WO2017069587A1 - 생체 시료의 선별적 분석방법 - Google Patents

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김성식
정윤진
김진현
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서울대학교산학협력단
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    • G01N2001/282—Producing thin layers of samples on a substrate, e.g. smearing, spinning-on with mapping; Identification of areas; Spatial correlated pattern

Definitions

  • the technology disclosed herein relates to a selective analysis method of a biological sample, and more particularly, to a method of selecting and analyzing a biological sample with high accuracy while maintaining an original state.
  • tissue As an example of a biological sample, tissue consists of a very large number of cells and not all of them have the same DNA or RNA. Therefore, for example, in order to accurately determine which cancerous tissues have abnormalities, a technique for selecting only cancer cells with high purity is necessary.
  • the technique of sorting a sample based on the size of the material or surface fluorescence enables precise sorting based on the surface physical properties of the material, but in the process of eluting the sample, the original tissue form or placement of the sample is lost. Since screening is based on points and some reference characteristics, specificity is poor and image information cannot be considered. In addition, a technique of eluting cells and then sorting them in microwells through image information also has a problem in that the original morphology (Morphology) cannot be maintained as it is.
  • preparing a substrate on which biological samples are disposed Distinguishing an area in which at least one target specimen is located from an area in which the at least one non-target specimen is located; Forming a masking structure for selectively masking an area where the non-target sample is located; Reacting the target sample by introducing a biochemical reaction reagent into a region where the target sample is located; And analyzing the target sample on the substrate or recovering and analyzing the sample from the substrate.
  • preparing a substrate on which biological samples are disposed Distinguishing an area in which at least one target sample is located from an area in which at least one non-target sample is located; Forming a masking film layer on the substrate for selectively masking a region where the non-target sample is located; Stripping the masking film layer from the substrate to remove the untargeted sample and to leave the target sample on the substrate; Introducing a biochemical reaction reagent into a region where the target sample is located or recovering the target sample from the substrate and reacting the target sample with the biochemical reaction reagent; And it provides a selective analysis method of a biological sample comprising the step of analyzing the target sample reacted.
  • preparing a substrate on which biological samples are disposed Distinguishing an area in which at least one target sample is located from an area in which at least one non-target sample is located; Forming a masking structure for selectively masking an area where the non-target sample is located; Dissolving the target sample by introducing a lysis solution into a region where the target sample is located; Preparing a library of nucleic acid molecules for sequencing by reacting nucleic acid molecules derived from the target sample with the biochemical reagent by the dissolution; Recovering the library of nucleic acid molecules from the substrate; And sequencing the recovered library of nucleic acid molecules.
  • preparing a substrate on which biological samples are disposed Distinguishing an area in which at least one target sample is located from an area in which at least one non-target sample is located; Forming a masking structure for selectively masking an area where the non-target sample is located; And introducing a biochemical reaction reagent into a region in which the target sample is located, and reacting the biological sample.
  • preparing a substrate on which biological samples are disposed Distinguishing an area in which at least one target sample is located from an area in which at least one non-target sample is located; Forming a masking structure for selectively masking an area where the non-target sample is located; Stripping the masking structure from the substrate together with the masked untargeted sample to remove the untargeted sample and leave the target sample on the substrate; And reacting the target sample by introducing a biochemical reaction reagent into a region where the target sample is located or recovering the target sample from the substrate, and then reacting the target sample with the biochemical reaction reagent.
  • a treatment method is provided.
  • preparing a substrate on which biological samples are disposed Distinguishing an area in which at least one target sample is located from an area in which at least one non-target sample is located; Selectively extracting only components of the target sample by selectively bonding or dissolving a region in which the target sample is located; After recovering the target sample from the substrate, there is provided a method for selectively treating a biological sample comprising the step of reacting the target sample with a biochemical reaction reagent.
  • preparing a substrate on which biological samples are disposed Distinguishing an area in which at least one target sample is located from an area in which at least one non-target sample is located; Providing a first microfluidic structure on the substrate; Introducing a curable material into the first microfluidic structure; Forming a masking structure by selectively applying energy to the curable material present in the region where the non-target sample is located to cure; Reacting the target sample by introducing a biochemical reaction reagent into a region where the target sample is located; And selectively analyzing a biological sample by analyzing the target sample on the substrate or recovering and analyzing the biological sample from the substrate, thereby providing a selective analysis method of the biological sample.
  • a first microfluidic structure providing unit for providing a first microfluidic structure for forming a masking structure on a substrate on which a biological sample is disposed;
  • a curable material injector for introducing a curable material into the first microfluidic structure;
  • a masking structure manufacturing unit for forming a masking structure by applying energy to the masking area and curing the masking area according to a user's request or a specific algorithm;
  • a first microfluidic structure removing unit for removing the first microfluidic structure from the substrate;
  • a second microfluidic structure providing unit providing a second microfluidic structure on the substrate for holding a biochemical reaction reagent;
  • a biochemical treatment unit for introducing a biochemical reaction reagent into a space between the second microfluidic structure and the substrate or applying energy of light, heat, agitation, vibration, or sound waves in order to proceed with a biochemical reaction.
  • a selective treatment apparatus is provided.
  • a first microfluidic structure providing unit for providing a first microfluidic structure for forming a masking structure on a substrate on which a biological sample is disposed;
  • a curable material injector for introducing a curable material into the first microfluidic structure;
  • a masking structure manufacturing unit for forming a masking structure by applying energy to the masking area and curing the masking area according to a user's request or a specific algorithm;
  • a selective treatment apparatus for a biological sample including a biochemical treatment unit for introducing a biochemical reaction reagent into the first microfluidic structure or applying energy of light, heat, agitation, vibration, or sound waves to proceed with a biochemical reaction.
  • a curable material injection portion for introducing a curable material into the first microfluidic structure;
  • a masking structure manufacturing unit for forming a masking structure by applying energy to the masking area and curing the masking area according to a user's request or a specific algorithm;
  • a biochemical treatment unit for introducing a biochemical reaction reagent into the first microfluidic structure or applying energy of light, heat, agitation, vibration, or sound waves to proceed with the biochemical reaction, wherein the first microfluidic structure is a biological sample.
  • a selective treatment apparatus for a biological sample wherein the sample is provided on a substrate on which is disposed.
  • the technology disclosed herein it is possible to separate the high specificity based on the type and location of the biological samples, and to manufacture the structure while maintaining the applied state, the original structure and shape of the target sample in the region where the target sample is located Analysis can be carried out while the target sample is not transferred to the corresponding vessel or substrate and then reacted to reduce the likelihood of contamination, provide high accuracy, and add additional conventional biochemical methodologies after sample separation. Has the effect can be applied as is without.
  • 1 is a process flow diagram showing an embodiment of a selective analysis method of a biological sample.
  • FIG. 2 shows two embodiments of a method for selectively analyzing a biological sample.
  • the left figure shows a method of reacting a target sample with a biochemical reaction reagent while leaving the masking structure on a substrate, and the right figure shows the removal of the masking structure from the substrate.
  • the method of reacting a target sample with a biochemical reaction reagent is shown.
  • FIG. 3 is a view showing an embodiment of the selective analysis method shown in FIG.
  • Figure 4 is an embodiment showing a method of forming a masking structure using a microfluidic structure.
  • Figure 5 is an embodiment showing the process of supplying and recovering the biochemical reaction reagent using the microfluidic structure.
  • FIG. 6 is an embodiment of a selective treatment apparatus for a biological sample.
  • FIG. 1 is a process flow diagram showing an embodiment of a selective analysis method of a biological sample.
  • step 110 a substrate on which biological samples are disposed is prepared.
  • the biological sample may be at least one selected from the group consisting of tissues, blood, cells, DNA, RNA, proteins, exosomes, metabolites, and biopsy specimens.
  • the biological sample is provided on a substrate using techniques such as stamping, rolling, smear, capillary, microfluidics, pipetting dispensing, and the like. Can be.
  • the substrate is not particularly limited as long as it provides a surface for supporting the biological sample, but is selected from the group consisting of slide glass, microbeads, nanoparticles, nanostructures, capillaries, microfluidic supports, pore structures, sponge structures, and dendrimers. It may be one or more kinds, or the substrate may be a substrate functionalized in part or in whole by one or more of a chemical functional group, DNA, RNA, protein.
  • the substrate may be made of glass, silicon or a polymer material.
  • the substrate may typically be slide glass.
  • the substrate may be a functionalized substrate modified with at least one member selected from the group consisting of DNA, RNA, protein, antibody, and chemical.
  • the substrate may be a microarray substrate in which biological samples such as DNA or protein are integrated, a massively parallele sequencing substrate.
  • step 120 the type and location of the biological samples are read to distinguish between an area in which at least one target sample is located and an area in which at least one non-target sample is located.
  • the reading of the type and location of the biological samples may be performed through, for example, image observation, fluorescent signals, or coordinate information.
  • the biological sample is not limited as long as it is a staining technique that can obtain information of the biological sample, but in the crowd consisting of Giemsa stain, hematoxylin and eosin stain (H & E), Fluorescence in situ hybridization (FISH), Immuno Fluorescence (IF), immunohistochemistry (IHC) It can be dyed by one dyeing technique to provide image information.
  • the image observation can be performed by using an observation tool such as an optical microscope or an electron microscope, for example.
  • the step of selecting the target sample may be performed by obtaining the positional information of the biological samples in a manner of direct observation through an optical microscope or an electron microscope or in an automated manner using separate software.
  • the target sample may be divided into several or tens of groups by using clustering or classification techniques in an automated manner, and then the target sample may be automatically or manually selected.
  • FIG. 2 shows two embodiments of a method for selectively analyzing a biological sample.
  • the left figure shows a method of reacting a target sample with a biochemical reaction reagent while leaving the masking structure on a substrate, and the right figure shows the removal of the masking structure from the substrate.
  • the method of reacting a target sample with a biochemical reaction reagent is shown.
  • a target sample that is, a sorting target to be sorted, is located by reading the types and positions of biological samples through image observation, fluorescent signals, or coordinate information on a substrate on which biological samples are arranged. Distinguish between the area where the sample is located and the area where the non-target sample is located.
  • FIG. 3 is a view showing an embodiment of the selective analysis method shown in FIG. Referring to the left figure of Figure 3, it can be seen that the target suspected cancer cells (cancer cells) during the observation of the image of the biological sample.
  • the type and location of the biological samples can be accurately classified through image observation, fluorescence signal, or coordinate information, so that the state of the coated sample can be selected as it is.
  • step 130 a masking structure for selectively masking the region where the non-target sample is located is formed.
  • the masking structure may be fabricated by applying the liquid masking material as a whole onto the substrate on which the biological sample is raised, and then selectively applying a physicochemical action only to selected areas.
  • a masking structure for selectively masking a region where a non-objective sample separated from the type and location reading result of the biological samples is formed is formed. That is, the target samples of interest are exposed for later biochemical reactions, and some or all of the non-target samples are masked with a predetermined structure so that reagents for the biochemical reaction do not penetrate the surrounding non-target samples.
  • the masking structure may be made of a material that is physically or chemically protected against a biochemical reaction reagent.
  • the masking structure may be made of one or more materials selected from the group consisting of polymer resins, waxes, metals, metal oxides, and glass.
  • forming the masking structure may include applying a curable material over the substrate and curing with light or heat.
  • the curable material may include unsaturated monomers, non-limiting examples of unsaturated monomers include ethoxylated trimethylolpropane triacrylate, curable epoxy (product name NOA), polyethylene glycol diacrylate, polypropylene glycol diacrylate, Polyurethane acrylates and combinations thereof.
  • the above-described polyethylene diacrylate has a structure having acrylate functional groups at both ends of polyethylene glycol, so that free radical polymerization can be crosslinked into a three-dimensional structure.
  • the curable material may include any form of medium that can change from a liquid to a solid.
