WO2021020268A1 - 生体移植材料 - Google Patents

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WO2021020268A1
WO2021020268A1 PCT/JP2020/028406 JP2020028406W WO2021020268A1 WO 2021020268 A1 WO2021020268 A1 WO 2021020268A1 JP 2020028406 W JP2020028406 W JP 2020028406W WO 2021020268 A1 WO2021020268 A1 WO 2021020268A1
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gelatin
bone
stem cells
cells
granules
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PCT/JP2020/028406
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崇浩 平塚
雅規 本田
雅哲 伊東
秋山　泰範
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富士フイルム株式会社
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    • C12N2533/50—Proteins
    • C12N2533/54—Collagen; Gelatin

Definitions

  • the present invention relates to a bone regenerating agent containing gelatin-containing granules and stem cells.
  • a base material for regenerative medicine in the fields of dentistry, oral surgery, orthopedics, etc. a base material made of gelatin having high biocompatibility is known.
  • Patent Document 1 discloses a bone regenerating agent and a bone replacement preparation containing recombinant gelatin.
  • the filling material carrier itself can promote bone regeneration.
  • the shape of gelatin disclosed in the examples of Patent Document 1 is a gel, and the sites where bone regeneration can be confirmed are the bone defect formed in the parietal bone of a rat (Example 4) and the oral cavity of a beagle dog. It is a tooth extraction site (Example 7) formed in.
  • Patent Document 2 discloses a cartilage regeneration material containing a mosaic cell mass using a petal-like block of recombinant gelatin and mesenchymal stem cells.
  • the site where cartilage regeneration can be confirmed is a rabbit osteochondral defect site (Example 1).
  • a regenerative medicine base material made from recombinant gelatin has a certain bone regeneration effect and cartilage regeneration effect.
  • the place where the tissue regeneration can be actually confirmed is limited to the place where the bone tissue or the cartilage tissue originally exists, such as the bone defect formed in the parietal bone. It is presumed that the regeneration of bone tissue and cartilage tissue is relatively easy in such a place.
  • cleft palate is a condition in which the gums have cracks, which is one of the congenital anomalies.
  • a method of autologous transplantation of the hip bone is known.
  • an alternative treatment method is required. It has not been sufficiently investigated whether a regenerative medicine substrate made from recombinant gelatin can exhibit a sufficient bone regeneration effect even in a place where there is originally no bone, such as reconstruction of a cleft lip and palate in the treatment of cleft lip and palate. It was.
  • An object of the present invention is to provide a bone regenerating agent showing a high bone regenerating effect.
  • a bone regenerating agent containing gelatin-containing granules and stem cells Gelatin has a repeating sequence represented by Gly-XY, which is characteristic of collagen, and here, a plurality of Gly-XY may be the same or different from each other.
  • ⁇ 3> The bone regenerating agent according to ⁇ 1> or ⁇ 2>, wherein one size of the gelatin-containing granules is 100 ⁇ m or more and 2000 ⁇ m or less.
  • ⁇ 4> The bone regenerating agent according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 3>, wherein the stem cells are mesenchymal stem cells, iPS cells or ES cells.
  • ⁇ 5> The bone regenerating agent according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 4>, wherein the stem cells are adipose-derived stem cells, bone marrow-derived stem cells or dental pulp-derived stem cells.
  • ⁇ 6> The bone regenerating agent according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 5>, wherein the number of stem cells per 1 mg of gelatin-containing granules is 1.0 ⁇ 10 3 or more.
  • ⁇ 7> The bone regenerating agent according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 6>, wherein 70% or more of stem cells are attached to the surface or pores on the surface of gelatin-containing granules.
  • ⁇ 8> The bone regenerating agent according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 7>, which is used for cleft palate.
  • ⁇ A> A method for bone regeneration, which comprises administering a bone regeneration agent containing gelatin-containing granules and stem cells to a patient.
  • ⁇ B> A therapeutic agent containing gelatin-containing granules and stem cells for use in the treatment of bone regeneration.
  • ⁇ C> Use of a combination of gelatin-containing granules and stem cells for the production of a bone regenerating agent.
  • the bone regenerating agent of the present invention According to the bone regenerating agent of the present invention, a high bone regenerating effect can be exhibited.
  • FIG. 1 shows an image of granules + stem cells (left) and petal-shaped blocks + stem cells (right).
  • FIG. 2 shows the measurement results of changes in bone volume over time in each transplant group.
  • FIG. 3 shows an image of the transplanted portion.
  • FIG. 4 shows the measurement results of changes in bone volume over time in each transplant group.
  • FIG. 5 shows a CT image (typical example) of the affected area of each transplant group.
  • the bone regenerating agent of the present invention contains gelatin-containing granules and stem cells.
  • the bone regenerating agent of the present invention can improve the bone regeneration rate as demonstrated in the rat parietal bone defect model in the examples described later. Further, according to the bone regenerating agent of the present invention, good bone regeneration is possible even in a place where there is originally no bone, as demonstrated in the cleft palate reconstruction model in the examples described later.
  • gelatin-containing granules that is, by using gelatin in the form of granules, even in a site where pressure is normally applied to a bone defect such as a cleft palate, the morphology It becomes possible to hold.
  • the gelatin may be either naturally derived gelatin or recombinant gelatin, but recombinant gelatin is preferable.
  • Recombinant gelatin means a polypeptide or protein-like substance having a gelatin-like amino acid sequence prepared by gene recombination technology.
  • the gelatin used in the present invention preferably has a repeating sequence represented by Gly-XY (where X and Y each independently indicate one of the amino acids), which is characteristic of collagen.
  • the plurality of Gly-XY may be the same or different.
  • two or more cell adhesion signals are contained in one molecule.
  • gelatin having an amino acid sequence derived from the partial amino acid sequence of collagen can be used.
  • the gelatin used in the present invention is preferably gelatin having the following aspects.
  • Recombinant gelatin has excellent biocompatibility due to the original performance of natural gelatin, and since it is not naturally derived, there is no concern about bovine spongiform encephalopathy (BSE) and it is excellent in non-infectivity.
  • BSE bovine spongiform encephalopathy
  • recombinant gelatin is more uniform than natural gelatin and its arrangement is determined, it is possible to precisely design it with less blurring due to cross-linking or the like in terms of strength and degradability.
  • the molecular weight of gelatin is not particularly limited, but is preferably 2000 or more and 100,000 or less (2 kDa or more and 100 kDa or less), more preferably 2500 or more and 95,000 or less (2.5 kDa or more and 95 kDa or less), and further preferably 5000 or more and 90000 or less. (5 kDa or more and 90 kDa or less), and most preferably 10,000 or more and 90000 or less (10 kDa or more and 90 kDa or less).
  • the molecular weight distribution of gelatin is not particularly limited, but it is preferable that the area of the maximum molecular weight peak in the molecular weight distribution measurement contains gelatin which is 70% or more of the total area of all the molecular weight peaks, more preferably 90% or more, and 95%. % Or more is most preferable.
  • the molecular weight distribution of gelatin can be measured by the method described in WO2017 / 170342.
  • Gelatin preferably has a repeating sequence represented by Gly-XY, which is characteristic of collagen.
  • the plurality of Gly-XY may be the same or different.
  • Gly-XY Gly represents glycine
  • X and Y represent any amino acid (preferably any amino acid other than glycine).
  • the sequence represented by Gly-XY, which is characteristic of collagen, is a very specific partial structure in the amino acid composition and sequence of gelatin collagen as compared with other proteins. In this part, glycine occupies about one-third of the whole, and the amino acid sequence is one in three repetitions.
  • Glycine is the simplest amino acid, has less binding to the arrangement of molecular chains, and contributes significantly to the regeneration of the helix structure during gelation.
  • Amino acids represented by X and Y contain a large amount of imino acids (proline, oxyproline), and preferably account for 10% to 45% of the total.
  • imino acids proline, oxyproline
  • 80% or more, more preferably 95% or more, and most preferably 99% or more of the amino acids in the gelatin sequence are the repeating structure of Gly-XY.
  • the polar amino acids specifically refer to cysteine, aspartic acid, glutamic acid, histidine, lysine, asparagine, glutamine, serine, threonine, tyrosine and arginine, and among these, polar uncharged amino acids are cysteine, aspartic acid, glutamine and serine.
  • the ratio of polar amino acids to all the constituent amino acids is 10 to 40%, preferably 20 to 30%.
  • the ratio of uncharged amino acids in the polar amino acids is preferably 5% or more and less than 20%, preferably 5% or more and less than 10%. Further, it is preferable that the sequence does not contain any one amino acid of serine, threonine, asparagine, tyrosine and cysteine, preferably two or more amino acids.
  • the smallest amino acid sequence that acts as a cell adhesion signal in a polypeptide is known (for example, "Pathophysiology” Vol. 9, No. 7 (1990), p. 527) published by Nagai Publishing Co., Ltd.).
  • the gelatin used in the present invention preferably has two or more of these cell adhesion signals in one molecule.
  • Specific sequences include RGD sequence, LDV sequence, REDV sequence, YIGSR sequence, PDSGR sequence, RYVVLPR sequence, LGTIPG sequence, and RNIAEI IKDI sequence, which are represented by single-letter amino acid notation in that there are many types of cells to which they adhere. Sequences of IKVAV sequence, LRE sequence, DGEA sequence, and HAV sequence are preferred.
  • RGD sequence More preferably, it is RGD sequence, YIGSR sequence, PDSGR sequence, LGTIPG sequence, IKVAV sequence and HAV sequence, and particularly preferably RGD sequence.
  • the ERGD sequence is preferable.
  • gelatin having a cell adhesion signal the amount of substrate produced by the cells can be improved.
  • the production of glycosaminoglycan (GAG) can be improved.
  • the number of amino acids between RGDs is not uniform between 0 and 100, preferably between 25 and 60.
  • the content of this minimum amino acid sequence is preferably 3 to 50, more preferably 4 to 30, and particularly preferably 5 to 20 per protein molecule from the viewpoint of cell adhesion and proliferation. Most preferably, it is twelve.
  • the ratio of the RGD motif to the total number of amino acids is preferably at least 0.4%. If gelatin contains 350 or more amino acids, it is preferred that each stretch of 350 amino acids contains at least one RGD motif.
  • the ratio of RGD motif to the total number of amino acids is more preferably at least 0.6%, further preferably at least 0.8%, still more preferably at least 1.0%, still more preferably at least 1.2%. Most preferably at least 1.5%.
  • the number of RGD motifs in the peptide is preferably at least 4, more preferably at least 6, still more preferably at least 8, and even more preferably 12 or more and 16 or less per 250 amino acids.
