WO2021045167A1 - シルクファイバーを含む不織布、創傷被覆材、ｉＰＳ細胞足場材、血液適合材料用不織布、血液適合材料、シルクファイバーを含む不織布の製造方法、創傷被覆材の製造方法、ｉＰＳ細胞足場材の製造方法、血液適合材料用不織布の製造方法、及び血液適合材料の製造方法 - Google Patents

シルクファイバーを含む不織布、創傷被覆材、ｉＰＳ細胞足場材、血液適合材料用不織布、血液適合材料、シルクファイバーを含む不織布の製造方法、創傷被覆材の製造方法、ｉＰＳ細胞足場材の製造方法、血液適合材料用不織布の製造方法、及び血液適合材料の製造方法 Download PDF

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雄貴 関矢
亘 河合
祐樹 萩原
佳 松永
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Definitions

  • One of the embodiments of the present invention is a non-woven fabric containing silk fiber, a wound dressing, an iPS cell scaffolding material, a non-woven fabric for blood-compatible material, a blood-compatible material, a method for producing a non-woven fabric containing silk fiber, and a method for producing a wound dressing.
  • a method for producing an iPS cell scaffold material, a method for producing a nonwoven fabric for a blood-compatible material, and a method for producing a blood-compatible material is a non-woven fabric containing silk fiber, a wound dressing.
  • Patent Document 1 discloses that an undecomposed silk fibroin obtained by scouring a cocoon layer or a cocoon thread of a raw cocoon, a dried cocoon or a boiled cocoon, or a raw silk, a silk fabric or a residual thread thereof is provided. ing. Further, Patent Document 2 has the inconvenience that the fibroin molded product produced from silk fibroin obtained by the method shown in Patent Document 1 exhibits high water solubility and shows dissolution or weakening of strength due to contact with water. It is stated that it exists. Further, Patent Document 2 describes that a treatment for the purpose of insolubilization (for example, induction of crystallization by alcohol or induction of crystallization by heat treatment) is known in order to overcome this inconvenience. There is.
  • insolubilization for example, induction of crystallization by alcohol or induction of crystallization by heat treatment
  • a tubular structure is formed from a silk fibroin solution by an electrospinning method, and the tubular structure is further coated with a silk fibroin sponge to be used for an artificial blood vessel that requires blood compatibility. It is disclosed.
  • Patent Document 4 is characterized in that it is entangled with fiber threads having a diameter of 10 nm to 100 ⁇ m, has a porous structure, has a bulkiness of 200 to 2000 cm 3 / g, and has a flexibility of 50 to 500 mN.
  • the fibrous membrane for tissue repair is disclosed.
  • Patent Document 5 discloses a cell scaffold material such as an osteoblast made of silk composite nanofibers having an arbitrary composition ratio of silk and polyoxyic acid and having a fiber diameter of 100 nm to 1000 nm.
  • the artificial blood vessel is water resistant. Further improvement is required from the viewpoint of property and toughness.
  • blood-compatible materials such as artificial blood vessels, it is also required to suppress blood leakage and blood adhesion.
  • the fibrous membrane for tissue repair described in Patent Document 4 has room for improvement in healing effect.
  • Wound dressings are known as materials for covering wounds on the skin, but the wound dressings need to be water resistant for applications that presuppose contact with blood or body fluids on the skin wounds.
  • high toughness is required in view of the followability after application to the damaged part and the durability against deformation such as bending and stretching of the skin.
  • iPS cells which have been actively studied in recent years, are required to have a scaffolding material capable of forming a three-dimensional tissue structure during proliferation. Further, considering that the culture medium for culturing iPS cells is generally water, the iPS cell scaffolding material needs to have water resistance, and also considering the processing and use of the scaffolding material. , Good handleability, in other words, high toughness is required.
  • One of the embodiments of the present invention has been made in view of the above, and one of the objects of the present invention is to provide a non-woven fabric containing silk fiber having high water resistance and high toughness, and a method for producing the same.
  • one of the embodiments of the present invention has been made in view of the above, and is a non-woven fabric for a blood-compatible material, which has high water resistance, high toughness, can suppress blood leakage, and suppresses blood adhesion.
  • One of the objects is to provide a blood-compatible material, a method for producing a non-woven fabric for a blood-compatible material, and a method for producing a blood-compatible material.
  • one of the embodiments of the present invention has been made in view of the above, and an object of the present invention is to provide a wound dressing having high water resistance, high toughness, and excellent healing effect, and a method for producing the same. It is one of.
  • one of the embodiments of the present invention has been made in view of the above, and is an iPS cell having high water resistance, high toughness, and an iPS cell capable of forming a three-dimensional tissue structure during proliferation.
  • One of the purposes is to provide a scaffolding material and a method for producing the scaffolding material.
  • Nonwoven fabrics containing silk fibers having an abs intensity ratio [abs (1650) / abs (1620)] of more than 0.65 and 1.90 or less, which is a ratio of [abs (1620)] have high water resistance.
  • the present inventors have found that the above-mentioned non-woven fabric provides a non-woven fabric for a blood-compatible material, which has high water resistance, high toughness, can suppress blood leakage, and suppresses blood adhesion.
  • the present inventors have found that by using the above-mentioned non-woven fabric, a wound dressing having high water resistance, high toughness, and excellent healing effect can be obtained. Furthermore, the present inventors have found that by using the above-mentioned non-woven fabric, an iPS cell scaffold material having high water resistance, high toughness, and capable of forming a three-dimensional tissue structure of iPS cells during proliferation can be obtained. I found it.
  • the present invention includes the following aspects.
  • the ratio of the intensity of a peak located near 1650 cm -1 in the infrared absorption spectrum [abs (1650)], the intensity of the peak located in the vicinity of 1620cm -1 [abs (1620)] , abs A method for producing a non-woven fabric containing silk fibers, wherein the strength ratio [abs (1650) / abs (1620)] is greater than 0.65 and less than 1.90. [9] The method for producing a non-woven fabric containing silk fibers according to [8], wherein the fluoroalcohol is a solvent containing 70% by mass or more of 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol.
  • the silk fibroin solution contains silk fibroin in a solvent containing 70% by mass or more of 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol at a dissolution temperature of 58.6 ° C. or higher and 180 ° C. or lower.
  • a non-woven fabric containing silk fiber having high water resistance and high toughness and a method for producing the same.
  • a method for producing a non-woven fabric for a blood-compatible material, a non-woven fabric for a blood-compatible material, and a non-woven fabric for a blood-compatible material, which have high water resistance, high toughness, can suppress blood leakage, and suppress blood adhesion.
  • a method for producing a blood compatible material can be provided.
  • an iPS cell scaffold material having high water resistance, high toughness, and capable of forming a three-dimensional tissue structure by iPS cells during proliferation, and a method for producing the same. ..
  • the microscopic observation after each of the first, second, and third subcultures is performed, and the microscopic observation photograph shows the state at the time of iPS cell proliferation in the example.
  • the microscopic observation after each of the first, second, and third subcultures is performed, and the microscopic observation photograph shows the state at the time of iPS cell proliferation in the comparative example.
  • the non-woven fabric containing the silk fiber of one embodiment of the present invention has a peak intensity [abs (1650)] located near 1650 cm -1 in the infrared absorption spectrum and a peak intensity [abs (abs (1650)] located near 1620 cm -1. 1620)], which is a non-woven fabric containing silk fibers having an abs strength ratio [abs (1650) / abs (1620)] of more than 0.65 and 1.90 or less.
  • the peak intensity [abs (1650)] is derived from the ⁇ -helix structure of silk fiber, and the peak intensity [abs (1620)] is derived from the ⁇ -sheet structure of silk fiber.
  • the vicinity of 1650 cm -1 in the infrared absorption spectrum, around the 1650 cm -1 is intended to mean a range of ⁇ 10 cm -1, located near 1650 cm -1 in the infrared absorption spectrum
  • the peak to be used means the maximum peak within the range of ⁇ 10 cm -1 centered on 1650 cm -1.
  • the near 1620 cm -1 in the infrared absorption spectrum, around the 1620 cm -1 is intended to mean a range of ⁇ 10 cm -1, a peak located near 1620 cm -1 in the infrared absorption spectrum the, around the 1620 cm -1, means the maximum peak in the range of ⁇ 10 cm -1.
  • the non-woven fabric containing the silk fiber of one embodiment of the present invention has an abs strength ratio [abs (1650) / abs (1620)] of the silk fiber contained in the non-woven fabric of more than 0.65 and 1.90 or less. It is possible to achieve high water resistance and high toughness.
  • the abs strength ratio [abs (1650) / abs (1620)] of silk fibers contained in the non-woven fabric for blood-compatible material is larger than 0.65 and 1.90 or less. By being present, it is possible to achieve high water resistance, high toughness, suppression of blood leakage, and suppression of blood adhesion.
  • the wound dressing according to the embodiment of the present invention uses a non-woven fabric containing silk fibers having an abs strength ratio [abs (1650) / abs (1620)] of more than 0.65 and 1.90 or less. , High water resistance, high toughness, and excellent healing effect can be achieved. Further, as the iPS cell scaffold material of one embodiment of the present invention, a non-woven fabric containing silk fibers having an abs strength ratio [abs (1650) / abs (1620)] of more than 0.65 and 1.90 or less is used. This makes it possible for iPS cells to have high water resistance, high toughness, and to form a three-dimensional tissue structure during proliferation.
  • the brittleness of the non-woven fabric can be improved by increasing the abs strength ratio [abs (1650) / abs (1620)] to more than 0.65.
  • the high peak intensity [abs (1620)] ensures toughness based on the ⁇ -sheet structure, while the peak intensity [abs (1650)] does not become too low, resulting in the ⁇ -helix structure. It is thought that the toughness will increase.
  • high water resistance can be obtained by setting the abs intensity ratio [abs (1650) / abs (1620)] to 1.90 or less.
  • the presence of the peak intensity [abs (1620)] ensures the toughness based on the ⁇ -sheet structure, while the peak intensity [abs (1650)] does not become too high, so that the water is caused by the ⁇ -helix structure. It is considered that the dissolution in water can be suppressed, the shape can be easily maintained in water, and the water resistance is guaranteed.
  • silk fibroin has been known to have excellent biocompatibility, and by using a non-woven fabric for blood-compatible materials, which is a non-woven fabric containing silk fiber, blood leakage can be suppressed and blood adhesion can be prevented. It is possible to suppress it.
  • the silk fiber in the blood-compatible material non-woven fabric of one embodiment of the present invention is usually obtained from silk fibroin, and most of the secondary structure thereof has a ⁇ -sheet planar structure rather than an ⁇ -helix helix structure. Therefore, it is a material that is insoluble and tough to water, and it is presumed that it protects blood leakage from physical external stimuli as a blood-compatible material, and further suppresses blood adhesion.
  • the brittleness of the non-woven fabric can be improved by increasing the abs strength ratio [abs (1650) / abs (1620)] to more than 0.65.
  • the high peak intensity [abs (1620)] ensures toughness based on the ⁇ -sheet structure, while the peak intensity [abs (1650)] does not become too low, so that the wound dressing is caused by the ⁇ -helix structure. It is considered that the compatibility with water as a material can be ensured, the toughness is increased, in other words, the shape of the non-woven fabric can be maintained.
  • high water resistance can be obtained by setting the abs intensity ratio [abs (1650) / abs (1620)] to 1.90 or less.
  • the presence of the peak intensity [abs (1620)] ensures toughness based on the ⁇ -sheet structure, while the peak intensity [abs (1650)] does not become too high, so that the wound is caused by the ⁇ -helix structure. It is considered that the dissolution of the coating material in water can be suppressed, the shape can be easily maintained in water, and the water resistance is guaranteed.
  • Silk moth-derived silk fibroin is said to be a material with excellent biocompatibility, and has been used, for example, in surgical sutures (manufactured by Manny Co., Ltd., trade name: Manny Silk).
  • the silk fiber in the wound dressing of one embodiment of the present invention is usually obtained from silk fibroin, and the silk fiber in the non-woven fabric of one embodiment of the present invention has a spiral structure in which most of the secondary structures are ⁇ -helices.
  • ⁇ -sheet Since it has a planar structure of ⁇ -sheet, it is a material that is insoluble and tough to water, and as a wound dressing, it protects the wound from physical external stimuli and enhances its healing effect. It is presumed to be. Generally, in the process of wound healing, the epithelial tissue of the skin is finally regenerated through each stage of hemostasis, inflammation, cell proliferation, and maturation. As a wound material, a non-woven fabric containing silk fiber is used. By using it, it is considered that it contributes to the regeneration of tissues (particularly the regeneration of epithelial layer) in these healing processes.
  • the brittleness of the non-woven fabric can be improved, and it is considered that the non-woven fabric can be used as a scaffolding material for iPS cells.
  • the exact reason for this is unknown, but the peak intensity [abs (1650)] does not become too low while ensuring the toughness based on the ⁇ -sheet structure due to the large peak intensity [abs (1620)]. Therefore, it is considered that the compatibility with water as an iPS cell scaffold material due to the ⁇ -helix structure can be ensured, the toughness is increased, in other words, the shape of the non-woven fabric can be maintained.
  • iPS cells can form a three-dimensional tissue structure during proliferation.
  • Silk moth-derived silk fibroin is said to be a material with excellent biocompatibility in nature, and has been used, for example, in surgical sutures (trade name: Manny Silk, Manny Co., Ltd.).
  • the silk fiber in the present invention is usually obtained from silk fibroin, and most of the secondary structure of the silk fiber in the non-woven fabric of the embodiment of the present invention is not a spiral structure of an ⁇ helix but a planar structure of a ⁇ sheet.
  • the abs intensity ratio is larger than 0.65 and 1.90 or less, preferably 0.70 or more and 1.00 or less, and more preferably 0.70 or more and 0.80 or less. If the abs strength ratio is 0.65 or less, toughness cannot be guaranteed. On the other hand, if the abs strength ratio is larger than 1.90, water resistance cannot be guaranteed.
  • the method for adjusting the abs intensity ratio to be larger than 0.65 and 1.90 or less is not particularly limited.