  • the curable material may further include a nanomaterial or an initiator that converts electromagnetic waves into heat, and the initiator may cause free radical polymerization by an external energy source.
  • the initiator may be an azo compound or a peroxide.
  • the curable material may further include a suitable crosslinking agent, and examples thereof include N, N'-methylenebisacrylamide, methylenebismethacrylamide and ethylene glycol dimethacrylate.
  • Suitable energy sources for the curing reaction may include, without limitation, heat, ultraviolet light, visible light, infrared rays and electron beams.
  • the curable material may be a material that bonds to the substrate simultaneously with curing.
  • the masking structure can be more strongly fixed to the substrate by curing the material with the glass during curing.
  • the curable material may penetrate into a biological sample and be cured.
  • a basic dissolving reagent or proteinase may be mixed with a general curable material so that the curable material may penetrate between or inside tissues and then be cured by an external energy source.
  • Pretreatment of the biological sample may be included before supplying the curable material to increase the permeability of the curable material to the biological sample.
  • a chemical reaction that creates pores in the cell membrane can increase the permeability of the curable material.
  • the curable material may be provided after leaving only the cell nucleus in a biological sample through a biochemical reaction that dissolves the cell membrane but does not dissolve the nuclear membrane.
  • forming the masking structure may include applying a curable material to the substrate as a whole and curing with light or heat and then removing the remaining uncured material.
  • forming the masking structure may include dispensing the curable material along the shape of the masking structure and then curing with light or heat.
  • forming the masking structure may include providing a curable material through a microfludic chip or through a microfluidic chamber.
  • the masking structure may be formed by any one method selected from the group consisting of a lithography method, laser scanning, inkjet printing, and 3D printing method.
  • a lithography method for example, general photo mask lithography may be used, or maskless ligthography using a digital mirror device (DMD) may be used.
  • DMD digital mirror device
  • the masking structure can be fabricated at the location by applying a curable material to the area where the non-target sample is located and using optofluidic maskless lithography. Can be.
  • the masking structure is formed by applying a curable material on the substrate as a whole to form a masking structure in a large area, or leaving an area on the substrate where there is a non-target sample that is far from the desired target sample.
  • the masking structure may be formed only on the required area by applying only to an area having an untargeted sample located nearby.
  • the lithography method for forming the masking structure may be a method of performing a lithography in a large area without a lens between a mask and a substrate, and is a method of sequentially performing lithography on various areas of the curable material at high resolution using a lens.
  • the masking structure is sequentially formed using one or several kinds of fixed masks, thereby eliminating the need to change the mask every time the sample is changed.
  • the method of sequentially performing a lithography on a biological sample using the lens may further include an optimization algorithm for forming a masking structure on a desired sample region using one or several kinds of fixed masks.
  • the method may further include an optimization algorithm for forming a masking structure on a desired target sample region using a digital mirror device (DMD).
  • DMD digital mirror device
  • Lithography using one or several kinds of fixed masks may further include a method of adjusting the size and resolution of the masking structure by adjusting the magnification of the lens.
  • the method for forming the masking structure may be a method of forming a masking structure structured by an optical lithography method using a mask in which a patterned pattern is engraved.
  • the standardized pattern may be a lattice masking pattern. This method does not form the masking structure only around the selected target sample, but the standardized masking structure can be formed to include the target sample, and the masking structure forming process is simpler than the maskless lithography.
  • the method of forming the masking structure may be a method of supplying a hydrophilic coating or a hydrophobic coating.
  • a hydrophobic coating agent may be provided around the target sample to form a masking structure, and then the aqueous solution may be supplied only to the inside of the masking structure.
  • the method for forming the masking structure may be a method of placing or assembling the already formed masking structure on a substrate.
  • the biological sample may be cultured after the masking structure is formed. For example, by selectively forming a masking structure only around a cell having a desired phenotype, and then culturing the cell, the cell can be cultured by separating the cell from another phenotype.
  • step 140 a biochemical reaction reagent is introduced into a region where the target sample is located and reacted with the target sample.
  • the biochemical reagents include a lysis solution, a reagent for PCR reaction, a reagent for whole genome amplification and a reagent for whole transcriptome amplification, reverse transcription, and reverse transcription PCR.
  • RT PCR in vitro transcription
  • rolling circle amplifciation bisulfite treatment
  • DNA extraction DNA extraction
  • RNA extraction protein extraction
  • genome editing accessible Reagents required for various biochemical reactions, such as permeabilization, cell in situ sequencing
  • lysis solution for example, a basic dissolution reagent or proteinase (Proteinase) may be used.
  • the biochemical reagent is a library preparation reaction for massively parallel sequencing including, for example, transposase, ligase, fragmentation, etc. It may be a reagent for.
  • the biochemical reagent may be introduced after covering the hydrogel on the biological sample in which the barrier structure is formed in order to minimize the diffusion of the biochemical.
  • agarose may be introduced onto a biological sample in which a barrier structure is formed, and then hardened to form a hydrogel, and biochemical reaction reagents may be introduced thereon.
  • the biochemical reagent may be introduced by soaking the biochemical reagent in the hydrogel and then covering the hydrogel on the biological sample.
  • the biochemical reaction reagent may be used for reagent injection for reacting a biomaterial on a DNA microarray substrate, a ultra high-capacity sequencing plate, or a flow cell for ultra high-capacity sequencing.
  • the biochemical reagent may be a decrosslink reagent that releases the crosslink of the curable curable material to form a barrier structure.
  • the barrier structure covers the region where the target sample is located, all biological samples around the region where the barrier structure is present are dissolved and removed, and then the decrosslink reagent is supplied to expose the target sample, followed by further biochemical reaction. Can be done.
  • the biochemical reaction may include a reaction in which different kinds of oligonucleotides are ligated and inserted into an existing reactant to tag the reactants of different microwells. .
  • the tagging method also includes beads, microparticles, hydrogels, droplets, or core-shell particles having different types of oligonucleotides attached thereto. It may include a method of injecting.
  • the tagging method may also include a method of assembling a microarray substrate to which oligonucleotides are attached and a substrate on which biological samples are placed.
  • the biochemical reaction may also include a reaction for ELISA, aptamer binding, and mass spectroscopy. Referring to the right picture of FIG.
  • the lysate solution spreads to the area where the target sample is located and around the target sample.
  • the dissolution reaction occurs only for the target sample present in the unmasked region, and the reaction does not occur for the biological sample present in the masked region so that the target sample can be selectively processed without contamination from other biological samples. .
  • the sample thus treated can be recovered and analyzed in a separate space.
  • the biochemical reaction reagent is introduced into a region where the target sample is located. There may be various ways of introducing the biochemical reaction reagent.
  • a masking structure may be formed around the non-objective samples that are present at a close distance from the target sample during patterning for masking. At this time, the introduction of the biochemical reaction reagent may be made within the range of the region in which the target sample is located and the masked region located around the target sample to prevent contamination from other samples.
  • the biochemical reaction reagent can be conveniently introduced within the range of the desired sample and the masked area around it.
  • the introduction of biochemical reaction reagents is not particularly limited but may be carried out by microdispensing or large volume pipetting such as inkjet printing. That is, if the biochemical reaction reagent does not reach far from the target sample, it can be conveniently reacted with a general large-capacity pipetting means. That is, since the surrounding unpurposed samples are protected by masking, it is not necessary to precisely introduce the biochemical reaction reagent into inkjet printing in a narrow area where the target sample is placed in order to prevent contamination from other non-purpose samples.
  • the treatment area of the biochemical reaction reagent may range from several tens of um to several mm.
  • a masking material may be applied and patterned entirely on the substrate to form the masking structure in large areas.
  • the masking structure may form a single large area film layer as a whole when the target sample region is exposed and the masking structure is formed over the periphery of the target sample and over a wider range.
  • the masking film layer thus formed may be peeled off from the substrate together with the non-purpose samples as long as the material has a high bonding strength with the non-purpose samples without high adhesion to the substrate. As a result, all untargeted samples are removed and only the target samples remain on the substrate.
  • the treatment method of the biochemical reaction reagent is more free than the above embodiment.
  • the target sample is analyzed on the substrate or recovered from the substrate.
  • the sample of interest may be analyzed on a substrate in reaction with a biochemical reagent, or with supernatant sequencing (NGS), mass spectrometry, RNA- with a solution recovered and recovered from the substrate. You can perform seq analysis.
  • the solution of the target sample may be recovered using a micromanipulator, liquid handler, ultrasonic wave, micro pipetting, or the like.
  • a method for selectively analyzing a biological sample in the following manner. First, a substrate on which biological samples are placed is prepared. Next, a region in which at least one target sample is located and a region in which at least one non-target sample is located are distinguished. The distinguishing step may include reading the type and location of the biological samples.
  • a masking structure is then formed to selectively mask the area where the non-target sample is located.
  • a lysis solution is introduced into a region where the target sample is located to dissolve the target sample.
  • the nucleic acid molecules derived from the target sample by the lysis are treated with a biochemical reaction reagent to prepare a library of the nucleic acid molecules for sequencing.
  • the library of nucleic acid molecules is then recovered from the substrate.
  • the biological sample on the substrate can then be selectively analyzed by sequencing the library of recovered nucleic acid molecules.
  • the sequencing may be performed by a high-throughput sequencing technique, such as next generation sequencing, which is highly efficient.
  • optical and electromagnetic signals sequentially generated according to the type of the nucleotide sequence may be provided together with the location information.
  • the ultra-high-capacity sequencing method analyzes hundreds of thousands of sequences at the same time, so that the analysis throughput is very high-throughput compared to the conventional sequencing method (statistics for the sequencing of the sample to be analyzed) Resources may be provided.
  • the selective treatment method of the target sample may include a process of easily removing the masking structure with a physical force with a biological sample other than the target sample without damaging the target sample.
  • the overall description of this process can proceed as follows:
  • a substrate on which biological samples are placed is prepared.
  • the type and location of the biological samples are read to distinguish an area in which at least one target sample is located from an area in which at least one non-target sample is located.
  • a masking structure for selectively masking the region where the non-target sample is located is formed.
  • the masking structure is peeled off from the substrate together with the masked untargeted sample to remove the untargeted sample and to leave the target sample on the substrate.
  • a biochemical reaction reagent is reacted with the target sample, and the target sample is analyzed.
  • a biochemical reaction reagent is introduced into a region where the target sample is located for reaction and analysis of the target sample to react the target sample and then analyzed on the substrate. can do.
  • the target sample remaining after the peeling process may be scraped off using a tool such as a knife, and then recovered from the substrate, and then reacted with a biochemical reagent, followed by analysis.
  • the target sample may be physically separated from the non-target sample by providing a material including an adhesive material or a cell lysis reagent in a region where the target sample is located for the reaction and analysis of the target sample. have.
  • a material including an adhesive material or a cell lysis reagent in a region where the target sample is located for the reaction and analysis of the target sample.
  • the adhesive material or the material including the cell lysis reagent may be a liquid, a solid, a polymer, a hydrogel, but is not limited thereto.
  • the adhesive material or the material containing the cell lysis reagent may have a particle form, wherein the diameter may be 0.1um ⁇ 1mm, preferably 1um ⁇ 100um.
  • the selective treatment method of the target sample may be using a microfluidic structure.
  • This method like other embodiments described above, includes: i) preparing a substrate on which biological samples are placed; and ii) reading the type and location of the biological samples so that at least one of the target samples and at least one region of the sample is located. And identifying the area where one non-objective sample is located. Iii) providing a first microfluidic structure on the substrate.
  • the first microfluidic structure may be in the form of a microfluidic chip or a microfluidic chamber.
  • the first microfluidic structure may have at least one opening for entering and exiting a fluid, such as a curable material.
  • the first microfluidic structure may have a form covering the substrate so as to surround a region in which the target sample is located among the biological samples. Thus, a space is created between the target sample and the first microfluidic structure.