  • a ratio of 0.4% of RGD motif corresponds to at least one RGD sequence per 250 amino acids.
  • gelatin consisting of 251 amino acids must contain at least two RGD sequences to satisfy the feature of at least 0.4%.
  • gelatin comprises at least 2 RGD sequences per 250 amino acids, more preferably contains at least 3 RGD sequences per 250 amino acids, and even more preferably comprises at least 4 RGD sequences per 250 amino acids. ..
  • Further embodiments of gelatin in the present invention include at least 4 RGD motifs, preferably at least 6, more preferably at least 8, and even more preferably 12 or more and 16 or less RGD motifs.
  • Gelatin may be partially hydrolyzed.
  • the gelatin used in the present invention is represented by A-[(Gly-XY) n ] m- B.
  • the n Xs independently represent one of the amino acids, and the n Ys independently represent one of the amino acids.
  • m preferably represents an integer of 2 to 10, and more preferably an integer of 3 to 5.
  • n is preferably an integer of 3 to 100, more preferably an integer of 15 to 70, and most preferably an integer of 50 to 65.
  • A indicates an arbitrary amino acid or amino acid sequence
  • B indicates an arbitrary amino acid or amino acid sequence.
  • the n Gly-XY may be the same or different.
  • the gelatin used in the present invention has the formula: Gly-Ala-Pro-[(Gly-XY) 63 ] 3 -Gly (in the formula, 63 Xs each independently represent one of the amino acids. , 63 Y each independently indicate one of the amino acids. Note that 63 Gly-XY may be the same or different, respectively.).
  • the naturally occurring collagen referred to here may be any naturally occurring collagen, but is preferably type I, type II, type III, type IV, or type V collagen. More preferably, it is type I, type II, or type III collagen. According to another form, the origin of the collagen is preferably human, bovine, porcine, mouse or rat, more preferably human.
  • the isoelectric point of gelatin used in the present invention is preferably 5 to 10, more preferably 6 to 10, and even more preferably 7 to 9.5.
  • the measurement of the isoelectric point of gelatin is performed according to the isoelectric focusing method (see Maxey, CR (1976; Phitogr. Gelatin 2, Editor Cox, PJ Academic, London, Engl.). This can be done by measuring the pH after passing the gelatin solution through a mixed crystal column of cation and anion exchange resins.
  • gelatin is not deaminated.
  • gelatin is telopeptide-free.
  • gelatin is a substantially pure polypeptide prepared with a nucleic acid encoding an amino acid sequence.
  • the gelatin used in the present invention is (1) Peptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1; (2) A peptide consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and having biocompatibility; or (3) Set forth in SEQ ID NO: 1.
  • the "1 or several" in the "amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added” is preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, and even more preferably 1 to 5. It means one, particularly preferably one to three.
  • the hydrophilicity value "1 / IOB" of gelatin used in the present invention is preferably 0 to 1.0. More preferably, it is 0 to 0.6, and even more preferably 0 to 0.4.
  • IOB is an index of prohydrophobicity based on the organic conceptual diagram showing the polarity / non-polarity of an organic compound proposed by Akira Fujita, and the details are, for example, "Pharmaceutical Bulletin", vol.2, 2, pp. Explained in .163-173 (1954), “Area of Chemistry” vol.11, 10, pp.719-725 (1957), “Fragrance Journal", vol.50, pp.79-82 (1981), etc. There is.
  • the source of all organic compounds is methane (CH 4 ), and all other compounds are regarded as derivatives of methane, and constant values are set for their carbon numbers, substituents, transformation parts, rings, etc.
  • the scores are added to obtain the organic value (OV) and the inorganic value (IV), and these values are plotted on a diagram in which the organic value is on the X-axis and the inorganic value is on the Y-axis. It is something to go.
  • the IOB in the organic conceptual diagram means the ratio of the inorganic value (IV) to the organic value (OV) in the organic conceptual diagram, that is, "inorganic value (IV) / organic value (OV)".
  • the gelatin used in the present invention is preferably 0.3 or less and minus 9.0 or more, and 0.0 or less and minus 7.0 or more in the gravy index represented by the Grand average of hydropathicity (GRAVY) value. Is more preferable.
  • the Grand average of hydropathicity (GRAVY) value is "Gasteiger E., Hoogland C., Gattiker A., Duvaud S., Wilkins MR, Appel RD, Bairoch A .; Protein Identification and Analysis Tools on the ExPASy Server; (In) John M. Walker (ed): The Proteomics Protocols Handbook, Humana Press (2005). Pp.
  • the recombinant gelatin used in the present invention can be produced by a gene recombination technique known to those skilled in the art, for example, in EP1014176A2, US Pat. No. 6,992,172, International Publication WO2004 / 85473, International Publication WO2008 / 103041 and the like. It can be manufactured according to the method described. Specifically, a gene encoding a predetermined recombinant gelatin amino acid sequence is obtained, this is incorporated into an expression vector to prepare a recombinant expression vector, and this is introduced into an appropriate host to prepare a transformant. .. Recombinant gelatin is produced by culturing the obtained transformant in an appropriate medium. Therefore, the gelatin used in the present invention can be prepared by recovering the recombinant gelatin produced from the culture.
  • the gelatin-containing granules in the present invention mean granules in which all or part of the components are gelatin.
  • the gelatin-containing granules include granules composed only of gelatin and granules obtained by coating an inorganic component with gelatin. Two or more types of gelatin-containing granules may be mixed and used.
  • the gelatin-containing granules granules composed only of gelatin are preferable.
  • the inorganic components are group 1 alkali metals, group 2 alkaline earth metals, group 3-12 transition metals, group 13-15 typical metals, and metalloid elements such as boron, silicon, and germanium. Ingredients containing.
  • the inorganic component those having high biocompatibility such as ceramics, titanium, stainless steel, hydroxyapatite, and ⁇ -tricalcium phosphate are preferable.
  • Granules composed only of gelatin can be produced, for example, by producing a gelatin porous body (gelatin block) by freeze-drying an aqueous solution containing gelatin, and pulverizing the gelatin porous body with a pulverizer. it can.
  • Granules coated with gelatin on an inorganic component can be produced, for example, by immersing the granules on the inorganic component in an aqueous solution of gelatin and coating the granules on the inorganic component with gelatin by air drying or freeze drying.
  • the gelatin in the gelatin-containing granules may be crosslinked or uncrosslinked, but it is preferably crosslinked.
  • Common cross-linking methods include thermal cross-linking, cross-linking with aldehydes (eg formaldehyde, glutaaldehyde, etc.), cross-linking with condensing agents (carbodiimide, cyanamide, etc.), enzyme cross-linking, photocross-linking, ultraviolet cross-linking, hydrophobic interaction, etc. Hydrogen bonds, ionic interactions, etc. are known, and the above-mentioned cross-linking method can also be used in the present invention.
  • the crosslinking method used in the present invention is more preferably thermal crosslinking, ultraviolet crosslinking, or enzymatic crosslinking, and particularly preferably thermal crosslinking.
  • the enzyme When cross-linking with an enzyme, the enzyme is not particularly limited as long as it has a cross-linking action between polymer materials, but cross-linking can be preferably carried out using transglutaminase and laccase, and most preferably transglutaminase. ..
  • Specific examples of the protein that is enzymatically crosslinked with transglutaminase are not particularly limited as long as it is a protein having a lysine residue and a glutamine residue.
  • the transglutaminase may be derived from a mammal or a microorganism. Specifically, Ajinomoto Co., Inc.
  • Activa series a mammalian-derived transglutaminase marketed as a reagent, for example, Human-derived blood coagulation factors (Factor XIIIa, Haematologic Technologies, Inc.) such as guinea pig liver-derived transglutaminase, goat-derived transglutaminase, and rabbit-derived transglutaminase manufactured by Oriental Yeast Co., Ltd., Upstate USA Inc., Biodesign International, etc. .Company) and so on.
  • Human-derived blood coagulation factors Factor XIIIa, Haematologic Technologies, Inc.
  • guinea pig liver-derived transglutaminase goat-derived transglutaminase
  • the reaction temperature at the time of performing cross-linking is not particularly limited as long as the cross-linking is possible, but is preferably ⁇ 100 ° C. to 500 ° C., more preferably 0 ° C. to 300 ° C., and even more preferably. It is 50 ° C. to 300 ° C., more preferably 100 ° C. to 250 ° C., and even more preferably 120 ° C. to 200 ° C.
  • the degree of cross-linking of the gelatin-containing granules in the present invention is not particularly limited, but is preferably 0.4 or more, more preferably 0.6 or more and 30 or less, still more preferably 0.8 or more and 15 or less, and particularly. It is preferably 1.0 or more and 7 or less.
  • the method for measuring the degree of cross-linking (number of cross-links per molecule) of gelatin-containing granules is not particularly limited, but can be measured by, for example, the TNBS (2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid) method. Specifically, gelatin-containing granules, and the sample was quenched with after reacting for 3 hours in a mixed to 37 ° C.
  • Equation 2 (As-Ab) / 14600 ⁇ V / w (Formula 2) shows the amount of lysine (molar equivalent) per 1 g of gelatin-containing granules.
  • Ab is the blank absorbance
  • V is the reaction solution volume (g)
  • w is the gelatin-containing granule mass (mg).
  • each gelatin-containing granule is not particularly limited, but is preferably 100 ⁇ m or more and 2000 ⁇ m or less, more preferably 200 ⁇ m or more and 1800 ⁇ m or less, still more preferably 300 ⁇ m or more and 1700 ⁇ m or less, and particularly preferably. It is 500 ⁇ m or more and 1500 ⁇ m or less.
  • the size of one granule can be defined by the size of the sieve used to separate the granules.
  • the granules remaining on the sieve when the granules passed through the sieve of 2000 ⁇ m are sieved to the sieve of 500 ⁇ m can be granules having a size of 500 to 2000 ⁇ m.
  • Stem cells are used in the present invention.
  • Stem cells are cells that have the ability to proliferate by themselves (self-renewal ability) and the ability to differentiate into specific cells (pluripotency).
  • stem cells examples include mesenchymal stem cells (MSC), artificial pluripotent stem (iPS) cells, embryonic stem (ES) cells, germline stem (GS) cells, hematopoietic stem cells, sheep membrane cells, umbilical cord blood cells, and adipose-derived stem cells.
  • MSC mesenchymal stem cells
  • iPS artificial pluripotent stem
  • ES embryonic stem
  • GS germline stem
  • hematopoietic stem cells sheep membrane cells
  • umbilical cord blood cells and adipose-derived stem cells.