  • silk fibroin as a raw material is dissolved in a fluoroalcohol to obtain a silk fibroin solution and electrospun. Thereby, a non-woven fabric containing silk fiber can be obtained.
  • the non-woven fabric containing silk fibers (also simply referred to as “nonwoven fabric”) is preferably a non-woven fabric for blood-compatible materials.
  • the non-woven fabric is preferably a wound dressing.
  • the non-woven fabric is preferably an iPS cell scaffolding material.
  • silk fibroin used as a raw material can be obtained by removing impurities and the like from silk moth cocoon balls or raw silk.
  • the cocoon thread exhaled by the silk moth larva consists of a fibroin filament and the collagenous sericin that surrounds it, and the cocoon ball is created by adhering the fibroin filament with sericin.
  • the content of fibroin in the cocoon ball is 70% by mass or more and 80% by mass or less, the content of sericin is 20% by mass or more and 30% by mass or less, and other impurities such as a small amount of fat are included.
  • the raw yarn is a yarn taken out from the cocoon after the cocoon ball is soaked in hot water and contains impurities.
  • the silk moth species producing silk fibroin used in the iPS cell scaffold material of one embodiment of the present invention and the method for producing the same are not particularly limited, and wild silk moths such as silk moths, silk moths, and wild silk moths, or silk moths can be mentioned.
  • silk fibroin obtained through scouring can be used. Refining is a step of removing the contaminants from the cocoon balls. For example, the contaminants can be removed by bringing the cocoon balls or raw yarn into contact with an alkaline solution such as soap solution, lye or soda solution.
  • silk fibroin commercially available as silk thread, silk fabric, health food, etc. may be used. It is also possible to use silk fibroin collected directly from the silk glands of silk moth larvae.
  • the molecular weight (Mw) of silk fibroin used in the iPS cell scaffolding material of one embodiment of the present invention and the method for producing the same is not particularly limited.
  • the Mw of silk fibroin is usually 50,000 to 370,000, depending on the type of alkaline solution used in the refining of cocoon balls or raw silk and the refining conditions.
  • the fluorinated alcohol (also referred to as fluorinated alcohol) may be any fluorinated alcohol such as 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol (HFIP) as long as it can dissolve silk fibroin. Can be mentioned.
  • the fluoroalcohol is preferably HFIP.
  • the fluorinated alcohol may be used alone or in combination.
  • the fluorinated alcohol may be used by mixing one kind or two or more kinds of other solvents.
  • the other solvent may be any solvent that does not hinder the dissolution without causing alteration of silk fibroin and reduction of molecular weight.
  • the fluoroalcohol is a solvent containing 70% by mass or more of 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol.
  • the silk fibroin solution is obtained by dissolving silk fibroin as a raw material in a fluoroalcohol.
  • the container used for dissolving silk fibroin in a fluoroalcohol is not particularly limited as long as it is a container having airtightness and pressure resistance.
  • a closed pressure-resistant container made of glass, stainless steel, or a resin-lined container can be used.
  • the silk fibroin solution is obtained by dissolving silk fibroin in a solvent containing 70% by mass or more of 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol.
  • the dissolution temperature at the time of dissolving silk fibroin in a solvent containing 70% by mass or more of 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol is not particularly limited, but is 58.6 ° C. or higher and 180 ° C. The following is preferable.
  • 58.6 ° C. or higher which is the boiling point of HFIP at atmospheric pressure (1013.25 hPa)
  • the dissolution rate of silk fibroin does not slow down and the amount of insoluble matter recovered does not increase, which is preferable.
  • it is 60 ° C. or higher.
  • coloring of the solution due to hydrolysis or alteration of silk fibroin is unlikely to occur, which is preferable. It is preferably 140 ° C. or lower, and particularly preferably 120 ° C. or lower.
  • the dissolution time of silk fibroin in a solvent containing 70% by mass or more of 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol is 0.5 hours or more and 24 hours or less. ..
  • the dissolution time is 0.5 hours or more, the silk fibroin is sufficiently dissolved and the amount of insoluble matter recovered is unlikely to increase, which is preferable.
  • a dissolution time of 24 hours or less is preferable because it is highly productive and practical.
  • silk fibroin is less likely to be hydrolyzed to cause a decrease in molecular weight and the HFIP solution of silk fibroin is less likely to be colored. It is preferably within 12 hours, and particularly preferably within 6 hours.
  • the concentration of silk fibroin in the silk fibroin solution is preferably 0.01% by mass or more and 50% by mass or less with respect to the entire silk fibroin solution. More preferably, it is 0.1% by mass or more and 30% by mass or less, further preferably 1% by mass or more and 10% by mass or less, and particularly preferably 1% by mass or more and 5% by mass or less. If the concentration is 0.01% by mass or more, the productivity of the obtained non-woven fabric containing silk fiber can be easily ensured, and if it is 50% by mass or less, the viscosity of the solution does not become too high, so that molding is easy.
  • the concentration is 0.01% by mass or more, the productivity of the obtained non-woven fabric for blood-compatible material can be easily ensured, and if it is 50% by mass or less, the viscosity of the solution does not become too high, so that molding is easy. If the concentration is 0.01% by mass or more, the productivity of the obtained wound dressing can be easily ensured, and if it is 50% by mass or less, the viscosity of the solution does not become too high, so that molding is easy. When the concentration is 0.01% by mass or more, the productivity of the obtained iPS cell scaffold material can be guaranteed, which is preferable. When the concentration is 50% by mass or less, the viscosity of the silk fibroin solution does not become too high and it is easy to mold. preferable.
  • the method for producing the silk fibroin solution according to the embodiment of the present invention can be carried out in either an inert gas atmosphere such as nitrogen or helium, or an air atmosphere, but it is preferably carried out in an inert gas atmosphere.
  • the air atmosphere can be responsible for promoting hydrolysis and coloration of the solution.
  • the concentration of the silk fibroin solution will be described below. After preparing a dilute silk fibroin solution, it can be concentrated by distilling off a part of the fluoroalcohol in the solution to obtain a highly concentrated silk fibroin solution. For example, after preparing an HFIP solution of silk fibroin having a concentration of 1% by mass, an HFIP solution of silk fibroin having a concentration of 10% by mass or more can be obtained using an evaporator. Although the amount of HFIP used increases, it has the effect of shortening the dissolution time.
  • an electric field spinning method As a method of obtaining a non-woven fabric containing silk fiber using a silk fibroin solution, an electric field spinning method can be mentioned.
  • the electric field spinning method is a method in which a polymer solution is injected and spun while a high voltage is applied between a nozzle (needle) and an electrode (collector).
  • the polymer solution is put into a syringe, and the polymer solution is ejected from the needle toward the collector while applying a voltage of about 1 to 100 kV between the needle at the tip of the syringe and the collector.
  • a voltage about 1 to 100 kV between the needle at the tip of the syringe and the collector.
  • the repulsive force of the electric charge overcomes the surface tension of the droplet of the polymer solution, and a charged jet is generated.
  • the solvent evaporates while the jet evaporates in the electric field, forming fine fibers, and the fibers are accumulated on the collector to obtain a non-woven fabric.
  • JIS Japanese Industrial Standards
  • a non-woven fabric is defined as "fibers are oriented in one direction or randomly, and the fibers are bonded by entanglement, fusion, or adhesion" (JIS L). 0222: 2001).
  • the suitable applied voltage when performing electric field spinning is 1 kV or more and 100 kV or less. More preferably, it is 5 kV or more and 50 kV or less. Particularly preferably, it is 10 kV or more and 30 kV or less.
  • the applied voltage is 1 kV or more, when the HFIP solution of silk fibroin is injected from the needle, a charged jet is likely to be generated, and dripping is unlikely to occur.
  • the applied voltage is 100 kV or less, it is easy to control the velocity and shape of the jet.
  • the suitable distance (also referred to as spinning distance) between the needle and the collector when performing electric field spinning is 5 cm or more and 50 cm or less. More preferably, it is 7.5 cm or more and 40 cm or less. Particularly preferably, it is 10 cm or more and 30 cm or less. When the distance between the needle and the collector is 5 cm or more, the solvent easily evaporates sufficiently and dripping is unlikely to occur. If the distance between the needle and the collector is 50 cm or less, a jet is likely to occur.
  • the rotation speed of the collector is not particularly limited, but is preferably 30 rpm or more and 500 rpm or less, and more preferably 50 rpm or more and 150 rpm or less.
  • the temperature in the electrospinning method is not particularly limited, but is preferably 0 ° C. or higher and 80 ° C. or lower, and more preferably 15 ° C. or higher and 40 ° C. or lower, which is near room temperature (20 to 25 ° C.).
  • the humidity in the electrospinning method is not particularly limited, but is preferably 20% or more and 80% or less, more preferably 20% or more and 60% or less, and 20% or more and 40% or less. Is particularly preferred. Further, as described above, when the temperature and humidity are appropriately adjusted, the value of the abs intensity ratio [abs (1650) / abs (1620)] is easily adjusted to be larger than 0.65 and 1.90 or less.
  • a non-woven fabric electric field spinning device NANON-03 manufactured by MEC Co., Ltd. was used as a device for performing electric field spinning.
  • the non-woven fabric containing silk fibers produced by the electrospinning method as described above can be insolubilized by contacting (for example, dipping) with alcohol and drying. Thereby, the ratio of the ⁇ sheet structure in the non-woven fabric can be increased, and the value of the abs strength ratio [abs (1650) / abs (1620)] is adjusted to the range of 0.7 or more and 1.0 or less. It becomes easier to do.
  • the alcohol is not particularly limited, and examples thereof include water-soluble alcohols such as methanol, ethanol, n-propyl alcohol, and isopropanol. Preferably, it is ethanol that is easily available and easy to handle.
  • the alcohol may be an aqueous alcohol solution.
  • Examples of the method of contact with alcohol include known contact methods such as a method of immersing the non-woven fabric in alcohol, a method of exposing the non-woven fabric to the vapor of alcohol, and a method of spray-coating the non-woven fabric with alcohol. From the viewpoint of uniform insolubilization treatment in a short time, a method of immersing the non-woven fabric in alcohol is preferable.
  • the contact time with alcohol is not particularly limited, but is usually preferably 10 minutes or more and 5 hours or less, more preferably 10 minutes or more and 3 hours or less, and further preferably 10 minutes or more and 1 hour or less.
  • the contact temperature with alcohol is not particularly limited, but is preferably 10 ° C. or higher and 50 ° C. or lower, and more preferably 15 ° C. or higher and 40 ° C. or lower. Further, the contact with the alcohol may be performed under pressurized conditions.
  • the pressurizing conditions are not particularly limited, but are preferably atmospheric pressure (1013.25 hPa on the sea surface) or more and twice the atmospheric pressure (2026.5 hPa) or less.
  • the drying is not particularly limited as long as the insolubilized non-woven fabric is dried, and examples thereof include constant temperature drying and hot air drying.
  • the abs strength ratio [abs (1650) / abs (1620)] of the non-woven fabric before alcohol contact is 1.9 or less
  • the abs strength ratio [abs (1650) / abs (1620)] of the non-woven fabric after alcohol contact ] Becomes 0.65 or less and becomes brittle.
  • the abs strength ratio [abs (1650) / abs (1620)] of the non-woven fabric obtained by setting the humidity at the time of electrospinning before producing the non-woven fabric to 50% or more and 70% or less is 1.90 or more.
  • the abs strength ratio [abs (1650) / abs (1620)] of the non-woven fabric after the alcohol contact can be set to 0.70 or more and 0.80 or less ([in the present specification]. Example]).
  • the non-woven fabric contains silk fiber, but may be a non-woven fabric composed of only silk fiber (silk fiber non-woven fabric).
  • the non-woven fabric containing silk fiber can be controlled to a desired thickness by appropriately adjusting the amount and concentration of the silk fibroin solution as a raw material.
  • the thickness is preferably 1 ⁇ m or more and less than 250 ⁇ m because the thickness can be easily controlled. More preferably, it is 1 ⁇ m or more and 200 ⁇ m or less, and more preferably 5 ⁇ m or more and 150 ⁇ m or less. Particularly preferably, it is 10 ⁇ m or more and 100 ⁇ m or less.
  • a support for holding the non-woven fabric may be further bonded to one side or both sides of the obtained non-woven fabric depending on the application, and the material of the support. Is not particularly limited.
  • the suitable fiber diameter (thickness) (diameter in the case of a circular cross section) of the silk fiber (fiber) constituting the non-woven fabric is 10 nm or more and 10 ⁇ m or less. More preferably, it is 20 nm or more and 5 ⁇ m or less.
  • the fiber diameter is particularly preferably 30 nm or more and 1 ⁇ m or less. Fibers having a fiber diameter of 10 nm or more and 10 ⁇ m or less can be easily obtained by an electrospinning method.
  • the non-woven fabric is preferably a non-woven fabric for blood compatible materials.
  • the present invention also relates to blood compatible materials, including non-woven fabrics for blood compatible materials, including silk fibers.
  • a blood-compatible material is a material used in contact with blood.
  • the blood-compatible material is not particularly limited, and examples thereof include artificial blood vessels, catheters, blood filters, adhesion-preventing materials, stents, cell scaffolding materials, artificial organs, blood storage containers, blood transfusion tools, and the like.
  • the non-woven fabric containing the silk fiber of one embodiment of the present invention can be particularly preferably used for artificial blood vessels that are in constant contact with blood.
  • These blood compatible materials may contain at least a portion of silk fiber and may include other components.
  • these blood-compatible materials are multilayer bodies in which a non-woven fabric for a blood-compatible material containing silk fibers is coated on a base material (for example, a polymer member containing a synthetic polymer or a biopolymer, or a metal member). You may.
  • a base material for example, a polymer member containing a synthetic polymer or a biopolymer, or a metal member.
  • the non-woven fabric is preferably a wound dressing.
  • the non-woven fabric is preferably an iPS cell scaffolding material.
  • iPS cells represent induced pluripotent stem cells and are pluripotent stem cells.
  • stem cell refers to a cell having self-renewal ability and differentiation ability. Among stem cells, those having self-renewal ability and capable of differentiating from one cell into all endoderm, mesoderm, and ectoderm cells are called "pluripotent stem cells”.