  • a width between the substrate and a lower portion of the ceiling of the first microfluidic structure in the separation space may be 1 to 500 um.
  • a curable material is introduced into the first microfluidic structure to fill the space.
  • a masking structure is formed by selectively applying energy to the curable material present in the region where the non-target sample is located to cure.
  • the energy may be heat or light and may use a lithographic scheme for selective energy application.
  • the height of the masking structure may be limited according to the size of the separation space, and the curable material may be uniformly provided for the entire substrate, thereby reducing the consumption of the curable material.
  • the first microfluidic structure is removed from the substrate to obtain a substrate on which a masking structure is disposed in an area other than the target sample.
  • Figure 4 is an embodiment showing a method of forming a masking structure using a microfluidic structure.
  • step vii) and viii) may also be performed using microfluidic technology.
  • Figure 5 is an embodiment showing the process of supplying and recovering the biochemical reaction reagent using the microfluidic structure. Referring to FIG. 5, when a biochemical reaction reagent is supplied using a microfluidic structure, an inner region of the microfluidic structure may include a pre-formed masking structure therein (FIGS. 1-a to 1- in FIG. 5). d).
  • the microfluidic structure may be in contact with the top of the pre-formed masking structure.
  • the biochemical reaction reagent may be selectively provided to only a part of the unmasked region according to the size or structure of the microfluidic structure for providing the biochemical reaction reagent (2-a to 2-d of FIG. 5).
  • a second microfluidic structure is first provided on the substrate for the substrate on which the masking structure is formed, for the introduction and recovery of the biochemical reaction reagent using the microfluidic structure.
  • the second microfluidic structure may be in the form of a microfluidic chip or a microfluidic chamber.
  • the second microfluidic structure may include at least one opening for entering and exiting a fluid such as a biochemical reagent.
  • the second microfluidic structure may be the same structure as the first microfluidic structure. In this case, the second microfluidic structure may be used without removing the first microfluidic structure existing on the substrate.
  • the second microfluidic structure may be arranged on the outer side of the masking structure (1-b in FIG. 5) or to be in direct contact with the top side (2-b in FIG. 5), whereby the region of the target sample is located.
  • a separation space containing a biological sample may be formed through which a biochemical reaction reagent may be retained. If the 1-b method of FIG. 5 is selected, a chamber may be formed regardless of the shape of the masking structure by a general approach. In addition, if the 2-b method of FIG. 5 is selected, the biochemical reaction reagent may be selectively provided to only a part of the unmasked region according to the size or structure of the microfluidic structure for providing the biochemical reaction reagent.
  • a biochemical reaction reagent is then introduced into the second microfluidic structure to react the target sample. Subsequently, the target sample after the reaction is recovered and analyzed by the second microfluidic structure.
  • the biochemical reaction reagent may be supplied in a state in which the first microfluidic structure made in FIG. 4D is disposed without using the second microfluidic structure for introduction and recovery of the biochemical reaction reagent using the microfluidic structure.
  • the supply range of the reagent is limited to a certain space, thereby reducing the consumption of the reagent and preventing the evaporation of the reagent.
  • an apparatus for selectively processing a biological sample includes: i) a first microfluidic structure providing unit 610 for providing a first microfluidic structure for forming a masking structure on a substrate on which a biological sample is disposed; ii) a curable material injector 620 for introducing a curable material into the first microfluidic structure, iii) masking for forming a masking structure by applying energy to the masking area and curing the masking area according to a user's request or a specific algorithm.
  • a structure fabricator 630 iv) a first microfluidic structure remover 640 for removing the first microfluidic structure from the substrate, and v) a second microfluidic structure for retaining a biochemical reaction reagent.
  • the second microfluidic structure providing unit 650 and vi) a biochemical treatment unit 660 that applies energy of light, heat, agitation, vibration, or sound waves to proceed with the biochemical reaction.
  • the first and second microfluidic structure providing units 610 and 650 may include an electric stage, a motor, and an actuator.
  • the masking structure manufacturing unit 630 may include a lithography system, an inkjet printing system, or a 3D printing system.
  • the masking structure manufacturing unit 630 may include a photofluidic maskless lithography system.
  • the masking structure manufacturing unit 630 may include a UV light source, a digital mirror device, a lens, and the like.
  • the biochemical treatment unit 660 may include a storage means and a supply means of the biochemical reaction reagent.
  • the biochemical treatment unit 660 may include a reaction promoting device for applying a physical force, such as stirring, vibration or ultrasonic waves to the reaction space in which the target sample is located.
  • the biochemical processor 660 may further include a temperature controller for controlling the reaction temperature.
  • the apparatus for selectively treating the biological sample may include some or all of the components, and, for example, when used as a structure for introducing a biochemical reaction reagent without removing the first microfluidic structure, Since the second microfluidic structure is not required, the first microfluidic structure removing unit 640 and the second microfluidic structure removing unit 650 for removing the first microfluidic structure from the substrate may not be included. . In addition, when artificially manufacturing the first microfluidic structure, the first microfluidic structure providing unit 610 may not be required.
  • the target sample can be selectively and accurately processed from the biological sample containing the target sample in an economical and rapid manner, and can be usefully used for the selective analysis of the biological sample thereafter.
  • the selective treatment method or analysis method of the biological sample as described above it is possible to determine exactly which side or abnormality the tissue (especially cancer tissue) has.
  • cancer tissues extracted from cancer patients may be coated on slide glass, and then stained with a conventional staining reagent (eg, giemsa), and the desired cells may be selected, processed and recovered while observing under a microscope.
  • a conventional staining reagent eg, giemsa

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Abstract

생체 시료들이 배치된 기판을 준비하는 단계; 상기 시료들 중 적어도 하나의 목적 시료가 위치하는 영역과 적어도 하나의 비목적 시료가 위치하는 영역을 구분하는 단계; 상기 비목적 시료가 위치하는 영역을 선택적으로 마스킹하기 위한 마스킹 구조물을 형성하는 단계; 상기 목적 시료가 위치하는 영역에 생화학 반응 시약을 도입하여 상기 목적 시료를 반응시키는 단계; 및 상기 목적 시료를 상기 기판 상에서 분석하거나 상기 기판으로부터 회수하여 분석하는 단계를 포함하는 생체 시료의 선별적 분석방법이 제공된다.

Description

생체 시료의 선별적 분석방법
본 명세서에 개시된 기술은 생체 시료의 선별적 분석방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 생체 시료를 본래의 상태를 유지하면서 높은 정확도로 선별하여 분석하는 방법에 관한 것이다.
생체 시료의 일례로서, 조직은 매우 많은 수의 세포로 이루어져 있고 그 세포들이 모두 같은 DNA나 RNA를 가지고 있는 것은 아니다. 따라서 일례로 암 조직이 어떤 변이나 이상을 갖는지를 정확하게 판단하기 위해 암세포만을 순도높게 선별해내는 기술이 필요하다.
생체 시료를 선별하여 분석하는 종래의 기술들로서 미국공개특허 2014-0093911, PCT공개공보 WO2013-130714, 미국공개특허 2014-0357511 등이 있다.
물질의 크기나 표면 형광 등을 기준으로 샘플을 선별(sorting)하는 기술은 물질의 표면 물리적 특성을 기준으로 정밀한 선별이 가능하지만, 샘플을 용리하는 과정에서 샘플 본래의 조직 형태나 배치 상태를 잃어버린다는 점과 몇 가지의 기준 특성만을 바탕으로 선별하기 때문에 특이성이 떨어지고 이미지 정보를 고려하지 못하는 단점이 있다. 또한 세포를 용리시킨 뒤 마이크로웰에 담아 이미지 정보를 통해 선별하는 기술 또한 원래의 모폴로지(Morphology)를 자연 상태 그대로 유지하지 못한다는 문제가 있다.
상술한 바와 같이 샘플을 선별하기 위해서는 다루기 편리하도록 용액 상태에 용리(elution)시켜서 선별을 수행하는 방식이 일반적으로 알려져 있다. 하지만 대상 샘플의 특성은 그 자체의 이미지 뿐 아니라 주변 이미지에 의해서도 결정되며, 용액 상태로 용리된 샘플이 본래의 상태와 동일하다고 생각하기도 어렵다. 따라서 샘플의 본래 모폴러지를 변화시키지 않으면서 도포된 상태 그대로 선별하는 기술이 요구된다.
본 명세서에 개시된 기술의 일 측면에 의하면, 생체 시료들이 배치된 기판을 준비하는 단계; 상기 생체 시료들 중 적어도 하나의 목적 시료(target specimen)가 위치하는 영역과 적어도 하나의 비목적 시료(non-target specimen)가 위치하는 영역을 구분하는 단계; 상기 비목적 시료가 위치하는 영역을 선택적으로 마스킹하기 위한 마스킹 구조물을 형성하는 단계; 상기 목적 시료가 위치하는 영역에 생화학 반응 시약을 도입하여 상기 목적 시료를 반응시키는 단계; 및 상기 목적 시료를 상기 기판 상에서 분석하거나 상기 기판으로부터 회수하여 분석하는 단계를 포함하는 생체 시료의 선별적 분석방법을 제공한다.
본 명세서에 개시된 기술의 다른 측면에 의하면, 생체 시료들이 배치된 기판을 준비하는 단계; 상기 시료들 중 적어도 하나의 목적 시료가 위치하는 영역과 적어도 하나의 비목적 시료가 위치하는 영역을 구분하는 단계; 상기 비목적 시료가 위치하는 영역을 선택적으로 마스킹하기 위한 마스킹 필름 층을 상기 기판 위에 형성하는 단계; 상기 마스킹 필름 층을 상기 기판으로부터 박리함으로써 상기 비목적 시료를 제거하고 상기 목적 시료를 상기 기판 위에 남기는 단계; 상기 목적 시료가 위치하는 영역에 생화학 반응 시약을 도입하거나 상기 목적 시료를 상기 기판으로부터 회수한 후 상기 목적 시료와 생화학 반응 시약을 반응시켜 상기 목적 시료를 반응시키는 단계; 및 반응시킨 상기 목적 시료를 분석하는 단계를 포함하는 생체 시료의 선별적 분석방법이 제공된다.
본 명세서에 개시된 기술의 또 다른 측면에 의하면, 생체 시료들이 배치된 기판을 준비하는 단계; 상기 시료들 중 적어도 하나의 목적 시료가 위치하는 영역과 적어도 하나의 비목적 시료가 위치하는 영역을 구분하는 단계; 상기 비목적 시료가 위치하는 영역을 선택적으로 마스킹하기 위한 마스킹 구조물을 형성하는 단계; 상기 목적 시료가 위치하는 영역에 라이시스 용액을 도입하여 상기 목적 시료를 용해시키는 단계; 상기 용해에 의해 상기 목적 시료로부터 유래된 핵산 분자들을 생화학 반응시약으로 반응시켜 시퀀싱을 위한 상기 핵산 분자들의 라이브러리를 준비하는 단계; 상기 핵산 분자들의 라이브러리를 상기 기판으로부터 회수하는 단계; 및 회수된 상기 핵산분자들의 라이브러리를 시퀀싱하는 단계를 포함하는 생체 시료의 선별적 분석방법이 제공된다.
본 명세서에 개시된 기술의 또 다른 측면에 의하면, 생체 시료들이 배치된 기판을 준비하는 단계; 상기 시료들 중 적어도 하나의 목적 시료가 위치하는 영역과 적어도 하나의 비목적 시료가 위치하는 영역을 구분하는 단계; 상기 비목적 시료가 위치하는 영역을 선택적으로 마스킹하기 위한 마스킹 구조물을 형성하는 단계; 및 상기 목적 시료가 위치하는 영역에 생화학 반응 시약을 도입하여 반응시키는 단계를 포함하는 생체 시료의 선별적 처리방법이 제공된다.