  • Stem cells bone marrow-derived stem cells, dental pulp-derived stem cells, myocardial stem cells, synovial stem cells, nerve stem cells and the like can be used.
  • stem cells mesenchymal stem cells (MSC), induced pluripotent stem (iPS) cells, or embryonic stem (ES) cells are preferable, and adipose-derived stem cells, bone marrow-derived stem cells, or dental pulp-derived stem cells are also preferable.
  • MSC mesenchymal stem cells
  • iPS induced pluripotent stem
  • ES embryonic stem
  • the stem cells used may be one type or a combination of a plurality of types of cells. Further, the cells to be used are preferably animal cells, more preferably vertebrate-derived cells, and particularly preferably human-derived cells. Moreover, the origin of the cell may be either an autologous cell or an allogeneic cell.
  • the stem cells used may include cells other than stem cells.
  • the number of stem cells is preferably 1.0 ⁇ 10 3 or more, more preferably 2.5 ⁇ 10 3 or more, and 1.0 ⁇ 10 4 or more per 1 mg of gelatin-containing granules. More preferably, it is more preferably 2.5 ⁇ 10 4 or more, and the upper limit is not particularly limited, but generally 1.0 ⁇ 10 6 or less, 1.0 ⁇ 10 5 It may be as follows.
  • the number of stem cells is preferably 2.0 ⁇ 10 2 or more, more preferably 5.0 ⁇ 10 2 or more, and 2.0 ⁇ 10 3 or more per gelatin-containing granule. It is more preferable that there are 5.0 ⁇ 10, 3 or more, and the upper limit is not particularly limited, but generally 2.0 ⁇ 10 5 or less, 2.0 ⁇ 10 4 It may be less than one.
  • the bone regenerating agent of the present invention can be produced by mixing gelatin-containing granules and stem cells together. For example, gelatin-containing granules are infiltrated with a cell suspension containing stem cells on a plate such as a 96-well plate and cultured for a predetermined time. Then, the bone regenerating agent of the present invention can be produced by putting the gelatin-containing granules infiltrated with the above cells in a culture vessel containing an appropriate medium and giving vibration.
  • Gelatin-containing granules + stem cells are images of the bone regenerating agent of the present invention. As can be seen from FIG. 1, the cells shown in the oval shape are less likely to use gelatin-containing granules.
  • the number of cells per 1 mg of gelatin-containing granules is preferably 1.0 ⁇ 10 3 or more, and generally 2.0 ⁇ 10. 5 or less.
  • stem cells are attached to the surface of the gelatin-containing granules. Specifically, it is preferable that 70% or more (preferably 80% or more, more preferably 90% or more) of stem cells are attached to the surface or surface pores of gelatin-containing granules. It can be confirmed and measured by photographs that the stem cells are attached to the surface or the pores on the surface of the gelatin-containing granules.
  • the bone regenerating agent by preparing frozen sections of the bone regenerating agent and then staining with hematoxylin / eosin (HE) staining, 70% or more of the observable stem cells are formed on the surface or surface pores of the gelatin-containing granules. It can be confirmed that they are attached.
  • HE hematoxylin / eosin
  • the bone regeneration agent of the present invention can promote and induce bone regeneration by administering it to a subject (for example, a mammal such as a human) who needs bone regeneration.
  • a subject for example, a mammal such as a human
  • the bone regenerating agent of the present invention can be directly administered to a bone-deficient site in a living body.
  • the dose, usage, and dosage form of the bone regenerating agent of the present invention can be appropriately determined according to the purpose of use.
  • the bone regenerating agent of the present invention may be directly administered to a target site in a living body, or distilled water for injection, physiological saline for injection, and a buffer solution having a pH of 5 to 8 (phosphoric acid type, citric acid type).
  • Etc. may be suspended in a liquid excipient such as an aqueous solvent and administered by, for example, injection or application.
  • a liquid excipient such as an aqueous solvent
  • it may be mixed with an appropriate excipient to form an ointment, a gel, a cream, or the like before application.
  • the preparation of the bone regenerating agent of the present invention can be carried out according to a method known to those skilled in the art.
  • the pharmaceutical carrier when the pharmaceutical carrier is a liquid, it can be dissolved or dispersed, and when the pharmaceutical carrier is a powder, it can be mixed or adsorbed.
  • pharmaceutically acceptable additives eg, preservatives, stabilizers, antioxidants, excipients, binders, disintegrants, wetting agents, lubricants, colorants, fragrances
  • Flavoring agents skins, suspending agents, emulsifiers, solubilizing agents, buffers, tonicity agents, plastic agents, surfactants, soothing agents, etc.
  • the dose of gelatin is not particularly limited, but is, for example, 1 to 100 mg, preferably 1 to 50 mg per 1 cm 2 of the surface area of the living body to be administered.
  • the target of the bone regenerating agent of the present invention is, for example, bone defects and fractures due to trauma, oral surgical diseases and treatment methods thereof (alveolar bone defects, lip and palate fissures, jaw fissures, periodontal diseases, periodontal disease bone defects, etc.). , Osteoporosis, arthritis, and spinal fusion (for spondylolisthesis, spondylolisthesis, and spondylolisthesis, etc.).
  • the bone regenerating agent of the present invention can be used for cleft palate.
  • CBE3 Molecular weight: 51.6kD Structure: GAP [(GXY) 63 ] 3 G Amino acid number: 571 RGD sequence: 12 Imino acid content: 33% Almost 100% of amino acids have a repeating structure of GXY.
  • the amino acid sequence of CBE3 does not include serine, threonine, asparagine, tyrosine and cysteine.
  • CBE3 has an ERGD sequence.
  • GAP GAPGLQGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGPAGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGPAGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGPAGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPP) 3 GAP (GAPGLQGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGPAGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPP) 3 GAP (GAPGLQGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKG
  • gelatin aqueous solution containing 7.5% by mass of recombinant gelatin was poured into a cylindrical container, and then frozen by allowing it to stand in a freezer at -50 ° C (Hitachi, ultra-low temperature freezer RS-U30T) for 1 hour or longer.
  • a gelatin block was obtained.
  • This gelatin block was freeze-dried (Takara, TF5-85ATNNN), pulverized with a crusher (Quadro, Komil U10) on a screen having a pore size of about 1 mm, and a fraction under a sieve having an opening of 1.4 mm was collected.
  • the obtained gelatin-containing granules were treated in a nitrogen atmosphere at 135 ° C.
  • gelatin porous granules (hereinafter, also referred to as gelatin granules).
  • the degree of cross-linking of the granules by thermal cross-linking was 1.4.
  • the oral cavity was disinfected before tooth extraction, and extraction of the right maxillary milk incisor (5-year-old child) was performed. Immediately after removal, the extracted tooth was placed in a 15 ml centrifuge tube containing 10 ml of MEM ⁇ (Wako) (FBS (gibco) 20% + Pencillin-Streptomycin (Wako) 1% (hereinafter P / S)), and then placed at 4 ° C. I kept it in the cooler box and carried it from the university hospital to the oral anatomy laboratory on the Kusumoto campus of the Faculty of Dentistry, Aichi Gakuin University. The cells were stored in a refrigerator (at 4 ° C.) until treatment. MEM ⁇ means Minimum Essential Medium ⁇ , and FBS means fetal bovine serum (Fetal Bovine Serum).
  • the cells obtained above are cells containing dental pulp-derived stem cells.
  • DDPSCs deciduous dental pulp-derived stem cells
  • 1.0 ⁇ 10 5 cells / 18 ⁇ l, 5.0 ⁇ 10 4 cells / 18 ⁇ l, 1.0 ⁇ 10 4 cells / An 18 ⁇ l cell suspension was prepared.
  • the cells were cultured in a carbon dioxide incubator (SANYO MCO-18AIC (UV)) (CO 2 : 5% in a 37 ° C. environment) for 10 minutes. Then, in 15 ml of Cell reactor (Greener bio-one), 10 ml of PRIME-XV (registered trademark) MCS XSFM (P / S1%) and 3 mg of the gelatin granules infiltrated earlier were added, and the mixture was placed in Bioshaker (under 37 ° C. environment). Transplants (gelatin granules + cells) were prepared by applying vibration (frequency 118 rpm / min) for 24 hours.
  • SANYO MCO-18AIC UV
  • PRIME-XV registered trademark
  • MCS XSFM registered trademark
  • the gelatin granules are moved from the 96-well-plate to determine the number of cells remaining on the bottom surface and the medium. I measured it.
  • the gelatin granules in the Cell receiver were moved, and the cells remaining in the medium of PRIME-XV (registered trademark) MCS XSFM were collected and the number of cells was counted. From these measured values, the number of cells that could not be colonized in gelatin granules was calculated, and the cell colonization rate was examined.
  • the retention rate of cells in gelatin granules was 85.5% when 1.0 ⁇ 10 5 cells were sown, and 85 when 5.0 ⁇ 10 4 cells were sown.
  • the retention rate was 83.3%.
  • the first group was a group in which only 2 mg of gelatin granules were transplanted, and in this case, SD rats (male, 11 weeks old, 5 animals) were used. When transplanting the transplanted body, bleeding from the cleft palate of the rat was used, and the transplanted body was transplanted after being acclimated with blood. This group was designated as the control group.
  • the second group is a group in which 1 ⁇ 10 5 deciduous pulp-derived mesenchymal stem cells are seeded in 2 mg of gelatin granules. Immune-deficient nude rats (male, 11 weeks old, 5) were used for transplantation. For the production of a mixture of cells and the day before by seeding 1 ⁇ 10 5 cells deciduous dental pulp-derived mesenchymal stem cells in gelatin granules (2 mg).
  • the degree of bone regeneration after transplantation was evaluated by micro-CT imaging before transplantation and 4 weeks after transplantation.
  • the shooting conditions were: The exposure parameters: 18s, 90kV, and 88 ⁇ A.
  • voxel size 45 ⁇ m.
  • CT analysis software 3 by 4 viewer 2011 (Kitasenju Radio Operator Dental Clinic I-View Image Center, Tokyo, Japan).
  • ROI size 1.8 x 2.7 x 0.9 mm.
  • Table 2 and FIG. 4 show the results of comparing the volume of newborn bone between the two groups by CT analysis.
  • a CT image of the affected area (typical example) of each transplant group is shown in FIG.

