 세포 분주 및 배양용 디스크를 준비하는 단계;
    상기 주입구에 세포를 주입하는 단계;
    상기 세포 분주 및 배양용 디스크를 회전시키며 상기 주입된 세포를 복수의 세포 이송 채널별로 분산하여 이송하는 단계;
    상기 세포 분주 및 배양용 디스크를 회전시키며 상기 세포 이송 채널의 하류에 위치한 세포 포획부의 포획 홈으로 상기 이송된 세포로부터 단일 세포를 포획하는 단계; 및
    상기 포획된 단일 세포를 세포 배양부로 이동시키는 단계
    를 포함하는 세포 분주 및 배양 방법.
  27. 제 26 항에 있어서,
    상기 포획된 단일 세포를 세포 배양부로 이동시키는 단계는,
    상기 세포 분주 및 배양용 디스크를 뒤집어 상기 포획된 단일 세포를 중력으로 세포 포집부로 이동시키는 과정, 및
    상기 세포 분주 및 배양용 디스크를 회전시켜 상기 세포 포집부의 단일 세포를 상기 세포 배양부로 이동시키는 과정을 더 포함하는 세포 분주 및 배양 방법.
  28. 제 26 항에 있어서,
    상기 세포 배양부에서 상기 단일 세포를 배양하는 단계; 및
    상기 배양된 세포를 상기 세포 배양부에서 추출하는 단계
    를 더 포함하는 세포 분주 및 배양 방법.
  29. 제 28 항에 있어서,
    실시간 이미징을 통해 상기 세포 배양부에서 배양된 세포의 생장을 측정하는 단계; 및
    형광 시약을 이용해 상기 세포 배양부에 생성된 단백질의 양을 측정하는 단계
    를 더 포함하는 세포 분주 및 배양 방법.
  30. 제 26 항에 있어서,
    상기 포획된 단일 세포를 제외한 나머지 상기 이송된 세포를 상기 세포 분주 및 배양용 디스크의 배출구로부터 회수하는 단계
    를 더 포함하는 세포 분주 및 배양 방법.
PCT/KR2020/015090 2019-11-01 2020-10-30 세포 분주 및 배양용 디스크, 실시간 모니터링 시스템 및 세포 분주 및 배양 방법 WO2021086136A1 (ko)

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