본 명세서에 개시된 기술의 또 다른 측면에 의하면, 생체 시료들이 배치된 기판을 준비하는 단계; 상기 시료들 중 적어도 하나의 목적 시료가 위치하는 영역과 적어도 하나의 비목적 시료가 위치하는 영역을 구분하는 단계; 상기 비목적 시료가 위치하는 영역을 선택적으로 마스킹하기 위한 마스킹 구조물을 형성하는 단계; 상기 마스킹 구조물을 마스킹된 상기 비목적 시료와 함께 상기 기판으로부터 박리함으로써 상기 비목적 시료를 제거하고 상기 목적 시료를 상기 기판 위에 남기는 단계; 및 상기 목적 시료가 위치하는 영역에 생화학 반응 시약을 도입하거나 상기 목적 시료를 상기 기판으로부터 회수한 후 상기 목적 시료와 생화학 반응 시약을 반응시켜 상기 목적 시료를 반응시키는 단계를 포함하는 생체 시료의 선별적 처리방법이 제공된다.
본 명세서에 개시된 기술의 또 다른 측면에 의하면, 생체 시료들이 배치된 기판을 준비하는 단계; 상기 시료들 중 적어도 하나의 목적 시료가 위치하는 영역과 적어도 하나의 비목적 시료가 위치하는 영역을 구분하는 단계; 상기 목적 시료가 위치하는 영역을 선택적으로 접착 혹은 용해시켜 상기 목적시료의 구성물만 선택적으로 추출하는 단계; 상기 목적 시료를 상기 기판으로부터 회수한 후 상기 목적 시료와 생화학 반응 시약을 반응시키는 단계를 포함하는 생체 시료의 선별적 처리방법이 제공된다.
본 명세서에 개시된 기술의 또 다른 측면에 의하면, 생체 시료들이 배치된 기판을 준비하는 단계; 상기 생체 시료들중 적어도 하나의 목적 시료가 위치하는 영역과 적어도 하나의 비목적 시료가 위치하는 영역을 구분하는 단계; 제1 미세유체 구조물을 상기 기판 위에 제공하는 단계; 경화성 물질을 상기 제1 미세유체 구조물 내부에 도입하는 단계; 상기 비목적 시료가 위치하는 영역에 존재하는 상기 경화성 물질에 대해 선택적으로 에너지를 인가하여 경화시킴으로써 마스킹 구조물을 형성하는 단계; 상기 목적 시료가 위치하는 영역에 생화학 반응 시약을 도입하여 상기 목적 시료를 반응시키는 단계; 및 상기 목적 시료를 상기 기판 상에서 분석하거나 상기 기판으로부터 회수하여 분석함으로써 생체 시료를 선별적으로 분석하는 단계를 포함하는 생체 시료의 선별적 분석방법을 포함하는 생체 시료의 선별적 분석방법이 제공된다.
본 명세서에 개시된 기술의 또 다른 측면에 의하면, 마스킹 구조물 형성을 위한 제1 미세유체 구조물을 생체 시료가 배치된 기판 위에 제공하는 제1 미세유체 구조물 제공부; 상기 제1 미세유체 구조물 내부에 경화성 물질을 도입하기 위한 경화성 물질 주입부; 사용자의 요청 혹은 특정 알고리즘에 따라 마스킹 영역에 에너지를 인가하여 경화시켜 마스킹 구조물을 형성하기 위한 마스킹 구조물 제조부; 상기 제1 미세유체 구조물을 상기 기판으로부터 제거하기 위한 제1 미세유체 구조물 제거부; 생화학 반응 시약을 보유하기 위한 제2 미세유체 구조물을 상기 기판 위에 제공하는 제2 미세유체 구조물 제공부; 및 생화학 반응을 진행하기 위해 상기 제2 미세유체 구조물과 상기 기판 사이의 이격 공간에 생화학 반응 시약을 도입하거나 빛, 열, 교반, 진동 또는 음파의 에너지를 인가하는 생화학적 처리부를 포함하는 생체 시료의 선별적 처리장치가 제공된다.
본 명세서에 개시된 기술의 또 다른 측면에 의하면, 마스킹 구조물 형성을 위한 제1 미세유체 구조물을 생체 시료가 배치된 기판 위에 제공하는 제1 미세유체 구조물 제공부; 상기 제1 미세유체 구조물 내부에 경화성 물질을 도입하기 위한 경화성 물질 주입부; 사용자의 요청 혹은 특정 알고리즘에 따라 마스킹 영역에 에너지를 인가하여 경화시켜 마스킹 구조물을 형성하기 위한 마스킹 구조물 제조부; 생화학 반응을 진행하기 위해 상기 제1 미세유체 구조물 내에 생화학 반응 시약을 도입하거나 빛, 열, 교반, 진동 또는 음파의 에너지를 인가하는 생화학적 처리부를 포함하는 생체 시료의 선별적 처리장치가 제공된다.
본 명세서에 개시된 기술의 또 다른 측면에 의하면, 제1 미세유체 구조물 내부에 경화성 물질을 도입하기 위한 경화성 물질 주입부; 사용자의 요청 혹은 특정 알고리즘에 따라 마스킹 영역에 에너지를 인가하여 경화시켜 마스킹 구조물을 형성하기 위한 마스킹 구조물 제조부; 및 생화학 반응을 진행하기 위해 상기 제1 미세유체 구조물 내에 생화학 반응 시약을 도입하거나 빛, 열, 교반, 진동 또는 음파의 에너지를 인가하는 생화학적 처리부를 포함하되, 상기 제1 미세유체 구조물은 생체 시료가 배치된 기판 위에 제공된 것인 생체 시료의 선별적 처리장치가 제공된다.
본 명세서에 개시된 기술에 따르면, 생체 시료들의 종류와 위치를 기준으로 높은 특이도의 분리가 가능하고, 도포된 상태를 유지하면서 구조물을 제작하므로 목적 시료가 위치하는 영역 내 목적 시료의 본래 구조와 형태를 유지하면서 분석을 수행할 수 있고, 목적 시료를 대응 용기 혹은 기판으로 옮긴 다음 반응시킬 필요가 없기 때문에 오염 확률이 줄고, 높은 정확도를 제공하며, 시료를 분리한 뒤에는 기존의 생화학적 방법론을 추가 장비 없이 그대로 적용할 수 있는 효과를 갖는다.
도 1은 생체 시료의 선별적 분석방법의 일 구현예를 나타내는 공정흐름도이다.
도 2는 생체 시료의 선별적 분석 방법의 두 가지 구현예로서, 좌측 도면은 마스킹 구조물을 기판 상에 그대로 둔 채 목적 시료를 생화학 반응 시약과 반응시키는 방법이고 우측 도면은 마스킹 구조물을 기판으로부터 제거한 후 목적 시료를 생화학 반응 시약과 반응시키는 방법을 나타낸다.
도 3은 도 1로 나타낸 선별적 분석방법의 일 구현예를 나타낸 도면이다.
도 4는 미세유체 구조물을 이용하여 마스킹 구조물을 형성하는 방법을 나타낸 일 구현예이다.
도 5는 미세유체 구조물을 이용하여 생화학 반응 시약을 공급 및 회수하는 과정을 나타낸 일 구현예이다.
도 6은 생체 시료의 선별적 처리장치의 일 구현예이다.
이하, 도면을 참조하여 본 명세서에 개시된 기술의 구현예들에 대해 상세히 설명하고자 한다. 다음에 소개되는 구현예들은 당업자에게 개시된 사상이 충분히 전달될 수 있도록 하기 위한 예로서 제공되어지는 것이다. 따라서 개시된 기술은 이하 설명된 구현예들에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 그리고 도면들에 있어서, 구성요소의 폭, 길이, 두께 등은 편의를 위하여 과장되어 표현될 수도 있다. 명세서 전체에 걸쳐서 동일한 참조부호들은 동일한 구성요소들을 나타낸다. 전체적으로 도면 설명시 관찰자 시점에서 설명하였고, 일 구성요소가 다른 구성요소 위에 있다고 할 때, 이는 다른 구성요소 바로 위에 있는 경우 뿐 아니라, 그 중간에 또 다른 구성요소가 있는 경우도 포함한다.
도 1은 생체 시료의 선별적 분석방법의 일 구현예를 나타내는 공정흐름도이다. 도 1을 참조하면, 단계 110에서 생체 시료들이 배치된 기판을 준비한다.
상기 생체 시료는 조직, 혈액, 세포, DNA, RNA, 단백질, 엑소좀, 대사체(metabolite) 및 생검 검사물(biopsy specimen)로 이루어진 군 중에서 선택되는 1종 이상일 수 있다.
상기 생체 시료는 스탬핑(stamping), 롤링(rolling), 스미어(smear), 캐필러리(capillary), 미세유체 공학(microfluidics), 피펫팅 분산(pipetting dispensing) 등의 기법을 사용하여 기판 상에 제공될 수 있다.
상기 기판은 생체 시료를 지지하기 위한 표면을 제공하는 것이라면 특별히 제한되지 않지만, 슬라이드 글래스, 마이크로 비드, 나노입자, 나노구조체, 모세관, 미세유체 지지체, 공극 구조체, 스폰지 구조체, 및 덴드리머로 이루어진 군 중에서 선택되는 1종 이상일 수 있고, 혹은 표면이 화학 관능기, DNA, RNA, 단백질 중 1이상으로 부분 또는 전체가 작용화된 기판일 수 있다. 상기 기판은 유리, 실리콘 또는 고분자 재질로 이루어질 수 있다. 예를 들어, 상기 기판은 통상 슬라이드 글래스일 수 있다. 또는 상기 기판은 DNA, RNA, 단백질, 항체, 화학물질로 이루어진 군중에서 선택되는 1종 이상으로 개질(modification)된 기능화(functionalize)된 기판일 수 있다. 예를 들어, DNA나 단백질 등의 생체 시료가 집적된 마이크로어레이 기판, 초대용량 염기서열 분석(Massively parallele sequencing) 기판일 수 있다.
단계 120에서, 상기 생체 시료들의 종류 및 위치를 판독하여 상기 시료들 중 적어도 하나의 목적 시료가 위치하는 영역과 적어도 하나의 비목적 시료가 위치하는 영역을 구분한다.
상기 생체 시료들의 종류 및 위치를 판독하는 단계는 예를 들어, 이미지 관찰, 형광 신호 또는 좌표 정보를 통해 수행될 수 있다. 상기 생체 시료는 생체 시료의 정보를 얻을수 있는 염색기법이라면 제한되지 않지만 Giemsa stain, hematoxylin and eosin stain (H&E), Fluorescence in situ hybridization (FISH), Immuno Fluorescence (IF), immunohistochemistry (IHC) 로 이루어진 군중에서 하나의 염색기법으로 염색되어 이미지 정보를 제공할 수 있다. 상기 이미지 관찰은 일례로 광학 현미경이나 전자 현미경 등의 관찰 도구를 이용하여 수행할 수 있다. 몇몇 구현예에서, 상기 목적 시료를 선별하는 단계는 광학 현미경 또는 전자 현미경을 통해 직접 눈으로 관찰하는 방식 또는 별도 소프트웨어를 이용한 자동화된 방식으로 상기 생체 시료들의 위치 정보를 얻음으로써 수행할 수 있다. 한편 DNA 마이크로어레이 기판의 경우 여러 스폿들이 이미지로는 보이지 않지만 좌표 정보를 알기 때문에 선별이 가능하다. 일례로 상기 생체 시료의 이미지를 얻은 뒤 자동화된 방식으로 클러스터링(clustering) 또는 분류(classification)기법을 이용해 목적 시료를 수 또는 수십 개의 군으로 나눈 뒤 대상시료를 자동 또는 수동으로 선별할 수 있다.
도 2는 생체 시료의 선별적 분석 방법의 두 가지 구현예로서, 좌측 도면은 마스킹 구조물을 기판 상에 그대로 둔 채 목적 시료를 생화학 반응 시약과 반응시키는 방법이고 우측 도면은 마스킹 구조물을 기판으로부터 제거한 후 목적 시료를 생화학 반응 시약과 반응시키는 방법을 나타낸다.