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Abstract

本発明の課題は、高い骨再生効果を示す骨再生剤を提供することである。本発明によれば、ゼラチン含有顆粒と、幹細胞とを含む、骨再生剤が提供される。ゼラチンとしては、コラーゲンに特徴的なＧｌｙ－Ｘ－Ｙで示される配列の繰り返しを有するものが好ましい。ここで、複数個のＧｌｙ－Ｘ－Ｙはそれぞれ同一でも異なっていてもよく、式中、Ｘ及びＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示す。ゼラチンの分子量は２ＫＤａ以上１００ＫＤａ以下であることが好ましい。

Description

生体移植材料
　本発明は、ゼラチン含有顆粒と、幹細胞とを含む、骨再生剤に関する。
　歯科領域、口腔外科領域、整形外科領域等における再生医療用基材として、生体親和性が高いゼラチンを原料とした基材が知られている。
　特許文献１には、リコンビナントゼラチンを含む骨再生剤及び骨補填製剤が開示されている。特許文献１に記載の骨再生剤及び骨補填製剤においては、補填材担体自体で骨再生を促進することができる。特許文献１の実施例で開示されているゼラチンの形状はゲルであり、骨再生が確認できている部位は、ラット頭頂骨に形成した骨欠損部（実施例４）、及びビーグル犬の口腔内に形成した抜歯部位（実施例７）である。
　特許文献２には、リコンビナントゼラチンの花弁状ブロックと間葉系幹細胞とを用いたモザイク細胞塊を含む軟骨再生材料が開示されている。特許文献２の実施例において軟骨再生が確認できている部位は、ウサギ骨軟骨欠損部位（実施例１）である。
国際公開ＷＯ２０１１／０２７８５０号公報 国際公開ＷＯ２０１６／１４８２４５号公報
　リコンビナントゼラチンを原料とした再生医療用基材は、一定の骨再生効果及び軟骨再生効果を有することが確認されている。しかし、組織の再生が実際に確認できている箇所は、頭頂骨に形成した骨欠損部等、元々、骨組織又は軟骨組織が存在する箇所に限られていた。このような箇所は、骨組織及び軟骨組織の再生が比較的容易であると推測される。
　一方、顎裂（がくれつ）とは、歯茎に割れ目がある状態であり、先天性異常の一つである。顎裂を埋めるためには、骨組織を補う必要があり、腰骨を自家移植する方法が知られている。しかし、腰骨などからの自家骨移植は患者の負担が大きいことから、代替の治療法が求められている。リコンビナントゼラチンを原料とした再生医療用基材が、口唇口蓋裂の治療における顎裂部再建のように、元々骨がない箇所でも十分な骨再生効果を示せるかについては十分な検討がされていなかった。
　上記の通り、患者負担軽減の観点から、より早く組織再生効果を示す再生医療用基材の開発が求められていた。本発明の課題は、高い骨再生効果を示す骨再生剤を提供することである。
　本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、ゼラチン含有顆粒と幹細胞とを組み合わせて用いることによって、高い骨再生速度を達成できることを見出した。本発明はこれらの知見に基づいて完成したものである。
　即ち、本発明によれば、以下の発明が提供される。
＜１＞　ゼラチン含有顆粒と、幹細胞とを含む、骨再生剤。
＜２＞　ゼラチンが、コラーゲンに特徴的なＧｌｙ－Ｘ－Ｙで示される配列の繰り返しを有し、ここで、複数個のＧｌｙ－Ｘ－Ｙはそれぞれ同一でも異なっていてもよく、式中、Ｘ及びＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、ゼラチンの分子量が２ＫＤａ以上１００ＫＤａ以下である、＜１＞に記載の骨再生剤。
＜３＞　ゼラチン含有顆粒の１つの大きさが１００μｍ以上２０００μｍ以下である、＜１＞又は＜２＞に記載の骨再生剤。
＜４＞　幹細胞が、間葉系幹細胞、ｉＰＳ細胞又はＥＳ細胞である、＜１＞から＜３＞の何れか一に記載の骨再生剤。
＜５＞　幹細胞が、脂肪由来幹細胞、骨髄由来幹細胞又は歯髄由来幹細胞である、＜１＞から＜４＞の何れか一に記載の骨再生剤。
＜６＞　ゼラチン含有顆粒１ｍｇあたりの幹細胞の数が１．０×１０３個以上である、＜１＞から＜５＞の何れか一に記載の骨再生剤。
＜７＞　幹細胞の７０％以上が、ゼラチン含有顆粒の表面又は表面の孔に付着している、＜１＞から＜６＞の何れか一に記載の骨再生剤。
＜８＞　顎裂部に用いる、＜１＞から＜７＞の何れか一に記載の骨再生剤。
＜Ａ＞　ゼラチン含有顆粒と、幹細胞とを含む、骨再生剤を患者に投与することを含む、骨再生方法。
＜Ｂ＞　ゼラチン含有顆粒と、幹細胞とを含む、骨再生の治療において使用するための治療剤。
＜Ｃ＞　骨再生剤の製造のための、ゼラチン含有顆粒と幹細胞との組み合わせの使用。
　本発明の骨再生剤によれば、高い骨再生効果を発揮することができる。
図１は、顆粒＋幹細胞（左）と花弁状ブロック＋幹細胞（右）のイメージ図を示す。 図２は、各移植群の骨体積経時変化の測定結果を示す。 図３は、移植部のイメージ図を示す。 図４は、各移植群の骨体積経時変化の測定結果を示す。 図５は、各移植群の患部ＣＴ画像（代表例）を示す。
　以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
　本発明の骨再生剤は、ゼラチン含有顆粒と、幹細胞とを含む。
　本発明の骨再生剤は、後記の実施例におけるラット頭頂骨欠損モデルにおいて実証される通り、骨再生速度を向上することができる。また、本発明の骨再生剤によれば、後記の実施例における顎裂部再建モデルにおいて実証される通り、元々骨がない箇所でも良好な骨再生が可能である。
　本発明においては、ゼラチン含有顆粒を使用することにより、すなわち、ゼラチンを顆粒の形状において使用することにより、顎裂部のように、骨の欠損部に常態的に圧力がかかる部位においても、形態を保持することが可能になる。
＜ゼラチン＞
　ゼラチンとしては、天然由来ゼラチン又はリコンビナントゼラチンの何れでもよいが、リコンビナントゼラチンが好ましい。
　リコンビナントゼラチンとは、遺伝子組み換え技術により作られたゼラチン類似のアミノ酸配列を有するポリペプチドもしくは蛋白様物質を意味する。
　本発明で用いるゼラチンは、コラーゲンに特徴的なＧｌｙ－Ｘ－Ｙ（式中、ＸおよびＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示す）で示される配列の繰り返しを有するものが好ましい。ここで、複数個のＧｌｙ－Ｘ－Ｙはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。好ましくは、細胞接着シグナルが一分子中に２配列以上含まれている。本発明で用いるゼラチンとしては、コラーゲンの部分アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を有するゼラチンを用いることができる。例えばＥＰ１０１４１７６、米国特許第６９９２１７２号、国際公開ＷＯ２００４／８５４７３、国際公開ＷＯ２００８／１０３０４１等に記載のものを用いることができるが、これらに限定されるものではない。本発明で用いるゼラチンとして好ましいものは、以下の態様のゼラチンである。
　リコンビナントゼラチンは、天然のゼラチン本来の性能から、生体親和性に優れ、且つ天然由来ではないことで牛海綿状脳症（ＢＳＥ）などの懸念がなく、非感染性に優れている。また、リコンビナントゼラチンは天然ゼラチンと比べて均一であり、配列が決定されているので、強度および分解性においても架橋等によってブレを少なく精密に設計することが可能である。
　ゼラチンの分子量は、特に限定されないが、好ましくは２０００以上１０００００以下（２ｋＤａ以上１００ｋＤａ以下）であり、より好ましくは２５００以上９５０００以下（２．５ｋＤａ以上９５ｋＤａ以下）であり、さらに好ましくは５０００以上９００００以下（５ｋＤａ以上９０ｋＤａ以下）であり、最も好ましくは１００００以上９００００以下（１０ｋＤａ以上９０ｋＤａ以下）である。
　ゼラチンの分子量分布は特に限定されないが、分子量分布測定における最大の分子量ピークの面積が、全ての分子量ピークの合計面積の７０％以上であるゼラチンを含むことが好ましく、９０％以上がより好ましく、９５％以上が最も好ましい。ゼラチンの分子量分布は、国際公開ＷＯ２０１７／１７０３４２に記載の方法で測定することができる。
　ゼラチンは、コラーゲンに特徴的なＧｌｙ－Ｘ－Ｙで示される配列の繰り返しを有することが好ましい。ここで、複数個のＧｌｙ－Ｘ－Ｙはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。Ｇｌｙ－Ｘ－Ｙ において、Ｇｌｙはグリシンを表し、ＸおよびＹは、任意のアミノ酸（好ましくは、グリシン以外の任意のアミノ酸）を表す。コラーゲンに特徴的なＧｌｙ－Ｘ－Ｙで示される配列とは、ゼラチン・コラーゲンのアミノ酸組成および配列における、他のタンパク質と比較して非常に特異的な部分構造である。この部分においてはグリシンが全体の約３分の１を占め、アミノ酸配列では３個に１個の繰り返しとなっている。グリシンは最も簡単なアミノ酸であり、分子鎖の配置への束縛も少なく、ゲル化に際してのヘリックス構造の再生に大きく寄与している。ＸおよびＹで表されるアミノ酸にはイミノ酸（プロリン、オキシプロリン）が多く含まれ、全体の１０％～４５％を占めることが好ましい。好ましくは、ゼラチンの配列の８０％以上、更に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９９％以上のアミノ酸が、Ｇｌｙ－Ｘ－Ｙの繰り返し構造である。