  • the method for producing a non-woven fabric containing silk fiber according to an embodiment of the present invention has been described, but the method for producing a non-woven fabric containing silk fiber according to a preferred embodiment of the present invention is as follows.
  • the ratio of the intensity of a peak located near 1650 cm -1 in the infrared absorption spectrum [abs (1650)], the intensity of the peak located in the vicinity of 1620cm -1 [abs (1620)] , abs A method for producing a non-woven fabric containing silk fibers, wherein the strength ratio [abs (1650) / abs (1620)] is greater than 0.65 and less than 1.90.
  • Silk fibroin, fluorinated alcohol, silk fibroin solution, electric field spinning, abs intensity ratio [abs (1650) / abs (1620)] and the like are as described above.
  • the fluoroalcohol is preferably a solvent containing 70% by mass or more of 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol.
  • the silk fibroin solution contains silk fibroin in a solvent containing 70% by mass or more of 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol at a dissolution temperature of 58.6 ° C. or higher and 180 ° C. or lower. It is preferably obtained by dissolving.
  • Fluorine-based alcohol, silk fibroin solution, solvent containing 70% by mass or more of 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol and the like are as described above.
  • the fluoroalcohol is preferably 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol.
  • the step of contacting with alcohol is as described above.
  • the alcohol is ethanol or an aqueous solution thereof.
  • the non-woven fabric is preferably a wound dressing.
  • the non-woven fabric is preferably an iPS cell scaffolding material.
  • the non-woven fabric is preferably a non-woven fabric for blood-compatible materials (non-woven fabric for blood-compatible materials containing silk fibers).
  • one embodiment of the present invention also relates to a method for producing a blood-compatible material, including a method for producing a nonwoven fabric for a blood-compatible material containing the silk fiber.
  • the method for culturing iPS cells in one embodiment of the present invention is a known culturing method in which a culture medium (liquid) and a scaffold material are prepared in a plastic petri dish, and then the iPS cells are adhered to the scaffold material and cultured. Was used.
  • the iPS cells after cell culture were evaluated for their undifferentiated potential by flow cytometry and real-time PCR according to known methods.
  • An example of the culture method will be described in the examples of the present invention.
  • Silk Fibroin HFIP Solution 0.2 g of silk fibroin and 19.8 g of HFIP were weighed in a 100 mL stainless steel pressure resistant container equipped with a thermometer and a stir bar at 25 ° C. Next, the inside of the pressure-resistant container was heated to 110 ° C. and then stirred for 2 hours to dissolve the silk fibroin to obtain an HFIP solution having a silk fibroin concentration of 1% by mass. From the obtained silk fibroin HFIP solution, 10.0 g of HFIP was distilled off under reduced pressure using an evaporator to obtain 10.0 g of a silk fibroin HFIP solution having a concentration of 2% by mass.
  • Example 1 Spinning by electrospinning Using a non-woven fabric electrospinning apparatus NANON-03 manufactured by MEC Co., Ltd., spinning was performed from the silk fibroin HFIP solution obtained above.
  • the inner diameter of the nozzle was set to 0.4 mm, the applied voltage was set to 25 kV, and the spinning distance was set to 20 cm.
  • the temperature of the spinning apparatus was maintained at 23 to 24 ° C., and the humidity was maintained at 20 to 30%.
  • a drum roll collector was used as the collector, and imitation paper was used on the collector electrode.
  • the rotation speed of the drum collector was 100 rpm.
  • the obtained non-woven fabric had a thickness of 20 to 50 ⁇ m and a fiber diameter of 100 to 700 nm.
  • Example 1 Spinning by electrospinning Spinning was carried out in the same manner as in Example 1 except that the temperature of the spinning apparatus was maintained at 26 to 27 ° C. and the humidity was maintained at 50 to 60%.
  • the obtained non-woven fabric had a thickness of 20 to 50 ⁇ m and a fiber diameter of 100 to 700 nm.
  • Example 2 A non-woven fabric prepared under the same conditions as in Comparative Example 1 was immersed in ethanol at 23 ° C. for 20 minutes and dried to obtain an insolubilized non-woven fabric.
  • Example 3 A non-woven fabric produced under the same conditions as in Comparative Example 1 was immersed in ethanol at 23 ° C. for 1 hour and dried to obtain an insolubilized non-woven fabric.
  • Example 4 A non-woven fabric produced under the same conditions as in Comparative Example 1 was immersed in ethanol at 23 ° C. for 3 hours and dried to obtain an insolubilized non-woven fabric.
  • Example 5 0.2 g of silk fibroin and 19.8 g of HFIP were weighed at 25 ° C. in a 100 mL stainless steel pressure vessel equipped with a thermometer and a stir bar. By stirring for 2 hours to dissolve the silk fibroin, an HFIP solution having a silk fibroin concentration of 1% by mass was obtained. From the obtained silk fibroin HFIP solution, 15.0 g of HFIP was distilled off under reduced pressure using an evaporator to obtain 5.0 g of a silk fibroin HFIP solution having a concentration of 4% by mass. Spinning was carried out under the same conditions as in Example 1 except that this silk fibroin HFIP solution was used. The obtained non-woven fabric had a thickness of 20 to 50 ⁇ m and a fiber diameter of 100 to 700 nm.
  • Table 1 shows the values of the abs strength ratio [abs (1650) / abs (1620)] of the non-woven fabric produced and the water resistance evaluation result.
  • Example 1 in which the abs intensity ratio [abs (1650) / abs (1620)] was 2.15, the non-woven fabric was completely dissolved, resulting in poor water resistance.
  • Example 1 in which the abs intensity ratio [abs (1650) / abs (1620)] is 1.81 and in Example 5 in which the abs intensity ratio is 1.69, the dissolution is limited to partial, and the non-woven fabric is formed with respect to water. It tended to maintain its shape easily.
  • Examples 2 to 4 in which the abs intensity ratio [abs (1650) / abs (1620)] is 1.00 or less, dissolution is not confirmed, and the shape of the non-woven fabric can be maintained with respect to water.
  • the silk fiber non-woven fabrics produced in Examples 1 to 5 and Comparative Examples 1 and 2 were used as non-woven fabrics for blood-compatible materials, respectively.
  • the evaluation of the water resistance of the silk fiber non-woven fabric is as shown in Table 1.
  • the silk fiber non-woven fabric produced in Example 3 above was used as a non-woven fabric for a blood-compatible material.
  • a pressure resistance test of the non-woven fabric required for a blood-compatible material such as an artificial blood vessel was performed.
  • the polyester fiber non-woven fabric was also tested in the same manner.
  • the polyester fiber non-woven fabric is a non-woven fabric produced by the electrolytic spinning method after using polyethylene terephthalate, model number NEH-2070 manufactured by Unitika Co., Ltd. as a raw material and dissolving it with HFIP in the same manner as the silk fiber non-woven fabric to make a solution. ..
  • a plastic disposable syringe (internal volume 10 ml) was prepared, and a plastic filter holder (filter inner diameter 13 mm) was connected to the outlet side of the syringe.
  • the silk fiber non-woven fabric and polyester fiber non-woven fabric produced in Example 3 were cut out to a circular size with a diameter of 13 mm using scissors, and then each non-woven fabric was sandwiched between filter holders of a syringe.
  • Table 2 shows the results of pressure resistance evaluation of each non-woven fabric.
  • the silk nanofiber non-woven fabric did not leak blood in the range of 0 mmHg to 500 mmHg.
  • the polyester fiber non-woven fabric did not leak blood in the range of 0 mmHg to 200 mmHg, but leaked blood at pressures of 300 mmHg, 400 mmHg, and 500 mmHg.
  • the silk nanofiber non-woven fabric does not leak blood at each pressure and has preferable pressure resistance characteristics as a non-woven fabric for blood-compatible materials.
  • Table 3 shows the results of the blood adhesion test of each non-woven fabric.
  • the silk nanofiber non-woven fabric is preferable as a non-woven fabric for a blood-compatible material because it has a property that blood does not easily adhere to it.
  • the silk fiber non-woven fabrics produced in Examples 1 to 5 and Comparative Examples 1 and 2 were used as wound dressings, respectively.
  • the evaluation of the water resistance of the wound dressing is as shown in Table 1.
  • the experimental animal was anesthetized with isoflurane and shaved.
  • a full-thickness defect wound with a diameter of 15 mm was prepared using a peeling punch.
  • the wound dressings of groups E and Si were moistened with physiological saline and brought into close contact with the wound site.
  • the CH group attached the dressing to the wound site according to the product package insert. After attaching the dressing, gauze was attached from above the dressing, fixed with surgical tape, and then a net bandage was attached to the body so as to cover the gauze.
  • gauze moistened with physiological saline was applied directly to the wound site, fixed with surgical tape, and then a net bandage was attached to the torso so as to cover the gauze.
  • Elizabethan collars were applied to all rats after model animal production on the day of model animal production. After the model animal production date, the Elizabethan collar was changed once every 2 to 4 days.
  • the dressing, gauze and net bandage were replaced, but if the dressing and gauze did not come off from the wound site, they were moistened with physiological saline and then peeled off. If it did not come off even when wet, did not forcibly remove it, and replaced only the gauze or net bandage attached on top.
  • Rats were anesthetized with isoflurane inhalation anesthesia. Under anesthesia, the dressing, gauze and net bandages were removed and the wound site was photographed with a digital camera.
  • Rats were anesthetized with isoflurane inhalation anesthesia. Under anesthesia, the dressing, gauze and net bandages were removed and the shape of the wound site was transferred to tracing paper. If the dressing or gauze did not come off from the wound site, it was moistened with physiological saline and then peeled off. If it did not come off even when wet, it was not forcibly peeled off, and the shape of the wound site was transferred through a dressing or gauze. Information on tracing paper was input to the computer using an image scanner. The area was measured using ImageJ software (US National Institutes of Health).
  • Table 4 shows the area of the damaged part and the ratio (%) of the area of the damaged part.
  • wound area evaluation A: The area of the wound becomes smaller at an early stage (see after 4 days), and the area of the wound becomes smaller after 14 days.
  • the silk group (Si group) had the smallest area in terms of wound site area (average) at an early stage up to 4 days later.
  • the silk (Si) group has a smaller wound site area (average) and is superior in cross-sectional observation of the wound tissue to the regeneration of the epithelial layer as compared with the other groups.
  • the wound was beautifully regenerated. From the above, it can be seen that the silk group (Si) is superior in healing effect as compared with the other groups.
  • the silk fiber non-woven fabrics prepared in Examples 1 to 5 and Comparative Examples 1 and 2 were used as iPS cell scaffolding materials, respectively.
  • the evaluation of the water resistance of the iPS cell scaffold material is as shown in Table 1.
  • IPS cell culture test the iPS cell culture test will be described in detail, but the present invention is not limited thereto.
  • human iPS cells Cellartis human iPS cell line P11025 (European / North African, male, 33.4 years old) manufactured by Takara Bio Inc. was used.
  • culture medium DEF-CS 100 Basal Medium of Cellartis DEF-CS 100 Culture System manufactured by Takara Bio Inc. was used.
  • the culture substrate cell scaffold
  • the silk fiber non-woven fabric prepared in Example 3 above, or DEF-CS COAT-1 manufactured by Takara Bio Co., Ltd., non-silk fiber
  • control comparativative example
  • the culture substrates (cell scaffolds) applied to the petri dishes (polystyrene cell culture plates manufactured by TPP) were used.
  • the cell exfoliating solution used for cell culture and passage was CTSTM TrypLETM Select Enzyme (Thermo Fisher Scientific, Cat. No. A1285901), Cell lavage solution D-PBS (-) (Wako, Cat. No. 045-29795,). Lot. No. APG7057) and STEM-CELLBANKER (manufactured by Zenoaq, Cat. No. CB045) were used as the cell preservation solution.
  • the iPS cells were cultured on the silk fiber non-woven fabric and the DEF-CS COAT-1 coated scaffolds until they became confluent, and the iPS cells were observed under an inverted microscope (this is referred to as the first passage). Furthermore, iPS cells were subcultured on a newly prepared silk fiber non-woven fabric and a DEF-CS COAT-1 coat, and the culture was repeated. Finally, at the end of the third passage, two methods, a flow cytometry method and a real-time PCR method, were performed to confirm the undifferentiation of iPS cells.
  • Example 1 Cut each silk fiber non-woven fabric into a circle with a diameter of about 2.1 cm. 2). Immerse a circular silk fiber non-woven fabric in 70% ethanol and sterilize it. 3). After air-drying the silk fiber non-woven fabric, wash it with D-PBS (-) several times. 4). Put the silk fiber non-woven fabric in the well of the 12-hole plate. 5). Add culture medium (GF3 +). 6). Incubate at 37 ° C for at least 2 hours. 7). Wash 70-80% confluent cells with D-PBS (-) 1 mL / well. 8).
  • the above table shows the total number of cells in which iPS cells were first seeded and how much the iPS cells proliferated after culturing, and the percentage of living iPS cells in the total cells excluding dead cells. It describes the rate, etc. From the above table, it can be seen that the total number of iPS cells increased steadily on the silk fiber non-woven scaffold as well as the control COAT-1 scaffold, and the proportion of dead cells was not high.
  • iPS cell culture increases the number of cells and also retains undifferentiated ability.
  • the expression of undifferentiated markers SSEA-4 and TRA-1-60 was tested by flow cytometry, respectively. Specifically, in order to evaluate the undifferentiated ability of iPS cells, analysis was performed with a flow cytometer (manufactured by BD Bioscience, FACS Maria). The evaluation results are shown below.
  • the iPS cells cultured on the silk fiber showed the same positive results as the control test for both SSEA-4 and TRA-1-60, which are undifferentiated markers on the surface of the iPS cells. It was found that the differentiation ability was maintained.
  • the iPS cells cultured on the silk fiber non-woven fabric showed the same expression level as the control test, and it was found that the undifferentiated ability was maintained.
  • the expression level ratio of the control was high for Oct3 / 4, and it was about the same for Oct3 / 4. It was found that there was and maintained undifferentiated.
  • a non-woven fabric containing silk fiber having high water resistance and high toughness and a method for producing the same.