도 2의 1. 항목을 참조하면, 생체 시료들이 배치된 기판에서 이미지 관찰, 형광 신호 또는 좌표 정보를 통해 생체 시료들의 종류와 위치를 판독하여 목적 시료, 즉 선별하고자 하는 타겟(sorting target)이 위치하는 영역과 비목적 시료가 위치하는 영역을 구분한다.
도 3은 도 1로 나타낸 선별적 분석방법의 일 구현예를 나타낸 도면이다. 도 3의 왼쪽 그림을 참조하면, 생체 시료의 이미지 관찰 도중 암 세포(cancer cell)로 의심되는 타겟을 선별해낸 것을 확인할 수 있다.
본 명세서에 개시된 기술에 따르면, 생체 시료들의 종류 및 위치를 이미지 관찰, 형광 신호 또는 좌표 정보를 통해 정확하게 구분하므로 도포된 시료의 상태 그대로 선별이 가능하다.
단계 130에서, 상기 비목적 시료가 위치하는 영역을 선택적으로 마스킹하기 위한 마스킹 구조물을 형성한다.
일 구현예에서, 생체 시료가 올라가 있는 기판 위에 액상의 마스킹 재료를 전체적으로 도포한 후 선택된 영역에만 물리화학적 작용이 선별적으로 가해짐으로써 마스킹 구조물이 제작될 수 있다.
도 2의 2. 항목을 참조하면, 생체 시료들의 종류와 위치 판독 결과로부터 구분된 비목적 시료가 위치하는 영역을 선택적으로 마스킹하는 마스킹 구조물을 형성한다. 즉, 관심대상인 목적 시료들에 대해서는 추후 생화학 반응을 위해 노출시키고, 생화학 반응을 위한 시약이 주변의 비목적 시료들에 침투하지 않도록 비목적 시료들 의 일부 또는 전부를 소정의 구조물로 마스킹한다.
상기 마스킹 구조물은 생화학 반응 시약에 대해 물리적 또는 화학적으로 보호되는 재질로 이루어질 수 있다. 예를 들어, 마스킹 구조물은 고분자 수지, 왁스, 금속, 금속 산화물 및 유리로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 재질로 이루어질 수 있다.
일 구현예에서, 상기 마스킹 구조물을 형성하는 단계는 경화성 물질을 상기 기판 위에 도포하고 빛 또는 열로 경화하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 경화성 물질은 불포화 단량체를 포함할 수 있으며, 상기 불포화 단량체의 비제한적인 예들은 에톡시화 트리메틸올프로판 트리아크릴레이트, 경화형 에폭시(제품명 NOA), 폴리에틸렌글리콜 디아크릴레이트, 폴리프로필렌글리콜 디아크릴레이트, 폴리우레탄 아크릴레이트 및 이들의 조합일 수 있다. 예를 들어, 상술한 폴리에틸렌 디아크릴레이트는 폴리에틸렌 글리콜 양 말단에 아크릴레이트 작용기를 갖는 구조를 가지므로 자유라디칼 중합이 일어날 경우 3차원 구조로 가교될 수 있다. 기타, 경화성 물질은 액체에서 고체로 변할 수 있는 어떠한 형태의 매질도 포함할 수 있다.
상기 경화성 물질은 전자기파를 열로 전환시켜주는 나노물질이나 개시제를 더 포함할 수 있으며, 상기 개시제는 외부의 에너지원에 의해 자유라디칼 중합을 유발할 수 있다. 개시제는 아조계 화합물 또는 과산화물이 될 수 있다. 경화성 물질은 적절한 가교제를 더 포함할 수 있으며, 예를 들면 N,N'-메틸렌비스아크릴아마이드, 메틸렌비스메타크릴아마이드 및 에틸렌글리콜디메타크릴레이트 등을 들 수 있다. 상기 경화반응에 적절한 에너지원은 열, 자외선, 가시광선, 적외선 및 전자빔을 제한 없이 포함할 수 있다.
상기 경화성 물질은 경화와 동시에 기판과 본딩(bonding)하는 물질일 수 있다. 예를 들어 경화과정에서 상기 물질이 유리와 결합을 형성함으로써 마스킹 구조물이 더 강력하게 기판에 고정될 수 있다.
상기 경화성 물질은 생체 시료에 침투하여 경화될 수 있다. 일례로 일반 경화성 물질에 염기성 용해시약이나 프로틴에이즈(Proteinase)를 섞어 경화성 물질이 조직 사이나 내부를 침투할 수 있고, 그 후 외부의 에너지원에 의해 경화될 수 있다.
상기 경화성 물질의 생체 시료에 대한 침투성을 높이기 위해 경화성 물질을 제공(supply)하기 이전에 생체 시료를 전처리하는 과정이 포함될 수 있다. 예를 들어 세포막에 구멍(pore)이 생기는 화학반응을 통해 경화성 물질의 침투성을 높일수 있다. 또 다른 일례로 세포막을 용해(lysis)하지만 핵막은 용해하지 않는 생화학 반응을 통해 생체 시료에서 세포 핵만을 남긴뒤 상기 경화성 물질을 제공할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 마스킹 구조물을 형성하는 단계는 경화성 물질을 상기 기판 위에 전체적으로 도포하고 빛 또는 열로 경화한 뒤 경화되지 않은 잔여 경화성 물질을 제거하는 단계를 포함할 수 있다. 또 다른 구현 예에서 상기 마스킹 구조물을 형성하는 단계는 경화성 물질을 마스킹 구조물의 모양을 따라 투여(dispensing)한 뒤 빛 또는 열로 경화하는 단계를 포함할 수 있다. 또 다른 구현 예에서 상기 마스킹 구조물을 형성하는 단계는 경화성 물질을 미세유체 칩(microfludic chip)을 통해 제공하거나 미세유체 챔버(chamber)를 통해 공급하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 비목적 시료들에 대한 선택적인 마스킹을 위해 각종 패터닝 기술이 활용될 수 있다. 예를 들어 상기 마스킹 구조물의 형성은 리소그래피 방식, 레이저 스캐닝, 잉크젯 프린팅, 및 3D 프린팅 방식으로 이루어진 군 중에서 선택되는 어느 하나의 방식에 의해 이루어질 수 있다. 구체적으로 상기 마스킹 구조물을 형성하기 위해 일례로 일반적인 광 마스크 리소그래피를 이용하거나, 디지털 미러 디바이스(DMD)를 이용한 무마스크 리소그래피(Maskless Ligthography)을 이용할 수 있다.
관련하여 도 3의 중간 그림을 참조하면, 상기 마스킹 구조물은 비목적 시료가 위치하는 영역에 경화성 물질을 도포하고 광유체적 무마스크 리소그래피(Optofluidic Maskless Lithography)를 사용함으로써 해당 위치에 제작될 수 있음을 확인할 수 있다.
목적 시료를 선별한 후 마스킹 구조물을 형성하는 방식은 경화성 물질을 기판 위에 전체적으로 도포하여 마스킹 구조물을 대면적으로 형성하거나, 기판 위에서 원하는 목적 시료로부터 멀리 떨어져 있는 비목적 시료가 있는 영역은 놔두고 목적 시료의 주변에 위치한 비목적 시료가 있는 영역에만 도포하여 마스킹 구조물을 필요한 부분에만 형성하는 방식일 수 있다.
상기 마스킹 구조물을 형성하기 위한 리소그래피 방식은 마스크와 기판 사이에 렌즈 없이 대면적으로 리소그래피를 수행하는 방식일 수 있으며, 렌즈를 이용해 고해상도로 상기 경화성 물질의 여러 영역에 대해 순차적으로 리소그래피를 수행하는 방식일 수 있다. 특히 렌즈를 이용하는 리소그래피의 경우 생체 시료가 바뀌어 대상영역이 바뀌게 되더라도 하나 또는 여러 종류의 고정 마스크를 이용해 순차적으로 마스킹 구조물을 형성함으로써 시료가 바뀔 때마다 마스크를 일일이 바꾸어주어야 할 필요성이 사라진다.
상기 렌즈를 이용해 생체 시료에 순차적으로 리소그래피를 수행하는 방식은 하나 또는 여러 종류의 고정 마스크를 이용해 원하는 대상시료 영역에 마스킹 구조물을 형성하기 위한 최적화 알고리즘을 더 포함할 수 있다. 또한 디지털 미러 디바이스(DMD)를 이용해 원하는 대상시료 영역에 마스킹 구조물을 형성하기 위한 최적화 알고리즘을 더 포함할 수 있다.
상기 하나 또는 여러 종류의 고정마스크를 이용한 리소그래피는 렌즈의 배율을 조절함으로써 마스킹 구조물의 크기와 해상도를 조절하는 방식을 더 포함할 수 있다.
광 리소그래피를 방식의 일례로 상기 마스킹 구조물을 형성하기 위한 방식은 정형화된 패턴이 새겨진 마스크(mask)를 이용한 광 리소그래피 방식으로 정형화된 마스킹 구조물을 형성하는 방법일 수 있다. 일례로 상기 정형화된 패턴은 격자모양의 마스킹 패턴일 수 있다. 이 방식은 선별된 목적 시료 주변에만 마스킹 구조물을 형성하진 않지만 정형화된 마스킹 구조물이 목적 시료를 포함하도록 형성될 수 있으며, 무마스크 리소그래피에 비해 마스킹 구조물 형성과정이 간단하다.
상기 마스킹 구조물을 형성하는 방식은 친수성 코팅제 또는 소수성 코팅제를 공급하는 방식일 수 있다. 바람직한 일례로 대상 시료의 주변에 소수성 코팅제를 제공하여 마스킹 구조물을 형성한 뒤 마스킹 구조물의 내부에만 수용액이 공급될 수 있도록 할 수 있다.
상기 마스킹 구조물을 형성하기 위한 방식은 이미 형성된 마스킹 구조물을 기판 위에 올려놓거나 조립(assemble)하는 방식일 수 있다.
상기 마스킹 구조물의 형성과정은 생체 시료에 악영향을 크게 끼치지 않으므로 마스킹 구조물의 형성 후 생체 시료를 배양할 수 있다. 일례로 원하는 표현형(phenotype)을 가진 세포 주변에만 선별적으로 마스킹 구조물을 형성한 뒤 세포를 배양함으로써 다른 표현형을 가진 세포와 분리하여 세포를 배양할 수 있다.
단계 140에서, 상기 목적 시료가 위치하는 영역에 생화학 반응 시약을 도입하여 상기 목적 시료와 반응시킨다.
상기 생화학 반응시약은 라이시스 용액(lysis solution), PCR 반응용 시약, 전장유전체증폭 반응(whole genome amplification)용 시약 및 전사체 증폭 반응(whole transcriptome amplification)용 시약, 역전사(Reverse transcription), 역전사 PCR(RT PCR), 시험관내 전사(in vitro transcription), 회전환 증폭(Rolling circle amplifciation), 중아황산염 처리(bisulfite treatment), DNA추출, RNA추출, 단백질 추출, 유전체 편집(Genome editing), 퍼미어블아이제이션(permeabilization), 세포 인-시츄 시퀀싱(in situ sequencing) 등 여러 생화학 반응에 필요한 시약을 단독으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 상기 라이시스 용액으로는, 일례로 염기성 용해시약 혹은 프로티네이즈(Proteinase) 등을 사용할 수 있다.
상기 생화학 반응시약은 예를 들어 트랜스포사제(transposase), 리가제(ligase), 절편화제(fragmentase) 등을 포함하는 초대용량 염기서열 분석(Massively parallel sequencing)을 위한 라이브러리 준비(Library preparation) 반응을 위한 시약일 수 있다.