　一般的なゼラチンは、極性アミノ酸のうち電荷を持つものと無電荷のものが１：１で存在する。ここで、極性アミノ酸とは具体的にシステイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジン、リジン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシンおよびアルギニンを指し、このうち極性無電荷アミノ酸とはシステイン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニンおよびチロシンを指す。本発明で用いるゼラチンにおいては、構成する全アミノ酸のうち、極性アミノ酸の割合が１０～４０％であり、好ましくは２０～３０％である。且つ上記極性アミノ酸中の無電荷アミノ酸の割合が５％以上２０％未満、好ましくは５％以上１０％未満であることが好ましい。さらに、セリン、スレオニン、アスパラギン、チロシンおよびシステインのうちいずれか１種のアミノ酸、好ましくは２種以上のアミノ酸を配列上に含まないことが好ましい。
　一般にポリペプチドにおいて、細胞接着シグナルとして働く最小アミノ酸配列が知られている（例えば、株式会社永井出版発行「病態生理」Ｖｏｌ．９、Ｎｏ．７（１９９０年）５２７頁）。本発明で用いるゼラチンは、これらの細胞接着シグナルを１分子中に２以上有することが好ましい。具体的な配列としては、接着する細胞の種類が多いという点で、アミノ酸一文字表記で表される、ＲＧＤ配列、ＬＤＶ配列、ＲＥＤＶ配列、ＹＩＧＳＲ配列、ＰＤＳＧＲ配列、ＲＹＶＶＬＰＲ配列、ＬＧＴＩＰＧ配列、ＲＮＩＡＥＩＩＫＤＩ配列、ＩＫＶＡＶ配列、ＬＲＥ配列、ＤＧＥＡ配列、およびＨＡＶ配列の配列が好ましい。さらに好ましくはＲＧＤ配列、ＹＩＧＳＲ配列、ＰＤＳＧＲ配列、ＬＧＴＩＰＧ配列、ＩＫＶＡＶ配列およびＨＡＶ配列、特に好ましくはＲＧＤ配列である。ＲＧＤ配列のうち、好ましくはＥＲＧＤ配列である。細胞接着シグナルを有するゼラチンを用いることにより、細胞の基質産生量を向上させることができる。例えば、細胞として、間葉系幹細胞を用いた軟骨分化の場合には、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の産生を向上させることができる。
　本発明で用いるゼラチンにおけるＲＧＤ配列の配置としては、ＲＧＤ間のアミノ酸数が０～１００の間、好ましくは２５～６０の間で均一でないことが好ましい。
　この最小アミノ酸配列の含有量は、細胞接着・増殖性の観点から、タンパク質１分子中３～５０個が好ましく、さらに好ましくは４～３０個、特に好ましくは５～２０個である。最も好ましくは１２個である。
　本発明で用いるゼラチンにおいて、アミノ酸総数に対するＲＧＤモチーフの割合は少なくとも０．４％であることが好ましい。ゼラチンが３５０以上のアミノ酸を含む場合、３５０のアミノ酸の各ストレッチが少なくとも１つのＲＧＤモチーフを含むことが好ましい。アミノ酸総数に対するＲＧＤモチーフの割合は、更に好ましくは少なくとも０．６％であり、更に好ましくは少なくとも０．８％であり、更に好ましくは少なくとも１．０％であり、更に好ましくは少なくとも１．２％であり、最も好ましくは少なくとも１．５％である。ペプチド内のＲＧＤモチーフの数は、２５０のアミノ酸あたり、好ましくは少なくとも４、更に好ましくは少なくとも６、更に好ましくは少なくとも８、更に好ましくは１２以上１６以下である。ＲＧＤモチーフの０．４％という割合は、２５０のアミノ酸あたり、少なくとも１つのＲＧＤ配列に対応する。ＲＧＤモチーフの数は整数であるので、少なくとも０．４％の特徴を満たすには、２５１のアミノ酸からなるゼラチンは、少なくとも２つのＲＧＤ配列を含まなければならない。好ましくは、ゼラチンは、２５０のアミノ酸あたり、少なくとも２つのＲＧＤ配列を含み、より好ましくは２５０のアミノ酸あたり、少なくとも３つのＲＧＤ配列を含み、さらに好ましくは２５０のアミノ酸あたり、少なくとも４つのＲＧＤ配列を含む。本発明におけるゼラチンのさらなる態様としては、少なくとも４つのＲＧＤモチーフ、好ましくは少なくとも６つ、より好ましくは少なくとも８つ、さらに好ましくは１２以上１６以下のＲＧＤモチーフを含む。
　ゼラチンは部分的に加水分解されていてもよい。
　好ましくは、本発明で用いるゼラチンは、Ａ－［（Ｇｌｙ－Ｘ－Ｙ）ｎ］ｍ－Ｂで示されるものである。ｎ個のＸはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、ｎ個のＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示す。ｍは好ましくは２～１０の整数を示し、より好ましくは３～５の整数を示す。ｎは３～１００の整数が好ましく、１５～７０の整数がさらに好ましく、５０～６５の整数が最も好ましい。Ａは任意のアミノ酸またはアミノ酸配列を示し、Ｂは任意のアミノ酸またはアミノ酸配列を示す。なお、ｎ個のＧｌｙ－Ｘ－Ｙはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。
　より好ましくは、本発明で用いるゼラチンは、　式：Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－［（Ｇｌｙ－Ｘ－Ｙ）６３］３－Ｇｌｙ（式中、６３個のＸはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、６３個のＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示す。なお、６３個のＧｌｙ－Ｘ－Ｙはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。）で示されるものである。
　繰り返し単位には天然に存在するコラーゲンの配列単位を複数結合することが好ましい。ここで言う天然に存在するコラーゲンとは天然に存在するものであればいずれでも構わないが、好ましくはＩ型、II型、III型、IV型、またはV型コラーゲンである。より好ましくは、I型、II型、またはIII型コラーゲンである。別の形態によると、上記コラーゲンの由来は好ましくは、ヒト、ウシ、ブタ、マウスまたはラットであり、より好ましくはヒトである。
　本発明で用いるゼラチンの等電点は、好ましくは５～１０であり、より好ましくは６～１０であり、さらに好ましくは７～９．５である。ゼラチンの等電点の測定は、等電点電気泳動法（Ｍａｘｅｙ，Ｃ．Ｒ．（１９７６；Ｐｈｉｔｏｇｒ．Ｇｅｌａｔｉｎ ２，Ｅｄｉｔｏｒ Ｃｏｘ，Ｐ．Ｊ．Ａｃａｄｅｍｉｃ，Ｌｏｎｄｏｎ，Ｅｎｇｌ．参照）に従って、１質量％ゼラチン溶液をカチオンおよびアニオン交換樹脂の混晶カラムに通したあとのｐＨを測定することで実施することができる。
　好ましくは、ゼラチンは脱アミン化されていない。
　好ましくは、ゼラチンはテロペプタイドを有さない。
　好ましくは、ゼラチンは、アミノ酸配列をコードする核酸により調製された実質的に純粋なポリペプチドである。
　本発明で用いるゼラチンとして特に好ましくは、
（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチド；
（２）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ生体親和性を有するペプチド；または
（３）配列番号１に記載のアミノ酸配列と８０％以上（さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上）の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ生体親和性を有するペプチド；
の何れかである
　「１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列」における「１若しくは数個」とは、好ましくは１～２０個、より好ましくは１～１０個、さらに好ましくは１～５個、特に好ましくは１～３個を意味する。
　本発明で用いるゼラチンの親水性値「１／ＩＯＢ」値は、０から１．０が好ましい。より好ましくは、０から０．６であり、さらに好ましくは０から０．４である。ＩＯＢとは、藤田穆により提案された有機化合物の極性/非極性を表す有機概念図に基づく、親疎水性の指標であり、その詳細は、例えば、"Pharmaceutical Bulletin", vol.2, 2, pp.163-173（1954）、「化学の領域」vol.11, 10, pp.719-725（1957）、「フレグランスジャーナル」, vol.50, pp.79-82（1981）等で説明されている。簡潔に言えば、全ての有機化合物の根源をメタン（ＣＨ４）とし、他の化合物はすべてメタンの誘導体とみなして、その炭素数、置換基、変態部、環等にそれぞれ一定の数値を設定し、そのスコアを加算して有機性値（ＯＶ）、無機性値（ＩＶ）を求め、この値を、有機性値をＸ軸、無機性値をＹ軸にとった図上にプロットしていくものである。有機概念図におけるＩＯＢとは、有機概念図における有機性値（ＯＶ）に対する無機性値（ＩＶ）の比、すなわち「無機性値（ＩＶ）／有機性値（ＯＶ）」をいう。有機概念図の詳細については、「新版有機概念図－基礎と応用－」（甲田善生等著、三共出版、２００８）を参照されたい。本明細書中では、ＩＯＢの逆数をとった「１／ＩＯＢ」値で親疎水性を表している。「１／ＩＯＢ」値が小さい（０に近づく）程、親水性であることを表す表記である。
　本発明で用いるゼラチンの「１／ＩＯＢ」値を上記範囲とすることにより、親水性が高く、かつ、吸水性が高くなる。
　本発明で用いるゼラチンは、Grand average of hydropathicity（GRAVY）値で表される親疎水性指標において、０．３以下、マイナス９．０以上であることが好ましく、０．０以下、マイナス７．０以上であることがさらに好ましい。Grand average of hydropathicity（GRAVY）値は、『Gasteiger E., Hoogland C., Gattiker A., Duvaud S., Wilkins M.R., Appel R.D., Bairoch A.;Protein Identification and Analysis Tools on the ExPASy Server;(In) John M. Walker (ed): The Proteomics Protocols Handbook, Humana Press (2005). pp. 571-607』および『Gasteiger E., Gattiker A., Hoogland C., Ivanyi I., Appel R.D., Bairoch A.; ExPASy: the proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis.; Nucleic Acids Res. 31:3784-3788(2003).』に記載されたの方法により得ることができる。