  • a method for producing a non-woven fabric for a blood-compatible material, a non-woven fabric for a blood-compatible material, and a non-woven fabric for a blood-compatible material, which have high water resistance, high toughness, can suppress blood leakage, and suppress blood adhesion.
  • a method for producing a blood compatible material can be provided.
  • an iPS cell scaffold material having high water resistance, high toughness, and capable of forming a three-dimensional tissue structure by iPS cells during proliferation, and a method for producing the same. ..

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Abstract

本発明の実施形態の一つは、赤外吸収スペクトルの１６５０ｃｍ－１付近に位置するピークの強度［ａｂｓ(（１６５０）)］と、１６２０ｃｍ－１付近に位置するピークの強度［ａｂｓ(（１６２０）)］の比である、ａｂｓ強度比［ａｂｓ(（１６５０）)／ａｂｓ(（１６２０）)］が０．６５より大きく、１．９０以下であるシルクファイバーを含む不織布、およびその製造方法を提供する。

Description

シルクファイバーを含む不織布、創傷被覆材、ｉＰＳ細胞足場材、血液適合材料用不織布、血液適合材料、シルクファイバーを含む不織布の製造方法、創傷被覆材の製造方法、ｉＰＳ細胞足場材の製造方法、血液適合材料用不織布の製造方法、及び血液適合材料の製造方法
　本発明の実施形態の一つは、シルクファイバーを含む不織布、創傷被覆材、ｉＰＳ細胞足場材、血液適合材料用不織布、血液適合材料、シルクファイバーを含む不織布の製造方法、創傷被覆材の製造方法、ｉＰＳ細胞足場材の製造方法、血液適合材料用不織布の製造方法、及び血液適合材料の製造方法に関する。
　特許文献１には、生繭、乾繭もしくは煮繭した繭の繭層もしくは繭糸を、あるいは生糸、絹織物又はそれらの残糸を精練に付して得られる未分解絹フィブロインを提供することが開示されている。
　そして、特許文献２には、特許文献１に示す方法により得られた絹フィブロインから製造されるフィブロイン成形体は、高い水溶性を示し、水との接触によって溶解もしくは強度の脆弱化を示す不都合が存在することが記載されている。
　さらに、特許文献２には、この不都合を克服するために、不溶化を目的とした処理(例えば、アルコールによる結晶化の誘起、あるいは熱処理による結晶化の誘起)が知られていることが記載されている。
　特許文献３には、絹フィブロイン溶解液からエレクトロスピニング法により管状構造物を形成し、さらにその管状構造物を絹フィブロインスポンジにてコーティングして、血液適合性が要求される人工血管に用いることが開示されている。
　特許文献４には、直径が１０ｎｍ～１００μｍの繊維糸で交絡してなり、多孔質構造を有し、嵩高が２００～２０００ｃｍ３／ｇであり、柔軟度が５０～５００ｍＮであることを特徴とする組織修復用繊維膜が開示されている。
　特許文献５には、シルクとポリオキシ酸との任意の組成比からなり、繊維径が１００ｎｍから１０００ｎｍであるシルク複合ナノファイバーからなる骨芽細胞等の細胞足場材が開示されている。
日本国特開２００１－１６３８９９号公報 日本国特開２０１７－１４９６７４号公報 日本国特開２０１０－１３７０４１号公報 日本国特許第６１４０２９５号公報 日本国特開２０１４－０１５７０２号公報
　しかしながら、特許文献２に記載されているようなアルコールによる不溶化処理を施した場合には、靭性の低下（脆さの誘因）を招く場合があり、耐水性及び靭性の観点でさらなる改善の余地があった。
　特許文献３に記載の絹フィブロイン溶解液からエレクトロスピニング法により管状構造物を形成し、さらにその管状構造物を絹フィブロインスポンジにてコーティングして人工血管に用いる場合に限らず、人工血管には耐水性及び靭性の観点でさらなる改善が求められている。
　人工血管のような血液適合材料において、血液の漏出の抑制、及び血液の付着を抑えることも求められている。
　特許文献４に記載の組織修復用繊維膜は、治癒効果に改善の余地がある。
　皮膚における傷口を覆う素材として創傷被覆材が知られているが、皮膚の傷口の血液や体液との接触を前提とする用途のために、創傷被覆材は、耐水性を備えることが必要であり、また損傷部位への貼付後の追従性、および皮膚の曲げ伸ばしなどの変形への耐久性を鑑みて、靭性が高いことが必要とされている。
　特許文献５に記載の骨芽細胞等に限らず、特に近年研究が盛んなｉＰＳ細胞が、増殖時に３次元組織構造をつくることが可能な足場材が求められている。
　また、ｉＰＳ細胞を培養する培養液は、一般的には水であることを鑑みて、ｉＰＳ細胞足場材は、耐水性を備えることが必要であり、また、足場材の加工、使用を鑑みて、取り扱い性が良好、言い換えれば、靭性が高いことが必要とされている。
　本発明の実施形態の一つは、上記を鑑みてなされたものであり、耐水性が高く、靭性が高い、シルクファイバーを含む不織布およびその製造方法を提供することを目的の一つとする。
　あるいは、本発明の実施形態の一つは、上記を鑑みてなされたものであり、耐水性が高く、靭性が高く、血液の漏出を抑制でき、かつ血液の付着を抑える血液適合材料用不織布、血液適合材料、血液適合材料用不織布の製造方法、および血液適合材料の製造方法を提供することを目的の一つとする。
　あるいは、本発明の実施形態の一つは、上記を鑑みてなされたものであり、耐水性が高く、靭性が高く、かつ治癒効果に優れた創傷被覆材およびその製造方法を提供することを目的の一つとする。
　あるいは、本発明の実施形態の一つは、上記を鑑みてなされたものであり、耐水性が高く、靭性が高く、かつｉＰＳ細胞が、増殖時に３次元組織構造をつくることが可能なｉＰＳ細胞足場材およびその製造方法を提供することを目的の一つとする。
　本発明者らが鋭意検討したところ、シルクファイバーを含む不織布において、赤外吸収スペクトルの１６５０ｃｍ－１付近に位置するピークの強度［ａｂｓ(１６５０)］と、１６２０ｃｍ－１付近に位置するピークの強度［ａｂｓ(１６２０)］の比である、ａｂｓ強度比［ａｂｓ(１６５０)／ａｂｓ(１６２０)］が０．６５より大きく、１．９０以下であるシルクファイバーを含む不織布は、耐水性が高く、靭性が高いことを見出した。
　本発明者らは、上記不織布により、耐水性が高く、靭性が高く、血液の漏出を抑制でき、かつ血液の付着を抑える血液適合材料用不織布が得られることを見出した。
　また、本発明者らは、上記不織布を用いることで、耐水性が高く、靭性が高く、かつ治癒効果の優れた創傷被覆材が得られることを見出した。
　更に、本発明者らは、上記不織布を用いることで、耐水性が高く、靭性が高く、かつｉＰＳ細胞が、増殖時に３次元組織構造をつくることが可能なｉＰＳ細胞足場材が得られることを見出した。
　本発明は、以下の態様を含むものである。
［１］
　赤外吸収スペクトルの１６５０ｃｍ－１付近に位置するピークの強度［ａｂｓ(１６５０)］と、１６２０ｃｍ－１付近に位置するピークの強度［ａｂｓ(１６２０)］の比である、ａｂｓ強度比［ａｂｓ(１６５０)／ａｂｓ(１６２０)］が０．６５より大きく、１．９０以下であるシルクファイバーを含む不織布。
［２］
　前記ａｂｓ強度比［ａｂｓ(１６５０)／ａｂｓ(１６２０)］が０．７０以上、１．００以下である、［１］に記載のシルクファイバーを含む不織布。
［３］
　前記不織布が、血液適合材料用不織布である、［１］又は［２］に記載のシルクファイバーを含む不織布。
［４］
　［３］に記載のシルクファイバーを含む不織布を含む血液適合材料。
［５］
　前記血液適合材料が人工血管、カテーテル、血液フィルタ、癒着防止材、ステント、細胞足場材料、人工臓器、血液保存容器、または、輸血用具である、［４］に記載の血液適合材料。
［６］
　前記不織布が、創傷被覆材である、［１］又は［２］に記載のシルクファイバーを含む不織布。
［７］
　前記不織布が、ｉＰＳ細胞足場材である、［１］又は［２］に記載のシルクファイバーを含む不織布。
［８］
　シルクフィブロインをフッ素系アルコールに溶解してシルクフィブロイン溶液を得て、上記溶液を用いて電界紡糸する、シルクファイバーを含む不織布の製造方法であって、
　前記シルクファイバーにおいて、赤外吸収スペクトルの１６５０ｃｍ－１付近に位置するピークの強度［ａｂｓ(１６５０)］と、１６２０ｃｍ－１付近に位置するピークの強度［ａｂｓ(１６２０)］の比である、ａｂｓ強度比［ａｂｓ(１６５０)／ａｂｓ(１６２０)］が０．６５より大きく、１．９０以下である、シルクファイバーを含む不織布の製造方法。
［９］
　前記フッ素系アルコールが１，１，１，３，３，３－ヘキサフルオロ－２－プロパノールを７０質量％以上含む溶媒である、［８］に記載のシルクファイバーを含む不織布の製造方法。
［１０］
　前記シルクフィブロイン溶液が、１，１，１，３，３，３－ヘキサフルオロ－２－プロパノールを７０質量％以上含む溶媒に、５８．６℃以上、１８０℃以下の溶解温度で、シルクフィブロインを溶解させることにより得られる、［８］又は［９］に記載のシルクファイバーを含む不織布の製造方法。
［１１］
　前記フッ素系アルコールが１，１，１，３，３，３－ヘキサフルオロ－２－プロパノールである、［８］～［１０］のいずれか１項に記載のシルクファイバーを含む不織布の製造方法。
［１２］
　電界紡糸によって得られたシルクファイバーを含む前記不織布を、さらにアルコールに接触させる工程を含む、［８］～［１１］のいずれか１項に記載のシルクファイバーを含む不織布の製造方法。
［１３］
　前記アルコールが、エタノールまたはその水溶液である、［１２］に記載のシルクファイバーを含む不織布の製造方法。
［１４］
　前記不織布が、創傷被覆材である、［８］～［１３］のいずれか１項に記載のシルクファイバーを含む不織布の製造方法。
［１５］
　前記不織布が、ｉＰＳ細胞足場材である、［８］～［１３］のいずれか１項に記載のシルクファイバーを含む不織布の製造方法。
［１６］
　前記不織布が、血液適合材料用不織布である、［８］～［１３］のいずれか１項に記載のシルクファイバーを含む不織布の製造方法。
［１７］
　［１６］に記載のシルクファイバーを含む不織布の製造方法を含む、血液適合材料の製造方法。
　本発明の一実施形態によれば、耐水性が高く、靭性が高い、シルクファイバーを含む不織布およびその製造方法を提供することができる。
　本発明の一実施形態によれば、耐水性が高く、靭性が高く、血液の漏出を抑制でき、かつ血液の付着を抑える血液適合材料用不織布、血液適合材料、血液適合材料用不織布の製造方法、および血液適合材料の製造方法を提供することができる。
　本発明の一実施形態によれば、耐水性が高く、靭性が高く、かつ治癒効果に優れた創傷被覆材およびその製造方法を提供することができる。
　本発明の一実施形態によれば、耐水性が高く、靭性が高く、かつｉＰＳ細胞が、増殖時に３次元組織構造をつくることが可能なｉＰＳ細胞足場材およびその製造方法を提供することができる。
ｉＰＳ細胞の培養試験において、継代１回目、２回目、３回目のそれぞれの培養後の顕微鏡観察を行って、実施例におけるｉＰＳ細胞増殖時の様子を示す当該顕微鏡観察写真である。 ｉＰＳ細胞の培養試験において、継代１回目、２回目、３回目のそれぞれの培養後の顕微鏡観察を行って、比較例におけるｉＰＳ細胞増殖時の様子を示す当該顕微鏡観察写真である。
　本発明の一実施形態のシルクファイバーを含む不織布は、赤外吸収スペクトルの１６５０ｃｍ－１付近に位置するピークの強度［ａｂｓ(１６５０)］と、１６２０ｃｍ－１付近に位置するピークの強度［ａｂｓ(１６２０)］の比である、ａｂｓ強度比［ａｂｓ(１６５０)／ａｂｓ(１６２０)］が０．６５より大きく、１．９０以下であるシルクファイバーを含む不織布である。
　上記ピークの強度［ａｂｓ(１６５０)］は、シルクファイバーのαヘリックス構造に由来するものであり、上記ピークの強度［ａｂｓ(１６２０)］は、シルクファイバーのβシート構造に由来するものである。
　なお、本明細書において、赤外吸収スペクトルの１６５０ｃｍ－１付近とは、１６５０ｃｍ－１を中心として、±１０ｃｍ－１の範囲を意味するものであり、赤外吸収スペクトルの１６５０ｃｍ－１付近に位置するピークとは、１６５０ｃｍ－１を中心として、±１０ｃｍ－１の範囲内における最大のピークを意味する。
　本明細書において、赤外吸収スペクトルの１６２０ｃｍ－１付近とは、１６２０ｃｍ－１を中心として、±１０ｃｍ－１の範囲を意味するものであり、赤外吸収スペクトルの１６２０ｃｍ－１付近に位置するピークとは、１６２０ｃｍ－１を中心として、±１０ｃｍ－１の範囲内における最大のピークを意味する。
　本発明の一実施形態のシルクファイバーを含む不織布は、不織布が含むシルクファイバーのａｂｓ強度比［ａｂｓ(１６５０)／ａｂｓ(１６２０)］が０．６５より大きく、１．９０以下であることにより、耐水性が高く、靭性が高いことを達成することができる。