상기 생화학 시약을 도입하기 이전에 상기 생화학 물질의 확산을 최소화하기 위해 배리어 구조물이 형성된 생체 시료 위에 하이드로젤(hydrogel)을 덮은 뒤 생화학 시약을 도입할 수 있다. 일례로 배리어 구조물이 형성된 생체 시료 위에 아가로즈(agarose)를 도입하고 굳혀 하이드로젤을 만든 뒤 그 위에 생화학 반응 시약을 도입할 수 있다. 또 다른 일 예로 생화학 반응시약을 하이드로젤에 적신 뒤 하이드로 젤을 생체 시료 위에 덮음으로써 생화학 반응시약을 도입할 수 있다.
상기 생화학 반응 시약은 DNA 마이크로어레이 기판, 초대용량 염기서열 분석기판 혹은 초대용량 염기서열분석용 플로우 셀(flow cell) 위에 있는 바이오 물질을 반응시키기 위한 시약 주입을 위해 사용될 수도 있다.
상기 생화학 반응시약은 배리어 구조물을 형성하기 위해 경화된 경화성 물질의 교차결합(crosslink)을 풀어내는 디크로스링크(decrosslink) 시약일 수 있다. 일례로 배리어 구조물이 목적 시료가 위치한 영역을 덮고 있는 경우 배리어 구조물이 존재하는 영역 주변부의 생체 시료를 모두 용해(lysis) 하여 제거한 뒤 디크로스링크 시약을 공급하여 목적 시료를 노출시킨뒤 생화학 반응을 더 수행할 수 있다.
상기 생화학 반응은 서로 다른 마이크로웰의 반응물을 태깅(tagging)하기 위해 서로 다른 종류의 올리고뉴클레오타이드들(oligonucleotides)을 주입하여 기존 반응물에 라이게이션(ligation), 삽입(insertion) 시키는 반응을 포함할 수 있다. 상기 태깅 방법은 또한 서로 다른 종류의 올리고뉴클리오타이드들이 붙어있는 비드(bead), 마이크로파티클(microparticle), 하이드로젤(hydrogel), 드랍렛(droplet) 또는 코어-쉘 입자(core shell particle) 등을 주입하는 방법을 포함할 수 있다. 상기 태깅 방법은 또한 올리고뉴클리오타이드들이 붙어있는 마이크로어래이(microarray)기판과 생체 시료들이 배치된 기판을 어셈블(assemble)하는 방법을 포함할 수 있다. 상기 생화학 반응은 또한 ELISA, 앱타머 바인딩(aptamer binding), 질량 분광법(mass spectroscopy)을 위한 반응을 포함할 수 있다.도 3의 오른쪽 그림을 참조하면, 먼저 생화학 반응 시약 중 하나인 라이시스 용액을 목적 시료 위에 일정량을 적하하면 라이시스 용액이 목적 시료가 위치한 영역 및 상기 목적 시료 주위까지 퍼진다. 그 결과, 마스킹되지 않은 영역에 존재하는 목적 시료에 대해서만 용해 반응이 일어나고 마스킹된 영역에 존재하는 생체 시료에 대해서는 반응이 일어나지 않게 되어 다른 생체 시료로부터의 오염없이 목적 시료가 선별적으로 처리될 수 있다. 이렇게 처리된 시료는 별도의 공간으로 회수되어 분석될 수 있다.
상기 기판 위에 상기 마스킹 구조물을 패터닝한 다음 상기 목적 시료가 위치하는 영역에 상기 생화학 반응 시약을 도입하게 되는데, 상기 생화학 반응 시약을 도입하는 방식에는 여러 가지가 있을 수 있다.
일 구현예에서, 마스킹을 위한 패터닝 시 상기 목적 시료로부터 가까운 거리만큼 떨어져 존재하는 상기 비목적 시료들 위주로 마스킹 구조물이 형성될 수 있다. 이때 상기 생화학 반응 시약의 도입은 타 시료로부터의 오염을 막기 위하여 상기 목적 시료가 위치한 영역 및 상기 목적 시료 주위에 위치한 상기 마스킹된 영역의 범위 내에서 이루어지도록 할 수 있다.
도 2의 3-1. 및 4.항목을 참조하면, 목적 시료 및 그 주변의 마스킹된 영역의 범위 내에서 편리하게 생화학 반응 시약을 도입할 수 있다. 생화학 반응 시약의 도입은 특별히 제한되지 않지만 잉크젯 프린팅과 같은 마이크로디스펜싱 또는 대용량 피펫팅에 의해 수행될 수 있다. 즉 생화학 반응 시약이 목적 시료로부터 멀리 떨어진 정도까지 미치지 않는다면 일반적인 대용량의 피펫팅 수단으로 편리하게 반응시킬 수 있다. 즉 마스킹에 의해 주위의 비목적 시료들이 보호되므로, 다른 비목적 시료로부터의 오염을 방지하기 위해 일부러 목적 시료가 위치한 좁은 영역에 국한하여 생화학 반응 시약을 잉크젯 프린팅 등으로 정밀하게 도입할 필요가 없다.
예를 들어 목적 시료의 영역이 수 um 이내의 범위를 갖는 크기라 할지라도 상기 생화학 반응 시약의 처리 면적이 수십 um 내지 수 mm의 범위를 가질 수 있다.
다른 구현예에서, 마스킹 재료를 기판에 대해 전체적으로 도포하고 패터닝하여 상기 마스킹 구조물을 대면적으로 형성시킬 수도 있다.
도 2의 3-2. 및 4.항목을 참조하면, 목적 시료 영역을 노출시키고 목적 시료의 주변 및 그 보다 넓은 범위에 이르는 범위에 걸쳐 마스킹 구조물을 형성할 경우 마스킹 구조물이 전체적으로 하나의 대면적 필름 층을 형성할 수 있다. 이렇게 생성된 마스킹 필름 층이 기판과 접착성이 높지 않으면서도 비목적 시료들과 결합력이 강한 재질이라면 비목적 시료들과 함께 기판으로부터 박리될 수 있다. 그 결과 비목적 시료들은 모두 제거되고 목적 시료들만이 기판 위에 남게 된다.
이 경우 생화학 반응 시약의 처리 범위의 제한은 특별히 없으므로 앞서의 구현예보다 더 생화학 반응 시약의 처리방식이 자유롭다는 장점이 있다. 또한 기판 위에 다른 시료가 존재하지 않으므로 추후 목적 시료의 회수 및 분석이 용이할 수 있다.단계 150에서, 상기 목적 시료를 상기 기판 상에서 분석하거나 상기 기판으로부터 회수하여 분석한다.
상기 목적 시료는 생화학 반응 시약과 반응한 상태로 기판 상에서 분석이 될 수 있고, 혹은 상기 기판으로부터 회수하고 회수된 용액을 가지고 초대용량 염기서열분석(NGS), 질량 분광분석(mass spectrometry), RNA-seq 등의 분석을 수행할 수 있다. 상기 반응 후 목적 시료의 용액은 마이크로매니퓰레이터(micromanipulator), 리퀴드 핸들러(liquid handler), 초음파, 마이크로 피펫팅 등을 사용하여 회수될 수 있다.
본 명세서에 개시된 기술의 다른 구현예에 따르면, 다음과 같은 방식에 따른 생체 시료의 선별적 분석방법을 제공할 수 있다. 먼저 생체 시료들이 배치된 기판을 준비한다. 다음 상기 시료들 중 적어도 하나의 목적 시료가 위치하는 영역과 적어도 하나의 비목적 시료가 위치하는 영역을 구분한다. 상기 구분단계는 상기 생체 시료들의 종류 및 위치를 판독하는 단계를 포함할 수 있다.
이어서 상기 비목적 시료가 위치하는 영역을 선택적으로 마스킹하기 위한 마스킹 구조물을 형성한다. 상기 목적 시료가 위치하는 영역에 라이시스 용액을 도입하여 상기 목적 시료를 용해시킨다. 그리고 상기 용해에 의해 상기 목적 시료로부터 유래된 핵산 분자들을 생화학 반응 시약으로 처리하여 시퀀싱을 위한 상기 핵산 분자들의 라이브러리를 준비한다. 다음 상기 핵산 분자들의 라이브러리를 상기 기판으로부터 회수한다. 이어서 회수된 상기 핵산 분자들의 라이브러리를 시퀀싱함으로써 기판 위의 생체 시료를 선별적으로 분석할 수 있다.
바람직하게는 상기 시퀀싱은 분석 효율이 매우 높은 초대용량 염기서열 분석(Next Generation Sequencing) 기술과 같은 하이-쓰루풋 시퀀싱(high-throughput sequencing) 기술에 의해 수행될 수 있다.
시퀀싱을 수행함으로써 염기서열의 종류에 따라 순차적으로 발생하는 광학적, 전자기적 시그널을 위치 정보와 함께 제공받을 수 있다. 초대용량 염기서열 분석법을 이용하면 한번에 동시에 수십만 개 이상의 서열을 분석하게 되므로 기존의 전통적인 염기서열 분석방법에 비해 분석처리량이 매우 높으며(high-throughput), 이를 통해 분석하고자 하는 표본의 염기서열에 대한 통계자료를 제공받을 수 있다.
본 명세서에 개시된 기술의 또 다른 구현예에 따르면, 목적 시료의 선별적 처리방법은 목적 시료의 손상없이 목적 시료 외의 생체 시료와 함께 마스킹 구조물을 물리적인 힘으로 용이하게 제거하는 과정이 포함될 수 있다. 이러한 과정을 전체적으로 서술하면 다음과 같이 진행될 수 있다.
먼저 생체 시료들이 배치된 기판을 준비한다. 다음 상기 생체 시료들의 종류 및 위치를 판독하여 상기 시료들 중 적어도 하나의 목적 시료가 위치하는 영역과 적어도 하나의 비목적 시료가 위치하는 영역을 구분한다. 이어 상기 비목적 시료가 위치하는 영역을 선택적으로 마스킹하기 위한 마스킹 구조물을 형성한다. 그리고 상기 마스킹 구조물을 마스킹된 상기 비목적 시료와 함께 상기 기판으로부터 박리함으로써 상기 비목적 시료를 제거하고 상기 목적 시료를 상기 기판 위에 남긴다. 이어서 상기 목적 시료에 생화학 반응 시약을 반응시킨 후 상기 목적 시료를 분석한다.
상기 목적 시료의 반응 및 분석 과정을 위해 일 구현예에 따르면, 상기 목적 시료의 반응 및 분석을 위해 상기 목적 시료가 위치하는 영역에 생화학 반응 시약을 도입하여 상기 목적 시료를 반응시킨 후 상기 기판 상에서 분석할 수 있다. 다른 구현예에 따르면, 박리과정 후 남은 목적 시료를 예를 들어 나이프와 같은 도구를 이용하여 긁어서 상기 기판으로부터 회수한 후, 이를 생화학 반응 시약으로 반응시킨 후 분석할 수 있다. 이와 같은 생체 시료의 선별적 처리방법에 관련된 구체적인 구현예가 도 2의 3.2 및 4. 항목에서 이미 설명된 바 있다.
일 구현예에 따르면, 상기 목적 시료의 반응 및 분석 과정을 위해 상기 목적 시료가 위치하는 영역에 접착성 물질 혹은 세포 용해 시약을 포함한 물질을 제공하여 상기 목적 시료를 비목적 시료로부터 물리적으로 분리시킬 수 있다. 이렇게 상기 목적 시료를 상기 기판으로부터 회수하고, 이를 생화학 반응 시약으로 반응시킨후 분석할 수 있다.
상기 접착성 물질 혹은 상기 세포 용해 시약을 포함한 물질은 액체, 고체, 폴리머, 하이드로젤일 수 있으나 이에 국한되지는 않는다. 또한 상기 접착성 물질 혹은 상기 세포 용해 시약을 포함한 물질은 입자 형태를 가질 수 있으며, 이때 그 직경은 0.1um~1mm일 수 있고, 바람직하게는 1um~100um일 수 있다.