　本発明で用いるゼラチンのＧＲＡＶＹ値を上記範囲とすることにより、親水性が高く、かつ、吸水性が高くなる。
　本発明で用いるリコンビナントゼラチンは、当業者に公知の遺伝子組み換え技術によって製造することができ、例えばＥＰ１０１４１７６Ａ２号公報、米国特許第６９９２１７２号公報、国際公開ＷＯ２００４／８５４７３号、国際公開ＷＯ２００８／１０３０４１号等に記載の方法に準じて製造することができる。具体的には、所定のリコンビナントゼラチンのアミノ酸配列をコードする遺伝子を取得し、これを発現ベクターに組み込んで、組み換え発現ベクターを作製し、これを適当な宿主に導入して形質転換体を作製する。得られた形質転換体を適当な培地で培養することにより、リコンビナントゼラチンが産生されるので、培養物から産生されたリコンビナントゼラチンを回収することにより、本発明で用いるゼラチンを調製することができる。
＜ゼラチン含有顆粒＞
　本発明におけるゼラチン含有顆粒とは、その成分の全部又は一部がゼラチンである顆粒を意味する。ゼラチン含有顆粒としては、例えば、ゼラチンのみからなる顆粒、無機成分にゼラチンをコーティングした顆粒などが挙げられる。二種以上のゼラチン含有顆粒を混合して用いてもよい。ゼラチン含有顆粒としては、ゼラチンのみからなる顆粒が好ましい。また、無機成分とは、１族のアルカリ金属、２族のアルカリ土類金属、３～１２族の遷移金属、１３～１５族の典型金属、および、ホウ素、ケイ素、ゲルマニウム等の半金属の元素を含む成分をいう。無機成分は、セラミックス、チタン、ステンレス、ヒドロキシアパタイト、β－リン酸三カルシウムなど、生体適合性が高いものが好ましい。
　ゼラチンのみからなる顆粒は、例えば、ゼラチンを含有する水溶液を凍結乾燥することによってゼラチン多孔質体（ゼラチンブロック）を製造し、このゼラチン多孔質体を粉砕機により粉砕することにより、製造することができる。
　無機成分にゼラチンをコーティングした顆粒は、例えば、無機成分の顆粒をゼラチン水溶液に浸漬させ、風乾または凍結乾燥によって無機成分の顆粒にゼラチンをコーティングすることにより、製造することができる。
　ゼラチン含有顆粒におけるゼラチンは、架橋されているものでもよいし、架橋されていないものでもよいが、架橋されているものが好ましい。一般的な架橋方法としては、熱架橋、アルデヒド類（例えば、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒドなど）による架橋、縮合剤（カルボジイミド、シアナミドなど）による架橋、酵素架橋、光架橋、紫外線架橋、疎水性相互作用、水素結合、イオン性相互作用などが知られており、本発明においても上記の架橋方法を使用することができる。本発明で使用する架橋方法としては、さらに好ましくは熱架橋、紫外線架橋、又は酵素架橋であり、特に好ましくは熱架橋である。
　酵素による架橋を行う場合、酵素としては、高分子材料間の架橋作用を有するものであれば特に限定されないが、好ましくはトランスグルタミナーゼ及びラッカーゼ、最も好ましくはトランスグルタミナーゼを用いて架橋を行うことができる。トランスグルタミナーゼで酵素架橋するタンパク質の具体例としては、リジン残基及びグルタミン残基を有するタンパク質であれば特に制限されない。トランスグルタミナーゼは、哺乳類由来のものであっても、微生物由来のものであってもよく、具体的には、味の素（株）製アクティバシリーズ、試薬として発売されている哺乳類由来のトランスグルタミナーゼ、例えば、オリエンタル酵母工業（株）製、Upstate USA Inc.製、Biodesign International製などのモルモット肝臓由来トランスグルタミナーゼ、ヤギ由来トランスグルタミナーゼ、ウサギ由来トランスグルタミナーゼなど、ヒト由来の血液凝固因子（Factor XIIIa、Haematologic Technologies， Inc.社）などが挙げられる。
　架橋（例えば、熱架橋）を行う際の反応温度は、架橋ができる限り特に限定されないが、好ましくは、－１００℃～５００℃であり、より好ましくは０℃～３００℃であり、更に好ましくは５０℃～３００℃であり、更に好ましくは１００℃～２５０℃であり、更に好ましくは１２０℃～２００℃である。
　本発明におけるゼラチン含有顆粒の架橋度は、特に限定されないが、好ましくは０．４以上であり、さらに好ましくは０．６以上３０以下であり、さらに好ましくは０．８以上１５以下であり、特に好ましくは１．０以上７以下である。
　ゼラチン含有顆粒の架橋度（１分子当たりの架橋数）の測定方法は、特に限定されないが、例えば、ＴＮＢＳ（2,4,6-トリニトロベンゼンスルホン酸）法で測定することができる。具体的には、ゼラチン含有顆粒、ＮａＨＣＯ３水溶液及びＴＮＢＳ水溶液を混合して３７℃で３時間反応させた後に反応停止したサンプルと、ゼラチン含有顆粒、ＮａＨＣＯ３水溶液及びＴＮＢＳ水溶液を混合した直後に反応停止させたブランクとをそれぞれ調製し、純水で希釈したサンプル及びブランクの吸光度（３４５nm）を測定し、以下の（式２）、及び（式３）から架橋度（１分子当たりの架橋数）を算出することができる。
（式２）　（As-Ab）／１４６００×V／ｗ　
（式２）は、ゼラチン含有顆粒１ｇ当たりのリジン量（モル等量）を示す。
（式中、Asはサンプル吸光度、Abはブランク吸光度、Vは反応液量（ｇ）、ｗはゼラチン含有顆粒質量（ｍｇ）を示す。）
（式３）　１－（サンプル（式２）/未架橋の高分子（式２））×３４
（式３）は、１分子あたりの架橋数を示す。
　ゼラチン含有顆粒の顆粒一つ当たりの大きさは、特に限定されないが、好ましくは１００μｍ以上２０００μｍ以下であり、より好ましくは２００μｍ以上１８００μｍ以下であり、さらに好ましくは３００μｍ以上１７００μｍ以下であり、特に好ましくは５００μｍ以上１５００μｍ以下である。ゼラチン含有顆粒の顆粒一つ当たりの大きさを上記の範囲内にすることにより、良好な骨再生効果を発揮することができる。
　顆粒一つの大きさは、顆粒を分ける際に用いたふるいの大きさで定義することができる。例えば、２０００μｍのふるいにかけ、通過した顆粒を５００μｍのふるいにかけた際にふるいの上に残る顆粒を、５００～２０００μｍの大きさの顆粒とすることができる。
＜幹細胞＞    
　本発明では幹細胞を使用する。
　幹細胞とは、自ら増殖する能力（自己複製能）と、特定の細胞に分化する能力（多分化能）とを有する細胞である。
　幹細胞としては、例えば、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞、胚性幹（ＥＳ）細胞、生殖幹（ＧＳ）細胞、造血幹細胞、羊膜細胞、臍帯血細胞、脂肪由来幹細胞、骨髄由来幹細胞、歯髄由来幹細胞、心筋幹細胞、滑膜由来幹細胞又は神経幹細胞などを使用することができる。幹細胞としては、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞、又は胚性幹（ＥＳ）細胞が好ましく、さらに脂肪由来幹細胞、骨髄由来幹細胞、又は歯髄由来幹細胞も好ましい。
　使用する幹細胞は１種でもよいし、複数種の細胞を組み合せて用いてもよい。また、使用する細胞として、好ましくは、動物細胞であり、より好ましくは脊椎動物由来細胞、特に好ましくはヒト由来細胞である。また、細胞の由来は、自家細胞または他家細胞の何れでも構わない。使用する幹細胞は、幹細胞以外の細胞を含んでもよい。
　幹細胞の数は、ゼラチン含有顆粒１ｍｇ当たり、１．０×１０３個以上であることが好ましく、２．５×１０３個以上であることがより好ましく、１．０×１０４個以上であることがさらに好ましく、２．５×１０４個以上であることがよりさらに好ましく、上限は特に限定されないが、一般的には１．０×１０６個以下であり、１．０×１０５個以下でもよい。
　幹細胞の数は、ゼラチン含有顆粒１個当たり、２．０×１０２個以上であることが好ましく、５．０×１０２個以上であることがより好ましく、２．０×１０３個以上であることがさらに好ましく、５．０×１０３個以上であることがよりさらに好ましく、上限は特に限定されないが、一般的には２．０×１０５個以下であり、２．０×１０４個以下でもよい。
＜骨再生剤＞
　本発明の骨再生剤は、ゼラチン含有顆粒と幹細胞とを一緒に混合することによって製造することができる。例えば、９６ウエルプレート等のプレート上においてゼラチン含有顆粒に、幹細胞を含む細胞懸濁液を浸潤させて、所定の時間培養する。その後、適当な培地を含む培養容器中に上記の細胞を浸潤させたゼラチン含有顆粒を入れ、振動を与えることによって、本発明の骨再生剤を製造することができる。
　ゼラチン含有顆粒＋幹細胞（左）と花弁状ブロック＋幹細胞（右）のイメージ図を図１に示す。ゼラチン含有顆粒＋幹細胞（左）が、本発明の骨再生剤のイメージ図である。
図１から分かるように、楕円形で示す細胞は、ゼラチン含有顆粒を使用する場合の方が少ない。
　具体的には、ゼラチン含有顆粒＋幹細胞の場合、上記の通り、ゼラチン含有顆粒１ｍｇ当たりの細胞数は、１．０×１０３個以上であることが好ましく、一般的には２．０×１０５個以下である。一方、花弁状ブロック＋幹細胞の場合、例えば特許文献２では、花弁状ブロック１ｍｇ当たり、１．０×１０６個（＝細胞1個当たり０．００１μｇのブロック）であり、顆粒またはブロック当たりの細胞数に、数十～数千倍の差がある。