　本発明の一実施形態の血液適合材料用不織布は、血液適合材料用不織布が含むシルクファイバーのａｂｓ強度比［ａｂｓ(１６５０)／ａｂｓ(１６２０)］が０．６５より大きく、１．９０以下であることにより、耐水性が高く、靭性が高く、血液の漏出を抑制でき、かつ血液の付着を抑えることを達成することができる。
　また、本発明の一実施形態の創傷被覆材は、ａｂｓ強度比［ａｂｓ(１６５０)／ａｂｓ(１６２０)］が０．６５より大きく、１．９０以下であるシルクファイバーを含む不織布を用いることにより、耐水性が高く、靭性が高く、かつ優れた治癒効果を達成することができる。
　更に、本発明の一実施形態のｉＰＳ細胞足場材は、ａｂｓ強度比［ａｂｓ(１６５０)／ａｂｓ(１６２０)］が０．６５より大きく、１．９０以下であるシルクファイバーを含む不織布を用いることにより、耐水性が高く、靭性が高く、かつｉＰＳ細胞が、増殖時に３次元組織構造をつくることが可能となる。
　詳細は明らかではないが、以下の通りと推測される。
　ａｂｓ強度比［ａｂｓ(１６５０)／ａｂｓ(１６２０)］を０．６５より大きくすることで、不織布の脆さを改善できると考えられる。ピークの強度［ａｂｓ(１６２０)］が大きいことによりβシート構造に基づく強靭性を担保しつつ、ピークの強度［ａｂｓ(１６５０)］が低くなりすぎないために、αヘリックス構造に起因して、靭性が高くなると考えられる。
　また、ａｂｓ強度比［ａｂｓ(１６５０)／ａｂｓ(１６２０)］を１．９０以下とすることで、高い耐水性が得られると考えられる。ピークの強度［ａｂｓ(１６２０)］が存在することによりβシート構造に基づく強靭性を担保しつつ、ピークの強度［ａｂｓ(１６５０)］が高くなりすぎないために、αヘリックス構造に起因する水への溶解を抑えることができ、水に対して形状保持がしやすくなり、耐水性が担保されているものと考えられる。
　さらに、シルクフィブロインは従来から生体親和性に優れている事が知られており、シルクファイバーを含む不織布である血液適合材料用不織布を用いることで、血液の漏出を抑制でき、かつ血液の付着を抑えることが考えられる。
　本発明の一実施形態の血液適合材料用不織布におけるシルクファイバーは、通常、シルクフィブロインより得られ、その大部分の２次構造がαヘリックスの螺旋構造ではなく、βシートの平面構造をとっているため、水に対して不溶性かつ強靭な素材となっており、血液適合材料として物理的な外的刺激から血液の漏出を保護しつつ、さらに、血液の付着を抑えたものと推測される。
　上述の通り、ａｂｓ強度比［ａｂｓ(１６５０)／ａｂｓ(１６２０)］を０．６５より大きくすることで、不織布の脆さを改善できると考えられる。ピークの強度［ａｂｓ(１６２０)］が大きいことによりβシート構造に基づく強靭性を担保しつつ、ピークの強度［ａｂｓ(１６５０)］が低くなりすぎないために、αヘリックス構造に起因する創傷被覆材としての水への馴染み性も担保することができ、靭性が高くなる、言い換えると不織布の形状維持が可能となると考えられる。
　また、ａｂｓ強度比［ａｂｓ(１６５０)／ａｂｓ(１６２０)］を１．９０以下とすることで、高い耐水性が得られると考えられる。ピークの強度［ａｂｓ(１６２０)］が存在することによりβシート構造に基づく強靭性を担保しつつ、ピークの強度［ａｂｓ(１６５０)］が高くなりすぎないために、αヘリックス構造に起因する創傷被覆材としての水への溶解を抑えることができ、水に対して形状保持がしやすくなり、耐水性が担保されているものと考えられる。
　さらに、創傷材として、シルクファイバーを含む不織布を用いることで、優れた治癒効果が得られることが考えられる。
　カイコ由来のシルクフィブロインは生体親和性に優れた素材といわれており、例えば外科手術用縫合糸（マニー株式会社製、商品名マニーシルク）にも使用されてきた。
　本発明の一実施形態の創傷被覆材におけるシルクファイバーは、通常、シルクフィブロインより得られ、本発明の一実施形態の不織布におけるシルクファイバーは、その大部分の２次構造がαヘリックスの螺旋構造ではなく、βシートの平面構造をとっているため、水に対して不溶性かつ強靭な素材となっており、創傷被覆材として物理的な外的刺激から傷口を保護しつつ、その治癒効果を高めたものと推測される。
　一般的に創傷治癒の過程は、止血期、炎症期、細胞増殖期、成熟期の各段階を経て、最終的に皮膚の上皮組織が再生されるが、創傷材として、シルクファイバーを含む不織布を用いることで、これらの治癒過程において、組織の再生（特に上皮層の再生）に寄与しているものと考えられる。
　ａｂｓ強度比［ａｂｓ(１６５０)／ａｂｓ(１６２０)］を０．６５より大きくすることで、不織布の脆さを改善でき、ｉＰＳ細胞足場材として使用できると考えられる。これは確かな理由は不明であるが、ピークの強度［ａｂｓ(１６２０)］が大きいことによりβシート構造に基づく強靭性を担保しつつ、ピークの強度［ａｂｓ(１６５０)］が低くなりすぎないために、αヘリックス構造に起因するｉＰＳ細胞足場材としての水への馴染み性も担保することができ、靭性が高くなる、言い換えると不織布の形状維持が可能となると考えられる。
　また、ａｂｓ強度比［ａｂｓ(１６５０)／ａｂｓ(１６２０)］を１．９０以下とすることで、高い耐水性が得られると考えられる。これは確かな理由は不明であるが、ピークの強度［ａｂｓ(１６２０)］が存在することによりβシート構造に基づく強靭性を担保しつつ、ピークの強度［ａｂｓ(１６５０)］が高くなりすぎないために、αヘリックス構造に起因するｉＰＳ細胞足場材としての水への溶解を抑えることができ、水に対して形状保持がしやすくなり、耐水性が担保されているものと考えられる。
　さらに、ｉＰＳ細胞足場材として、シルクファイバーを含む不織布を用いることで、ｉＰＳ細胞が、増殖時に３次元組織構造をつくることが可能となるものと考えられる。
　カイコ由来のシルクフィブロインは本質的に生体親和性に優れた素材といわれており、例えば外科手術用縫合糸（販売名マニーシルク、マニー株式会社）にも使用されてきた。
　本発明におけるシルクファイバーは、通常、シルクフィブロインより得られ、本発明の一実施形態の不織布におけるシルクファイバーは、その大部分の２次構造がαヘリックスの螺旋構造ではなく、βシートの平面構造をとっているため、水に対して不溶性かつ強靭な素材となっており、確かな理由は不明であるが、細胞培養時の培地に不溶な足場材として機能する事が可能となるものと推測される。
　ｉＰＳ細胞足場材として、シルクファイバーを含む不織布を用いることで、ｉＰＳ細胞に対して適度な生体親和性であるため、詳細は不明であるが、その細胞増殖の挙動が足場材に対して平面状ではなく、立体状（３次元）に進行したものと推測される。
　ａｂｓ強度比は、０．６５より大きく、１．９０以下であり、０．７０以上、１．００以下が好ましく、０．７０以上、０．８０以下がさらに好ましい。
　ａｂｓ強度比は、０．６５以下であると、靭性を担保することができない。一方で、ａｂｓ強度比は、１．９０より大きいと耐水性を担保することができない。
　ａｂｓ強度比を０．６５より大きく、１．９０以下に調整する方法は特に限定されないが、例えば、原料となるシルクフィブロインをフッ素系アルコールに溶解して、シルクフィブロイン溶液を得て、電界紡糸することにより、シルクファイバーを含む不織布を得ることが挙げられる。
　上記シルクファイバーを含む不織布（単に、「不織布」ともいう）は、血液適合材料用不織布であることが好ましい。
　上記不織布は、創傷被覆材であることが好ましい。
　上記不織布は、ｉＰＳ細胞足場材であることが好ましい。
　本発明の一実施形態のシルクファイバーを含む不織布、及びその製造方法、本発明の一実施形態の血液適合材料用不織布及びその製造方法、本発明の一実施形態の創傷被覆材及びその製造方法、並びに、本発明の一実施形態のｉＰＳ細胞足場材及びその製造方法において、原料として用いるシルクフィブロインは、蚕の繭玉、または生糸から夾雑物等を除いて、得ることができる。蚕の幼虫が吐き出す繭糸は、フィブロインのフィラメントとその周りを被覆している膠質のセリシンからなり、繭玉は、フィブロインのフィラメントをセリシンで接着し創製される。
　繭玉中のフィブロインの含有率は７０質量％以上、８０質量％以下で、セリシンの含有率が２０質量％以上、３０質量％以下、その他少量の脂肪分等の夾雑物が含まれる。なお、生糸は、繭玉を熱水に漬け解した後、繭から取り出した糸であり夾雑物を含む。
　本発明の一実施形態のシルクファイバーを含む不織布、及びその製造方法、本発明の一実施形態の血液適合材料用不織布及びその製造方法、本発明の一実施形態の創傷被覆材及びその製造方法、並びに、本発明の一実施形態のｉＰＳ細胞足場材及びその製造方法に用いるシルクフィブロインを産生する蚕種は特に制限されず、エリ蚕、柞蚕、天蚕等の野蚕、または家蚕を挙げることができる。
　本発明の一実施形態のシルクファイバーを含む不織布、及びその製造方法、本発明の一実施形態の血液適合材料用不織布及びその製造方法、本発明の一実施形態の創傷被覆材及びその製造方法、並びに、本発明の一実施形態のｉＰＳ細胞足場材及びその製造方法において、例えば、精練を経て得られたシルクフィブロインを用いることができる。精練は繭玉から上記夾雑物を除去する工程であり、例えば、繭玉または生糸を、石鹸液、灰汁またはソーダ液等のアルカリ性溶液に接触させることで、上記夾雑物を除去することができる。また、絹糸、絹織物、健康食品等として市販されているシルクフィブロインを使用してもよい。また、蚕の幼虫の絹糸腺から直接採取したシルクフィブロインを用いることもできる。
　本発明の一実施形態のシルクファイバーを含む不織布、及びその製造方法、本発明の一実施形態の血液適合材料用不織布及びその製造方法、本発明の一実施形態の創傷被覆材及びその製造方法、並びに、本発明の一実施形態のｉＰＳ細胞足場材及びその製造方法に用いる、シルクフィブロインの分子量（Ｍｗ）は特に制限されない。繭玉または生糸の精練で使用されるアルカリ溶液の種類および精練条件にもよるが、通常、シルクフィブロインのＭｗは５０，０００～３７０，０００である。なお、家蚕の絹糸腺から産生されるシルクフィブロインのＭｗの文献値は３７０，０００である（非特許文献　Tashiro Yutaka and Otsuki Eiichi, Journal of Cell Biology, Vol.46, P1(1970)、非特許文献Prog.Polym.Sci.2007；32(8－9):991－1007に記載）。
　前記フッ素系アルコール（含フッ素アルコールともいう）は、シルクフィブロインを溶解できるものであればよく、１，１，１，３，３，３－ヘキサフルオロ－２－プロパノール（ＨＦＩＰ）等の含フッ素アルコールを挙げることができる。
　前記フッ素系アルコールは、好ましくはＨＦＩＰである。また、前記含フッ素アルコールは単独で用いてもよく、混合して用いてもよい。さらに、前記含フッ素アルコールは他の溶剤を１種類または２種類以上混合して用いてもよい。他の溶剤としては、シルクフィブロインの変質および分子量の低下を起こすことなく溶解を妨げない溶剤であればよい。このような溶剤としては、Ｎ－メチルモルホリンＮ－オキシド、２，２，２－トリフルオロエタノール、メタノール、アセトン、テトラヒドロフラン、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド、トルエンまたはジクロロメタンを例示することができる。これら溶剤は、シルクフィブロイン溶液を得る際に、含フッ素アルコールの質量を１００とする相対比で表して、３０以下（好ましくは１０以下）の範囲内で用いることができる。
　好ましい一態様として、前記フッ素系アルコールが１，１，１，３，３，３－ヘキサフルオロ－２－プロパノールを７０質量％以上含む溶媒である。
　シルクフィブロイン溶液は、原料となるシルクフィブロインをフッ素系アルコールに溶解して得られるものである。
　シルクフィブロインをフッ素系アルコールに溶解させる際に用いる容器は、気密性および耐圧性を有する容器であれば特に制限はない。例えば、ガラス製やステンレス鋼製、またはこれらを樹脂でライニングした密閉耐圧容器を用いることができる。
　好ましい一態様として、前記シルクフィブロイン溶液は、１，１，１，３，３，３－ヘキサフルオロ－２－プロパノールを７０質量％以上含む溶媒にシルクフィブロインを溶解させることにより得られる。１，１，１，３，３，３－ヘキサフルオロ－２－プロパノールを７０質量％以上含む溶媒にシルクフィブロインを溶解させる際の溶解温度は、特に限定されないが、５８．６℃以上、１８０℃以下であることが好ましい。
　ＨＦＩＰの大気圧（１０１３．２５ ｈＰａ）での沸点である５８．６℃以上では、シルクフィブロインの溶解速度が遅くならず、不溶分の回収量が増加しないため好ましい。好ましくは、６０℃以上である。１８０℃以下では、シルクフィブロインの加水分解または変質による溶液の着色が生じ難いため好ましい。好ましくは１４０℃以下であり、特に好ましくは１２０℃以下である。
　好ましい一態様として、シルクフィブロインの１，１，１，３，３，３－ヘキサフルオロ－２－プロパノールを７０質量％以上含む溶媒への溶解時間は、０．５時間以上、２４時間以内である。溶解時間が０．５時間以上では、シルクフィブロインの溶解が十分となり、不溶分の回収量が増加し難いため好ましい。溶解時間が２４時間以下では、生産性が高く実用的であるため好ましい。また、シルクフィブロインが加水分解し分子量の低下を起こし難く、シルクフィブロインのＨＦＩＰ溶液が着色し難いため好ましい。好ましくは、１２時間以内であり、特に好ましくは６時間以内である。不要な加熱を避けるため溶解の進行を適宜確認し、溶解が完了した後は速やかに冷却し、溶解作業を終了することが好ましい。この際、溶解時間を短縮する目的で攪拌を行ってもよい。