본 명세서에 개시된 기술의 또 다른 구현예에 따르면, 목적 시료의 선별적 처리방법이 미세유체 구조물을 이용한 것일 수 있다. 이러한 방식은 앞서의 다른 구현예들과 마찬가지로 i) 생체 시료들이 배치된 기판을 준비하고, ii) 상기 생체 시료들의 종류 및 위치를 판독하여 상기 시료들 중 적어도 하나의 목적 시료가 위치하는 영역과 적어도 하나의 비목적 시료가 위치하는 영역을 구분하는 단계를 포함한다. 이어 iii) 제1 미세유체 구조물을 상기 기판 위에 제공한다. 상기 제1 미세유체 구조물은 미세유체 칩 또는 미세유체 챔버 형태일 수 있다. 상기 제1 미세유체 구조물은 경화성 물질과 같은 유체의 입출입을 위한 적어도 하나의 개구부를 구비할 수 있다. 상기 제1 미세유체 구조물은 상기 생체 시료들 중 목적 시료가 위치하는 영역을 감싸도록 상기 기판 위를 덮는 형태를 가질 수 있다. 그리하여 상기 목적 시료와 상기 제1 미세유체 구조물 사이에 이격 공간을 만들게 된다. 상기 이격 공간에서 상기 기판과 상기 제1 미세유체 구조물 천정 하부 사이의 너비는 1 내지 500um 일 수 있다.
다음 iv) 경화성 물질을 상기 제1 미세유체 구조물 내부에 도입하여 상기 이격 공간을 채운다. 그리고 v) 상기 비목적 시료가 위치하는 영역에 존재하는 상기 경화성 물질에 대해 선택적으로 에너지를 인가하여 경화시킴으로써 마스킹 구조물을 형성한다. 상기 에너지는 열 또는 빛일 수 있고, 선택적 에너지 인가를 위해 리소그래피 방식을 이용할 수 있다. 이렇게 미세유체 기술을 이용하여 경화성 물질을 제공하는 경우 상기 이격 공간의 크기에 따라 마스킹 구조물의 높이를 제한할 수 있고, 전 기판에 대해 경화성 물질이 균일하게 제공될 수 있어서, 경화성 물질의 소모량을 줄일 수 있는 장점이 있다.
vi) 다음 상기 제1 미세유체 구조물을 상기 기판으로부터 제거함으로써 목적 시료 외의 영역에 마스킹 구조물이 배치된 기판을 얻게 된다.
도 4는 미세유체 구조물을 이용하여 마스킹 구조물을 형성하는 방법을 나타낸 일 구현예이다.
다음 vii) 상기 목적 시료가 위치하는 영역에 생화학 반응 시약을 도입하여 상기 목적 시료를 반응시키고, viii) 상기 목적 시료를 상기 기판 상에서 분석하거나 상기 기판으로부터 회수하여 분석함으로써 생체 시료를 선별적으로 분석한다.
일 구현예에서, 상기 vii) 단계 및 viii) 단계의 경우도 미세유체 기술을 이용하여 수행될 수 있다. 도 5는 미세유체 구조물을 이용하여 생화학 반응 시약을 공급 및 회수하는 과정을 나타낸 일 구현예이다. 도 5를 참조하면, 생화학 반응 시약을 미세유체 구조물을 이용하여 공급하는 경우, 상기 미세유체 구조물의 내부 영역이 기 형성된 마스킹 구조물을 내부에 포함하도록 할 수 있다(도 5의 1-a 내지 1-d ).
또는 상기 미세유체 구조물이 기 형성된 마스킹 구조물의 상단에 접촉되도록 할 수 있다. 이 경우 생화학 반응 시약을 제공하기 위한 상기 미세유체 구조물의 크기 혹은 구조에 따라 마스킹되지 않은 영역 중 일부에만 선택적으로 생화학 반응 시약을 제공할 수 있다(도 5의 2-a 내지 2-d ).
일 구현예에서, 구체적으로 미세유체 구조물을 이용한 생화학 반응시약의 도입 및 회수를 위해 먼저 상기 마스킹 구조물이 형성된 상기 기판에 대해 제2 미세유체 구조물을 상기 기판 위에 제공한다. 상기 제2 미세유체 구조물은 미세유체 칩 또는 미세유체 챔버 형태일 수 있다. 상기 제2 미세유체 구조물은 생화학 반응시약과 같은 유체의 입출입을 위한 적어도 하나의 개구부를 구비할 수 있다.
상기 제2 미세유체 구조물은 상기 제1 미세유체 구조물과 동일한 구조물일 수도 있으며, 이 경우에는 상기 기판 위에 존재하던 상기 제1 미세유체 구조물을 제거하지 않고 그대로 이용할 수도 있다.
상기 제2 미세유체 구조물은 상기 마스킹 구조물의 외곽 쪽에 배치되거나(도 5의 1-b) 또는 바로 상단 쪽에 접촉되도록 배치될 수 있으며(도 5의 2-b), 그 결과 목적 시료의 영역이 위치한 생체 시료를 포함하는 이격 공간이 형성되어 이를 통해 생화학 반응 시약이 보유될 수 있다. 상기 도 5의 1-b 방법을 선택하면 일반적인 접근 방법으로 마스킹 구조물의 모양에 상관 없이 챔버를 형성시킬 수 있다. 또한 도 5의 2-b 방법을 선택하면 생화학 반응 시약을 제공하기 위한 상기 미세유체 구조물의 크기 혹은 구조에 따라 마스킹되지 않은 영역 중 일부에만 선택적으로 생화학 반응 시약을 제공할 수 있다.
다음 생화학 반응 시약을 상기 제2 미세유체 구조물 내부에 도입하여 상기 목적 시료를 반응시킨다. 이어서 반응이 끝난 상기 목적 시료를 상기 제2 미세유체 구조물로터 회수하여 분석한다.
다른 구현예에서, 미세유체 구조물을 이용한 생화학 반응시약의 도입 및 회수를 위해 제2 미세유체 구조물을 사용하지 않고 도 4의 d에서 만들어진 제1 미세유체 구조물이 배치된 상태 그대로 생화학 반응 시약을 공급할 수도 있다.
상술한 바와 같이 미세유체 구조물을 기판 위에 조립한 후 생화학 반응 시약을 공급할 경우 시약의 공급 범위가 일정 공간 내로 국한되므로 시약의 소모를 줄일 수 있고, 시약의 증발을 막을 수 있는 장점이 있다.
또한 본 명세서에 개시된 기술의 일 구현에에 따르면, 생체 시료를 선별적으로 처리하기 위한 장치가 제공된다. 도 6은 생체 시료의 선별적 처리장치의 일 구현예이다. 도 6을 참조하면, 생체 시료의 선별적 처리장치(600)는 i) 마스킹 구조물 형성을 위한 제1 미세유체 구조물을 생체 시료가 배치된 기판 위에 제공하는 제1 미세유체 구조물 제공부(610), ii) 상기 제1 미세유체 구조물 내부에 경화성 물질을 도입하기 위한 경화성 물질 주입부(620), iii) 사용자의 요청 혹은 특정 알고리즘에 따라 마스킹 영역에 에너지를 인가하여 경화시켜 마스킹 구조물을 형성하기 위한 마스킹 구조물 제조부(630), iv) 상기 제1 미세유체 구조물을 상기 기판으로부터 제거하기 위한 제1 미세유체 구조물 제거부(640), v) 생화학 반응 시약을 보유하기 위한 제2 미세유체 구조물을 제공하는 제2 미세유체 구조물 제공부(650), 및 vi) 생화학 반응을 진행하기 위해 빛, 열, 교반, 진동 또는 음파의 에너지를 인가하는 생화학적 처리부(660)를 포함할 수 있다.
제1, 2 미세유체 구조물 제공부(610, 650)는 전동 스테이지, 모터, 및 액츄에이터(actuator)를 포함할 수 있다.
마스킹 구조물 제조부(630)는 리소그래피 시스템, 잉크젯 프린팅 시스템 혹은 3D 프린팅 시스템을 포함할 수 있다. 일례로 마스킹 구조물 제조부(630)는 광유체적 무마스크 리소그래피 시스템을 구비할 수 있다. 이를 위해 상기 마스킹 구조물 제조부(630)는 UV 광원, 디지털 미러 디바이스, 렌즈 등을 구비할 수 있다.
생화학적 처리부(660)는 상기 생화학 반응시약의 저장 수단 및 공급 수단 등을 구비할 수 있다. 일 구현예에서, 생화학적 처리부(660)는 목적 시료가 위치한 반응 공간에 교반, 진동 또는 초음파 등의 물리적 힘을 인가하기 위한 반응촉진 장치를 포함할 수 있다. 또는 일 구현예에서, 생화학적 처리부(660)는 반응 온도 조절을 위한 온도 제어장치를 더 포함할 수 있다.
상기 생체 시료의 선별적 처리장치는 상기 구성요소들의 일부 혹은 전부를 포함할 수 있으며, 예를 들어, 상기 제1 미세유체 구조물을 제거하지 않고 생화학 반응 시약의 도입을 위한 구조물로 그대로 사용할 경우, 별도의 제2 미세유체 구조물이 필요없으므로, 상기 제1 미세유체 구조물을 상기 기판으로부터 제거하기 위한 제1 미세유체 구조물 제거부(640) 및 제2 미세유체 구조물 제거부(650)를 포함하지 않을 수도 있다. 또한 인위적으로 제1 미세유체 구조물을 제조할 경우 제1 미세유체 구조물 제공부(610)가 필요없을 수도 있다.
상술한 생체 시료의 선별적 처리장치를 이용하면 목적 시료가 포함된 생체 시료로부터 경제적이고 신속한 방법으로 정확하게 목적 시료를 선별적으로 처리할 수 있어서, 이후 생체 시료의 선별적 분석에 유용하게 사용될 수 있다.
상술한 바와 같은 생체 시료의 선별적 처리 방법 또는 분석 방법에 따르면, 조직 (특히 암조직)이 어떤 변이나 이상을 가지고 있는지 정확하게 판단할 수 있다.
예를 들어 암환자로부터 추출한 암 조직을 슬라이드 글래스에 도포한 후 통상 사용하는 염색 시약(일례로 giemsa)을 염색하여 현미경으로 관찰하면서 원하는 세포를 선별하여 처리하고 회수하여 염기서열 분석을 할 수 있다.
즉 생체 시료들의 종류와 위치를 기준으로 높은 특이도의 분리가 가능하고, 도포된 상태를 유지하면서 구조물을 제작하므로 목적 시료가 위치하는 영역 내 목적 시료의 본래 구조와 형태를 유지하면서 용이하게 분석을 수행할 수 있다.
또한 목적 시료를 대응 용기 혹은 기판으로 옮긴 다음 반응시킬 필요가 없기 때문에 오염 확률이 줄고, 높은 정확도를 제공하며, 특히 시료를 처리한 뒤에는 기존의 생화학 분석방법을 복잡한 과정 없이 적용할 수 있으므로 선택적인 세포 분석, 단백질 분석, 유전자 분석 및 이를 통한 질병 진단 및 중개의학 등 고차원적인 후속 연구를 수행할 수 있다.
이상에서 본 명세서에 개시된 기술의 구현예들에 대해 상세히 기술하였지만, 해당 기술 분야에 있어서 통상의 지식을 가진 사람이라면, 본 명세서에 개시된 기술의 정신 및 범위를 벗어나지 않으면서 본 명세서에 개시된 기술을 여러 가지로 변형하여 실시할 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.

Claims (23)

  1. 생체 시료들이 배치된 기판을 준비하는 단계;
    상기 생체 시료들 중 적어도 하나의 목적 시료가 위치하는 영역과 적어도 하나의 비목적 시료가 위치하는 영역을 구분하는 단계;
    상기 비목적 시료가 위치하는 영역을 선택적으로 마스킹하기 위한 마스킹 구조물을 형성하는 단계;
    상기 목적 시료가 위치하는 영역에 생화학 반응 시약을 도입하여 상기 목적 시료를 반응시키는 단계; 및
    상기 목적 시료를 상기 기판 상에서 분석하거나 상기 기판으로부터 회수하여 분석하는 단계를 포함하는 생체 시료의 선별적 분석방법.