　本発明によるゼラチン含有顆粒と幹細胞とを含む骨再生剤においては、ゼラチン含有顆粒の表面に幹細胞が付着していることが好ましい。具体的には、幹細胞の７０％以上（好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上）が、ゼラチン含有顆粒の表面又は表面の孔に付着していることが好ましい。幹細胞が、ゼラチン含有顆粒の表面又は表面の孔に付着していることは、写真により確認及び測定することができる。具体的には、骨再生剤の凍結切片を作製した後、ヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）染色にて染色を行うことにより、観察できる幹細胞の７０％以上が、ゼラチン含有顆粒の表面又は表面の孔に付着していることを確認することができる。上記のように、幹細胞をゼラチン含有顆粒の表面又は表面の孔に付着させることにより、同じスペースの骨欠損部位に骨再生剤を充填する場合、使用する幹細胞数が少量で済むという利点がある。
　本発明の骨再生剤は、骨再生を必要とする対象者（例えば、ヒトなどの哺乳動物）に投与することによって、骨再生を促進、誘導することができる。好ましくは、本発明の骨再生剤は、生体中の骨が欠損した部位へ直接投与することができる。
　本発明の骨再生剤は、その使用目的に合わせて用量、用法、剤型を適宜決定することが可能である。例えば、本発明の骨再生剤は、生体内の目的部位に直接投与してもよいし、あるいは注射用蒸留水、注射用生理食塩水、ｐＨ５～８の緩衝液（リン酸系、クエン酸系等）等の水性溶媒等の液状賦形剤に懸濁して、例えば注射、塗布等により投与してもよい。また、適当な賦形剤と混合し、軟膏状、ゲル状、クリーム状等にしてから塗布してもよい。
　本発明の骨再生剤の製剤化は、当業者に公知の方法に従って行うことができる。例えば、製剤用担体が液体の場合は、溶解又は分散させ、また、製剤用担体が粉末の場合は、混合又は吸着させることができる。さらに必要に応じて、薬学的に許容される添加物（例えば、保存剤、安定化剤、抗酸化剤、賦形剤、結合剤、崩壊剤、湿潤剤、滑沢剤、着色剤、芳香剤、矯味剤、剤皮、懸濁化剤、乳化剤、溶解補助剤、緩衝剤、等張化剤、塑性剤、界面活性剤又は無痛化剤等）を含有させることもできる。
　ゼラチンの投与量は、特に限定されないが、例えば、投与される生体の表面積１ｃｍ2当たり１～１００ｍｇであり、好ましくは１～５０ｍｇである。
　本発明の骨再生剤の対象としては例えば、外傷などによる骨欠損や骨折、口腔外科疾患やその治療法（歯槽骨欠損、口唇口蓋裂、顎裂、歯周病、歯周病骨欠損など）、骨粗鬆症、関節症、および脊椎固定術（脊椎分離症、脊椎すべり症、および脊椎骨折などに施すもの）などが挙げられる。特に好ましくは、本発明の骨再生剤は、顎裂部に用いることができる。
　以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
［ゼラチン含有顆粒の調製］
＜１＞リコンビナントペプチド（リコンビナントゼラチン）
　リコンビナントペプチド（リコンビナントゼラチン）として以下のＣＢＥ３を用意した（国際公開ＷＯ２００８／１０３０４１号公報に記載）。
ＣＢＥ３：
分子量：５１．６ｋＤ
構造：ＧＡＰ［（ＧＸＹ）６３］３Ｇ
アミノ酸数：５７１個
ＲＧＤ配列：１２個
イミノ酸含量：３３％
ほぼ１００％のアミノ酸がＧＸＹの繰り返し構造である。ＣＢＥ３のアミノ酸配列には、セリン、スレオニン、アスパラギン、チロシンおよびシステインは含まれていない。ＣＢＥ３はＥＲＧＤ配列を有している。
等電点：９．３４
ＧＲＡＶＹ値：－０．６８２
１／ＩＯＢ値：０．３２３
アミノ酸配列（配列表の配列番号１）（国際公開ＷＯ２００８／１０３０４１号公報の配列番号３と同じ。但し末尾のＸは「Ｐ」に修正）
GAP(GAPGLQGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGPAGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPP)3G
＜２＞リコンビナントゼラチン多孔質体の顆粒の作製
　厚さ５ｍｍ、直径９８ｍｍのアルミ製円筒カップ状容器を用意した。円筒カップは曲面を側面としたとき、側面は１ｍｍのアルミで閉鎖されており、底面（平板の円形状）も５ｍｍのアルミで閉鎖されている。一方、上面は開放された形をしている。また、側面の内部にのみ、肉厚３ｍｍのテフロン（登録商標）を均一に敷き詰め、結果として円筒カップの内径は９０ｍｍになっている。以後、この容器のことを円筒形容器と呼称する。
　リコンビナントゼラチンを７．５質量％で含むゼラチン水溶液を、円筒形容器に約１８ｍｌ流し込んだ後、－５０℃の冷凍庫（日立、超低温フリーザーＲＳ-Ｕ３０Ｔ）に１時間以上静置することによって、凍結したゼラチンブロックを得た。このゼラチンブロックを凍結乾燥（タカラ、ＴＦ５-８５ＡＴＮＮＮ）し、粉砕機（クワドロ、コーミルＵ１０）にて孔径約1ｍｍのスクリーンにて粉砕し、目開き１．４ｍｍのふるい下の画分を回収した。得られたゼラチン含有顆粒を、窒素雰囲気下１３５℃（ヤマト科学、ＤＰ-４３）で４．７５時間処理し、ゼラチン多孔質体の顆粒（以下、ゼラチン顆粒とも言う）を得た。熱架橋による顆粒の架橋度は、１．４であった。
［歯髄由来幹細胞の調製］
　愛知学院大学歯学部附属病院・口腔外科の外来にて、患者とその保証人において、抜去乳歯及び歯髄の提供・研究への使用についての同意書に署名頂いた後、抜去歯から歯髄摘出した。
　抜歯前に口腔内を消毒し、右側上顎乳切歯の抜歯（５歳児）を施行した。抜去後すぐに抜去した歯をＭＥＭα（Ｗａｋｏ）１０ｍｌに（ＦＢＳ（ｇｉｂｃｏ）２０％＋Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ－Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（Ｗａｋｏ）１％（以下Ｐ／Ｓ））が入った１５ｍｌの遠沈管に入れた後に、４℃のクーラーボックス内に保管して、附属病院から愛知学院歯学部楠元キャンパスにある口腔解剖学の研究室へ運んだ。細胞の処理まで冷蔵庫（４℃下）にて保存した。ＭＥＭαは、Ｍｉｎｉｍｕｍ　Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ　αを意味し、ＦＢＳは、ウシ胎児血清（Ｆｅｔａｌ　Ｂｏｖｉｎｅ　Ｓｅｒｕｍを意味する。
　歯髄からの細胞の単離は、口腔解剖学の研究室にあるクリーンベンチ内にて作業した。具体的には、抜去した乳歯（歯根吸収しており髄腔は開放されていたため分割などはしていない）から歯科用Ｋファイル（販売会社：マニー　販売名：マニーＫファイル　サイズ１５　先端径０．１５ｍｍ）を用いて乳歯の歯冠部と歯根部から歯髄を摘出した。摘出した歯髄は、事前に用意した１５ｍｌ遠沈管にＤ－ＰＢＳ（Ｗａｋｏ）４ｍｌ（ＦＢＳ２％　Ｐ／Ｓ１％）を入れて、血液などを洗い流すために、撹拌した。次に、歯髄が沈殿したら上澄みのみをピペットで除去した。この操作を５回行った。Ｄ－ＰＢＳは、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水を示す。
　洗浄後に、歯髄から酵素処理にて細胞を単離する。１５ｍｌの遠沈管に洗浄後の歯髄と細胞剥離用酵素Ａｃｃｕｔａｓｅ３ｍｌ（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ　Ｃｅｌｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を加えて、Ｂｉｏ　ｓｈａｋｅｒ（ＴＡＩＴＥＣ　Ｂｉｏ　Ｓｈａｋｅｒ Ｖ・ＢＲ－３６：）にて３７℃環境下にて振動数１１８ｒｐｍ／ｍｉｎにて３０分撹拌させた。３０分撹拌後にＡｃｃｕｔａｓｅ３ｍｌに、ＰＲＩＭＥ－ＸＶ（登録商標）ＭＣＳ　ＸＳＦＭ７ｍｌ（３７℃環境下）（Ｉｒｖｉｎｅ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を加えて、酵素反応を停止させながら、ピペッティングを２０回行い、歯髄から細胞を単離する操作を行う。ピペッティング後に、遠心分離機（１００Ｇ、５分）で遠心分離後に上澄み液のみ除去しＰＲＩＭＥ－ＸＶ（登録商標）ＭＣＳ　ＸＳＦＭ５．７ｍｌ（Ｐ／Ｓ１％　（Ｉｒｖｉｎｅ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））を加えピペッティングを行い６ｗｅｌｌ－ｐｌａｔｅ（ＰＲＩＭＥ－ＸＶ（登録商標）Ｈｕｍａｎ　Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ（Ｉｒｖｉｎｅ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）２．５μｇ／ｍｌにて１２時間コーティング済み）の３－ｗｅｌｌにそれぞれ１．９　ｍｌずつ細胞懸濁液を添加することで、細胞を播種した。播種後１週間は、培地を交換せずに放置し、細胞がディッシュに生着することを待った。
　１週間後に、細胞の生着とその後の増殖を確認後、８０％コンフルエント状態になったら、細胞をディッシュから回収し、再度６－ｗｅｌｌ－ｐｌａｔｅ（ＰＲＩＭＥ－ＸＶ（登録商標）Ｈｕｍａｎ　Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ（Ｉｒｖｉｎｅ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）２．５μｇ／ｍｌにて１２時間コーティング済み）に１．０×１０４ｃｅｌｌｓ播種して、培地ＰＲＩＭＥ－ＸＶ（登録商標）ＭＣＳ　ＸＳＦＭ培地を３ｍｌ（Ｐ／Ｓ１％含有）添加した。この細胞群を１継代目として３継代目の細胞を今回の実験に用いることとした。上記で得られた細胞は、歯髄由来幹細胞を含む細胞である。
［ゼラチン含有顆粒と幹細胞を含む骨再生剤の調製］
　３継代目まで培養した乳歯歯髄由来幹細胞（以下、ＤＤＰＳＣｓ）を含む細胞を回収し、１．０×１０５ｃｅｌｌｓ／１８μｌ、５．０×１０４ｃｅｌｌｓ／１８μｌ、１．０×１０４ｃｅｌｌｓ／１８μｌの細胞懸濁液を作製した。窒素雰囲気下で１３５℃、４．７５時間処理した熱架橋体Ｆｕｊｉ　Ｂｏｎｅ　Ｇｒａｆｔ（ゼラチン顆粒）を３ｍｇ用意し、９６ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅ上で、先程準備した細胞懸濁液を浸潤させ、３７℃の環境下の炭酸ガスインキュベータ（ＳＡＮＹＯ　ＭＣＯ－１８ＡＩＣ（ＵＶ））（３７℃環境下　ＣＯ２：５％）内にて１０分間培養した。その後、Ｃｅｌｌ　ｒｅａｃｔｏｒ１５ｍｌ（Ｇｒｅｉｎｅｒ　ｂｉｏ－ｏｎｅ）に、ＰＲＩＭＥ－ＸＶ（登録商標）ＭＣＳ　ＸＳＦＭ（Ｐ／Ｓ１％）１０ｍｌと、先ほど浸潤させたゼラチン顆粒３ｍｇを入れ、Ｂｉｏ　ｓｈａｋｅｒ（３７℃環境下）にて２４時間振動（振動数１１８ｒｐｍ／ｍｉｎ）を与えて移植体（ゼラチン顆粒＋細胞）の調製を行った。