　上記シルクフィブロイン溶液におけるシルクフィブロインの濃度は、シルクフィブロイン溶液全体に対して、０．０１質量％以上、５０質量％以下が好ましい。より好ましくは、０．１質量％以上、３０質量％以下であり、更に好ましくは、１質量％以上、１０質量％以下であり、特に好ましくは、１質量％以上、５質量％以下である。
　濃度が０．０１質量％以上であれば、得られるシルクファイバーを含む不織布の生産性を担保し易く、５０質量％以下であれば、溶液の粘度が高くなりすぎないため、成形し易い。
　濃度が０．０１質量％以上であれば、得られる血液適合材料用不織布の生産性を担保し易く、５０質量％以下であれば、溶液の粘度が高くなりすぎないため、成形し易い。
　濃度が０．０１質量％以上であれば、得られる創傷被覆材の生産性を担保し易く、５０質量％以下であれば、溶液の粘度が高くなりすぎないため、成型し易い。
　濃度が０．０１質量％以上であれば、得られるｉＰＳ細胞足場材の生産性を担保できるため好ましく、５０質量％以下であれば、シルクフィブロイン溶液の粘度が高くなりすぎず、成形し易いため好ましい。
　本発明の一実施形態のシルクフィブロイン溶液の製造方法は、窒素もしくはヘリウム等の不活性ガス雰囲気、および空気雰囲気のいずれでも行なうことができるが、不活性ガス雰囲気下で行うことが好ましい。空気雰囲気は、加水分解や溶液の着色を促進する原因となることがある。
　以下、シルクフィブロイン溶液の濃縮について記載する。
　希薄なシルクフィブロイン溶液を調製した後、溶液中のフッ素系アルコールの一部を留去することにより濃縮し、高濃度のシルクフィブロイン溶液を得ることができる。例えば、濃度１質量％のシルクフィブロインのＨＦＩＰ溶液を調製した後、エバポレータを用いて、濃度１０質量％以上のシルクフィブロインのＨＦＩＰ溶液を得ることができる。ＨＦＩＰの使用量は増えるが、溶解時間が短縮される効果を奏する。
　シルクフィブロイン溶液を用いて、シルクファイバーを含む不織布を得る方法としては、電界紡糸法を挙げることができる。
　電界紡糸法は、ノズル（ニードル）と電極（コレクタ）の間に、高い電圧を印加した状態で、高分子溶液を噴射し、紡糸する方法である。
　具体的には、高分子溶液をシリンジに入れ、シリンジ先端のニードルと、コレクタ間に１～１００ｋＶ程度の電圧をかけながら、高分子溶液をニードルからコレクタへ向けて噴射させる。この際、電圧がしきい値を超えると、電荷の反発力が高分子溶液の液滴の表面張力に打ち勝って、電荷を帯びた噴流が発生する。電場内で噴流が伸長しながら溶媒が蒸発し、細いファイバーを形成し、コレクタ上にファイバーが集積されることで不織布が得られる。なお、日本工業規格（ＪＩＳ）では、不織布とは、「繊維が一方向またはランダムに配向しており、交絡、融着、接着によって繊維間が結合されたもの」と定義されている（ＪＩＳ　Ｌ　０２２２：２００１）。
　電界紡糸を行う際の好適な印加電圧は、１ｋＶ以上、１００ｋＶ以下である。より好ましくは、５ｋＶ以上、５０ｋＶ以下である。特に好ましくは、１０ｋＶ以上、３０ｋＶ以下である。印加電圧が１ｋＶ以上であれば、ニードルからシルクフィブロインのＨＦＩＰ溶液を噴射した際に、電荷を帯びた噴流が発生し易く、液垂れが生じ難い。印加電圧が１００ｋＶ以下であれば、噴流の速度および形状を制御し易い。
　電界紡糸を行う際のニードルとコレクタ間の好適な距離（紡糸距離ともいう）は、５ｃｍ以上、５０ｃｍ以下である。より好ましくは、７．５ｃｍ以上、４０ｃｍ以下である。特に好ましくは、１０ｃｍ以上、３０ｃｍ以下である。ニードルとコレクタ間の距離が５ｃｍ以上であれば、溶媒が十分に蒸発し易く、液垂れが生じ難い。ニードルとコレクタ間の距離が５０ｃｍ以下であれば、噴流が発生し易い。
　コレクタの回転速度は特に限定されないが、好ましくは３０ｒｐｍ以上、５００ｒｐｍ以下、さらに好ましくは５０ｒｐｍ以上、１５０ｒｐｍ以下である。
　電界紡糸法における温度は、特に限定されないが、０℃以上、８０℃以下であることが好ましく、室温（２０～２５℃）近辺である１５℃以上、４０℃以下であることがさらに好ましい。
　また、電界紡糸法における湿度は、特に限定されないが、２０％以上、８０％以下であることが好ましく、２０％以上、６０％以下であることが更に好ましく、２０％以上、４０％以下であることが特に好ましい。また、上記のように、温度、湿度を適宜調節すると、前記ａｂｓ強度比［ａｂｓ(１６５０)／ａｂｓ(１６２０)］の値を、０．６５より大きく、１．９０以下に調整し易い。
　電界紡糸時の圧力については、電界紡糸装置内を加圧または減圧しシルクフィブロイン溶液中の溶剤の蒸発速度を調整する必要がない限りは、あえて加圧または減圧する必要性はなく、大気圧（海面上で１０１３．２５ｈＰａ）にて行うことが好ましい。また、電界紡糸装置に加減圧機構を設ける必要もなく、経済的である。
　本明細書において、電界紡糸を行う装置としては、株式会社メック製の不織布電界紡糸装置ＮＡＮＯＮ－０３を用いた。
　上記のように電界紡糸法により作製した、シルクファイバーを含む不織布は、アルコールに接触（例えば、浸漬）させて乾燥させることで、不溶化処理を行うことができる。これにより、不織布のおける上記βシート構造の割合を増やすことができ、前記ａｂｓ強度比［ａｂｓ(１６５０)／ａｂｓ(１６２０)］の値を、０．７以上、１．０以下の範囲に調整し易くなる。
　アルコールとしては、特に限定されないが、例えばメタノール、エタノール、ｎ－プロピルアルコール、イソプロパノール等の水溶性アルコールを挙げることができる。好ましくは、入手が容易で取り扱いが容易なエタノールである。
　なお、アルコールは、アルコール水溶液であってもよい。
　アルコールへの接触の方法は、不織布をアルコールに浸漬する方法、不織布をアルコールの蒸気に曝す方法、不織布にアルコールをスプレー塗布する方法など既知の接触方法が挙げられる。短時間で均一に不溶化処理する観点から不織布をアルコールに浸漬する方法が好ましい。
　アルコールへの接触時間は特に限定されないが、通常１０分以上、５時間以下が好ましく、１０分以上、３時間以下がより好ましく、１０分以上、１時間以下がさらに好ましい。
　アルコールへの接触温度は特に限定されないが、１０℃以上、５０℃以下が好ましく、１５℃以上、４０℃以下がさらに好ましい。また、上記のアルコールへの接触は加圧条件下で行ってもよい。
　加圧条件としては、特に限定されないが、大気圧（海面上で１０１３．２５ｈＰａ）以上、大気圧の２倍（２０２６．５ｈＰａ）以下が好ましい。
　前記乾燥は、不溶化処理された不織布が乾燥すれば、特に限定されないが、例えば、恒温乾燥、熱風乾燥等を挙げることができる。
　アルコール接触前の不織布の前記ａｂｓ強度比［ａｂｓ(１６５０)／ａｂｓ(１６２０)］が１．９以下であると、アルコール接触後の不織布の前記ａｂｓ強度比［ａｂｓ(１６５０)／ａｂｓ(１６２０)］が０．６５以下になり脆くなる。不織布を作製する前の電界紡糸時の湿度を５０％以上、７０％以下にすることで得られる不織布の前記ａｂｓ強度比［ａｂｓ(１６５０)／ａｂｓ(１６２０)］を１．９０以上とすることができ、そのアルコール接触により、アルコール接触後の不織布の前記ａｂｓ強度比［ａｂｓ(１６５０)／ａｂｓ(１６２０)］を０．７０以上、０．８０以下にすることができる（本明細書の［実施例］参照）。
　前記不織布は、シルクファイバーを含むものであるが、シルクファイバーのみから構成されている不織布（シルクファイバー不織布）でもよい。
　シルクファイバーを含む不織布は、原料となるシルクフィブロイン溶液の量および濃度を適宜調整することで、所望の厚みに制御することができる。電界紡糸法から得られるシルクファイバーを含む不織布の場合、厚みの制御が容易なことから、１μｍ以上、２５０μｍ未満であることが好ましい。更に好ましくは、１μｍ以上、２００μｍ以下であり、より好ましくは、５μｍ以上、１５０μｍ以下である。特に好ましくは、１０μｍ以上、１００μｍ以下である。また電界紡糸法から得られるシルクファイバーを含む不織布は、用途に応じて、得られた不織布の片側又は両側に、さらに不織布を保持するための支持体を接合させてもよく、その支持体の素材は特に限定されない。
　不織布を構成するシルクファイバー（繊維）の好適な繊維径（太さ）（円断面であれば直径）は、１０ｎｍ以上、１０μｍ以下である。より好ましくは、２０ｎｍ以上、５μｍ以下である。繊維径は、特に好ましくは、３０ｎｍ以上、１μｍ以下である。繊維径が１０ｎｍ以上、１０μｍ以下の繊維は、電界紡糸法で得られ易い。
　上記不織布は、血液適合材料用不織布であることが好ましい。
　本発明は、シルクファイバーを含む血液適合材料用不織布を含む血液適合材料にも関する。
　血液適合材料は、血液に接触させて用いる材料である。
　前記血液適合材料としては、特に限定されないが、人工血管、カテーテル、血液フィルタ、癒着防止材、ステント、細胞足場材料、人工臓器、血液保存容器、輸血用具などが挙げられる。本発明の一実施形態のシルクファイバーを含む不織布は、常に血液と接触する人工血管に、特に好適に用いることができる。これらの血液適合材料は、シルクファイバーを少なくとも一部に含み、その他の構成部材を含んでもよい。例えば、これらの血液適合材料は、シルクファイバーを含む血液適合材料用不織布が基材（例えば、合成高分子や生体高分子を含むポリマー部材、あるいは、金属部材）にコーティングされた複層体であってもよい。
　上記不織布は、創傷被覆材であることが好ましい。
　上記不織布は、ｉＰＳ細胞足場材であることが好ましい。
　ｉＰＳ細胞は、人工多能性幹細胞（induced pluripotent stem cell）を表し、多能性幹細胞である。
　「幹細胞」とは、自己複製能と分化能を有する細胞をいう。幹細胞のうち、自己複製能を有し、かつ、１つの細胞から、内胚葉、中胚葉、外胚葉の全ての細胞へ分化できるものを「多能性幹細胞」という。
　上述の通り、本発明の一実施形態のシルクファイバーを含む不織布の製造方法について説明したが、本発明の好ましい実施形態にかかるシルクファイバーを含む不織布の製造方法は、以下の通りである。
　シルクフィブロインをフッ素系アルコールに溶解してシルクフィブロイン溶液を得て、前記溶液を用いて電界紡糸する、シルクファイバーを含む不織布の製造方法であって、
　前記シルクファイバーにおいて、赤外吸収スペクトルの１６５０ｃｍ－１付近に位置するピークの強度［ａｂｓ(１６５０)］と、１６２０ｃｍ－１付近に位置するピークの強度［ａｂｓ(１６２０)］の比である、ａｂｓ強度比［ａｂｓ(１６５０)／ａｂｓ(１６２０)］が０．６５より大きく、１．９０以下である、シルクファイバーを含む不織布の製造方法。
　シルクフィブロイン、フッ素系アルコール、シルクフィブロイン溶液、電界紡糸、及びａｂｓ強度比［ａｂｓ(１６５０)／ａｂｓ(１６２０)］等は、上述の通りである。
　前記フッ素系アルコールが１，１，１，３，３，３－ヘキサフルオロ－２－プロパノールを７０質量％以上含む溶媒であることが好ましい。
　前記シルクフィブロイン溶液が、１，１，１，３，３，３－ヘキサフルオロ－２－プロパノールを７０質量％以上含む溶媒に、５８．６℃以上、１８０℃以下の溶解温度で、シルクフィブロインを溶解させることにより得られることが好ましい。
　フッ素系アルコール、シルクフィブロイン溶液、１，１，１，３，３，３－ヘキサフルオロ－２－プロパノールを７０質量％以上含む溶媒等は、上述の通りである。
　前記フッ素系アルコールは１，１，１，３，３，３－ヘキサフルオロ－２－プロパノールであることが好ましい。
　電界紡糸によって得られたシルクファイバーを含む前記不織布を、さらにアルコールに接触する工程を含むことが好ましい。アルコールに接触する工程は、上述の通りである。
　前記アルコールが、エタノールまたはその水溶液であることが好ましい。
　前記不織布が、創傷被覆材であることが好ましい。
　前記不織布が、ｉＰＳ細胞足場材であることが好ましい。
　前記不織布が、血液適合材料用不織布（シルクファイバーを含む血液適合材料用不織布）であることが好ましい。
　また、本発明の一実施形態は、前記シルクファイバーを含む血液適合材料用不織布の製造方法を含む、血液適合材料の製造方法にも関する。
　以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明はその要旨を超えない限り、以下の実施例に限定されるものではない。
　本発明の一実施形態におけるｉＰＳ細胞の培養方法は、プラスチック製シャーレに培養培地（液体）と足場材を準備した上で、その足場材に対してｉＰＳ細胞を接着させて培養する公知の培養方法を用いた。細胞培養後のｉＰＳ細胞は、フローサイトメトリー法、ならびにＲｅａｌ－ｔｉｍｅ　ＰＣＲにて、それぞれ公知の方法に準じてその未分化能を評価した。本発明の実施例に培養方法の一例を記載する。
［シルクファイバーを含む不織布の作製］
　シルクフィブロインＨＦＩＰ溶液の作製
　温度計および撹拌子を備えた１００ｍＬのステンレス鋼製耐圧容器内に、２５℃でシルクフィブロインを０．２ｇ、ＨＦＩＰを１９．８ｇ量り入れた。次いで、耐圧容器内部を１１０℃まで昇温後、２時間攪拌してシルクフィブロインを溶解させることにより、シルクフィブロインの濃度が１質量％のＨＦＩＰ溶液を得た。得られたシルクフィブロインＨＦＩＰ溶液から、エバポレータを用いて１０．０ｇのＨＦＩＰを減圧留去することで、濃度２質量％のシルクフィブロインＨＦＩＰ溶液１０．０ｇを得た。
　［実施例１］
　電界紡糸による紡糸
　株式会社メック製の不織布電界紡糸装置ＮＡＮＯＮ－０３を用いて、上記で得られたシルクフィブロインＨＦＩＰ溶液から紡糸を行った。ノズルの内径は０．４ｍｍ、印可電圧２５ｋＶ、紡糸距離は２０ｃｍに設定した。紡糸装置の温度２３～２４℃、湿度は２０～３０％を維持した。また、コレクタにはドラムロールコレクタを用いて、コレクタ電極上には模造紙を用いた。ドラムコレクタの回転速度は１００ｒｐｍとした。得られた不織布は、厚さ２０～５０μｍ、繊維径１００～７００ｎｍであった。