  2. 제1 항에 있어서,
    상기 생체 시료들의 종류 및 위치를 판독하는 단계는 이미지 관찰, 형광 신호 또는 좌표 정보를 통해 수행되는 생체 시료의 선별적 분석방법.
  3. 제1 항에 있어서,
    상기 생체 시료는 조직, 혈액, 세포, DNA, RNA, 단백질, 엑소좀, 대사체(metabolite)및 생검　검사물(biopsy specimen)로 이루어진 군 중에서 선택되는 1종 이상인 생체 시료의 선별적 분석방법.
  4. 제1 항에 있어서,
    상기 마스킹 구조물의 형성은 리소그래피 방식, 잉크젯 프린팅, 및 3D 프린팅 방식으로 이루어진 군 중에서 선택되는 방식에 의해 이루어지는 생체 시료의 선별적 분석방법.
  5. 제1 항에 있어서,
    상기 마스킹 구조물의 형성은 경화성 물질을 상기 기판 위에 도포하고 빛 또는 열로 경화하는 단계를 포함하는 생체 시료의 선별적 분석방법.
  6. 제1 항에 있어서,
    상기 마스킹 구조물을 형성을 위한 리소그래피 방식은 마스크와 기판 사이에 렌즈를 이용하여 상기 경화성 물질의 여러 영역에 대해 순차적으로 리소그래피를 수행하는 방식인 것인 생체 시료의 선별적 분석방법.
  7. 제1 항에 있어서,
    상기 생화학 반응 시약의 처리는 상기 목적 시료가 위치한 영역 및 상기 목적 시료 주위에 위치한 상기 마스킹된 영역의 범위 내에서 이루어짐으로써, 마스킹되지 않은 영역에 존재하는 생체 시료로부터의 오염이 없도록 하는 생체 시료의 선별적 분석방법.
  8. 제1 항에 있어서,
    상기 생화학 반응 시약은 라이시스 용액(lysis solution), PCR 반응용 시약, 전장유전체증폭 반응(whole genome amplification)용 시약 및 전사체 증폭 반응(whole transcription amplification)용 시약으로 이루어진 군 중에서 선택되는 1종 이상인 생체 시료의 선별적 분석방법.
  9. 생체 시료들이 배치된 기판을 준비하는 단계;
    상기 시료들 중 적어도 하나의 목적 시료가 위치하는 영역과 적어도 하나의 비목적 시료가 위치하는 영역을 구분하는 단계;
    상기 비목적 시료가 위치하는 영역을 선택적으로 마스킹하기 위한 마스킹 필름 층을 상기 기판 위에 형성하는 단계;
    상기 마스킹 필름 층을 상기 기판으로부터 박리함으로써 상기 비목적 시료를 제거하고 상기 목적 시료를 상기 기판 위에 남기는 단계;
    상기 목적 시료가 위치하는 영역에 생화학 반응 시약을 도입하거나 상기 목적 시료를 상기 기판으로부터 회수한 후 상기 목적 시료와 생화학 반응 시약을 반응시키는 단계; 및반응이 이루어진 상기 목적 시료를 분석하는 단계를 포함하는 생체 시료의 선별적 분석방법.
  10. 생체 시료들이 배치된 기판을 준비하는 단계;
    상기 시료들 중 적어도 하나의 목적 시료가 위치하는 영역과 적어도 하나의 비목적 시료가 위치하는 영역을 구분하는 단계;
    상기 비목적 시료가 위치하는 영역을 선택적으로 마스킹하기 위한 마스킹 구조물을 형성하는 단계;
    상기 목적 시료가 위치하는 영역에 라이시스 용액을 도입하여 상기 목적 시료를 용해시키는 단계;
    상기 용해에 의해 상기 목적 시료로부터 유래된 핵산 분자들을 생화학 반응 시약으로 처리하여 시퀀싱을 위한 상기 핵산 분자들의 라이브러리를 준비하는 단계;
    상기 핵산 분자들의 라이브러리를 상기 기판으로부터 회수하는 단계; 및
    회수된 상기 핵산 분자들의 라이브러리를 시퀀싱하는 단계를 포함하는 생체 시료의 선별적 분석방법.
  11. 생체 시료들이 배치된 기판을 준비하는 단계;
    상기 시료들 중 적어도 하나의 목적 시료가 위치하는 영역과 적어도 하나의 비목적 시료가 위치하는 영역을 구분하는 단계;
    상기 비목적 시료가 위치하는 영역을 선택적으로 마스킹하기 위한 마스킹 구조물을 형성하는 단계; 및
    상기 목적 시료가 위치하는 영역에 생화학 반응 시약을 도입하여 상기 목적 시료를 반응시키는 단계를 포함하는 생체 시료의 선별적 처리방법.
  12. 제11 항에 있어서,
    상기 반응 시약의 처리는 상기 목적 시료가 위치한 영역 및 상기 목적 시료 주위에 위치한 상기 마스킹된 영역의 범위 내에서 이루어짐으로써, 마스킹되지 않은 영역에 존재하는 생체 시료로부터의 오염이 없도록 하는 생체 시료의 선별적 처리 방법.
  13. 생체 시료들이 배치된 기판을 준비하는 단계;
    상기 시료들 중 적어도 하나의 목적 시료가 위치하는 영역과 적어도 하나의 비목적 시료가 위치하는 영역을 구분하는 단계;
    상기 비목적 시료가 위치하는 영역을 선택적으로 마스킹하기 위한 마스킹 구조물을 형성하는 단계;
    상기 마스킹 구조물을 마스킹된 상기 비목적 시료와 함께 상기 기판으로부터박리함으로써 상기 비목적 시료를 제거하고 상기 목적 시료를 상기 기판 위에 남기는 단계; 및
    상기 목적 시료가 위치하는 영역에 생화학 반응 시약을 도입하거나 상기 목적 시료를 상기 기판으로부터 회수한 후 상기 목적 시료와 생화학 반응 시약을 반응시키는 단계를 포함하는 생체 시료의 선별적 처리방법.
  14. (a) 생체 시료들이 배치된 기판을 준비하는 단계;
    (b) 상기 생체 시료들중 적어도 하나의 목적 시료가 위치하는 영역과 적어도 하나의 비목적 시료가 위치하는 영역을 구분하는 단계;
    (c) 제1 미세유체 구조물을 상기 기판 위에 제공하는 단계;
    (d) 경화성 물질을 상기 제1 미세유체 구조물 내부에 도입하는 단계;
    (e) 상기 비목적 시료가 위치하는 영역에 존재하는 상기 경화성 물질에 대해 선택적으로 에너지를 인가하여 경화시킴으로써 마스킹 구조물을 형성하는 단계;
    (f) 상기 목적 시료가 위치하는 영역에 생화학 반응 시약을 도입하여 상기 목적 시료를 반응시키는 단계; 및
    (g) 상기 목적 시료를 상기 기판 상에서 분석하거나 상기 기판으로부터 회수하여 분석함으로써 생체 시료를 선별적으로 분석하는 단계를 포함하는 생체 시료의 선별적 분석방법.
  15. 제14 항에 있어서,
    상기 (e) 단계와 상기 (f) 단계 사이에 상기 제1 미세유체 구조물을 상기 기판으로부터 제거하는 단계를 더 포함하는 것인 생체 시료의 선별적 분석방법.
  16. 제14 항에 있어서,
    상기 제1 미세유체 구조물은 상기 생체 시료들 중 상기 목적 시료가 위치하는 영역을 감싸도록 상기 기판 위를 덮는 형태를 가져 상기 목적 시료와 상기 제1 미세유체 구조물 사이에 이격 공간을 만드는 것인 생체 시료의 선별적 분석방법.
  17. 제14 항에 있어서,
    상기 생화학 반응 시약을 도입하여 반응시키는 단계 및 상기 목적 시료를 회수하여 분석하는 단계는 미세유체 기술을 이용하여 수행하는 것인 생체 시료의 선별적 분석방법.
  18. 제14 항에 있어서,
    상기 (f) 단계는 이하의 단계들을 더 포함하는 것인 생체 시료의 선별적 분석방법:
    f-1) 상기 제1 미세유체 구조물을 상기 기판으로부터 제거하는 단계;
    f-2) 상기 제2 미세유체 구조물을 상기 기판 위에 제공하여 상기 제2 미세유체 구조물과 상기 기판 사이에 이격 공간을 갖도록 하는 단계; 및
    f-3) 생화학 반응 시약을 상기 제2 미세유체 구조물 내부에 도입하여 상기 목적 시료와 반응시키는 단계.
  19. 마스킹 구조물 형성을 위한 제1 미세유체 구조물을 생체 시료가 배치된 기판 위에 제공하는 제1 미세유체 구조물 제공부;
    상기 제1 미세유체 구조물 내부에 경화성 물질을 도입하기 위한 경화성 물질 주입부;
    사용자의 요청 혹은 특정 알고리즘에 따라 마스킹 영역에 에너지를 인가하여 경화시켜 마스킹 구조물을 형성하기 위한 마스킹 구조물 제조부;
    상기 제1 미세유체 구조물을 상기 기판으로부터 제거하기 위한 제1 미세유체 구조물 제거부;
    생화학 반응 시약을 보유하기 위한 제2 미세유체 구조물을 상기 기판 위에 제공하는 제2 미세유체 구조물 제공부; 및
    생화학 반응을 진행하기 위해 상기 제2 미세유체 구조물과 상기 기판 사이의 이격 공간에 생화학 반응 시약을 도입하거나 빛, 열, 교반, 진동 또는 음파의 에너지를 인가하는 생화학적 처리부를 포함하는 생체 시료의 선별적 처리장치.
  20. 제19 항에 있어서,
    상기 마스킹 구조물 제조부는 리소그래피 시스템, 레이저 스캐닝, 잉크젯 프린팅 시스템 또는 3D 프린팅 시스템을 포함하는 것인 생체 시료의 선별적 처리장치.
  21. 제19 항에 있어서,
    상기 생화학적 처리부는 상기 생화학 반응시약의 저장부 및 공급부를 구비한 것인 생체 시료의 선별적 처리장치.
  22. 마스킹 구조물 형성을 위한 제1 미세유체 구조물을 생체 시료가 배치된 기판 위에 제공하는 제1 미세유체 구조물 제공부;
    상기 제1 미세유체 구조물 내부에 경화성 물질을 도입하기 위한 경화성 물질 주입부;
    사용자의 요청 혹은 특정 알고리즘에 따라 마스킹 영역에 에너지를 인가하여 경화시켜 마스킹 구조물을 형성하기 위한 마스킹 구조물 제조부; 및
    생화학 반응을 진행하기 위해 상기 제1 미세유체 구조물 내에 생화학 반응 시약을 도입하거나 빛, 열, 교반, 진동 또는 음파의 에너지를 인가하는 생화학적 처리부를 포함하는 생체 시료의 선별적 처리장치.
  23. 제1 미세유체 구조물 내부에 경화성 물질을 도입하기 위한 경화성 물질 주입부;
    사용자의 요청 혹은 특정 알고리즘에 따라 마스킹 영역에 에너지를 인가하여 경화시켜 마스킹 구조물을 형성하기 위한 마스킹 구조물 제조부; 및
    생화학 반응을 진행하기 위해 상기 제1 미세유체 구조물 내에 생화학 반응 시약을 도입하거나 빛, 열, 교반, 진동 또는 음파의 에너지를 인가하는 생화학적 처리부를 포함하되,
    상기 제1 미세유체 구조물은 생체 시료가 배치된 기판 위에 제공된 것인 생체 시료의 선별적 처리장치.
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