　顆粒３ｍｇ当たりの顆粒の数は、平均１３個（ｎ＝３）であった。１×１０５ｃｅｌｌｓの場合、顆粒１個あたり、約７．７×１０３個の細胞となる。
　ゼラチン顆粒への歯髄由来幹細胞の定着率を測定するために、あらかじめ、ゼラチン顆粒に細胞を浸潤させた後に、ゼラチン顆粒を９６ｗｅｌｌ－ｐｌａｔｅから移動させて、その底面と培地に残っている細胞数を計測した。次に、２４時間Ｂｉｏ　ｓｈａｋｅｒを与えた後に、Ｃｅｌｌ　ｒｅａｃｔｅｒ内のゼラチン顆粒を移動させて、ＰＲＩＭＥ－ＸＶ（登録商標）ＭＣＳ　ＸＳＦＭの培地に残存する細胞を回収し細胞数を計測した。これらの計測値からゼラチン顆粒に定着できなかった細胞数を計算して、細胞定着率を検討した。
　上記の検討からゼラチン顆粒への細胞の定着率として、１．０×１０５ｃｅｌｌｓを播種した時の定着率は８５．５％、５．０×１０４ｃｅｌｌｓを播種した時の定着率は８５．０％、１．０×１０４ｃｅｌｌｓを播種した時の定着率は８３．３％の結果を得ることができた。
　また、細胞を定着させたゼラチン顆粒の切片を作製した場合、ヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）染色にて染色を行うことにより、染色像にて確認できる歯髄由来幹細胞の７０％以上が、ゼラチン含有顆粒の表面又は表面の孔に付着していることを確認できる。
［ラット頭頂骨欠損モデルでの評価］（ＷＯ１１／０２７８５０の実施例１参照）
　移植用の動物として、１７匹のｎｕｄｅラット（Ｆ３４４／ＮＪｃＬ－ｒｎｕ／ｒｎｕ　ｎｕｄｅ　ｒａｔ、雄、１０週齢、０．３～０．５ｋｇ）を用いた。ラットの麻酔には、マウス・ラット等小動物実験用簡易吸入麻酔装置ＮＡＲＣＯＢＩＴ－Ｅ（２型）を用いて、麻酔薬として、イソフルラン吸入麻酔液（ファイザー）を用い、吸入麻酔により麻酔した（導入が４．５％、　維持が３．５％の濃度）。Ｎｏ１５メスにてラットの頭蓋皮膚及び骨膜を切開し、剥離して頭蓋骨を露出させた。一定の骨欠損を作製するために、トレフィンバーφ４．０ｍｍ／５．０ｍｍ（Ｈａｎｇｅｒ　＆　Ｍｅｉｓｉｎｇｅｒ）にて、頭蓋骨の中央の縫合部を避けるようにして、頭頂骨の左側の中央に位置するように、直径５ｍｍの円形の骨欠損を作成した。
　次に、作製した骨欠損部に移植するためのサンプルを準備した。第１群はＤＤＰＳＣｓ　（１．０×１０５ｃｅｌｌｓ／１８μｌ、ｎ＝６）を含むゼラチン顆粒３ｍｇ、第２群としてＤＤＰＳＣｓ（５．０×１０４ｃｅｌｌｓ／１８μｌ、ｎ＝６）を含むゼラチン顆粒３ｍｇ、第３群として、ＤＤＰＳＣｓ（１．０×１０４ｃｅｌｌｓ／１８μｌ、ｎ＝５）を含むゼラチン顆粒３ｍｇを骨欠損部に移植した。移植後に骨膜を元の位置に戻して、皮膚を絹糸にて縫合した。
　移植後、小型実験動物用３ＤマイクロＸ線ＣＴ　ＣｏｓｍｏＳｃａｎ　ＧＸ（Ｒｉｇａｋｕ）（管電圧：９０ｋＶ　管電流：８８μＡ　ＦＯＶ［ｍｍ］：φ３０×Ｈ３０　撮影時間：１８秒　ボクセルサイズ［μｍ］：９０×９０×９０）による撮影を移植後４週目まで各週にて行い、そのイメージ像を基にして、骨形成量の比較をｂｙ　４ｖｉｅｗｅｒ２０１１（ｋｉｔａｓｅｎｎｊｕ　Ｒａｄｉｓｔ　Ｄｅｎｔａｌ　Ｃｌｉｎｉｃ　Ｉ－Ｖｉｅｗ　Ｉｍａｇｅ　Ｃｅｎｔｅｒ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）のソフトを用いて行った。
　各移植群の骨体積経時変化の測定結果を表１及び図２に示す。
　表１及び図２に示す結果から、各移植群において骨形成量の増加が認められた。また、ＤＤＰＣｓ１×１０５ｃｅｌｌｓ移植ラットにおいては、ＤＤＰＣｓ１×１０４ｃｅｌｌｓ移植ラットに比べ移植後１週における骨形成量に有意に高い値が認められた（ｔ値＝０．０３８）。
　また、ＤＤＰＣｓ１×１０５ｃｅｌｌｓ移植ラットとＤＤＰＣｓ５×１０４ｃｅｌｌｓ移植ラットの移植後１週における骨形成量には優位な差は認められなかった（ｔ値＝０．１７３）。２週目以降も骨形成量に差は認められたが優位な差は認められなかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
［顎裂部再建モデルでの評価］
　３種混合麻酔０．５ｍｌ／１００ｇ（０．３ｍｇ／ｋｇのＤＯＭＩＴＯＲ（登録商標）（Ｎｉｐｐｏｎ　Ｚｅｎｙａｋｕ　Ｋｏｇｙｏ　Ｃｏ．，Ｌｔｄ，Ｊａｐａｎ），４．０ｍｇ／ｋｇのｍｉｄａｚｏｌａｍ（ＳＡＮＤＯＺ，Ｊａｐａｎ）、５．０ｍｇ／ｋｇのＶｅｔｏｒｐｈａｌｅ（登録商標）（Ｍｅｉｊｉ　Ｓｅｉｋａ　Ｐｈａｒｍａ　Ｃｏ．，Ｌｔｄ，Ｊａｐａｎ）及び２．９ｍｌ／ｋｇのＯｔｓｕｋａ　Ｎｏｒｍａｌ　Ｓａｌｉｎｅ（Ｏｔｓｕｋａ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｃｏ．，Ｌｔｄ，Ｊａｐａｎ）を用いて腹腔内麻酔を行う。次に、移植体を移植する空洞を作成する（図３）。まずは、移植部位を作成する側の頬粘膜に絹糸をかけ、モスキートにて伸展し、口蓋部となる術野の視野を確保する。口蓋部の口蓋粘膜の切開にはＮｏ．１５のメスをもちいる。切開は、切歯から第一大臼歯方向にむけて、切歯骨体上に骨膜下の骨までの深さで長さ１０ｍｍの切開を加える（図３Ａ）。切歯骨から粘膜骨膜弁を剥離すると切歯骨体の皮質骨の表面が観察できる。骨膜まで剥離ができていないと骨が観察できない。切開部の骨膜に沿って、粘膜骨膜を切歯骨側から口蓋骨に沿って、鼻腔方向に向けて剥離を続けると、陥入している口蓋裂が観察できる。この陥入している口蓋裂部に、移植体を移植することになる。次に、鼻中隔側の骨膜を鼻腔側に向けて剥離を続ける。次に、口蓋裂を覆っていた口蓋部の粘膜を粘膜と骨膜に分離する（図３Ｂ）。剥離した切歯骨・口蓋骨側の骨膜と鼻中隔側の骨膜を、鼻腔側に滅菌綿球を用いて押し込む（図３Ｃ）。メジャーにて口蓋裂部の深さを計測し、口腔粘膜から５ｍｍ程度の深さが得られたところで、骨膜を鼻腔側に陥入させることを停める。ここに、インプラント体を移植する部位ができるので、ここに移植体を移植する。
　上記で作成した移植体は、２群用意した。第一の群は、ゼラチン顆粒２ｍｇのみを移植する群で、この場合には、ＳＤラット（雄、１１週齢、５匹）を用いた。移植体の移植時はラット口蓋裂部からの出血を利用し、血液でなじませてから移植した。この群をコントロール群とした。第二の群は、ゼラチン顆粒２ｍｇに１×１０５個の乳歯歯髄由来間葉系幹細胞を播種させた群である。移植には免疫不全のヌードラット（雄、１１週齢、５匹）を用いた。細胞の混合体の作製については、前日にゼラチン顆粒（２ｍｇ）に１×１０５個の乳歯歯髄由来間葉系幹細胞を播種させた。
　両群のそれぞれの移植終了後に、切歯骨体側（外側）の骨膜に減張切開を行い、ラット口蓋裂上面が骨膜で覆われることを確認し、粘膜骨膜弁を４－０絹糸にて縫合し創を閉鎖した。この縫合により、移植物は移植部位に留まることができた。移植手術が終了した後は、粉餌を与えた。
　移植後の骨の再生程度の評価は移植前と移植後４週においてマイクロＣＴ撮影による観察を行った。撮影条件は、Ｔｈｅ　ｅｘｐｏｓｕｒｅ　ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ：１８ｓ，９０ｋＶ，ａｎｄ　８８μＡ．ｖｏｘｅｌ　ｓｉｚｅ：４５μｍ．ＣＴ解析ソフトウェア：３　ｂｙ　４　ｖｉｅｗｅｒ　２０１１（Ｋｉｔａｓｅｎｊｙｕ　Ｒａｄｉｓｔ　Ｄｅｎｔａｌ　Ｃｌｉｎｉｃ　Ｉ－Ｖｉｅｗ　Ｉｍａｇｅ　Ｃｅｎｔｅｒ，　Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）．ＲＯＩ　ｓｉｚｅ：１．８×２．７×０．９ｍｍとした。
　２群間の新生骨体積量をＣＴ解析により比較した結果を表２及び図４に示す。各移植群の患部ＣＴ画像（代表例）を図５に示す。
　ゼラチン顆粒＋乳歯歯髄由来間葉系幹細胞を投与した群、及びゼラチン顆粒を投与した群において、新生骨体積量の増加が認められた。また、移植後４および８週においてゼラチン顆粒＋乳歯歯髄由来間葉系幹細胞群の新生骨体積量はゼラチン顆粒のみを移植した群の新生骨体積量と比較して、有意な差をもって高い結果となった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002

Claims (8)

  1. ゼラチン含有顆粒と、幹細胞とを含む、骨再生剤。
  2. ゼラチンが、コラーゲンに特徴的なＧｌｙ－Ｘ－Ｙで示される配列の繰り返しを有し、ここで、複数個のＧｌｙ－Ｘ－Ｙはそれぞれ同一でも異なっていてもよく、式中、Ｘ及びＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、ゼラチンの分子量が２ＫＤａ以上１００ＫＤａ以下である、請求項１に記載の骨再生剤。
  3. ゼラチン含有顆粒の１つの大きさが１００μｍ以上２０００μｍ以下である、請求項１又は２に記載の骨再生剤。
  4. 幹細胞が、間葉系幹細胞、ｉＰＳ細胞又はＥＳ細胞である、請求項１から３の何れか一項に記載の骨再生剤。
  5. 幹細胞が、脂肪由来幹細胞、骨髄由来幹細胞又は歯髄由来幹細胞である、請求項１から４の何れか一項に記載の骨再生剤。
  6. ゼラチン含有顆粒１ｍｇあたりの幹細胞の数が１．０×１０３個以上である、請求項１から５の何れか一項に記載の骨再生剤。
  7. 幹細胞の７０％以上が、ゼラチン含有顆粒の表面又は表面の孔に付着している、請求項１から６の何れか一項に記載の骨再生剤。
  8. 顎裂部に用いる、請求項１から７の何れか一項に記載の骨再生剤。
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