　［比較例１］
　電界紡糸による紡糸
　紡糸装置の温度２６～２７℃、湿度は５０～６０％を維持した以外は実施例１と同様に紡糸を行った。得られた不織布は、厚さ２０～５０μｍ、繊維径１００～７００ｎｍであった。
　［実施例２］
　比較例１と同様の条件にて作製した不織布を２３℃でエタノールに２０分浸漬させて、乾燥させることで不溶化処理された不織布を得た。
　［実施例３］
　比較例１と同様の条件にて作製した不織布を２３℃でエタノールに１時間浸漬させて、乾燥させることで不溶化処理された不織布を得た。
　［実施例４］
　比較例１と同様の条件にて作製した不織布を２３℃でエタノールに３時間浸漬させて、乾燥させることで不溶化処理された不織布を得た。
　［比較例２］
　実施例１と同様の条件にて作製した不織布を２３℃でエタノールと水の混合液（質量比でエタノール：水＝８０：２０）に１時間浸漬させて、乾燥させることで不溶化処理された不織布を得た。
　［実施例５］
　温度計および撹拌子を備えた１００ｍＬのステンレス鋼製耐圧容器内に、２５℃でシルクフィブロインを０．２ｇ、ＨＦＩＰを１９．８ｇ量り入れた。２時間攪拌してシルクフィブロインを溶解させることにより、シルクフィブロインの濃度が１質量％のＨＦＩＰ溶液を得た。得られたシルクフィブロインＨＦＩＰ溶液から、エバポレータを用いて１５．０ｇのＨＦＩＰを減圧留去することで、濃度４質量％のシルクフィブロインＨＦＩＰ溶液５．０ｇを得た。
　このシルクフィブロインＨＦＩＰ溶液を用いたこと以外は、実施例１と同様の条件にて紡糸を行った。得られた不織布は、厚さ２０～５０μｍ、繊維径１００～７００ｎｍであった。
　＜シルクファイバー不織布の膜厚測定＞
　シルクファイバー不織布の膜厚の測定には株式会社ミツトヨ製マイクロメータ、製品名：ＭＤＣ－２５ＭＸを用いた。測定は不織布の中心を含む、任意の３点を測定し、その平均値を膜厚とした。
　＜シルクファイバーの高次構造評価＞
　得られたシルクファイバー不織布のＩＲスペクトル測定で、αヘリックスに由来する１６５０ｃｍ－１付近のピーク強度（ａｂｓ）およびβシート構造に由来する１６２０ｃｍ－１付近のピーク強度（ａｂｓ）より、ａｂｓ強度比［ａｂｓ(１６５０)／ａｂｓ(１６２０)］を算出した。
　ＩＲスペクトル測定には、サーモフィッシャーサイエンティフィック社製、製品名：ＮｉｃｏｌｅｔｉＳ５を用いた。
　なお、各高次構造に由来するピークの波数については、非特許文献　Taiyo Yoshioka, Tamako Hata, Katsura Kojima, Yasumoto Nakazawa, and Tsunenori Kameda, Biomater. Sci. Eng.,Vol.3, P3207-3214(2017)に記載されている。
　＜シルクファイバー不織布の耐水性評価＞
　上記実施例、比較例にて得られたシルクファイバー不織布を、室温（約２５℃）で水に浸漬させた際の状態を目視観察し、以下の基準で耐水性を評価した。
　Ａ：外観に変化なし（溶解しない）
　Ｂ：部分的に溶解する
　Ｃ：完全に溶解する
　表１に作製した不織布のａｂｓ強度比［ａｂｓ(１６５０)／ａｂｓ(１６２０)］の値、および耐水性評価結果を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　表１に示すように、ａｂｓ強度比［ａｂｓ(１６５０)／ａｂｓ(１６２０)］が２．１５である比較例１では、不織布が完全に溶解し、耐水性に劣る結果となった。一方、ａｂｓ強度比［ａｂｓ(１６５０)／ａｂｓ(１６２０)］が１．８１である実施例１、１．６９である実施例５では溶解は部分的なものにとどまり、水に対して不織布が形状保持しやすい傾向であった。さらに、ａｂｓ強度比［ａｂｓ(１６５０)／ａｂｓ(１６２０)］が１．００以下である実施例２～４では溶解は確認されず、水に対して不織布が形状保持できる。
　また、ａｂｓ強度比［ａｂｓ(１６５０)／ａｂｓ(１６２０)］が０．６５である比較例２では、不織布作製時や取り扱い時に壊れてしまい、耐水性を評価することができなかった。一方、ａｂｓ強度比［ａｂｓ(１６５０)／ａｂｓ(１６２０)］が０．６５より大きい実施例１～５、比較例１では、不織布に脆さはなく、破損することはなかった。
　上記実施例１～５、比較例１、２で作製したシルクファイバー不織布をそれぞれ、血液適合材料用不織布として用いた。
　シルクファイバー不織布の耐水性の評価は、表１に示す通りである。
［シルクファイバーを含む血液適合材料用不織布の耐圧試験］
　上記実施例３で作製したシルクファイバー不織布を血液適合材料用不織布として用いた。
　上記実施例３で作製したシルクファイバー不織布を用いて、人工血管等の血液適合材料に要求される当該不織布の耐圧試験を行った。なお耐圧試験においては、ポリエステルファイバー不織布についても同様に試験を行った。ポリエステルファイバー不織布は、ユニチカ株式会社製、ポリエチレンテレフタラート、型番ＮＥＨ－２０７０を原料にして、シルクファイバー不織布と同様にＨＦＩＰを用いて溶解させて溶液にした後、電解紡糸法によって作製した不織布である。
　プラスチック製ディスポーザブルシリンジ（内容積１０ｍｌ）を用意し、シリンジの出口側にプラスチック製フィルターホルダー（フィルター内径１３ｍｍ）を接続した。上記実施例３で作製したシルクファイバー不織布、およびポリエステルファイバー不織布を、ハサミを用いて直径１３ｍｍの円形のサイズに切り抜いた後、各不織布をシリンジのフィルターホルダーに挟み込んだ。シリンジ内部に血液（牛保存血液、株式会社日本バイオテスト研究所製）を５ｍｌ封入し、シリンジのプランジャーから１００ｍｍＨｇ、２００ｍｍＨｇ、３００ｍｍＨｇ、４００ｍｍＨｇ、または５００ｍｍＨｇの圧力を加えて、不織布からの血液の漏れ具合を評価した。なお本試験において、不織布に何も圧力を加えてない場合の圧力は０ｍｍＨｇとなる。
　それぞれの不織布の耐圧評価の結果を表２に示す。
［不織布の耐圧性評価］
　Ａ：不織布から血液の漏れは生じなかった。
　Ｂ：不織布から血液の漏れが生じた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　表２に示すように、シルクナノファイバー不織布は０ｍｍＨｇから５００ｍｍＨｇの範囲内において、血液の漏れは生じなかった。ポリエステルファイバー不織布は０ｍｍＨｇから２００ｍｍＨｇの範囲内において、血液の漏れは生じなかったが、３００ｍｍＨｇ、４００ｍｍＨｇ、および５００ｍｍＨｇの各圧力では血液の漏れが生じた。シルクナノファイバー不織布は、各圧力での血液の漏れがなく、血液適合材料用不織布として好ましい耐圧特性を有している。
［シルクファイバーを含む血液適合材料用不織布の血液付着試験］
　上記実施例３で作製したシルクファイバー不織布を用いて、人工血管等の血液適合材料に要求される当該不織布の血液付着性を試験した。シルクファイバー不織布、およびポリエステルファイバー不織布を、ハサミを用いて２ｃｍ×２ｃｍの正方形に切り取った後、各不織布の全面に血液（牛保存血液、株式会社日本バイオテスト研究所製）を接触させた。その後、蒸留水で各不織布の全面をよく洗い流した。各不織布の外観を目視、および光学顕微鏡にて観察して、各不織布に対する血液付着性を評価した。
　それぞれの不織布の血液付着試験の結果を表３に示す。
［不織布の血液付着性評価］
Ａ：不織布に血液の付着は認められなかった。
Ｂ：不織布の全面に血液の付着が認められた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　表３に示すように、シルクナノファイバー不織布には血液の付着が認められなかった。しかしながらポリエステルファイバー不織布には血液の付着が認められた。シルクナノファイバー不織布は、血液適合材料用不織布として血液が付着しづらい性状を有しており、好ましい。
　上記実施例１～５、比較例１、２で作製したシルクファイバー不織布をそれぞれ、創傷被覆材として用いた。
　創傷被覆材の耐水性の評価は、表１に示す通りである。
［創傷被覆材の治癒効果評価試験］
　上記実施例３で作製したシルクファイバー不織布を創傷被覆材として用いた。
上記創傷被覆材にて、実験動物にラット(Slc:Wistar、オス、供給元：日本エルエスシー)を用いて試験を行った。試験開始時のラットは、体重142～154g、週齢8週のラットを16匹用いた。実験ラットを、創傷被覆材を用いない陰性対照群(CT)、キチン製創傷被覆材（ニプロ株式会社製、商品名べスキチンＷ）を用いたキチン群(CH)、ポリエステル製創傷被覆材（ユニチカ株式会社製、ポリエチレンテレフタラート、型番ＮＥＨ－２０７０）を用いたポリエステル群(E)、上記実施例３で作製したシルクファイバー不織布を用いた絹群(Si)の4群に分けて、各郡の実験動物を4匹とした。
　実験動物にイソフルランにて麻酔をかけ、剃毛した。皮抜きポンチを用いて直径15mmの全層欠損創を作製した。E群およびSi群の創傷被覆材については、生理食塩水で濡らし創傷部位に密着させた。CH群は製品添付文書に従い、被覆材を創傷部位に添付した。被覆材の添付後、被覆材の上からガーゼを添付し、サージカルテープで固定後、ガーゼを覆うようにネット包帯を胴体に装着させた。CT群では生理食塩液で湿らせたガーゼを直接創傷部位に貼付し、サージカルテープで固定後、ガーゼを覆うようにネット包帯を胴体に装着させた。モデル動物作製後の全ラットについてエリザベスカラーをモデル動物作製日に装着した。モデル動物作製日以降は2～4日に1回の頻度でエリザベスカラーを交換した。
　４日後および７日後では被覆材、ガーゼおよびネット包帯を交換したが、被覆材やガーゼが創傷部位から剥がれない場合は生理食塩液で濡らしてから剥がした。濡らしても剥がれない場合は無理に剥がさず、上に貼付するガーゼあるいはネット包帯のみ交換した。
　モデル動物作製後の全ラットについて、モデル動物作製日（開始時）、４日後、７日後、及び１４日後に創傷部位の写真撮影、面積測定を実施した。ラットをイソフルランの吸入麻酔にて麻酔した。
　麻酔下にて、被覆材、ガーゼおよびネット包帯を剥がし、創傷部位をデジタルカメラで撮影した。
　ラットをイソフルランの吸入麻酔にて麻酔した。麻酔下にて、被覆材、ガーゼおよびネット包帯を剥がし、トレーシングペーパーへ創傷部位の形状を転写した。被覆材やガーゼが創傷部位から剥がれない場合は生理食塩液で濡らしてから剥がした。濡らしても剥がれない場合は無理に剥がさず、被覆材あるいはガーゼ越しに創傷部位の形状を転写した。イメージスキャナーを用いてトレーシングペーパーの情報をコンピューターへ入力した。Image J software (US National Institutes of Health)を用いて面積を測定した。
　損傷部位面積、および損傷部位面積の割合（％）を表４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　１４日後に、創傷部組織断面の顕微鏡観察を行って、皮膚上皮組織の回復具合を確認した。
　創傷被覆材の創傷部面積評価、創傷部組織断面評価は、以下のように行い、治癒効果を評価した。評価結果を表５に示す。
［創傷部面積評価］
　Ａ：創傷部の面積が早期に小さくなり（４日後参照）、１４日後に創傷部の面積が小さくなる。
　Ｂ：１４日後に創傷部の面積が小さくなる。
　Ｃ：１４日後に創傷部の面積が比較的小さくなる。
　Ｄ：１４日後に創傷部の面積が比較的大きい。
［創傷部組織断面評価］
Ａ：上皮層が均一に再生されている。
Ｂ：上皮層が部分的に再生されている。
Ｃ：上皮層の再生がほとんど認められない。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　表４に記載されるように、４日後までの早期において創傷部位面積（平均）で絹群（Ｓｉ群）は、最も面積が小さくなっていた。
　表４、表５に示すように、絹（Ｓｉ）群では、創傷部位面積（平均）が小さくなるとともに、創傷部組織の断面観察において、他の群に比べて、上皮層の再生に優れており、組織が綺麗に再生されていた。
　以上により、絹群（Ｓｉ）では、他群と比較して、治癒効果に優れていることが分かる。
　上記実施例１～５、比較例１、２で作製したシルクファイバー不織布をそれぞれ、ｉＰＳ細胞足場材として用いた。
　ｉＰＳ細胞足場材の耐水性の評価は、表１に示す通りである。
［ｉＰＳ細胞の培養試験］
　以下、iPS細胞の培養試験を詳述するが、本発明はこれに限定されるものではない。
ヒトiPS細胞はタカラバイオ株式会社製、Cellartis human iPS cell line P11025（European/North African、男性、33.4歳）を用いた。培養培地にはタカラバイオ株式会社製、Cellartis DEF-CS 100 Culture SystemのDEF-CS 100 Basal Mediumを用いた。培養基質（細胞足場）には、上記実施例３で作製したシルクファイバー不織布を、又はコントロール（比較例）としてDEF-CS COAT-1（タカラバイオ株式会社製、非シルクファイバー）を、それぞれ、ポリスチレンシャーレ（TPP社製、平底細胞培養プレート）に塗布した培養基質（細胞足場）をそれぞれ使用した。また細胞培養と継代に用いた細胞剥離液はCTSTM TrypLETM Select Enzyme (Thermo Fisher Scientific製, Cat. No. A1285901)、細胞洗浄液D-PBS (-)（Wako製, Cat. No. 045-29795, Lot. No. APG7057）、細胞保存液はSTEM-CELLBANKER（Zenoaq製, Cat. No. CB045）を使用した。
　シルクファイバー不織布、およびDEF-CS COAT-1コートのそれぞれ足場に対して、iPS細胞をコンフルエントになるまで培養し、倒立顕微鏡でiPS細胞を観察した（これを継代１回目と記載する）。さらに新たに準備したシルクファイバー不織布、およびDEF-CS COAT-1コートにiPS細胞を継代し、培養を繰り返した。最終的に継代3回目を終えたところで、iPS細胞の未分化を確認するため、フローサイトメトリー法、Real-time PCR法の２種類を実施した。
１.　　細胞培養
１－１ 細胞の凍結融解
1).    DEF-CS COAT-1をD-PBS (+/+) で20倍希釈し、0.1 mL/cm2となるように培養容器に入れる。
2).    37°Cで2時間以上インキュベートする。
3).    DEF-CS GF3を1,000倍希釈になるように加えた培養培地を必要量用意する。
4).    15 mLチューブに必要量の培養培地 (GF3+)を入れる。
5).    標的細胞を液体窒素から取り出し、37°Cのウォーターバスで融解させる。
6).    4)で準備したチューブに融解した細胞を移す。凍結チューブに培養培地 1 mLを加えて、チューブに追加する。
7).    室温（25℃）、300 × gで、1分間遠心する。
8).    遠心後の細胞から培地を吸引除去した後、培養培地(GF3+) 1 mLを加えてピペッティングする。
9).    2)でコートしたプレートからDEF-CS COAT-1を除去し、必要量の培養培地 (GF3+)を入れる。
10).   9)のプレートに、約3.0 x 10５ cells/cm2で細胞を播種する。
11).   5% CO2存在下、37°Cで培養する。
12).   翌日、培養培地で培地交換し、その後は隔日で培地交換する。
１－２ 継代培養
　＜コントロール＞（比較例）
1).    DEF-CS COAT-1をD-PBS (+/+) で20倍希釈し、0.1 mL/cm2となるように培養容器に入れる。
2).    37°Cで2時間以上インキュベートする。
3).    70-80% コンフルエントの細胞をD-PBS (-) 1 mL/wellで洗浄する。
4).    D-PBS (-) をアスピレートし、TrypLETM Selectを20 μL/cm2になるよう76 μL/well入れて37°Cで5分間静置し、細胞間の接着を解離させる。
5).    培養培地(GF3+) 500 μL/wellを加えて、ピペッティングでシングルセル化させる。
6).    室温（25℃）、200 × gで4分間遠心する。
7).    上清をアスピレートし、培養培地(GF3+) 500 μL/wellで細胞ペレットを懸濁する。
8).    細胞数をカウントする。
9).    2)でコーティングした細胞容器からDEF-CS COAT-1をアスピレートし、培養培地(GF3+)を0.17 mL/cm2となるように入れる。
10).   9)のプレートに、約0.6～1.4 x 10５ cells/cm2となるように、細胞を播種する。
11).   37°CのCO2インキュベータ中で培養する。
12).   翌日培養培地で培地交換し、それ以降は2日毎に培地交換する。細胞数が増えて培地交換の翌日に培地が黄色くなり始めたら、毎日培地交換する。
　＜シルクファイバー不織布使用＞（実施例）
1).    シルクファイバー不織布をそれぞれ直径約2.1 cmの円形に切り取る。
2).    円形のシルクファイバー不織布を70%エタノール中に浸して滅菌する。
3).    シルクファイバー不織布を風乾させた後、D-PBS(-)で数回洗浄する。
4).    シルクファイバー不織布を12穴プレートのwellに入れる。
5).    培養培地(GF3+)を加える。
6).    37°Cで2時間以上インキュベートする。
7).    70-80% コンフルエントの細胞をD-PBS (-) 1 mL/wellで洗浄する。
8).    D-PBS (-) をアスピレートし、TrypLETM Selectを20 μL/cm2になるよう76 μL/well入れて37°Cで5分間静置し、細胞間の接着を解離させる。
9).    培養培地(GF3+) 500 μL/wellを加えて、ピペッティングでシングルセル化させる。
10).   室温（25℃）、200 × gで4分間遠心する。
11).   上清をアスピレートし、培養培地(GF3+) 500 μL/wellで細胞ペレットを懸濁する。
12).   細胞数をカウントする。
13).   5)のプレートに、約2.4～8.3 x 104 cells/cm2となるように、細胞を播種する。
14).   37°CのCO2インキュベータ中で培養する。
15).   翌日培養培地で培地交換し、それ以降は2日毎に培地交換する。細胞数が増えて培地交換の翌日に培地が黄色くなり始めたら、毎日培地交換する。
［ｉＰＳ細胞の培養試験結果］
　継代１回目、２回目、３回目のそれぞれの培養後の顕微鏡観察を行って、実施例と比較例におけるｉＰＳ細胞増殖時の様子を比較した。当該顕微鏡観察写真を図１および図２に示す。
　シルクファイバー不織布を足場材として用いた実施例では、培養後の顕微鏡写真中に黒い斑点のような塊が確認された。これは、ｉＰＳ細胞が塊を作りながら、上方向に（３次元的に）丸まりながら増殖していることを示唆している。
　一方、シルクファイバー不織布を用いずに、DEF-CS COAT-1を足場材として用いた比較例では、上述のような塊が認められず、ｉＰＳ細胞が３次元的ではなく２次元的に平面上に広がりながら増えていることを示唆している。
　今回の培養条件において、通常予見されるｉＰＳ細胞の成長過程は足場材に対して平面的な成長であり、３次元的な成長となると技術的な難易度が高いものである。
　また、細胞培養の結果を下表に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　上記表は、最初にｉＰＳ細胞を播種して、そのｉＰＳ細胞が培養後にどのくらい増殖したかを示す総細胞数、総細胞の中で死細胞を除いた、生きているｉＰＳ細胞の割合を示す生存率等を記載したものである。
　上記表より、今回のｉＰＳ細胞は、シルクファイバー不織布足場上でもコントロールのCOAT-1足場と同じように、しっかり細胞総数は増えており、さらに死細胞の割合も高くなかったことがわかる。
　ｉＰＳ細胞培養は、細胞数を増やす点も確認しつつ、かつ未分化能も保持している点も確認する必要がある。
　シルクファイバー不織布にて培養したｉＰＳ細胞の未分化を確認するため、フローサイトメトリーにて未分化マーカーであるSSEA-4とTRA-1-60の発現について、それぞれ試験を行った。
　具体的には、ｉＰＳ細胞の未分化能を評価するため、フローサイトメーター（ＢＤバイオサイエンス製、ＦＡＣＳ　Ａｒｉａ）で解析した。評価結果を以下に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　その結果、シルクファイバー上で培養したｉＰＳ細胞はｉＰＳ細胞表面の未分化マーカーであるＳＳＥＡ－４とＴＲＡ－１－６０がいずれもコントロール試験と同程度の陽性を示している事が確認され、未分化能を維持している事が分かった。
　また、シルクファイバー不織布にて培養したｉＰＳ細胞の未分化を確認するため、Real -Time-PCRによるOct3/4とNanogの発現について、それぞれ試験を行った。
　具体的には、ｉＰＳ細胞の未分化能を評価するため、Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ　ＰＣＲ（サーモフィッシャーサイエンティフィック製、ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓリアルタイムＰＣＲシステム）を用いて、未分化マーカーであるＯｃｔ３／４とＮＡＮＯＧの発現量を評価した。評価結果を以下に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　その結果、シルクファイバー不織布上で培養したｉＰＳ細胞は、コントロール試験と同程度の発現量を示している事が確認され、未分化能を維持している事が分かった。
　具体的には、シルクファイバー不織布とコントロールにて培養したｉＰＳ細胞の総RNA数を、揃えて遺伝子解析した結果、Ｏｃｔ３／４については、コントロールの発現量割合が高く、Ｏｃｔ３／４では同程度であり、未分化を維持していることが分かった。
　本発明の一実施形態によれば、耐水性が高く、靭性が高い、シルクファイバーを含む不織布およびその製造方法を提供することができる。
　本発明の一実施形態によれば、耐水性が高く、靭性が高く、血液の漏出を抑制でき、かつ血液の付着を抑える血液適合材料用不織布、血液適合材料、血液適合材料用不織布の製造方法、および血液適合材料の製造方法を提供することができる。
　本発明の一実施形態によれば、耐水性が高く、靭性が高く、かつ治癒効果に優れた創傷被覆材およびその製造方法を提供することができる。
　本発明の一実施形態によれば、耐水性が高く、靭性が高く、かつｉＰＳ細胞が、増殖時に３次元組織構造をつくることが可能なｉＰＳ細胞足場材およびその製造方法を提供することができる。
　本発明を詳細にまた特定の実施態様を参照して説明したが、本発明の精神と範囲を逸脱することなく様々な変更や修正を加えることができることは当業者にとって明らかである。
　なお、本出願は、２０１９年９月６日出願の日本特許出願（特願２０１９－１６３１７０）、２０１９年９月６日出願の日本特許出願（特願２０１９－１６３１７２）、２０１９年１０月８日出願の日本特許出願（特願２０１９－１８５４６１）、及び２０１９年１０月８日出願の日本特許出願（特願２０１９－１８５４６２）に基づくものであり、その内容はここに参照として取り込まれる。
 
 

Claims (17)

  1. 　赤外吸収スペクトルの１６５０ｃｍ－１付近に位置するピークの強度［ａｂｓ(１６５０)］と、１６２０ｃｍ－１付近に位置するピークの強度［ａｂｓ(１６２０)］の比である、ａｂｓ強度比［ａｂｓ(１６５０)／ａｂｓ(１６２０)］が０．６５より大きく、１．９０以下であるシルクファイバーを含む不織布。
  2. 　前記ａｂｓ強度比［ａｂｓ(１６５０)／ａｂｓ(１６２０)］が０．７０以上、１．００以下である、請求項１に記載のシルクファイバーを含む不織布。
  3. 　前記不織布が、血液適合材料用不織布である、請求項１又は２に記載のシルクファイバーを含む不織布。
  4. 　請求項３に記載のシルクファイバーを含む不織布を含む血液適合材料。
  5. 　前記血液適合材料が人工血管、カテーテル、血液フィルタ、癒着防止材、ステント、細胞足場材料、人工臓器、血液保存容器、または、輸血用具である、請求項４に記載の血液適合材料。
  6. 　前記不織布が、創傷被覆材である、請求項１又は２に記載のシルクファイバーを含む不織布。
  7. 　前記不織布が、ｉＰＳ細胞足場材である、請求項１又は２に記載のシルクファイバーを含む不織布。
  8. 　シルクフィブロインをフッ素系アルコールに溶解してシルクフィブロイン溶液を得て、上記溶液を用いて電界紡糸する、シルクファイバーを含む不織布の製造方法であって、
    　前記シルクファイバーにおいて、赤外吸収スペクトルの１６５０ｃｍ－１付近に位置するピークの強度［ａｂｓ(１６５０)］と、１６２０ｃｍ－１付近に位置するピークの強度［ａｂｓ(１６２０)］の比である、ａｂｓ強度比［ａｂｓ(１６５０)／ａｂｓ(１６２０)］が０．６５より大きく、１．９０以下である、シルクファイバーを含む不織布の製造方法。
  9. 　前記フッ素系アルコールが１，１，１，３，３，３－ヘキサフルオロ－２－プロパノールを７０質量％以上含む溶媒である、請求項８に記載のシルクファイバーを含む不織布の製造方法。
  10. 　前記シルクフィブロイン溶液が、１，１，１，３，３，３－ヘキサフルオロ－２－プロパノールを７０質量％以上含む溶媒に、５８．６℃以上、１８０℃以下の溶解温度で、シルクフィブロインを溶解させることにより得られる、請求項８又は９に記載のシルクファイバーを含む不織布の製造方法。
  11. 　前記フッ素系アルコールが１，１，１，３，３，３－ヘキサフルオロ－２－プロパノールである、請求項８～１０のいずれか１項に記載のシルクファイバーを含む不織布の製造方法。
  12. 　電界紡糸によって得られたシルクファイバーを含む前記不織布を、さらにアルコールに接触させる工程を含む、請求項８～１１のいずれか１項に記載のシルクファイバーを含む不織布の製造方法。
  13. 　前記アルコールが、エタノールまたはその水溶液である、請求項１２に記載のシルクファイバーを含む不織布の製造方法。
  14. 　前記不織布が、創傷被覆材である、請求項８～１３のいずれか１項に記載のシルクファイバーを含む不織布の製造方法。
  15. 　前記不織布が、ｉＰＳ細胞足場材である、請求項８～１３のいずれか１項に記載のシルクファイバーを含む不織布の製造方法。
  16. 　前記不織布が、血液適合材料用不織布である、請求項８～１３のいずれか１項に記載のシルクファイバーを含む不織布の製造方法。
  17. 　請求項１６に記載のシルクファイバーを含む不織布の製造方法を含む、血液適合材料の製造方法。
     
     
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